JP2005530781A - 新生物の治療に3−ヘテロアリール−2−インドリノンとシクロオキシゲナーゼ−2阻害剤との組み合わせを用いる方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物及びCOX−2選択的阻害剤を含む組み合わせを投与することによる新生物の治療又は予防に有用な方法及び組成物を提供する。さらに、新生物の治療及び予防のための組成物、薬剤組成物及びキッドを提供する。
Description
発明の分野
本発明は、新生物(neoplasm)を治療するための、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物とシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)選択的阻害剤との組み合わせを用いる組成物及び方法に関する。
本発明は、新生物(neoplasm)を治療するための、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物とシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)選択的阻害剤との組み合わせを用いる組成物及び方法に関する。
発明の背景
新生物、又は腫瘍は、細胞成長の異常で、調節されておらず、組織の乱れた増殖である。新生物は、破壊的に成長する性質、侵襲性及び転移性を有する場合には、悪性又は癌性である。侵襲性は、周囲組織の浸潤又は破壊による新生物の局部的広がり(local spread)を意味し、典型的には、組織の境界を定義する基底層を突破することによって、しばしば身体の循環系に侵入する。転移は、通常は、リンパ管又は血管による腫瘍細胞の播種(dissemination)を意味する。転移はさらに、漿膜腔又はクモ膜下腔又は他の空隙(spaces)を通じた直接の伸展による腫瘍細胞の移動を意味する。転移の経過を通して、身体の他の領域への腫瘍細胞の移動が、最初の出現部位から離れた領域における新生物を確立する。
新生物、又は腫瘍は、細胞成長の異常で、調節されておらず、組織の乱れた増殖である。新生物は、破壊的に成長する性質、侵襲性及び転移性を有する場合には、悪性又は癌性である。侵襲性は、周囲組織の浸潤又は破壊による新生物の局部的広がり(local spread)を意味し、典型的には、組織の境界を定義する基底層を突破することによって、しばしば身体の循環系に侵入する。転移は、通常は、リンパ管又は血管による腫瘍細胞の播種(dissemination)を意味する。転移はさらに、漿膜腔又はクモ膜下腔又は他の空隙(spaces)を通じた直接の伸展による腫瘍細胞の移動を意味する。転移の経過を通して、身体の他の領域への腫瘍細胞の移動が、最初の出現部位から離れた領域における新生物を確立する。
癌は、今や、合衆国における第2の主要死亡原因であり、合衆国では、8,000,000を超える人々が何らかの形の癌と診断されている。1995年には、癌は合衆国における全ての死亡の23.3%を占めている(U.S.Dept of Health and Human Services,National Center for Health Statistics,Health United Sates 1996-97 and Injury Chartbook 117(1997)を参照のこと)。
癌は、分子レベルで完全に理解されているとは言えない。例えば、ある種のウイルス、化学物質又は放射線のような発癌物質に細胞を暴露させると、“サプレッシブ”遺伝子を不活化するか、又は、“癌遺伝子(oncogene)”を活性化するDNA変化をもたらすことは、知られている。サプレッシブ遺伝子は成長調節遺伝子であり、これは、突然変異すると、もはや細胞増殖を抑制することができなくなる。癌遺伝子は、最初は正常な遺伝子(癌原遺伝子と呼ばれる)であるが、突然変異又は発現環境の変化によって、トランスフォーミング遺伝子になる。トランスフォーミング遺伝子の産物は、不適当な細胞増殖を惹起する。20種類以上の正常な細胞遺伝子が、遺伝子変化(genetic alteration)によって癌遺伝子になりうる。形質転換細胞(transformed cell)は、細胞の形態構造、細胞間相互作用、膜含有物(membrane content)、細胞骨格構造、タンパク質分泌、遺伝子発現及び死亡率を含めた、多くの点で正常細胞とは異なる(形質転換細胞は、無制限に増殖しうる)。
癌は、現在、3種類の療法:手術、放射線及び化学療法の1つ又は組み合わせによって主として治療されている。手術は、患部組織の大部分の除去を意味する。手術は、ある一定の部位、例えば、***(breast)、結腸及び皮膚に位置する腫瘍の除去に時には有効であるが、例えば背骨のような他の領域に位置する腫瘍の治療には、手術を用いることができないし、例えば白血病のような播種性新生物状態の治療にも用いることができない。
化学療法は、細胞複製又は細胞代謝を破壊することを意味する。化学療法は、乳癌、肺癌及び睾丸癌の治療に、最も頻繁に用いられる。新生物疾患の治療に用いられる全身性化学療法の副作用は、癌の治療を受ける患者によって最も恐れられている。これらの副作用のなかで、吐き気と嘔吐は最も一般的で、重度な副作用である。他の不利な副作用は、骨髄救助(bone marrow rescue)又は放射線療法と共に高用量の化学療法を受けた患者における血球減少症、感染、悪液質、粘膜炎;脱毛症(ヘア・ロス);皮膚併発症(化学療法剤に対する皮膚反応に関して、M. D. Abeloff, et al : Alopecia and Cutaneous Complications. P. 755-56.In Abeloff, M. D. , Armitage, J.O., Lichter, A. S. , and Niederhuber, J. E. (eds) Clinical Oncology,Churchill Livingston, New York, 1992を参照のこと)、例えば、心因性掻痒症、蕁麻疹及び血管性浮腫;神経併発症;放射線又は化学療法を受けた患者における肺及び心臓併発症;並びに生殖及び内分泌併発症を包含する。
化学療法誘導副作用は、患者のクオリティ・オブ・ライフに重大に影響を与え、治療による患者コンプライアンスに劇的に影響を及ぼす可能性がある。
さらに、化学療法剤に関連した不利な副作用は、一般に、これらの薬物の投与における主要な用量制限毒性(DLT)である。例えば、粘膜炎は、代謝拮抗物質の細胞傷害性薬剤5−FU、メトトレキセート及び例えばドキソルビシンのような抗腫瘍性抗生物質を含めた、幾つかの抗癌剤に対する主要な用量制限毒性である。これらの化学療法誘導副作用の多くは、重度であり、入院を招来するか、又は痛覚の治療のために鎮痛剤による処置を必要とする可能性がある。
さらに、化学療法剤に関連した不利な副作用は、一般に、これらの薬物の投与における主要な用量制限毒性(DLT)である。例えば、粘膜炎は、代謝拮抗物質の細胞傷害性薬剤5−FU、メトトレキセート及び例えばドキソルビシンのような抗腫瘍性抗生物質を含めた、幾つかの抗癌剤に対する主要な用量制限毒性である。これらの化学療法誘導副作用の多くは、重度であり、入院を招来するか、又は痛覚の治療のために鎮痛剤による処置を必要とする可能性がある。
化学療法剤及び放射線療法によって誘導される、不利な副作用は、癌患者の臨床管理にとって非常に重要になってきている。
米国特許第5,843,925号は、7−[置換アミノ]−9−[(置換グリシル)アミド]−6−デメチル−6−デオキシテトラサイクリンを用いた、血管形成及び内皮細胞増殖を阻害する方法を記載する。
米国特許第5,843,925号は、7−[置換アミノ]−9−[(置換グリシル)アミド]−6−デメチル−6−デオキシテトラサイクリンを用いた、血管形成及び内皮細胞増殖を阻害する方法を記載する。
米国特許第5,854,205号は、内皮細胞増殖及び血管形成の阻害剤である単離エンドスタチン・タンパク質を記載している。
米国特許第5,863,538号は、化学療法及び放射線と組み合わせて、免疫及び成長因子に基づく試薬を用いる、充実性腫瘍の腫瘍脈管構造を標的とするための方法及び組成物を記載している。
米国特許第5,863,538号は、化学療法及び放射線と組み合わせて、免疫及び成長因子に基づく試薬を用いる、充実性腫瘍の腫瘍脈管構造を標的とするための方法及び組成物を記載している。
米国特許第5,837,682号は、内皮細胞増殖阻害剤、アンギオスタチンのフラグメントの使用を記載している。
米国特許第5,861,372号は、凝集内皮細胞阻害剤、アンギオスタチンの使用と、血管形成の抑制におけるその使用を記載している。
米国特許第5,861,372号は、凝集内皮細胞阻害剤、アンギオスタチンの使用と、血管形成の抑制におけるその使用を記載している。
PCT/US97/09610は、腫瘍及び血管形成に関連する疾患の治療に用いるための少なくとも1種類の血管形成阻害剤又は抗腫瘍薬にコンジュゲートする、抗エンドギン・モノクローナル抗体(anti-endogin monoclonal antibody)の投与を記載している。
PCT/IL96/00012は、癌の治療のためのThrombin B鎖のフラグメントを記載している。
PCT/US95/16855は、組換えウイルス・ベクターを用いる、特定腫瘍細胞を殺す組成物及び方法を記載している。
PCT/US95/16855は、組換えウイルス・ベクターを用いる、特定腫瘍細胞を殺す組成物及び方法を記載している。
Ravaud,A.らは、転移腎細胞癌を有する患者におけるインターロイキン−2(IL−2)、インターフェロンα−2a及びフルオロウラシルの効力及び耐性(tolerance)を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.8,2728-32,1998.
Stadler,W.M.らは、転移腎細胞癌を有する患者における皮下インターロイキン−2及びインターフェロンαの外来患者処方計画に加えられる経口13−シス−レチノイン酸の反応速度及び毒性を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.5,1820-25,1998.
Rosenbeg,S.A.らは、転移黒色腫を有する患者に関し、シスプラチン、ダカルバジン及びタモキシフェン単独で又はインターロイキン−2及びインターフェロンα−2bと組み合わせた治療を述べている、J.Clin.Oncol.17,No.3,968-75,1999.
Tourani,J−Mらは、インターロイキン−2及びインターフェロンα−2bの、フルオロウラシルと組み合わせた投与を用いる腎細胞癌の治療を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.7,2505-13,1998.
Majewski,S.は、抗血管形成及び抗増殖効果に関連した、レチノイド、ビタミンD3及びサイトカイン(インターフェロン及びインターロイキン−12)の抗癌作用を述べている、J.Invest.Dermatol.108,No.571,1997.
Ryan,C.W.は、経口シスレチノイン酸に加え、GW−CSF、インターロイキン−2及びインターフェロン−αによる、転移腎細胞癌を有する患者の治療を述べている、J.Invest.Med.46,No.7,274A,1998.
Tai−Ping,D.は、可能な抗血管形成療法を述べている、Trends Pharmacol. Sci. 16, No. 2,57-66, 1995.
Brembeck, F. H. は、UICCステージIII/IV膵臓癌を治療するための13−1シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、Gastroenterology 114, No. 4, Pt. 2, A569,1998.
Brembeck, F. H.は、進行した膵臓癌を有する患者における13−シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、 Cancer 83, No. 11,2317- 23,1998.
Mackean, M. J.は、進行した悪性黒色腫又は腎癌を有する患者におけるロキニメックス(Linomide)及びαインターフェロンの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No. 12,1620-23, 1998.
Jayson, G. C. は、進行した腎癌におけるインターロイキン−2及びインターロイキン−インターフェロンαの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No.3, 366-69, 1998.
Abraham, J. M. は、転移腎癌を有する患者におけるインターロイキン−2、インターフェロンα及び5−フルオロウラシルの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, Suppl. 2, 8,1998.
Soori, G. S. は、非ホジキン・リンパ腫を有する患者におけるクロラムブシル及びαインターフェロンによる化学−生物学的療法の使用を述べている、Blood 92, No. 10, Pt. 2 Suppl. 1,240b, 1998.
Enschede, S. H. は、低悪性度及び中間悪性度の非ホジキン・リンパ腫の治療におけるアントラサイクリンに基づく治療計画に加えたインターフェロンαの使用を述べているBlood 92, No. 10, Pt. 1 Suppl. 1,412a, 1998.
Schachter, J. は、インターフェロンα、4薬物化学療法計画及びGM−CSFによる逐次多重薬物化学療法及び生物学的療法の使用を述べている、Cancer Biother. Radiopharm. 13, No. 3,155-64, 1998.
Mross, K. は、転移乳癌患者におけるレチノイン酸、インターフェロンα及びタモキシフェンの使用を述べている、J. Cancer Res. Clin. Oncology. 124Suppl. 1 R123, 1998.
Muller, H. は、進行した及び転移した膵臓癌の治療におけるスラミン及びタモキシフェンの使用を述べている、Eur. J. Cancer 33,Suppl. 8, S50, 1997.
Rodriguez, M. R. は、転移乳癌の治療におけるタキソールとシスプラチン、及びタキソテレとビノレルビンの使用を述べている、 Eur. J. Cancer 34,Suppl. 4,S17-S18, 1998.
Formenti, C. は、局所進行乳癌患者におけるパクリタキセルと放射線との併用療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S39,1998.
Durando, A. は、転移乳癌のためのパクリタキセル(T)及びエピルビシン(E)による複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S41,1998.
Osaki, A.は、進行乳癌のためのセカンドライン療法としてのマイトマイシン−C、エトポシド、ドキシフルリジン及びメドロキシプロゲステロン・アセテートによる複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S59,1998.
Lode, H. らは、自発的腫瘍転移を撲滅する、抗血管形成性インテグリンαvアンタゴニストと、抗体−サイトカイン融合タンパク質との相乗効果を述べている、Proc. Nat. Acad. Sci. USA. , 96 (4), 1591-1596,1999.
Giannis, A. らは、血管形成の阻害剤としてのインテグリン・アンタゴニスト及び他の低分子量化合物:癌療法における新規な薬物を述べている、Angew. Chem. int. Ed. Engl. 36 (6), 588-590,1997.
Takada, Y.らは、インテグリンの構造及び機能を述べている、Jikken Igaku 14 (17), 2317-2322,1996.
Varner, J.らは、腫瘍血管形成及び血管細胞インテグリンαvβ3の役割を述べている、Impt. Adv.Onc., 69-87 Ref: 259.1996.
シクロホスファミド、CDDP又はチオテーパ(thiotepa)と組み合わせた、TNP−470及びミノサイクリンの使用が、1つの前臨床充実性腫瘍モデルにおいて腫瘍成長遅延を実質的に高めることが観察されている(Teicher, B. A. etal., Breast Cancer Research and Treatment, 36 : 227-236, 1995).さらに、該抗血管形成剤をシクロホスファミド及び分割放射線療法と組み合わせて用いた場合に、改良された結果が観察されている、(Teicher, B. A.et al., European Journal of Cancer 32A (14) : 2461-2466,1996).
Neri らは、癌の治療のためのカルボプラチン及びタキソールと組み合わせたAG−3340の使用を検討した(Neri etal., Proc Am Assoc Can Res, Vol 39,89 meeting, 302 1998).
米国特許第5,837,696号は、癌成長を抑制するためのテトラサイクリンの使用を記載している。
Stadler,W.M.らは、転移腎細胞癌を有する患者における皮下インターロイキン−2及びインターフェロンαの外来患者処方計画に加えられる経口13−シス−レチノイン酸の反応速度及び毒性を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.5,1820-25,1998.
Rosenbeg,S.A.らは、転移黒色腫を有する患者に関し、シスプラチン、ダカルバジン及びタモキシフェン単独で又はインターロイキン−2及びインターフェロンα−2bと組み合わせた治療を述べている、J.Clin.Oncol.17,No.3,968-75,1999.
Tourani,J−Mらは、インターロイキン−2及びインターフェロンα−2bの、フルオロウラシルと組み合わせた投与を用いる腎細胞癌の治療を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.7,2505-13,1998.
Majewski,S.は、抗血管形成及び抗増殖効果に関連した、レチノイド、ビタミンD3及びサイトカイン(インターフェロン及びインターロイキン−12)の抗癌作用を述べている、J.Invest.Dermatol.108,No.571,1997.
Ryan,C.W.は、経口シスレチノイン酸に加え、GW−CSF、インターロイキン−2及びインターフェロン−αによる、転移腎細胞癌を有する患者の治療を述べている、J.Invest.Med.46,No.7,274A,1998.
Tai−Ping,D.は、可能な抗血管形成療法を述べている、Trends Pharmacol. Sci. 16, No. 2,57-66, 1995.
Brembeck, F. H. は、UICCステージIII/IV膵臓癌を治療するための13−1シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、Gastroenterology 114, No. 4, Pt. 2, A569,1998.
Brembeck, F. H.は、進行した膵臓癌を有する患者における13−シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、 Cancer 83, No. 11,2317- 23,1998.
Mackean, M. J.は、進行した悪性黒色腫又は腎癌を有する患者におけるロキニメックス(Linomide)及びαインターフェロンの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No. 12,1620-23, 1998.
Jayson, G. C. は、進行した腎癌におけるインターロイキン−2及びインターロイキン−インターフェロンαの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No.3, 366-69, 1998.
Abraham, J. M. は、転移腎癌を有する患者におけるインターロイキン−2、インターフェロンα及び5−フルオロウラシルの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, Suppl. 2, 8,1998.
Soori, G. S. は、非ホジキン・リンパ腫を有する患者におけるクロラムブシル及びαインターフェロンによる化学−生物学的療法の使用を述べている、Blood 92, No. 10, Pt. 2 Suppl. 1,240b, 1998.
Enschede, S. H. は、低悪性度及び中間悪性度の非ホジキン・リンパ腫の治療におけるアントラサイクリンに基づく治療計画に加えたインターフェロンαの使用を述べているBlood 92, No. 10, Pt. 1 Suppl. 1,412a, 1998.
Schachter, J. は、インターフェロンα、4薬物化学療法計画及びGM−CSFによる逐次多重薬物化学療法及び生物学的療法の使用を述べている、Cancer Biother. Radiopharm. 13, No. 3,155-64, 1998.
Mross, K. は、転移乳癌患者におけるレチノイン酸、インターフェロンα及びタモキシフェンの使用を述べている、J. Cancer Res. Clin. Oncology. 124Suppl. 1 R123, 1998.
Muller, H. は、進行した及び転移した膵臓癌の治療におけるスラミン及びタモキシフェンの使用を述べている、Eur. J. Cancer 33,Suppl. 8, S50, 1997.
Rodriguez, M. R. は、転移乳癌の治療におけるタキソールとシスプラチン、及びタキソテレとビノレルビンの使用を述べている、 Eur. J. Cancer 34,Suppl. 4,S17-S18, 1998.
Formenti, C. は、局所進行乳癌患者におけるパクリタキセルと放射線との併用療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S39,1998.
Durando, A. は、転移乳癌のためのパクリタキセル(T)及びエピルビシン(E)による複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S41,1998.
Osaki, A.は、進行乳癌のためのセカンドライン療法としてのマイトマイシン−C、エトポシド、ドキシフルリジン及びメドロキシプロゲステロン・アセテートによる複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S59,1998.
Lode, H. らは、自発的腫瘍転移を撲滅する、抗血管形成性インテグリンαvアンタゴニストと、抗体−サイトカイン融合タンパク質との相乗効果を述べている、Proc. Nat. Acad. Sci. USA. , 96 (4), 1591-1596,1999.
Giannis, A. らは、血管形成の阻害剤としてのインテグリン・アンタゴニスト及び他の低分子量化合物:癌療法における新規な薬物を述べている、Angew. Chem. int. Ed. Engl. 36 (6), 588-590,1997.
Takada, Y.らは、インテグリンの構造及び機能を述べている、Jikken Igaku 14 (17), 2317-2322,1996.
Varner, J.らは、腫瘍血管形成及び血管細胞インテグリンαvβ3の役割を述べている、Impt. Adv.Onc., 69-87 Ref: 259.1996.
シクロホスファミド、CDDP又はチオテーパ(thiotepa)と組み合わせた、TNP−470及びミノサイクリンの使用が、1つの前臨床充実性腫瘍モデルにおいて腫瘍成長遅延を実質的に高めることが観察されている(Teicher, B. A. etal., Breast Cancer Research and Treatment, 36 : 227-236, 1995).さらに、該抗血管形成剤をシクロホスファミド及び分割放射線療法と組み合わせて用いた場合に、改良された結果が観察されている、(Teicher, B. A.et al., European Journal of Cancer 32A (14) : 2461-2466,1996).
Neri らは、癌の治療のためのカルボプラチン及びタキソールと組み合わせたAG−3340の使用を検討した(Neri etal., Proc Am Assoc Can Res, Vol 39,89 meeting, 302 1998).
米国特許第5,837,696号は、癌成長を抑制するためのテトラサイクリンの使用を記載している。
WO97/48,685は、メタロプロテアーゼを阻害する、種々な置換化合物を記載している。
EP48/9,577は、腫瘍細胞の転移及び浸潤を防止するために用いられるペプチジル誘導体を記載している。
EP48/9,577は、腫瘍細胞の転移及び浸潤を防止するために用いられるペプチジル誘導体を記載している。
WO98/25,949は、メタロプロテイナーゼ酵素を阻害するためのN5−置換5−アミノ−1,3,4−チアジアゾール−2−チオールの使用を記載している。
WO99/21,583は、野性型p53が主として発現する癌を有する患者における転移を、放射線療法と選択的マトリックス・メタロプロテイナーゼとの組み合わせを用いて抑制する方法を記載している。
WO99/21,583は、野性型p53が主として発現する癌を有する患者における転移を、放射線療法と選択的マトリックス・メタロプロテイナーゼとの組み合わせを用いて抑制する方法を記載している。
WO98/33,768は、癌の治療におけるアリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体を記載している。
WO98/30,566は、癌の治療に有用な環状スルホン誘導体を記載している。
WO98/30,566は、癌の治療に有用な環状スルホン誘導体を記載している。
WO98/34,981は、癌の治療に有用なアリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体を記載している。
WO98/33,788は、腫瘍の治療のためのカルボン酸誘導体又はヒドロキサム酸誘導体の使用を記載している。
WO98/33,788は、腫瘍の治療のためのカルボン酸誘導体又はヒドロキサム酸誘導体の使用を記載している。
WO97/41,844は、ヒト患者における血管新生の予防及び/又は治療のために止血性化合物組み合わせを用いる方法を記載している。
EP48/9,579は、癌の治療において、腫瘍転移を制御するために有用であると考えられる選択的ゲラチナーゼ作用を有するペプチジル誘導体を記載している。
EP48/9,579は、癌の治療において、腫瘍転移を制御するために有用であると考えられる選択的ゲラチナーゼ作用を有するペプチジル誘導体を記載している。
WO98/03,516は、癌の治療に有用な、ホスフィネートに基づく化合物を記載している。
WO93/24,475は、スルファミド誘導体が、癌の治療において転移の発生を制御するために有用でありうると、記載している。
WO93/24,475は、スルファミド誘導体が、癌の治療において転移の発生を制御するために有用でありうると、記載している。
WO98/16,227は、新生物の治療及び予防に[ピロゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミドを用いる方法を記載している。
WO98/22,101は、抗血管形成剤として[ピロゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミドを用いる方法を記載している。
WO98/22,101は、抗血管形成剤として[ピロゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミドを用いる方法を記載している。
WO96/03,385は、単独で又は、癌の治療に有用であると考えられるNSAIDs、ステロイド、5−LO阻害剤、LTB4アンタゴニスト若しくはLTA4ヒドロラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される3,4−二置換ピラゾール化合物を記載している。
WO98/47,890は、単独で又は他の有効成分と組み合わせて用いられうる置換ベンゾピラン誘導体を記載している。
シクロオキシゲナーゼ−2酵素を選択的に阻害する化合物が、発見されている。これらの化合物は、COX−2の活性を、COX−1の活性よりも大きな程度に選択的に阻害する。該新規なCOX−2阻害剤は、COX−1の阻害に関連した、有害な副作用を回避しながら、炎症を予防又は軽減する能力を包含する利点を提供すると考えられる。したがって、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、療法に、特に、例えば関節炎の痛覚及び炎症の制御のためのような長期間投与を必要とする療法に用いるために非常に有用であると判明している。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤の同定に関する他の情報は、(1)Buttgereit, F.et al., Am. J.Med., 110 (3 Suppl. 1) :13-9 (2001); (2) Osiri, M.et al, Arthritis Care Res., 12(5) : 351-62 (1999); (3) Buttar, N. S.et al., Mayo Clin. Proc. , 75(10) : 1027-38 (2000); (4) Wollheim, F. A., Current Opin.Rheumatol., 13 : 193-201 (2001); (5) U. S. Patent Nos. 5,434, 178 (1,3,5−三置換ピラゾール化合物); (6) 5,476, 944 (環状フェノールチオエーテル誘導体); (7) 5,643, 933 (置換スルホニルフェニル複素環) ; 5,859, 257 (イソオキサゾール化合物); (8) 5,932, 598 (ベンゼンスルホンアミド含有COX−2阻害剤のプロドラッグ); (9) 6,156, 781 (置換ピラゾリルベンゼンスルホンアミド) ; 及び(10) 6,110, 960 (ジヒドロベンゾピランと関連化合物に関して)に見出すことができる。
シクロオキシゲナーゼ−2酵素を選択的に阻害する化合物が、発見されている。これらの化合物は、COX−2の活性を、COX−1の活性よりも大きな程度に選択的に阻害する。該新規なCOX−2阻害剤は、COX−1の阻害に関連した、有害な副作用を回避しながら、炎症を予防又は軽減する能力を包含する利点を提供すると考えられる。したがって、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、療法に、特に、例えば関節炎の痛覚及び炎症の制御のためのような長期間投与を必要とする療法に用いるために非常に有用であると判明している。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤の同定に関する他の情報は、(1)Buttgereit, F.et al., Am. J.Med., 110 (3 Suppl. 1) :13-9 (2001); (2) Osiri, M.et al, Arthritis Care Res., 12(5) : 351-62 (1999); (3) Buttar, N. S.et al., Mayo Clin. Proc. , 75(10) : 1027-38 (2000); (4) Wollheim, F. A., Current Opin.Rheumatol., 13 : 193-201 (2001); (5) U. S. Patent Nos. 5,434, 178 (1,3,5−三置換ピラゾール化合物); (6) 5,476, 944 (環状フェノールチオエーテル誘導体); (7) 5,643, 933 (置換スルホニルフェニル複素環) ; 5,859, 257 (イソオキサゾール化合物); (8) 5,932, 598 (ベンゼンスルホンアミド含有COX−2阻害剤のプロドラッグ); (9) 6,156, 781 (置換ピラゾリルベンゼンスルホンアミド) ; 及び(10) 6,110, 960 (ジヒドロベンゾピランと関連化合物に関して)に見出すことができる。
炎症の治療のためのシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤の効力及び副作用が、報告されている。参考文献は、Hillson, J. L.et al., Expeff Opin. Pharmacother., 1 (5) : 1053-66 (2000),(ロフェコキシブ、VioxxO, Merck & Co.,Inc.に関して) ; Everts, B. et al.,Clin. Rheumatol., 19 (5) : 331-43 (2000), (セレコキシブ、Celebrex(登録商標) Pharmacia Corporation及びロフェコキシブに関して); Jamali, F. , J. Pharm. Pharm.Sci., 4 (1) :1-6 (2001),(セレコキシブに関して) ; U. S. Patent Nos. 5,521, 207 及び 5,760, 068 (置換ピラゾリルベンゼンスルホンアミドに関して) ; Davies, N. M. et al.,Clinical.Genetics,Abstr.at.http://www.mmhc.com/cg/articles/CG0006/davies.html (メロキシカム、セレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ及びロフェコキシブに関して); http ://www. celebrex. com (セレコキシブに関して) ;
http : //www. docguide. com/dg.nsf/PrintPrint/F1F8DDD2D8B009408525698F00742187, 5/9/2001 (エトリコキシブ、 MK-663, Merck & Co., Inc.に関して) ; Saag, K. et al., Arch. Fam.Med., 9 (10) : 1124-34 (2000), (ロフェコキシブに関して); 国際特許公開 No. WO 00/24719 (ABT 963, Abbott Laboratoriesに関して)を包含する。
http : //www. docguide. com/dg.nsf/PrintPrint/F1F8DDD2D8B009408525698F00742187, 5/9/2001 (エトリコキシブ、 MK-663, Merck & Co., Inc.に関して) ; Saag, K. et al., Arch. Fam.Med., 9 (10) : 1124-34 (2000), (ロフェコキシブに関して); 国際特許公開 No. WO 00/24719 (ABT 963, Abbott Laboratoriesに関して)を包含する。
COX−2阻害剤はまた、癌の治療(W098/16227) 及び腫瘍の治療( EP 927,555,及び Rozic et al., Int. J. Cancer, 93 (4) : 497-506 (2001)参照)に関して記載されている。Celecoxib(登録商標)、COX−2の選択的阻害剤は、ラットにおける線維芽細胞増殖因子誘導角膜血管形成に強力な阻害を発揮した(Masferrer et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Research 1999, 40 : 396)。WO98/41511は、癌の治療に用いられる5−(4−スルフニル−フェニル)−ピリダジノン誘導体を記載している。WO98/41516は、癌の治療に用いることができる(メチルスルホニル)フェニル−2−(5H)−フラノン誘導体を記載している。Kalgutkar, A. S.ら, Curr. Drug Targets,2(1) : 79-106 (2001)は、COX−2選択的阻害剤を用いて、腫瘍の生存性、成長及び転移に影響を及ぼすことによって、癌を治療する又は予防することができることを示唆している。Masferrer らは、Ann.NYAcad.Sci., 889: 84-86 (1999)において、数種類の癌における可能な治療的有用性を有する抗血管形成剤としてのCOX−2選択的阻害剤を述べている。臨床的癌予防におけるCOX−2阻害の有用性は、結腸癌に対する化学予防剤としてのCOX−2選択的阻害剤の可能性を述べている、Oncology, 15 (3) : 21-26 (2001)におけるLynch, P. M.と、Biofactors 2000,12 (1-4) : 129-133 (2000)におけるWatanabeらによって説明されている。
さらに、COX−2阻害剤を用いた種々な複合療法が、癌の治療のための他の選択された複合治療計画と共に、報告されている。例えば、FR2771005(癌及び他の疾患の治療のために用いられる、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及びN−メチル−d−アスパルテート(NMDA)アンタゴニストを含有する組成物);WO99/18960(結腸直腸癌及び乳癌の治療に用いることができる、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及び誘導酸化窒素シンターゼ阻害剤(iNOS)を含む組み合わせ);WO99/13799(シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤とオピオイド鎮痛剤との組み合わせ);WO97/36497(癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及び5−リポキシゲナーゼ阻害剤を含む組み合わせ);WO97/29776(ロイコトリエンB4受容体アンタゴニスト及び免疫抑制薬と組み合わせて、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤を含む組成物);WO97/29775(ロイコトリエンA4ヒドラーゼ阻害剤及び免疫抑制薬と組み合わせた、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤の使用);WO97/29774(癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤と、プロスタグランジン又は抗潰瘍薬との組み合わせ);WO97/11701(結腸直腸癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及びロイコトリエンB4受容体アンタゴニストから成る組み合わせ);WO96/41645(シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及びロイコトリエンAヒドラーゼ阻害剤から成る組み合わせ);WO96/03385(癌の治療のために、単独で又はNSAIDs、ステロイド、5−LO阻害剤、LTB4アンタゴニスト又はLTA4ヒドラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される3,4−二置換ピラゾール化合物);WO98/47890(単独で又は他の有効成分と組み合わせて用いることができる置換ベンゾピラン誘導体);WO00/38730(新生物の治療における複合療法としての、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤及び1種類以上の抗新生物薬の使用方法);Mann, M.etal, Gastroenterology, 120 (7): 1713-1719 (2001) (COX−2及びHER−2の新規な阻害剤による組み合わせ治療が、結腸直腸癌の増殖を減じた)を参照のこと。
このように、新生物の治療及び予防のために新規な又は改良された方法を開発することが、望ましい。
発明の概要
それ故、簡単に言えば、本発明は、新生物障害の治療又は予防を必要とする対象における新生物障害の治療又は予防の新規な方法であって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグと、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む組み合わせを該対象に投与することを含む方法に関する。
それ故、簡単に言えば、本発明は、新生物障害の治療又は予防を必要とする対象における新生物障害の治療又は予防の新規な方法であって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグと、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む組み合わせを該対象に投与することを含む方法に関する。
1つの実施態様では、本発明の3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、式:
で示される化合物を包含する。
(式中、
R1は、H又はアルキルであり;
R2は、O又はSであり;
R3は、水素であり;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH3)nCO2R、及びCONRR’から成る群から選択される;
Aは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、2−スルホニルフラン、4−アルキルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、1つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’によって置換される;
nは、0〜3であり;
Rは、H、アルキル又はアリールであり;
R’は、H、アルキル又はアリールである。)
本発明の該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル)]メチレン}−2−インドリノン;3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン;3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;及び3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。
(式中、
R1は、H又はアルキルであり;
R2は、O又はSであり;
R3は、水素であり;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH3)nCO2R、及びCONRR’から成る群から選択される;
Aは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、2−スルホニルフラン、4−アルキルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、1つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’によって置換される;
nは、0〜3であり;
Rは、H、アルキル又はアリールであり;
R’は、H、アルキル又はアリールである。)
本発明の該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル)]メチレン}−2−インドリノン;3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン;3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;及び3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施態様では、該化合物は、3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5416)又はそのプロドラッグである。
本発明はまた、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む、新生物の治療又は予防のための新規な組成物にも関する。
本発明はまた、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む、新生物の治療又は予防のための新規な組成物にも関する。
本発明はさらに、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、新規な薬剤組成物にも関する。好ましくは、該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5416)又はそのプロドラッグである。
本発明はまた、新生物の治療又は予防に用いるために適する新規なキットであって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン又はそのプロドラッグを含む第1投与形及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む第2投与形を、新生物障害の治療又は予防のための該化合物の治療有効量を構成する量で含むキットにも関する。
詳細な説明
“アルキル”は、直鎖、分枝鎖又は環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は1〜12個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルキル基は、炭素数1〜7、より好ましくは炭素数1〜4の低級アルキルである。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を包含する。該アルキル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、NO2、ハロゲン、N(CH3)2アミノ及びSHから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されることも可能である。
“アルキル”は、直鎖、分枝鎖又は環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は1〜12個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルキル基は、炭素数1〜7、より好ましくは炭素数1〜4の低級アルキルである。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を包含する。該アルキル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、NO2、ハロゲン、N(CH3)2アミノ及びSHから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されることも可能である。
“アルケニル”は、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖、分枝鎖又は環状の不飽和炭化水素基を意味する。好ましくは、該アルケニル基は、1〜12個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルケニル基は、炭素数1〜7、より好ましくは炭素数1〜4の低級アルケニルである。該アルケニル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、NO2、ハロゲン、N(CH3)2、アミノ及びSHから成る群から選択される1つ以上の置換基によって置換されうる。
“アルキニル”は、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖、分枝鎖又は環状の不飽和炭化水素を意味する。好ましくは、該アルキニル基は、1〜12個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルキニル基は、炭素数1〜7、より好ましくは炭素数1〜4の低級アルキニルである。該アルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、NO2、ハロゲン、N(CH3)2、アミノ及びSHから成る群から選択される1つ以上の置換基によって置換されうる。
“アルコキシ”は、“O−アルキル”基を意味する。
“アリール”は、共役pi電子系を有する環を少なくとも1つ有する芳香族基を意味し、炭素環アリール、複素環アリール及びビアリール基を包含する。該アリール基は、場合によっては、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、SH、OH、NO2、アミン、チオエーテル、シアノ、アルコキシ、アルキル及びアミノから成る群から選択される1つ以上の置換基によって置換されうる。
“アリール”は、共役pi電子系を有する環を少なくとも1つ有する芳香族基を意味し、炭素環アリール、複素環アリール及びビアリール基を包含する。該アリール基は、場合によっては、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、SH、OH、NO2、アミン、チオエーテル、シアノ、アルコキシ、アルキル及びアミノから成る群から選択される1つ以上の置換基によって置換されうる。
“アルカリール”は、アリール基に共有結合したアルキルを意味する。好ましくは、該アルキルは低級アルキルである。
“炭素環アリール”は、環原子が炭素であるアリール基を意味する。
“炭素環アリール”は、環原子が炭素であるアリール基を意味する。
“複素環アリール”は、環原子として、1〜3個のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素であるアリール基を意味する。ヘテロ原子は、酸素、硫黄及び窒素を包含する。したがって、複素環アリール基は、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、N−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等を包含する。
“アミド”は、−C(O)−NH−R(式中、Rはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である)を意味する。
“チオアミド”は、−C(S)−NH−R(式中、Rはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である)を意味する。
“チオアミド”は、−C(S)−NH−R(式中、Rはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である)を意味する。
“アミン”は、−N(R’)R”(式中、R’とR”は、アルキル、アリール及びアルキルアリールから成る群から独立に選択される)を意味する。
“チオエーテル”は、−S−R(式中、Rはアルキル、アリール又はアルキルアリールである)を意味する。
“チオエーテル”は、−S−R(式中、Rはアルキル、アリール又はアルキルアリールである)を意味する。
“スルホニル”は、−S(O)2−R(式中、Rは、アリール、C(CN)=C−アリール、CH2CN、アルキアリール(alkyaryl)、スルホンアミド、NH−アルキル、NH−アルキルアリール又はNH−アリールである)を意味する。
本明細書で用いる限り、“3−ヘテロアリール−2−インドリノン”なる用語は、その薬学的に許容される塩を包含する。
本明細書で用いる限り、3−ヘテロアリール−2−インドリノン・プロドラッグは、in vivoで親化合物の3−ヘテロアリール−2−インドリノンに転化する作用物質(agent)を意味する。プロドラッグは、状況によっては、親薬物よりも投与し易い可能性がある。例えば、プロドラッグは、経口投与によってバイオアベイラブル(bioavailable)であるが、親薬物はそうではない、又は、プロドラッグは、溶解性を改良して、静脈内投与を可能にすることができる。3−ヘテロアリール−2−インドリノンのプロドラッグのクラスは、米国特許第6,316,635号に記載されている。本明細書における“インドリノン”、“オキシンドール”、“3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物”等への言及は、状況がプロドラッグを排除しない限り、それらのプロドラッグを包含する。
本明細書で用いる限り、3−ヘテロアリール−2−インドリノン・プロドラッグは、in vivoで親化合物の3−ヘテロアリール−2−インドリノンに転化する作用物質(agent)を意味する。プロドラッグは、状況によっては、親薬物よりも投与し易い可能性がある。例えば、プロドラッグは、経口投与によってバイオアベイラブル(bioavailable)であるが、親薬物はそうではない、又は、プロドラッグは、溶解性を改良して、静脈内投与を可能にすることができる。3−ヘテロアリール−2−インドリノンのプロドラッグのクラスは、米国特許第6,316,635号に記載されている。本明細書における“インドリノン”、“オキシンドール”、“3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物”等への言及は、状況がプロドラッグを排除しない限り、それらのプロドラッグを包含する。
本発明は、新生物の治療又は予防を必要とする対象における新生物を治療又は予防する方法であって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む組み合わせを該対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の方法及び組み合わせは、末端性ほくろ性黒色腫、日光性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細管(capillary)、類癌腫、癌腫、癌肉腫、海綿状(cavernous)、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫/癌腫、明細胞癌、嚢胞状腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜腺癌、上衣(ependymal)、類上皮(epitheloid)、ユーイング肉腫、層状化線維(fibrolamellar)、限局性結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、胚細胞腫瘍、グリア芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症(hepatic adenomatosis)、肝細胞癌、インシュリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平細胞新生物、浸潤性扁平細胞腫、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性ほくろ性黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮(mesothelial)、転移性癌、粘類表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞 (oligodendroglial)、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)、横紋筋肉腫、肉腫、重篤癌(serious carcinoma)、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下(submesothelial)、表在拡大型黒色腫(superficial spreading melanoma)、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ビポーマ、分化癌(well differentiated carcinoma)、及びウィルムス腫瘍を包含する新生物障害の治療又は予防のために用いることができる。
1実施態様では、本発明の3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、式:
で示される化合物を包含する。
(式中、
R1は、H又はアルキルであり;
R2は、O又はSであり;
R3は、水素であり;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH3)nCO2R、及びCONRR’から成る群から選択される;
Aは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、2−スルホニルフラン、4−アルキルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、1つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’によって置換される;
nは、0〜3であり;
Rは、H、アルキル又はアリールであり;
R’は、H、アルキル又はアリールである。)
本発明の該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル)]メチレン}−2−インドリノン;3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン;3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;及び3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の詳細な説明に関しては米国特許第5,792,783号を参照のこと。
(式中、
R1は、H又はアルキルであり;
R2は、O又はSであり;
R3は、水素であり;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH3)nCO2R、及びCONRR’から成る群から選択される;
Aは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、2−スルホニルフラン、4−アルキルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、1つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’によって置換される;
nは、0〜3であり;
Rは、H、アルキル又はアリールであり;
R’は、H、アルキル又はアリールである。)
本発明の該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル)]メチレン}−2−インドリノン;3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン;3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;及び3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の詳細な説明に関しては米国特許第5,792,783号を参照のこと。
本発明の好ましい実施態様では、該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5416)又はそのプロドラッグである。
他の実施態様では、新生物を治療、予防又は抑制するためにCOX−2阻害剤と組み合わせる該インドリノン化合物は、ピロール置換2−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、これらはタンパク質キナーゼの活性をモジュレートする。このようなインドリノン、及びそれらを供給する又は調製する方法は、係属中で許可通知が出されている(has been allowed)米国特許第09/322,297号、及び国際公開第WO99/61422号に詳しく記載されており、これらの参考文献は本明細書に援用される。好ましい実施態様では、該インドリノンは、3−[3,5−ジメチル−4−(2−カルボキシエチル)ピロル−2−イルメチリデン]−2−インドリノン(SU−6668)である。
本明細書で挙げる3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の化学式は、互変異性又は構造異性の現象を示すことがある。例えば、本明細書に記載する該化合物は、S−インドリノン3−置換基をインドリノン環に結合させる二重結合に関してシス又はトランスのコンフォーメーションをとってもよく、シス異性体とトランス異性体との混合物であってもよい。本明細書内に描いた式は、1つの可能な互変異性体又は構造異性体形を表すことができるに過ぎないので、本発明が、チロシン・キナーゼのシグナル伝達又は細胞増殖を調節する、抑制する及び/又はモジュレートする能力を有する、任意の互変異性体若しくは構造異性体形又はこれらの混合物を包含するものであり、式の図に用いられた、いずれか1つの互変異性体若しくは構造異性体形に限定されないことを理解すべきである。
上記化合物及びそれらの薬学的に許容される塩の他に、本発明のインドリノンは、適用可能である場合には、細胞増殖を調節する及び/又はモジュレートする能力を有する化合物の溶媒和形(例えば、水和形)を非溶媒和形と同様に包含する。
本明細書に記載した3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られた任意の方法によって調製することができる。適当な方法は、実施例において説明する。必要な出発物質は、有機化学の標準的な手段によって得ることができる。
受容体チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達に影響を及ぼす作用物質としての、個々の化合物の関連活性及び効力は、利用可能な手法を用いて測定することができる。優先的に、化合物に一連のスクリーニングを行なって、細胞増殖をモジュレートする、調節する及び/又は抑制する、該化合物の能力を測定する。これらのスクリーニングは、それらが行なわれる順序で、生化学アッセイ、細胞増殖アッセイ及びin vivo実験を包含する。
好ましくは、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はそのプロドラッグは、COX−2選択的阻害剤と組み合わせて、低用量で、即ち、単独で投与される個別化合物の各々の、臨床状況で慣用的に用いられる用量よりも低い用量で投与される。
対象に投与される、本発明の化合物、組成物、剤、及び療法の用量を低減することの利点は、高い投与量に付随する有害作用(adverse effect)の発生率の低下を包含する。例えば、Sugen5416のような化学療法剤の投与量を低減することによって、より高い投与量において観察される副作用の頻度及び重症度に比べて、該頻度及び重症度の減少が生じる。本明細書に記載する、他の3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物をCOX−2選択的阻害剤と組み合わせて用いることに関しても、同様な利点が考えられる。
有害作用の発生率を低減することによって、治療を受ける患者のクオリティ・オブ・ライフの改善が考えられる。有害作用の発生率を低減することのさらなる利点は、患者コンプライアンスの改善、有害作用の治療のために必要な入院回数の減少、及び該不利な副作用に関連した痛みの治療のために必要な鎮痛剤の投与の減少を包含する。
本明細書に記載した、COX−2選択的阻害剤と3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物との組み合わせは、細胞増殖障害、線維形成障害(fibrotic disorders)及び代謝障害を含めた、調節されない(unregulated)チロシンキナーゼ・シグナル伝達に関連した障害の治療に有用である。このような疾患の治療に3−ヘテロアリール−2−インドリノンを使用できることは、これらの化合物が、受容体チロシンキナーゼ(RTKs)及び/又は非受容体チロシンキナーゼの酵素活性に影響を及ぼして、このようなタンパク質によって伝達されるシグナルを妨害することによって、チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節する、モジュレートする及び/又は抑制すると言う事実に由来する。
チロシンキナーゼのシグナル伝達は、細胞増殖、分化及び代謝に重要な役割を果たす。異常な細胞増殖は、例えば癌腫のような新生物、肉腫、白血病、グリア芽細胞腫、血管腫、乾癬、アテローム硬化症、関節炎及び糖尿病性網膜症(又は、制御されない血管形成及び/又は脈管形成に関連した、他の障害)の発生を含めた、広範囲な障害及び疾患を生じる可能性がある。したがって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物を含有する、本明細書に開示した組み合わせは、例えば、異常なチロシンキナーゼ・シグナル伝達に起因する疾患の治療に有用である。
本発明によって治療することができる、又はさらに研究することができる細胞増殖障害は、癌の他に、血管増殖障害及びメサンギウム細胞増殖障害を包含する。
血管増殖障害は、一般に血管の異常な増殖を生じる血管形成障害及び脈管形成障害を意味する。血管の形成及び延展(spreading)、又は脈管形成及び血管形成は、それぞれ、例えば胚発育、黄体形成、創傷治癒及び器官再生のような、多様な生理的プロセスに重要な役割を果たしている。これらは、さらに、癌発生に極めて重要な役割を果たしている。血管増殖障害の他の例は、新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎、及び、網膜中の新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血し、盲目を惹起する糖尿病性網膜症等の眼疾患を包含する。逆に、例えば再狭窄のような、血管の収縮、狭窄(contraction)又は閉塞に関連した障害も、包含される。
血管増殖障害は、一般に血管の異常な増殖を生じる血管形成障害及び脈管形成障害を意味する。血管の形成及び延展(spreading)、又は脈管形成及び血管形成は、それぞれ、例えば胚発育、黄体形成、創傷治癒及び器官再生のような、多様な生理的プロセスに重要な役割を果たしている。これらは、さらに、癌発生に極めて重要な役割を果たしている。血管増殖障害の他の例は、新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎、及び、網膜中の新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血し、盲目を惹起する糖尿病性網膜症等の眼疾患を包含する。逆に、例えば再狭窄のような、血管の収縮、狭窄(contraction)又は閉塞に関連した障害も、包含される。
線維形成障害は、細胞外マトリックスの異常な形成を意味する。線維形成障害の例は、肝硬変及びメサンギウム細胞増殖障害を包含する。肝硬変は、肝臓瘢痕の(hepatic scar)の形成をもたらす細胞外マトリックス構成成分(constituents)の増加を特徴とする。肝硬変は、例えば、肝臓の硬変のような疾患を惹起しうる。肝臓瘢痕をもたらす細胞外マトリックスの増加は、例えば肝炎のような、ウイルス感染症によっても惹起されうる。類洞周囲脂質細胞(lipocytes)が、肝硬変に重要な役割を果たすように思われる。関与する他の線維形成障害は、アテローム硬化症を包含する(以下参照)。
メサンギウム細胞増殖障害は、メサンギウム細胞の異常な増殖によってもたらされる障害を意味する。メサンギウム細胞増殖障害は、種々なヒト腎臓疾患、例えば、腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性細小血管障害症候群、移植片拒絶、及び糸球体症等を包含する。PDGF−Rは、メサンギウム細胞増殖の維持に関連付けられている。Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S-54S.
