ES2258173T3 - Planta de cafe con actividad alfa-d-galactosidasa reducida. - Google Patents
Planta de cafe con actividad alfa-d-galactosidasa reducida.Info
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Abstract
Una planta de café transgénica que contiene una célula de planta de café, que produce galactomananos, la cual célula ha sido modificada por la introducción en la célula de una construcción génica que contiene un ácido nucleico que se transcribe a un ácido ribonucleico, el cual es antisentido al ARNm, ó una parte del mismo, derivado del gen de la á-D- galactosidasa, de tal forma que el nivel endógeno de la actividad de á-galactosidasa está reducida, de forma que la ramificación de la galactosa de los galactomananos aumenta.
Description
Planta de café con actividad
\alpha-D-galactosidasa
reducida.
La presente invención se refiere a la
modificación de los galactomananos presentes en el haba de café
verde, mediante la reducción del nivel endógeno de la actividad
\alpha-D-galactosidasa, mediante
la introducción de una construcción génica en una célula de planta
de café que contiene un ácido nucleico que es transcrito en una
copia antisentido del RNAm codificado por el gen de la
\alpha-D-galactosidasa o una parte
del mismo.
En los granos de café, los polisacáridos de la
pared celular constituyen aproximadamente el 48% del peso seco del
haba de café maduro, del cual los mananos representan
aproximadamente la mitad. Estos polisacáridos son esencialmente
insolubles en la forma purificada y tienen muy poca ramificación de
la galactosa (Bradbury y Haliday, J. agric. Food Chem. 38
(1990), 389-392). Se admite que los polímeros de
manano son la razón principal de las grandes pérdidas del peso
original del café verde encontradas durante la preparación de
bebidas de café soluble. Las pérdidas tienen lugar o bien cuando el
material insoluble permanece como sedimento durante la extracción
inicial, o bien cuando precipitan y se forman geles durante el
almacenamiento de los licores de café. Los mananos han sido también
mostrados como el principal componente responsable de la turbidez y
precipitación de las bebidas de café en
reposo.
reposo.
En algunas plantas se ha descubierto que el grado
de ramificación de la galactosa sobre las cadenas de manano depende
parcialmente de la actividad de la
\alpha-D-galactosidasa (EC
3.2.1.22). Esta enzima es capaz de liberar unidades de galactosa
unida a \alpha-1,6 a partir de los galactomananos
almacenados en el tejido de almacenamiento de la semilla de la
planta o maduración (Buckeridge y Dietrich, Plant Sci. 117
(1996), 33-43). Además, también la acumulación de
galactomananos que tienen un ratio muy bajo de galactosa/manosa en
algunas plantas endospermas o tejidos de cotiledón ha demostrado
ser correlativa con un pico de actividad
\alpha-D-galactosidasa durante la
maduración de estos tejidos y con un endurecimiento y secado de los
mismos (Kontos y Spyropoulos, Plant Physiol. Biochem 34
(1996), 787-793).
La actividad
\alpha-D-galactosidasa ha sido
también asociada con la capacidad de eliminar los radicales de
galactosa que están unidos \alpha-1,6 a los
polisacáridos de galactomanano, lo cual ocasiona aproximadamente
una solubilidad disminuida de los polímeros (McCleary, Car. Res.
92 (1981), 269-285). Además, la eliminación
de las cadenas laterales de galactosa de los galactomananos parece
aumentar la capacidad de los mismos de interactuar con otros
polisacáridos, p. ej., los xantanos del guar, con una formación
concomitante del gel del complejo. La ramificación de la galactosa
sobre el manano del grano de café disminuye desde aproximadamente
un 40% en granos jóvenes hasta el bajo nivel encontrado en los
granos maduros durante la maduración. Al mismo tiempo, la actividad
de la enzima
\alpha-D-galactosidasa aumenta
durante la maduración del grano de café.
