JP2005505290A - α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性が低下したコーヒー植物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによる生コーヒー豆に存在するガラクトロマンナンの改変に関する。特に、本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性が低下した植物細胞及びこのような植物細胞を有する植物に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって生コーヒー豆に存在するガラクトマンナンを改変することに関する。特に、本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性が低下した植物細胞及びこのような植物細胞を有する植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー豆では、細胞壁の多糖類は熟したコーヒー豆乾燥重量の約４８％を占め、そのうちマンナンが約半分に相当する。これらの多糖類は、精製された形態では本質的に不溶性で、ガラクトースの枝分かれが非常に少ない（Bradbury and Haliday、J.agric.Food Chem.38(1990)、389〜392）。マンナンポリマーが、可溶性コーヒー飲料調製中に直面する元の生コーヒー重量の多大な損失の主な理由であると認識されている。不溶性物質が沈殿物として最初の抽出中に残存したり、コーヒー液体の貯蔵中に沈殿及びゲルが形成されたりしてこのような損失が生じる。また、マンナンがコーヒー飲料の静置中の濁りや沈殿の原因となる主成分であることが示されている。
【０００３】
いくつかの植物では、マンナン鎖のガラクトース枝分かれの程度はα−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）の活性に部分的に左右されることが発見された。この酵素は、植物種子保存組織、又は成熟中に保存されたガラクトマンナンからα−１，６結合ガラクトース単位を遊離することができる（Buckeridge and Dietrich、Plant Sci.117(1996)、33〜43）。さらに、内胚乳又は子葉組織におけるガラクトース／マンノース比が非常に低いある種の植物では、ガラクトマンナンの蓄積は、これらの組織の成熟中及びそれらの硬化及び乾燥によるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性のピークと関係があることが示された（Kontos and Spyropoulos、Plant Physiol.Biochem.34(1996)、787〜793）。
【０００４】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性はまた、ガラクトマンナン多糖類にα−１，６−結合したガラクトース残基を除去する能力に関連しており、重合体の溶解性の低下をもたらす（McCleary、Carb.Res.92(1981)、269〜285）。さらに、ガラクトマンナンからガラクトース側鎖を除去すると、そのほかの多糖類、たとえばグアー中のキサンタンと相互作用して、それに伴って複合ゲルを形成する能力が増大するようである。コーヒー豆マンナンのガラクトース枝分かれは成熟中に減少し、若い豆では約４０％であったのが、成熟豆では低レベルになる。同時に、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素活性は、コーヒー豆成熟の間に増大する。
【０００５】
コーヒーのα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡはクローニングされている（Zhu and Goldstein、Gene 140(1994)、227〜231）。それらから得られた情報によれば、成熟コーヒー豆のα−Ｄ−ガラクトシダーゼは、３６３個のアミノ酸から構成されるものと推定され、４２０残基のプレプロ酵素として合成される。生合成の後、プロテアーゼによる２カ所の切断によって分泌シグナル（３８残基）及びもう１つのシグナルペプチド（１９残基）が除去され、活性酵素に特徴的なＮ末端アミノ酸配列を示す蛋白質が生成される。
【０００６】
可溶性コーヒーの調製及び／又は貯蔵性において知られているガラクトマンナンの効果を考えると、当業界ではこのような状況を改善する必要性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、可溶性コーヒーの調製方法を改良しながら、同時にコーヒー液体を貯蔵するときの障害を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の問題は、ガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させたコーヒー植物細胞、及びコーヒー植物それぞれを提供することによって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施形態によれば、この目的は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって達成することができる。これは、当業界で使用されている技術を使用して、従来の突然変異及び選択の方法によって達成することができる。したがって、植物細胞を、細胞ＤＮＡの改変をもたらす化学物質や照射に暴露することなどの変異処理に供することが可能である。したがって、処理した細胞はその後所望する特性についてスクリーニングする。
【００１０】
他の好ましい実施形態では、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンスコピー又はその一部に転写される核酸を含有する構築物をコーヒー植物細胞に導入することによってα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルの低下をもたらす。
【００１１】
このため、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンスコピーは、生理学的条件下で２量体を形成できる、すなわち、細胞内の一般的な条件下で、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸であってよい。したがって、このアンチセンスコピーは対応する相手と１００％相同である必要はなく、どちらかといえば２量体を形成するために十分な結合をもたらすことが必要である。したがって、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入によって改変されたアンチセンスコピー（及び転写される対応核酸）はまた、十分に本発明の範囲内である。この点に関して、このアンチセンスコピーはα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対する完全な相手であることが可能である、すなわち、α−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡと本質的に同じ長さを有するＲＮＡ分子を提供できることもまた、理解されよう。他方、このアンチセンスコピーはα−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部のみを含むことが可能である。
【００１２】
リボ核酸、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンス、又はその一部をコードする核酸は、構造又は誘導プロモータの制御下にあることが可能で、したがってアンチセンスＲＮＡのレベルを適切に調節することが可能である。しかし、いかなる場合においても、アンチセンスコピーのレベルは、リボソームに接近できるα−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡコピー数を減少させるために十分高くなければならない。
【００１３】
好ましい実施形態では、使用するプロモータは十分高い転写速度をもたらすコーヒーｃｓｐ１プロモータである。
【００１４】
したがって、本発明は最終的にガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させるようにα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性レベルが低下した改変コーヒー植物細胞及びコーヒー植物のそれぞれを提供する。好ましい実施形態によれば、この植物はトランスジェニック植物で、その植物の細胞にはα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子から得られたｍＲＮＡのアンチセンスコピー又はその一部を提供できる構造物が存在する。
【００１５】
本発明はまた、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の低下を示す植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む可溶性コーヒーの調製方法を提供する。この点に関して、本発明はまた、ガラクトース枝分かれを増加させることによってコーヒーの溶解性を高める方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ガラクトースの枝分かれを増加させることによってコーヒーガラクトマンナンの溶解性を高めることを目的とする。採用した戦略は、好ましくはコーヒーｃｓｐ１プロモータの制御下にそのｃＤＮＡのアンチセンスコピーを導入することによってα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させる方法である。
【００１７】
