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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Modifikation von Galactomannanen,
die in der grünen
Kaffeebohne vorhanden sind, indem man den endogenen Grad an α-D-Galactosidaseaktivität dadurch
vermindert, dass man in eine Kaffeepflanzenzelle ein Konstrukt einführt, das
eine Nucleinsäure
enthält,
die in eine Antisense-Kopie der mRNA transkribiert wird, für die das α-D-Galactosidasegen
codiert, oder einen Teil davon.
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Bei
Kaffeebohnen machen Zellwandpolysaccharide etwa 48% des Trockengewichts
der reifen Kaffeebohne aus, und von diesen bilden Mannane etwa die
Hälfte.
Diese Polysaccharide sind in gereinigter Form im wesentlichen unlöslich und
weisen eine sehr geringe Galactoseverzweigung auf (Bradbury and
Haliday, J. agric. Food Chem. 38 (1990), 389-392). Es ist anerkannt,
dass Mannanpolymere der Hauptgrund für die großen Verluste beim Gewicht des
ursprünglichen
Bohnenkaffees sind, die während
der Herstellung von löslichen
Kaffeedrinks beobachtet werden. Die Verluste treten entweder auf,
wenn unlösliches
Material während
der ursprünglichen
Extraktion als Sedimente zurückbleibt,
oder wenn sich während
der Lagerung von Kaffeeflüssigkeiten
Niederschläge
und Gele bilden. Es wurde ferner gezeigt, dass Mannane den Hauptbestandteil
bilden, der für
das Trübwerden
und für
Niederschläge
beim Stehenlassen von Kaffeegetränken
verantwortlich ist.
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In
einigen Pflanzen wurde festgestellt, dass der Grad der Galactoseverzweigung
der Mannanketten teilweise von der Aktivität der α-D-Galactosidase (EC 3.2.1.22)
abhängt.
Dieses Enzym ist in der Lage, α-1,6-verknüpfte Galactoseeinheiten
von Galactomannanen freizusetzen, die in Pflanzensamen-Speichergewebe
bei der Reifung gespeichert werden (Buckeridge und Dietrich, Plant
Sci. 117 (1996), 33-43). Ferner wurde gezeigt, dass auch die Akkumulation
von Galactomannanen mit einem sehr niedrigen Galactose/Mannose-Ver hältnis in
einigen Pflanzen-Endosperm- oder Keimblattgeweben mit einem Maximum
an α-D-Galactosidaseaktivität während der
Reifung dieser Gewebe und mit deren Härtung und Trocknung korreliert
sind (Kontos und Spyropoulos, Plant Physiol, Biochem. 34 (1996),
787-792).
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Die α-D-Galactosidaseaktivität wurde
auch mit der Fähigkeit
in Verbindungs gebracht, Galactosidasereste zu entfernen, die an
Galactomannan-Polysaccharide α-1,6
gebunden sind, was eine verminderte Löslichkeit der Polymeren zur
Folge hat (McCleary, Carb. Res. 92 (1981), 269-285). Außerdem scheint
die Entfernung von Galactose-Seitenketten von Galactomannanen deren
Fähigkeit
zu erhöhen,
mit anderen Polysacchariden zu wechselwirken, z.B. mit Xanthanen
in Guar, was von einer Bildung eines komplexen Gels begleitet ist.
Die Galactoseverzweigung an Kaffeekörnermannanen vermindert sich
von etwa 40% in jungen Körnern während der
Reifung bis auf das niedrige Niveau, das in den reifen Körnern gefunden
wird. Gleichzeitig nimmt die α-D-Galactosidase-Enzymaktivität während der
Reifung der Kaffeekörner
zu.
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Die
cDNA von α-D-Galactosidase
wurde kloniert (Zhu und Goldstein, Gene 140 (1994), 227-231). Aufgrund
der Information, die man aus der reifen Kaffeebohnen-α-D-Galactosidase
gewonnen hat, wird angenommen, dass sie aus 363 Aminosäuren besteht
und als ein Präproenzym
aus 420 Resten synthetisiert wird. Im Anschluss an die Biosynthese
entfernen dann zwei Proteasespaltungen ein Sekretationssignal (38
Reste) sowie ein weiteres Signalpeptid (19 Reste), wobei das Protein
erzeugt wird, das die N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die für das aktive
Enzym charakteristisch ist.
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Angesichts
der bekannten Effekte von Galactomannanen auf die Herstellung und/oder
Lagerfähigkeit von
löslichem
Kaffee bestand auf dem Fachgebiet ein Bedarf, diese Situation zu
verbessern.
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Es
ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes
Verfahren zur Herstellung von löslichem
Kaffee zu schaffen, bei dem man gleichzeitig die bekannten Nachteile
bei einer Lagerung von Kaffeeflüssigkeiten
vermeidet. Das obige Problem wurde dadurch gelöst, dass man eine Kaffeepflanzenzelle
bzw. eine Kaffeepflanze bereitstellt, bei der die Galactoseverzweigung
an den Galactomannanen erhöht
ist.