El ADNc de la
\alpha-D-galactosidasa del café ha
sido clonada (Zhu y Goldstein, Gene 140 (1994),
227-231). De acuerdo con la información derivada de
este trabajo, la
\alpha-D-galactosidasa del haba de
café maduro, se presume que está compuesta de 363 aminoácidos y se
sintetiza como una proenzima de 420 radicales. Después de la
biosíntesis, dos escisiones de proteasa eliminan a continuación una
señal de secreción (38 radicales) y otro péptido señal (19
radicales) para producir la proteína que tiene la secuencia del
aminoácido N-terminal característica de la enzima
activa.
En vista de los conocidos efectos de los
galactomananos sobre la preparación y/o almacenabilidad del café
soluble, existe la necesidad en la técnica, de mejorar esta
situación.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es el de proporcionar un método perfeccionado para la preparación
de café soluble a la vez que se obvian los inconvenientes conocidos
cuando se almacenan los licores de café.
El problema anterior ha sido solucionado
proporcionando una célula de planta de café, y una planta de café
respectivamente, en las que se ha aumentado la ramificación de la
galactosa en los galactomananos.
Este objetivo se consigue reduciendo el nivel
endógeno de la actividad
\alpha-D-galactosidasa,
introduciendo una construcción génica en una célula de planta de
café, que contiene un ácido nucleico que se transcribe en una copia
antisentido del ARNm codificado por el gen de la
\alpha-D-galactosidasa, o a una
parte del mismo.
Para este finalidad, la copia antisentido del
ARNm codificado por el gen de la
\alpha-D-galactosidasa, puede ser
cualquier ácido ribonucleico capaz de formar dímeros en condiciones
fisiológicas, a saber, para hibridar con el ARNm codificado por el
gen de la \alpha-D-galactosidasa
en las condiciones que prevalecen en la célula. Así, la copia
antisentido no necesita ser un 100% homóloga a la correspondiente
parte opuesta, sino que más bien necesita proporcionar suficiente
fuerza de unión para la formación de un dímero. En consecuencia,
las copias antisentido (y los correspondientes ácidos nucleicos a
partir de los cuales se transcriben) que se modifican por
substitución, deleción y/o inserción de nucleótidos caen bien dentro
del contexto de la presente invención. A este respecto, se
apreciará también que la copia antisentido puede representar una
contrapartida completa para el ARNm codificado por el gen de la
\alpha-D-galactosidasa, es decir,
puede proporcionar una molécula de ARN que tiene esencialmente la
misma longitud que el ARNm que codifica el polipéptido de la
\alpha-D-galactosidasa. Por otro
lado, la copia antisentido puede cubrir solamente una parte del ARNm
que codifica el polipéptido de la
\alpha-D-galactosidasa.
El ácido nucleico que codifica un ácido
ribonucleico, antisentido al ARNm codificado por el gen de la
\alpha-D-galactosidasa, o a una
parte del mismo, puede estar bajo el control de un promotor
constitutivo o de un promotor inducible, de manera que el nivel del
ARN antisentido puede controlarse convenientemente. Sin embargo, en
todos los casos el nivel de la copia antisentido debe ser lo
suficientemente alto de manera que se reduzca el número de copias
ARNm que codifican el polipéptido de la
\alpha-D-galactosidasa accesible
para los ribosomas.
De acuerdo con una versión preferida, el promotor
utilizado es el promotor csp1 de café, el cual da una
velocidad de transcripción suficientemente alta.
La presente invención por lo tanto, proporciona
para una planta de café transgénica, respectivamente, en donde el
nivel de actividad
\alpha-D-galactosidasa ha sido
reducido de tal manera que eventualmente la ramificación de la
galactosa en el galactomanano, aumenta. La planta es una planta
transgénica, las células de la cual hospedan una construcción
génica capaz de proporcionar una copia antisentido del ARNm derivado
del gen de la
\alpha-D-galactosidasa o una parte
del mismo.
La presente invención proporciona también un
método para la preparación de café soluble, el cual comprende el
paso del empleo de las habas de café derivadas de una planta de café
transgénica que tiene una actividad
\alpha-D-galactosidasa reducida. A
este respecto, la presente invención proporciona también un método
para aumentar la solubilidad del café aumentando la ramificación de
la galactosa.