PTKsは、このような細胞増殖障害に関連付けられている。例えば、RTKファミリーの一部のメンバーは、癌の発達に関連した。EGFR(Tuzi etal., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719)、HER2/neu(Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) 及びPDGF−R(Kumabe et al.,1992, Oncogene 7: 627-633)のような、上記受容体の幾つかが多くの腫瘍に過度発現される、及び/又は自己分泌ループによって永続的に活性化される。実際に、最も一般的で、重度な癌においては、これらの受容体の過度発現(Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360)及び自己分泌ループ(Lee and Donoghue, 1992, J.Cell. Biol. 118: 1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra)は、実証されている。例えば、EGFR受容体は、扁平上皮癌、星状細胞腫、グリオ芽細胞腫、頭頚部癌、肺癌及び膀胱癌に関連付けられている。HER2は、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膵臓癌及び膀胱癌に関連付けられている。PDGF−Rは、グリオ芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、黒色腫及び前立腺癌に関連付けられている。RTKc−metは一般に、肝発癌、したがって肝細胞癌に関連付けられている。さらに、c−metは悪性腫瘍形成に関連付けられている。さらに具体的には、RTKc−metは、他の癌のなかでも、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌及び胃癌、白血病及びリンパ腫に関連付けられている。さらに、Hodgkins疾患、Burkitts疾患及びリンパ腫細胞株を有する患者に、c−met遺伝子の過度発現が検出されている。
PTKsは、このような細胞増殖障害に関連付けられている。例えば、RTKファミリーの一部のメンバーは、癌の発達に関連した。EGFR(Tuzi etal., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719)、HER2/neu(Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) 及びPDGF−R(Kumabe et al.,1992, Oncogene 7: 627-633)のような、上記受容体の幾つかが多くの腫瘍に過度発現される、及び/又は自己分泌ループによって永続的に活性化される。実際に、最も一般的で、重度な癌においては、これらの受容体の過度発現(Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360)及び自己分泌ループ(Lee and Donoghue, 1992, J.Cell. Biol. 118: 1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra)は、実証されている。例えば、EGFR受容体は、扁平上皮癌、星状細胞腫、グリオ芽細胞腫、頭頚部癌、肺癌及び膀胱癌に関連付けられている。HER2は、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膵臓癌及び膀胱癌に関連付けられている。PDGF−Rは、グリオ芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、黒色腫及び前立腺癌に関連付けられている。RTKc−metは一般に、肝発癌、したがって肝細胞癌に関連付けられている。さらに、c−metは悪性腫瘍形成に関連付けられている。さらに具体的には、RTKc−metは、他の癌のなかでも、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌及び胃癌、白血病及びリンパ腫に関連付けられている。さらに、Hodgkins疾患、Burkitts疾患及びリンパ腫細胞株を有する患者に、c−met遺伝子の過度発現が検出されている。
IGF−IRは、栄養支持及びII型糖尿病に関係付けられている他に、数種類の癌に関連付けられている。例えば、IGF−Iは、数種類の腫瘍型、例えばヒト乳癌の癌細胞(Arteaga etal., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) 及び小肺腫瘍細胞(Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50: 2511-2517)に対する自己分泌増殖刺戟因子(autocrine growth stimulator)として関係付けられている。さらに、神経系の正常な成長及び分化に一体的に関連するIGF−Iは、ヒト神経膠腫の自己分泌刺戟因子であると思われる。Sandberg-Nordqvist etal., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478.細胞増殖におけるIGF−IRとそのリガンドの重要性は、培養中の多くの細胞種類(線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、T−リンパ球、骨髄性細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の幹細胞)がIGF−Iによって増殖を刺戟されると言う事実によって、さらに支持される。Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326.一連の最近の刊行物では、Besergaはさらに、IGF−I−Rが形質転換の機構に主要な役割を果たし、このようなものとして、広範囲なヒト悪性腫瘍に対する治療的介入のための好ましい標的になりうることを示唆している。Baserga, 1995, Cancer Res. 55: 249-252; Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola etal., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 4588-4595.
しかし、RTKsにおける異常性と疾患との関係は、癌にのみ限定される訳ではない。例えば、RTKsは、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症及び神経変性疾患のような代謝性疾患に関連付けられている。例えば、EGF−Rは、角膜及び皮膚創傷治癒に適応される。インシュリン−R及びIGF−IRにおける欠陥(defects in the Insulin-R and the IGF-IR)は、II型糖尿病に適応される。特定のRTKsとそれらの治療的適応症とのより完全な相互関係は、Plowman etal., 1994, DN & P 7: 334- 339.に記載されている。
しかし、RTKsにおける異常性と疾患との関係は、癌にのみ限定される訳ではない。例えば、RTKsは、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症及び神経変性疾患のような代謝性疾患に関連付けられている。例えば、EGF−Rは、角膜及び皮膚創傷治癒に適応される。インシュリン−R及びIGF−IRにおける欠陥(defects in the Insulin-R and the IGF-IR)は、II型糖尿病に適応される。特定のRTKsとそれらの治療的適応症とのより完全な相互関係は、Plowman etal., 1994, DN & P 7: 334- 339.に記載されている。
受容体型チロシンキナーゼのみでなく、 src, abl, fps, yes, fyn,lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk を含めた、多くの細胞チロシンキナーゼ(Bolen et al., 1992, FASEB J. 6: 3403-3409によって概説されている)が、増殖及び代謝シグナル伝達経路に、したがって、本発明の適応症に関与している。例えば、突然変異したsrc(v-src)は、ニワトリにおけるオンコタンパク質(oncoprotein)(pp60v−src)として実証されている。さらに、その細胞同族体、プロト−癌遺伝子pp60c−srcは、多くの受容体の癌遺伝子シグナルを伝達する。例えば、腫瘍におけるEGF−R又はHER2/neuの過度発現は、正常細胞には存在しないpp60c−srcの構成的活性化を生じ、悪性細胞に特徴的である。他方では、c-srcの発現が不充分であるマウスは、大理石骨病の表現型を示し、c-srcが破骨細胞機能に重要に関与し、関連障害に関与する可能性があることを実証している。同様に、Zap70は、T−細胞シグナリングに関与する。
その上、RTK向けブロッカー(RTK aimed blocker)によって増強する又は該ブロッカーと相乗作用さえするCTKモジュレーティング化合物(CTK modulating compounds)の同定は、本発明の態様である。
最後に、RTKs及び非受容体型キナーゼの両方が、過免疫障害に関連付けられている。
したがって、本発明の複合療法は、新生物の治療に用いられる他に、例えば、血管増殖障害、線維形成障害、メサンギウム細胞増殖障害及び代謝疾患のような疾患の治療に用いることができる。
したがって、本発明の複合療法は、新生物の治療に用いられる他に、例えば、血管増殖障害、線維形成障害、メサンギウム細胞増殖障害及び代謝疾患のような疾患の治療に用いることができる。
本明細書に用いる限り、“シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤”なる用語は、シクロオキシゲナーゼ−1に比べてシクロオキシゲナーゼ−2を選択的に阻害する化合物を包含し、さらに、これらの化合物の薬学的に許容される塩又はエステルをも包含する。
実際に、COX−2阻害剤の選択性は、試験が行なわれる条件及び試験される阻害剤に依存して、変化する。しかし、本明細書のために、COX−2阻害剤の選択性は、COX−2の阻害に関するIC50値によって割り算したCOX−1阻害に関するin vitro又はin vivoIC50値の比率(COX−1 IC50/COX−2 IC50)として測定することができる。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、COX−1 IC50のCOX−2 IC50に対する比率が1より大きい、好ましくは2より大きい、より好ましくは5より大きい、さらにより好ましくは10より大きい、なおより好ましくは50より大きい、より好ましくはさらに100より大きい、任意の阻害剤である。
本明細書で用いる限り、“IC50”なる用語は、シクロオキシゲナーゼ活性の50%阻害を生じるために必要である化合物の濃度を意味する。
本発明の好ましいシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、約1μM未満、より好ましくは約0.5μMのシクロオキシゲナーゼ−2 IC50を有する。
本発明の好ましいシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、約1μM未満、より好ましくは約0.5μMのシクロオキシゲナーゼ−2 IC50を有する。
好ましいシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、約1μMより大きい、より好ましくは20μMより大きい、シクロオキシゲナーゼ−1IC50を有する。
このような、好ましい選択性は、一般的なNSAID誘導副作用の発生率を減ずる可能性を示すと考えられる。
このような、好ましい選択性は、一般的なNSAID誘導副作用の発生率を減ずる可能性を示すと考えられる。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤のプロドラッグとして作用する化合物も、本発明の範囲内に包含される。COX−2選択的阻害剤に関連し、本明細書で用いる限り、“プロドラッグ”なる用語は、対象の体内で代謝プロセス又は単純な化学的プロセスによって、活性なCOX−2選択的阻害剤に転化されうる化学化合物を意味する。COX−2選択的阻害剤のプロドラッグの1例は、パレコキシブ(parecoxib)であり、これは三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤バルデコキシブ(valdecoxib)の治療的に有効な(therapeutically effective)プロドラッグである。好ましいCOX−2選択的阻害剤プロドラッグの例は、パレコキシブ・ナトリウムである。COX−2阻害剤プロドラッグのクラスは、米国特許第5,932,598号に記載されている。本明細書における“シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤”、“COX−2選択的阻害剤”等への言及は、文脈がプロドラッグを排除しない限り、それらのプロドラッグを包含する。
1つの実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物に用いるCOX−2阻害剤は、一般式(I):
で示される、置換したベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン若しくはジヒドロナフタレン、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから成る群から選択され。
(式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
GはO又はS又はNRaであり;
Raはアルキルであり;
R1は、H及びアリールから成る群から選択され;
R2は、カルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択され;
R3は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、場合によっては、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
各R4は、独立に、H、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ,ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、ヒドロキシアリールカルボニル、ニトロアリール、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル及びアルキルカルボニルから成る群から選択される;又は
R4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する。)
他の実施態様では、本発明に用いるCOX−2阻害剤は、一般式(II):
(式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
GはO又はS又はNRaであり;
Raはアルキルであり;
R1は、H及びアリールから成る群から選択され;
R2は、カルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択され;
R3は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、場合によっては、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
各R4は、独立に、H、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ,ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、ヒドロキシアリールカルボニル、ニトロアリール、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル及びアルキルカルボニルから成る群から選択される;又は
R4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する。)
他の実施態様では、本発明に用いるCOX−2阻害剤は、一般式(II):
で示されるCOX−2阻害剤、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである。
(式中、Dは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル環及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され;
R13は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールから成る群から選択され、この場合に、R13は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
R14は、メチル又はアミノであり;
R15は、H、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、N−アリールアミノカルボニル、N−アルキル−N−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、N−アリールアミノ、N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、N−アリールアミノアルキル、N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、N−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、又はN−アルキル−N−アリールアミノスルホニルである。)
他の実施態様によると、本発明はさらに、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物を第2量で、新生物障害の治療を必要とする対象に投与することを含む新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、一般式(III):
(式中、Dは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル環及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され;
R13は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールから成る群から選択され、この場合に、R13は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
R14は、メチル又はアミノであり;
R15は、H、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、N−アリールアミノカルボニル、N−アルキル−N−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、N−アリールアミノ、N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、N−アリールアミノアルキル、N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、N−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、又はN−アルキル−N−アリールアミノスルホニルである。)
他の実施態様によると、本発明はさらに、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物を第2量で、新生物障害の治療を必要とする対象に投与することを含む新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、一般式(III):
[式中、R16はメチル又はエチルであり;
R17はクロロ又はフルオロであり;
R18は水素又はフルオロであり;
R19は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり;
R20は水素又はフルオロであり;
R21はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、R16がエチルでありR19がHである場合には、R17、R18、R19及びR20の全てがフルオロになるということはない]
で示されるフェニル酢酸誘導体又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを含む組成物に関する。
R17はクロロ又はフルオロであり;
R18は水素又はフルオロであり;
R19は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり;
R20は水素又はフルオロであり;
R21はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、R16がエチルでありR19がHである場合には、R17、R18、R19及びR20の全てがフルオロになるということはない]
で示されるフェニル酢酸誘導体又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを含む組成物に関する。
他の実施態様では、本発明の組成物及び方法に有用なCOX−2阻害剤は、式(IV):
[式中、XはO又はSであり;
Jは炭素環又は複素環であり;
R22はNHSO2CH3又はFであり;
R23はH、NO2又はFであり;
R24はH、NHSO2CH3又は(SO2CH3)C6H4である]
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
Jは炭素環又は複素環であり;
R22はNHSO2CH3又はFであり;
R23はH、NO2又はFであり;
R24はH、NHSO2CH3又は(SO2CH3)C6H4である]
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
他の実施態様によると、本明細書に記載するCOX−2阻害剤は、構造式(V):
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである。
(式中、TとMは、独立に、フェニル、ナフチル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり;
Q1、Q2、L1又はL2は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級メトキシであり:
Q1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、パラ位置に存在し、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル若しくは1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2である;或いは、
Q1とQ2はメチレンジオキシであるか;又は、
L1とL2はメチレンジオキシである;
R25、R26、R27及びR28は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、
R25とR26がOであるか、又は
R27とR28がOである、或いは、
R25、R26は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
R27、R28は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。)
本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、例えば、COX−2選択的阻害剤メロキシカム、式B−0(CAS registry number 71125-38-7)、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグでありうる。
(式中、TとMは、独立に、フェニル、ナフチル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり;
Q1、Q2、L1又はL2は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級メトキシであり:
Q1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、パラ位置に存在し、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル若しくは1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2である;或いは、
Q1とQ2はメチレンジオキシであるか;又は、
L1とL2はメチレンジオキシである;
R25、R26、R27及びR28は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、
R25とR26がOであるか、又は
R27とR28がOである、或いは、
R25、R26は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
R27、R28は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。)
本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、例えば、COX−2選択的阻害剤メロキシカム、式B−0(CAS registry number 71125-38-7)、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグでありうる。
本発明の他の実施態様では、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、COX−2選択的阻害剤RS57067、6−[[5−(4−クロロベンゾイル)−1,4−ジメチル−1H−ピロル−2−イル]メチル]−3(2H)−ピリダジノン、式B−2(CAS registry number 179382-91-3)、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグでありうる。
本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、例えば、式B−1で示されるCOX−2選択的阻害剤[2−(2,4−ジクロロ−6−エチル−3,5−ジメチル−フェニルアミノ)−5−プロピル−フェニル]−酢酸、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
本発明の好ましい実施態様では、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、置換ベンゾピラン又は置換ベンゾピラン類似体であるクロメン構造クラスのものであり、さらにより好ましくは、本明細書に示す一般式Iで示される構造を有する置換ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン又はジヒドロナフタレンから成る群から選択され、例として、表1に開示した構造を、それらのジアステレオマー、エナンチオマー、ラセメート、互変異性体、塩、エステル、アミド及びプロドラッグを含めて有するが、これらに限定されない。
さらに、本発明の実施に有用なベンゾピランCOX−2選択的阻害剤は、米国特許第6,034,256号及び第6,077,850号に記載されている。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(I)[式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
Gは酸素又は硫黄であり;
R1はHであり;
R2はカルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル又は低級アルコキシカルボニルであり;
R3は低級ハロアルキル、低級シクロアルキル又はフェニルであり;
各R4は、H、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである;或いは、
R4は、環Eのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(I)[式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
Gは酸素又は硫黄であり;
R1はHであり;
R2はカルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル又は低級アルコキシカルボニルであり;
R3は低級ハロアルキル、低級シクロアルキル又はフェニルであり;
各R4は、H、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである;或いは、
R4は、環Eのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(I)[式中、R2はカルボキシルであり;
R3は低級ハロアルキルであり;
各R4は、H、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである;或いは、R4は、環Eと一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
R3は低級ハロアルキルであり;
各R4は、H、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである;或いは、R4は、環Eと一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(I)[式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
R3は、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチルであり;各R4が、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、tert−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、N,N−ジメチルアミノ、N,N−ジエチルアミノ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、ニトロ、N,N−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−エチルスルホニル、2,2−ジメチルエチルアミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−(2−メチルプロピル)アミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、2,2−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル又はフェニルであるか;或いは、
R4は、環Eのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
R3は、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチルであり;各R4が、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、tert−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、N,N−ジメチルアミノ、N,N−ジエチルアミノ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、ニトロ、N,N−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−エチルスルホニル、2,2−ジメチルエチルアミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−(2−メチルプロピル)アミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、2,2−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル又はフェニルであるか;或いは、
R4は、環Eのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(I)[式中、nは、0、1、2、3又は4である整数であり;
R3はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;
各R4は、独立に、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−(2,2−ジメチルエチル)アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、2−メチルプロピルアミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、又はフェニルであるか;或いは、
R4は、環Eのそれがが結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
R3はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;
各R4は、独立に、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−(2,2−ジメチルエチル)アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、2−メチルプロピルアミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、又はフェニルであるか;或いは、
R4は、環Eのそれがが結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、式(I)の構造[式中、n=4;
GはO又はSであり;
R1はHであり;
R2はCO2Hであり;
R3は低級ハロアルキルであり;
R9に相当する第1のR4はヒドリド又はハロであり;
R10に相当する第2のR4は、H、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルコキシ、低級アラルキルカルボニル、低級ジアルキルアミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級ヘテロアラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル又は六員窒素含有ヘテロシクロスルホニルであり;
R11に相当する第3のR4は、H、低級アルキル、ハロ、低級アルコキシ又はアリールであり;
R12に相当する第4のR4は、H、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ又はアリールである]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる;この場合、式(I)は、式(Ia):
GはO又はSであり;
R1はHであり;
R2はCO2Hであり;
R3は低級ハロアルキルであり;
R9に相当する第1のR4はヒドリド又はハロであり;
R10に相当する第2のR4は、H、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルコキシ、低級アラルキルカルボニル、低級ジアルキルアミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級ヘテロアラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル又は六員窒素含有ヘテロシクロスルホニルであり;
R11に相当する第3のR4は、H、低級アルキル、ハロ、低級アルコキシ又はアリールであり;
R12に相当する第4のR4は、H、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ又はアリールである]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる;この場合、式(I)は、式(Ia):
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを包含する。
本発明の(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(Ia)の構造[式中、R8はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;
R9はH、クロロ又はフルオロであり;
R10は、H、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、tert−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル又はモルホリノスルホニルであり;
R11は、H、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、クロロ、メトキシ、ジエチルアミノ又はフェニルであり;
R12は、H、クロロ、ブロモ、フルオロ、メチル、エチル、tert−ブチル、メトキシ又はフェニルである]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
本発明の(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤はさらに、式(Ia)の構造[式中、R8はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;
R9はH、クロロ又はフルオロであり;
R10は、H、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、tert−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル又はモルホリノスルホニルであり;
R11は、H、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、クロロ、メトキシ、ジエチルアミノ又はフェニルであり;
R12は、H、クロロ、ブロモ、フルオロ、メチル、エチル、tert−ブチル、メトキシ又はフェニルである]で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
本発明はさらに、新生物障害の治療を必要とする対象に、BMS-347070 (B-74), ABT 963 (B-25), NS-398 (B-26), L-745337 (B- 214), RWJ-63556 (B-215), 又は L-784512 (B-216).を含むシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤の治療有効量を投与することを含む、新生物障害を治療するための新規な方法に関する。
COX−2阻害剤のなかで、表1に挙げたCOX−2阻害剤は、以下に示すような、クロメンCOX−2阻害剤である:
表1.クロメンCOX−2選択的阻害剤の例
表1.クロメンCOX−2選択的阻害剤の例
本発明の他の好ましい実施態様では、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、インドリノンと組み合わせて用いる場合に、式(II)の一般構造:
で示される三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤のクラス、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから選択することができる。
(式中、Dは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され;
R13は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールであり、この場合に、R13は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
R14は、メチル又はアミノから成る群から選択され;
R15は、H、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、N−アリールアミノカルボニル、N−アルキル−N−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、N−アリールアミノ、N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、N−アリールアミノアルキル、N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、N−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、N−アルキル−N−アリールアミノスルホニルから選択されるラジカルから成る群から選択される。
(式中、Dは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され;
R13は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールであり、この場合に、R13は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される1つ以上のラジカルによって置換される;
R14は、メチル又はアミノから成る群から選択され;
R15は、H、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、N−アリールアミノカルボニル、N−アルキル−N−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、N−アリールアミノ、N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、N−アリールアミノアルキル、N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、N−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、N−アルキル−N−アリールアミノスルホニルから選択されるラジカルから成る群から選択される。
本発明のさらにより好ましい実施態様では、本発明の方法(単数又は複数)に関連して、インドリノンと組み合わせて用いるための三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤(単数又は複数種類)は、上記式(II)で示され、セレコキシブ(B−18)、バルデコキシブ(B−19)、デラコキシブ(B−20)、ロフェコキシブ(B−21)、エトリコキシブ(MK−663;B−22)、JTE−522(B−23)、又はこれらの異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから成る、表2に例示した化合物の群から選択される。
表2.三環状COX−2選択的阻害剤の例
表2.三環状COX−2選択的阻害剤の例
本発明のさらにより好ましい実施態様では、COX−2選択的阻害剤は、インドリノンと組み合わせて用いる場合に、セレコキシブ、ロフェコキシブ及びエトリコキシブから成る群から選択される。
本発明の他の好ましい実施態様では、三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤バルデコキシブ(B−19)の治療有効なプロドラッグであるパレコキシブ(B−24)が、本発明の方法(単数又は複数)に関連して、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の供給源(source)として有利に用いられうる(例えば、米国特許5,932,598参照のこと)。
パレコキシブの好ましい形は、ナトリウム・パレコキシブである。
本発明の他の好ましい実施態様では、国際公開第WO00/24719号に既に記載されている、式(B−25)で示される化合物ABT−963は、本発明の方法(単数又は複数)に関連して有利に用いられうる、もう1つの三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤である。
本発明の他の好ましい実施態様では、国際公開第WO00/24719号に既に記載されている、式(B−25)で示される化合物ABT−963は、本発明の方法(単数又は複数)に関連して有利に用いられうる、もう1つの三環状シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤である。
本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられる、もう1つの好ましいシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、B−26として以下に示す構造を有するN−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)−メタンスルホンアミド(NS−398)である。この化合物の用途は、例えば、 Yoshimi, N.et al.によって,Japanese J. Cancer Res., 90 (4) : 406-412 (1999)中に;Faigueyret, J. -P. et al.によって, Science Spectra,( http://www.gbhap. com/Science~Spectra/20-1-article. htm (06/06/2001)で入手可能)中に;及びIwata, K.et al.によって, Jpn. J. Pharmacol., 75 (2) : 191-194 (1997)中に記載されている。
本発明の方法(単数又は複数)に関連してシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤として有用である、他の化合物は、非限定的に、下記化合物を包含する:
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−27);
6−クロロ−7−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−28);
8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−29);
6−クロロ−8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−30);
2−トリフルオロメチル−3H−ナフト[2,1−b]ピラン−3−カルボン酸(B−31);
7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−32);
6−ブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−33);
8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−34);
6−トリフルオロメトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−35);
5,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−36);
8−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−37);
7,8−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−38);
6,8−ビス(ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−39);
7−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−40);
7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−41);
6−クロロ−7−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−42);
6−クロロ−8−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−43);
6−クロロ−7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−44);
6,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−45);
6,8−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−46);
6−クロロ−8−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−47);
8−クロロ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−48);
8−クロロ−6−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−49);
6−ブロモ−8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−50);
8−ブロモ−6−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−51);
8−ブロモ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−52);
8−ブロモ−5−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−53);
6−クロロ−8−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−54);
6−ブロモ−8−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−55);
6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−56);
6−[(ジメチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−57);
6−[(メチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−58);
6−[(4−モルホリノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−59);
6−[(1,1−ジメチルエチル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−60);
6−[(2−メチルプロピル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−61);
6−メチルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−62);
8−クロロ−6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−63);
6−フェニルアセチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−64);
6,8−ジブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−65);
8−クロロ−5,6−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−66);
6,8−ジクロロ−(S)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−67);
6−ベンジルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−68);
6−[[N−(2−フリルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−69);
6−[[N−(2−フェニルエチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−70);
6−ヨード−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−71);
7−(1,1−ジメチルエチル)−2−ペンタフルオロエチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−72);
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾチオピラン−3−カルボン酸(B−73);
3−[(3−クロロ−フェニル)−(4−メタンスルホニル−フェニル)−メチレン]−ジヒドロ−フラン−2−オン若しくはBMS−347070(B−74);
8−アセチル−3−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニル)フェニル−イミダゾ(1,2−a)ピリジン(B−75);
5,5−ジメチル−4−(4−メチルスルホニル)フェニル−3−フェニル−2−(5H)−フラノン(B−76);
5−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−77);
4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−フェニル−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−78);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−79);
4−(3,5−ビス(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−80);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−81);
4−(3,5−ビス(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−82);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−83);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−84);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(5−クロロ−2−チエニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−85);
4−(4−クロロ−3,5−ジフェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−86);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−87);
4−[5−フェニル−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−88);
4−[5−(4−フルオロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−89);
4−[5−(4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−90);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−91);
4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−92);
4−[4−クロロ−5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−93);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−94);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−95);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−96);
4−[3−シアノ−5−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−97);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−98);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−99);
4−[4−クロロ−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−100);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ヒドロキシメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−101);
4−[5−(4−(N,N−ジメチルアミノ)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−102);
5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−103);
4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−104);
6−(4−フルオロフェニル)−7−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[3.4]オクタ−6−エン(B−105);
5−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−106);
4−[6−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−107);
5−(3,5−ジクロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−108);
5−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−109);
4−[6−(3,4−ジクロロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−110);
2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール(B−111);
2−(2−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール(B−112);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−メチルチアゾール(B−113);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール(B−114);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(2−チエニル)チアゾール(B−115);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−ベンジルアミノチアゾール(B−116);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(1−プロピルアミノ)チアゾール(B−117);
2−[(3,5−ジクロロフェノキシ)メチル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]チアゾール(B−118);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール(B−119);
1−メチルスルホニル−4−[1,1−ジメチル−4−(4−フルオロフェニル)シクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼン(B−120);
4−[4−(4−フルオロフェニル)−1,1−ジメチルシクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−121);
5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン(B−122);
4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−123);
6−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル(B−124);
2−ブロモ−6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル(B−125);
6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−ピリジン−3−カルボニトリル(B−126);
4−[2−(4−メチルピリジン−2−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−127);
4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−128);
4−[2−(2−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−129);
3−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−130);
2−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−131);
2−メチル−4−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−132);
2−メチル−6−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−133);
4−[2−(6−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−134);
2−(3,4−ジフルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−135);
4−[2−(4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−136);
2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−メチル−1H−イミダゾール(B−137);
2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−フェニル−1H−イミダゾール(B−138);
2−(4−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1H−イミダゾール(B−139);
2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−140);
1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−141);
2−(4−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−142);
4−[2−(3−クロロ−4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−143);
2−(3−フルオロ−5−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−144);
4−[2−(3−フルオロ−4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−145);
2−(3−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−146);
4−[2−(3−メチルフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−147);
1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−148);
4−[2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−149);
4−[2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−150);
4−[2−(4−メトキシ−3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−151);
1−アリル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール(B−152);
4−[1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−3−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−153);
N−フェニル−[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセトアミド(B−154);
エチル[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセテート(B−155);
4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−1H−ピラゾール(B−156);
4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−5−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−157);
1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール(B−158);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−159);
4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(2−チオフェニル)−2−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−160);