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Diese
Aufgabe wird dadurch erreicht, dass man den endogenen Grad der α-D-Galactosidaseaktivität vermindert,
indem man in eine Kaffeepflanzenzelle ein Konstrukt einführt, das
eine Nucleinsäure
enthält,
die zu einer Antisense-Kopie der mRNA transkribiert wird, für die das α-D-Galactosidasegen
codiert, oder in einen Teil davon.
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Zu
diesem Zweck kann die Antisense-Kopie der mRNA, für die das α-D-Galactosidasegen
codiert, irgendeine Ribonucleinsäure
sein, die in der Lage ist, unter physiologischen Bedingungen Dimere
zu bilden, d.h. mit der mRNA zu hybridisieren, für die das α-D-Galactosidasegen codiert,
und zwar unter den Bedingungen, die in der Zelle herrschen. Somit
muss die Antisense-Kopie kein 100-%iges Homologes ihres entsprechenden Gegenstücks sein,
sondern muss nur eine ausreichende Bindung zur Bildung eines Dimers
zeigen. Folglich liegen Antisense-Kopien (sowie die entsprechenden
Nucleinsäuren,
von denen sie transkribiert werden), die durch Substitution, Deletion
und/oder Insertion von Nucleotiden modifiziert sind, im Bereich
der vorliegenden Erfindung. Diesbezüglich versteht es sich ferner,
dass die Antisense-Kopie
ein volles Gegenstück
zu der mRNA sein kann, für
die das α-D-Galactosidasegen
codiert, d.h. sie kann ein RNA-Molekül darstellen,
das im wesentlichen die gleiche Länge wie die mRNA aufweist,
die für
das α-D-Galactosidase-Polypeptid
codiert. Andererseits kann die Antisense-Kopie nur einen Teil der
mRNA überdecken,
die für
das α-D-Galactosidase-Polypeptid
codiert.
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Die
Nucleinsäure,
die für
eine Ribonucleinsäure
codiert, die antisense zu der mRNA ist, für die das α-D-Galactosidasegen codiert,
oder zu einem Teil davon, kann unter der Kontrolle eines konstitutiven
oder eines induzierbaren Promotors stehen, so dass das Niveau der
Antisense-RNA ein fach gesteuert werden kann. In allen Fällen sollte
das Niveau der Antisense-Kopie jedoch ausreichend hoch sein, so
dass die Zahl an mRNA-Kopien, die für das α-D-Galactosidase-Polypeptid codieren
und die für
die Ribosomen zugänglich
sind, vermindert wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist der verwendete Promotor der Kaffee-csp1-Promotor, der einen
ausreichend hohen Transkriptionsgrad ergibt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Kaffeepflanze
bereit, in der der Grad der α-D-Galactosidaseaktivität vermindert
wurde, so dass letztlich die Galactoseverzweigung an den Galactomannanen
erhöht
ist. Die Pflanze ist eine transgene Pflanze, deren Zellen ein Konstrukt
beherbergen, das in der Lage ist, eine Antisense-Kopie der mRNA
zu erzeugen, die sich von dem α-D-Galactosidasegen
ableitet, oder eines Teils davon.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung
von löslichem
Kaffee bereit, das die Stufe der Verwendung von Kaffeebohnen umfasst,
die von einer transgenen Kaffeepflanze stammen, die eine verminderte α-D-Galactosidaseaktivität aufweist.
Diesbezüglich
liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Erhöhung der
Löslichkeit
von Kaffee durch Erhöhung
der Galactoseverzweigung.
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Die
vorliegende Erfindung hat das Ziel, die Löslichkeit von Kaffee-Galactomannanen
dadurch zu erhöhen,
dass man ihre Galactoseverzweigung erhöht. Die angewandte Strategie
besteht darin, das endogene Niveau an α-D-Galactosidaseaktivität zu vermindern,
indem man eine Antisense-Kopie ihrer cDNA unter der Kontrolle eines
Kaffee-csp1-Promotors einführt.
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Dieser
csp1-Promotor wurde bereits charakterisiert (Marraccini et al.,
Plant Physiol. Biochem. 37 (1999), 273-282) und kontrolliert die Expression
eines Gens, das für
das Kaffee 11S-Speicherprotein codiert. Eine Kassette, die den Promotor
enthält,
wurde konstruiert und in den T-DNA-Abschnitt eines binären Transformationsvektors
eingeführt,
der sich von dem pTiT37-Plasmid ableitet (Bevan, Nucl. Acids Res.