このｃｓｐ１プロモータは、既に特徴づけられており（Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999）、２７３〜２８２）、コーヒー１１Ｓ貯蔵蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する。前記プロモータを含有するカセットを構築して、ｐＴｉＴ３７プラスミドから得られた翻訳用バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域に導入した（Bevan、Nucl.Acids Res.12(1984)、8711〜8721）。この組換えベクターをアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入して、コーヒー外植片の形質転換に使用した。ゲノムに挿入されたＴ−ＤＮＡを有するコーヒー植物を再生させ、その種子のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。
【００１８】
Ｉ．成熟中のコーヒー豆におけるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の分析
温室（温度約２５℃、湿度７０％及び天然光）で栽培しＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種Ｃａｔｕｒｒａ Ｔ２３０８から様々な成熟段階で果実を収穫した（齢は開花後の週、ＷＡＦとして表す）。果実を収穫後液体窒素で凍結させ、使用するまで−８５℃で保存した。成熟研究のために、内胚乳と子葉組織を分離した。
【００１９】
植物材料を液体窒素中で磨砕して、氷冷酵素抽出緩衝液（グリセロール１０％ｖ／ｖ、メタ重亜硫酸ナトリウム １０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＭＯＰＳ（ＮａＯＨ）４０ｍＭ、ｐＨ６．５）で１００μｌ当たり約２０ｍｇの比で抽出した。この混合物を氷上で２０分間撹拌して、遠心し（１２０００ｇ×３０分間）、一定分量に分けて使用するまで−８５℃で保存した。α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＧＰ）で分光光度計によって検出した。
【００２０】
この反応混合物は、２００μｌの１００ｍＭ ｐＮＧＰ及び酵素抽出物を含有し、ＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（クエン酸１００ｍＭ−Ｎａ２ＨＰＯ４ ２００ｍＭ ｐＨ６．５）で最終量１ｍｌとした。反応は、２６℃で維持して、酵素を添加して開始させ、４倍量の停止溶液（Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３ １００ｍＭ ｐＨ１０．２）を添加することによって停止させた。吸光度は４０５ｎｍで読み取る。ニトロフェニルの生成は、分子吸光係数ε＝１８３００（ｐＨ１０．２に特異的）を使用して算出し、１分間当たりの蛋白質１ｍｇ当たりのｍｍｏｌに変換した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２（１９７６）、２４８〜２５４）、水性緩衝液で抽出した試料で全蛋白質量を測定した。活性の発現には、各試料を抽出して一定分量に分け、アッセイを３つ組で実施し、結果は平均で表した。
【００２１】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、若い豆の段階では極めて低いか、又は検出されないが、果皮の色が赤くなると同時にピークに達する。その後の段階で、活性は果実がまだ赤くても低下する。活性は又、コーヒー植物の異なる組織で比較する。外胚乳、根及び葉における活性は特に低く、検出限界に近い。しかし、内胚乳では高い活性が記録され、その活性は約３６ＷＡＦでピークに達するが、給水膨潤後発芽した豆でも高い活性が記録される。
【００２２】
ＩＩ．Ｃ．ａｒａｂｉｃａのα−ガラクトシダーゼ完全長ｃＤＮＡの単離
数種のコーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ配列が文献で得られているが、元のコーヒー材料が示されていない。アミノ酸及び核酸配列の違いが、Ｃ．ａｒａｂｉｃａとＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａの間に認められるかどうかを確かめるために、両種からα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをクローニングすることに決定した。
【００２３】
Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種Ｃａｔｕｒｒａ Ｔ２３０８から得られたｃＤＮＡライブラリは、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（Plant Physiol.Biochem.、37(1999)、261〜272）に従って開花後３０週で抽出したｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡで構築した。このプラスミドｃＤＮＡライブラリ（１０ｎｇ）は、コーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡ配列から直接推定したプライマーＢＥＴＡ１（配列番号２）及びＢＥＴＡ３（配列番号３）を使用してＰＣＲによって試験した（Zhu and Goldstein、1994）。ＢＥＴＡ１プライマーは配列番号１のヌクレオチド１７７と１９３の間に位置する。ＢＥＴＡ３プライマーは、配列番号１のヌクレオチド１２９７と１３１３の間に位置する。ＰＣＲ反応は、適切な１×緩衝液、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ及び各オリゴヌクレオチド０．２５μＭ中で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、11011 North Torrey Pines Road、La Jolla、カリフォルニア 92037、USA）で実施した。変性は、９４℃で３０秒、アニーリングは４６℃で３０秒、及び伸長温度は７２℃で３分である。このサイクルをＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｓｔａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）で３０回繰り返した。ＰＣＲ産物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＡ、ＢＰ３０７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ ｃｅｄｅｘ ７８０５４、フランス）カートリッジで精製し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）が説明するようにｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）に連結した。次に、連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換し、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ断片を含有する組換えベクターを精製して、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ Ａｍｐ（＋）のＳｆｒＩ部位にクローニングした。その配列は、配列番号１の配列の位置１７７と１３１３の間に位置する。
【００２４】
文献によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡの５’末端には、ＢＥＴＡ１プライマーの５’末端の上流に１９８ｂｐを含有する。我々の遺伝子型からこの配列をクローニングするために、プライマーＢＥＴＡ１００（配列番号３）及びＢＥＴＡ１０１（配列番号４）を用いて、既に説明したようにさらにＰＣＲを実施する。このＣ．ａｒａｂｉｃａ配列は、ｐＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングされて、ｐＬＰ１が得られ、これは配列番号１に対応している。
【００２５】
得られたｃＤＮＡは、配列番号１の位置５１から始まって位置１３１３で終わる１２６３ｂｐのオープンリーディングフレームを含有する。翻訳産物は、配列番号２に対応し、コーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼは位置１２６のＡＴＧの代わりに位置５１の翻訳開始コドンＡＴＧを使用したプレプロ酵素として合成されることが示唆された。他方、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａからクローニングされたα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡの分析によって、翻訳産物はＣ．ａｒｂｉｃａで見いだされた蛋白質と非常に相同性が高い（類似度＞９９％）ことが示された。
【００２６】
ＩＩＩ．果実成熟中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
生長の様々な段階、すなわち、開花後（ＷＡＦ）９、１２、１６、３０及び３５週で収穫したＣ．ａｒａｂｉｃａ Ｃａｔｕｒｒａのコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の発現をモニターした。これを行うために、これらのコーヒー豆の全ＲＮＡ１０μｇをホルムアミド（５０％）及びホルムアルデヒド（最終濃度０．６６Ｍ）の存在下で、１×ＭＯＰＳ緩衝液（ＭＯＰＳ ２０ｍＭ、酢酸ナトリウム ５ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ７）中において６５℃で１５分間変性させた。次に、ホルムアルデヒド最終濃度２．２Ｍを含有する１．２−％アガロースゲルを用いて、１×ＭＯＰＳ緩衝液の存在下、２．５Ｖ／ｃｍで６時間の電気泳動によってこれらを分離した。