Esta invención reivindica el aumento de la
solubilidad de los galactomananos del café mediante el aumento de
ramificación de la galactosa. La estrategia adoptada es la de
reducir el nivel endógeno de la actividad de
\alpha-D-galactosidasa,
introduciendo una copia antisentido de su ADNc bajo el control del
promotor csp1 de café.
Este promotor csp1 ha sido ya bien
caracterizado (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem.
37 (1999), 273-282) y controla la expresión
de un gen que codifica la proteína 11S de almacenamiento del café.
Se construyó un cassette que contiene dicho promotor, y se
introdujo en la región T-ADN de un vector binario de
transformación, el cual es un derivado del plásmido pTiT37 (Bevan,
Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). Este
vector recombinante se introdujo en el Agrobacterium
tumefaciens, el cual se empleó para transformar los explantes
de café. Las plantas de café que hospedan el T-ADN
insertado en su genoma fueron regeneradas y analizadas para
determinar la actividad
\alpha-D-galactosidasa en sus
granos.
Se cosecharon los frutos en diferentes estados de
maduración (la edad se expresa en semanas después de la floración:
WAF) de Coffea arabica variedad Caturra T2308
cultivada en invernadero (temperatura de aproximadamente 25ºC, 70%
de humedad y luz natural). Las cerezas se congelaron en nitrógeno
líquido después de ser cosechadas, y se almacenaron a -85ºC hasta
que se utilizaron. Para los estudios de maduración, se separaron
los tejidos del endosperma y perisperma.
El material vegetal se molió en nitrógeno líquido
y se extrajo en tampón de extracción de enzima enfriado con hielo
(glicerina 10% v/v, metabisulfito de sodio 10 mM, EDTA 5 mM, MOPS
(NaOH) 40 mM, pH 6,5) a un ratio aproximado de 20 mg por 100
\mul. La mezcla se agitó en hielo durante 20 minutos, se sometió a
centrifugación (12.000 g x 30 minutos), se dividió en alícuotas y
se almacenó a -85ºC hasta su utilización. La actividad
\alpha-D-galactosidasa se detectó
espectrofotométricamente con el substrato
p-nitrofenil-\alpha-D-galactopiranosido
(pNGP).
La mezcla de reacción contenía 200 \mul de pNGP
100 mM en tampón de McIlvain (ácido cítrico 100 mM -
Na_{2}HPO_{4} 200 mM, pH 6,5) hasta el volumen final de 1 ml
con extracto de enzima. La reacción se mantuvo a 26ºC, empezó con
la adición de enzima y se interrumpió mediante la adición de 4
volúmenes de solución de interrupción
(Na_{2}CO_{3}-NaHCO_{3} 100 mM pH 10,2). La
absorción se lee a 405 nm. La evolución de nitrofenilo se calcula
empleando el coeficiente de extinción molar \varepsilon = 18300
(específico para pH 10,2) y convertido a mmoles minuto^{-1} mg de
proteína^{-1}. La proteína total se midió en muestras extraídas
en tampones acuosos por el método de Bradford (Anal. Biochem.,
72 (1976), 248-254). Para la expresión de la
actividad, cada muestra se extrajo y se dividió en alícuotas, y los
ensayos se efectuaron por triplicado, expresándose los resultados
como valores promedio.
La actividad
\alpha-D-galactosidasa es
extremadamente baja o es indetectable en las etapas de grano joven,
y alcanza un pico que coincide con un enrojecimiento del color del
pericarpio. En etapas posteriores, la actividad declina mientras
que las cerezas son todavía rojas. Las actividades se comparan
también en diferentes tejidos de la planta de café. La actividad en
el perispermo, raíces y hojas es particularmente baja y próxima a
los límites de detección. Sin embargo, se registran altas
actividades en el endosperma donde la actividad alcanza un pico a
aproximadamente 36 WAF pero también en el grano de germinación
después de que el agua ha sido embebida.