12 (1984), 8711-8721). Dieser rekombinante Vektor wurde in Agrobacterium
tumefaciens eingeführt,
das dazu verwendet wurde, Kaffeepflanzen zu transformieren. Kaffeepflanzen,
die in ihrem Genom als Insert die T-DNA beherbergten, wurden regeneriert
und auf die α-D-Galactosidaseaktivität in ihren
Körnern
analysiert.
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I Analyse
der α-D-Galactosidaseaktivität in Kaffeekörnern während der
Reifung
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Früchte wurden
zu unterschiedlichen Reifungsstufen geerntet (das Alter wird ausgedrückt als
Wochen nach der Blüte:
WAF), und zwar von Coffea arabica, Varietät Caturra T2308, die in einem
Gewächshaus
gezüchtet
wurde (Temperatur von etwa 25°C,
70% Feuchtigkeit und natürliche
Beleuchtung). Die Kaffeekirschen wurden im Anschluss an die Ernte
in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei –85 °C gelagert.
Für Reifungsstudien
wurden Endosperm- und Perisperm-Gewebe getrennt.
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Pflanzenmaterial
wurde in flüssigem
Stickstoff zerkleinert und in einem eiskalten Enzymextraktionspuffer
extrahiert (Glycerin 10% v/v, Natriummetabisulfit 10 mM, EDTA 5
mM, MOPS (NaOH) 40 mM, pH 6,5), bei einem ungefähren Verhältnis von 20 mg pro 100 μl. Die Mischung
wurde auf Eis 20 min gerührt,
zentrifugiert (12.000 g × 30
min), in Teilmengen aufgeteilt und bei –85 °C bis zur Verwendung gelagert. α-D-Galactosidaseaktivität wurde
spektrophotometrisch mit dem Substrat p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid
(pNGP) nachgewiesen.
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Die
Reaktionsmischung enthielt 200 μl
pNGP, 100 mM in McIlvain's
Puffer (Citronensäure
100 mM - Na2HPO4,
200 mM, pH 6,5) bis zu einem Endvolumen von 1 ml mit Enzymextrakt.
Man hielt die Reaktion auf 26 °C
und startete sie mit der Zugabe an Enzym und stoppte sie durch 4
Volumina Stopplösung
ab (Na2CO3-NaHCO3 100 mM, pH 10,2). Die Absorption wird bei
405 nm bestimmt. Die Entwicklung von Nitrophenyl wird unter Verwendung
eines molaren Extinktionskoeffizienten ϵ = 18300 (spezifisch
für pH
10,2) errechnet und in mmol min–1 mg
Protein–1 umgerechnet.
Gesamtprotein wurde in den in wässrigen
Puffern extrahierten Proben nach dem Verfahren von Bradford gemessen
(Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254). Zur Bestimmung der Aktivität wurde
jede Probe extrahiert und in Teilmengen aufgeteilt, und die Tests
wurden dreifach durchgeführt,
wobei die Ergebnisse als Mittelwerte angegeben werden.
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α-D-Glactosidaseaktivität ist in
den Stadien des jungen Korns extrem niedrig oder nicht feststellbar, und
erreicht ein Maximum, das mit einer Rotverfärbung des Pericarps zusammenfällt. In
späteren
Stufen nimmt die Aktivität
ab, während
die Kirschen weiterhin rot sind. Die Aktivitäten werden auch in unterschiedlichen
Geweben der Kaffeepflanze verglichen. Die Aktivität im Perisperm,
den Wurzeln und Blättern
ist besonders niedrig, und liegt nahe an den Nachweisgrenzen. Hohe
Aktivitäten
wurden jedoch im Endosperm festgestellt, wo die Aktivität ein Maximum
bei etwa 36 WAF erreicht, jedoch auch im keimenden Korn im Anschluss an
ein Einweichen in Wasser.
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II Isolierung von α-Galctosidase-cDNA
voller Länge
aus C. arabica
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Obwohl
verschiedene Kaffee-α-D-Galactosidase-cDNA-Sequenzen in der
Literatur zugänglich
sind, wird die Quelle des Kaffeematerials nicht angegeben. Um festzustellen,
ob zwischen C. arabica und C. canephora Aminosäure- und Nucleinsäure-Sequenzunterschiede
beobachtbar sind, wurde beschlossen, α-D-Galactosidase-cDNAs von beiden
Spezies zu klonieren.
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Eine
cDNA-Bibliothek von Coffea arabica var. Caturra T2308 wurde gemäß Rogers
et al. (Plant Physiol. Biochem., 37 (1999), 261-272) mit PolyA+
mRNA konstruiert, die 30 Wochen nach der Blüte extrahiert wurde. Diese
Plasmid-cDNA-Bibliothek (10 ng) wurde mittels PCR untersucht, wobei
man die Primer BETA1 (SEQ ID NO:2) und BETA3 (SEQ ID NO:3) verwende te,
die direkt von der Kaffee-α-D-Galactosidase-cDNA-Sequenz
abgeleitet wurden (Zhu und Goldstein, 1994). Der BETA1-Primer findet sich
zwischen den Nucleotiden 177 und 193 in der Sequenz SEQ ID NO: 1.
