CN102643800B

CN102643800B - 一种提取植物dna的方法及其专用试剂盒

Info

Publication number: CN102643800B
Application number: CN201210124356.7A
Authority: CN
Inventors: 周世良; 李金璐; 于婧; 王硕
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN102643800A

Abstract

本发明的目的是提供一种被称为mCTAB的植物DNA提取方法及其专用试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括缓冲液A，所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠4-6mmol·L^-1，NaCl 0.2-0.3M，聚乙烯基吡咯烷酮1-3g/100ml；1M且pH8.0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml；所述溶剂为水。本发明的mCTAB法提取植物DNA具有产率高、质量较好、PCR扩增成功率高、成本低、通用性好五大优点，能满足一般分子生物学研究DNA提取的需要，特别适合科研经费不充裕的研究者和大批量植物DNA的提取。

Description

一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒。

背景技术

DNA是植物的基本遗传物质，是植物遗传信息的载体。一定量及高质量的DNA样品是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的基础。因此，如何获取一定量及高质量的DNA样品显得极为重要。

植物细胞有细胞壁，含有较多的多糖等次生代谢物，而且不同植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，有时同种植物不同器官或组织的此生代谢物的种类和含量也不一样，导致获取高质量的DNA有一定的难度。针对某种特殊物种优化的DNA提取方法不一定适用于其他物种。传统CTAB法是目前应用最多的DNA提取方法，但由于植物材料化学成分、组织结构等差异，传统的CTAB法的提取效果有时欠佳，在使用上受到一定的限制。因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的植物DNA提取方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒。

本发明所提供的用于提取植物DNA的试剂盒，包括缓冲液A；所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠4-6mmol·L^-1，NaCl 0.2-0.3M，聚乙烯基吡咯烷酮1-3g/100ml；浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml；所述溶剂为水。

上述试剂盒中还可包括缓冲液B；所述缓冲液B由溶质及溶剂组成：所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下：浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠20-30mmol·L^-1，NaCl 1.2-1.6M，CTAB2.5-3.5g/100ml，偏亚硫酸氢钠0.5-1.5g/100ml，抗坏血酸钠0.5-1.5g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮1-3g/100ml，β-巯基乙醇80-120ul/100ml；所述溶剂为水。

上述任一所述试剂盒中，所述缓冲液A具体可为如下：所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠5mmol·L^-1，NaCl 0.25M，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml；浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml；

上述任一所述试剂盒中，所述缓冲液B具体可为如下：所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下：浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠25mmol·L^-1，NaCl 1.4M，CTAB 3g/100ml，偏亚硫酸氢钠1g/100ml，抗坏血酸钠1g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml，β-巯基乙醇100ul/100ml。

本发明所提供的提取植物DNA的方法，包括如下步骤：

(1)将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；

(2)将缓冲液B与步骤(1)所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液；

(3)用氯仿异戊醇溶液从步骤(2)中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA；

所述缓冲液A和所述缓冲液B均为上述任一所述试剂盒中的缓冲液A和缓冲液B。

上述方法中，所述步骤(1)中，冰浴的时间为10min-20min。

上述方法中，所述步骤(2)中，所述放置的方法为60℃-70℃水浴90-120min，具体为65℃水浴100min。

上述方法中，在所述步骤(1)之后，所述步骤(2)之前，还包括如下重复步骤：将上一步骤所得沉淀与所述缓冲液A混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；直到上清不粘稠。

上述方法中，所述步骤(1)中，所述缓冲液A与植物组织粉末的配比为1mL缓冲液A：20mg植物组织粉末；所述冰浴过程中颠倒混匀2-3次；所述离心为7000×g离心10min；所述冰浴的时间为15min；

上述方法中，所述步骤(2)中，所述缓冲液B与所述植物组织粉末的配比为0.7mL缓冲液B：20mg植物组织粉末；所述水浴过程中颠倒混匀数次；所述离心为10000×g离心10min。

上述方法中，所述步骤(3)中，所述用氯仿异戊醇溶液从步骤(2)中所得上清液中提取DNA的方法如下：向步骤(2)所得上清液中加入0.7mL氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀10min，10000×g，离心10min，收集上清；氯仿异戊醇溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；重复上述氯仿异戊醇步骤，直到离心后两个液面之间没有沉淀；然后加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置20min，10000×g，离心10min，弃上清；

上述方法中，所述步骤(3)中，所述去RNA的方法包括如下步骤：加入0.1mL的浓度为100mg·L^-1的RNase溶液，37℃放置30-60min；加入0.1mL去离子水、0.1mL5MNaCl溶液，0.8mL 95％无水乙醇，混匀，10000×g离心10min，弃上清；