【００２７】
移動後、ＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、USA、1989、chapter 9.31から9.51）に従って臭化エチジウム（ＢＥＴ）で染色した。これによって、１８Ｓ及び２５ＳリボソームＲＮＡの蛍光の強度からゲルに沈着した量を標準化することが可能である。次に、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Roche-Boehringer Mannheim GmbH、Biochemica、Postfach 310120、Mannheim 31、DE）の推奨に従って全ＲＮＡを正に荷電したナイロン膜に移して固定した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、前述の条件に従って実施した。
【００２８】
ノザンブロットの結果によって、内胚乳生長の早期段階で遺伝子発現のピークが示された。温室条件下での特異的ｍＲＮＡ発現のピークは約２６ＷＡＦで起こり、酵素活性の増大開始と一致する。ｍＲＮＡ発現のピーク期間は、内胚乳膨張の主要期間に対応し、これらの条件下での果実成熟中に硬化が生じる。α−ガラクトシダーゼ特異的ｍＲＮＡのピーク発現は、１１Ｓ果実貯蔵蛋白質ｍＲＮＡのピーク発現と同時か、又は少し後に生じた。これらの結果から、成熟中のコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼ活性レベルを低下させるために、１１Ｓコーヒープロモータの制御下におけるα−ガラクトシダーゼをコードするコーヒーｃＤＮＡのアンチセンスカセットの構築がもたらされた。
【００２９】
ＩＶ．α−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットの構築
配列番号７に対応する特異的プライマーＵＰ２１０−１及び配列番号８に対応するＢＡＧＵＳ２を用いて、コーヒーから１１Ｓプロモータ配列（Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999)、273〜282）を増幅した。オリゴヌクレオチドＵＰ２１０−１は、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されたヌクレオチド２４と７６との間の配列に対応し、ＫｐｎＩ制限部位を含有し、配列番号９に対応する合成配列ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧを５’末端に含有する。ＢＡＧＵＳ２プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含有する配列番号１０に対応する合成配列ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧを５’末端に含有する。このプライマーは又、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）によって報告された配列のヌクレオチド９９８から９７６を含有する。この反応は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（３単位）の存在下で、ｐＣＳＰＰ４（ＷＯ９９／０２６８８）１０ｎｇを用いて、ＫＣｌ １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、ＢＳＡ １０μｇ／ｍｌ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、前記の各オリゴヌクレオチド ０．２５μＭを含有する最終量５０μｌにおいて実施した。次に、この反応混合物を３０回（９４℃−６０秒、５５℃−６０秒、７２℃−３分）インキュベートし、その後最終伸長サイクルとして７２℃で７分インキュベートした。
【００３０】
約９５０ｂｐのＰＣＲ断片をＭｉｃｒｏｃｏｎ １００カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、フランス）で精製し、供給元の推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２８００ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１ ＵＳＡ）の存在下で、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターに連結させた。次に、完全なライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した。形質転換体１種を選択して、ＰＣＲ断片の方向を決定するために、そのプラスミドを精製して挿入部分を配列決定した。この分析により、プラスミドのｐＬＰ７の選択が可能となった。
【００３１】
１１Ｓプロモータのより短い変種も、配列番号１１の核酸配列を有するプライマーＵＰ２１３−１をプライマーＵＰ２１０−１と置換すること以外は同様の手法によって増幅した。このプライマーは、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されたヌクレオチド７５４と７７７の間の配列に対応し、５’末端に合成配列、配列番号９を含有する。これによって、既に説明した様にクローニングされたｐ１１Ｓコーヒープロモータの２５０ｂｐ断片の増幅が導かれ、プラスミドｐＬＰ８が得られた。
【００３２】
ＴＮＯＳターミネータは、配列番号１２の核酸配列を有するプライマーＴＮＯＳ１及び配列番号１３の核酸配列を有するＴＮＯＳ２を使用すること以外は、ｐ１１Ｓプロモータの増幅で説明した方法に従って増幅する。ＴＮＯＳ１はその５’末端に配列番号１０の配列を含有する。ＴＮＯＳ２は、その５’末端に配列番号９の配列を含有する。これらのプライマーによって、ｐ３５ＳＧＦＰ市販ベクター（Clontech Laboratories Inc.、1020 East Meadow Circle、Palo Alto、カリフォルニア94303-4230 USA）からＴＮＯＳ配列の増幅がもたらされた。ＰＣＲ産物を前述のようにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングし、ｐＬＰ３２と称される組換えベクターを導き、その方向を決定するために配列決定した。次に、このベクターをＢａｍＨＩで消化して、ＴＮＯＳ配列を除去して、後でＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、平滑末端を形成した。
【００３３】
他方、ｐＬＰ７及びｐＬＰ８ベクターを、ＥｃｏＲＩによって直線化し、又Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成した。次に、ＴＮＯＳターミネータを正しい方向でｐＬＰ７及びｐＬＰ８ベクターにクローニングして、それぞれベクターｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋を導いた。
【００３４】
配列番号１４の核酸配列を有するプライマーＢＥＴＡ１００Ｂ１及び配列番号１５の核酸配列を有するＢＥＴＡ１０１Ｂ１を使用すること以外は前述の条件を使用して、α−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを既に単離したベクターｐＬＰ１から増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、以前に使用したＮＥＴＡ１０１及びＢＥＴＡ１００プライマーに対応しており、配列番号１０の配列に対応するＢａｍＨＩ制限部位が５’末端に導入されていた。このＰＣＲ産物を前述のようにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングして、ｐＬＰ２０と称する組換えベクターを導いた。
【００３５】
このプラスミドをＢａｍＨＩで消化してα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを放出させた。他方で、受容ベクターｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋を同様の制限酵素によって独立して消化して、供給元（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に従ってＣＩＡＰ処理によって脱リン酸化した。α−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋ベクターにアンチセンス方向にクローニングして、ｐＡＬＰＨＡ１及びｐＡＬＰＨＡ９と称するベクターを導いた。
【００３６】
これらのカセットをコーヒー細胞懸濁液の形質転換に使用するバイナリーベクターに移動させるために、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる最終ＰＣＲ反応を、配列番号１６の核酸配列を有するプライマーＵＰＳＡＬ１及び配列番号１７の核酸配列を有するＵＰＳＡＬ２を使用して実施した。両オリゴヌクレオチドは、ＳａｌＩ制限部位を含有し、１１Ｓプロモータ及びＮＯＳターミネータ（ＴＮＯＳ）ＤＮＡ領域に隣接したｐＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターのＤＮＡ配列を認識する。さらに、この制限部位にはバイナリープラスミドのＴ−ＤＮＡに導入するための配列が存在しない。これらのＰＣＲ産物を再度ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングし、ＳａｌＩで消化して、この制限部位がカセットに隣接していることを確かめた。得られたプラスミドは、ｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０と称され、ｐＡＬＰＨＡ１及びｐＡＬＰＨＡ９それぞれから得られた。
【００３７】