Der BETA3-Primer findet sich zwischen den Nucleotiden 1297 und 1313
in der Sequenz SEQ ID NO: 1. Die PCR-Reaktion wurde mit Pfu-DNA-Polymerase
(Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California
92037, USA) durchgeführt
in einem geeigneten 1 × Puffer, 0,2
mM einer jeden dNTP und 0,25 μM
von jedem Oligonucleotid. Die Denaturierungs-, Renaturierungs- und Kettenverlängerungstemperaturen
betrugen 94 °C
für 30
s, 46 °C
für 30
s bzw. 72 °C
für 3 min.
Dieser Zyklus wurde im Robocycler Statagene (USW) 30 mal wiederholt.
PCR-Produkte wurden mit einer Microcon 100 (Millipore SA, BP307
Saint Quentin Yvelines cedex 78054, Frankreich)-Patrone gereinigt
und, wie von Stratagene (USA) beschrieben wird, in den pCR-Script
SK (+) ligiert. Die Ligationsmischung wurde dann dazu verwendet, den
E.coli-Stamm XL1-Blue MRF' zu
transformieren, und ein rekombinanter Vektor, der das α-D-Galactosidase-Fragment
enthielt, wurde gereinigt und in den SfrI-Ort des pCR-Script SK
Amp (+) kloniert. Seine Sequenz ist zwischen den Positionen 177
und 1313 der Sequenz SEQ ID NO: 1 angeordnet.
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Gemäß der Literatur
enthält
das 5'-Ende der α-D-Galactosidase-cDNA
stromauf des 5'-Endes
des BETA 1-Primers 198 Phasenpaare. Um diese Sequenz aus unserem
Genotyp zu klonieren, führten
wir eine zusätzliche
PCR durch, wie sie oben beschrieben wurde, mit den Primern BETA100
(SEQ ID NO: 3) und BETA101 (SEQ ID NO: 4). Diese C. arabica-Sequenz
wurde in den pCR Script Amp SK (+)-Vektor kloniert und lieferte
pLP1 und entspricht SEQ ID NO: 1.
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Die
erhaltene cDNA enthält
ein offenes Leseraster von 1263 bp, beginnend in Position 51 und
endend in Position 1313 der Sequenz SEQ ID NO: 1. Das Translationsprodukt
entspricht Sequenz ID NO: 2, was nahelegt, dass die Kaffee-α-D-Galactosidase als ein Präproenzym
synthetisiert wird, wobei der Translations-Startcodon ATG in Position
51 anstelle von ATG in Position 126 verwendet wird. Andererseits zeigte
die Analyse der α-D-Galactosidase-cDNA,
die aus C. canephora kloniert wurde, dass ihr Tanslationsprodukt
dem Protein, das in C. arabica gefunden wird, sehr homolog (Ähnlichkeit > 99%) ist.
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III Expression
des α-D-Galactosidasegens
während
der Kornreifung
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Die
Expression des Gens, das in Kaffeebohnen von C. arabica Caturra
für die α-Galactosidase
codiert, die auf unterschiedlichen Entwicklungsstufen, d.h. 9, 12,
16, 30 und 35 Wochen nach der Blüte
(WAF), geerntet wurden, wurde überwacht.
Zu diesem Zwecke wurden 10 μg
der Gesamt-RNAs dieser Kaffeebohnen 15 min bei 65 °C in 1 × MOPS-Puffer
(20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 7) in der Gegenwart
von Formamid (50%) und Formaldehyd (0,66 M Endkonzentrat) denaturiert.
Sie wurden dann durch Elektrophorese 6 Stunden bei 2,5 V/cm in Gegenwart
von 1 × MOPS-Puffer
auf einem 1,2-Agarosegel,
das 2,2 M-Formaldehyd als Endkonzentration enthielt, aufgetrennt.
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Nach
der Wanderung wurden die RNAs mit Ethidiumbromid (BET) gemäß Sambrook
et al. angefärbt (Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
USA, 1989, Kapitel 9.31 bis 9.51). Das ermöglicht es, die auf einem Gel
abgeschiedenen Mengen anhand der Fluoreszenzintesitäten der 18S
und 255 ribosomalen RNAs zu standardisieren. Die Gesamt-RNAs wurden
dann übertragen
und gemäß den Empfehlungen
von Boehringer Mannheim (Roche-Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica,
Postfach 310120, Mannheim 31, DE) auf eine positiv geladene Nylon-Membran übertragen
und fixiert. Die Vorhybridisierung und die Hybridisierung wurden
entsprechend den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
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Ergebnisse
des Northern-Blottings zeigen ein Maximum der Genexpression während der
Frühphase der
Endospermentwicklung. Das Maximum einer spezifischen mRNA-Expression
unter Gewächshausbedingungen
erfolgte bei etwa 26 WAF und entspricht dem Beginn der Zunahme der
Enzymaktivität.
