JP2005505290A - α−D−ガラクトシダーゼ活性が低下したコーヒー植物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、α−D−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって生コーヒー豆に存在するガラクトマンナンを改変することに関する。特に、本発明は、α−D−ガラクトシダーゼ活性が低下した植物細胞及びこのような植物細胞を有する植物に関する。
【背景技術】
【0002】
コーヒー豆では、細胞壁の多糖類は熟したコーヒー豆乾燥重量の約48%を占め、そのうちマンナンが約半分に相当する。これらの多糖類は、精製された形態では本質的に不溶性で、ガラクトースの枝分かれが非常に少ない(Bradbury and Haliday、J.agric.Food Chem.38(1990)、389〜392)。マンナンポリマーが、可溶性コーヒー飲料調製中に直面する元の生コーヒー重量の多大な損失の主な理由であると認識されている。不溶性物質が沈殿物として最初の抽出中に残存したり、コーヒー液体の貯蔵中に沈殿及びゲルが形成されたりしてこのような損失が生じる。また、マンナンがコーヒー飲料の静置中の濁りや沈殿の原因となる主成分であることが示されている。
【0003】
いくつかの植物では、マンナン鎖のガラクトース枝分かれの程度はα−D−ガラクトシダーゼ(EC3.2.1.22)の活性に部分的に左右されることが発見された。この酵素は、植物種子保存組織、又は成熟中に保存されたガラクトマンナンからα−1,6結合ガラクトース単位を遊離することができる(Buckeridge and Dietrich、Plant Sci.117(1996)、33〜43)。さらに、内胚乳又は子葉組織におけるガラクトース/マンノース比が非常に低いある種の植物では、ガラクトマンナンの蓄積は、これらの組織の成熟中及びそれらの硬化及び乾燥によるα−D−ガラクトシダーゼ活性のピークと関係があることが示された(Kontos and Spyropoulos、Plant Physiol.Biochem.34(1996)、787〜793)。
【0004】
α−D−ガラクトシダーゼ活性はまた、ガラクトマンナン多糖類にα−1,6−結合したガラクトース残基を除去する能力に関連しており、重合体の溶解性の低下をもたらす(McCleary、Carb.Res.92(1981)、269〜285)。さらに、ガラクトマンナンからガラクトース側鎖を除去すると、そのほかの多糖類、たとえばグアー中のキサンタンと相互作用して、それに伴って複合ゲルを形成する能力が増大するようである。コーヒー豆マンナンのガラクトース枝分かれは成熟中に減少し、若い豆では約40%であったのが、成熟豆では低レベルになる。同時に、α−D−ガラクトシダーゼ酵素活性は、コーヒー豆成熟の間に増大する。
【0005】
コーヒーのα−D−ガラクトシダーゼcDNAはクローニングされている(Zhu and Goldstein、Gene 140(1994)、227〜231)。それらから得られた情報によれば、成熟コーヒー豆のα−D−ガラクトシダーゼは、363個のアミノ酸から構成されるものと推定され、420残基のプレプロ酵素として合成される。生合成の後、プロテアーゼによる2カ所の切断によって分泌シグナル(38残基)及びもう1つのシグナルペプチド(19残基)が除去され、活性酵素に特徴的なN末端アミノ酸配列を示す蛋白質が生成される。
【0006】
可溶性コーヒーの調製及び/又は貯蔵性において知られているガラクトマンナンの効果を考えると、当業界ではこのような状況を改善する必要性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
したがって、本発明の目的は、可溶性コーヒーの調製方法を改良しながら、同時にコーヒー液体を貯蔵するときの障害を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記の問題は、ガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させたコーヒー植物細胞、及びコーヒー植物それぞれを提供することによって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
好ましい実施形態によれば、この目的は、α−D−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって達成することができる。これは、当業界で使用されている技術を使用して、従来の突然変異及び選択の方法によって達成することができる。したがって、植物細胞を、細胞DNAの改変をもたらす化学物質や照射に暴露することなどの変異処理に供することが可能である。したがって、処理した細胞はその後所望する特性についてスクリーニングする。
【0010】