Ｖ．形質転換用バイナリーベクターにおけるα−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットのクローニング
ベクターｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０に含有されるα−ガラクトシダーゼカセットの配列を決定して、その完全性を確認し、特にＰＣＲ増幅サイクル中にいかなる点突然変異も再構成も生じていないことを確かめた。次に、ｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０ベクターをＳａｌＩ制限酵素で消化することによってこれらのカセットを精製し、遺伝子ｃｒｙｌＡｃが存在しない以外はＬｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（Plant Cell Rep.19(1999)、382〜389）に記載されたベクターに関連するｐＢｉｎ１９由来のプラスミドに、それぞれ独立してクローニングした。これを実施するために、ｕｉｄＡとｃｓｒ１−１遺伝子の間の特有の部位を認識するＳａｌＩ制限酵素でベクターを消化し、脱リン酸化した。このライゲーションの後、ベクターｐＢＩＡ１２１、ｐＢＩＡ１２６及びｐＢＩＡ９を選択した。ｐＢＩＡ１２１ベクターでは、ｐＡＬＰ４１４から得られたＳａｌＩカセットを［ＬＢ］Ｇｕｓ−イントロン＞ｐ１１Ｓ（長）アンチセンスα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ＞ｃｓｒ１−１［ＲＢ］の方向でクローニングする。しかし、同様のカセットをｐＢＩＡ１２６ベクターでは逆方向にクローニングする。他方、ｐＢＩＡ９ベクターにクローニングしたｐＡＬＰ５０から得られたＳａｌＩカセットは、以下の方向、［ＬＢ］Ｇｕｓ−イントロン＞ｐ１１Ｓ（短）アンチセンスα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ＞ｃｓｒ１−１［ＲＢ］の方向でクローニングする。
【００３８】
ＶＩ．アグロバクテリウム ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens ）の形質転換
前述した形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＡ１２１、ｐＢＩＡ１２６及びｐＢＩＡ９を、Ａｎ ｅｔ ａｌ．が記載した直接形質転換方法（Plant Mol.Biol.Manuel、Gelvin、Schilperoort and Verma Eds、Kluwer Academic Publishers Dordrecht、Netherlands、A3(1993)、1〜19）に従って無害化したアグロバクテリウム ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株にそれぞれ独立して導入した。それぞれの形質転換について、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスクローンはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びリファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）を補給したＬＢ培地で選択した。
【００３９】
アグロバクテリウム ツメファシエンスに導入したプラスミドの構造を調べるために、迅速少量調製法によってこれらを抽出し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株に逆形質転換した後、制限マッピングによって分析した。
【００４０】
ＶＩＩ．Ｃｏｆｆｅａ種の形質転換
葉外植片を培養して、体細胞胚が移植片の縁に出現するまで、３から５カ月間、５週間間隔で継代培養した。体細胞胚を魚雷型胚の段階で採取し、滅菌したメスで傷をつけて、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を０．３から０．５のＯＤ６００ｎｍで含有する０．９％ＮａＣｌ溶液に２時間浸漬した。暗所において、ホルモンを含まない半固形ＭＳ培地で共培養を３日間実施し、次に一定であるがゆっくり振盪しながら、セフォタキシム（１ｇｒ／ｌ）を含有する液体ＭＳ培地で３から５時間洗浄した。胚は照明を低くした条件下で（１日当たり明期１６時間）セフォタキシム（４００ｍｇ／ｌ）の存在下でＢＡＰ５μＭ、スクロース９０μＭを含む半固形培地で培養した。３から４週間後、それらをセフォタキシム（４００ｍｇ／ｌ）及びクロルスルフロン（８０ｍｇ／ｌ）を補給した選択ＭＳ培地に移した。次に、カルスが発芽するまで、これらを毎月新しい選択培地に移した。次に、カルスの周りに生長した形質転換胚をＭｏｒｅｌビタミン（ＢＡＰ１μＭ及びスクロース３０μＭ）を含む半固形ＭＳ培地で培養して、発芽を誘導した。この段階の後、前述の、但しＢＡＰを含まない培地に対応する発根培地に移した。
【００４１】
形質転換の有効性を調べるために、カルス、茎頂、根及び葉におけるｕｉｄＡリポーターの発現をＧＵＳ組織化学アッセイで定期的に試験した（Jefferson et al.、J.EMBO 6(1987)、3901〜3907）。
【００４２】
この操作の後で、数個の個々の植物を選択して、微細に切断してｉｎ ｖｉｔｒｏにおける繁殖を行った。それらのいくつかは温室に移して生長させた。形態異常は認められなかった。
【００４３】
ＶＩＩＩ．形質転換コーヒー植物の体細胞胚の分析
体細胞胚は又、葉移植片から誘導して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在を検出した。１１Ｓコーヒー蛋白質は、体細胞胚で検出され（Yuffa et al.、Plant Cell Rep.13(1994)197〜202）、ｃｓｐ１プロモータがこの組織で活性化されていることが示唆された。これが事実であれば、若いトランスジェニックコーヒー植物から誘導された体細胞胚を分析することによって、豆よりも早くα−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在を検出することが可能となる。
【００４４】
次に、全ＲＮＡを前述のように形質転換した体細胞胚１００ｍｇから抽出して、Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ系キット（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＳＡ）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって試験した。最初に、１１Ｓ特異的ｍＲＮＡの存在を１１ＳｃＤＮＡのコード配列に位置するプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施することによって確認した。これは、配列番号１８の配列に対応するプライマーＳＯ１１及び配列番号１９の配列に対応するプライマーＳＯ２−１を使用して実施した。ＳＯ１１プライマーは、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告された配列のヌクレオチド１０３５から１０５９の間の配列に対応する。他方、ＳＯ２−１プライマーは、報告された配列の最後の２４ヌクレオチドに対応する。ｃＤＮＡの最初の鎖の合成（逆転写段階）は、供給元の説明のように実施した（４８℃、４５分）。以下の変数をＰＣＲ反応に使用した。４５回（変性段階として９４℃で６０秒、アニーリング段階として５２℃で９０秒、伸長段階として６８℃で４分）、６８℃で７分間最終伸長。
【００４５】
この実験から、プライマーＳＯ１１及びＳＯ２−１に隣接した１１ＳｃＤＮＡ配列に対応する１５９０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この結果によって、１１ＳｍＲＮＡは試験した全ての組織、すなわち、根、葉、花には存在しないが、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａの体細胞胚並びに２７ＷＡＦの豆には有効的に存在することが確かめられた。
【００４６】
第２に、α−ガラクトシダーゼセンスｍＲＮＡの存在は、逆転写段階で配列番号２１の配列に対応するプライマーＢ３３のみを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を実施することによって試験した（条件１）。このプライマーは、配列番号１のヌクレオチド１２８６から１３１４の相補的配列に対応する。
【００４７】
併行して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの検出を、逆転写段階でプライマーＢ１１のみを使用して実施した（条件２）。このプライマーは、配列番号１のヌクレオチド５０から７８の間の配列に対応する。この逆転写後（４８℃、４５分）、反応混合物を１分間９４℃で処理して、ＭＭＬＶ逆転写酵素を不活性化した。欠損したオリゴヌクレオチド、条件１のＢ１１及び条件２のＢ３３を添加して、反応を４５回（変性段階として９４℃で６０秒、アニーリング段階として４５℃で９０秒、伸長段階として６８℃で４分）、６８℃で７分間の最終伸長によるＰＣＲによって継続した。形質転換していないＣ．ａｒａｂｉｃａから得られた体細胞を使用すると、１３１０ｂｐの増幅産物は条件１で確認されたが、条件２の実験では確認されなかった。しかし、ｐＢＩＡ９ベクターによって形質転換したコーヒー小植物から得られた体細胞胚については、実験条件２で増幅産物を検出することはできなかったので、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在が確認された。
【０００１】