Die Maximumsperiode der mRNA-Expression entspricht der Hauptperiode
der Endosperm-Expansion, und unter diesen Bedingungen erfolgt eine
Härtung
der reifenden Körner.
Die Maximumsexpression für α-Galactosidase-spezifische
mRNA fiel entweder zusammen mit der oder erfolgte geringfügig später als
die Maximumsexpression der 11S-Körnerspeicherprotein-mRNA.
Diese Ergebnisse führten
zur Konstruktion einer Antisense-Kassette
der Kaffee-cDNA, die für
die α-Galactosidase
codierte, unter der Kontrolle des 11S-Kaffeepromotors, um den Grad der α-Galactosidaseaktivität in Kaffeebohnen
bei der Reifung zu vermindern.
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IV. Konstruktion der α-Galactosidase-Antisensekassette
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Die
11s-Promotor-Sequenz (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem.
37 (1999), 273-282) aus Kaffee wird mit den spezifischen Primern
UP210-1 entsprechend der Sequenz SEQ ID NO: 7, und BAGUS2, entsprechend
der Sequenz SEQ ID NO: 8, vervielfältigt. Das Oligonucleotid UP210-1
entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 24 und 76, veröffentlicht
von Marraccini et al., supra und enthält in seinem 5'-Ende die synthetische Sequenz CGGGGTACCCCG,
die eine KpnI-Restriktionsstelle
enthält
und der Sequenz SEQ ID NO: 9 entspricht. Der BAGUS2-Primer enthält in seinem
5'-Ende die synthetische
Sequenz CGCGGATCCGCG, die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entspricht,
die eine BamHI-Restriktionsstelle trägt. Dieser Primer enthält auch
die Nucleotide 998 bis 976 der Sequenz, die von Marraccini et al.
(1999) publiziert wurde. Diese Reaktion wird in Gegenwart von Pfu-DNA
Polymerase (3 Einheiten) durchgeführt, mit 10 ng pCSPP4 (WO 99/02688),
in einem Endvolumen von 50 μl,
das 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 01% Triton X-100,
2 mM MgCl2, 10 μg/ml BSA, 0,2 mM einer jeden
dNTP, 0,25 μM
eines jeden der obigen Oligonucleotide enthielt. Die Reaktionsmischung
wurde dann für
30 Zyklen inkubiert (94°C-60s,
55°C-60s,
72°C-3 min),
gefolgt von einem abschließenden
Verlängerungszyklus
bei 72 °C
für 7 min.
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Das
PCR-Fragment aus etwa 950 bp wurde mit einer Microcon 100-Kassette
(Millipore, Frankreich) gereinigt und in den pCR-Script Amp SK (+)-Vektor
in Gegenwart von T4 DNA-Ligase
(Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin
53711 USA) gemäß den von
dem Lieferanten gestellten Empfehlungen ligiert. Als nächstes wurde
der E. coli Stamm XL1-Blue MRF' mit
der gesamten Ligationsmischung transformiert. Es wurde ein Transformant
ausgewählt,
und sein Plasmid wurde gereinigt, um den Insert zu sequenzieren,
um die Orientierung des PCR-Fragments zu bestimmen. Die Analyse
machte es so möglich,
das Plasmid pLP7 zu selektieren.
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Eine
kürzere
Version des 11S-Promotors wurde ebenfalls gemäß dem gleichen Ansatz vervielfältigt, außer dass
der Primer UP213-1 mit der Nucleinsäure SEQ ID NO: 11 den Primer
UP210-1 ersetzte. Dieser Primer entspricht der Sequenz zwischen
den Nucleotiden 754 und 777, veröffentlicht
von Marraccini et al., supra, und enthält in seinem 5'-Ende die synthetische
Sequenz SEQ ID NO: 9. Das führte
zur Vervielfältigung
eines 250 bp-Fragments des p11S-Kaffee-Promotors, der wie oben beschrieben
kloniert wurde und das Plasmid pLP8 lieferte.
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Der
TNOS-Terminator wird vervielfältigt,
indem man dem oben für
die Vervielfältigung
des p11S-Promotors beschriebenen Protokoll folgte, außer dass
die Primer TNOS1 mit der Nucleinsäuresquenz SEQ ID NO: 12 und
TNOS2 mit der Nucleinsäuresequenz
SEQ ID NO: 13 verwendet wurden. TNOS1 enthält die Sequenz SEQ ID NO: 10
in seinem 5'-Ende.