Aunque en la literatura se dispone de varias
secuencias de ADNc de la
\alpha-D-galactosidasa del café,
el origen del material de café no está indicado. Con el fin de ver
si se observan diferencias en la secuencia de aminoácidos y la
secuencia nucleica entre la C. arabica y la C.
canephora, se decidió clonar el ADNc de la
\alpha-D-galactosidasa de ambas
especies.
Se construyó una biblioteca de ADNc a partir de
la Coffea arabica var. Caturra T2308, con poliA+ ARNm
extraído a las 30 semanas después de la floración, de acuerdo con
Rogers et al. (Plant Physiol. Biochem., 37 (1999),
261-272). Esta biblioteca de ADNc de plásmido (10
ng) fue analizada mediante PCR empleando los cebadores BETA 1 (SEQ
ID NO:2) y BETA 3 (SEQ ID NO:3) deducidos directamente a partir de
la secuencia de ADNc de la
\alpha-D-galactosidasa del café
(Zhu y Goldstein, 1994). El cebador BETA 1 está situado entre los
nucleótidos 177 y 193 en la secuencia SEQ ID NO:1. El cebador BETA
3 está situado entre los nucleótidos 1297 y 1313 en la secuencia
SEQ ID NO:1. La reacción de la PCR se efectuó con Pfu ADN
polimerasa (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla,
California 92037, USA) en tampón 1 X apropiado, 0,2 mM de cada dNTP
y 0,25 \muM de cada oligonucleótido. Las temperaturas de
desnaturalización, reasociación y extensión son: 94ºC durante 30
segundos, 46ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos
respectivamente. Este ciclo se repitió 30 veces en el Robocycler
Stratagene (USA). Los productos de la PCR se purificaron con un
cartucho Microcon 100 (Millipore SA, BP307 Saint Quentin Yvelines
cedes 78054, Francia), y se unieron al pCR-Script SK
(+) como se describe por Stratagene (USA). A continuación, se
empleó la mezcla de ligación para transformar la cepa E. coli
XL1-azul MRF' y un vector recombinante conteniendo
el fragmento de
\alpha-D-galactosidasa se purificó
y se clonó en el sitio SfrI del pCR-Script
SK Amp (+). Su secuencia está situada entre las posiciones 177 y
1313 de la secuencia SEQ ID NO:1.
De acuerdo con la literatura, el extremo 5' del
ADNc de la \alpha-D-galactosidasa
contiene 198 bp corriente arriba del extremo 5' del cebador BETA 1.
Con el fin de clonar esta secuencia a partir de nuestro genotipo,
efectuamos una PCR adicional, como se ha descrito anteriormente, con
los cebadores BETA 100 (SEQ ID NO: 3) y BETA 101 (SEQ ID NO: 4).
Esta secuencia de C. arabica se clonó en el vector pCR Script
Amp SK (+) para dar el pLP1, y corresponde a SEQ ID NO:1.
El ADNc obtenido contiene un marco abierto de
lectura de 1263 bp, que empieza en la posición 51 y termina en la
posición 1313 de la secuencia SEQ ID NO:1. El producto de la
traducción corresponde a la SEQ ID NO: 2, sugiriendo que la
\alpha-D-galactosidasa de café se
sintetiza como una preproenzima, empleando el codón de partida de
traducción ATG en la posición 51, en lugar del codón ATG en la
posición 126. Por otra parte, el análisis del ADNc de la
\alpha-D-galactosidasa clonado, a
partir de C. canephora, mostró que su producto de traducción
es muy homólogo (similaridad > 99%) a la proteína encontrada en
C. arabica.
Se monitorizó la expresión del gen que codifica
la \alpha-galactosidasa en las habas de café de
C. arabica Caturra, cosechada en varias etapas de
desarrollo, a saber, 9, 12, 16, 30 y 35 semanas después de la
floración (WAF). Para efectuarlo, se desnaturalizaron 10 \mug del
ARN total de estas habas de café durante 15 minutos a 65ºC en
tampón 1 x MOPS (20 mM de MOPS, 5 mM de acetato de sodio, 1 mM de
EDTA, pH 7) en presencia de formamida (50%) y formaldehido (0,66 M,
de concentración final). A continuación, se separaron por
electroforesis durante 6 horas a 2,5 V/cm, en presencia de tampón 1
x MOPS, en un gel de agarosa al 1,2% conteniendo 2,2 M de
formaldehido como concentración final.