他の好ましい実施形態では、α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるmRNAのアンチセンスコピー又はその一部に転写される核酸を含有する構築物をコーヒー植物細胞に導入することによってα−D−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルの低下をもたらす。
【0011】
このため、α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるmRNAのアンチセンスコピーは、生理学的条件下で2量体を形成できる、すなわち、細胞内の一般的な条件下で、α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるmRNAとハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸であってよい。したがって、このアンチセンスコピーは対応する相手と100%相同である必要はなく、どちらかといえば2量体を形成するために十分な結合をもたらすことが必要である。したがって、ヌクレオチドの置換、欠失及び/又は挿入によって改変されたアンチセンスコピー(及び転写される対応核酸)はまた、十分に本発明の範囲内である。この点に関して、このアンチセンスコピーはα−D−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるmRNAに対する完全な相手であることが可能である、すなわち、α−D−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするmRNAと本質的に同じ長さを有するRNA分子を提供できることもまた、理解されよう。他方、このアンチセンスコピーはα−D−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするmRNAの一部のみを含むことが可能である。
【0012】
リボ核酸、α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるmRNAのアンチセンス、又はその一部をコードする核酸は、構造又は誘導プロモータの制御下にあることが可能で、したがってアンチセンスRNAのレベルを適切に調節することが可能である。しかし、いかなる場合においても、アンチセンスコピーのレベルは、リボソームに接近できるα−D−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするmRNAコピー数を減少させるために十分高くなければならない。
【0013】
好ましい実施形態では、使用するプロモータは十分高い転写速度をもたらすコーヒーcsp1プロモータである。
【0014】
したがって、本発明は最終的にガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させるようにα−D−ガラクトシダーゼ活性レベルが低下した改変コーヒー植物細胞及びコーヒー植物のそれぞれを提供する。好ましい実施形態によれば、この植物はトランスジェニック植物で、その植物の細胞にはα−D−ガラクトシダーゼ遺伝子から得られたmRNAのアンチセンスコピー又はその一部を提供できる構造物が存在する。
【0015】
本発明はまた、α−D−ガラクトシダーゼ活性の低下を示す植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む可溶性コーヒーの調製方法を提供する。この点に関して、本発明はまた、ガラクトース枝分かれを増加させることによってコーヒーの溶解性を高める方法を提供する。
【0016】
本発明は、ガラクトースの枝分かれを増加させることによってコーヒーガラクトマンナンの溶解性を高めることを目的とする。採用した戦略は、好ましくはコーヒーcsp1プロモータの制御下にそのcDNAのアンチセンスコピーを導入することによってα−D−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させる方法である。
【0017】
このcsp1プロモータは、既に特徴づけられており(Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999)、273〜282)、コーヒー11S貯蔵蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する。前記プロモータを含有するカセットを構築して、pTiT37プラスミドから得られた翻訳用バイナリーベクターのT−DNA領域に導入した(Bevan、Nucl.Acids Res.12(1984)、8711〜8721)。この組換えベクターをアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入して、コーヒー外植片の形質転換に使用した。ゲノムに挿入されたT−DNAを有するコーヒー植物を再生させ、その種子のα−D−ガラクトシダーゼ活性を分析した。
【0018】