TNOS2 enthält
die Sequenz SEQ ID NO: 9 in seiner 5'-Endsequenz. Diese Primer führten zur
Vervielfältigung
der TNOS-Sequenz aus dem kommerziellen p35SGFP-Vektor (Clontech Laboratories
Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303-4230
USA). Das PCR-Produkt wurde in den pCR-Script Amp SK (+)-Vektor, wie oben
beschrieben, kloniert, was zu dem rekombinanten Vektor führte, der
pLP32 genannt wurde, und wurde zur Bestimmung seiner Orientierung
sequenziert. Dieser Vektor wurde dann mit BamHI verdaut, um die
TNOS-Sequenz zu entfernen, die danach mit der T4-DNA-Polymerase
behandelt wurde, um glatte Enden zu erzeugen.
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Andererseits
wurden die pLP7 und pLP8-Vektoren mit EcoRI linearisiert und ebenfalls
mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Der
TNOS-Terminator wurde dann in der korrekten Orientierung in die
pLP7 und pLP8-Vektoren kloniert, was zu den Vektoren p11STNOS7 bzw.
p11STNOS7+ führte.
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Die α-Galactosidase-cDNA
wurde aus dem vorher isolierten Vektor pLP1 vervielfältigt, wobei
man die obigen Bedingungen anwandte, außer dass die Primer BETA100B1
mit der Nucleinsäuresequenz
SEQ ID NO: 14 und BETA101B1 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 15 verwendet
wurden. Diese Oligonucleotide entsprechen den vorher verwendeten
BETA101 und BETA100-Primern, bei denen eine BamHI-Restriktionsstelle,
die der Sequenz SEQ ID NO: 10 entsprach, in ihre 5'-Enden eingeführt wurde. Das PCR-Produkt
wurde in den pCR-Script
Amp SK(+)-Vektor, wie oben beschrieben, kloniert, was zu dem rekombinanten
Vektor führte,
der pLP20 genannt wurde.
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Dieses
Plasmid wurde mit BamH1 verdaut, um die α-Galactosidase-cDNA freizusetzen.
Andererseits wurden die Aufnahmevektoren p11STNOS7 und p11STNOS7+
unabhängig
voneinander mit Hilfe des gleichen Restriktionsenzyms verdaut und
durch eine CIAP-Behandlung gemäß dem Lieferanten
(Promega, USA) dephosphoryliert. Die α-Galactosidase-cDNA wurde in
der Antisense-Orientierung kloniert, und zwar in den p11STNOS7 bzw.
p11STNOS7+-Vektoren, was zu den Vektoren führte, die als pALPHA1 und pALPHA9
bezeichnet wurden.
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Um
diese Kassetten in den binären
Vektor zu mobilisieren, der während
der Transformation einer Kaffeezellsuspension verwendet wurde, wurde
eine abschließende
PCR-Reaktion mit der Pfu-DNA-Polymerase durchgeführt, wobei man die Primer UPSAL1
mit der Nucleinsäuresequenz
SEQ ID NO: 16 und UPSAL2 mit der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 17 verwendete.
Beide Oligonucleotide enthalten eine SalI-Restriktionsstelle und
erkennen DNA-Sequenzen des pCR-Script Amp SK(+)-Vektors, die die
11S-Promotoren- und die NOS-Terminator (TNOS)DNA-Abschnitte flankieren.
Außerdem
fehlt diese Restriktionsstelle bei der Sequenz, die in die T-DNA
des binären
Plasmids eingeführt
werden sollte. Diese PCR-Produkte wurden wiederum in den pCR-Script
Amp SK(+)Vektor kloniert, der mit SalI verdaut wurde, um die Bestätigung zu
erhalten, dass diese Restriktionsstelle die Kassetten flankiert.
Die erhaltenen Plasmide wurden pALP414 und pALP50 genannt und leiten
sich von pALPHA1 bzw. pALPHA9 ab.
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V. Klonieren der α-Galactosidase-Antisense-Kassette
in den binären
Transformationsvektor
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Die α-Galactosidase-Kassetten,
die in den Vektoren pALP414 und pALP50 enthalten waren, wurden sequenziert,
um eine Bestätigung
für ihre
Integrität
zu erhalten, insbesondere um zu bestätigen, dass während der
PCR-Vervielfältigungszyklen
keine Punktmutationen oder Umlagerungen aufgetreten waren. Diese
Kassetten wurden dann durch Verdauung der pALP414 und pALP50-Vektoren
mit dem SalI-Restriktionsenzym gereinigt und unabhängig in
das pBin19-Derivatplasmid kloniert, das mit dem Vektor verwandt
ist, der von Leroy et al. (Plant Cell Rep. 19 (1999), 382-389) beschrieben
wird, außer
dass das Gen crylAc fehlte. Um das zu tun, wurde der Vektor mit
dem SalI-Restriktionsenzym verdaut, das eine einzigartige Stelle
zwischen den uidA- und csr1-1-Genen erkennt, und dephosphoryliert.