上述方法中，所述步骤(3)中，所述沉淀DNA的方法如下：加入0.5mL 75％乙醇水溶液，弹起沉淀，10000×g，离心2min，弃上清。

上述方法中，所述植物组织为植物叶片。

上述方法中，所述植物为如下中的任一种：短尖叶墙藓、荚果蕨、油松、二乔玉兰、葡萄、月季花、反枝苋、美丽向日葵、箬竹、西藏虎头兰。

本发明的mCTAB法提取植物DNA具有产率高、质量较好、PCR扩增成功率高、成本低、通用性好五大优点，能满足一般分子生物学研究DNA提取的需要，特别适合科研经费不充裕的研究者和大批量植物DNA的提取。

附图说明

图1为用五种方法提取的10种植物的DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。λDNA的浓度从左到右分别为10ng、25ng和50ng。编号1-10为样品编号(同表1)。I、II、III和IV分别代表四个公司的DNA提取试剂盒。

图2为用五种方法提取的10种植物的DNA扩增四种DNA条形码常用片段的情况。引物情况：A.rbcLaf/r；B.trnH/psbA；C.matK472F/1248R；D.ITS1/ITS4。编号1-10为样品编号(同表1)；MD为mCTAB；I、II、III和IV分别代表四个公司的DNA提取试剂盒。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述各实施例及对比例中使用的原料如下：选取10种常见植物(表1)，分别作为苔藓植物、蕨类植物、裸子植物、基部被子植物、单子叶植物、蔷薇类植物、菊类植物等各大分枝(APG III，2009)的代表。这10种植物同时包含了乔木、灌木、藤本、多年生草本、一年生草本等不同的生长习性，有代表性。植物样品均采自中国科学院植物研究所植物园，数字影像信息及凭证标本存放于中国科学院植物研究所标本馆(PE)。采集该10种植物材料的新鲜叶片，40℃烘干后用硅胶保存备用。

表1.用于对比研究的材料。

下述实施例及对比例中对DNA的产率和质量的检测方法如下：

(1)电泳检测

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测五种DNA提取方法提取的DNA的片段大小、降解情况和浓度。取1μL DNA原液，加9μL电泳缓冲液，混匀后点入1％琼脂糖凝胶，5V/cm电泳30min，紫外凝胶成像仪上观察并拍照。用10ng、25ng和50ng三种浓度的λDNA为标准，Quantity One(BIO-RAD)计算DNA的量，从而推算DNA产率。

(2)分光光度计检测

取1μL DNA原液，用美国NanoDrop 2000微量分光光度计测定五种DNA提取方法提取的DNA的OD值及A260/280比值。根据分光光度计测定的DNA的OD值计算DNA的产率。

(3)PCR检测

将五种DNA提取方法提取的DNA原液稀释到50ng/μL，然后用植物DNA条形码候选片段(Kress et al.，2005；Plant Working Group 2009；Li et al.2011)进行PCR扩增，所用引物为：rbcLaf/r(Kress et al.，2007)、trnH/psbA(Kress et al.，2005)、matK472F/1248R(Yu et al.，2011)及ITS1/ITS4(Henrion et al.，1992)。

PCR扩增采用10μL反应体系，其中包括10×PCR Buffer(含MgCl₂)1μL，2mmol·L^-1dNTPs 1μL，5μmol·L^-1Primer F/R 0.5μL，0.5U Taq DNA polymerase0.1Ml，Template DNA 1μL，ddH₂O 5.9μL。

PCR扩增反应在BIO-RAD C1000TM Thermal Cycler PCR仪上完成。PCR扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性30s；52℃退火40s；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增成功情况，紫外凝胶成像仪观察并拍照。

实施例1、本发明的提取植物DNA的方法(以下简称mCTAB法)

1、称取20mg植物干材料，加入石英砂，研磨成粉末，将粉末转移到2.0mL的离心管中。

2、加入1mL预冷的缓冲液A，混匀后冰浴15min；冰浴过程中颠倒混匀2-3次。7000×g离心10min弃上清。

3、重复步骤2，直到上清不粘稠。

4、加入0.7mL缓冲液B(表3)，混匀后65℃水浴90-120min，水浴过程中颠倒混匀数次。10000×g，离心10min，吸上清于新的2.0mL离心管中。

5、加入0.7mL氯仿异戊醇溶液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀10min。10000×g，离心10min，吸上清于新的1.5mL离心管中。

6、重复步骤5，直到离心后两个液面之间没有沉淀。

7、加入0.5mL预冷异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置20min。10000×g，离心10min，弃上清。

8、加入0.1mL的RNase(100mg·L^-1)，37℃放置30-60min。加入0.1mL去离子水、0.1mL5M NaCl，0.8mL预冷95％无水乙醇，轻轻混匀。10000×g离心10min，弃上清。

9、加入0.5mL 75％乙醇，轻轻弹起沉淀，10000×g，离心2min，弃上清。

10、重复步骤9.