Después de la migración, los ARN se colorearon
con bromuro de etidio (BET) de acuerdo con Sambrook et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual ("Clonación Molecular, Un
Manual de Laboratorio") Cold Spring Harbor Laboratory Press,
USA, 1989, capítulo 9.31 a 9.51). Esto hace posible la
estandarización de las cantidades depositadas sobre un gel a partir
de las intensidades de fluorescencia de los ARN 18S y 25S
ribosómicos. Los ARN totales se transfirieron a continuación y se
fijaron en una membrana de nylon cargada positivamente, de acuerdo
con las instrucciones proporcionadas por Boehringer Mannheim
(Roche-Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica,
Postfach 310120, Mannheim 31, DE). La prehibridación y la
hibridación se efectuaron de acuerdo con las condiciones descritas
más arriba.
Los resultados del Northern Blot indicaron un
pico de la expresión génica durante la fase temprana del desarrollo
del endosperma. El pico de la expresión del ARNm específico en las
condiciones del invernadero tuvo lugar a aproximadamente 26 WAF, y
corresponde al principio del aumento de la actividad de la enzima.
El período del pico de la expresión del ARNm corresponde al período
principal de la expansión del endosperma, teniendo lugar el
endurecimiento en los granos de maduración bajo estas condiciones.
La expresión del pico para el ARNm específico de la
\alpha-galactosidasa, o bien coincidió o tuvo
lugar ligeramente más tarde, que la expresión del pico del ARNm de
la proteína de almacenamiento del grano 11S. Estos resultados
condujeron a la construcción de un casette antisentido del ADNc del
café, que codifica la \alpha-galactosidasa, bajo
el control del promotor del café 11S, con el fin de reducir el nivel
de la actividad \alpha-galactosidasa en los
granos de café en maduración.
Se amplificó la secuencia del promotor 11S
(Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem 37 (1999),
273-282) de café, con el cebador específico
UP210-1, correspondiente a las secuencias SEQ ID NO:
7, y BAGUS 2, correspondientes a la secuencia SEQ ID NO: 8. El
oligonucleótido UP210-1 corresponde a la secuencia
entre los nucleótidos 24 y 76 publicada por Marraccini et
al., supra, y contiene dentro de su extremo 5' la
secuencia sintética CGGGGTACCCCG conteniendo un sitio de
restricción KpnI y que corresponde a la secuencia SEQ ID NO:
9. El cebador BAGUS 2 contiene en su extremo 5' la secuencia
sintética CGCGGATCCGCG que corresponde a la secuencia SEQ ID NO:
10, que lleva un sitio de restricción BamHI. Este cebador
contiene también los nucleótidos 998 a 976 de la secuencia
publicada por Marraccini et al., (1999). Esta reacción se
efectúa en presencia de Pfu ADN polimerasa (3 unidades) con
10 ng de pCSPP4 (patente WO 99/02688), en un volumen final de 50
\mul conteniendo 10 mM de KCl, 6 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% de Triton X-100, 2 mM de MgCl_{2}, 10 \mug/ml de BSA, 0,2 mM de cada dNTP, 0,25 \muM de cada uno de los oligonucleótidos descritos más arriba. La mezcla de reacción se incubó a continuación durante 30 ciclos (94ºC-60 segundos, 55ºC-60 segundos, 72ºC-3 minutos) seguido de un ciclo final de extensión a 72ºC durante 7 minutos.
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% de Triton X-100, 2 mM de MgCl_{2}, 10 \mug/ml de BSA, 0,2 mM de cada dNTP, 0,25 \muM de cada uno de los oligonucleótidos descritos más arriba. La mezcla de reacción se incubó a continuación durante 30 ciclos (94ºC-60 segundos, 55ºC-60 segundos, 72ºC-3 minutos) seguido de un ciclo final de extensión a 72ºC durante 7 minutos.