Nach dieser Ligation wurden die Vektoren pBIA121, pBIA126 und pBIA9
selektiert. In dem pBIA121-Vektor ist die aus pALP414 erhaltene
SalI-Kassette in der Orientierung [LB]Gus-Intron > p11S (lange) Antisense-α-Galactosidase-cDNA > csr1-1 [RB] kloniert.
Die gleiche Kassette ist jedoch in dem pBIA126-Vektor in der umgekehrten
Orientierung kloniert. Andererseits weist die SalI-Kassette, die
aus pALP50 erhalten wurde und in dem pBIA9-Vektor kloniert wurde,
die folgende Orientierung auf: [LB]Gus-Intron > p11 (kurze) Antisense-α-Galactosidase-cDNA > csr1-1 [RB].
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VI Transformation
of Agrobacterium tumefaciens
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Die
binären
Transformationsvektoren pBIA121, pBIA126 und pBIA9, die oben beschrieben
wurden, wurden unabhängig
voneinander nach dem direkten Transformationsverfahren, das von
An et al. (Plant Mol. Biol. Manuel, Gelvin, Schilperoort und Verma
Eds, Kluwer Academic Publishers Dordrecht, Netherlands, A3 (1993,
1-19) beschrieben wurde, in den abgerüsteten Agrobacterium tumefaciens-Stamm
LBA4404 eingeführt.
Für jede
Transformation wurden die rekombinanten Agrobacterium tumefaciens-Klone
an LB-Medium, das mit Kanamycin (50 μg/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und
Rifampicin (50 μg/ml)
ergänzt
war, selektiert.
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Um
die Struktur der Plasmide zu prüfen,
die in Agrobacterium tumefaciens eingeführt wurden, wurden sie gemäß der Schnell-Minipräparationstechnik
extrahiert und dann durch Restriktionsmapping nach einer Reverse-Transformation
im E. coli-Stamm XL2Blue MRF' analysiert.
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VII Transformation von
Coffea sp.
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Blatt-Explantate
wurden jeweils fünf
Wochen für
3 bis 5 Monate kultiviert und subkultiviert, bis an der Kante der
Explantate somatische Embryos erschienen. Somatische Embryos wurden
in der Torpedeo-Stufe geerntet, mit einem sterilen Skalpell verletzt
und zwei Stunden in einer 0,09%-igen NaCl-Lösung eingeweicht, die den rekombinanten
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 bei einer OD600 nm von 0,3 bis 0,5 enthielt. Die Cokultur
wurde in der Dunkelheit auf einem halbfesten MS-Medium ohne Hormone
für drei
Tage durchgeführt,
und dann in flüssigem
MS-Medium, das Cefotaxim (1 g/l) enthielt, für 3 bis 5 Stunden bei einem
konstanten jedoch leichten Rühren
gewaschen. Embryos wurden auf einem halbfesten Medium mit 5 μM BAP, 90 μM Saccharose
in Gegenwart von Cefotaxim (400 mg/l) unter Schwachlichtbedingungen
(16 Stunden Photoperiode pro Tag) kultiviert. Nach einem Zeitraum
von 3 bis 4 Wochen wurden sie auf ein selektives MS-Medium überführt, das
mit Cefotaxim (400 mg/l) und Chlorsulfuron (80 mg/l) ergänzt war.
Sie wurden dann jeden Monat auf ein neues selektives Medium übertragen,
bis eine Regeneration von Kalli erfolgte. Transformierte Embryos, die
um die Kalli herum wuchsen, wurden dann auf dem halbfesten MS-Medium mit Morel-Vitaminen
(1 μM BAP und
30 μM Saccharose)
kultiviert, um ihre Keimung auszulösen. Nach dieser Stufe wurden
sie auf das Wurzelmedium übertragen,
das dem eben beschriebenen Medium entsprach, jedoch ohne BAP.
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Um
die Wirksamkeit der Transformation zu prüfen, wurden Kalli, Sprößlinge und
Blätter
regelmäßig auf
die Expression des uidA-Reporters mit einem GUS-histochemischen
Assay getestet (Jefferson et al., J. EMBO 6 (1987), 3901-3907).
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Nach
dieser Prozedur wurden verschiedene individuelle Pflanzen ausgewählt und
in vitro mittels Mikroschnitten vervielfältigt. Einige von ihnen wurden
in ein Gewächshaus überführt, um
ihre Entwicklung zu erreichen. Es wurden keinerlei morphologische
Anormalitäten
beobachtet.
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VIII Analyse
somatischer Embryos von transformierten Kaffeepflanzen
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Somatische
Embryos wurden auch ausgehend von Blatt-Explantaten induziert, um
die Anwesenheit von α-Galactosidase-Antisense-mRNA nachzuweisen.