5−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−161);
2−エトキシ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−162);
5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(2−プロピニルオキシ)−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−163);
2−ブロモ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−164);
4−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−4,5−ジフルオロフェニル]ベンゼンスルホンアミド(B−165);
1−(4−フルオロフェニル)−2−[4−(メチルスルホニル)フェニル]ベンゼン(B−166);
5−ジフルオロメチル−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−3−フェニルイソオキサゾール(B−167);
4−[3−エチル−5−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−168);
4−[5−ジフルオロメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−169);
4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−170);
4−[5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−171);
1−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−172);
1−[2−(4−フルオロ−2−メチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−173);
1−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−174);
1−[2−(2,4−ジクロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−175);
1−[2−(4−トリフルオロメチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−176);
1−[2−(4−メチルチオフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−177);
1−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−178);
4−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−179);
1−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−180);
4−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−181);
4−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−182);
4−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−183);
1−[2−(4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−184);
1−[2−(2,3−ジフルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−185);
4−[2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−186);
1−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−187);
4−[2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−188);
4−[2−(2−メチルピリジン−5−イル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−189);
エチル2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]−2−ベンジル−アセテート(B−190);
2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]酢酸(B−191);
2−(tert−ブチル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール(B−192);
4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニルオキサゾール(B−193);
4−(4−フルオロフェニル)−2−メチル−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール(B−194);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−2−トリフルオロメチル−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−195);
6−クロロ−7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−196);
6−クロロ−8−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−197);
5,5−ジメチル−3−(3−フルオロメチル)−4−メチルスルホニル−2(5H)−フラノン(B−198);
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾチオピラン−3−カルボン酸(B−199);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−200);
4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−201);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−202);
3−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−203);
2−メチル−5−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−204);
4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−205);
4−[5−メチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−206);
4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−207);
[2−トリフルオロメチル−5−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−208);
4−[2−メチル−4−フェニル−5−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−209);
4−[5−(2−フルオロ−4−メトキシフェニル)−2−トリフルオロメチル−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−210);
[2−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアミノ)−5−メチル−フェニル]酢酸若しくはCOX189(B−211);
N−(4−ニトロ−2−フェノキシ−フェニル)−メタンスルホンアミド若しくはニメスリド(nimesulide)(B−212);
N−[6−(2,4−ジフルオロ−フェノキシ)−1−オキソ−インダン−5−イル]−メタンスルホンアミド若しくはフロスリド(flosulide)(B−213);
N−[6−(2,4−ジフルオロ−フェニルスルファニル)−1−オキソ−インデン−5−イル]−メタンスルホンアミド、ナトリウム塩若しくはL−745337(B−214);
N−[5−(4−フルオロ−フェニルスルファニル)−チオフェン−2−イル]−メタンスルホンアミド若しくはRWJ−63556(B−215);
3−(3,4−ジフルオロ−フェノキシ)−4−(4−メタンスルホニル−フェニル)−5−メチル−5−(2,2,2−トリフルオロエチル)−5H−フラン−2−オン若しくはL−784512若しくはL−784512(B−216);
(5Z)−2−アミノ−5−[[3,5−ビス(1,1−ジメチルエチル)−4−ヒドロキシフェニル]メチレン]−4(5H)−チアゾロン若しくはダルブフェロン(darbufelone)(B−217);
CS−502(B−218);
LAS−34475(B−219);
LAS−34555(B−220);
S−33516(B−221);
SD−8381(B−222);
L−783003(B−223);
N−[3−(ホルミルアミノ)−4−オキソ−6−フェノキシ−4H−1−ベンゾピラン−7−イル]−メタンスルホンアミド若しくはT−614(B−224);
D−1367(B−225);
L−748731(B−226);
(6aR,10aR)−3−(1,1−ジメチルヘプチル)−6a,7,10、10a−テトラヒドロ−1−ヒドロキシ−6,6−ジメチル−6H−ジベンゾ[b,d]ピラン−9−カルボン酸若しくはCT3(B−227);
CGP−28238(B−228);
4−[[3,5−ビス(1,1−ジメチルエチル)−4−ヒドロキシフェニル]メチレン]ジヒドロ−2−メチル−2H−1,2−オキサジン−3(4H)−オン又はBF−389(B−229);
GR−253035(B−230);
6−ジオキソ−9H−プリン−8−イル−ケイ皮酸(B−231);又はS−2474(B−232);或いは、これらの、それぞれの異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ。
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−27);
6−クロロ−7−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−28);
8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−29);
6−クロロ−8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−30);
2−トリフルオロメチル−3H−ナフト[2,1−b]ピラン−3−カルボン酸(B−31);
7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−32);
6−ブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−33);
8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−34);
6−トリフルオロメトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−35);
5,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−36);
8−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−37);
7,8−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−38);
6,8−ビス(ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−39);
7−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−40);
7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−41);
6−クロロ−7−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−42);
6−クロロ−8−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−43);
6−クロロ−7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−44);
6,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−45);
6,8−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−46);
6−クロロ−8−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−47);
8−クロロ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−48);
8−クロロ−6−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−49);
6−ブロモ−8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−50);
8−ブロモ−6−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−51);
8−ブロモ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−52);
8−ブロモ−5−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−53);
6−クロロ−8−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−54);
6−ブロモ−8−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−55);
6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−56);
6−[(ジメチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−57);
6−[(メチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−58);
6−[(4−モルホリノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−59);
6−[(1,1−ジメチルエチル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−60);
6−[(2−メチルプロピル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−61);
6−メチルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−62);
8−クロロ−6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−63);
6−フェニルアセチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−64);
6,8−ジブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−65);
8−クロロ−5,6−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−66);
6,8−ジクロロ−(S)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−67);
6−ベンジルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−68);
6−[[N−(2−フリルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−69);
6−[[N−(2−フェニルエチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−70);
6−ヨード−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−71);
7−(1,1−ジメチルエチル)−2−ペンタフルオロエチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−72);
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾチオピラン−3−カルボン酸(B−73);
3−[(3−クロロ−フェニル)−(4−メタンスルホニル−フェニル)−メチレン]−ジヒドロ−フラン−2−オン若しくはBMS−347070(B−74);
8−アセチル−3−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニル)フェニル−イミダゾ(1,2−a)ピリジン(B−75);
5,5−ジメチル−4−(4−メチルスルホニル)フェニル−3−フェニル−2−(5H)−フラノン(B−76);
5−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−77);
4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−フェニル−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−78);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−79);
4−(3,5−ビス(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−80);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−81);
4−(3,5−ビス(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−82);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−83);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−84);
4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(5−クロロ−2−チエニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−85);
4−(4−クロロ−3,5−ジフェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド(B−86);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−87);
4−[5−フェニル−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−88);
4−[5−(4−フルオロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−89);
4−[5−(4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−90);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−91);
4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−92);
4−[4−クロロ−5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−93);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−94);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−95);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−96);
4−[3−シアノ−5−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−97);
4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−98);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−99);
4−[4−クロロ−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−100);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ヒドロキシメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−101);
4−[5−(4−(N,N−ジメチルアミノ)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−102);
5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−103);
4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−104);
6−(4−フルオロフェニル)−7−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[3.4]オクタ−6−エン(B−105);
5−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−106);
4−[6−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−107);
5−(3,5−ジクロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−108);
5−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン(B−109);
4−[6−(3,4−ジクロロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−110);
2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール(B−111);
2−(2−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール(B−112);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−メチルチアゾール(B−113);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール(B−114);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(2−チエニル)チアゾール(B−115);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−ベンジルアミノチアゾール(B−116);
4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(1−プロピルアミノ)チアゾール(B−117);
2−[(3,5−ジクロロフェノキシ)メチル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]チアゾール(B−118);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール(B−119);
1−メチルスルホニル−4−[1,1−ジメチル−4−(4−フルオロフェニル)シクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼン(B−120);
4−[4−(4−フルオロフェニル)−1,1−ジメチルシクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−121);
5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン(B−122);
4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−123);
6−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル(B−124);
2−ブロモ−6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル(B−125);
6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−ピリジン−3−カルボニトリル(B−126);
4−[2−(4−メチルピリジン−2−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−127);
4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−128);
4−[2−(2−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−129);
3−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−130);
2−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−131);
2−メチル−4−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−132);
2−メチル−6−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−133);
4−[2−(6−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−134);
2−(3,4−ジフルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−135);
4−[2−(4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−136);
2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−メチル−1H−イミダゾール(B−137);
2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−フェニル−1H−イミダゾール(B−138);
2−(4−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1H−イミダゾール(B−139);
2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−140);
1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−141);
2−(4−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−142);
4−[2−(3−クロロ−4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−143);
2−(3−フルオロ−5−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−144);
4−[2−(3−フルオロ−4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−145);
2−(3−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−146);
4−[2−(3−メチルフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−147);
1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−148);
4−[2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−149);
4−[2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−150);
4−[2−(4−メトキシ−3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−151);
1−アリル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール(B−152);
4−[1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−3−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−153);
N−フェニル−[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセトアミド(B−154);
エチル[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセテート(B−155);
4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−1H−ピラゾール(B−156);
4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−5−(トリフルオロメチル)ピラゾール(B−157);
1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール(B−158);
5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール(B−159);
4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(2−チオフェニル)−2−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール(B−160);
5−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−161);
2−エトキシ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−162);
5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(2−プロピニルオキシ)−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−163);
2−ブロモ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン(B−164);
4−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−4,5−ジフルオロフェニル]ベンゼンスルホンアミド(B−165);
1−(4−フルオロフェニル)−2−[4−(メチルスルホニル)フェニル]ベンゼン(B−166);
5−ジフルオロメチル−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−3−フェニルイソオキサゾール(B−167);
4−[3−エチル−5−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−168);
4−[5−ジフルオロメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−169);
4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−170);
4−[5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−171);
1−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−172);
1−[2−(4−フルオロ−2−メチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−173);
1−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−174);
1−[2−(2,4−ジクロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−175);
1−[2−(4−トリフルオロメチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−176);
1−[2−(4−メチルチオフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−177);
1−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−178);
4−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−179);
1−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−180);
4−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−181);
4−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−182);
4−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−183);
1−[2−(4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−184);
1−[2−(2,3−ジフルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−185);
4−[2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−186);
1−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(B−187);
4−[2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−188);
4−[2−(2−メチルピリジン−5−イル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−189);
エチル2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]−2−ベンジル−アセテート(B−190);
2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]酢酸(B−191);
2−(tert−ブチル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール(B−192);
4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニルオキサゾール(B−193);
4−(4−フルオロフェニル)−2−メチル−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール(B−194);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−2−トリフルオロメチル−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−195);
6−クロロ−7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−196);
6−クロロ−8−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸(B−197);
5,5−ジメチル−3−(3−フルオロメチル)−4−メチルスルホニル−2(5H)−フラノン(B−198);
6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾチオピラン−3−カルボン酸(B−199);
4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−200);
4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−201);
4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−202);
3−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−203);
2−メチル−5−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン(B−204);
4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−205);
4−[5−メチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−206);
4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド(B−207);
[2−トリフルオロメチル−5−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−208);
4−[2−メチル−4−フェニル−5−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−209);
4−[5−(2−フルオロ−4−メトキシフェニル)−2−トリフルオロメチル−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド(B−210);
[2−(2−クロロ−6−フルオロ−フェニルアミノ)−5−メチル−フェニル]酢酸若しくはCOX189(B−211);
N−(4−ニトロ−2−フェノキシ−フェニル)−メタンスルホンアミド若しくはニメスリド(nimesulide)(B−212);
N−[6−(2,4−ジフルオロ−フェノキシ)−1−オキソ−インダン−5−イル]−メタンスルホンアミド若しくはフロスリド(flosulide)(B−213);
N−[6−(2,4−ジフルオロ−フェニルスルファニル)−1−オキソ−インデン−5−イル]−メタンスルホンアミド、ナトリウム塩若しくはL−745337(B−214);
N−[5−(4−フルオロ−フェニルスルファニル)−チオフェン−2−イル]−メタンスルホンアミド若しくはRWJ−63556(B−215);
3−(3,4−ジフルオロ−フェノキシ)−4−(4−メタンスルホニル−フェニル)−5−メチル−5−(2,2,2−トリフルオロエチル)−5H−フラン−2−オン若しくはL−784512若しくはL−784512(B−216);
(5Z)−2−アミノ−5−[[3,5−ビス(1,1−ジメチルエチル)−4−ヒドロキシフェニル]メチレン]−4(5H)−チアゾロン若しくはダルブフェロン(darbufelone)(B−217);
CS−502(B−218);
LAS−34475(B−219);
LAS−34555(B−220);
S−33516(B−221);
SD−8381(B−222);
L−783003(B−223);
N−[3−(ホルミルアミノ)−4−オキソ−6−フェノキシ−4H−1−ベンゾピラン−7−イル]−メタンスルホンアミド若しくはT−614(B−224);
D−1367(B−225);
L−748731(B−226);
(6aR,10aR)−3−(1,1−ジメチルヘプチル)−6a,7,10、10a−テトラヒドロ−1−ヒドロキシ−6,6−ジメチル−6H−ジベンゾ[b,d]ピラン−9−カルボン酸若しくはCT3(B−227);
CGP−28238(B−228);
4−[[3,5−ビス(1,1−ジメチルエチル)−4−ヒドロキシフェニル]メチレン]ジヒドロ−2−メチル−2H−1,2−オキサジン−3(4H)−オン又はBF−389(B−229);
GR−253035(B−230);
6−ジオキソ−9H−プリン−8−イル−ケイ皮酸(B−231);又はS−2474(B−232);或いは、これらの、それぞれの異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ。
本発明の他の好ましい実施態様では、本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、式(III)の一般構造:
で示されるフェニル酢酸誘導体のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグのクラスから選択することができる;
(式中、R16はメチル又はエチルであり;
R17はクロロ又はフルオロであり;
R18は水素又はフルオロであり;
R19は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり;
R20は水素又はフルオロであり;R21はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、R16がエチルでありR19がHである場合には、R17、R18,R19及びR20の全てがフルオロになるということはない。)
本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられる、特に好ましいフェニル酢酸シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、COX189(B−211)の名称を有し、式(III)[式中、R16はエチルであり;R17とR19はクロロであり;R18とR20は水素であり;R21はメチルである]で示される構造を有する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
(式中、R16はメチル又はエチルであり;
R17はクロロ又はフルオロであり;
R18は水素又はフルオロであり;
R19は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり;
R20は水素又はフルオロであり;R21はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、R16がエチルでありR19がHである場合には、R17、R18,R19及びR20の全てがフルオロになるということはない。)
本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられる、特に好ましいフェニル酢酸シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、COX189(B−211)の名称を有し、式(III)[式中、R16はエチルであり;R17とR19はクロロであり;R18とR20は水素であり;R21はメチルである]で示される構造を有する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
他の実施態様によると、本発明は、新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で、及びインドリノンを第2量で投与することを含み、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及びインドリノンの治療有効量である新生物障害の治療方法であって、前記COX−2阻害剤が、式(IV):
[式中、XはO又はSであり;Jは炭素環又は複素環であり;R22はNHSO2CH3又はFであり;R23はH、NO2又はFであり;R24はH、NHSO2CH3又は(SO2CH3)C6H4である]
で示される化合物、その異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである治療方法に関する。
で示される化合物、その異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである治療方法に関する。
式B−26で示される構造を有するN−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド(NS-398,CAS RN 123653-11-2)の用途に関するさらなる情報は、例えば、Yoshimi, N.et al.によって、Japanese J. Cancer Res.,90(4):406-412 (1999)に;Falgueyret, J. -P. et al.によって、Science Spectra(http://www. gbhap.com/Science~Spectra/20-1-article. htm (06/06/2001)に;及びIwata, K.et al.によって、Jpn.J.Pharmacol., 75 (2) : 191-194 (1997)に記載されている。
炎症のイヌ・モデルにおけるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤、RWJ63556の抗炎症活性の評価は、Kirchner et al.によって、J Pharmacol Exp Ther 282, 1094-1101 (1997)に記載されている。
他の実施態様によると、インドリノンと組み合わせて用いられるCOX−2阻害剤は、構造式(V):
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
(式中、TとMは、独立に、フェニル、ナフチル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり;
Q1、Q2、L1又はL2は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級メトキシであり:
Q1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、パラ位置に存在し、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、若しくは1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2である;或いは、
Q1とQ2はメチレンジオキシであるか;又は、
L1とL2はメチレンジオキシである;
R25、R26、R27及びR28は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、
R25とR26がOであるか、又は
R27とR28がOである、或いは、
R25、R26は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
R27、R28は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。)
この化合物のファミリーに包含され、本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤として役立ちうる特定の物質は、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド及び(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドを包含する。
(式中、TとMは、独立に、フェニル、ナフチル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり;
Q1、Q2、L1又はL2は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級メトキシであり:
Q1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、パラ位置に存在し、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、若しくは1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2である;或いは、
Q1とQ2はメチレンジオキシであるか;又は、
L1とL2はメチレンジオキシである;
R25、R26、R27及びR28は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、
R25とR26がOであるか、又は
R27とR28がOである、或いは、
R25、R26は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
R27、R28は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。)
この化合物のファミリーに包含され、本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤として役立ちうる特定の物質は、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド及び(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドを包含する。
化合物のこのファミリーに包含され、本発明のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤として役立ちうる特定の物質は、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド及び(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドを包含する。
本発明に有用である、好ましいシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、ダルブフェロン(Pfizer)、CS−502(Sankyo)、LAS34475(Almirall Profesfarma)、LAS34555(Almirall Profesfarma)、S−33516(Servier)、SD8381(Pharmacia、米国特許第6,034,256号に記載)、BMS−347070(Bristol Myers Squibb)、米国特許第6,180,651号に記載)、MK−966(Merck)、T−614(Toyama)、D−1367(Chiroscience)、L−748731(Merck)、CT3(Atlantic Pharmaceutical)、CGP−28238(Novartis)、BF−389(Biofor/Scherer)、GR−253035(Glaxo Wellcome)、6−ジオキソ−9H−プリン−8−イル−ケイ皮酸(Glaxo Wellcome)及びS−2474(Shionogi)を包含する。
上記S−33516に関する情報は、Current Drugs Headline News, at http://www. current-drugs. com/NEWS/Inflam1. htm, 10/04/2001に見出すことができ、この文献では、S−33516が、シクロオキシゲナーゼ−1及びシクロオキシゲナーゼ−2に対して、それぞれ、0.1mM及び0.001mMのIC50値を有するテトラヒドロイソインデ(tetrahydroisoinde)誘導体であることが報告されている。ヒト全血において、S−33516がED50=0.39mg/kgを有することが報告されている。
上記シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、本明細書では、総称して、COX−2選択的阻害剤又はシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤と呼ぶことができる。
本発明に有用であるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、任意の供給源から、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が薬学的に許容される限り、供給されることが可能である。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、天然の供給源から単離し、精製することができ、又は合成することができる。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、医薬品に用いるために慣用的に売買されるような、品質及び純度であるべきである。
本発明に有用であるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、任意の供給源から、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が薬学的に許容される限り、供給されることが可能である。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、天然の供給源から単離し、精製することができ、又は合成することができる。シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤は、医薬品に用いるために慣用的に売買されるような、品質及び純度であるべきである。
本明細書に用いる限り、“有効量”とは、対象へ投与される用量若しくは有効量及び対象への投与回数を意味し、当業者によって既知手法を用いて、同様な環境下で得られた結果を観察することによって容易に決定される。患者へ投与される用量若しくは有効量及び対象への投与回数は、当業者によって既知手法を用いて、同様な環境下で得られた結果を観察することによって容易に決定されうる。有効量又は用量を決定する場合に、用いる化合物の効力及び作用の持続期間;治療すべき病気の性質及び重症度;並びに治療される患者の性別、年齢、体重、全身の健康及び個人的の応答性;並びにその他の関連する状況を包含する、多くの要因が、主治医である診断者によって考慮されるが、これらに限定されない。
“治療的に有効(therapeutically-effective)”なるフレーズは、作用物質が、代わりの療法に典型的に付随する不利な副作用を回避しつつ、障害を予防する、又は障害の重症度を改善する可能性を意味する。“治療的に有効”なるフレーズが、“治療又は予防のために有効”なるフレーズと同等であることを理解すべきであり、両方共が、代わりの療法に典型的に付随する不利な副作用を回避しつつ、各作用物質の単独の治療に比べて、新生物の重症度及び発生率を改良すると言う目標を達成する併用療法に用いるための各作用物質の量を限定するように意図される。
当業者は、投与量がGoodman &Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), AppendixII, pp. 1707-1711からの指導によっても決定されうることを理解するであろう。
本発明の方法に用いる3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物に関して、任意の組み合わせに含有される治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、細胞培養で測定されるIC50(即ち、PTK活性の最大半減(half-maximum)阻害を達成する試験化合物濃度)を包含する循環濃度範囲に達するように、用量を動物モデルで策定することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有効な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載する任意の組み合わせに含有される3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の毒性効果及び治療効果は、例えば、LD50(集団の50%に致命的な用量)及びED50(集団の50%に治療的に有効な用量)の測定に関して、細胞培養及び動物実験において標準製薬方法(standard pharmaceutical procedure)によって評価することができる。
毒性効果と治療効果との用量比率が治療指数であり、これは、LD50とED50との比率として表現することができる。
毒性効果と治療効果との用量比率が治療指数であり、これは、LD50とED50との比率として表現することができる。
高い治療指数を有するインドリノン化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量範囲の策定に用いることができる。このような化合物の投与量は、ED50を包含し毒性が殆ど又は全くない循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、この範囲内で、用いる投与形及び用いる投与経路に依存して変化しうる。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択することができる(例えば、Fingl et al., 1975, in"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1参照)。
投与量及び投与間隔は、キナーゼ調節効果(kinase modulating effect)又は最小有効濃度(MEC)を維持するために充分である活性部分の血漿レベルを与えるように、個々に調節することができる。MECは各化合物で変化するが、in vitroデータから;例えば、本明細書に記載したアッセイを用いて、キナーゼの50〜90%阻害を達成するために必要な濃度から算出することができる。MECに達するために必要な投与量は、個人的な特徴及び投与経路に依存する。しかし、HPLCアッセイ又はバイオアッセイを用いて、血漿濃度を測定することができる。
投与間隔も、MEC値を用いて、決定することができる。MECを超える血漿レベルを該時間の10〜90%、好ましくは30〜90%、最も好ましくは50〜90%間維持する投与計画を用いて、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物を投与すべきである。局所投与又は選択的摂取の場合には、該薬物の有効局所濃度を、血漿濃度に関連付けることができない。
組成物の投与量は、当然、治療される対象、対象の体重、苦痛(affliction)の重症度、投与形式及び処方医(prescribing physician)の判断に依存する。
本発明の方法では、用いる3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の量は、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤と共に投与した場合に、該組み合わせの有効量を構成するために充分であるような量である。該組み合わせの投与量が治療有効量を構成することが好ましい。
本発明の方法では、用いる3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の量は、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤と共に投与した場合に、該組み合わせの有効量を構成するために充分であるような量である。該組み合わせの投与量が治療有効量を構成することが好ましい。
治療の1回投与量のためにシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤と組み合わせて用いられる3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の量は約0.001mg/kg対象の体重から約200mg/kgまでの範囲内であることが、好ましい。該量が約0.01mg/kg〜約20mg/kgであることがより好ましく、約0.1mg/kg〜約12mg/kgであることがさらにより好ましく、約0.2mg/kg〜約10mg/kgであることがなおいっそう好ましい。
投与回数は、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物の半減期にある程度依存する。3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物が短い半減期(例えば、約2〜10時間)を有する場合には、1日に1回以上投与することが必要であると考えられる。或いは、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物が長い半減期(例えば、約2〜約15日間)を有する場合には、1日に1回、1週間に1回、又は1か月若しくは2か月毎に1回でさえも投与することが必要であるに過ぎない。好ましい投与速度(dosage rate)は、上記投与量を対象に1日に1回投与することである。
同様に、本発明の方法で用いるCOX−2選択的阻害剤の量は、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物と共に投与する場合に、該組み合わせの有効量を構成するために充分であるような量でありうる。このような量が該組み合わせの治療有効量を提供するために充分であることが好ましい。該治療有効量は、該組み合わせの新生物治療又は予防有効量として、本明細書に記載しうる。
本発明の方法では、新規な治療方法に用いるCOX−2選択的阻害剤の量は、好ましくは、対象の体重1kgにつき約0.01〜約100mg/日(mg/日・kg)、より好ましくは約0.1〜約50mg/日・kg、さらにより好ましくは約1〜約20mg/日・kgの範囲である。
COX−2選択的阻害剤がロフェコキシブを含む場合に、用いる量が約0.15〜約1.0mg/日・kgの範囲内であることが好ましく、約0.18〜約0.4mg/日・kgであることがさらにより好ましい。
COX−2選択的阻害剤がエトリコキシブを含む場合に、用いる量が約0.5〜約5mg/日・kgの範囲内であることが好ましく、約0.8〜約4mg/日・kgであることがさらにより好ましい。
COX−2選択的阻害剤がセレコキシブを含む場合に、用いる量が約1〜約10mg/日・kgの範囲内であることが好ましく、約1.4〜約8.6mg/日・kgであることがさらにより好ましく、約2〜約3mg/日・kgであることがなおいっそう好ましい。
本発明の方法及び本発明の組成物では、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物をCOX−2選択的阻害剤と共に投与する、又は3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物をCOX−2選択的阻害剤と組み合わせる。対象に投与する3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物量のCOX−2選択的阻害剤量に対する重量比率は約0.0001:1から約2000:1までの範囲内であることが好ましく、約0.002:1から約1200:1までの範囲であることがより好ましく、約0.01:1から約1:1までの範囲であることがさらにより好ましい。
3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物とCOX−2選択的阻害剤との組み合わせは、新規な治療組成物の形態で供給することができ、この形態は本発明の範囲内であると考えられる。治療組成物の各成分の相対的量は変化することができ、直前に記載した通りでありうる。上述した3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物とCOX−2選択的阻害剤とは、各成分の好ましい量が例えば単一の投与、1回の注射若しくは単一のカプセルによって、又は4個まで若しくは4個より多くのの単一投与形によって供給されるように、治療組成物中に供与することができる。
該新規な組み合わせを薬学的に許容されるキャリヤー又は賦形剤と共に供給する場合には、薬剤組成物が形成される。本発明の薬剤組成物は、チロシンキナーゼ・シグナル伝達に関連する疾患の予防又は治療に適した組成物を目的とする。該薬剤組成物は、薬学的に許容されるキャリヤー、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤を含む。1つの好ましい実施態様では、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物は3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5416)である。
薬学的に許容される賦形剤は、生理食塩水、リンガー液、リン酸塩溶液若しくは緩衝液、緩衝化生理食塩水及び当該技術分野で知られた他のキャリヤーを包含するが、これらに限定されない。薬剤組成物はさらに、安定剤、酸化防止剤、着色剤及び希釈剤をも包含することができる。薬学的に許容されるキャリヤー及び添加剤は、薬剤化合物からの副作用が最少になり、該化合物の性能が、治療が無効になるような程度にまで、解消される又は阻害されることがないように選択される。
“薬理有効量(pharmacologically effective amount)”なる用語は、研究者又は臨床医が求めている、組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応を誘出するような、薬物又は薬剤の量を意味することになる。この量が治療有効量でありうる。
“薬学的に許容される”なる用語は、修飾された名詞が特定の医薬品に用いるために適当であることを意味するように、本明細書で用いられる。薬学的に許容されるカチオンは、金属イオン及び有機イオンを包含する。より好ましい金属イオンは、適当なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び他の生理的に許容される金属イオンを包含するが、これらに限定されない。典型的なイオンは、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛をそれらの通常の原子価で包含する。好ましい有機イオンは、プロトン化第3級アミン及び第4級アンモニウム・カチオンを包含し、一部には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、(N−メチルグルカミン)及びプロカインを包含する。典型的な、薬学的に許容される酸は、塩酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸等を包含するが、これらに限定されない。