I.成熟中のコーヒー豆におけるα−D−ガラクトシダーゼ活性の分析
温室(温度約25℃、湿度70%及び天然光)で栽培しCoffea arabica種Caturra T2308から様々な成熟段階で果実を収穫した(齢は開花後の週、WAFとして表す)。果実を収穫後液体窒素で凍結させ、使用するまで−85℃で保存した。成熟研究のために、内胚乳と子葉組織を分離した。
【0019】
植物材料を液体窒素中で磨砕して、氷冷酵素抽出緩衝液(グリセロール10%v/v、メタ重亜硫酸ナトリウム 10mM、EDTA 5mM、MOPS(NaOH)40mM、pH6.5)で100μl当たり約20mgの比で抽出した。この混合物を氷上で20分間撹拌して、遠心し(12000g×30分間)、一定分量に分けて使用するまで−85℃で保存した。α−D−ガラクトシダーゼ活性は、基質p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド(pNGP)で分光光度計によって検出した。
【0020】
この反応混合物は、200μlの100mM pNGP及び酵素抽出物を含有し、McIlvain緩衝液(クエン酸100mM−Na2HPO4 200mM pH6.5)で最終量1mlとした。反応は、26℃で維持して、酵素を添加して開始させ、4倍量の停止溶液(Na2CO3−NaHCO3 100mM pH10.2)を添加することによって停止させた。吸光度は405nmで読み取る。ニトロフェニルの生成は、分子吸光係数ε=18300(pH10.2に特異的)を使用して算出し、1分間当たりの蛋白質1mg当たりのmmolに変換した。Bradford法によって(Anal.Biochem.、72(1976)、248〜254)、水性緩衝液で抽出した試料で全蛋白質量を測定した。活性の発現には、各試料を抽出して一定分量に分け、アッセイを3つ組で実施し、結果は平均で表した。
【0021】
α−D−ガラクトシダーゼ活性は、若い豆の段階では極めて低いか、又は検出されないが、果皮の色が赤くなると同時にピークに達する。その後の段階で、活性は果実がまだ赤くても低下する。活性は又、コーヒー植物の異なる組織で比較する。外胚乳、根及び葉における活性は特に低く、検出限界に近い。しかし、内胚乳では高い活性が記録され、その活性は約36WAFでピークに達するが、給水膨潤後発芽した豆でも高い活性が記録される。
【0022】
II.C.arabicaのα−ガラクトシダーゼ完全長cDNAの単離
数種のコーヒーα−D−ガラクトシダーゼcDNA配列が文献で得られているが、元のコーヒー材料が示されていない。アミノ酸及び核酸配列の違いが、C.arabicaとC.canephoraの間に認められるかどうかを確かめるために、両種からα−D−ガラクトシダーゼcDNAをクローニングすることに決定した。
【0023】
Coffea arabica種Caturra T2308から得られたcDNAライブラリは、Rogers et al.(Plant Physiol.Biochem.、37(1999)、261〜272)に従って開花後30週で抽出したpolyA+mRNAで構築した。このプラスミドcDNAライブラリ(10ng)は、コーヒーα−D−ガラクトシダーゼのcDNA配列から直接推定したプライマーBETA1(配列番号2)及びBETA3(配列番号3)を使用してPCRによって試験した(Zhu and Goldstein、1994)。BETA1プライマーは配列番号1のヌクレオチド177と193の間に位置する。BETA3プライマーは、配列番号1のヌクレオチド1297と1313の間に位置する。PCR反応は、適切な1×緩衝液、各dNTP0.2mM及び各オリゴヌクレオチド0.25μM中で、PfuDNAポリメラーゼ(Stratagene、11011 North Torrey Pines Road、La Jolla、カリフォルニア 92037、USA)で実施した。変性は、94℃で30秒、アニーリングは46℃で30秒、及び伸長温度は72℃で3分である。このサイクルをRobocycler Statagene(USA)で30回繰り返した。PCR産物は、Microcon 100(Millipore SA、BP307 Saint Quentin Yvelines cedex 78054、フランス)カートリッジで精製し、Stratagene(USA)が説明するようにpCR−ScriptSK(+)に連結した。次に、連結混合物を使用してE.coli XL1−Blue MRF’株を形質転換し、α−D−ガラクトシダーゼ断片を含有する組換えベクターを精製して、pCR−Script SK Amp(+)のSfrI部位にクローニングした。その配列は、配列番号1の配列の位置177と1313の間に位置する。
【0024】
文献によれば、α−D−ガラクトシダーゼcDNAの5’末端には、BETA1プライマーの5’末端の上流に198bpを含有する。我々の遺伝子型からこの配列をクローニングするために、プライマーBETA100(配列番号3)及びBETA101(配列番号4)を用いて、既に説明したようにさらにPCRを実施する。このC.arabica配列は、pCR Script Amp SK(+)ベクターにクローニングされて、pLP1が得られ、これは配列番号1に対応している。