本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって生コーヒー豆に存在するガラクトマンナンを改変することに関する。特に、本発明は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性が低下した植物細胞及びこのような植物細胞を有する植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー豆では、細胞壁の多糖類は熟したコーヒー豆乾燥重量の約４８％を占め、そのうちマンナンが約半分に相当する。これらの多糖類は、精製された形態では本質的に不溶性で、ガラクトースの枝分かれが非常に少ない（Bradbury and Haliday、J.agric.Food Chem.38(1990)、389〜392）。マンナンポリマーが、可溶性コーヒー飲料調製中に直面する元の生コーヒー重量の多大な損失の主な理由であると認識されている。不溶性物質が沈殿物として最初の抽出中に残存したり、コーヒー液体の貯蔵中に沈殿及びゲルが形成されたりしてこのような損失が生じる。また、マンナンがコーヒー飲料の静置中の濁りや沈殿の原因となる主成分であることが示されている。
【０００３】
いくつかの植物では、マンナン鎖のガラクトース枝分かれの程度はα−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）の活性に部分的に左右されることが発見された。この酵素は、植物種子保存組織、又は成熟中に保存されたガラクトマンナンからα−１，６結合ガラクトース単位を遊離することができる（Buckeridge and Dietrich、Plant Sci.117(1996)、33〜43）。さらに、内胚乳又は子葉組織におけるガラクトース／マンノース比が非常に低いある種の植物では、ガラクトマンナンの蓄積は、これらの組織の成熟中及びそれらの硬化及び乾燥によるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性のピークと関係があることが示された（Kontos and Spyropoulos、Plant Physiol.Biochem.34(1996)、787〜793）。
【０００４】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性はまた、ガラクトマンナン多糖類にα−１，６−結合したガラクトース残基を除去する能力に関連しており、重合体の溶解性の低下をもたらす（McCleary、Carb.Res.92(1981)、269〜285）。さらに、ガラクトマンナンからガラクトース側鎖を除去すると、そのほかの多糖類、たとえばグアー中のキサンタンと相互作用して、それに伴って複合ゲルを形成する能力が増大するようである。コーヒー豆マンナンのガラクトース枝分かれは成熟中に減少し、若い豆では約４０％であったのが、成熟豆では低レベルになる。同時に、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素活性は、コーヒー豆成熟の間に増大する。
【０００５】
コーヒーのα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡはクローニングされている（Zhu and Goldstein、Gene 140(1994)、227〜231）。それらから得られた情報によれば、成熟コーヒー豆のα−Ｄ−ガラクトシダーゼは、３６３個のアミノ酸から構成されるものと推定され、４２０残基のプレプロ酵素として合成される。生合成の後、プロテアーゼによる２カ所の切断によって分泌シグナル（３８残基）及びもう１つのシグナルペプチド（１９残基）が除去され、活性酵素に特徴的なＮ末端アミノ酸配列を示す蛋白質が生成される。
【０００６】
可溶性コーヒーの調製及び／又は貯蔵性において知られているガラクトマンナンの効果を考えると、当業界ではこのような状況を改善する必要性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、可溶性コーヒーの調製方法を改良しながら、同時にコーヒー液体を貯蔵するときの障害を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の問題は、ガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させたコーヒー植物細胞、及びコーヒー植物それぞれを提供することによって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施形態によれば、この目的は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させることによって達成することができる。これは、当業界で使用されている技術を使用して、従来の突然変異及び選択の方法によって達成することができる。したがって、植物細胞を、細胞ＤＮＡの改変をもたらす化学物質や照射に暴露することなどの変異処理に供することが可能である。したがって、処理した細胞はその後所望する特性についてスクリーニングする。
【００１０】
他の好ましい実施形態では、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンスコピー又はその一部に転写される核酸を含有する構築物をコーヒー植物細胞に導入することによってα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルの低下をもたらす。
【００１１】
このため、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンスコピーは、生理学的条件下で２量体を形成できる、すなわち、細胞内の一般的な条件下で、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸であってよい。したがって、このアンチセンスコピーは対応する相手と１００％相同である必要はなく、どちらかといえば２量体を形成するために十分な結合をもたらすことが必要である。したがって、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入によって改変されたアンチセンスコピー（及び転写される対応核酸）はまた、十分に本発明の範囲内である。この点に関して、このアンチセンスコピーはα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対する完全な相手であることが可能である、すなわち、α−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡと本質的に同じ長さを有するＲＮＡ分子を提供できることもまた、理解されよう。他方、このアンチセンスコピーはα−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部のみを含むことが可能である。
【００１２】
リボ核酸、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのアンチセンス、又はその一部をコードする核酸は、構造又は誘導プロモータの制御下にあることが可能で、したがってアンチセンスＲＮＡのレベルを適切に調節することが可能である。しかし、いかなる場合においても、アンチセンスコピーのレベルは、リボソームに接近できるα−Ｄ−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡコピー数を減少させるために十分高くなければならない。
【００１３】
好ましい実施形態では、使用するプロモータは十分高い転写速度をもたらすコーヒーｃｓｐ１プロモータである。
【００１４】
したがって、本発明は最終的にガラクトマンナンのガラクトース枝分かれを増加させるようにα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性レベルが低下した改変コーヒー植物細胞及びコーヒー植物のそれぞれを提供する。好ましい実施形態によれば、この植物はトランスジェニック植物で、その植物の細胞にはα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子から得られたｍＲＮＡのアンチセンスコピー又はその一部を提供できる構造物が存在する。
【００１５】
本発明はまた、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の低下を示す植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む可溶性コーヒーの調製方法を提供する。この点に関して、本発明はまた、ガラクトース枝分かれを増加させることによってコーヒーの溶解性を高める方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ガラクトースの枝分かれを増加させることによってコーヒーガラクトマンナンの溶解性を高めることを目的とする。採用した戦略は、好ましくはコーヒーｃｓｐ１プロモータの制御下にそのｃＤＮＡのアンチセンスコピーを導入することによってα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルを低下させる方法である。
【００１７】
このｃｓｐ１プロモータは、既に特徴づけられており（Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999）、２７３〜２８２）、コーヒー１１Ｓ貯蔵蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する。前記プロモータを含有するカセットを構築して、ｐＴｉＴ３７プラスミドから得られた翻訳用バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域に導入した（Bevan、Nucl.Acids Res.12(1984)、8711〜8721）。この組換えベクターをアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入して、コーヒー外植片の形質転換に使用した。ゲノムに挿入されたＴ−ＤＮＡを有するコーヒー植物を再生させ、その種子のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。
【００１８】