本発明の組み合わせには、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤の異性体、互変異性体及び薬学的に許容される塩も包含される。具体的な薬学的に許容される塩は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸(mesylic acid)、ステアリン酸、サリチル酸、p−ヒドロキシル安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(embonic acid)(パモ酸(pamoic acid))、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸から調製される。
本発明の化合物の、薬学的に許容される適当な塩基付加塩は、金属イオン塩及び有機イオン塩を包含する。より好ましい金属イオン塩は、適当なアルカリ金属(Ia族)塩、アルカリ土類金属(IIa族)塩、及び他の生理的に許容される金属イオンを包含するが、これらに限定されない。このような塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛のイオンから製造されうる。好ましい有機塩は、第3級アミン及び第4級アンモニウム塩から製造されることができ、一部には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、(N−メチルグルカミン)及びプロカインを包含する。上記塩の全ては、当業者によって、本発明の対応化合物から慣用的な手段によって調製することができる。
“治療する(treating)”又は“治療すること(to treat)”なる用語は、症状を軽減する、一時的若しくは永久的な規模で原因を除去する、又は症状の発現を予防する若しくは遅延させることを意味する。“治療(treatment)”なる用語は、新生物の緩和、原因の除去又は新生物の予防を包含する。ヒトの治療のために有用であることの他に、これらの組み合わせは、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ等を含めた哺乳動物の治療のためにも有用である。
治療の目的のための“対象(subject)”なる用語は、特定の治療を必要とする、特に新生物の予防を必要とする、又はこのような障害に罹患している、任意のヒト又は動物の対象を包含する。該対象は、通常、ヒトである。“哺乳動物”なる用語は、本明細書で用いる限り、ヒト、家畜及び飼育場動物、並びに動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含めた哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、該哺乳動物はヒトである。
予防方法に関して、対象は任意のヒト又は動物対象であり、好ましくは、新生物の予防及び/又は治療を必要とする対象である。該対象は、例えば新生物のような障害又は状態について危険状態にあるヒト対象でありうる。該対象は、遺伝的素因、坐ることの多い生活様式、食事、障害誘導作用物質への露出、病原性作用物質への露出等によって危険状態にある可能性がある。
本発明の薬剤組成物は、経腸的に(enterally)又は非経口的に投与することができる。非経口的投与は、皮下、筋肉内、皮内、***内、静脈内、及び当該技術分野で知られた他の投与方法を包含する。経腸的投与は、溶液、錠剤、持続放出カプセル、腸溶性被覆カプセル及びシロップを包含する。投与したときに、該薬剤組成物は体温又はほぼ体温になりうる。
シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤とインドリノンとの使用の定義における“併用療法(combination therapy)”、“同時投与(co-administration)”、“一緒に投与(adminiration with)”又は“同時療法(co-therapy)”なるフレーズは、薬物組み合わせの有利な効果をもたらす投与計画において各作用物質を連続形式で投与することを包含するように意図され;例えば、これらの活性作用物質を一定比率で有する単一カプセル若しくは投与デバイスで、又は各作用物質の別々の複数カプセル若しくは投与デバイスでのように、これらの作用物質を実質的に同時形式で同時投与することも包含するように意図される、この場合、該別々のカプセル若しくは投与デバイスは同時に一緒に摂取されてもよく、該組み合わせの両方の成分作用物質からの有利な効果を受容するために充分な時間内に摂取されてもよい。
本発明の組み合わせは、3−ヘテロアリール−2−インドリノン成分及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤成分をそれぞれの成分の各々の有効時間内(within an effective time)に投与することを包含しうるが、それぞれの成分の両方を同時に投与することが好ましく、それぞれの成分の両方を単一デリバリー量(single delivery dose)として投与することがさらに好ましい。
特に、本発明の組み合わせは、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠(dragee)、トローチ剤、菱形剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、エマルジョン、硬質若しくは軟質カプセル剤、シロップ剤又はエリキシル剤として、経口投与することができる。経口用に意図された組成物は、薬剤組成物の製造のために当該技術分野で知られた任意の方法によって調製することができ、このような組成物は、薬剤的に的確で、口当たりの良い製剤を提供するために、甘味剤、フレーバー剤(flavoring agent)、着色剤及び保存剤から成る群から選択される1つ以上の作用物質を含有することができる。錠剤は、有効成分を、錠剤の製造に適した非毒性で薬学的に許容される賦形剤との混合物として含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム若しくはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤;例えば、トウモロコシ・デンプン若しくはアルギン酸のような、顆粒化剤及び崩壊剤;例えば、デンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムのような結合剤;及び例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクのような潤滑剤でありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、錠剤を既知手法によって被覆して、胃腸管内での崩壊及び吸着を遅延させ、それによって長期間にわたって持続作用を与えてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような時間遅延物質(time delay material)を用いることができる。
経口用の製剤はさらに、有効成分が不活性固体希釈剤(例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリン)と混合されている硬質ゼラチンカプセルとして、或いは有効成分がそれ自体として、又は水若しくは油媒質、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油との混合物として存在する軟質ゼラチンカプセルとしても提示されうる。
活性物質を水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として含有する水性懸濁液を製造することができる。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガムである;分散剤又は湿潤剤は、天然生成ホスファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトール・モノオレエート、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエートでありうる。
水性懸濁液はさらに、1種類以上の保存剤、例えば、エチル若しくはn−プロピルp−ヒドロキシベンゾエート、1種類以上の着色剤、1種類以上のフレーバー剤、又は1種類以上の甘味剤、例えばスクロース若しくはサッカリンを含有しうる。
油性懸濁液は、ω−3脂肪酸、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、胡麻油若しくはココナッツ油中に、又は鉱物油、例えば液体パラフィン中に有効成分を懸濁させることによって、処方することができる。該油性懸濁液は、増粘剤、例えば、みつろう、固形パラフィン(hard paraffin)又はセチルアルコールを含有することができる。
例えば上述したような甘味剤及びフレーバー剤を加えて、口当たりの良い製剤を提供することができる。これらの組成物は、例えばアスコルビン酸のような酸化防止剤の添加によって、保存することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤及び顆粒剤は、有効成分を、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤及び1種類以上の保存剤との混合物として供給する。適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述したものによって例示される。付加的な賦形剤、例えば、甘味剤、フレーバー剤及び着色剤も存在しうる。
該新規な組み合わせを含有するシロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトール又はスクロースを加えて処方することができる。このような製剤は、粘滑剤(demulcent)、保存剤、フレーバー剤及び着色剤をも含有することができる。
本発明の組み合わせは、非経口的に、皮下、若しくは静脈内、若しくは筋肉内、若しくは胸骨内のいずれかに、又は注入法によって、無菌水性若しくは油性懸濁液の形態で投与することができる。このような懸濁液は、上記に挙げたような、適当な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁化剤又は他の許容される作用物質を用いて、既知技術にしたがって処方することができる。無菌の注射可能な製剤はまた、例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液のように、非毒性で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液でもありうる。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液が存在する。さらに、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁化媒質として慣用的に用いられる。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを含めた、任意のブランドの不揮発性油を用いることができる。さらに、n−3ポリ不飽和脂肪酸を注射可能物質の調製に用いることができる。
本発明の組み合わせはさらに、エアゾール若しくはネブライザー用溶液として吸入によって投与してもよく、常温で固体であるが直腸温度では液体になり、そのために直腸内で溶融して薬物を放出する適当な無刺激性賦形剤と薬物を混合することによって調製される座薬として直腸投与してもよい。このような物質は、カカオ脂及びポリエチレングリコールである。
該新規な組成物はさらに、クリーム、軟膏、ゼリー、洗眼剤(collyrium)、溶液又は懸濁液として局所投与することができる。
1日投与量は、広い範囲内で変化することができ、各特定の場合に個々の必要条件に合わせて調節される。一般に、成人への投与について、適当な1日投与量は上述したが、好ましいとして同定した範囲は、必要に応じて超えてもよい。該1日投与量は、単一投与として又は分割投与量で投与することができる。
1日投与量は、広い範囲内で変化することができ、各特定の場合に個々の必要条件に合わせて調節される。一般に、成人への投与について、適当な1日投与量は上述したが、好ましいとして同定した範囲は、必要に応じて超えてもよい。該1日投与量は、単一投与として又は分割投与量で投与することができる。
種々なデリバリー系は、例えば、カプセル、錠剤及びゼラチン・カプセルを包含する。
本発明はさらに、上記したような新生物の治療又は予防方法の実施に用いるために適当であるキットを含む。1つの実施態様では、該キットは、3−ヘテロアリール−2−インドリノン又は関連化合物を含む第1投与形と、1種類以上のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む第2投与形とを、本発明の方法を実施するために充分な量で含有する。好ましくは、該第1投与形及び該第2投与形は一緒に、新生物の治療又は予防のための治療有効量の化合物を含む。
本発明はさらに、上記したような新生物の治療又は予防方法の実施に用いるために適当であるキットを含む。1つの実施態様では、該キットは、3−ヘテロアリール−2−インドリノン又は関連化合物を含む第1投与形と、1種類以上のシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む第2投与形とを、本発明の方法を実施するために充分な量で含有する。好ましくは、該第1投与形及び該第2投与形は一緒に、新生物の治療又は予防のための治療有効量の化合物を含む。
下記実施例は、本発明の実施態様を記載する。本明細書の特許請求の範囲内の他の実施態様は、本明細書に開示した本発明の明細又は実施の検討から、当業者に明らかであると思われる。該明細書は、実施例と共に、例示に過ぎないと見なすように意図され、本発明の範囲及び要旨は、実施例に続く特許請求の範囲によって表示される。
実施例1
一般的合成:
方法A
エタノール(1〜2ml/1mmolオキシインドール)中の適当なオキシインドール(2−インドリノン)(1当量)、適当なアルデヒド(1.2当量)及びピペリジン(0.1当量)の反応混合物を、90℃で3〜5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、目標化合物を得た。
一般的合成:
方法A
エタノール(1〜2ml/1mmolオキシインドール)中の適当なオキシインドール(2−インドリノン)(1当量)、適当なアルデヒド(1.2当量)及びピペリジン(0.1当量)の反応混合物を、90℃で3〜5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、目標化合物を得た。
方法B
Vismeier反応による適当なアルデヒドの調製. 1,2−ジクロロエタン(2.0ml/1.0mmol出発物質)中のN,N−ジメチルホルムアミド(1.2当量)の溶液に、オキシ塩化リン(1.2当量)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに30分間撹拌した。適当な出発物質(1.0当量)を上記溶液に少量ずつ(portionwise)加え、該反応混合物を50〜70℃で5時間〜2日間撹拌した。反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入し(混合後に、pH=9)、得られた混合物を室温において1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物を得た。
Vismeier反応による適当なアルデヒドの調製. 1,2−ジクロロエタン(2.0ml/1.0mmol出発物質)中のN,N−ジメチルホルムアミド(1.2当量)の溶液に、オキシ塩化リン(1.2当量)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに30分間撹拌した。適当な出発物質(1.0当量)を上記溶液に少量ずつ(portionwise)加え、該反応混合物を50〜70℃で5時間〜2日間撹拌した。反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入し(混合後に、pH=9)、得られた混合物を室温において1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物を得た。
3−置換−2−インドリノン類似体の合成. エタノール(1〜2ml、1mmolオキシインドール)中の適当なオキシインドール(2−インドリノン)(1当量)、適当なアルデヒド(1.2当量)及びピペリジン(0.1当量)の反応混合物を90℃で3.5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、目標化合物を得た。
3−ベンジリデン−2−インドリノン(SU4928)の合成
3−ベンジリデン−2−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである:メタノール2.0ml中のオキシインドール137.0mgの溶液に、ベンズアルデヒド123.2μlとピペリジン40μlを加える。この反応混合物を3時間還流させ、氷−水浴中で該混合物を冷却する。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、40℃のオーブン中で一晩乾燥させる。このようなプロトコールを用いて、化合物約129.0mgが得られた。
3−ベンジリデン−2−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである:メタノール2.0ml中のオキシインドール137.0mgの溶液に、ベンズアルデヒド123.2μlとピペリジン40μlを加える。この反応混合物を3時間還流させ、氷−水浴中で該混合物を冷却する。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、40℃のオーブン中で一晩乾燥させる。このようなプロトコールを用いて、化合物約129.0mgが得られた。
3−[(ピリダ−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5212)の合成
3−[(ピリダ−4−イル)メチレン]−2−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである:メタノール2.0ml中のオキシインドール138.0mgの溶液に、4−ピリジンカルボキサルデヒド(4-pyridinecarboxaldehyde)117.0μlとピペリジン40μlを加える。この反応混合物を3時間還流させ、氷−水浴中で冷却した。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、40℃のオーブン中で一晩乾燥させて、該化合物134.5mgを得た。
3−[(ピリダ−4−イル)メチレン]−2−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである:メタノール2.0ml中のオキシインドール138.0mgの溶液に、4−ピリジンカルボキサルデヒド(4-pyridinecarboxaldehyde)117.0μlとピペリジン40μlを加える。この反応混合物を3時間還流させ、氷−水浴中で冷却した。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、40℃のオーブン中で一晩乾燥させて、該化合物134.5mgを得た。
3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU4981)の合成(方法B):
4−(モルホリン−4−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン50ml中のN,N−ジメチルホルムアミド15mlの溶液に、オキシ塩化リン10mlを0℃で加えた。氷−水浴を除去し、反応混合物をさらに30分間撹拌した。上記溶液に4−フェニルモルホリン(16.3g)を少量ずつ加えて、反応混合物を2日間還流させた。トリエチルアミン(2.5ml)を上記反応混合物に加えて、この反応を2日間還流させた。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入し(混合後に、pH=9)、反応混合物を室温において1時間撹拌した。有機層を分離し、水層をジクロロメタン2x20mlで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物12.95g(68%)を白色固体として得た。
4−(モルホリン−4−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン50ml中のN,N−ジメチルホルムアミド15mlの溶液に、オキシ塩化リン10mlを0℃で加えた。氷−水浴を除去し、反応混合物をさらに30分間撹拌した。上記溶液に4−フェニルモルホリン(16.3g)を少量ずつ加えて、反応混合物を2日間還流させた。トリエチルアミン(2.5ml)を上記反応混合物に加えて、この反応を2日間還流させた。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入し(混合後に、pH=9)、反応混合物を室温において1時間撹拌した。有機層を分離し、水層をジクロロメタン2x20mlで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物12.95g(68%)を白色固体として得た。
3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU4981)
エタノール50ml中のオキシインドール6.66g、4−(モルホリン−4−イル)ベンズアルデヒド11.50g及びピペリジン5mlの反応混合物を90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物15.0g(98%)を黄色固体として得た。
エタノール50ml中のオキシインドール6.66g、4−(モルホリン−4−イル)ベンズアルデヒド11.50g及びピペリジン5mlの反応混合物を90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物15.0g(98%)を黄色固体として得た。
3−[4−(4−ホルミルピペラジン−イル)ベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4984)の合成(方法B):
4−(4−ホルミルピペラジン−1−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン20ml中のN,N−ジメチルホルムアミド3.9ml(30mmol)の溶液に、オキシ塩化リン3.0ml(3.9mmol)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに15分間撹拌した。1−フェニルピペラジン(16.0g、10mmol)を溶液に少量ずつ加え、反応混合物を50℃で1時間撹拌した。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル20mlで2回抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの混合物で溶出して、標題化合物9.0g(41%)を淡黄色固体として得た。
4−(4−ホルミルピペラジン−1−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン20ml中のN,N−ジメチルホルムアミド3.9ml(30mmol)の溶液に、オキシ塩化リン3.0ml(3.9mmol)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに15分間撹拌した。1−フェニルピペラジン(16.0g、10mmol)を溶液に少量ずつ加え、反応混合物を50℃で1時間撹拌した。この反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル20mlで2回抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの混合物で溶出して、標題化合物9.0g(41%)を淡黄色固体として得た。
3−[4−(4−ホルミルピペラジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU4984)
エタノール2ml中のオキシインドール133.15mg、4−(ピペラジン−イル)ベンズアルデヒド228.3mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物199.5mg(65%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール133.15mg、4−(ピペラジン−イル)ベンズアルデヒド228.3mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物199.5mg(65%)を黄色固体として得た。
3−[4−(ピペリジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5450)の合成(方法B)
4−(ピペリジン−1−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン10ml中のN,N−ジメチルホルムアミド2.3ml(mmol)の溶液に、オキシ塩化リン2.8ml(30mmol)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物を15分間撹拌した。1−フェニルピペリジン(3.2ml、20mmol)を上記溶液に少量ずつ加え、反応混合物を一晩還流させた。この反応混合物を氷冷2N水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル2x20mlで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとで溶出して、標題化合物1.5g(40%)を白色固体として得た。
4−(ピペリジン−1−イル)ベンズアルデヒド. 1,2−ジクロロエタン10ml中のN,N−ジメチルホルムアミド2.3ml(mmol)の溶液に、オキシ塩化リン2.8ml(30mmol)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物を15分間撹拌した。1−フェニルピペリジン(3.2ml、20mmol)を上記溶液に少量ずつ加え、反応混合物を一晩還流させた。この反応混合物を氷冷2N水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル2x20mlで抽出した。一緒にした有機層をブラインでpH=7になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとで溶出して、標題化合物1.5g(40%)を白色固体として得た。
3−[4−(ピペリジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5450)
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、4−(ピペリジン−1−イル)ベンズアルデヒド226.8mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物268.5mg(88%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、4−(ピペリジン−1−イル)ベンズアルデヒド226.8mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で5時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物268.5mg(88%)を黄色固体として得た。
3−[2−クロロ−4−メトキシベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5480)の合成
2−クロロ−4−メトキシベンズアルデヒド. N,N−ジメチルホルムアミド10ml中の2−クロロ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド1.0g(6.4mmol)、炭酸カリウム4.4g(32mmol)及びヨウ化メチル1.4g(9.6mmol)の反応混合物を、70℃で2時間撹拌して、氷水中に注入した。沈殿を濾過し、水で洗浄して、真空オーブン中、40℃で一晩乾燥させて、標題化合物750mg(68%)を薄いピンク色固体として得た。
2−クロロ−4−メトキシベンズアルデヒド. N,N−ジメチルホルムアミド10ml中の2−クロロ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド1.0g(6.4mmol)、炭酸カリウム4.4g(32mmol)及びヨウ化メチル1.4g(9.6mmol)の反応混合物を、70℃で2時間撹拌して、氷水中に注入した。沈殿を濾過し、水で洗浄して、真空オーブン中、40℃で一晩乾燥させて、標題化合物750mg(68%)を薄いピンク色固体として得た。
3−[2−クロロ−4−メトキシベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5480)
エタノール5ml中のオキシインドール487.9mg(3.7mmol)、2−クロロ−4−メトキシベンズアルデヒド750mg(4.3mmol)及びピペリジン4滴の反応混合物を、90℃で2時間加熱し、室温に冷却した。黄色沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、真空オーブン中、40℃で一晩乾燥させて、標題化合物680.2mg(62%)を得た。
エタノール5ml中のオキシインドール487.9mg(3.7mmol)、2−クロロ−4−メトキシベンズアルデヒド750mg(4.3mmol)及びピペリジン4滴の反応混合物を、90℃で2時間加熱し、室温に冷却した。黄色沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、真空オーブン中、40℃で一晩乾燥させて、標題化合物680.2mg(62%)を得た。
3−[(4−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5401)の合成
エタノール3ml中のオキシインドール133.0mg、4−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.2mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物147.3mg(61%)を黄色固体として得た。
エタノール3ml中のオキシインドール133.0mg、4−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.2mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物147.3mg(61%)を黄色固体として得た。
3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5404)の合成
エタノール2ml中のオキシインドール133.0mg、3−メチルピロール−2−カルボキサルデヒド130.9mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物150.9mg(67%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール133.0mg、3−メチルピロール−2−カルボキサルデヒド130.9mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物150.9mg(67%)を黄色固体として得た。
3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5406)の合成
3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンをJ.Heterocyclic Chem.13:1145-1147(1976)に記載されているように合成した。
3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンをJ.Heterocyclic Chem.13:1145-1147(1976)に記載されているように合成した。
エチル4−メチルピロール−3−カルボキシレート. 2:1エーテル/ジメチルスルホキシド500ml中のエチルクロトネート11.86g(0.1mol)とp−トルエンスルホニルメチルイソシアニド19.50g(0.1mol)との溶液を、エーテル中の水素化ナトリウム6.8gの懸濁液(60%鉱油分散液、0.17mol)中に室温で滴加した。添加の完了時に、反応混合物を30分間撹拌し、水400mlで希釈した。水層をエーテル3x100mlで抽出した。一緒にしたエーテル抽出物をアルミナ・カラムに通過させ、該カラムをジクロロメタンで溶出した。有機溶媒を蒸発させ、得られた残渣は放置すると凝固した。該固体をヘキサンで洗浄して、真空オーブン中、40℃で一晩乾燥させて、標題化合物12.38g(80%)を得た。
3,4−ジメチルピロールの調製. ナトリウムジヒドロビス(2−メトキシエトキシアルミネート)23g(80mmol)の溶液に、窒素雰囲気下、室温で、ベンゼン50ml中のエチル4−メチルピロール−3−カルボキシレート5g(34mmol)の溶液を滴加した。この反応混合物を18時間撹拌した。この反応混合物に水(100ml)を加えた。有機層を分離して、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去して、残渣を蒸留して、標題化合物1.2g(44%)を得た。
3,4−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒドの調製. 1,2−ジクロロエタン ml中のN,N−ジメチルホルムアミド0.92ml(12mmol)の溶液に、オキシ塩化リン1.0ml(12mmol)を0℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに30分間撹拌した。上記溶液に、3,4−ジメチルピロール(960.0mg、10mmol)を少量ずつ加え、反応混合物を50℃で5時間撹拌した。反応混合物を氷冷1N水酸化ナトリウム溶液中に注入し(混合後に、pH=9)、反応混合物を室温で1時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をpH=7になるまでブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物610mg(50%)を得た。
3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5406)
2中のオキシインドール67.0mg(0.5mmol)、3,4−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド73.0mg(0.6mmol)及びピペリジン2滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物87.7mg(37%)を黄色固体として得た。
2中のオキシインドール67.0mg(0.5mmol)、3,4−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド73.0mg(0.6mmol)及びピペリジン2滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物87.7mg(37%)を黄色固体として得た。
3−[(2,4−ジメチル−3−エトキシカルボニルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5408)の合成
エタノール3ml中のオキシインドール134.0mg、4−エトキシカルボニル−3,5−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド234.3mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物244.6mg(79%)を黄色固体として得た。
エタノール3ml中のオキシインドール134.0mg、4−エトキシカルボニル−3,5−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド234.3mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物244.6mg(79%)を黄色固体として得た。
3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5416)の合成
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、3,5−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド147.8mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物136.7mg(57%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、3,5−ジメチルピロール−2−カルボキサルデヒド147.8mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物136.7mg(57%)を黄色固体として得た。
3−[(2−メチルメルカプトチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5419)の合成
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、5−メチルメルカプトチオフェン−2−カルボキサルデヒド189.9mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物246.6mg(90%)を橙色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、5−メチルメルカプトチオフェン−2−カルボキサルデヒド189.9mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物246.6mg(90%)を橙色固体として得た。
3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5424)の合成
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、5−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.42mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物237.8mg(99%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、5−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.42mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物237.8mg(99%)を黄色固体として得た。
3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5427)の合成
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、3−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.4mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物157.8mg(65%)を黄色固体として得た。
エタノール2ml中のオキシインドール134.0mg、3−メチルチオフェン−2−カルボキサルデヒド151.4mg及びピペリジン3滴の反応混合物を、90℃で3時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物157.8mg(65%)を黄色固体として得た。
3−(2,5−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4793)の合成
3−(2,5−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2,5−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2,3−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4794)の合成
3−(2,3−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2,3−ジメトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(3−ブロモ−6−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4796)の合成
3−(3−ブロモ−6−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(3−ブロモ−6−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[4−(4−t−ブチルカルボニル−ピペラジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5393)の合成
3−[4−(4−t−ブチルカルボニル−ピペラジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[4−(4−t−ブチルカルボニル−ピペラジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU4798)の合成
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−アセトアミドベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4799)の合成
3−(4−アセトアミドベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−アセトアミドベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4799)の合成
3−(4−アセトアミドベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−クロロ−4−ヒドロキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4932)の合成
3−(2−クロロ−4−ヒドロキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−クロロ−4−ヒドロキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4942)の合成
3−(4−ブロモベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−アセチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4944)の合成
3−(4−アセチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−アセチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4944)の合成
3−(4−アセチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4949)の合成
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノン(SU4952)の合成
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノン(SU4952)の合成
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4312)の合成
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンは、MNaybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンは、MNaybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノン(SU4956)の合成
3−(4−ブロモベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−1−メチル−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4967)の合成
5−クロロ−3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−(4−ジメチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−5−クロロ−2−インドリノン(SU4972)の合成
3−(4−ブロモベンジリデニル)−5−クロロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ブロモベンジリデニル)−5−クロロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジエチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4978)の合成
3−(4−ジエチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジエチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジ−n−ブチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4979)の合成
3−(4−ジ−n−ブチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−ジ−n−ブチルアミノベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
1−メチル−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU4982)の合成
1−メチル−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
1−メチル−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
5−クロロ−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU4983)の合成
5−クロロ−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
5−クロロ−3−[4−(モルホリン−4−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−(3,4−ジクロロベンジリデニル)−2−インドリノン(SU5201)の合成
3−(3,4−ジクロロベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(3,4−ジクロロベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−エトキシベンジリデニル)−2−インドリノン(SU5204)の合成
3−(2−エトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−フルオロベンジリデニル)−2−インドリノン(SU5205)の合成
3−(4−フルオロベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−エトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−フルオロベンジリデニル)−2−インドリノン(SU5205)の合成
3−(4−フルオロベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンの合成(SU5208)
3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンの合成
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンの合成
3−(2−メトキシベンジリデニル)−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2−[(3,5−ジ−(トリフルオロメチル)フェニル)フラン−5−イル]メチレン]−2−インドリノン(SU5217)の合成
3−[2−[(3,5−ジ−(トリフルオロメチル)フェニル)フラン−5−イル]メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2−[(3,5−ジ−(トリフルオロメチル)フェニル)フラン−5−イル]メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
2,6−ジ−(ジメチルアミノ)−3,5−ジ−[(インドリン−2−オン−3−イリデニル)メチル]−フェニルシアニド(SU5218)の合成
2,6−ジ−(ジメチルアミノ)−3,5−ジ−[(インドリン−2−オン−3−イリデニル)メチル]−フェニルシアニドを方法Aによって合成する。
2,6−ジ−(ジメチルアミノ)−3,5−ジ−[(インドリン−2−オン−3−イリデニル)メチル]−フェニルシアニドを方法Aによって合成する。
3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5402)の合成
3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法 によって合成する。
3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法 によって合成する。
3−[(3,4−ジブロモ−5−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5403)の合成
3−[(3,4−ジブロモ−5−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(3,4−ジブロモ−5−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(3,4−ジメチル−2−ホルミルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5405)の合成
3−[(3,4−ジメチル−2−ホルミルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3,4−ジメチル−2−ホルミルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル]メチレン}−2−インドリノン(SU5407)の合成
3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル]メチレン}−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル]メチレン}−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ヨードフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5409)の合成
3−[(2−ヨードフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ヨードフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−エトキシカルボニル−2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5410)の合成
3−[(3−エトキシカルボニル−2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−エトキシカルボニル−2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5418)の合成
3−[(3−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−クロロチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5420)の合成
3−[(2−クロロチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−クロロチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2,3−ジメチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5421)の合成
3−[(2,3−ジメチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2,3−ジメチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−ニトロチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5422)の合成
3−[(5−ニトロチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−ニトロチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−カルボキシチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5423)の合成
3−[(2−カルボキシチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−カルボキシチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ブロモチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5425)の合成
3−[(2−ブロモチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ブロモチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5426)の合成
3−[(4−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−ブロモチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−スルホニルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン・ナトリウム塩(SU5428)の合成
3−[(2−スルホニルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン・ナトリウム塩を方法Aによって合成する。
3−[(2−スルホニルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン・ナトリウム塩を方法Aによって合成する。
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5429)の合成
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5430)の合成
3−[(2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(フラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5430)の合成
3−[(2−メチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−エチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5431)の合成
3−[(2−エチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−エチルフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ニトロフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5432)の合成
3−[(2−ニトロフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−ニトロフラン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−ブロモフラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5438)の合成
3−[(5−ブロモフラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−ブロモフラン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−エチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5451)の合成
3−[(2−エチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(2−エチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5453)の合成
3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エトキシカルボニル−4−エトキシカルボニルエチル−3−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5454)の合成
3−[(5−エトキシカルボニル−4−エトキシカルボニルエチル−3−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エトキシカルボニル−4−エトキシカルボニルエチル−3−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−カルボキシ−3−エチル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5455)の合成
3−[(5−カルボキシ−3−エチル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを によって合成する。
3−[(5−カルボキシ−3−エチル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを によって合成する。
3−[(3,5−ジヨード−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5456)の合成
3−[(3,5−ジヨード−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3,5−ジヨード−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−クロロ−3−メトキシカルボニル−4−メトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5459)の合成
3−[(5−クロロ−3−メトキシカルボニル−4−メトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−クロロ−3−メトキシカルボニル−4−メトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−アセチル−5−エトキシカルボニル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5460)の合成
3−[(3−アセチル−5−エトキシカルボニル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−アセチル−5−エトキシカルボニル−4−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−{[1−(3,5−ジクロロフェニル)ピロル−2−イル]メチレン}−2−インドリノン(SU5461)の合成
3−{[1−(3,5−ジクロロフェニル)ピロル−2−イル]メチレン}−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−{[1−(3,5−ジクロロフェニル)ピロル−2−イル]メチレン}−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[1−(4−クロロフェニル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5462)の合成
3−[1−(4−クロロフェニル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[1−(4−クロロフェニル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−エトキシカルボニル−3−メチル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5463)の合成
3−[(4−エトキシカルボニル−3−メチル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−エトキシカルボニル−3−メチル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5464)の合成
3−[(1−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エトキシカルボニル−3−エトキシカルボニルエチル−4−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5465)の合成
3−[(5−エトキシカルボニル−3−エトキシカルボニルエチル−4−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エトキシカルボニル−3−エトキシカルボニルエチル−4−エトキシカルボニルメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[4−(ピロリジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5466)の合成
3−[4−(ピロリジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[4−(ピロリジン−1−イル)ベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5468)の合成
3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルチアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5469)の合成
3−[(5−メチルチアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルチアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5472)の合成
3−[(3−メチルピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5473)の合成
3−[(イミダゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−クロロピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5474)の合成
3−[(4−クロロピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−クロロピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−ブロモ−1−(4−クロロベンジル)ピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5475)の合成
3−[(4−ブロモ−1−(4−クロロベンジル)ピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−ブロモ−1−(4−クロロベンジル)ピラゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−クロロ−1−メチルピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5476)の合成
3−[(4−クロロ−1−メチルピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−クロロ−1−メチルピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(4−エチル−3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5477)の合成
3−[(4−エチル−3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(4−エチル−3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(5−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5478)の合成
3−[(5−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[(5−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[3,5−ジメチル−4−(プロペン−2−イル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5479)の合成
3−[3,5−ジメチル−4−(プロペン−2−イル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
3−[3,5−ジメチル−4−(プロペン−2−イル)ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Bによって合成する。
5,6−ジメトキシ−3−[2,3−ジメトキシベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5495)の合成
5,6−ジメトキシ−3−[2,3−ジメトキシベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5,6−ジメトキシ−3−[2,3−ジメトキシベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2,4,6−トリメトキシベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5607)の合成