【0025】
得られたcDNAは、配列番号1の位置51から始まって位置1313で終わる1263bpのオープンリーディングフレームを含有する。翻訳産物は、配列番号2に対応し、コーヒーα−D−ガラクトシダーゼは位置126のATGの代わりに位置51の翻訳開始コドンATGを使用したプレプロ酵素として合成されることが示唆された。他方、C.canephoraからクローニングされたα−D−ガラクトシダーゼcDNAの分析によって、翻訳産物はC.arbicaで見いだされた蛋白質と非常に相同性が高い(類似度>99%)ことが示された。
【0026】
III.果実成熟中のα−D−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
生長の様々な段階、すなわち、開花後(WAF)9、12、16、30及び35週で収穫したC.arabica Caturraのコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の発現をモニターした。これを行うために、これらのコーヒー豆の全RNA10μgをホルムアミド(50%)及びホルムアルデヒド(最終濃度0.66M)の存在下で、1×MOPS緩衝液(MOPS 20mM、酢酸ナトリウム 5mM、EDTA 1mM、pH7)中において65℃で15分間変性させた。次に、ホルムアルデヒド最終濃度2.2Mを含有する1.2−%アガロースゲルを用いて、1×MOPS緩衝液の存在下、2.5V/cmで6時間の電気泳動によってこれらを分離した。
【0027】
移動後、RNAをSambrook et al.(「分子クローニング、研究室マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、USA、1989、chapter 9.31から9.51)に従って臭化エチジウム(BET)で染色した。これによって、18S及び25SリボソームRNAの蛍光の強度からゲルに沈着した量を標準化することが可能である。次に、Boehringer Mannheim(Roche-Boehringer Mannheim GmbH、Biochemica、Postfach 310120、Mannheim 31、DE)の推奨に従って全RNAを正に荷電したナイロン膜に移して固定した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、前述の条件に従って実施した。
【0028】
ノザンブロットの結果によって、内胚乳生長の早期段階で遺伝子発現のピークが示された。温室条件下での特異的mRNA発現のピークは約26WAFで起こり、酵素活性の増大開始と一致する。mRNA発現のピーク期間は、内胚乳膨張の主要期間に対応し、これらの条件下での果実成熟中に硬化が生じる。α−ガラクトシダーゼ特異的mRNAのピーク発現は、11S果実貯蔵蛋白質mRNAのピーク発現と同時か、又は少し後に生じた。これらの結果から、成熟中のコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼ活性レベルを低下させるために、11Sコーヒープロモータの制御下におけるα−ガラクトシダーゼをコードするコーヒーcDNAのアンチセンスカセットの構築がもたらされた。
【0029】
IV.α−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットの構築
配列番号7に対応する特異的プライマーUP210−1及び配列番号8に対応するBAGUS2を用いて、コーヒーから11Sプロモータ配列(Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999)、273〜282)を増幅した。オリゴヌクレオチドUP210−1は、前述のMarraccini et al.によって報告されたヌクレオチド24と76との間の配列に対応し、KpnI制限部位を含有し、配列番号9に対応する合成配列CGGGGTACCCCGを5’末端に含有する。BAGUS2プライマーは、BamHI制限部位を含有する配列番号10に対応する合成配列CGCGGATCCGCGを5’末端に含有する。このプライマーは又、Marraccini et al.(1999)によって報告された配列のヌクレオチド998から976を含有する。この反応は、PfuDNAポリメラーゼ(3単位)の存在下で、pCSPP4(WO99/02688)10ngを用いて、KCl 10mM、(NH4)2SO4 6mM、Tris−HCl 20mM、pH8.0、0.1%Triton X−100、MgCl2 2mM、BSA 10μg/ml、各dNTP0.2mM、前記の各オリゴヌクレオチド 0.25μMを含有する最終量50μlにおいて実施した。次に、この反応混合物を30回(94℃−60秒、55℃−60秒、72℃−3分)インキュベートし、その後最終伸長サイクルとして72℃で7分インキュベートした。