Ｉ．成熟中のコーヒー豆におけるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の分析
温室（温度約２５℃、湿度７０％及び天然光）で栽培しＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種Ｃａｔｕｒｒａ Ｔ２３０８から様々な成熟段階で果実を収穫した（齢は開花後の週、ＷＡＦとして表す）。果実を収穫後液体窒素で凍結させ、使用するまで−８５℃で保存した。成熟研究のために、内胚乳と子葉組織を分離した。
【００１９】
植物材料を液体窒素中で磨砕して、氷冷酵素抽出緩衝液（グリセロール１０％ｖ／ｖ、メタ重亜硫酸ナトリウム １０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＭＯＰＳ（ＮａＯＨ）４０ｍＭ、ｐＨ６．５）で１００μｌ当たり約２０ｍｇの比で抽出した。この混合物を氷上で２０分間撹拌して、遠心し（１２０００ｇ×３０分間）、一定分量に分けて使用するまで−８５℃で保存した。α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＧＰ）で分光光度計によって検出した。
【００２０】
この反応混合物は、２００μｌの１００ｍＭ ｐＮＧＰ及び酵素抽出物を含有し、ＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（クエン酸１００ｍＭ−Ｎａ２ＨＰＯ４ ２００ｍＭ ｐＨ６．５）で最終量１ｍｌとした。反応は、２６℃で維持して、酵素を添加して開始させ、４倍量の停止溶液（Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３ １００ｍＭ ｐＨ１０．２）を添加することによって停止させた。吸光度は４０５ｎｍで読み取る。ニトロフェニルの生成は、分子吸光係数ε＝１８３００（ｐＨ１０．２に特異的）を使用して算出し、１分間当たりの蛋白質１ｍｇ当たりのｍｍｏｌに変換した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２（１９７６）、２４８〜２５４）、水性緩衝液で抽出した試料で全蛋白質量を測定した。活性の発現には、各試料を抽出して一定分量に分け、アッセイを３つ組で実施し、結果は平均で表した。
【００２１】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、若い豆の段階では極めて低いか、又は検出されないが、果皮の色が赤くなると同時にピークに達する。その後の段階で、活性は果実がまだ赤くても低下する。活性は又、コーヒー植物の異なる組織で比較する。外胚乳、根及び葉における活性は特に低く、検出限界に近い。しかし、内胚乳では高い活性が記録され、その活性は約３６ＷＡＦでピークに達するが、給水膨潤後発芽した豆でも高い活性が記録される。
【００２２】
ＩＩ．Ｃ．ａｒａｂｉｃａのα−ガラクトシダーゼ完全長ｃＤＮＡの単離
数種のコーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ配列が文献で得られているが、元のコーヒー材料が示されていない。アミノ酸及び核酸配列の違いが、Ｃ．ａｒａｂｉｃａとＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａの間に認められるかどうかを確かめるために、両種からα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをクローニングすることに決定した。
【００２３】
Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種Ｃａｔｕｒｒａ Ｔ２３０８から得られたｃＤＮＡライブラリは、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（Plant Physiol.Biochem.、37(1999)、261〜272）に従って開花後３０週で抽出したｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡで構築した。このプラスミドｃＤＮＡライブラリ（１０ｎｇ）は、コーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡ配列から直接推定したプライマーＢＥＴＡ１（配列番号２）及びＢＥＴＡ３（配列番号３）を使用してＰＣＲによって試験した（Zhu and Goldstein、1994）。ＢＥＴＡ１プライマーは配列番号１のヌクレオチド１７７と１９３の間に位置する。ＢＥＴＡ３プライマーは、配列番号１のヌクレオチド１２９７と１３１３の間に位置する。ＰＣＲ反応は、適切な１×緩衝液、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ及び各オリゴヌクレオチド０．２５μＭ中で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、11011 North Torrey Pines Road、La Jolla、カリフォルニア 92037、USA）で実施した。変性は、９４℃で３０秒、アニーリングは４６℃で３０秒、及び伸長温度は７２℃で３分である。このサイクルをＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｓｔａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）で３０回繰り返した。ＰＣＲ産物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＡ、ＢＰ３０７ Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ ｃｅｄｅｘ ７８０５４、フランス）カートリッジで精製し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＵＳＡ）が説明するようにｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）に連結した。次に、連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換し、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ断片を含有する組換えベクターを精製して、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ Ａｍｐ（＋）のＳｆｒＩ部位にクローニングした。その配列は、配列番号１の配列の位置１７７と１３１３の間に位置する。
【００２４】
文献によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡの５’末端には、ＢＥＴＡ１プライマーの５’末端の上流に１９８ｂｐを含有する。我々の遺伝子型からこの配列をクローニングするために、プライマーＢＥＴＡ１００（配列番号３）及びＢＥＴＡ１０１（配列番号４）を用いて、既に説明したようにさらにＰＣＲを実施する。このＣ．ａｒａｂｉｃａ配列は、ｐＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングされて、ｐＬＰ１が得られ、これは配列番号１に対応している。
【００２５】
得られたｃＤＮＡは、配列番号１の位置５１から始まって位置１３１３で終わる１２６３ｂｐのオープンリーディングフレームを含有する。翻訳産物は、配列番号２に対応し、コーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼは位置１２６のＡＴＧの代わりに位置５１の翻訳開始コドンＡＴＧを使用したプレプロ酵素として合成されることが示唆された。他方、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａからクローニングされたα−Ｄ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡの分析によって、翻訳産物はＣ．ａｒｂｉｃａで見いだされた蛋白質と非常に相同性が高い（類似度＞９９％）ことが示された。
【００２６】
ＩＩＩ．果実成熟中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
生長の様々な段階、すなわち、開花後（ＷＡＦ）９、１２、１６、３０及び３５週で収穫したＣ．ａｒａｂｉｃａ Ｃａｔｕｒｒａのコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の発現をモニターした。これを行うために、これらのコーヒー豆の全ＲＮＡ１０μｇをホルムアミド（５０％）及びホルムアルデヒド（最終濃度０．６６Ｍ）の存在下で、１×ＭＯＰＳ緩衝液（ＭＯＰＳ ２０ｍＭ、酢酸ナトリウム ５ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ７）中において６５℃で１５分間変性させた。次に、ホルムアルデヒド最終濃度２．２Ｍを含有する１．２−％アガロースゲルを用いて、１×ＭＯＰＳ緩衝液の存在下、２．５Ｖ／ｃｍで６時間の電気泳動によってこれらを分離した。
【００２７】
移動後、ＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、USA、1989、chapter 9.31から9.51）に従って臭化エチジウム（ＢＥＴ）で染色した。これによって、１８Ｓ及び２５ＳリボソームＲＮＡの蛍光の強度からゲルに沈着した量を標準化することが可能である。次に、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Roche-Boehringer Mannheim GmbH、Biochemica、Postfach 310120、Mannheim 31、DE）の推奨に従って全ＲＮＡを正に荷電したナイロン膜に移して固定した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、前述の条件に従って実施した。
【００２８】