11、风干乙醇，加入0.1mLTE溶解DNA.

缓冲液A由如下溶质及溶剂组成：

溶质及其在缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠5mmol·L^-1，NaCl 0.25M，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml；1M且pH8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml；溶剂为水。

缓冲液B由如下溶质及溶剂组成：

溶质及其在缓冲液B中的终浓度如下：1M且pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠25mmol·L^-1，NaCl 1.4M，CTAB 3g/100ml，偏亚硫酸氢钠1g/100ml，抗坏血酸钠1g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml，β-巯基乙醇100ul/100ml。溶剂为水。

实施例2、

方法基本与实施例1中相同，不同之处如下：

缓冲液A由溶质及溶剂组成；溶质及其在缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠4mmol·L^-1，NaCl 0.2M，聚乙烯基吡咯烷酮1g/100ml；1M且pH8.0的Tris-HCl缓冲液8ml/100ml；所述溶剂为水。

缓冲液B由溶质及溶剂组成：溶质及其在缓冲液B中的终浓度如下：1M且pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液8ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠20mmol·L^-1，NaCl 1.2M，CTAB2.5g/100ml，偏亚硫酸氢钠0.5g/100ml，抗坏血酸钠0.5g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮1g/100ml，β-巯基乙醇80ul/100ml；所述溶剂为水。

冰浴的时间为10min；水浴的条件为60℃水浴90min。

实施例3、

方法基本与实施例1中相同，不同之处如下：

缓冲液A由溶质及溶剂组成；溶质及其在缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠6mmol·L^-1，NaCl 0.3M，聚乙烯基吡咯烷酮3g/100ml；1M且pH8.0的Tris-HCl缓冲液12ml/100ml；所述溶剂为水。

缓冲液B由溶质及溶剂组成：溶质及其在缓冲液B中的终浓度如下：1M且pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液12ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠30mmol·L^-1，NaCl 1.6M，CTAB3.5g/100ml，偏亚硫酸氢钠1.5g/100ml，抗坏血酸钠1.5g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮3g/100ml，β-巯基乙醇120ul/100ml；所述溶剂为水。

冰浴的时间为20min；水浴的条件为70℃水浴120min。

对比例1、

用市面上的公司I出售的植物DNA提取试剂盒、按照说明书进行提取。以下简称公司I。

对比例2、

用市面上的公司II出售的植物DNA提取试剂盒、按照说明书进行提取。以下简称公司II。

对比例3、

用市面上的公司III出售的植物DNA提取试剂盒、按照说明书进行提取。以下简称公司III。

对比例4、

用市面上的公司IV出售的植物DNA提取试剂盒、按照说明书进行提取。以下简称公司IV。

结果如下：

1、DNA的产率

电泳结果：不同的DNA提取方法因细胞裂解方法的不同与后续操作中DNA捕获程度的不同，其DNA产率不同，从DNA电泳条带亮度可以判断出DNA产率的高低。上述五种方法中，实施例1的mCTAB法提取的DNA其电泳条带明显比其他方法的DNA电泳条带亮(图1)，说明实施例1的mCTAB提取的DNA的产率高。

分光光度计测定结果(表2)：五种方法中，实施例1的mCTAB法提取的DNA产率明显高于其他四种试剂盒方法，10种植物平均值比各试剂盒方法平均值高出一倍多。尤其对于5号样品葡萄而言，实施例1的mCTAB法提取了较多的DNA，公司I的DNA提取试剂盒仅提取了微量的DNA，而公司II、公司III、公司IV基本上没有获得DNA，说明对于难度较高的材料，实施例1的mCTAB法提取效果很好，公司I的试剂盒效果均不理想。

表2.用分光光度估计的10种植物的DNA产率(每毫克干材料纳克DNA，ng.mg^-1)

2、DNA的质量

现有技术中，一般认为，用紫外分光光度计检测，高纯度DNA的A260/280比值应在1.8～2.0之间。当A260/280小于1.8时，说明DNA样品中存在蛋白质的污染，当A260/280大于2.0时，说明DNA样品中RNA含量较高。从表3可以看出，不同方法提取的DNA纯度有一定差异。实施例1的mCTAB法提取的DNA有7个样品A260/280比值位于1.8～1.89之间。公司I试剂盒提取的DNA有9个样品A260/280比值大于2.0，说明DNA样品中RNA含量较高。公司II、公司III和公司IV的试剂盒提取的DNA多数样品的A260/280比值均小于1.8，说明DNA样品中存在蛋白质等有机物的污染。由此可见，实施例1的mCTAB法提取的DNA纯度最高。