【0030】
約950bpのPCR断片をMicrocon 100カートリッジ(Millipore、フランス)で精製し、供給元の推奨に従って、T4DNAリガーゼ(Promega Corporation、2800 Woods Hollow Road、Madison、Wisconsin 53711 USA)の存在下で、pCR−Script Amp SK(+)ベクターに連結させた。次に、完全なライゲーション混合物でE.coli XL1−Blue MRF’株を形質転換した。形質転換体1種を選択して、PCR断片の方向を決定するために、そのプラスミドを精製して挿入部分を配列決定した。この分析により、プラスミドのpLP7の選択が可能となった。
【0031】
11Sプロモータのより短い変種も、配列番号11の核酸配列を有するプライマーUP213−1をプライマーUP210−1と置換すること以外は同様の手法によって増幅した。このプライマーは、前述のMarraccini et al.によって報告されたヌクレオチド754と777の間の配列に対応し、5’末端に合成配列、配列番号9を含有する。これによって、既に説明した様にクローニングされたp11Sコーヒープロモータの250bp断片の増幅が導かれ、プラスミドpLP8が得られた。
【0032】
TNOSターミネータは、配列番号12の核酸配列を有するプライマーTNOS1及び配列番号13の核酸配列を有するTNOS2を使用すること以外は、p11Sプロモータの増幅で説明した方法に従って増幅する。TNOS1はその5’末端に配列番号10の配列を含有する。TNOS2は、その5’末端に配列番号9の配列を含有する。これらのプライマーによって、p35SGFP市販ベクター(Clontech Laboratories Inc.、1020 East Meadow Circle、Palo Alto、カリフォルニア94303-4230 USA)からTNOS配列の増幅がもたらされた。PCR産物を前述のようにpCR−Script Amp SK(+)ベクターにクローニングし、pLP32と称される組換えベクターを導き、その方向を決定するために配列決定した。次に、このベクターをBamHIで消化して、TNOS配列を除去して、後でT4DNAポリメラーゼによって処理して、平滑末端を形成した。
【0033】
他方、pLP7及びpLP8ベクターを、EcoRIによって直線化し、又T4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を形成した。次に、TNOSターミネータを正しい方向でpLP7及びpLP8ベクターにクローニングして、それぞれベクターp11STNOS7及びp11STNOS7+を導いた。
【0034】
配列番号14の核酸配列を有するプライマーBETA100B1及び配列番号15の核酸配列を有するBETA101B1を使用すること以外は前述の条件を使用して、α−ガラクトシダーゼcDNAを既に単離したベクターpLP1から増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、以前に使用したNETA101及びBETA100プライマーに対応しており、配列番号10の配列に対応するBamHI制限部位が5’末端に導入されていた。このPCR産物を前述のようにpCR−Script Amp SK(+)ベクターにクローニングして、pLP20と称する組換えベクターを導いた。
【0035】
このプラスミドをBamHIで消化してα−ガラクトシダーゼcDNAを放出させた。他方で、受容ベクターp11STNOS7及びp11STNOS7+を同様の制限酵素によって独立して消化して、供給元(Promega、USA)に従ってCIAP処理によって脱リン酸化した。α−ガラクトシダーゼcDNAをp11STNOS7及びp11STNOS7+ベクターにアンチセンス方向にクローニングして、pALPHA1及びpALPHA9と称するベクターを導いた。
【0036】
これらのカセットをコーヒー細胞懸濁液の形質転換に使用するバイナリーベクターに移動させるために、Pfu DNAポリメラーゼによる最終PCR反応を、配列番号16の核酸配列を有するプライマーUPSAL1及び配列番号17の核酸配列を有するUPSAL2を使用して実施した。両オリゴヌクレオチドは、SalI制限部位を含有し、11Sプロモータ及びNOSターミネータ(TNOS)DNA領域に隣接したpCR Script Amp SK(+)ベクターのDNA配列を認識する。さらに、この制限部位にはバイナリープラスミドのT−DNAに導入するための配列が存在しない。これらのPCR産物を再度pCR−Script Amp SK(+)ベクターにクローニングし、SalIで消化して、この制限部位がカセットに隣接していることを確かめた。得られたプラスミドは、pALP414及びpALP50と称され、pALPHA1及びpALPHA9それぞれから得られた。