3−[2,4,6−トリメトキシベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2,4,6−トリメトキシベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5612)の合成
5−クロロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5613)の合成
5−クロロ−3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−(4−イソプロピルベンジリデニル)−2−インドリノン(SU4313)の合成
3−(4−イソプロピルベンジリデニル)−2−インドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
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5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5614)の合成
5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU4314)の合成
3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
5−クロロ−3−[(インドル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5615)の合成
5−クロロ−3−[(インドル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(インドル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5616)の合成
5−クロロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5617)の合成
5−クロロ−3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5618)の合成
5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5619)の合成
5−クロロ−3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5620)の合成
5−クロロ−3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5621)の合成
5−クロロ−3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−クロロ−3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2,4−ジメトキシ−6−メチルベンジリデニル]−2−インドリノン(SU5623)の合成
3−[2,4−ジメトキシ−6−メチルベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[2,4−ジメトキシ−6−メチルベンジリデニル]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−ニトロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5624)の合成
5−ニトロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−ニトロ−3−[(ピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5625)の合成
3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5626)の合成
3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(インドル−3−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5627)の合成
3−[(インドル−3−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(インドル−3−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−ニトロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(SU5628)の合成
5−ニトロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
5−ニトロ−3−[(チエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5629)の合成
3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5630)の合成
3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5631)の合成
3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−エチルチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5632)の合成
3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−メチルメルカプトチエン−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン(SU5633)の合成
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7127)の合成
3−[(オキサゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7128)の合成
3−[(オキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7129)の合成
3−[(オキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(オキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7130)の合成
3−[(チアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7131)の合成
3−[(チアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7132)の合成
3−[(チアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(チアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7133)の合成
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(ピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7135)の合成
3−[(ピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(ピラゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(ピラゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7136)の合成
3−[(ピラゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(ピラゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7137)の合成
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7138)の合成
3−[(イソオキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7139)の合成
3−[(イソオキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7140)の合成
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソチアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7141)の合成
3−[(イソオキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソチアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7142)の合成
3−[(イソオキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(イソオキサゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1,2,3−トリアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7143)の合成
3−[(1,2,3−トリアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1,2,3−トリアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1,3,4−トリアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7144)の合成
3−[(1,3,4−トリアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(1,3,4−トリアゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7145)の合成
3−[(5−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(5−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−3−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7146)の合成
3−[(3−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−フェニル−1,2,4−オキサジアゾル−5−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−フェニル−1,2,5−オキサジアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノン(CS7147)の合成
3−[(3−フェニル−1,2,5−オキサジアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
3−[(3−フェニル−1,2,5−オキサジアゾル−4−イル)メチレン]−2−インドリノンを方法Aによって合成する。
実施例2
in vitro RTKアッセイ
下記in vitroアッセイを用いて、1つ以上のRTKに対する本発明の種々な化合物の活性及び効果のレベルを測定することができる。同様なアッセイを、当該技術分野で周知の手法を用いて、任意のチロシンキナーゼに対する同じ系統に沿って設計することができる。
in vitro RTKアッセイ
下記in vitroアッセイを用いて、1つ以上のRTKに対する本発明の種々な化合物の活性及び効果のレベルを測定することができる。同様なアッセイを、当該技術分野で周知の手法を用いて、任意のチロシンキナーゼに対する同じ系統に沿って設計することができる。
酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)
酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、チロシン・キナーゼ活性の存在を検出し、測定することができる。ELISAは、例えば、Voller, et al.,1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,": Manual of Clinical Immunology, 第2版 , Rose 及びFriedman編集、359-371頁 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.に記載されている既知プロトコールに従って行なうことができる。
酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、チロシン・キナーゼ活性の存在を検出し、測定することができる。ELISAは、例えば、Voller, et al.,1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,": Manual of Clinical Immunology, 第2版 , Rose 及びFriedman編集、359-371頁 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.に記載されている既知プロトコールに従って行なうことができる。
開示されたプロトコールを、特定のRTKに対する活性の測定に適応させることができる。例えば、特定のRTKsに対するELISA実験を行なうための好ましいプロトコールを以下に提供する。RTKファミリーの他のメンバー並びに非受容体チロシンキナーゼに対する化合物の活性を測定するためにこれらのプロトコールを適応させることは、当業者の範囲内である。
FLK−1ELISA
FLK−1受容体のキナーゼ活性、より具体的には、FLK−1受容体に対するタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害又は活性化を測定するために、ELISAアッセイを行なった。詳しくは、下記アッセイを行なって、FLK−1/NIH3T3細胞におけるFLK−1受容体のキナーゼ活性を測定した。
FLK−1受容体のキナーゼ活性、より具体的には、FLK−1受容体に対するタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害又は活性化を測定するために、ELISAアッセイを行なった。詳しくは、下記アッセイを行なって、FLK−1/NIH3T3細胞におけるFLK−1受容体のキナーゼ活性を測定した。
物質と方法
物質.下記試薬及び購入品を用いた:
a.Corning 96穴ELISAプレート(Corning Catalog No. 25805-96);
b.Cappel ヤギ抗ウサギIgG(catalog no. 55641);
c.PBS(Gibco Catalog No. 450-1300EB);
d.TBSWバッファー(50mM Tris(pH7.2)、150mM NaCl 及び0.1%Tween20);
e.エタノールアミン・ストック(10%エタノールアミン(pH7.0)、4℃で貯蔵);
f.HNTGバッファー(20mM HEPESバッファー(pH7.5)、150mM NaCl、0.2%Triton X−100、及び10%グリセロール);
g.EDTA(0.5M(pH7.0)、100Xストックとして);
h.オルト・バナジン酸ナトリウム(100Xストックとして、0.5M);
i.ピロリン酸ナトリウム(100Xストックとして、0.2M);
j.NUNC 96穴V底ポリプロピレン・プレート (Applied Scientific Catalog No. AS-72092);
k.NIH3T3 C7#3細胞(FLK−1発現細胞);
l.1X高グルコースLグルタミンを含むDMEM(catalog No.11965-050);
m.FBS,Gico(catalog no.16000-028);
n.L−グルタミン、Gibco(catalog no.25030-016);
o.VEGF、PeproTech, Inc. (catalog no. 100-20) (Milli-Q dH2O 中1μg/100μlストックとして維持、−20℃で貯蔵)。アフィニティ精製抗FLK−1抗血清、Enzymology Lab, Sugen, Inc.;
q.ホスホチロシンに特異的なUB40モノクローナル抗体、Enzymology Lab, Sugen, Inc. (Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558参照);
r.EIAグレード・ヤギ抗マウスIgG−POD(BioRad catalog no. 172-1011);
s.2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンズ−チアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)溶液(100mMクエン酸(無水)、250mM Na2HPO4(pH4.0)、0.5mg/mlABTS(Sigma catalog no.A-1888)、溶液は、使用の準備ができるまで、暗所で4℃において貯蔵すべきである;
t.H2O2(30%溶液)(Fisher catalog no.H325);
u.ABTS/H2O2(15mlABTS溶液、2μlH2O2)、使用の5分間前に調製して、室温に放置する;
v.H2O中0.2M HClストック;
w.ジメチルスルホキシド(100%)(Sigma Catalog No.D-8418);及び
y.トリプシン−EDTA(Gibco BRL Catalog No.25200-049)。
物質.下記試薬及び購入品を用いた:
a.Corning 96穴ELISAプレート(Corning Catalog No. 25805-96);
b.Cappel ヤギ抗ウサギIgG(catalog no. 55641);
c.PBS(Gibco Catalog No. 450-1300EB);
d.TBSWバッファー(50mM Tris(pH7.2)、150mM NaCl 及び0.1%Tween20);
e.エタノールアミン・ストック(10%エタノールアミン(pH7.0)、4℃で貯蔵);
f.HNTGバッファー(20mM HEPESバッファー(pH7.5)、150mM NaCl、0.2%Triton X−100、及び10%グリセロール);
g.EDTA(0.5M(pH7.0)、100Xストックとして);
h.オルト・バナジン酸ナトリウム(100Xストックとして、0.5M);
i.ピロリン酸ナトリウム(100Xストックとして、0.2M);
j.NUNC 96穴V底ポリプロピレン・プレート (Applied Scientific Catalog No. AS-72092);
k.NIH3T3 C7#3細胞(FLK−1発現細胞);
l.1X高グルコースLグルタミンを含むDMEM(catalog No.11965-050);
m.FBS,Gico(catalog no.16000-028);
n.L−グルタミン、Gibco(catalog no.25030-016);
o.VEGF、PeproTech, Inc. (catalog no. 100-20) (Milli-Q dH2O 中1μg/100μlストックとして維持、−20℃で貯蔵)。アフィニティ精製抗FLK−1抗血清、Enzymology Lab, Sugen, Inc.;
q.ホスホチロシンに特異的なUB40モノクローナル抗体、Enzymology Lab, Sugen, Inc. (Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558参照);
r.EIAグレード・ヤギ抗マウスIgG−POD(BioRad catalog no. 172-1011);
s.2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンズ−チアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)溶液(100mMクエン酸(無水)、250mM Na2HPO4(pH4.0)、0.5mg/mlABTS(Sigma catalog no.A-1888)、溶液は、使用の準備ができるまで、暗所で4℃において貯蔵すべきである;
t.H2O2(30%溶液)(Fisher catalog no.H325);
u.ABTS/H2O2(15mlABTS溶液、2μlH2O2)、使用の5分間前に調製して、室温に放置する;
v.H2O中0.2M HClストック;
w.ジメチルスルホキシド(100%)(Sigma Catalog No.D-8418);及び
y.トリプシン−EDTA(Gibco BRL Catalog No.25200-049)。
プロトコール. アッセイの実施に下記プロトコールを用いた:
1.Corning96穴ELISAプレートに、0.1M Na2CO3(pH9.6)中のCappel抗ウサギIgG抗体1.0μg/穴を被覆する。最終量を150μl/穴にする。プレートを4℃で一晩被覆する。4℃で貯蔵した場合に、プレートを2週間まで維持することができる。
2.適当な培養皿において増殖培地(2.0mML−グルタミン、10%FBSを補充したDMEM)中で細胞を、37℃、5%CO2で集密になるまで、増殖させる。
3.トリプシン処理によって細胞を回収し、Corning 25850ポリスチレン96穴丸底細胞プレートに、増殖培地200μl中25,000細胞/穴で接種する。
4.細胞を37℃、5%CO2で少なくとも1日間増殖させる。
5.細胞をD−PBS 1Xで洗浄する。
6.スターベーション培地(DMEM、2.0mMl−グルタミン 0.1%FBS)200μl/穴を加えて、37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。
7.ポリプロピレン96穴プレート中で、スターベーション培地を用いて、化合物/抽出物を1:20に希釈する。対照穴に用いるためにジメチルスルホキシドを1:20に希釈する。
8.スターベーション培地を96穴細胞培養プレートから除去して、各穴に新鮮なスターベーション培地162μlを加える。
9.細胞刺戟後の1:200の最終希釈のために、1:20希釈した化合物/抽出物希釈物(工程7から)18μlを各穴に加え、さらに、対照穴(+/−VEGF)に1:20ジメチルスルホキシド希釈物を加える
10.プレートを反転させて、液体を除去することによって、ELISAプレートから未結合抗体を除去する。TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)によって3回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽く叩いて、過剰な液体及び泡を除去する。
11.プレートをTBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)150μl/穴でブロックする。プレートを、マイクロタイター・プレート・シェーカー上で振とうしながら、30分間インキュベートする。
12.プレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
13.アフィニティ精製抗FLU−1ポリクローナル・ウサギ抗血清0.5μg/穴を加える。TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)によって、最終量を150μl/穴にする。プレートを振とうしながら30分間インキュベートする。
14.細胞にスターベーション培地180μlを加え、10.0mMオルトバナジン酸ナトリウム20μl/穴とVEGF500ng/mlとによって、37℃、5%CO2において8分間、細胞を刺激する(最終濃度は1.0mM オルトバナジン酸ナトリウム及び50ng/ml VEGF/穴となる)。負の対照穴には、スターベーション培地のみを加える。
15.8分間後に、培地を細胞から取り出し、PBS200μl/穴で1回洗浄する。
16.室温で5分間振とうしながら、HNTG150μl/穴中で細胞を溶解する。HNTG製剤はオルトバナジン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム及びEDTAを包含する。
17.ELISAプレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
18.細胞溶解物(cell lysate)を細胞プレートからELISAプレートに移し、2時間振とうしながらインキュベートする。細胞溶解物を移すためには、穴をこすりながら、ピペットを上下させる。
19.プレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
20.TBSW+0.5%エタノールアミン中のUB40 0.02μg/穴を加えて、ELISAプレートをインキュベートする。最終量を150μl/穴にする。30分間振とうしながら、インキュベートする。
21.プレートを、工程10に記載したように、3回洗浄する。
22.TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)中の1:10,000希釈EIAグレードヤギ抗マウスIgGコンジュゲート・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加えて、ELISAプレートをインキュベートする。最終量を150μl/穴にする。30分間振とうしながら、インキュベートする。
23.プレートを工程10に記載したように洗浄する。
24.ABTS/H2O2 100μlを穴に加える。振とうしながら、10分間インキュベートする。
25.発色反応を停止させるために、最終0.1M HClにするように0.2M HCl 100μlを加える。室温において1分間振とうする。ゆっくりとした空気流で泡を除去し、ELISAプレート・リーダーにおいて410nmでELISAプレートを読み取る。
1.Corning96穴ELISAプレートに、0.1M Na2CO3(pH9.6)中のCappel抗ウサギIgG抗体1.0μg/穴を被覆する。最終量を150μl/穴にする。プレートを4℃で一晩被覆する。4℃で貯蔵した場合に、プレートを2週間まで維持することができる。
2.適当な培養皿において増殖培地(2.0mML−グルタミン、10%FBSを補充したDMEM)中で細胞を、37℃、5%CO2で集密になるまで、増殖させる。
3.トリプシン処理によって細胞を回収し、Corning 25850ポリスチレン96穴丸底細胞プレートに、増殖培地200μl中25,000細胞/穴で接種する。
4.細胞を37℃、5%CO2で少なくとも1日間増殖させる。
5.細胞をD−PBS 1Xで洗浄する。
6.スターベーション培地(DMEM、2.0mMl−グルタミン 0.1%FBS)200μl/穴を加えて、37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。
7.ポリプロピレン96穴プレート中で、スターベーション培地を用いて、化合物/抽出物を1:20に希釈する。対照穴に用いるためにジメチルスルホキシドを1:20に希釈する。
8.スターベーション培地を96穴細胞培養プレートから除去して、各穴に新鮮なスターベーション培地162μlを加える。
9.細胞刺戟後の1:200の最終希釈のために、1:20希釈した化合物/抽出物希釈物(工程7から)18μlを各穴に加え、さらに、対照穴(+/−VEGF)に1:20ジメチルスルホキシド希釈物を加える
10.プレートを反転させて、液体を除去することによって、ELISAプレートから未結合抗体を除去する。TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)によって3回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽く叩いて、過剰な液体及び泡を除去する。
11.プレートをTBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)150μl/穴でブロックする。プレートを、マイクロタイター・プレート・シェーカー上で振とうしながら、30分間インキュベートする。
12.プレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
13.アフィニティ精製抗FLU−1ポリクローナル・ウサギ抗血清0.5μg/穴を加える。TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)によって、最終量を150μl/穴にする。プレートを振とうしながら30分間インキュベートする。
14.細胞にスターベーション培地180μlを加え、10.0mMオルトバナジン酸ナトリウム20μl/穴とVEGF500ng/mlとによって、37℃、5%CO2において8分間、細胞を刺激する(最終濃度は1.0mM オルトバナジン酸ナトリウム及び50ng/ml VEGF/穴となる)。負の対照穴には、スターベーション培地のみを加える。
15.8分間後に、培地を細胞から取り出し、PBS200μl/穴で1回洗浄する。
16.室温で5分間振とうしながら、HNTG150μl/穴中で細胞を溶解する。HNTG製剤はオルトバナジン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム及びEDTAを包含する。
17.ELISAプレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
18.細胞溶解物(cell lysate)を細胞プレートからELISAプレートに移し、2時間振とうしながらインキュベートする。細胞溶解物を移すためには、穴をこすりながら、ピペットを上下させる。
19.プレートを工程10に記載したように3回洗浄する。
20.TBSW+0.5%エタノールアミン中のUB40 0.02μg/穴を加えて、ELISAプレートをインキュベートする。最終量を150μl/穴にする。30分間振とうしながら、インキュベートする。
21.プレートを、工程10に記載したように、3回洗浄する。
22.TBSW+0.5%エタノールアミン(pH7.0)中の1:10,000希釈EIAグレードヤギ抗マウスIgGコンジュゲート・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加えて、ELISAプレートをインキュベートする。最終量を150μl/穴にする。30分間振とうしながら、インキュベートする。
23.プレートを工程10に記載したように洗浄する。
24.ABTS/H2O2 100μlを穴に加える。振とうしながら、10分間インキュベートする。
25.発色反応を停止させるために、最終0.1M HClにするように0.2M HCl 100μlを加える。室温において1分間振とうする。ゆっくりとした空気流で泡を除去し、ELISAプレート・リーダーにおいて410nmでELISAプレートを読み取る。
HER−2ELISA
アッセイ1:全細胞(whole cell)でのEGF受容体−HER2キメラ受容体アッセイ.全EGFR−NIH3T3細胞におけるHER2キナーゼ活性を、以下に記載するように測定した。
アッセイ1:全細胞(whole cell)でのEGF受容体−HER2キメラ受容体アッセイ.全EGFR−NIH3T3細胞におけるHER2キナーゼ活性を、以下に記載するように測定した。
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いて、アッセイを行なった:
a.EGF:ストック濃度=16.5ILM;EGF201;TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
b.05−101(UBI)(EGFR細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体)。
c.抗ホスホチロシン抗体(抗pTyr)(ポリクローナル)(Fendley,et al.,上記文献)。
d.検出抗体:ヤギ抗ウサギIgGホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TAGO,Inc.,Burlingame,Calif.
e.TBSTバッファー:
a.EGF:ストック濃度=16.5ILM;EGF201;TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
b.05−101(UBI)(EGFR細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体)。
c.抗ホスホチロシン抗体(抗pTyr)(ポリクローナル)(Fendley,et al.,上記文献)。
d.検出抗体:ヤギ抗ウサギIgGホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TAGO,Inc.,Burlingame,Calif.
e.TBSTバッファー:
f.HNTG 5×ストック:
g.ABTSストック:
*(2,2−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)).使用まで溶液を暗所、4℃に保存する。
h.EDTA 100mM(pH7.0)、Na3VO4 0.5M、及びNa4(P2O7)0.2Mのストック試薬。
方法. 下記プロトコールを用いた:
A.ELISAプレートをプレコート(precoat)する。
1.ELISAプレート(Corning,96 well,Cat.#25805-96)に05−101抗体をPBS中0.5g/穴で、100μl最終量/穴まで塗布して、4℃で一晩貯蔵する。被覆したプレートは、4℃で貯蔵する場合に、10日間まで良好である。
2.使用当日、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー(5%Carnation Instant Non-Fat Dry Milk in PBS)100μlと交換する。プレートを室温(約23℃〜25℃)において30分間振とうしながら、インキュベートする。使用直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをTBSTバッファーで4回洗浄する。
h.EDTA 100mM(pH7.0)、Na3VO4 0.5M、及びNa4(P2O7)0.2Mのストック試薬。
方法. 下記プロトコールを用いた:
A.ELISAプレートをプレコート(precoat)する。
1.ELISAプレート(Corning,96 well,Cat.#25805-96)に05−101抗体をPBS中0.5g/穴で、100μl最終量/穴まで塗布して、4℃で一晩貯蔵する。被覆したプレートは、4℃で貯蔵する場合に、10日間まで良好である。
2.使用当日、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー(5%Carnation Instant Non-Fat Dry Milk in PBS)100μlと交換する。プレートを室温(約23℃〜25℃)において30分間振とうしながら、インキュベートする。使用直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをTBSTバッファーで4回洗浄する。
B.細胞を接種する。
1.EGFR細胞外ドメイン及び細胞外HER2キナーゼを含有する、キメラ受容体を過度発現するNIH3T3細胞系をこのアッセイに用いることができる。
2.実験のために80〜90%集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、10%ウシ胎仔血清を加えて、反応を停止させる。細胞をDMEM培地(10%CS DMEM培地)中に懸濁させ、室温において5分間、1500rpmで1回遠心分離する。
3.接種培地(DMEM、0.5%ウシ血清)中に細胞を再懸濁させて、トリパン・ブルーを用いて細胞をカウントする。90%を超える生存率が許容される。96穴マイクロタイター・プレートにおいて、細胞を100μl/穴、10,000細胞/穴の密度でDMEM培地(0.5%ウシ血清)に接種する。接種した細胞を5%CO2中、37℃で約40時間インキュベートする。
1.EGFR細胞外ドメイン及び細胞外HER2キナーゼを含有する、キメラ受容体を過度発現するNIH3T3細胞系をこのアッセイに用いることができる。
2.実験のために80〜90%集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、10%ウシ胎仔血清を加えて、反応を停止させる。細胞をDMEM培地(10%CS DMEM培地)中に懸濁させ、室温において5分間、1500rpmで1回遠心分離する。
3.接種培地(DMEM、0.5%ウシ血清)中に細胞を再懸濁させて、トリパン・ブルーを用いて細胞をカウントする。90%を超える生存率が許容される。96穴マイクロタイター・プレートにおいて、細胞を100μl/穴、10,000細胞/穴の密度でDMEM培地(0.5%ウシ血清)に接種する。接種した細胞を5%CO2中、37℃で約40時間インキュベートする。
C.アッセイ方法
1.接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック(DMSO中10mg/ml)をDMEM培地中で1:10に希釈して、次に、最終薬物希釈が1:200の及び最終DMSO濃度が1%とするため、5μlをTBST穴に移す。対照穴には、DMSOのみを加える。5%CO2中、37℃で2時間インキュベートする。
2.EGFリガンドを調製する:希釈EGF(1:12希釈)10μlを移したときに100nMの最終濃度が得られるように、ストックEGFをDMEM中で希釈する。
3.新鮮なHNTGを、100μl/穴に充分に調製して;氷上に置く。
1.接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック(DMSO中10mg/ml)をDMEM培地中で1:10に希釈して、次に、最終薬物希釈が1:200の及び最終DMSO濃度が1%とするため、5μlをTBST穴に移す。対照穴には、DMSOのみを加える。5%CO2中、37℃で2時間インキュベートする。
2.EGFリガンドを調製する:希釈EGF(1:12希釈)10μlを移したときに100nMの最終濃度が得られるように、ストックEGFをDMEM中で希釈する。
3.新鮮なHNTGを、100μl/穴に充分に調製して;氷上に置く。
4.薬物と共に120分間インキュベートした後に、調製したSGFリガンドを細胞に、10μl/穴で、100nMの最終濃度まで加える。対照穴には、DMEMのみを加える。室温で振とうしながら5分間インキュベートする。
5.薬物、EGF及びDMEMを除去する。細胞をPBSで2回洗浄する。HNTG*を細胞に、100μl/穴で移す。氷上に5分間置く。その間に、他のELISAプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにTBSTで洗浄する。
6.マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、HNTG*溶解バッファー(lysis buffer)の吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したELISAプレートに、溶解物(lysate)を移す。室温において1時間、振とうしながらインキュベートする。
7.溶解物を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈した抗pTyr抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。抗pTyr抗血清(TBST中1:3000希釈)の存在下で、室温において30分間振とうしながらインキュベートする。
8.抗pTyr抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈したTAGO抗ウサギIgG抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。室温で振とうしながら30分間インキュベートする(抗ウサギIgG抗体:TBST中1:3000希釈)。
9.TAGO検出抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに調製したABTS/H2O2溶液をELISAプレートに、100μl/穴で移す。室温で振とうしながら20分間インキュベートする(ABTS/H2O2溶液:ABTSストック10ml中30%H2O2 1.0μl)。
10.5N H2SO4(任意)50μlを加えて、反応を停止させ、410nmでO.D.を測定する。
11.正対照から負対照を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害%を、負対照の控除後に算出する。
5.薬物、EGF及びDMEMを除去する。細胞をPBSで2回洗浄する。HNTG*を細胞に、100μl/穴で移す。氷上に5分間置く。その間に、他のELISAプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにTBSTで洗浄する。
6.マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、HNTG*溶解バッファー(lysis buffer)の吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したELISAプレートに、溶解物(lysate)を移す。室温において1時間、振とうしながらインキュベートする。
7.溶解物を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈した抗pTyr抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。抗pTyr抗血清(TBST中1:3000希釈)の存在下で、室温において30分間振とうしながらインキュベートする。
8.抗pTyr抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈したTAGO抗ウサギIgG抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。室温で振とうしながら30分間インキュベートする(抗ウサギIgG抗体:TBST中1:3000希釈)。
9.TAGO検出抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに調製したABTS/H2O2溶液をELISAプレートに、100μl/穴で移す。室温で振とうしながら20分間インキュベートする(ABTS/H2O2溶液:ABTSストック10ml中30%H2O2 1.0μl)。
10.5N H2SO4(任意)50μlを加えて、反応を停止させ、410nmでO.D.を測定する。
11.正対照から負対照を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害%を、負対照の控除後に算出する。
アッセイ2:HER2−BT474 ELISA.全細胞HER2活性を測定するために、第2アッセイを行なうことができる。このようなアッセイは下記のように行なうことができる:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた:
a.BT−474(ATCC HBT20)、高レベルのHER2キナーゼを発現するヒト***腫瘍
b.インキュベーター中で5%CO2、37℃におけるBT−474の増殖に用いるための、RPMI+10%FBS+GMS−G(Gibcoサプルメント)+グルタミンを含む増殖培地
c.モノクローナル抗HER2抗体
d.D−PBS:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた:
a.BT−474(ATCC HBT20)、高レベルのHER2キナーゼを発現するヒト***腫瘍
b.インキュベーター中で5%CO2、37℃におけるBT−474の増殖に用いるための、RPMI+10%FBS+GMS−G(Gibcoサプルメント)+グルタミンを含む増殖培地
c.モノクローナル抗HER2抗体
d.D−PBS:
e.ブロッキング・バッファー:TBSTプラス5%Milk(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk).
f.TBSTバッファー:
f.TBSTバッファー:
この場合、TESストック溶液(10×)を調製して、TritonX−10を該バッファーに希釈中に加える。
g.HNTGバッファー(5×):
g.HNTGバッファー(5×):
ストック溶液(5×)を調製して、40℃において保存する。
h.EDTA−HCl:500×ストックとして、0.5M、pH7.0(10N HCl)。
i.Na3VO4:100×ストックとしての0.5Mをアリコートとして−80℃に保存する。
j.Na4(P2O7):100×ストックとして、0.2M。
k.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン。
l.ヤギ抗ウサギIgG、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(POD)コンジュゲート(検出抗体)、Tago(Cat. No. 4520; Lot No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, Calif.
m.ABTS溶液:
h.EDTA−HCl:500×ストックとして、0.5M、pH7.0(10N HCl)。
i.Na3VO4:100×ストックとしての0.5Mをアリコートとして−80℃に保存する。
j.Na4(P2O7):100×ストックとして、0.2M。
k.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン。
l.ヤギ抗ウサギIgG、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(POD)コンジュゲート(検出抗体)、Tago(Cat. No. 4520; Lot No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, Calif.
m.ABTS溶液:
この場合、ABTSは2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)である。このアッセイのために、ABTS溶液は暗所で4℃に保存するべきである。該溶液は、緑色に変色したならば、廃棄するべきである。
n.H2O2:30%溶液を暗所、4℃に保存する。
方法. 下記工程の全ては、特に指定のない限り、室温及び無菌下で行なわれる。全てのELISAプレート洗浄は、蒸留水で3回とTBSTで1回のすすぎ洗いによる。
n.H2O2:30%溶液を暗所、4℃に保存する。
方法. 下記工程の全ては、特に指定のない限り、室温及び無菌下で行なわれる。全てのELISAプレート洗浄は、蒸留水で3回とTBSTで1回のすすぎ洗いによる。
A.細胞の接種
1.BT474細胞を組織培養皿(Corning 25020-100)中で、80〜90%集密度まで増殖させて、Trypsin−EDTA(0.25%,GIBCO)を用いて回収する。
2.該細胞を新鮮な培地中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、約25,000〜50,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。該細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
1.BT474細胞を組織培養皿(Corning 25020-100)中で、80〜90%集密度まで増殖させて、Trypsin−EDTA(0.25%,GIBCO)を用いて回収する。
2.該細胞を新鮮な培地中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、約25,000〜50,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。該細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
B.ELISAプレートの塗布とブロッキング
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を、PBS150μl中0.5μg/穴の抗HER2抗体で、4℃において一晩被覆し、パラフィンでシールする。抗体塗布プレートは、4℃で貯蔵した場合に、2週間まで使用可能である。
2.使用当日に、塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー200μlと交換する、プレートを振とうし、次に、細胞溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を、PBS150μl中0.5μg/穴の抗HER2抗体で、4℃において一晩被覆し、パラフィンでシールする。抗体塗布プレートは、4℃で貯蔵した場合に、2週間まで使用可能である。
2.使用当日に、塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー200μlと交換する、プレートを振とうし、次に、細胞溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
C.アッセイ方法
1.無血清状態下のTBST、薬物。薬物を加える前に、古い培地を無血清RPMI(90μl/穴)と交換する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)をRPMIで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、1%の最終薬物DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃でインキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
1.無血清状態下のTBST、薬物。薬物を加える前に、古い培地を無血清RPMI(90μl/穴)と交換する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)をRPMIで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、1%の最終薬物DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃でインキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
4.薬物の2時間のプレインキュベーション後に、該プレートから全ての溶液を除去して、HNTG*(100μl/穴)を細胞に移し、10分間振とうする。
5.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物をELISAプレートに移し、1時間振とうする。
6.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)100μl/穴を加えて、30分間振とうする。
7.抗pTyrを取り出し、プレートを洗浄して、ヤギ抗ウサギIgG結合抗体(1:5,000、TBSTによる)を100μl/穴で加えて、30分間振とうする。
8.抗ウサギIgG抗体を取り出し、プレートを洗浄し、該プレートに新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlにH2O21.2μl)を100 l/穴で加えて、発色を開始させる、これは通常20分間要する。
9.OD410nmを測定する、Dynatec MR5000.
5.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物をELISAプレートに移し、1時間振とうする。
6.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)100μl/穴を加えて、30分間振とうする。
7.抗pTyrを取り出し、プレートを洗浄して、ヤギ抗ウサギIgG結合抗体(1:5,000、TBSTによる)を100μl/穴で加えて、30分間振とうする。
8.抗ウサギIgG抗体を取り出し、プレートを洗浄し、該プレートに新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlにH2O21.2μl)を100 l/穴で加えて、発色を開始させる、これは通常20分間要する。
9.OD410nmを測定する、Dynatec MR5000.
PDGF−R ELISA
全ての細胞培養培地、グルタミン及びウシ胎仔血清は、特に指定しない限り、Gibco Life Technologies (Grand Island, N.Y.)から購入した。全ての細胞は、90〜95%空気及び5〜10%CO2の湿った雰囲気中、37℃で増殖させた。全ての細胞系はルーチンに週2回継代培養し、Mycotect方法(Gibco)での測定によってマイコプラズマに関して陰性であった。
全ての細胞培養培地、グルタミン及びウシ胎仔血清は、特に指定しない限り、Gibco Life Technologies (Grand Island, N.Y.)から購入した。全ての細胞は、90〜95%空気及び5〜10%CO2の湿った雰囲気中、37℃で増殖させた。全ての細胞系はルーチンに週2回継代培養し、Mycotect方法(Gibco)での測定によってマイコプラズマに関して陰性であった。
ELISAアッセイのために、細胞(U1242、Joseph Schlessinger, NYUから入手)を増殖培地(10%FBS、NEAA、1mM NaPyr及び2mM GLNを含むMEM)中で80〜90%集密度まで増殖させ、96穴組織培養プレートの0.5%血清中に25,000〜30,000細胞/穴で接種した。0.5%血清含有培地中で一晩インキュベートした後に、細胞を無血清培地に移して、試験化合物によって5%CO2、37℃インキュベーター中で2時間処理した。次に、細胞をリガンドによって5〜10分間刺激し、次いで、HNTG(20mM Hepes、150mM NaCl、10%グリセロール、5mM EDTA、5mM Na3VO4、0.2% TritonX−100及び2mM NaPyr)によって溶解(lysis)した。細胞溶解物(0.5mg/穴、PBS中)を、受容体特異性抗体を予め被覆し、TBST(50mM Tris−HCl、pH7.2、150mM NaCl及び0.1%TritonX−100)中5%Milkで室温において30分間ブロックしたELISAプレートに移した。溶解物を振とうしながら室温において1時間インキュベートした。該プレートをTBSTで4回洗浄し、次に、ポリクローナル抗ホスホチロシン抗体と共に室温において30分間インキュベートした。該プレートをTBSTで4回すすぎ洗いすることによって過剰な抗ホスホチロシン抗体を除去した。ヤギ抗ウサギIgG抗体を該ELISAプレートに室温において30分間加えてから、次に、TBSTでさらに4回すすぎ洗いした。ABTS(100mMクエン酸、250mM Na2HPO4及び0.5mg/mlの2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸))プラスH2O2(ABTS10mlに対して30%H2O21.2ml)を該ELISAプレートに加えて、発色を開始させた。
ABTSの添加後約15〜30分間に、630nmの基準波長で、410nmでの吸光度を記録した。
ABTSの添加後約15〜30分間に、630nmの基準波長で、410nmでの吸光度を記録した。
IGF−I ELISA
下記プロトコールを用いて、IGF−I受容体上のホスホチロシン・レベルを測定することができる該ホスホチロシン・レベルは、IGF−I受容体キロシンキナーゼ活性を示す。
下記プロトコールを用いて、IGF−I受容体上のホスホチロシン・レベルを測定することができる該ホスホチロシン・レベルは、IGF−I受容体キロシンキナーゼ活性を示す。
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた:
a.このアッセイに用いた細胞系は、3T3/IGF−IR、IGF−I受容体を過度発現する細胞系である。
b.NIH3T3/IGF−IRをインキュベーター中で、5%CO2、37℃において増殖させる。増殖培地は、DMEM+10%FBS(熱不活化)+2mM L−グルタミンである。
c.17−69と名付けられた抗IGF−IR抗体を用いる。抗体はthe Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製される。
d.D−PBS:
a.このアッセイに用いた細胞系は、3T3/IGF−IR、IGF−I受容体を過度発現する細胞系である。
b.NIH3T3/IGF−IRをインキュベーター中で、5%CO2、37℃において増殖させる。増殖培地は、DMEM+10%FBS(熱不活化)+2mM L−グルタミンである。
c.17−69と名付けられた抗IGF−IR抗体を用いる。抗体はthe Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製される。
d.D−PBS:
e.ブロッキング・バッファー:TBSTプラス5%Milk(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)。
f.TBSTバッファー:
f.TBSTバッファー:
TBS(10×)ストック溶液を調製して、該バッファーに希釈中にTritonX−100を加える。
g.HNTGバッファー:
g.HNTGバッファー:
ストック溶液(5×)を調製して、4℃で保存する。
h.EDTA/HCl:100×ストックとして0.5M、pH7.0(NaOH)。
i.Na3VO4:100×ストックとして0.5M、アリコートを−80℃で保存する。
j.Na4P2O7:100×ストックとして0.2M。
k.インスリン様増殖因子−I、Promegsから(Cat# G5111)。
l.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン:Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清。
m.ヤギ抗ウサギIgG、PODコンジュゲート(検出抗体)、Tago (Cat. No.4520, Lot No. 1802):Tago,Inc.,Burlingame, CA.
n.ABTS(2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸))溶液:
h.EDTA/HCl:100×ストックとして0.5M、pH7.0(NaOH)。
i.Na3VO4:100×ストックとして0.5M、アリコートを−80℃で保存する。
j.Na4P2O7:100×ストックとして0.2M。
k.インスリン様増殖因子−I、Promegsから(Cat# G5111)。
l.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン:Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清。
m.ヤギ抗ウサギIgG、PODコンジュゲート(検出抗体)、Tago (Cat. No.4520, Lot No. 1802):Tago,Inc.,Burlingame, CA.
n.ABTS(2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸))溶液:
ABTS溶液は、暗所で、4℃において保存するべきである。該溶液は、緑色に変色したならば、廃棄するべきである。
o.過酸化水素:30%溶液を暗所で、4℃において保存する。
方法. 全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのELISAプレート洗浄は、プレートを水道水で3回すすぎ洗いして、次にTBSTすすぎ洗い1回で行なう。プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
o.過酸化水素:30%溶液を暗所で、4℃において保存する。
方法. 全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのELISAプレート洗浄は、プレートを水道水で3回すすぎ洗いして、次にTBSTすすぎ洗い1回で行なう。プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
A.細胞の接種:
1.組織培養皿(Corning 25020-100)中で80〜90%集密度まで増殖させた細胞をTrypsin−EDTA(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収する。
2.該細胞を新鮮なDMEM+10%FBS+2mM L−グルタミン中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、20,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。1日間インキュベートしてから、培地を無血清培地(90μl)に取り替えて、5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
1.組織培養皿(Corning 25020-100)中で80〜90%集密度まで増殖させた細胞をTrypsin−EDTA(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収する。
2.該細胞を新鮮なDMEM+10%FBS+2mM L−グルタミン中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、20,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。1日間インキュベートしてから、培地を無血清培地(90μl)に取り替えて、5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
B.ELISAプレートの塗布とブロッキング:
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を抗IGF−I抗体で、PBS100μl中の0.5μg/穴で、少なくとも2時間被覆する。
2.塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー100μlと交換し、30分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を抗IGF−I抗体で、PBS100μl中の0.5μg/穴で、少なくとも2時間被覆する。
2.塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー100μlと交換し、30分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
C.アッセイ方法
1.薬物を無血清状態下で試験する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)を、96穴ポリプロピレン・プレート中で、DMEMで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、最終薬物希釈1:100及び1.0%の最終DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃で、2時間インキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
1.薬物を無血清状態下で試験する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)を、96穴ポリプロピレン・プレート中で、DMEMで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、最終薬物希釈1:100及び1.0%の最終DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃で、2時間インキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
4.薬物の2時間インキュベーション後に、PBS中200nM IGF−Iリガンド10μl/穴を細胞に移し(最終濃度=20nM),5%CO2、37℃において10分間インキュベートする。
5.培地を除去し、HNTG*100μl/穴を加えて、10分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
6.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体塗布ELISAプレートに移して、1時間振とうする。
7.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
8.抗pTyrを除去し、該プレートを洗浄して、Tago(1:3,000、TBSTによる)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
9.検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlに対してH2O21.2μl)を100μl/穴でプレートに移して、発色を開始させる。
10.Ingresに接続するDynatec MR5000において、ODを測定する。
5.培地を除去し、HNTG*100μl/穴を加えて、10分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
6.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体塗布ELISAプレートに移して、1時間振とうする。
7.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
8.抗pTyrを除去し、該プレートを洗浄して、Tago(1:3,000、TBSTによる)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
9.検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlに対してH2O21.2μl)を100μl/穴でプレートに移して、発色を開始させる。
10.Ingresに接続するDynatec MR5000において、ODを測定する。
EGF受容体ELISA
全細胞中のEGF受容体キナーゼ活性(EGFR−NIH3T3アッセイ)を以下に記載するように測定した:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた。
a.EGFリガンド:ストック濃度=16.5μM;EGF201、TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
b.05−101(UBI)(EGFR細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体)。
c.抗ホスホチロシン抗体(抗pTyr)(ポリクローナル)。
d.検出抗体:ヤギ抗ウサギIgGホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TACO, Inc., Burlingame,Calif.