表3.用五种方法提取10种植物的DNA纯度(A260/280)。

样品	mCTAB	I	II	III	IV
						1	1.81	3.06	1.71	1.70	1.73
2	1.89	2.25	1.74	1.52	1.77
						3	1.80	2.11	1.80	1.67	1.77
4	1.88	2.09	1.81	1.79	1.73
						5	1.66	5.69	1.66	1.82	1.60
6	1.85	4.51	1.61	1.25	1.79
						7	2.16	2.14	1.71	1.75	1.79
8	1.68	1.98	1.25	1.29	1.47
						9	1.83	2.21	1.78	1.80	1.06
10	1.88	2.12	1.83	1.84	1.84

PCR扩增成功率是评判DNA质量的重要依据之一。由图2的总体PCR扩增成功率可以看出，实施例1的mCTAB和公司I相同，扩增出条带最多；公司II和公司IVPCR相同，扩增出条带稍少；公司III最差。就具体基因片段而言，实施例1的mCTAB和公司I的matK和ITS明显优于其他方法。

3、成本核算

DNA提取的成本是科研经费有限情况下必须考虑的因素之一。经过核算，实施例1的mCTAB法的成本为单个样品0.6元，公司I和公司II的试剂盒的成本为单个样品5元，公司III的成本为单个样品11元，公司IV的成本为单个样品为30元。显然，mCTAB法具有极显著的成本优势。

上述实施例2和实施例3中所示方法也提取得到目的DNA，结果与实施例1无显著差异。

综上所述，本发明的mCTAB法提取植物DNA具有产率高、质量较好、PCR扩增成功率高、成本低、通用性好五大优点，能满足一般分子生物学研究DNA提取的需要，特别适合科研经费不充裕的研究者和大批量植物DNA的提取。

Claims

1.一种用于提取植物DNA的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括缓冲液A；

所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠5mmol·L^-1，NaCl0.25M，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml；浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml；所述溶剂为水；

所述试剂盒中还包括缓冲液B；所述缓冲液B由溶质及溶剂组成：所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下：浓度为1M且pH为8.0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠25mmol·L^-1，NaCl1.4M，CTAB3g/100ml，偏亚硫酸氢钠1g/100ml，抗坏血酸钠1g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml，β-巯基乙醇100ul/100ml；所述溶剂为水。

2.一种提取植物DNA的方法，包括如下步骤：

（1）将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；

（2）将缓冲液B与步骤（1）所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液；所述放置的方法为60℃-70℃水浴90-120min；

（3）用氯仿异戊醇溶液从步骤（2）中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA；

所述缓冲液A和所述缓冲液B均为权利要求1所述试剂盒中的缓冲液A和缓冲液B。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，冰浴的时间为10min-20min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述放置的方法为65℃水浴100min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述步骤（1）之后，所述步骤（2）之前，还包括如下重复步骤：将上一步骤所得沉淀与所述缓冲液A混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；直到上清不粘稠。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步骤（1）中，所述缓冲液A与植物组织粉末的配比为1mL缓冲液A：20mg植物组织粉末；所述冰浴过程中颠倒混匀2-3次；所述离心为7000×g离心10min；所述冰浴的时间为15min；

所述步骤（2）中，所述缓冲液B与所述植物组织粉末的配比为0.7mL缓冲液B：20mg植物组织粉末；所述水浴过程中颠倒混匀数次；所述离心为10000×g离心10min；

所述步骤（3）中，所述用氯仿异戊醇溶液从步骤（2）中所得上清液中提取DNA的方法如下：向步骤（2）所得上清液中加入0.7mL氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀10min， 10000×g，离心10min，收集上清；氯仿异戊醇溶液中氯仿:异戊醇的体积比为24:1；重复上述氯仿异戊醇提取DNA的步骤，直到离心后两个液面之间没有沉淀；然后加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置20min，10000×g，离心10min，弃上清；

所述步骤（3）中，所述去RNA的方法包括如下步骤：加入0.1mL的浓度为100mg·L^-1的RNase溶液，37℃放置30-60min；加入0.1mL去离子水、0.1mL5M NaCl溶液，0.8mL95%无水乙醇，混匀，10000×g离心10min，弃上清；

所述步骤（3）中，所述沉淀DNA的方法如下：加入0.5mL75﹪乙醇水溶液，弹起沉淀，10000×g，离心2min，弃上清。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述植物组织为植物叶片。