【0037】
V.形質転換用バイナリーベクターにおけるα−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットのクローニング
ベクターpALP414及びpALP50に含有されるα−ガラクトシダーゼカセットの配列を決定して、その完全性を確認し、特にPCR増幅サイクル中にいかなる点突然変異も再構成も生じていないことを確かめた。次に、pALP414及びpALP50ベクターをSalI制限酵素で消化することによってこれらのカセットを精製し、遺伝子crylAcが存在しない以外はLeroy et al.(Plant Cell Rep.19(1999)、382〜389)に記載されたベクターに関連するpBin19由来のプラスミドに、それぞれ独立してクローニングした。これを実施するために、uidAとcsr1−1遺伝子の間の特有の部位を認識するSalI制限酵素でベクターを消化し、脱リン酸化した。このライゲーションの後、ベクターpBIA121、pBIA126及びpBIA9を選択した。pBIA121ベクターでは、pALP414から得られたSalIカセットを[LB]Gus−イントロン>p11S(長)アンチセンスα−ガラクトシダーゼcDNA>csr1−1[RB]の方向でクローニングする。しかし、同様のカセットをpBIA126ベクターでは逆方向にクローニングする。他方、pBIA9ベクターにクローニングしたpALP50から得られたSalIカセットは、以下の方向、[LB]Gus−イントロン>p11S(短)アンチセンスα−ガラクトシダーゼcDNA>csr1−1[RB]の方向でクローニングする。
【0038】
VI.アグロバクテリウム ツメファシエンス( Agrobacterium tumefaciens )の形質転換
前述した形質転換用バイナリーベクターpBIA121、pBIA126及びpBIA9を、An et al.が記載した直接形質転換方法(Plant Mol.Biol.Manuel、Gelvin、Schilperoort and Verma Eds、Kluwer Academic Publishers Dordrecht、Netherlands、A3(1993)、1〜19)に従って無害化したアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株にそれぞれ独立して導入した。それぞれの形質転換について、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスクローンはカナマイシン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及びリファンピシン(50μg/ml)を補給したLB培地で選択した。
【0039】
アグロバクテリウム ツメファシエンスに導入したプラスミドの構造を調べるために、迅速少量調製法によってこれらを抽出し、その後E.coli XL2 Blue MRF’株に逆形質転換した後、制限マッピングによって分析した。
【0040】
VII.Coffea種の形質転換
葉外植片を培養して、体細胞胚が移植片の縁に出現するまで、3から5カ月間、5週間間隔で継代培養した。体細胞胚を魚雷型胚の段階で採取し、滅菌したメスで傷をつけて、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株を0.3から0.5のOD600nmで含有する0.9%NaCl溶液に2時間浸漬した。暗所において、ホルモンを含まない半固形MS培地で共培養を3日間実施し、次に一定であるがゆっくり振盪しながら、セフォタキシム(1gr/l)を含有する液体MS培地で3から5時間洗浄した。胚は照明を低くした条件下で(1日当たり明期16時間)セフォタキシム(400mg/l)の存在下でBAP5μM、スクロース90μMを含む半固形培地で培養した。3から4週間後、それらをセフォタキシム(400mg/l)及びクロルスルフロン(80mg/l)を補給した選択MS培地に移した。次に、カルスが発芽するまで、これらを毎月新しい選択培地に移した。次に、カルスの周りに生長した形質転換胚をMorelビタミン(BAP1μM及びスクロース30μM)を含む半固形MS培地で培養して、発芽を誘導した。この段階の後、前述の、但しBAPを含まない培地に対応する発根培地に移した。
【0041】
形質転換の有効性を調べるために、カルス、茎頂、根及び葉におけるuidAリポーターの発現をGUS組織化学アッセイで定期的に試験した(Jefferson et al.、J.EMBO 6(1987)、3901〜3907)。
【0042】
この操作の後で、数個の個々の植物を選択して、微細に切断してin vitroにおける繁殖を行った。それらのいくつかは温室に移して生長させた。形態異常は認められなかった。
【0043】
VIII.形質転換コーヒー植物の体細胞胚の分析