e.TBSTバッファー:
全細胞中のEGF受容体キナーゼ活性(EGFR−NIH3T3アッセイ)を以下に記載するように測定した:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた。
a.EGFリガンド:ストック濃度=16.5μM;EGF201、TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
b.05−101(UBI)(EGFR細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体)。
c.抗ホスホチロシン抗体(抗pTyr)(ポリクローナル)。
d.検出抗体:ヤギ抗ウサギIgGホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TACO, Inc., Burlingame,Calif.
e.TBSTバッファー:
f.HNTG5×ストック:
g.ABTSストック:
溶液を、使用するまで、暗所で4℃において保存する。
h.ストック試薬:
EDTA 100mM pH7.0
Na3VO4 0.5M
Na4(P2O7) 0.2M
方法. 下記プロトコールを用いた:
A.ELISAプレートをプレコートする。
1.ELISAプレート(Corning, 96 well, Cat.#25805-96)に05−101抗体を、PBS中0.5μg/穴、150μl最終量/穴で被覆して、4℃で一晩保存する。被覆したプレートは、4℃で保存した場合に、10日間まで良好である。
2.使用当日に、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー(PBS中5% Carnation Instant Non Fat Dry Milk)と交換する。該プレートを室温(約23℃〜25℃)において30分間インキュベートした。使用する直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをTBSTバッファーで4回洗浄する。
h.ストック試薬:
EDTA 100mM pH7.0
Na3VO4 0.5M
Na4(P2O7) 0.2M
方法. 下記プロトコールを用いた:
A.ELISAプレートをプレコートする。
1.ELISAプレート(Corning, 96 well, Cat.#25805-96)に05−101抗体を、PBS中0.5μg/穴、150μl最終量/穴で被覆して、4℃で一晩保存する。被覆したプレートは、4℃で保存した場合に、10日間まで良好である。
2.使用当日に、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー(PBS中5% Carnation Instant Non Fat Dry Milk)と交換する。該プレートを室温(約23℃〜25℃)において30分間インキュベートした。使用する直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをTBSTバッファーで4回洗浄する。
B.細胞を接種する。
1.このアッセイのために、NIH3T3/C7細胞(Honegger,et al.,Cell 51: 199-209,1987)を用いることができる。
2.実験のために、80〜90%集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、10%CS DMEM培地を加えて、反応を停止する。細胞をDMEM培地(10%CS DMEM培地)中に懸濁させて、1000rpmで1回遠心分離し、室温において1回5分間遠心分離する。
3.細胞を接種培地(DMEM、0.5%ウシ血清)中に再懸濁させ、トリパンブルーを用いて細胞をカウントする。90%を超える生存率が許容される。96穴マイクロタイター・プレートにおいてDMEM培地(0.5%ウシ血清)中に細胞を、10,000細胞/穴、100μl/穴で接種する。接種した細胞を5%CO2中、37℃で約40時間インキュベートする。
1.このアッセイのために、NIH3T3/C7細胞(Honegger,et al.,Cell 51: 199-209,1987)を用いることができる。
2.実験のために、80〜90%集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、10%CS DMEM培地を加えて、反応を停止する。細胞をDMEM培地(10%CS DMEM培地)中に懸濁させて、1000rpmで1回遠心分離し、室温において1回5分間遠心分離する。
3.細胞を接種培地(DMEM、0.5%ウシ血清)中に再懸濁させ、トリパンブルーを用いて細胞をカウントする。90%を超える生存率が許容される。96穴マイクロタイター・プレートにおいてDMEM培地(0.5%ウシ血清)中に細胞を、10,000細胞/穴、100μl/穴で接種する。接種した細胞を5%CO2中、37℃で約40時間インキュベートする。
C.アッセイ方法
1.接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック(DMSO中10mg/ml)をDMEM培地中で1:10に希釈して、次に、最終薬物希釈が1:200及び最終DMSO濃度が1%とするため、5μlを試験穴に移す。対照穴には、DMSOのみを加える。5%CO2中、37℃で1時間インキュベートする。
2.EGFリガンドを調製する:希釈EGF(1:12希釈)10μlを移したときに、25nMの最終濃度が得られるように、ストックEGFをDMEM中で希釈する。
3.100μl/穴のために充分な、新鮮なHNTG10mlを調製する、この場合、HNTG*は、HNTGストック(2.0ml)、milli−Q・H2O(7.3ml)、EDTA,100mM,pH7.0(0.5ml)、Na3VO40.5M(0.1ml)及びNa4(P2O7),0.2M(0.1ml)を含む。
4.氷上に置く。
5.薬物と共に2時間インキュベートした後に、調製したEGFリガンドを細胞に、10μl/穴で、25nMの最終濃度まで加える。対照穴には、DMEMのみを加える。室温で振とうしながら5分間インキュベートする。
6.薬物、EGF及びDMEMを除去する。細胞をPBSで2回洗浄する。HNTG*を細胞に、100μl/穴で移す。氷上に5分間置く。その間に、他のELISAプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにTBSTで洗浄する。
7.マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、HNTG*溶解バッファーの吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したELISAプレートに、溶解物を移す。室温において1時間、振とうしながらインキュベートする。
8.溶解物を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈した抗pTyr抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。抗pTyr抗血清(TBST中1:3000希釈)の存在下で、室温において30分間振とうしながらインキュベートする。
9.抗pTyr抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈したTAGO 30抗ウサギIgG抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。室温で振とうしながら30分間インキュベートする(抗ウサギIgG抗体:TBST中1:3000希釈)。
10.検出抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに調製したABTS/H2O2溶液をELISAプレートに、100μl/穴で移す。室温で20分間インキュベートする。ABTS/H2O2溶液:ABTSストック10ml中30%H2O2 1.2μl。
11.N H2SO4(任意)50μlを加えて、反応を停止させ、410nmでO.D.を測定する。
12.正対照から負対照値を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害%を、負対照の控除後に算出する。
1.接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック(DMSO中10mg/ml)をDMEM培地中で1:10に希釈して、次に、最終薬物希釈が1:200及び最終DMSO濃度が1%とするため、5μlを試験穴に移す。対照穴には、DMSOのみを加える。5%CO2中、37℃で1時間インキュベートする。
2.EGFリガンドを調製する:希釈EGF(1:12希釈)10μlを移したときに、25nMの最終濃度が得られるように、ストックEGFをDMEM中で希釈する。
3.100μl/穴のために充分な、新鮮なHNTG10mlを調製する、この場合、HNTG*は、HNTGストック(2.0ml)、milli−Q・H2O(7.3ml)、EDTA,100mM,pH7.0(0.5ml)、Na3VO40.5M(0.1ml)及びNa4(P2O7),0.2M(0.1ml)を含む。
4.氷上に置く。
5.薬物と共に2時間インキュベートした後に、調製したEGFリガンドを細胞に、10μl/穴で、25nMの最終濃度まで加える。対照穴には、DMEMのみを加える。室温で振とうしながら5分間インキュベートする。
6.薬物、EGF及びDMEMを除去する。細胞をPBSで2回洗浄する。HNTG*を細胞に、100μl/穴で移す。氷上に5分間置く。その間に、他のELISAプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにTBSTで洗浄する。
7.マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、HNTG*溶解バッファーの吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したELISAプレートに、溶解物を移す。室温において1時間、振とうしながらインキュベートする。
8.溶解物を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈した抗pTyr抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。抗pTyr抗血清(TBST中1:3000希釈)の存在下で、室温において30分間振とうしながらインキュベートする。
9.抗pTyr抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに希釈したTAGO 30抗ウサギIgG抗体をELISAプレートに100μl/穴で移す。室温で振とうしながら30分間インキュベートする(抗ウサギIgG抗体:TBST中1:3000希釈)。
10.検出抗体を取り出し、TBSTで4回洗浄する。新たに調製したABTS/H2O2溶液をELISAプレートに、100μl/穴で移す。室温で20分間インキュベートする。ABTS/H2O2溶液:ABTSストック10ml中30%H2O2 1.2μl。
11.N H2SO4(任意)50μlを加えて、反応を停止させ、410nmでO.D.を測定する。
12.正対照から負対照値を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害%を、負対照の控除後に算出する。
細胞インスリン受容体ELISA
下記プロトコールを用いて、本発明の化合物がインスリン受容体チロシンキナーゼ活性を有するかどうかを判定した。
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いて、インスリン受容体上のホスホチロシン・レベル(インスリン受容体チロシンキナーゼ活性を示す)を測定した。
1.好ましい細胞系は、インスリン受容体を過度発現するNIH3T3細胞系(ATCC No.1658)であった(H25細胞);
2.H25細胞をインキュベーター中で5%CO2、37℃において増殖させる。増殖培地は、DMEM+10%FBS(熱不活化)+2mM L−グルタミンである;
3.ELISAプレートの被覆のために、BBEと名付けられたモノクローナル抗IR抗体を用いる。該抗体は、Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製された;
4.D−PBSは下記を含む:
下記プロトコールを用いて、本発明の化合物がインスリン受容体チロシンキナーゼ活性を有するかどうかを判定した。
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いて、インスリン受容体上のホスホチロシン・レベル(インスリン受容体チロシンキナーゼ活性を示す)を測定した。
1.好ましい細胞系は、インスリン受容体を過度発現するNIH3T3細胞系(ATCC No.1658)であった(H25細胞);
2.H25細胞をインキュベーター中で5%CO2、37℃において増殖させる。増殖培地は、DMEM+10%FBS(熱不活化)+2mM L−グルタミンである;
3.ELISAプレートの被覆のために、BBEと名付けられたモノクローナル抗IR抗体を用いる。該抗体は、Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製された;
4.D−PBSは下記を含む:
5.ブロッキング・バッファー:TBSTプラス5%Milk(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk);
6.TBSTバッファーは、下記を含む:
6.TBSTバッファーは、下記を含む:
注:TBS(10×)ストック溶液を調製して、TritonX−100を希釈中に該バッファーに加える;
7.HNTGバッファー、下記を含む:
7.HNTGバッファー、下記を含む:
注:ストック溶液(5×)を調製して、4℃で保存する。
8.EDTA HCl:100×ストックとして、0.5M pH7.0(NaCl);
9.Na3VO4:100×ストックとして0.5M、アリコートを−80℃で保存する;
10.Na4P2O7:100×ストックとして0.2M;
11.GIBCO BRL(Cat#18125039)からのインスリン;
12.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン:Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清;
13.検出抗体、好ましくは、ヤギ抗ウサギIgG、PODコンジュゲート、Tago(Cat.No.4520:Lot No.1802):Tago,Inc.,Burlingame,CA;
14.ABTS溶液、下記を含む:
8.EDTA HCl:100×ストックとして、0.5M pH7.0(NaCl);
9.Na3VO4:100×ストックとして0.5M、アリコートを−80℃で保存する;
10.Na4P2O7:100×ストックとして0.2M;
11.GIBCO BRL(Cat#18125039)からのインスリン;
12.ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン:Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清;
13.検出抗体、好ましくは、ヤギ抗ウサギIgG、PODコンジュゲート、Tago(Cat.No.4520:Lot No.1802):Tago,Inc.,Burlingame,CA;
14.ABTS溶液、下記を含む:
この場合、ABTSは、2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)であり、暗所で、4℃において保存し、緑色に変色する場合には、廃棄する。
15.過酸化水素:30%溶液を暗所に、40℃で保存する。
プロトコール. 全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのELISAプレート洗浄は、プレートを水道水で3回すすぎ洗いして、次にTBSTすすぎ洗い1回で行なう。使用前に、プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
15.過酸化水素:30%溶液を暗所に、40℃で保存する。
プロトコール. 全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのELISAプレート洗浄は、プレートを水道水で3回すすぎ洗いして、次にTBSTすすぎ洗い1回で行なう。使用前に、プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
A.細胞の接種:
1.組織培養皿(10cm、Corning 25020-100)中で80〜90%集密度まで増殖させて、細胞をTrypsin−EDTA(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収した。
2.該細胞を新鮮なDMEM+10%FBS+2mM L−グルタミン中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、20,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。次に、細胞を1日間インキュベートする。このようなインキュベーション後に、古い培地を0.01%血清培地(90μl)に取り替えて、細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
1.組織培養皿(10cm、Corning 25020-100)中で80〜90%集密度まで増殖させて、細胞をTrypsin−EDTA(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収した。
2.該細胞を新鮮なDMEM+10%FBS+2mM L−グルタミン中に再懸濁させ、96穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、20,000細胞/穴で移す(100μl/穴)。次に、細胞を1日間インキュベートする。このようなインキュベーション後に、古い培地を0.01%血清培地(90μl)に取り替えて、細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
B.ELISAプレートの被覆とブロッキング:
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を抗IR抗体で、PBS100μl中の0.5μg/穴で、少なくとも2時間被覆する。
2.被覆溶液を除去して、ブロッキング・バッファー100μlと交換し、30分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
1.ELISAプレート(Corning 25806-96)を抗IR抗体で、PBS100μl中の0.5μg/穴で、少なくとも2時間被覆する。
2.被覆溶液を除去して、ブロッキング・バッファー100μlと交換し、30分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
C.アッセイ方法
1.薬物を無血清状態下で試験する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)を、96穴ポリプロピレン・プレート中で、DMEMで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、最終薬物希釈1:100及び1.0%の最終DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃で、2時間インキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
1.薬物を無血清状態下で試験する。
2.薬物ストック(100%DMSO中)を、96穴ポリプロピレン・プレート中で、DMEMで1:10に希釈し、この溶液10μl/穴を細胞に移し、最終薬物希釈1:100及び1.0%の最終DMSO濃度を得る。細胞を5%CO2中、37℃で、2時間インキュベートする。
3.新鮮な細胞溶解バッファー(HNTG*)の調製
4.薬物の2時間インキュベーション後に、PBS中1μMインスリン10μl/穴を細胞に移し(最終濃度=100nM),5%CO2、37℃において10分間インキュベートする。
5.培地を除去し、HNTG*100μl/穴を加えて、10分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
6.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体被覆ELISAプレートに移して、1時間振とうする。
7.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
8.抗pTyrを除去し、該プレートを洗浄して、Tago(1:3,000、TBSTによる)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
9.検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlに対してH2O21.2μl)を100μl/穴でプレートに移して、発色を開始させる。
10.Ingresに接続するDynatec MR5000において、ODを測定する。
5.培地を除去し、HNTG*100μl/穴を加えて、10分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
6.12−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体被覆ELISAプレートに移して、1時間振とうする。
7.溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pTyr(TBSTによって1:3,000)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
8.抗pTyrを除去し、該プレートを洗浄して、Tago(1:3,000、TBSTによる)を100μl/穴で移して、30分間振とうする。
9.検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なABTS/H2O2(ABTS10mlに対してH2O21.2μl)を100μl/穴でプレートに移して、発色を開始させる。
10.Ingresに接続するDynatec MR5000において、ODを測定する。
ELISAアッセイからの実験結果
上記プロトコールを用いた、本発明による種々な化合物に関する実験結果を表1に示す:
表1
上記プロトコールを用いた、本発明による種々な化合物に関する実験結果を表1に示す:
表1
表1続き
表1続き
細胞増殖アッセイ
下記アッセイを行うことにより、特許請求の範囲の化合物と1つ以上のRTKsとの相互作用の結果として、細胞増殖に対する該化合物及び組み合せの効果を測定することができる。特に指定しない限り、下記アッセイを、任意の特定のRTKに対する化合物の活性を測定するために一般的に適用することができる。以下に記載するアッセイが特定のRTKに関する範囲で、当業者は、開示されたプロトコールを、第2のRTKの活性の測定に用いるように適応させることができると考えられる。
下記アッセイを行うことにより、特許請求の範囲の化合物と1つ以上のRTKsとの相互作用の結果として、細胞増殖に対する該化合物及び組み合せの効果を測定することができる。特に指定しない限り、下記アッセイを、任意の特定のRTKに対する化合物の活性を測定するために一般的に適用することができる。以下に記載するアッセイが特定のRTKに関する範囲で、当業者は、開示されたプロトコールを、第2のRTKの活性の測定に用いるように適応させることができると考えられる。
軟寒天アッセイ
軟寒天を用いて、細胞増殖に対する物質の効果又は該物質を含有する組み合わせの効果を測定することができる。他に記載しない限り、軟寒天アッセイは下記のように行なった:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた:
a.39℃に設定した水浴及び37℃のもう1つの水浴。
b.2×アッセイ培地は、以下の:20%ウシ胎仔血清(FBS)、2mMピルビン酸ナトリウム、4mMグルタミン・アミン及び20mM HEPES非必須アミノ酸(100×ストックから1:50)を補助した、2×Dulbecco’s5改変イーグル培地(DMEM)(Gibco Cat. # CA400-4AN03)から構成される。
c.10%FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、10mM HEPES、非必須アミノ酸(100×ストックから1:100)を補助した1×DMEMから製造される1×アッセイ培地
d.オートクレーブ・ボトル入りの1.6%SeaPlaque Agarose
e.滅菌した35mm Corningプレート(FMC Bioproducts Cat.#50102)。
f.滅菌した5mlガラスピペット(個別に包装)
g.滅菌した15mlと50mlの円錐状遠心分離管
h.ピペットと滅菌したチップ
i.滅菌した微小遠心分離管
j.T75フラスコ中の細胞:SKOV−3(ATCC HTB77)
k.0.25%トリプシン溶液(Gibco #25200-015)
方法. 下記方法を用いて、軟寒天アッセイを行なった:
A.基層(base layer)の製造方法
1.37℃水浴中で全ての培地を加温する。
2.1×のアッセイ培地+0.8%寒天を製造するために;2×アッセイ培地によって溶融寒天(39℃に冷却)を1:2(vol:vol)希釈する。
3.寒天を含む培地の全てを、使用しないときには、39℃水浴中で温かく保持する。
4.1×アッセイ培地+0.8%寒天1mlを皿に分配して、プレートを穏やかに撹拌して、均一な基層を形成する。気泡は避けるべきである。
5.基層を冷蔵して、凝固させる(約20分間)。基層を冷蔵庫で一晩保存することができる。
軟寒天を用いて、細胞増殖に対する物質の効果又は該物質を含有する組み合わせの効果を測定することができる。他に記載しない限り、軟寒天アッセイは下記のように行なった:
物質と試薬. 下記物質と試薬を用いた:
a.39℃に設定した水浴及び37℃のもう1つの水浴。
b.2×アッセイ培地は、以下の:20%ウシ胎仔血清(FBS)、2mMピルビン酸ナトリウム、4mMグルタミン・アミン及び20mM HEPES非必須アミノ酸(100×ストックから1:50)を補助した、2×Dulbecco’s5改変イーグル培地(DMEM)(Gibco Cat. # CA400-4AN03)から構成される。
c.10%FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、10mM HEPES、非必須アミノ酸(100×ストックから1:100)を補助した1×DMEMから製造される1×アッセイ培地
d.オートクレーブ・ボトル入りの1.6%SeaPlaque Agarose
e.滅菌した35mm Corningプレート(FMC Bioproducts Cat.#50102)。
f.滅菌した5mlガラスピペット(個別に包装)
g.滅菌した15mlと50mlの円錐状遠心分離管
h.ピペットと滅菌したチップ
i.滅菌した微小遠心分離管
j.T75フラスコ中の細胞:SKOV−3(ATCC HTB77)
k.0.25%トリプシン溶液(Gibco #25200-015)
方法. 下記方法を用いて、軟寒天アッセイを行なった:
A.基層(base layer)の製造方法
1.37℃水浴中で全ての培地を加温する。
2.1×のアッセイ培地+0.8%寒天を製造するために;2×アッセイ培地によって溶融寒天(39℃に冷却)を1:2(vol:vol)希釈する。
3.寒天を含む培地の全てを、使用しないときには、39℃水浴中で温かく保持する。
4.1×アッセイ培地+0.8%寒天1mlを皿に分配して、プレートを穏やかに撹拌して、均一な基層を形成する。気泡は避けるべきである。
5.基層を冷蔵して、凝固させる(約20分間)。基層を冷蔵庫で一晩保存することができる。
B.細胞の回収方法
1.インキュベーターから細胞系に当り1フラスコを取り出す;培地を吸い出し;PBSで1回洗浄して、吸い出し;トリプシン溶液3mlを加える。
2.全ての細胞がフラスコから解離した後に、1×アッセイ培地3mlを加えて、トリプシン活性を阻害する。細胞をピペットで上下させて、次に、該懸濁液を15ml管中に移す。
3.Coulterカウンターを用いて細胞濃度を、トリパンブルー排除によって生存率を測定する。
4.プレート当り3300生存細胞を接種するために必要な適当量を取り出して、これを1×アッセイ培地で1.5mlに希釈する。
1.インキュベーターから細胞系に当り1フラスコを取り出す;培地を吸い出し;PBSで1回洗浄して、吸い出し;トリプシン溶液3mlを加える。
2.全ての細胞がフラスコから解離した後に、1×アッセイ培地3mlを加えて、トリプシン活性を阻害する。細胞をピペットで上下させて、次に、該懸濁液を15ml管中に移す。
3.Coulterカウンターを用いて細胞濃度を、トリパンブルー排除によって生存率を測定する。
4.プレート当り3300生存細胞を接種するために必要な適当量を取り出して、これを1×アッセイ培地で1.5mlに希釈する。
C.上部0.4%アガロース層の製造方法
1.TBST化合物を所望の最終アッセイ濃度の2倍で加える;1×アッセイ培地10%FBS中の細胞懸濁液+1.5ml;1×アッセイ培地+0.8%アガロース*+1.5ml:合計=3.0mlの1×培地+0.4%アガロース、3300生存細胞/ml、TBST化合物を含む及び含まない場合。
*(上記基層方法について、1.6%寒天30により、2×培地を1:2希釈によって製造)
2.アッセイ・ミックス1mlを基層1ml上に加える(plate)。該3ml量から、2通りに加える。
3.該皿を100%湿度の10%CO2インキュベーター中で、2〜3週間インキュベートする。
4.60ミクロン以上であるコロニーを、陽性(positive)と記録する。
1.TBST化合物を所望の最終アッセイ濃度の2倍で加える;1×アッセイ培地10%FBS中の細胞懸濁液+1.5ml;1×アッセイ培地+0.8%アガロース*+1.5ml:合計=3.0mlの1×培地+0.4%アガロース、3300生存細胞/ml、TBST化合物を含む及び含まない場合。
*(上記基層方法について、1.6%寒天30により、2×培地を1:2希釈によって製造)
2.アッセイ・ミックス1mlを基層1ml上に加える(plate)。該3ml量から、2通りに加える。
3.該皿を100%湿度の10%CO2インキュベーター中で、2〜3週間インキュベートする。
4.60ミクロン以上であるコロニーを、陽性(positive)と記録する。
スルホローダミンB(SRB)増殖アッセイ
SRBアッセイを用いて、細胞増殖に対する物質の効果を測定することができる。該アッセイは下記のように行なう。
SRBアッセイを用いて、細胞増殖に対する物質の効果を測定することができる。該アッセイは下記のように行なう。
アッセイ1:3T3/E/H+TGF−a(T)細胞増殖SRBアッセイ
物質:
96穴平底滅菌プレート
96穴丸底滅菌プレート
滅菌25ml又は100mlレサバー
ピペット、マルチ−チャンネル・ピペットマン
滅菌ピペットチップ
滅菌15ml管と50ml管
試薬:
1%酢酸中0.4%SRB
10mM Tris塩基
10%TCA
1%酢酸
滅菌DMSO(Sigma)
DMSO中の化合物(100mM以下のストック溶液)
細胞解離溶液(cell dissociation solution)(Sigma)中の25%トリプシン−EDTA
細胞系と増殖培地:
3T3/E/H+TGF−a(T)(EGF−R/HER2キメラ及びTGF−aを発現するNIH3T3クローン7細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞)
2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード(laminar flow hood)中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液100μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)と、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
物質:
96穴平底滅菌プレート
96穴丸底滅菌プレート
滅菌25ml又は100mlレサバー
ピペット、マルチ−チャンネル・ピペットマン
滅菌ピペットチップ
滅菌15ml管と50ml管
試薬:
1%酢酸中0.4%SRB
10mM Tris塩基
10%TCA
1%酢酸
滅菌DMSO(Sigma)
DMSO中の化合物(100mM以下のストック溶液)
細胞解離溶液(cell dissociation solution)(Sigma)中の25%トリプシン−EDTA
細胞系と増殖培地:
3T3/E/H+TGF−a(T)(EGF−R/HER2キメラ及びTGF−aを発現するNIH3T3クローン7細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞)
2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード(laminar flow hood)中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液100μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)と、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.96穴丸底プレートにおいて、増殖培地125μlをカラム3〜11に加える。このプレートを用いて、化合物を、化合物につき4列を滴定する(titrate out)。
2.滅菌15ml管において、1:250希釈のために合計2ml増殖培地に化合物8μlを加えることによって、化合物の最高濃度の2×溶液を製造する。この希釈で、DMSO濃度は、2×溶液では0.4%であり、細胞上の1×溶液では0.2%である。化合物の出発濃度は通常100μMであるが、この濃度は、化合物の溶解性に依存して変化しうる。
3.2×出発化合物溶液を96穴丸底プレートのカラム12の4通りの穴に移す。カラム12からカラム11へ、カラム11から10へ、以下同様に125μlを移すことによって、該プレートを右から左へ1:2連続希釈を行なう。化合物希釈物100μlを、96穴平底プレートの対応する穴中の細胞上の100μl培地上に移す。穴当りの合計量は200μlになるべきである。
4.ビヒクル対照として、増殖培地中0.4%DMSOで、DMSOの2×溶液を調製する。該DMSO溶液を適当な穴の細胞に加える。DMSOの最終濃度は0.2%である。
5.培地対照穴のために、適当な穴の細胞に増殖培地100μl/穴を加える。
6.該プレートをインキュベーターに戻し、4日間インキュベートする。
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.96穴丸底プレートにおいて、増殖培地125μlをカラム3〜11に加える。このプレートを用いて、化合物を、化合物につき4列を滴定する(titrate out)。
2.滅菌15ml管において、1:250希釈のために合計2ml増殖培地に化合物8μlを加えることによって、化合物の最高濃度の2×溶液を製造する。この希釈で、DMSO濃度は、2×溶液では0.4%であり、細胞上の1×溶液では0.2%である。化合物の出発濃度は通常100μMであるが、この濃度は、化合物の溶解性に依存して変化しうる。
3.2×出発化合物溶液を96穴丸底プレートのカラム12の4通りの穴に移す。カラム12からカラム11へ、カラム11から10へ、以下同様に125μlを移すことによって、該プレートを右から左へ1:2連続希釈を行なう。化合物希釈物100μlを、96穴平底プレートの対応する穴中の細胞上の100μl培地上に移す。穴当りの合計量は200μlになるべきである。
4.ビヒクル対照として、増殖培地中0.4%DMSOで、DMSOの2×溶液を調製する。該DMSO溶液を適当な穴の細胞に加える。DMSOの最終濃度は0.2%である。
5.培地対照穴のために、適当な穴の細胞に増殖培地100μl/穴を加える。
6.該プレートをインキュベーターに戻し、4日間インキュベートする。
5日目:アッセイの進行
アッセイのこの部分は、実験台(bench)上で行なう。
1.培地を吸い出す又は注ぎ出す。冷10%TCA200μlを各穴に加えて、細胞を固定する。プレートを4℃で、少なくとも60分間インキュベートする。
2.TCAを捨て、穴を水で5回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして乾燥させる。
3.細胞を0.4%SRB100μl/穴で10分間染色する。
4.SRBを注ぎ出し、穴を1%酢酸で5回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして、完全に乾燥させる。
5.染料を10mM Tris塩基100μl/穴によって、シェーカー上で5〜10分間可溶化する。
6.Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、570nmにおいて、630nmを基準にしてプレートを読み取る。
アッセイのこの部分は、実験台(bench)上で行なう。
1.培地を吸い出す又は注ぎ出す。冷10%TCA200μlを各穴に加えて、細胞を固定する。プレートを4℃で、少なくとも60分間インキュベートする。
2.TCAを捨て、穴を水で5回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして乾燥させる。
3.細胞を0.4%SRB100μl/穴で10分間染色する。
4.SRBを注ぎ出し、穴を1%酢酸で5回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして、完全に乾燥させる。
5.染料を10mM Tris塩基100μl/穴によって、シェーカー上で5〜10分間可溶化する。
6.Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、570nmにおいて、630nmを基準にしてプレートを読み取る。
アッセイ2:3T3/EGF−R+TGF−a(T)細胞増殖SRBアッセイ
物質と試薬:アッセイ1に関すると同じである。
細胞系と増殖培地:
3T3/EGF−R+TGF−a(T)(EGF−R及びTGF−aを発現するNIH3T3クローン7細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞)、2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液100μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)と、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
物質と試薬:アッセイ1に関すると同じである。
細胞系と増殖培地:
3T3/EGF−R+TGF−a(T)(EGF−R及びTGF−aを発現するNIH3T3クローン7細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞)、2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液100μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)と、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
アッセイ3:3T3/PDGF−βR/PDGF−BB(T)細胞増殖SRBアッセイ
細胞系と増殖培地:
3T3/PDGF−βR/PDGF−BB(T)(PDGFβ−受容体及びPDGF−BBを発現するNIH3T3クローン7細胞、胸腺欠損マウスから切除した腫瘍から)、2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液200μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)を、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、プレートに細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
細胞系と増殖培地:
3T3/PDGF−βR/PDGF−BB(T)(PDGFβ−受容体及びPDGF−BBを発現するNIH3T3クローン7細胞、胸腺欠損マウスから切除した腫瘍から)、2%子ウシ血清/DMEM+2mMグルタミン
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液200μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で60,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、6000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)を、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、プレートに細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
アッセイ4:ヒト平滑筋細胞(SMC)増殖SRBアッセイ
物質と試薬:アッセイ1に関すると同じである。
細胞系と増殖培地:
ヒト大動脈平滑筋細胞(Clonetics)
Clonetics’s Bulletキット:平滑筋基礎培地(SmBM)、これは、ウシ胎児血清(5%)、hFGF(2ng/ml)、hEGF(0.1ng/ml)、インスリン(5.0ng/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)及びアンホテリシンB(50ng/ml)を含有する改変MCDB131である。
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液200μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で20,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、2000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)を、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
物質と試薬:アッセイ1に関すると同じである。
細胞系と増殖培地:
ヒト大動脈平滑筋細胞(Clonetics)
Clonetics’s Bulletキット:平滑筋基礎培地(SmBM)、これは、ウシ胎児血清(5%)、hFGF(2ng/ml)、hEGF(0.1ng/ml)、インスリン(5.0ng/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)及びアンホテリシンB(50ng/ml)を含有する改変MCDB131である。
プロトコール:
0日目:細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
1.細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液200μlをイソトン10mlに移す。細胞をCoulterカウンターでカウントする。
2.細胞を増殖培地中で20,000細胞/mlに希釈する。細胞100μlを96穴平底プレートの各穴に移し、2000細胞/穴を得る。
3.各化合物に対してプレートの半分(4列)を、各化合物濃度に対して4通りの穴を用い、培地対照に対して4穴のセット及びDMSO対照に対して4穴のセットを用いる。
4.プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
5.10%CO2インキュベーター中で37℃において該プレートをインキュベートする。
1日目:化合物の添加:アッセイ1に関すると同じ。
5日目:アッセイの進行:アッセイ1に関すると同じ。
3T3細胞増殖アッセイ
アッセイ1:PDGF誘導BrdU組み込みアッセイ(PDGF-induced BrdU Incrporation Assay)
物質と試薬:
(1)PDGF:ヒトPDGF B/B;1276-956、Boehringer Mannheim, Germany.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、社内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系(3T3engineered cell line):3T3/EGFRc7.
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mMGln中に8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる(serum starved)。
(4)3日目に、リガンド(PDGF=3.8nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(PDGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、デカンティング(decanting)と逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって、培地を除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
アッセイ1:PDGF誘導BrdU組み込みアッセイ(PDGF-induced BrdU Incrporation Assay)
物質と試薬:
(1)PDGF:ヒトPDGF B/B;1276-956、Boehringer Mannheim, Germany.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、社内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系(3T3engineered cell line):3T3/EGFRc7.
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mMGln中に8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる(serum starved)。
(4)3日目に、リガンド(PDGF=3.8nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(PDGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、デカンティング(decanting)と逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって、培地を除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
アッセイ2:EGF誘導BrdU組み込みアッセイ(EGF-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬:
(1)EGF:マウスEGF、201;Toyobo,Co.,Ltd.日本.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:3T3/EGFRc7.
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM中の10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(EGF=2nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(EGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
物質と試薬:
(1)EGF:マウスEGF、201;Toyobo,Co.,Ltd.日本.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:3T3/EGFRc7.
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM中の10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(EGF=2nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(EGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
アッセイ3:EGF誘導Her2由来BrdU組み込み(EGF-induced Her2-driven BrdU Incorporation)
物質と試薬:
(1)EGF:マウスEGF、201;Toyobo,Co.,Ltd.日本.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:
3T3/EGFr/Her2/EGFr(Her2キナーゼ・ドメインを有するEGFr).
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(EGF=2nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(EGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
物質と試薬:
(1)EGF:マウスEGF、201;Toyobo,Co.,Ltd.日本.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:
3T3/EGFr/Her2/EGFr(Her2キナーゼ・ドメインを有するEGFr).
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(EGF=2nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(EGF)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の20時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
アッセイ4:IGF1誘導BrdU組み込みアッセイ(IGF1-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬:
(1)IGF1リガンド:ヒト、組換え体;G511,Promega Corp,USA.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:3T3/IGF1r
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(IGF1=3.3nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(IGF1)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の16時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10AM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
物質と試薬:
(1)IGF1リガンド:ヒト、組換え体;G511,Promega Corp,USA.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、工場内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:3T3/IGF1r
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(IGF1=3.3nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(IGF1)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の16時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10AM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
アッセイ5:インスリン誘導BrdU組み込みアッセイ(Insulin-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬:
(1)インスリン:結晶、ウシ、亜鉛;13007,Gibco BRL,USA.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、社内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:H25
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(インスリン=10nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(インスリン)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の16時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、発色が測光的検出のために充分になるまで、プレート・シェーカー上で室温において20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
物質と試薬:
(1)インスリン:結晶、ウシ、亜鉛;13007,Gibco BRL,USA.