ノザンブロットの結果によって、内胚乳生長の早期段階で遺伝子発現のピークが示された。温室条件下での特異的ｍＲＮＡ発現のピークは約２６ＷＡＦで起こり、酵素活性の増大開始と一致する。ｍＲＮＡ発現のピーク期間は、内胚乳膨張の主要期間に対応し、これらの条件下での果実成熟中に硬化が生じる。α−ガラクトシダーゼ特異的ｍＲＮＡのピーク発現は、１１Ｓ果実貯蔵蛋白質ｍＲＮＡのピーク発現と同時か、又は少し後に生じた。これらの結果から、成熟中のコーヒー豆におけるα−ガラクトシダーゼ活性レベルを低下させるために、１１Ｓコーヒープロモータの制御下におけるα−ガラクトシダーゼをコードするコーヒーｃＤＮＡのアンチセンスカセットの構築がもたらされた。
【００２９】
ＩＶ．α−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットの構築
配列番号７に対応する特異的プライマーＵＰ２１０−１及び配列番号８に対応するＢＡＧＵＳ２を用いて、コーヒーから１１Ｓプロモータ配列（Marraccini et al.、Plant Physiol.Biochem.37(1999)、273〜282）を増幅した。オリゴヌクレオチドＵＰ２１０−１は、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されたヌクレオチド２４と７６との間の配列に対応し、ＫｐｎＩ制限部位を含有し、配列番号９に対応する合成配列ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧを５’末端に含有する。ＢＡＧＵＳ２プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含有する配列番号１０に対応する合成配列ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧを５’末端に含有する。このプライマーは又、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）によって報告された配列のヌクレオチド９９８から９７６を含有する。この反応は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（３単位）の存在下で、ｐＣＳＰＰ４（ＷＯ９９／０２６８８）１０ｎｇを用いて、ＫＣｌ １０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、ＢＳＡ １０μｇ／ｍｌ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、前記の各オリゴヌクレオチド ０．２５μＭを含有する最終量５０μｌにおいて実施した。次に、この反応混合物を３０回（９４℃−６０秒、５５℃−６０秒、７２℃−３分）インキュベートし、その後最終伸長サイクルとして７２℃で７分インキュベートした。
【００３０】
約９５０ｂｐのＰＣＲ断片をＭｉｃｒｏｃｏｎ １００カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、フランス）で精製し、供給元の推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２８００ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１ ＵＳＡ）の存在下で、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターに連結させた。次に、完全なライゲーション混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した。形質転換体１種を選択して、ＰＣＲ断片の方向を決定するために、そのプラスミドを精製して挿入部分を配列決定した。この分析により、プラスミドのｐＬＰ７の選択が可能となった。
【００３１】
１１Ｓプロモータのより短い変種も、配列番号１１の核酸配列を有するプライマーＵＰ２１３−１をプライマーＵＰ２１０−１と置換すること以外は同様の手法によって増幅した。このプライマーは、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されたヌクレオチド７５４と７７７の間の配列に対応し、５’末端に合成配列、配列番号９を含有する。これによって、既に説明した様にクローニングされたｐ１１Ｓコーヒープロモータの２５０ｂｐ断片の増幅が導かれ、プラスミドｐＬＰ８が得られた。
【００３２】
ＴＮＯＳターミネータは、配列番号１２の核酸配列を有するプライマーＴＮＯＳ１及び配列番号１３の核酸配列を有するＴＮＯＳ２を使用すること以外は、ｐ１１Ｓプロモータの増幅で説明した方法に従って増幅する。ＴＮＯＳ１はその５’末端に配列番号１０の配列を含有する。ＴＮＯＳ２は、その５’末端に配列番号９の配列を含有する。これらのプライマーによって、ｐ３５ＳＧＦＰ市販ベクター（Clontech Laboratories Inc.、1020 East Meadow Circle、Palo Alto、カリフォルニア94303-4230 USA）からＴＮＯＳ配列の増幅がもたらされた。ＰＣＲ産物を前述のようにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングし、ｐＬＰ３２と称される組換えベクターを導き、その方向を決定するために配列決定した。次に、このベクターをＢａｍＨＩで消化して、ＴＮＯＳ配列を除去して、後でＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、平滑末端を形成した。
【００３３】
他方、ｐＬＰ７及びｐＬＰ８ベクターを、ＥｃｏＲＩによって直線化し、又Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成した。次に、ＴＮＯＳターミネータを正しい方向でｐＬＰ７及びｐＬＰ８ベクターにクローニングして、それぞれベクターｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋を導いた。
【００３４】
配列番号１４の核酸配列を有するプライマーＢＥＴＡ１００Ｂ１及び配列番号１５の核酸配列を有するＢＥＴＡ１０１Ｂ１を使用すること以外は前述の条件を使用して、α−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを既に単離したベクターｐＬＰ１から増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、以前に使用したＮＥＴＡ１０１及びＢＥＴＡ１００プライマーに対応しており、配列番号１０の配列に対応するＢａｍＨＩ制限部位が５’末端に導入されていた。このＰＣＲ産物を前述のようにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングして、ｐＬＰ２０と称する組換えベクターを導いた。
【００３５】
このプラスミドをＢａｍＨＩで消化してα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを放出させた。他方で、受容ベクターｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋を同様の制限酵素によって独立して消化して、供給元（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に従ってＣＩＡＰ処理によって脱リン酸化した。α−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをｐ１１ＳＴＮＯＳ７及びｐ１１ＳＴＮＯＳ７＋ベクターにアンチセンス方向にクローニングして、ｐＡＬＰＨＡ１及びｐＡＬＰＨＡ９と称するベクターを導いた。
【００３６】
これらのカセットをコーヒー細胞懸濁液の形質転換に使用するバイナリーベクターに移動させるために、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる最終ＰＣＲ反応を、配列番号１６の核酸配列を有するプライマーＵＰＳＡＬ１及び配列番号１７の核酸配列を有するＵＰＳＡＬ２を使用して実施した。両オリゴヌクレオチドは、ＳａｌＩ制限部位を含有し、１１Ｓプロモータ及びＮＯＳターミネータ（ＴＮＯＳ）ＤＮＡ領域に隣接したｐＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターのＤＮＡ配列を認識する。さらに、この制限部位にはバイナリープラスミドのＴ−ＤＮＡに導入するための配列が存在しない。これらのＰＣＲ産物を再度ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）ベクターにクローニングし、ＳａｌＩで消化して、この制限部位がカセットに隣接していることを確かめた。得られたプラスミドは、ｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０と称され、ｐＡＬＰＨＡ１及びｐＡＬＰＨＡ９それぞれから得られた。
【００３７】
Ｖ．形質転換用バイナリーベクターにおけるα−ガラクトシダーゼアンチセンスカセットのクローニング
ベクターｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０に含有されるα−ガラクトシダーゼカセットの配列を決定して、その完全性を確認し、特にＰＣＲ増幅サイクル中にいかなる点突然変異も再構成も生じていないことを確かめた。次に、ｐＡＬＰ４１４及びｐＡＬＰ５０ベクターをＳａｌＩ制限酵素で消化することによってこれらのカセットを精製し、遺伝子ｃｒｙｌＡｃが存在しない以外はＬｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（Plant Cell Rep.19(1999)、382〜389）に記載されたベクターに関連するｐＢｉｎ１９由来のプラスミドに、それぞれ独立してクローニングした。これを実施するために、ｕｉｄＡとｃｓｒ１−１遺伝子の間の特有の部位を認識するＳａｌＩ制限酵素でベクターを消化し、脱リン酸化した。このライゲーションの後、ベクターｐＢＩＡ１２１、ｐＢＩＡ１２６及びｐＢＩＡ９を選択した。ｐＢＩＡ１２１ベクターでは、ｐＡＬＰ４１４から得られたＳａｌＩカセットを［ＬＢ］Ｇｕｓ−イントロン＞ｐ１１Ｓ（長）アンチセンスα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ＞ｃｓｒ１−１［ＲＢ］の方向でクローニングする。しかし、同様のカセットをｐＢＩＡ１２６ベクターでは逆方向にクローニングする。他方、ｐＢＩＡ９ベクターにクローニングしたｐＡＬＰ５０から得られたＳａｌＩカセットは、以下の方向、［ＬＢ］Ｇｕｓ−イントロン＞ｐ１１Ｓ（短）アンチセンスα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ＞ｃｓｒ１−１［ＲＢ］の方向でクローニングする。