体細胞胚は又、葉移植片から誘導して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスmRNAの存在を検出した。11Sコーヒー蛋白質は、体細胞胚で検出され(Yuffa et al.、Plant Cell Rep.13(1994)197〜202)、csp1プロモータがこの組織で活性化されていることが示唆された。これが事実であれば、若いトランスジェニックコーヒー植物から誘導された体細胞胚を分析することによって、豆よりも早くα−ガラクトシダーゼアンチセンスmRNAの存在を検出することが可能となる。
【0044】
次に、全RNAを前述のように形質転換した体細胞胚100mgから抽出して、Access RT−PCR系キット(Promega USA)を使用してRT−PCRによって試験した。最初に、11S特異的mRNAの存在を11ScDNAのコード配列に位置するプライマーを使用してRT−PCRを実施することによって確認した。これは、配列番号18の配列に対応するプライマーSO11及び配列番号19の配列に対応するプライマーSO2−1を使用して実施した。SO11プライマーは、前述のMarraccini et al.によって報告された配列のヌクレオチド1035から1059の間の配列に対応する。他方、SO2−1プライマーは、報告された配列の最後の24ヌクレオチドに対応する。cDNAの最初の鎖の合成(逆転写段階)は、供給元の説明のように実施した(48℃、45分)。以下の変数をPCR反応に使用した。45回(変性段階として94℃で60秒、アニーリング段階として52℃で90秒、伸長段階として68℃で4分)、68℃で7分間最終伸長。
【0045】
この実験から、プライマーSO11及びSO2−1に隣接した11ScDNA配列に対応する1590bpのPCR産物が得られた。この結果によって、11SmRNAは試験した全ての組織、すなわち、根、葉、花には存在しないが、Coffea canephoraの体細胞胚並びに27WAFの豆には有効的に存在することが確かめられた。
【0046】
第2に、α−ガラクトシダーゼセンスmRNAの存在は、逆転写段階で配列番号21の配列に対応するプライマーB33のみを使用してRT−PCR反応を実施することによって試験した(条件1)。このプライマーは、配列番号1のヌクレオチド1286から1314の相補的配列に対応する。
【0047】
併行して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスmRNAの検出を、逆転写段階でプライマーB11のみを使用して実施した(条件2)。このプライマーは、配列番号1のヌクレオチド50から78の間の配列に対応する。この逆転写後(48℃、45分)、反応混合物を1分間94℃で処理して、MMLV逆転写酵素を不活性化した。欠損したオリゴヌクレオチド、条件1のB11及び条件2のB33を添加して、反応を45回(変性段階として94℃で60秒、アニーリング段階として45℃で90秒、伸長段階として68℃で4分)、68℃で7分間の最終伸長によるPCRによって継続した。形質転換していないC.arabicaから得られた体細胞を使用すると、1310bpの増幅産物は条件1で確認されたが、条件2の実験では確認されなかった。しかし、pBIA9ベクターによって形質転換したコーヒー小植物から得られた体細胞胚については、実験条件2で増幅産物を検出することはできなかったので、α−ガラクトシダーゼアンチセンスmRNAの存在が確認された。
Claims (9)
- ガラクトース枝分かれが増加したガラクトロマンナンを産生するコーヒー植物細胞。
- α−D−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルが低下した請求項1に記載のコーヒー植物細胞。
- α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の、mRNAのアンチセンスであるリボ核酸又はその一部に転写される核酸を含有する、請求項1又は2に記載のコーヒー植物細胞。
- α−D−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の、mRNAのアンチセンスであるリボ核酸又はその一部に転写される核酸が構成的又は誘導プロモータの制御下にある、請求項3に記載のコーヒー植物細胞。
- 前記プロモータがコーヒーcsp1プロモータである請求項5に記載の植物細胞。
- 前記請求項のいずれかに記載の植物細胞を含有する、コーヒー植物。
- 請求項6に記載のコーヒー植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む、可溶性コーヒーの調製方法。
- 請求項6に記載の植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む、コーヒーの溶解度を増大させる方法。
- 可溶性コーヒーを調製するための、請求項6に記載のコーヒー植物から得られた豆の使用。
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