(2)BrdU標識試薬:PBS(pH7.4)中10mM、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(3)FixDenat:固定溶液(使用できる状態)、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
(4)Anti−BrdU−POD:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(5)TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB)、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
(6)PBS洗浄溶液:1×PBS,pH7.4、社内で製造
(7)アルブミン、ウシ(BSA):フラクションV粉末;A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール:
(1)3T3改変細胞系:H25
(2)細胞を96穴プレートにおいて、DMEM、10%CS、2mM Glnに8000細胞/穴で接種する。細胞を5%CO2中、37℃で一晩インキュベートする。
(3)24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、次に、無血清培地(0.1%BSAを含む0%CS DMEM)中で24時間血清欠如させる。
(4)3日目に、リガンド(インスリン=10nM、0.1%BSAを含むDMEM中で調製)と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、0.1%BSAを含む無血清DMEMのみを加え;正対照穴には、リガンド(インスリン)を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は96穴プレートにおいてリガンドと共に無血清DMEM中に用意し、7つの試験濃度に連続希釈する。
(5)リガンド活性化の16時間後に、希釈したBrdU標識試薬(DMEM、0.1%BSA中で1:100)を加えて、細胞をBrdU(最終濃度=10μM)と共に1.5時間インキュベートする。
(6)標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において45分間インキュベートする。
(7)FixDenat溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え(PBS中5%乾燥乳、200μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において30分間インキュベートする。
(8)該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をPBSによって1回洗浄する。anti−BrdU−POD溶液(PBS、1%BSA中で1:100希釈、)を加え(100μl/穴)、プレートをプレート・シェーカー上で室温において90分間インキュベートする。
(9)デカンティングと、穴をPBSによって5回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
(10)TMB基質溶液を加えて(100μl/穴)、発色が測光的検出のために充分になるまで、プレート・シェーカー上で室温において20分間インキュベートする。
(11)Dynatech ELISAプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を410nmにおいて測定する(基準波長としての490nmにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで)。
HUV−EC−Cアッセイ
下記プロトコールをさらに用いて、組成物の活性を測定することができる:
0日目:
1.HUV−EC−C細胞(ヒト臍静脈内皮細胞(American Type Culture Collection ; catalogue no. 1730 CRL))。Dulbecco’sリン酸塩緩衝化生理食塩水(D-PBS;Gibco BRLから入手; catalogue no. 14190-029)によって2回、組織培養フラスコの約1ml/10cm2で洗浄する。非酵素性細胞解離溶液(Sigma Chemical Company; catalogue no.C-1544)中の0.05%トリプシン−EDTAによってトリプシン処理する。0.05%トリプシンは、0.25%トリプシン/1mM EDTA(Gibco; catalogue no. 25200- 049)を細胞解離溶液中で希釈することによって製造した。組織培養フラスコの約1ml/25〜30cm2で、37℃において約5分間トリプシン処理する。細胞が該フラスコから剥離した後に、等量のアッセイ培地を加えて、50ml滅菌遠心分離管(Fisher Scientific;catalogue no.05-539-6)に移す。
2.アッセイ培地を加えることによって、細胞を50ml滅菌遠心分離管中のアッセイ培地約35mlによって洗浄し、上清を吸引し、訳200Xgで10分間遠心分離し、D−PBS35mlによって再懸濁させる。D−PBSによって、洗浄をさらに2回繰り返し、細胞を組織培養フラスコの約1mlアッセイ培地/15cm2中に再懸濁させる。アッセイ培地は、F12K培地(Gibco BRL; catalogue no. 21127-014)+0.5%熱不活化ウシ胎仔血清から成る。細胞をCoulterカウンター(RTM. v Coulter Electronics,Inc.)によってカウントして、アッセイ培地を該細胞に加えて、0.8〜1.0×105細胞/mlの濃度を得る。
3.96穴平底プレートに100μl/穴で、又は0.8〜1.0×104細胞/穴で加える。37℃、5%CO2で約24時間インキュベートする。
下記プロトコールをさらに用いて、組成物の活性を測定することができる:
0日目:
1.HUV−EC−C細胞(ヒト臍静脈内皮細胞(American Type Culture Collection ; catalogue no. 1730 CRL))。Dulbecco’sリン酸塩緩衝化生理食塩水(D-PBS;Gibco BRLから入手; catalogue no. 14190-029)によって2回、組織培養フラスコの約1ml/10cm2で洗浄する。非酵素性細胞解離溶液(Sigma Chemical Company; catalogue no.C-1544)中の0.05%トリプシン−EDTAによってトリプシン処理する。0.05%トリプシンは、0.25%トリプシン/1mM EDTA(Gibco; catalogue no. 25200- 049)を細胞解離溶液中で希釈することによって製造した。組織培養フラスコの約1ml/25〜30cm2で、37℃において約5分間トリプシン処理する。細胞が該フラスコから剥離した後に、等量のアッセイ培地を加えて、50ml滅菌遠心分離管(Fisher Scientific;catalogue no.05-539-6)に移す。
2.アッセイ培地を加えることによって、細胞を50ml滅菌遠心分離管中のアッセイ培地約35mlによって洗浄し、上清を吸引し、訳200Xgで10分間遠心分離し、D−PBS35mlによって再懸濁させる。D−PBSによって、洗浄をさらに2回繰り返し、細胞を組織培養フラスコの約1mlアッセイ培地/15cm2中に再懸濁させる。アッセイ培地は、F12K培地(Gibco BRL; catalogue no. 21127-014)+0.5%熱不活化ウシ胎仔血清から成る。細胞をCoulterカウンター(RTM. v Coulter Electronics,Inc.)によってカウントして、アッセイ培地を該細胞に加えて、0.8〜1.0×105細胞/mlの濃度を得る。
3.96穴平底プレートに100μl/穴で、又は0.8〜1.0×104細胞/穴で加える。37℃、5%CO2で約24時間インキュベートする。
1日目:
1.それぞれの96穴プレートで2倍薬物滴定(two-fold drug titrations)を一般に50μMから0μMまで構成する。上記0日目の工程2に記載したのと同じアッセイ培地を用いる。薬物90μl/穴を200μM(4×最終穴濃度)で、特定プレートカラムの先端穴(top well)に加えることによって、滴定を行なう。ストック薬物濃度は通常DMSO中20mMであるので、200μM薬物濃度は2%DMSOを含有する。それ故、薬物は希釈するけれどもDMSO濃度は一定に維持するために、アッセイ培地(F12K+0.5%ウシ胎仔血清)中2%DMSOに構成した希釈剤を、薬物滴定の希釈剤として用いる。この希釈剤を該カラム中の残りの穴に60μl/穴で加える。該カラムの該先端穴中の200μM薬物希釈物(drug dilution)120μlから60μlを取り出し、該カラムの第2穴中の60μlと混合する。この穴から60μlを取り出し、該カラムの第3穴中の60μlと混合し、2倍滴定が完成するまで、以下同様に行なう。最後の穴の隣接穴を混合する場合に、この穴中の120μlのうちの60μlを取り出し、これを捨てる。DMSO/培地希釈剤60μlを含む最後の穴は、薬物を含有しない対照として残す。それぞれ(1)VEGF(Pepro TechInc., catalogue no. 100-200から入手)、(2)内皮細胞増殖因子(ECGF)(酸性線維芽細胞増殖因子、又はFGFとしても知られる)(Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600から入手)及びアッセイ培地対照のための3通りの穴に対して充分な、滴定済み(titrated)薬物の9カラムを作製する。ECGFは、ナトリウム・ヘパリンを含む製剤(a preparation with sodium heparin)となる。
1.それぞれの96穴プレートで2倍薬物滴定(two-fold drug titrations)を一般に50μMから0μMまで構成する。上記0日目の工程2に記載したのと同じアッセイ培地を用いる。薬物90μl/穴を200μM(4×最終穴濃度)で、特定プレートカラムの先端穴(top well)に加えることによって、滴定を行なう。ストック薬物濃度は通常DMSO中20mMであるので、200μM薬物濃度は2%DMSOを含有する。それ故、薬物は希釈するけれどもDMSO濃度は一定に維持するために、アッセイ培地(F12K+0.5%ウシ胎仔血清)中2%DMSOに構成した希釈剤を、薬物滴定の希釈剤として用いる。この希釈剤を該カラム中の残りの穴に60μl/穴で加える。該カラムの該先端穴中の200μM薬物希釈物(drug dilution)120μlから60μlを取り出し、該カラムの第2穴中の60μlと混合する。この穴から60μlを取り出し、該カラムの第3穴中の60μlと混合し、2倍滴定が完成するまで、以下同様に行なう。最後の穴の隣接穴を混合する場合に、この穴中の120μlのうちの60μlを取り出し、これを捨てる。DMSO/培地希釈剤60μlを含む最後の穴は、薬物を含有しない対照として残す。それぞれ(1)VEGF(Pepro TechInc., catalogue no. 100-200から入手)、(2)内皮細胞増殖因子(ECGF)(酸性線維芽細胞増殖因子、又はFGFとしても知られる)(Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600から入手)及びアッセイ培地対照のための3通りの穴に対して充分な、滴定済み(titrated)薬物の9カラムを作製する。ECGFは、ナトリウム・ヘパリンを含む製剤(a preparation with sodium heparin)となる。
2.0日目そして20(from day 0 and 20)からのHUV−EC−C細胞を0.8〜1.0×104細胞/100μl/穴で含有する96穴アッセイ・プレートに、薬物希釈物50μl/穴を移して、37℃、5%CO2において約2時間インキュベートする。
3.80ng/ml VEGF、20ng/ml ECGF又は培地対照を50μl/穴で各薬物状態に加える。薬物と同様に、増殖因子濃度は4×目的最終濃度である。0日目工程2からのアッセイ培地を用いて、増殖因子の該濃度を作製する。37℃、5%CO2において約24時間インキュベートする。各穴は、50μlの薬物希釈物、50μlの増殖因子又は培地、及び100μlの細胞、全体で=200μl/穴を有することになる。したがって、4×濃度の薬物及び増殖因子は、総てのものを穴に加えると、1×になる。
3.80ng/ml VEGF、20ng/ml ECGF又は培地対照を50μl/穴で各薬物状態に加える。薬物と同様に、増殖因子濃度は4×目的最終濃度である。0日目工程2からのアッセイ培地を用いて、増殖因子の該濃度を作製する。37℃、5%CO2において約24時間インキュベートする。各穴は、50μlの薬物希釈物、50μlの増殖因子又は培地、及び100μlの細胞、全体で=200μl/穴を有することになる。したがって、4×濃度の薬物及び増殖因子は、総てのものを穴に加えると、1×になる。
2日目:
1.3H−チミジン(Amersham; catalogue no. TRK-686)を1μCi/穴(RPMI培地+10%熱不活化ウシ胎仔血清中に構成した100μCi/ml溶液を10μl/穴)で加えて、37℃、5%CO2において約24時間インキュベートする。
1.3H−チミジン(Amersham; catalogue no. TRK-686)を1μCi/穴(RPMI培地+10%熱不活化ウシ胎仔血清中に構成した100μCi/ml溶液を10μl/穴)で加えて、37℃、5%CO2において約24時間インキュベートする。
注:本出願人らが3H−チミジンを用いる他の出願の総てがRPMI中で行なわれた実験を含むので、3H−チミジンをRPMI培地中で構成する。この工程における培地の相違は恐らく重要ではない。RPMIは、Gibco BRL, catalogue no.11875-051から入手した。
3日目:
1.プレートを−20℃において一晩冷凍する。
4日目:
1.プレートを解凍して、96穴プレート回収装置(harvester)(Tomtec Harvester 96. RTM.)によってフィルターマット(Wallac ; catalogue no. 1205-401)上に回収して;Wallac BetaplateTM液体シンチレーション・カウンター上のカウントを読み取る。
1.プレートを−20℃において一晩冷凍する。
4日目:
1.プレートを解凍して、96穴プレート回収装置(harvester)(Tomtec Harvester 96. RTM.)によってフィルターマット(Wallac ; catalogue no. 1205-401)上に回収して;Wallac BetaplateTM液体シンチレーション・カウンター上のカウントを読み取る。
PDGF−R細胞アッセイ
PDGF細胞キナーゼ・アッセイを下記のように行なった:0.2M Hepes、0.15M NaCl、10%V/Vグリセロール、0.04%TritonX−100、5mM EDTA、5mMバナジン酸ナトリウム及び2mMピロリン酸Na+中で細胞を溶解する;次に、細胞溶解物を、抗PDGF受容体抗体(Genzyme)を被覆したELISAプレートに加える;該溶解物を添加する前に、PBS150μl中の抗体0.5μg/穴で、ELISAプレートを4℃において18時間被覆する;該溶解物を該被覆プレートにおいて1時間インキュベートしてから、TBST(35mM Tris−HCl(pH7.0)、0.15M NaCl、0.1%TritonX100)中で4回洗浄し;抗ホスホチロシン抗体(PBS中100μl)を加えて、該混合物を室温において30分間インキュベートする;次に、穴をTBST中で4回洗浄し、POD(TAGO)にコンジュゲートした第2抗体を各穴に加え、処理済み穴を室温において30分間インキュベートする;次に、穴をTBST中で4回洗浄して、ABTS/H2O2溶液を各穴に加え、該穴を2分間インキュベートする;次に、吸光度を410nmにおいて測定する。
PDGF細胞キナーゼ・アッセイを下記のように行なった:0.2M Hepes、0.15M NaCl、10%V/Vグリセロール、0.04%TritonX−100、5mM EDTA、5mMバナジン酸ナトリウム及び2mMピロリン酸Na+中で細胞を溶解する;次に、細胞溶解物を、抗PDGF受容体抗体(Genzyme)を被覆したELISAプレートに加える;該溶解物を添加する前に、PBS150μl中の抗体0.5μg/穴で、ELISAプレートを4℃において18時間被覆する;該溶解物を該被覆プレートにおいて1時間インキュベートしてから、TBST(35mM Tris−HCl(pH7.0)、0.15M NaCl、0.1%TritonX100)中で4回洗浄し;抗ホスホチロシン抗体(PBS中100μl)を加えて、該混合物を室温において30分間インキュベートする;次に、穴をTBST中で4回洗浄し、POD(TAGO)にコンジュゲートした第2抗体を各穴に加え、処理済み穴を室温において30分間インキュベートする;次に、穴をTBST中で4回洗浄して、ABTS/H2O2溶液を各穴に加え、該穴を2分間インキュベートする;次に、吸光度を410nmにおいて測定する。
細胞増殖アッセイの実験結果
上記アッセイから得られた、種々な化合物の結果を、以下の表に記載する:
表2.
上記アッセイから得られた、種々な化合物の結果を、以下の表に記載する:
表2.
表2続き
表2続き
表2続き
表3
表3続き
表4
3T3/E/H+TGF−α(T):EGFR/HER2キメラとTGF−αを発現するNIH3T3細胞、腫瘍由来3T3/EGFR+TGF−α(T):EGFRとTGF−αを発現するNIH3T3細胞、腫瘍由来3T3/PDGFR+PDGF(T):PDGF−βRとPDGF−ββを発現するNIH3T3細胞、腫瘍由来SMC:Cloneticsからのヒト平滑筋細胞
細胞毒性の測定
治療用化合物は、細胞傷害性効果の発揮におけるよりも、受容体チロシンキナーゼ活性の阻害において大きい効力を有するべきである。化合物の有効性及び細胞毒性の指標(measure)は、治療指数:IC50/LD50の算出によって得ることができる。IC50、50%阻害を達成するために必要な用量は、例えば、本明細書に記載するような標準手法を用いて測定することができる。LD50、50%毒性を生じる用量も、標準手法(Mossman, 1983,J.Immunol.Methods,65:55-63)によって、放出されるLDH量の測定(Korzeniewski and Callewaert,1983,J.Immunol.Methods 64:313; Decker and Lohmann-Matthes,1988,J. Immunol.Methods 115:61)によって、又は動物モデルにおける致死量の測定によって測定することができる。大きい治療指数を有する化合物が好ましい。治療指数は、2より大、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも50であるべきである。
治療用化合物は、細胞傷害性効果の発揮におけるよりも、受容体チロシンキナーゼ活性の阻害において大きい効力を有するべきである。化合物の有効性及び細胞毒性の指標(measure)は、治療指数:IC50/LD50の算出によって得ることができる。IC50、50%阻害を達成するために必要な用量は、例えば、本明細書に記載するような標準手法を用いて測定することができる。LD50、50%毒性を生じる用量も、標準手法(Mossman, 1983,J.Immunol.Methods,65:55-63)によって、放出されるLDH量の測定(Korzeniewski and Callewaert,1983,J.Immunol.Methods 64:313; Decker and Lohmann-Matthes,1988,J. Immunol.Methods 115:61)によって、又は動物モデルにおける致死量の測定によって測定することができる。大きい治療指数を有する化合物が好ましい。治療指数は、2より大、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも50であるべきである。
in vivo動物モデル、異種移植動物モデル
胸腺欠損マウス(例えば、Balb/c,nu/nu)において異種移植片として増殖するヒト腫瘍の能力は、ヒト腫瘍の治療法に対する生物学的反応を研究するための有用なin vivoモデルを与える。胸腺欠損マウスへのヒト腫瘍の異物移植の最初の成功(Rygaard and Povisen,1969 Acta Pathol.Microbial Scand.77:758-760)以来、多くの種々なヒト腫瘍細胞系(例えば、***、肺、尿生殖器、胃腸、頭頚部、グリア芽細胞腫、骨、及び悪性黒色腫)が、ヌードマウスに移植されて、首尾よく増殖している。MCF−7、ZR75−I及びMDA−MB−231を包含するヒト***腫瘍細胞系は、ヌードマウスにおける皮下異種移植片として確立されている(Warri et al.,1991,Int.J.Cancer 49: 616-623; Ozzello and Sordat,1980,Eur.J.Cancer 16:553-559; Osborne et al.,1985, Cancer Res.45:584-590; Seibert et al.,1983,Cancer Res. 43:2223-2239)。
胸腺欠損マウス(例えば、Balb/c,nu/nu)において異種移植片として増殖するヒト腫瘍の能力は、ヒト腫瘍の治療法に対する生物学的反応を研究するための有用なin vivoモデルを与える。胸腺欠損マウスへのヒト腫瘍の異物移植の最初の成功(Rygaard and Povisen,1969 Acta Pathol.Microbial Scand.77:758-760)以来、多くの種々なヒト腫瘍細胞系(例えば、***、肺、尿生殖器、胃腸、頭頚部、グリア芽細胞腫、骨、及び悪性黒色腫)が、ヌードマウスに移植されて、首尾よく増殖している。MCF−7、ZR75−I及びMDA−MB−231を包含するヒト***腫瘍細胞系は、ヌードマウスにおける皮下異種移植片として確立されている(Warri et al.,1991,Int.J.Cancer 49: 616-623; Ozzello and Sordat,1980,Eur.J.Cancer 16:553-559; Osborne et al.,1985, Cancer Res.45:584-590; Seibert et al.,1983,Cancer Res. 43:2223-2239)。
アッセイ1:HER2/異種移植動物モデル
HER2発現腫瘍に対する抗腫瘍薬候補の効果を研究するためには、該腫瘍細胞が、補充エストロゲンの不存在下で、増殖することができるべきである。多くの***細胞系は、ヌードマウスにおけるin vivo増殖に関して、エストロゲンに依存している(Osborne et al.,上記文献)、しかし、外因性エストロゲンはヌードマウスにおけるHER2発現を抑制する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,1990,Oncogene 5:1001-1006).
例えば、エストロゲンの存在下では、MCF−7、ZR−75−1及びT47D細胞はin vivoで良好に増殖するが、非常に低レベルのHER2を発現する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,上記文献)。
HER2発現腫瘍に対する抗腫瘍薬候補の効果を研究するためには、該腫瘍細胞が、補充エストロゲンの不存在下で、増殖することができるべきである。多くの***細胞系は、ヌードマウスにおけるin vivo増殖に関して、エストロゲンに依存している(Osborne et al.,上記文献)、しかし、外因性エストロゲンはヌードマウスにおけるHER2発現を抑制する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,1990,Oncogene 5:1001-1006).
例えば、エストロゲンの存在下では、MCF−7、ZR−75−1及びT47D細胞はin vivoで良好に増殖するが、非常に低レベルのHER2を発現する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,上記文献)。
下記種類の異種移植プロトコールを用いることができる:
(1)生後5〜6週間の雌Balbfc nu/nu胸腺欠損マウスの後脇腹に腫瘍細胞を移植する(皮下);
(2)抗腫瘍化合物を投与する;
(3)腫瘍容積の測定によって腫瘍成長を測定する。
(1)生後5〜6週間の雌Balbfc nu/nu胸腺欠損マウスの後脇腹に腫瘍細胞を移植する(皮下);
(2)抗腫瘍化合物を投与する;
(3)腫瘍容積の測定によって腫瘍成長を測定する。
Western及び免疫組織化学的分析によって、例えばHER2、EGF又はPDGFのような、受容体の存在に関して、腫瘍をさらに分析することができる。当該技術分野に知られた手法を用いて、例えば、種々な治療計画の使用によって、当業者は上記方法を変えることができる。
アッセイ2:FLK−1/異種移植片モデル
SC異種移植片として確立されている、卵巣、黒色腫、前立腺、肺及び***腫瘍細胞系を阻害する、本発明の化合物の能力を試験した。これらの研究は、1〜75mg/kg/日の範囲内の用量を用いて行なった。
SC異種移植片として確立されている、卵巣、黒色腫、前立腺、肺及び***腫瘍細胞系を阻害する、本発明の化合物の能力を試験した。これらの研究は、1〜75mg/kg/日の範囲内の用量を用いて行なった。
物質と方法. 腫瘍細胞を、指定系統のマウスの皮下に移植した。特に指定しない限り、移植後1日目に処置を開始した(例えば、A375黒色腫細胞に関するSCIDマウスの治療は、9日目に開始した)。8〜16匹のマウスが各試験グループを構成した。
特異性:
動物. 雌胸腺欠損マウス(BALB/c、nu/nu)、BALB/cマウス、Wistarラット及びFisher344ラットは、Simonsen Laboratories (Gilroy,Calif.)から入手した。雌AIマウスは、Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me.)から入手した。DAラットは、B & K Universal,Inc.(Fremont,Calif.)から入手した。胸腺欠損R/Nuラット、DBA/2Nマウス及びBALB/cマウスは、Harlan Sprague Dawley (Indianapolis,Ind.)から入手した。雌C57BL/6マウスは、Taconic (Germantown, N.Y.)から入手した。総ての動物は、Alpha−dri床敷きを有するMicro−isolatorケージで、クリーンルームの条件下に維持した。動物は、無菌のげっ歯類飼料と水を任意に摂取した。
総ての治療は、NIH Guide for the Care and Use Of Laboratory Animalsに従って行なった。
動物. 雌胸腺欠損マウス(BALB/c、nu/nu)、BALB/cマウス、Wistarラット及びFisher344ラットは、Simonsen Laboratories (Gilroy,Calif.)から入手した。雌AIマウスは、Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me.)から入手した。DAラットは、B & K Universal,Inc.(Fremont,Calif.)から入手した。胸腺欠損R/Nuラット、DBA/2Nマウス及びBALB/cマウスは、Harlan Sprague Dawley (Indianapolis,Ind.)から入手した。雌C57BL/6マウスは、Taconic (Germantown, N.Y.)から入手した。総ての動物は、Alpha−dri床敷きを有するMicro−isolatorケージで、クリーンルームの条件下に維持した。動物は、無菌のげっ歯類飼料と水を任意に摂取した。
総ての治療は、NIH Guide for the Care and Use Of Laboratory Animalsに従って行なった。
皮下異種移植片モデル. 細胞系は、適当な培地中で上述したように増殖させた。細胞を集密又はほぼ集密で0.05%トリプシン−EDTAによって回収し、450xgにおいて10分間ペレット化した。ペレットを滅菌したPBS又は培地(FBS含まず)中に図の凡例(Figure legends)に示した適当な濃度に再懸濁し、該細胞をマウスの後脇腹中に移植した。腫瘍成長を、ベニール・ノギス(venier caliper)を用いて、3〜6週間にわたって測定し、特に指定しない限り、腫瘍容積を長さ×幅×高さの積として計算した。P値は、Students’t−検定を用いて算出した。
賦形剤(ジメチルスルホキシド、PBTE、PBTE6C:D5W又はPBTE:D5W)50〜100μl中の種々な濃度の化合物を、IP注入によってデリバリーした(delivered)。
脳内異種移植片モデル. マウスICモデルに対しては、ラットC6神経膠腫細胞を回収して、滅菌PBS中に2.5×107細胞/mlの濃度で懸濁させて、氷上に置いた。細胞をBALB/c、Nu/nuマウスに下記方法で移植した:70%エタノールによるスワビング(swabbing)の前に、必要に応じて、マウスの前頭頭頂部の頭皮を動物用クリッパーで剃った。動物をイソフルオランによって麻酔し、頭蓋を通して脳の左半球中に針を挿入した。3mmのみの侵入を可能にするスリーブによって装着した30ga1/2インチ針を用いて、Hamiltonガスタイトシリンジから細胞を分配した。細胞懸濁液4μlを正確にデリバリーするために、反復ディスペンサー(repeater dispenser)を用いた。動物を健康に関して毎日モニターして、動物が約40%の体重損失を示すか、及び/又は神経症状を示した場合には、動物を殺した。ラットICモデルに対しては、ラット(Wistar,Sprague Dawley,Fisher344,又は胸腺欠損R/Nu,約200-400g(約3-400g))をケタセット(ketamine hydrochloride;Aveco,Fort Dodge,lowa)100mg/kgと、Rompun(xylazine,2% solution;Bayer,Germany)5mg/kgのIP注入によって麻酔した。麻酔の開始後、頭皮を剃って、動物を定位固定装置(Stoelting,Wood Dale,lit.)に定位させた。切開部位の皮膚を、70%エタノールと10%Povidone−ヨウ素との交互スワブ(alternating swabs)によって3回消毒した。滅菌外科ブレードを用いて、正中1.0〜1.5cm切開を頭皮に行なった。該皮膚を僅かに引き離して、頭蓋表面の縫合を露出するように、両側に引っ張った。歯科用ドリル(Stoelting,Wood Dale,Ill.)を用いて、ブレグマの約1mm前方及び2mm側方の頭蓋に小さい(直径1〜2mm)頭蓋骨孔を作製した。該細胞懸濁液を、23又は25gの標準ベベル針を装着した50μl Hamiltonシリンジに引き入れた。該シリンジを該頭蓋骨孔にくも膜のレベルで定位させ、該針の先端が脳構造中に3mm深さになるまで下げて、細胞懸濁液を徐々に注入した。細胞を注入した後に、該針を該頭蓋骨孔中に1〜2分間残して、細胞を完全にデリバリーさせた。頭蓋を消毒して(cleaned)、皮膚を2〜3個の縫合によって閉じた。動物を手術と麻酔からの回復に関して観察した。実験の間中、脳内腫瘍の進行に関連した症状の発生に関して、動物を毎日少なくとも2回観察した。進行した症状(痩せ(leaning)、平衡感覚の喪失(loss of balance)、脱水、食欲低下、協調性の喪失、グルーミング活動の停止及び/又はかなりの体重損失)を示した動物は、人道的に殺し、問題の器官及び組織を摘出した。
腹腔内モデル. 細胞系を適当な培地中で増殖させた。細胞を回収し、滅菌PBS又は、FBSを含まない培地中で洗浄し、適当な濃度に再懸濁させ、適当な系統のマウスの腹腔内に注入した。マウスを腹水形成の発生に関して毎日観察した。動物が40%の体重増加を示したとき、又はIP腫瘍負担が動物への不当なストレス若しくは痛覚を惹起し始めたときに、個々の動物を殺した。
in vivo VEGFペレット・モデル
下記実験では、ペレット・モデルを用いて、FLK−1受容体に対する化合物の活性及び血管形成に関連した障害に対する化合物の活性を試験した。このモデルにおいて、VEGFを徐放性ペレット(time-release pellet)中にパッケージし、ヌードマウスの腹部に皮下移植して、“発赤”反応及びその後の該ペレット周囲の腫脹(swelling)を誘導した。次に、可能性のあるFLK−1阻害剤をメチルセルロース中で、VEGFペレット近くに移植して、このような阻害剤を発赤反応及びその後の腫脹を阻害するために用いることができるか否かを決定することができる。
下記実験では、ペレット・モデルを用いて、FLK−1受容体に対する化合物の活性及び血管形成に関連した障害に対する化合物の活性を試験した。このモデルにおいて、VEGFを徐放性ペレット(time-release pellet)中にパッケージし、ヌードマウスの腹部に皮下移植して、“発赤”反応及びその後の該ペレット周囲の腫脹(swelling)を誘導した。次に、可能性のあるFLK−1阻害剤をメチルセルロース中で、VEGFペレット近くに移植して、このような阻害剤を発赤反応及びその後の腫脹を阻害するために用いることができるか否かを決定することができる。
物質と方法: 下記物質を用いた:
(1)VEGF−ヒト組換え体凍結乾燥製品は商業的に入手可能であり、Peprotech,Inc.,Princeton Business Park,G2;P.O.box 275,Rocky Hill,N.J.08553から入手することができる。
(2)21日放出ペレット(21day release pellets)中にパッケージされたVEGFを、Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P. O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606)から、特許化されたマトリックス・ドライブン・デリバリー・システム(patented matrix driven delivery system)を用いて入手した。ペレットは、0.20、0.21又は2.1μgVEGF/ペレットでパッケージした。これらの用量は、10ng/日及び100ng/日のVEGF放出に近似する。
(3)メチルセルロース
(4)水(滅菌)
(5)メタノール
(6)適当な薬物/阻害剤
(7)10cm培養プレート
(8)パラフィン
次に、下記プロトコールに従って、VEGFペレット・モデルを処理する:
(1)Peprotechから購入したVEGFを慣用的なペレット調製のためにInnovative Researchに送った;
(2)メチルセルロース、滅菌水中1.5%(w/v)に調製;
(3)薬物をメタノール中で可溶化した(通常濃度範囲=10〜20mg/ml);
(4)滅菌パラフィンを滅菌10cmプレートに入れた;
(5)メタノール中の薬物150μlを1.5%メチルセルロース1.35mlに加えて、よく混合した/渦流させた;
(6)該ホモジネートの25μlアリコートをパラフィン上に置き、ディスク状に乾燥させた;
(7)マウス(生後6〜10週間、Balb/c胸腺欠損マウスnu/nu、雌)をイソフルラン吸入で麻酔した;
(8)VEGFペレットとメチルセルロース・ディスクを腹部に皮下移植した;並びに
(9)24時間目と48時間目に、マウスを発赤及び腫脹反応に関して記録した。
(1)VEGF−ヒト組換え体凍結乾燥製品は商業的に入手可能であり、Peprotech,Inc.,Princeton Business Park,G2;P.O.box 275,Rocky Hill,N.J.08553から入手することができる。
(2)21日放出ペレット(21day release pellets)中にパッケージされたVEGFを、Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P. O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606)から、特許化されたマトリックス・ドライブン・デリバリー・システム(patented matrix driven delivery system)を用いて入手した。ペレットは、0.20、0.21又は2.1μgVEGF/ペレットでパッケージした。これらの用量は、10ng/日及び100ng/日のVEGF放出に近似する。
(3)メチルセルロース
(4)水(滅菌)
(5)メタノール
(6)適当な薬物/阻害剤
(7)10cm培養プレート
(8)パラフィン
次に、下記プロトコールに従って、VEGFペレット・モデルを処理する:
(1)Peprotechから購入したVEGFを慣用的なペレット調製のためにInnovative Researchに送った;
(2)メチルセルロース、滅菌水中1.5%(w/v)に調製;
(3)薬物をメタノール中で可溶化した(通常濃度範囲=10〜20mg/ml);
(4)滅菌パラフィンを滅菌10cmプレートに入れた;
(5)メタノール中の薬物150μlを1.5%メチルセルロース1.35mlに加えて、よく混合した/渦流させた;
(6)該ホモジネートの25μlアリコートをパラフィン上に置き、ディスク状に乾燥させた;
(7)マウス(生後6〜10週間、Balb/c胸腺欠損マウスnu/nu、雌)をイソフルラン吸入で麻酔した;
(8)VEGFペレットとメチルセルロース・ディスクを腹部に皮下移植した;並びに
(9)24時間目と48時間目に、マウスを発赤及び腫脹反応に関して記録した。
この実施例に用いた特定の実験設計は下記に示す:
N=4動物/グループ
対照: VEGFペレット+薬物プラセボ、VEGFプラセボ+薬物ペレット、
実験結果. 本発明の化合物は、このアッセイによって活性を実証した。
N=4動物/グループ
対照: VEGFペレット+薬物プラセボ、VEGFプラセボ+薬物ペレット、
実験結果. 本発明の化合物は、このアッセイによって活性を実証した。
***脂肪体モデル(mammary fat pad model)
乳癌において多くのRTKs(例えば、HER2受容体)が果たす確立された役割のために、このようなRTKsを阻害する化合物の効力の測定において、***脂肪体モデルが特に有用である。腫瘍細胞を問題の位置に直接移植することによって、その場モデル(in situ model)は腫瘍発生の生物学を、皮下モデルよりも正確に示す。MCF−7を含めた、ヒト***細胞系は、胸腺欠損マウスの***脂肪体において増殖されている。Shafie and Grantham,1981,Natl.Cancer Instit.67:51-56; Gottardis et al.,1988,J.Steroid Biochem. 30: 311-314。より詳しくは、下記手段を用いて、HER2受容体に対する化合物の阻害効果を測定することができる:
(1)HER2をトランスフェクトされた、MDA−MB−231及びMCF−7細胞を、種々な濃度で、雌胸腺欠損マウスの腋窩***脂肪体(axillary mammary fat pad)中に移植する;
(2)化合物を投与する;並びに
(3)種々な時点で腫瘍成長を測定する。
乳癌において多くのRTKs(例えば、HER2受容体)が果たす確立された役割のために、このようなRTKsを阻害する化合物の効力の測定において、***脂肪体モデルが特に有用である。腫瘍細胞を問題の位置に直接移植することによって、その場モデル(in situ model)は腫瘍発生の生物学を、皮下モデルよりも正確に示す。MCF−7を含めた、ヒト***細胞系は、胸腺欠損マウスの***脂肪体において増殖されている。Shafie and Grantham,1981,Natl.Cancer Instit.67:51-56; Gottardis et al.,1988,J.Steroid Biochem. 30: 311-314。より詳しくは、下記手段を用いて、HER2受容体に対する化合物の阻害効果を測定することができる:
(1)HER2をトランスフェクトされた、MDA−MB−231及びMCF−7細胞を、種々な濃度で、雌胸腺欠損マウスの腋窩***脂肪体(axillary mammary fat pad)中に移植する;
(2)化合物を投与する;並びに
(3)種々な時点で腫瘍成長を測定する。
さらに、Western及び免疫組織化学的分析によって、例えばHER2のような受容体の存在に関して、腫瘍を分析することもできる。当該技術分野に知られた手法を用いて、当業者は、例えば種々な治療計画を用いて、上記方法を変えることができる。
腫瘍浸潤モデル
下記腫瘍浸潤モデルが開発されており、問題の化合物の治療的価値(therapeutic value)及び効力を評価するために用いることができる。
方法:
生後8週間のヌードマウス(雌)(Simonsen Inc.)を実験動物として用いた。腫瘍細胞の移植は、層流フード内で行なった。麻酔のためには、キシラジン/ケタミン・カクテル(100mg/kgケタミン及び5mg/kg)を腹腔内に投与する。正中線切開を行なって、腹腔を露出し(長さ、約1.5cm)、100μl培地量中の107腫瘍細胞を注入する。細胞は、膵臓の十二指腸葉(duodenal lobe of pancreas)中、又は結腸の漿膜下のいずれかに注入する。腹腔と筋肉とを6−0シルク連続縫合糸によって閉じて、皮膚を創傷クリップを用いて閉じた。動物を毎日観察した。
下記腫瘍浸潤モデルが開発されており、問題の化合物の治療的価値(therapeutic value)及び効力を評価するために用いることができる。
方法:
生後8週間のヌードマウス(雌)(Simonsen Inc.)を実験動物として用いた。腫瘍細胞の移植は、層流フード内で行なった。麻酔のためには、キシラジン/ケタミン・カクテル(100mg/kgケタミン及び5mg/kg)を腹腔内に投与する。正中線切開を行なって、腹腔を露出し(長さ、約1.5cm)、100μl培地量中の107腫瘍細胞を注入する。細胞は、膵臓の十二指腸葉(duodenal lobe of pancreas)中、又は結腸の漿膜下のいずれかに注入する。腹腔と筋肉とを6−0シルク連続縫合糸によって閉じて、皮膚を創傷クリップを用いて閉じた。動物を毎日観察した。
分析
2〜6週間後に、動物の肉眼観察に応じて、マウスを殺して、種々な器官(肺、肝臓、脳、胃、脾臓、心臓、筋肉)への局部腫瘍転移を摘出して、分析する(腫瘍サイズ、浸潤度、免疫化学及びin situハイブリッド形成の測定)。
2〜6週間後に、動物の肉眼観察に応じて、マウスを殺して、種々な器官(肺、肝臓、脳、胃、脾臓、心臓、筋肉)への局部腫瘍転移を摘出して、分析する(腫瘍サイズ、浸潤度、免疫化学及びin situハイブリッド形成の測定)。
結果
上記in vivoアッセイから得られた種々な化合物の結果を以下の表5に記載する:
表5
上記in vivoアッセイから得られた種々な化合物の結果を以下の表5に記載する:
表5
本発明は、例示した実施態様によって、範囲を限定されることはなく、該実施態様は本発明の1つの側面の例示として意図される。実際に、本明細書に記載したものに加え本発明の種々な改変が、上記説明から明らかであると思われる。このような改変は、特許請求の範囲内に入ると意図される。
本明細書に引用した総ての参考文献は、それらの全体で、本明細書に援用される。
本明細書に引用した総ての参考文献は、それらの全体で、本明細書に援用される。
実施例3
CelecoxibとSU−5416との組み合わせは、HN1483腫瘍モデルにおいて腫瘍抑制を生じる
ヒト腫瘍異種移植ヌードマウス(HN1483)を、CelecoxibとSU−5416との組み合わせの腫瘍抑制効果の研究に用いた。頭頚部扁平上皮細胞癌(1483細胞系)のヒト腫瘍異種移植ヌードマウスは、ヒト上皮癌と同様に、腫瘍細胞及び脈管構造にCOX−2を発現する。Matrigel(30%)を腫瘍成長の100%発生をもたらす細胞懸濁液と混合する。このようにして、腫瘍細胞及び脈管構造にシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)を発現するHN1483マウス・ヒト上皮癌は、COX−2阻害剤を包含する抗癌薬の効力をヒトにおける効力に相関づけるための良好なモデルである。
CelecoxibとSU−5416との組み合わせは、HN1483腫瘍モデルにおいて腫瘍抑制を生じる
ヒト腫瘍異種移植ヌードマウス(HN1483)を、CelecoxibとSU−5416との組み合わせの腫瘍抑制効果の研究に用いた。頭頚部扁平上皮細胞癌(1483細胞系)のヒト腫瘍異種移植ヌードマウスは、ヒト上皮癌と同様に、腫瘍細胞及び脈管構造にCOX−2を発現する。Matrigel(30%)を腫瘍成長の100%発生をもたらす細胞懸濁液と混合する。このようにして、腫瘍細胞及び脈管構造にシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)を発現するHN1483マウス・ヒト上皮癌は、COX−2阻害剤を包含する抗癌薬の効力をヒトにおける効力に相関づけるための良好なモデルである。
HN1483プロトコール
物質と方法:
細胞培養:
1483ヒト頭頚部扁平上皮細胞癌(HNSCC)細胞を、3×106細胞、90%ウシ胎仔血清(FBS)及び10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する冷凍バイアル中に保存する。冷凍バイアルを取り出し、37℃において素早く解凍して、15mM Hepesバッファー、L−グルタミン、ピリドキシン塩酸塩及び10%FBSと共にD−MEM/F12培地(GibcoBRL)を含有するT−162cm2(Corning)中に入れた。細胞をインキュベーターにおいて5%CO2及び37℃の温度で増殖させる。培地を隔日で変え、80〜90%集密度に達したときに、細胞を継代させる。細胞の継代のために、フラスコをリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)10mlで洗浄し、吸引し、トリプシン/EDTA(0.25%/1mM、GibcoBRL)2mlを加えて、インキュベーターに戻し入れ、5分間後に、細胞は剥離する(detach)。上記培地8mlをフラスコに加えて、リンスし(rinse)、滅菌した50ml遠心分離管に移す。さらに30mlの培地を加えて、混合し、ヘマサイトメーター(hemacytometer)を用いて、細胞をカウントし、3〜4×106細胞を含有するT−162cm2中で細胞をプレートする(plate out)。
物質と方法:
細胞培養:
1483ヒト頭頚部扁平上皮細胞癌(HNSCC)細胞を、3×106細胞、90%ウシ胎仔血清(FBS)及び10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する冷凍バイアル中に保存する。冷凍バイアルを取り出し、37℃において素早く解凍して、15mM Hepesバッファー、L−グルタミン、ピリドキシン塩酸塩及び10%FBSと共にD−MEM/F12培地(GibcoBRL)を含有するT−162cm2(Corning)中に入れた。細胞をインキュベーターにおいて5%CO2及び37℃の温度で増殖させる。培地を隔日で変え、80〜90%集密度に達したときに、細胞を継代させる。細胞の継代のために、フラスコをリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)10mlで洗浄し、吸引し、トリプシン/EDTA(0.25%/1mM、GibcoBRL)2mlを加えて、インキュベーターに戻し入れ、5分間後に、細胞は剥離する(detach)。上記培地8mlをフラスコに加えて、リンスし(rinse)、滅菌した50ml遠心分離管に移す。さらに30mlの培地を加えて、混合し、ヘマサイトメーター(hemacytometer)を用いて、細胞をカウントし、3〜4×106細胞を含有するT−162cm2中で細胞をプレートする(plate out)。
1483動物モデル:
ヌードマウスに注入する前に、1483細胞の回収前24時間に培地を変える。細胞培養の項で上述したように1483細胞をトリプシン処理する。細胞をカウントし、細胞数を決定する。細胞を室温で1000rpmにおいて5分間遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を(複数の50ml遠心分離管が存在する場合には)1本の50ml遠心分離管にHank’s緩衝化生理食塩水溶液(HBSS、GibcoBRL)と共にプールして、前述のように遠心分離する。追加の細胞(extra cell)は必要に応じて入手することができる。細胞をマウスに注入するように準備する。1483細胞を0.03ml/マウス、全体量100マウス×0.03ml=3ml中1×106細胞で注入する。細胞を、30%Matrigel(Collaborative Biomedical Products)及び70%HBSSと共に注入する。プールしたペレットを冷HBSS2.1ml(70%)によって再懸濁させ、次に、解凍済み液化冷Matrigel0.9ml(30%)を加え、氷上で充分に混合する。この細胞準備物(cell prep)を、マウスに注入するまで常に、氷上に保存する。
ヌードマウスに注入する前に、1483細胞の回収前24時間に培地を変える。細胞培養の項で上述したように1483細胞をトリプシン処理する。細胞をカウントし、細胞数を決定する。細胞を室温で1000rpmにおいて5分間遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を(複数の50ml遠心分離管が存在する場合には)1本の50ml遠心分離管にHank’s緩衝化生理食塩水溶液(HBSS、GibcoBRL)と共にプールして、前述のように遠心分離する。追加の細胞(extra cell)は必要に応じて入手することができる。細胞をマウスに注入するように準備する。1483細胞を0.03ml/マウス、全体量100マウス×0.03ml=3ml中1×106細胞で注入する。細胞を、30%Matrigel(Collaborative Biomedical Products)及び70%HBSSと共に注入する。プールしたペレットを冷HBSS2.1ml(70%)によって再懸濁させ、次に、解凍済み液化冷Matrigel0.9ml(30%)を加え、氷上で充分に混合する。この細胞準備物(cell prep)を、マウスに注入するまで常に、氷上に保存する。
雄ヌードマウス生後4〜6週間を研究に用いた(Harlen)。マウスをCO2/O2ガスを用いて麻酔し、マウスの右後足の中央に0.5ccツベルクリン注射器(Beckerson & Dickerson)を用いて注入する。研究開始の基準重量として、注入日(0日目)にマウスの体重を計量する。7日目に開始して、マウスを計量し、プレチスモメーター(Stoelting Co.)を用いて、後足腫瘍容積のために右後足を測定する。プレチスモメーターは、水置換によって後足容積を測定する装置である。若干の注入されない左後足を測定し、バックグラウンド測定値として平均して、右の腫瘍含有後足から控除する。研究を通して、7、10、14、17、21、24及び28日目に、マウスを計量し、測定する。動物は、0日目に化合物治療(compound treatment)を開始してもよく(予防的)、又は約7日目に腫瘍の存在が確証されると化合物治療を開始してもよい(治療的)。約30日目にビヒクル(対照)マウスは大きい腫瘍(約1.0〜1.5ml)を有し、体重が低下し始める、この時点で、ビヒクル動物を終了させることができる。
Celecoxib、SU−5416及びこれらの組み合わせによるHN1483マウスの治療プロトコール
結果:
(1)腫瘍成長、抑制
(2)健康評価としての体重
細胞を、30%Matrigelを含むHBSS中の1×106細胞/後足の濃度で、右後足に注入する。
結果:
(1)腫瘍成長、抑制
(2)健康評価としての体重
細胞を、30%Matrigelを含むHBSS中の1×106細胞/後足の濃度で、右後足に注入する。
SU−5416は、毎日s.c.投与し、Celecoxibは、半分は食餌中で、半分は強制栄養によって(by gavage)11:00amに投与される。動物の耳に切れ目を入れ、床敷きを含むポリカーブ(polycarbs)中に、4匹/ポリカーブで収容した。動物を到着時に標準Chawミールを与え、腫瘍のサイズが100〜200μlになったときにChawミール中の試験化合物を与えて、研究を通して化合物ミールを与え続けた。体重を週2回測定した。腫瘍容積を週2回プレチスモメーターを用いて測定した。
処置したマウスの腫瘍容積に関するデータ
表6は、処置したマウスの腫瘍容積測定値を示す未加工データを例示する。
処置したHN1483マウスの重量に関するデータ
Celecoxib、SU−5416及びこれらの組み合わせによって処置したHN1483マウスの重量に関するデータを表7に再現する。
表6は、処置したマウスの腫瘍容積測定値を示す未加工データを例示する。
処置したHN1483マウスの重量に関するデータ
Celecoxib、SU−5416及びこれらの組み合わせによって処置したHN1483マウスの重量に関するデータを表7に再現する。
表6
表6続き
表7
表7続き
Claims (74)
- 新生物障害の治療又は予防を必要とする対象における新生物障害の治療又は予防方法であって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグとの組み合わせの治療有効量で、該対象を治療することを含む方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノンが、式:
(式中、R1は、H又はアルキルであり;R2は、O又はSであり;R3は、水素であり;R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’から成る群から選択される;
Aは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、1,2,3−トリアゾール、1,2,4−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、2−スルホニルフラン、4−アルキルフラン、1,2,3−オキサジアゾール、1,2,4−オキサジアゾール、1,2,5−オキサジアゾール、1,3,4−オキサジアゾール、1,2,3,4−オキサトリアゾール、1,2,3,5−オキサトリアゾール、1,2,3−チアジアゾール、1,2,4−チアジアゾール、1,2,5−チアジアゾール、1,3,4−チアジアゾール、1,2,3,4−チアトリアゾール、1,2,3,5−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、1つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、S(O)R、SO2NRR’、SO3R、SR、NO2、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R、及びCONRR’によって置換される;
nは、0〜3であり;Rは、H、アルキル又はアリールであり;R’は、H、アルキル又はアリールである。) - 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物が、3−[(3−メチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,4−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(2−メチルチエン−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−{[4−(2−メトキシカルボニルエチル)−3−メチルピロル−5−イル)]メチレン}−2−インドリノン;3−[(4,5−ジメチル−3−エチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(5−メチルイミダゾル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(5−メチルチエン−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−5−ニトロ−2−インドリノン;3−[(3−(2−カルボキシエチル)−4−メチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;5−クロロ−3−[(3,5−ジメチルピロル−2−イル)メチレン]−2−インドリノン;又は3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン;又はこれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項2記載の方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物が、3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項3記載の方法。
- 該新生物が、末端性ほくろ性黒色腫、日光性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細管、類癌腫、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫/癌腫、明細胞癌、嚢胞状腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜腺癌、上衣、類上皮、ユーイング肉腫、層状化線維、限局性結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、胚細胞腫瘍、グリア芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症(hepatic adenomatosis)、肝細胞癌、インシュリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平細胞新生物、浸潤性扁平細胞腫、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性ほくろ性黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、骨髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮(mesothelial)、転移性癌、粘類表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞(origodendroglial)、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)、横紋筋肉腫、肉腫、重篤癌(serious caricnoma)、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下(submesothelial)、表在拡大型黒色腫(superficial spreading melanoma)、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ビポーマ、分化癌(well differentiated carcinoma)、及びウィルムス腫瘍から成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- 該組み合わせを逐次的に投与する、請求項1記載の方法。