【００３８】
ＶＩ．アグロバクテリウム ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens ）の形質転換
前述した形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＡ１２１、ｐＢＩＡ１２６及びｐＢＩＡ９を、Ａｎ ｅｔ ａｌ．が記載した直接形質転換方法（Plant Mol.Biol.Manuel、Gelvin、Schilperoort and Verma Eds、Kluwer Academic Publishers Dordrecht、Netherlands、A3(1993)、1〜19）に従って無害化したアグロバクテリウム ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株にそれぞれ独立して導入した。それぞれの形質転換について、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスクローンはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びリファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）を補給したＬＢ培地で選択した。
【００３９】
アグロバクテリウム ツメファシエンスに導入したプラスミドの構造を調べるために、迅速少量調製法によってこれらを抽出し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株に逆形質転換した後、制限マッピングによって分析した。
【００４０】
ＶＩＩ．Ｃｏｆｆｅａ種の形質転換
葉外植片を培養して、体細胞胚が移植片の縁に出現するまで、３から５カ月間、５週間間隔で継代培養した。体細胞胚を魚雷型胚の段階で採取し、滅菌したメスで傷をつけて、組換えアグロバクテリウム ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を０．３から０．５のＯＤ６００ｎｍで含有する０．９％ＮａＣｌ溶液に２時間浸漬した。暗所において、ホルモンを含まない半固形ＭＳ培地で共培養を３日間実施し、次に一定であるがゆっくり振盪しながら、セフォタキシム（１ｇｒ／ｌ）を含有する液体ＭＳ培地で３から５時間洗浄した。胚は照明を低くした条件下で（１日当たり明期１６時間）セフォタキシム（４００ｍｇ／ｌ）の存在下でＢＡＰ５μＭ、スクロース９０μＭを含む半固形培地で培養した。３から４週間後、それらをセフォタキシム（４００ｍｇ／ｌ）及びクロルスルフロン（８０ｍｇ／ｌ）を補給した選択ＭＳ培地に移した。次に、カルスが発芽するまで、これらを毎月新しい選択培地に移した。次に、カルスの周りに生長した形質転換胚をＭｏｒｅｌビタミン（ＢＡＰ１μＭ及びスクロース３０μＭ）を含む半固形ＭＳ培地で培養して、発芽を誘導した。この段階の後、前述の、但しＢＡＰを含まない培地に対応する発根培地に移した。
【００４１】
形質転換の有効性を調べるために、カルス、茎頂、根及び葉におけるｕｉｄＡリポーターの発現をＧＵＳ組織化学アッセイで定期的に試験した（Jefferson et al.、J.EMBO 6(1987)、3901〜3907）。
【００４２】
この操作の後で、数個の個々の植物を選択して、微細に切断してｉｎ ｖｉｔｒｏにおける繁殖を行った。それらのいくつかは温室に移して生長させた。形態異常は認められなかった。
【００４３】
ＶＩＩＩ．形質転換コーヒー植物の体細胞胚の分析
体細胞胚は又、葉移植片から誘導して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在を検出した。１１Ｓコーヒー蛋白質は、体細胞胚で検出され（Yuffa et al.、Plant Cell Rep.13(1994)197〜202）、ｃｓｐ１プロモータがこの組織で活性化されていることが示唆された。これが事実であれば、若いトランスジェニックコーヒー植物から誘導された体細胞胚を分析することによって、豆よりも早くα−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在を検出することが可能となる。
【００４４】
次に、全ＲＮＡを前述のように形質転換した体細胞胚１００ｍｇから抽出して、Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ系キット（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＳＡ）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって試験した。最初に、１１Ｓ特異的ｍＲＮＡの存在を１１ＳｃＤＮＡのコード配列に位置するプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施することによって確認した。これは、配列番号１８の配列に対応するプライマーＳＯ１１及び配列番号１９の配列に対応するプライマーＳＯ２−１を使用して実施した。ＳＯ１１プライマーは、前述のＭａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって報告された配列のヌクレオチド１０３５から１０５９の間の配列に対応する。他方、ＳＯ２−１プライマーは、報告された配列の最後の２４ヌクレオチドに対応する。ｃＤＮＡの最初の鎖の合成（逆転写段階）は、供給元の説明のように実施した（４８℃、４５分）。以下の変数をＰＣＲ反応に使用した。４５回（変性段階として９４℃で６０秒、アニーリング段階として５２℃で９０秒、伸長段階として６８℃で４分）、６８℃で７分間最終伸長。
【００４５】
この実験から、プライマーＳＯ１１及びＳＯ２−１に隣接した１１ＳｃＤＮＡ配列に対応する１５９０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この結果によって、１１ＳｍＲＮＡは試験した全ての組織、すなわち、根、葉、花には存在しないが、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａの体細胞胚並びに２７ＷＡＦの豆には有効的に存在することが確かめられた。
【００４６】
第２に、α−ガラクトシダーゼセンスｍＲＮＡの存在は、逆転写段階で配列番号２１の配列に対応するプライマーＢ３３のみを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を実施することによって試験した（条件１）。このプライマーは、配列番号１のヌクレオチド１２８６から１３１４の相補的配列に対応する。
【００４７】
併行して、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの検出を、逆転写段階でプライマーＢ１１のみを使用して実施した（条件２）。このプライマーは、配列番号１のヌクレオチド５０から７８の間の配列に対応する。この逆転写後（４８℃、４５分）、反応混合物を１分間９４℃で処理して、ＭＭＬＶ逆転写酵素を不活性化した。欠損したオリゴヌクレオチド、条件１のＢ１１及び条件２のＢ３３を添加して、反応を４５回（変性段階として９４℃で６０秒、アニーリング段階として４５℃で９０秒、伸長段階として６８℃で４分）、６８℃で７分間の最終伸長によるＰＣＲによって継続した。形質転換していないＣ．ａｒａｂｉｃａから得られた体細胞を使用すると、１３１０ｂｐの増幅産物は条件１で確認されたが、条件２の実験では確認されなかった。しかし、ｐＢＩＡ９ベクターによって形質転換したコーヒー小植物から得られた体細胞胚については、実験条件２で増幅産物を検出することはできなかったので、α−ガラクトシダーゼアンチセンスｍＲＮＡの存在が確認された。
Claims (9)
- ガラクトース枝分かれが増加したガラクトロマンナンを産生するコーヒー植物細胞。
- α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の内在レベルが低下した請求項１に記載のコーヒー植物細胞。
- α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の、ｍＲＮＡのアンチセンスであるリボ核酸又はその一部に転写される核酸を含有する、請求項１又は２に記載のコーヒー植物細胞。
- α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の、ｍＲＮＡのアンチセンスであるリボ核酸又はその一部に転写される核酸が構成的又は誘導プロモータの制御下にある、請求項３に記載のコーヒー植物細胞。
- 前記プロモータがコーヒーｃｓｐ１プロモータである請求項５に記載の植物細胞。
- 前記請求項のいずれかに記載の植物細胞を含有する、コーヒー植物。
- 請求項６に記載のコーヒー植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む、可溶性コーヒーの調製方法。
- 請求項６に記載の植物由来のコーヒー豆を使用する段階を含む、コーヒーの溶解度を増大させる方法。
- 可溶性コーヒーを調製するための、請求項６に記載のコーヒー植物から得られた豆の使用。
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