11S-Kaffee-Speicherproteine wurden in somatischen Embryos nachgewiesen
(Yuffa et al., Plant Cell Rep. 13 (1994) 197-202), was darauf hindeutete,
dass der csp1-Promotor in diesem Gewebe aktiv ist. Wenn das der
Fall ist, sollte die Analyse von somatischen Embryos, die von den
Blättern
von jungen transgenen Kaffeepflanzen induziert wurden, den Nachweis
der Anwesenheit der α-Galactosidase-Antisense-mRNA
früher
als in den Bohnen gestatten.
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Gesamt-RNAs
wurden dann aus 100 mg von transformierten somatischen Embryos,
wie weiter oben beschrieben, extrahiert und durch RT-PCR getestet,
wobei man das Kit Access RT-PCR-System
(Promega, USA) verwendete. Zuerst wurde die Anwesen heit einer 11S-spezifischen
mRNA durch Durchführung
einer RT-PCR unter Verwendung der Primer bestätigt, die in der Codiersequenz
der 11S cDNA angeordnet sind. Das wurde unter Verwendung der Primer
SO11, der der Sequenz SEQ NO: 18 entspricht, und SO2-1, der der
Sequenz SEQ ID NO: 19 entspricht, durchgeführt. Der SO11-Primer entspricht
der Sequenz zwischen den Nucleotiden 1035 und 1059 der von Marraccini
et al., supra, veröffentlichten
Sequenz. Andererseits entspricht der SO2-1-Primer den letzten 24
Nucleotiden der veröffentlichten
Sequenz. Die Synthese des ersten Strangs der cDNA (Stufe der Reverse-Transkription)
wurde, wie von dem Lieferanten beschrieben, durchgeführt (45
min, 48 °C).
Die folgenden Parameter wurden für
die PCR-Reaktion verwendet: 45 Zyklen (60 s bei 94 °C für die Denaturierstufe,
90 s bei 52 °C
für die
Renaturierstufe, 4 min bei 68 °C
für die
Verlängerungsstufe),
mit einer Endverlängerung
bei 68 °C
für 7 min.
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Aus
diesem Experiment wurde ein PCR-Produkt von 1590 bp erhalten, das
der 11S cDNA-Sequenz, flankiert von den Primern SO11 und SO2-1,
entsprach. Das Ergebnis bestätigte,
dass 11S mRNA in allen untersuchten Geweben fehlte, d.h. Wurzeln,
Blättern,
Blüten,
jedoch wirksam in somatischen Embryos von Coffea canephora sowie
in Bohnen bei 27 WAF vorhanden waren.
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Zweitens
wurde die Anwesenheit von α-Galactosidase-Sense-mRNA dadurch
geprüft,
dass man eine RT-PCR-Reaktion durchführte, wobei man nur den Primer
B33 verwendete, der der Sequenz SEQ ID NO: 21 entsprach, und zwar
während
der Phase der Reverse-Transkription (Bedingung 1). Dieser Primer
entspricht der komplementären
Sequenz der Nucleotide 1286 bis 1314 der Sequenz SEQ ID NO: 1.
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Parallel
dazu wurde der Nachweis der α-Galactosidase-Antisense-mRNA durchgeführt, indem
man nur den Primer B11 während
der Phase der Reverse-Transkription verwendete (Bedingung 2). Dieser
Primer entspricht der Sequenz zwischen den Nucleotiden 50 und 78
der Sequenz SEQ ID NO:1. Nach dieser Reverse-Transkription (45 min,
48 °C) wurde
die Reak tionsmischung bei 94 °C
für eine
Minute behandelt, um die MMLV-Reverse-Transkriptase zu inaktivieren.
Das fehlende Oligonucleotid, B11 bei Bedingung 1 und B33 bei Bedingung
2, wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde mittels PCR fortgesetzt:
45 Zyklen (60 s bei 94 °C
für die
Denaturierungsstufe, 90 s bei 45 °C
für die
Renaturierungsstufe, 4 min bei 68 °C für die Verlängerungsstufe), mit einer abschließenden Verlängerung
bei 68 °C
für 7 min.
Unter Verwendung von somatischen Zellen von nicht-transformiertem
C. arabica wurde für
den Versuch gemäß Bedingung
1 ein Vervielfältigungsprodukt von
1310 bp beobachtet, jedoch nicht für das Experiment für Bedingung
2. Für
somatische Embryos, die aus einem Kaffeepflänzchen erhalten wurden, das
mit dem pBIA9-Vektor transformiert wurde, war es möglich, ein Vervielfältigungsprodukt
während
der Versuchsbedingung 2 nachzuweisen, was die Anwesenheit der α-Galactosidase-Antisense-mRNA
bestätigte. Sequenzprotokoll
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