- 該組み合わせを実質的に同時に投与する、請求項1記載の方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、約0.01〜約20mg/日の範囲内である、請求項1記載の方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を経口投与する、請求項1記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約0.01〜約20mg/日である、請求項9記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、懸濁液剤又はエマルジョン剤として、局所投与する、請求項1記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約0.01%〜約10%である、請求項11記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を静脈内投与する、請求項1記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約0.01〜約20mg/日である、請求項13記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を直腸投与する、請求項1記載の新生物治療方法。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約0.01〜約20mg/日である、請求項15記載の新生物治療方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、約0.2μmol/L未満のシクロオキシゲナーゼ−2 IC50を有する、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、少なくとも約1μmol/Lのシクロオキシゲナーゼ−1 IC50を有する、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、少なくとも約10μmol/Lのシクロオキシゲナーゼ−1 IC50を有する、請求項18記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、クロメンを含む、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、一般式:
で示される、置換したベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン又はジヒドロナフタレン又はその異性体から成り、それらのジアステレオマー、エナンチオマー、ラセメート、互変異性体、塩、エステル、アミド、薬学的に許容される塩及びプロドラッグを包含する群から選択される、請求項21記載の方法。 - 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、式:
(式中、
Yは、O又はS又はNRbから成る群から選択される;Rbはアルキルである;R5は、カルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択される;R6は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、この場合、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールは、それぞれ独立に、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルによって場合によっては置換される;R7は、ヒドリド、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル、及びアルキルカルボニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルである;又はR7は、環Aと共にナフチル・ラジカルを形成する。) - 該式において、Yが、酸素及び硫黄から成る群から選択され;R5が、カルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル及び低級アルコキシカルボニルから成る群から選択され;R6が、低級ハロアルキル、低級シクロアルキル及びフェニルから成る群から選択され;R7が、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、及び低級アルキルカルボニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルであるか、又はR7が、環Aと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項23記載の方法。
- 該式において、R5がカルボキシルであり;R6が、低級ハロアルキルであり;R7が、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、及び低級アルキルカルボニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルであるか、又はR7が、環Aと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項23記載の方法。
- 該式において、R6が、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル、及びトリフルオロメチルから成る群から選択され;R7が、ヒドリド、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、tert−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、N,N−ジメチルアミノ、N,N−ジエチルアミノ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、ニトロ、N,N−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−エチルスルホニル、2,2−ジメチルエチルアミノスルホニル、N,N−ジメチルエチルアミノスルホニル、N−(2−メチルプロピル)アミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、2,2−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル及びフェニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルであるか;又はR2が、環Aと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項23記載の方法。
- 該式において、R6が、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルから成る群から選択され;R7が、ヒドリド、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、N−(2,2−ジメチルエチル)アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、2−メチルプロピルアミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル及びフェニルから成る群から選択される1つ以上のラジカルであるか;又はR7が、環Aと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項23記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、
(a1)8−アセチル−3−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニル)フェニル−イミダゾ(1,2−a)ピリジン;
(a2)5,5−ジメチル−4−(4−メチルスルホニル)フェニル−3−フェニル−2−(5H)−フラノン;
(a3)5−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール;
(a4)4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−フェニル−3−(トリフルオロメチル)ピラゾール;
(a5)4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(a6)4−(3,5−ビス(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(a7)4−(5−(4−クロロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(a8)4−(3,5−ビス(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(a9)4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(a10)4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(b1)4−(5−(4−クロロフェニル)−3−(5−クロロ−2−チエニル)−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(b2)4−(4−クロロ−3,5−ジフェニル−1H−ピラゾル−1−イル)ベンゼンスルホンアミド;
(b3)4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b4)4−[5−フェニル−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b5)4−[5−(4−フルオロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b6)4−[5−(4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b7)4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b8)4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b9)4−[4−クロロ−5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(b10)4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メチルフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c1)4−[3−(ジフルオロメチル)−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c2)4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c3)4−[3−シアノ−5−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c4)4−[3−(ジフルオロメチル)−5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c5)4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c6)4−[4−クロロ−5−フェニル−1H−ピラゾル−1−イル}ベンゼンスルホンアミド;
(c7)4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(ヒドロキシメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c8)4−[5−(4−(N,N−ジメチルアミノ)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(c9)5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン;
(c10)4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(d1)6−(4−フルオロフェニル)−7−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[3.4]オクタ−6−エン;
(d2)5−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン;
(d3)4−[6−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(d4)5−(3,5−ジクロロ−4−メトキシフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン;
(d5)5−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−5−エン;
(d6)4−[6−(3,4−ジクロロフェニル)スピロ[2.4]ベンゼンスルホンアミド;
(d7)2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール;
(d8)2−(2−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)チアゾール;
(d9)5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−メチルチアゾール;
(d10)4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール;
(e1)4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(2−チエニル)チアゾール;
(e2)4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−ベンジルアミノチアゾール;
(e3)4−(4−フルオロフェニル)−5−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−(1−プロピルアミノ)チアゾール;
(e4)2−[(3,5−ジクロロフェノキシ)メチル]−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]チアゾール;
(e5)5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチルチアゾール;
(e6)1−メチルスルホニル−4−[1,1−ジメチル−4−(4−フルオロフェニル)シクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼン:
(e7)4−[4−(4−フルオロフェニル)−1,1−ジメチルシクロペンタ−2,4−ジエン−3−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(e8)5−(4−フルオロフェニル)−6−[4−(メチルスルホニル)フェニル]スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン;
(e9)4−[6−(4−フルオロフェニル)スピロ[2.4]ヘプタ−4,6−ジエン−5−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(e10)6−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル;
(f1)2−ブロモ−6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−ピリジン−3−カルボニトリル;
(f2)6−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−ピリジン−3−カルボニトリル;
(f3)4−[2−(4−メチルピリジン−2−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(f4)4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(f5)4−[2−(2−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(f6)3−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ピリジン;
(f7)2−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ピリジン;
(f8)2−メチル−4−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン;
(f9)2−メチル−6−[1−[4−(メチルスルホニル)フェニル−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン;
(f10)4−[2−(6−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(g1)2−(3,4−ジフルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール;
(g2)4−[2−(4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(g3)2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−メチル−1H−イミダゾール;
(g4)2−(4−クロロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−フェニル−1H−イミダゾール;
(g5)2−(4−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1H−イミダゾール;
(g6)2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール;
(g7)1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール;
(g8)2−(4−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール;
(g9)4−[2−(3−クロロ−4−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(g10)2−(3−フルオロ−5−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール;
(h1)4−[2−(3−フルオロ−5−メチルフェニル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(h2)2−(3−メチルフェニル)−1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール;
(h3)4−[2−(3−メチルフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(h4)1−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール;
(h5)4−[2−(3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(h6)4−[2−フェニル−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(h7)4−[2−(4−メトキシ−3−クロロフェニル)−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(h8)1−アリル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール;
(h10)4−[1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−3−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(i1)N−フェニル−[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセトアミド;
(i2)エチル[4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]アセテート;
(i3)4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−1H−ピラゾール;
(i4)4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−1−(2−フェニルエチル)−5−(トリフルオロメチル)ピラゾール;
(i5)1−エチル−4−(4−フルオロフェニル)−3−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール;
(i6)5−(4−フルオロフェニル)−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−2−トリフルオロメチル−1H−イミダゾール;
(i7)4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−5−(2−チオフェニル)−2−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾール;
(i8)5−(4−フルオロフェニル)−2−メトキシ−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン;
(i9)2−エトキシ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン;
(i10)5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−(2−プロピニルオキシ)−6−(トリフルオロメチル)ピリジン;
(j1)2−ブロモ−5−(4−フルオロフェニル)−4−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−6−(トリフルオロメチル)ピリジン;
(j2)4−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)−4,5−ジフルオロフェニル]ベンゼンスルホンアミド;
(j3)1−(4−フルオロフェニル)−2−[4−(メチルスルホニル)フェニル]ベンゼン;
(j4)5−ジフルオロメチル−4−(4−メチルスルホニルフェニル)−3−フェニルイソオキサゾール;
(j5)4−[3−エチル−5−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(j6)4−[5−ジフルオロメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(j7)4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(j8)4−[5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(j9)1−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(j10)1−[2−(4−フルオロ−2−メチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k1)1−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k2)1−[2−(2,4−ジクロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k3)1−[2−(4−トリフルオロメチルフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k4)1−[2−(4−メチルチオフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k5)1−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k6)4−[2−(4−フルオロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(k7)1−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(k8)4−[2−(4−クロロフェニル)−4,4−ジメチルシクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(k9)4−[2−(4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(k10)4−[2−(4−クロロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(l1)1−[2−(4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(l2)1−[2−(2,3−ジフルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(l3)4−[2−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(l4)1−[2−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)シクロペンテン−1−イル]−4−(メチルスルホニル)ベンゼン;
(l5)4−[2−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(l6)4−[2−(2−メチルピリジン−5−イル)シクロペンテン−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(l7)エチル2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]−2−ベンジル−アセテート;
(l8)2−[4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾル−2−イル]酢酸;
(l9)2−(tert−ブチル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール;
(l10)4−(4−フルオロフェニル)−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]−2−フェニルオキサゾール;
(m1)4−(4−フルオロフェニル)−2−メチル−5−[4−(メチルスルホニル)フェニル]オキサゾール;及び
(m2)4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−2−トリフルオロメチル−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド;
(m3)6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m4)6−クロロ−7−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m5)8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m6)6−クロロ−7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m7)6−クロロ−8−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m8)2−トリフルオロメチル−3H−ナフトピラン−3−カルボン酸;
(m9)7−(1,1−ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(m10)6−ブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n1)8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n2)6−トリフルオロメトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n3)5,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n4)8−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n5)7,8−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n6)6,8−ビス(ジメチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n7)7−(1−メチルエチル)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n8)7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n9)6−クロロ−7−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(n10)6−クロロ−8−エチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o1)6−クロロ−7−フェニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o2)6,7−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o3)6,8−ジクロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o4)2−トリフルオロメチル−3H−ナフト[2.1−b]ピラン−3−カルボン酸;
(o5)6−クロロ−8−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o6)8−クロロ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o7)8−クロロ−6−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o8)6−ブロモ−8−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o9)8−ブロモ−6−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(o10)8−ブロモ−6−メチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p1)8−ブロモ−5−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p2)6−クロロ−8−フルオロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p3)6−ブロモ−8−メトキシ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p4)6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p5)6−[(ジメチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p6)6−[(メチルアミノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p7)6−[(4−モルホリノ)スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p8)6−[(1,1−ジメチルエチル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p9)6−[(2−メチルプロピル)アミノスルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(p10)6−メチルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q1)8−クロロ−6−[[(フェニルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q2)6−フェニルアセチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q3)6,8−ジブロモ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q4)8−クロロ−5,6−ジメチル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q5)6,8−ジクロロ−(S)−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q6)6−ベンジルスルホニル−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q7)6−[[N−(2−フリルメチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q8)6−[[N−(2−フェニルエチル)アミノ]スルホニル]−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q9)6−ヨード−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(q10)7−(1,1−ジメチルエチル)−2−ペンタフルオロエチル−2H−1−ベンゾピラン−3−カルボン酸;
(r1)5,5−ジメチル−3−(3−フルオロフェニル)−4−(4−メチル−スルホニル)−2(5H)−フラノン;
(r2)6−クロロ−2−トリフルオロメチル−2H−1−ベンゾチオピラン−3−カルボン酸;
(r3)4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(r4)4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(r5)4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル)−3−(ジフルオロメチル)−1H−ピラゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(r6)3−[1−(4−メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン;
(r7)2−メチル−5−[1−(4−メチルスルホニル)フェニル]−4−トリフルオロメチル−1H−イミダゾル−2−イル]ピリジン;
(r8)4−[2−(5−メチルピリジン−3−イル)−4−(トリフルオロメチル)−1H−イミダゾル−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(r9)4−[5−メチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(r10)4−[5−ヒドロキシメチル−3−フェニルイソオキサゾル−4−イル]ベンゼンスルホンアミド;
(s1)[2−トリフルオロメチル−5−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド;
(s2)4−[2−メチル−4−フェニル−5−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド;又は
(s3)4−[5−(3−フルオロ−4−メトキシフェニル−2−トリフルオロメチル)−4−オキサゾリル]ベンゼンスルホンアミド;
又はこれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項1記載の方法。 - 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的的阻害剤が、式:
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項1記載の方法。 - 該式において、R8が、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルから成る群から選択され;R9が、ヒドリド、クロロ及びフルオロから成る群から選択され;R10が、ヒドリド、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、tert−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル及びモルホリノスルホニルから成る群から選択され;R11が、ヒドリド、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、クロロ、メトキシ、ジエチルアミノ、及びフェニルから成る群から選択され;R12が、ヒドリド、クロロ、ブロモ、フルオロ、メチル、エチル、tert−ブチル、メトキシ、及びフェニルから成る群から選択される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項29記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、一般構造式:
で示される三環式シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグのクラスから選択される物質を含む、請求項1記載の方法。 - 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、セレコキシブ、JTE−522、デラコキシブ、クロメン、クロマン、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、ロフェコキシブ、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド、COX189、ABT963、メロキシカム、これらのいずれもの薬学的に許容される塩、これらのいずれものプロドラッグ、及び上記の混合物から成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、セレコキシブ又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項34記載の方法。
- 該式において、R16がエチルであり;R17とR19がクロロであり;R18とR20が水素であり;R21がメチルであるフェニル酢酸誘導体、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項36記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、ジアリールメチリデンフラン誘導体を含む、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、一般式:
(式中、環TとMは、独立に、フェニル・ラジカル、ナフチル・ラジカル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルである;置換基Q1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2に等しい整数であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル若しくは1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2基であって、パラ位置に位置する;他の置換基は、水素原子、ハロゲン原子、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、トリフルオロメチル・ラジカル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級O−アルキル・ラジカルである;或いは、Q1とQ2又はL1とL2はメチレンジオキシ基である;R24、R25、R26及びR27は、独立に、水素原子;ハロゲン原子;1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル;1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル;又はフェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、R24、R25若しくはR26、R27は酸素原子であるか、又はR24、R25若しくはR26、R27は、それらが結合する炭素原子と共に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。) - 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド及び(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドから成る群から選択される化合物を含む、請求項39記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、N−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミドを含む、請求項39記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドを含む、請求項39記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、ニメスリド、フロスリド、NS−398、L−745337、RWJ−63556、L−784512、ダルブフェロン、CS−502、LAS−34475、LAS−34555、S−33516、SD−8381、BMS−347070、S−2474、これらの任意の2つ以上の混合物、これらの薬学的に許容される塩及びプロドラッグから成る群から選択される物質を含む、請求項1記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、対象の体重1kgにつき約0.01〜約100mg/日の範囲内である、請求項8記載の方法。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、対象の体重1kgにつき約1〜約20mg/日の範囲内である、請求項44記載の方法。
- 3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、新生物の治療又は予防のための組成物。
- 3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ;及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬剤組成物。
- 該3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物が、3−[(2,4−ジメチルピロル−5−イル)メチレン]−2−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項47記載の薬剤組成物。
- 新生物の治療、予防又は抑制に用いるために適したキットであって、3−ヘテロアリール−2−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む第1投与形、及びシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む第2投与形を、新生物の治療又は予防のための該化合物の組み合わせの治療有効量を構成する量で含むキット。
- 該シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤が、請求項20〜43のいずれかに記載したシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤から選択される、請求項3記載の方法。
- 新生物障害の治療、予防又は抑制を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、シクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第1量で、及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で含み、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約5μmol/L未満のCOX−2 IC50を有する、請求項51記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約1.5のCOX−2阻害のCOX−1阻害に対する選択比率を有する、請求項52記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約1μmol/L未満のCOX−2 IC50と、少なくとも約100のCOX−2阻害のCOX−1阻害に対する選択比率とを有する、請求項53記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約1μmol/LのCOX−1 IC50を有する、請求項51記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約20μmol/LのCOX−1 IC50を有する、請求項55記載の組成物。
- 新生物障害の治療、予防又は抑制を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、置換ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン及びジヒドロナフタレンから成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ−2選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第1量で、及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で含み、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
- 新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で、及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で投与することを含む、新生物障害の治療のための組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノンの治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、式(I):
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。 - GがO又はSであり;R2がカルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル及び低級アルコキシカルボニルであり;R3が低級ハロアルキル、低級シクロアルキル及びフェニルであり;1つ以上のR4の各々が、H、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アラルキルカルボニル、低級アルキルカルボニル及び、フェニル(場合によっては、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ又はアルキルチオから成る群から選択される1つ以上のラジカルによって独立に置換される)であるか、又は、R4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する、請求項58記載の組成物。
- R2がカルボキシルであり;R3が低級ハロアルキルであり;1つ以上のR4の各々が、独立に、H、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、又は低級アルキルカルボニルであるか、或いはR4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項59記載の組成物。
- 前記低級ハロアルキルR3が、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチルであり;R4の各々又は1つ以上が、独立に、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、tert−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、N,N−ジメチルアミノ、N,N−ジエチルアミノ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、ニトロ、N,N−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、N−エチルスルホニル、2,2−ジメチルエチルアミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、N−(2−メチルプロピル)アミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、2,2−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル又はフェニルであるか;或いは、R4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項60記載の組成物。
- R3がトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;1つ以上のR4の各々が、独立に、H、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、N,N−ジエチルアミノ、N−フェニルメチルアミノスルホニル、N−フェニルエチルアミノスルホニル、N−(2−フリルメチル)アミノスルホニル、N,N−ジメチルアミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、N−(2,2−ジメチルエチル)アミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、2−メチルプロピルアミノスルホニル、N−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、又はフェニルであるか;又はR4は、環EのR4が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項61記載の組成物。
- R3がトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり;1つ以上のR4の各々が、独立に、H、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、tert−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、N−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル、モルホリノスルホニル、N,N−ジエチルアミノ、又はフェニルである、請求項62記載の組成物。
- 新生物障害の治療を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための組成物であって、三環式COX−2阻害剤から成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ−2阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第1量で、及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で含み、前記第1量が、前記第2量と一緒に、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
- 新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で、及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で投与することを含む、新生物障害の治療のための組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、式(II):
(式中、Dは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル環又は部分的不飽和若しくは飽和炭素環であり;R13は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールであり、この場合に、R13は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ又はアルキルチオである1つ以上のラジカルによって置換される;R14は、メチル又はアミノであり;及び、R15は、H、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、N−アリールアミノカルボニル、N−アルキル−N−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、N−アリールアミノ、N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アラルキルアミノ、N−アルキル−N−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、N−アリールアミノアルキル、N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アラルキルアミノアルキル、N−アルキル−N−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、N−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、又はN−アルキル−N−アリールアミノスルホニルである。) - 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約5μmol/L未満のCOX−2 IC50を有する、請求項65記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグにおいて、COX−2阻害のCOX−1阻害に対する選択比率が少なくとも約1.5である、請求項66記載の組成物。
- 前記COX−2阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグにおいて、COX−2 IC50が約1μmol/L未満であり、COX−2阻害のCOX−1阻害に対する選択比率が少なくとも約100である、請求項66記載の組成物。
- シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で含む、新生物障害を治療するための組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、式(III):
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。 - R16がエチルであり;R17とR19がクロロであり;R19とR20が水素であり;R21がメチルである、請求項69記載の組成物。
- 新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で投与することを含む新生物障害の治療のための組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、式(IV):
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。 - 前記COX−2阻害剤が、ニメスリド(B−212)、フロスリド(B−213)、NS−398(B−26)、L−745337(B−214)、RWJ−63556(B−215)又はL−784512(B−216)である、請求項71記載の組成物。
- 新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤を第1量で及び3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第2量で投与することを含む新生物障害の治療のための組成物であって、前記第2量と一緒にした前記第1量が、前記COX−2阻害剤及び前記3−ヘテロアリール−2−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記COX−2阻害剤が、式(V):
(式中、TとMは、独立に、フェニル、ナフチル、5〜6員を含み1〜4個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり;Q1、Q2、L1又はL2は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は1〜6個の炭素原子を有する低級メトキシであり:及びQ1、Q2、L1又はL2の少なくとも1つは、パラ位置に存在し、−S(O)n−R(式中、nは0、1若しくは2であり、Rは、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである)、又は−SO2NH2である;或いは、Q1とQ2はメチレンジオキシであるか;又は、L1とL2はメチレンジオキシである;R25、R26、R27及びR28は、独立に、水素、ハロゲン、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、1〜6個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである;或いは、R25とR26がOであるか、又はR27とR28がOである、或いは、R25、R26は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又はR27、R28は、それらが結合する炭素原子と一緒に、3〜7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。) - 前記COX−2阻害剤がN−(2−シクロヘキシルオキシニトロフェニル)メタンスルホンアミド、又は(E)−4−[(4−メチルフェニル)(テトラヒドロ−2−オキソ−3−フラニリデン)メチル]ベンゼンスルホンアミドである、請求項73記載の組成物。
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