El fragmento de la PCR de aproximadamente 950 bp
se purificó con un cartucho Microcon 100 (Millipore, Francia), y se
unió al vector pCR-Script Amp (+) en presencia de T4
ADN ligasa (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison,
Wisconsin 53711 USA), de acuerdo con las instrucciones facilitadas
por el suministrador. A continuación, la cepa E. coli
XLI-azul MRF' se transformó con la mezcla de
ligación entera. Se seleccionó un transformante y su plásmido se
purificó para secuenciar el inserto con el fin de determinar la
orientación del fragmento de PCR. Este análisis hizo así posible,
la selección del plásmido pLP7.
Una versión más corta del promotor 11S se
amplificó también mediante el mismo método excepto que el cebador
UP213-1 que tenía la secuencia nucleica SEQ ID NO:
11 substituye el cebador UP210-1. El cebador
corresponde a la secuencia entre los nucleótidos 754 y 777
publicada por Marraccini et al., supra, y contiene en
su extremo 5' la secuencia sintética SEQ ID NO: 9. Esto conduce a la
amplificación de un fragmento de 250 bp del promotor de café p11S,
el cual se clonó como se ha descrito anteriormente para dar el
plásmido pLP8.
El terminador TNOS se amplificó siguiendo el
protocolo descrito para la amplificación del promotor p11S a
excepción de que se emplearon los cebadores: TNOS 1, que tiene la
secuencia nucleica SEQ ID NO: 12 y TNOS 2, que tiene la secuencia
nucleica SEQ ID NO: 13. El TNOS 1 contiene la secuencia SEQ ID NO:
10 en su extremo 5'. El TNOS 2 contiene la secuencia SEQ ID NO: 9
en su extremo 5'. Estos cebadores conducen a la amplificación de la
secuencia TNOS a partir del vector comercial p35SGFP (Clontech
Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California
94303-4230 USA). El producto de la PCR se clonó en
el vector pCR-Script Amp SK (+) como se ha descrito
anteriormente, conduciendo al vector recombinante llamado pLP32 y se
secuenció para determinar su orientación. Este vector fue digerido
a continuación mediante BamHI para eliminar la secuencia
TNOS, y se trató después con T4 ADN polimerasa para proporcionar
extremos romos.
Por otro lado, los vectores pLP7 y pLP8 se
linealizaron mediante EcoRI y se trataron también con T4 ADN
polimerasa para proporcionar extremos romos. El terminador TNOS se
clonó a continuación en la orientación correcta en los vectores
pLP7 y pLP8, lo cual condujo a los vectores p11STNOS7 y p11STNOS7+
respectivamente.
El ADNc de la
\alpha-galactosidasa se amplificó a partir del
vector pLP1 previamente aislado, empleando las condiciones
descritas más arriba a excepción de que se emplearon los cebadores
BETA 100B1 con la secuencia nucleica SEQ ID NO: 14 y BETA 101B1 con
la secuencia nucleica SEQ ID NO: 15. Estos oligonucleótidos
corresponden a los cebadores BETA 101 y BETA 100 empleados
anteriormente, en los cuales un sitio de restricción BamHI
correspondiente a la secuencia SEQ ID NO: 10 ha sido introducido en
sus extremos 5'. El producto de la PCR se clonó en el vector
pCR-Script Amp SK (+) como se ha descrito
anteriormente, lo cual condujo al vector recombinante llamado
pLP20.
Este plásmido se digirió con BamHI para
liberar el cADN de la \alpha-galactosidasa. Por
otro lado, los vectores receptores p11STNOS7 y p11STNOS7+ fueron
digeridos independientemente por medio de la misma enzima de
restricción y desfosforilados mediante un tratamiento con CIAP de
acuerdo con el proveedor (Promega, USA). El cADN de la
\alpha-galactosidasa se clonó en la orientación
antisentido, respectivamente en los vectores p11STNOS7 y
p11STNOS7+, lo cual condujo a los vectores designados como pALPHA1 y
pALPHA9.
Para movilizar estas cassettes en el vector
binario empleado durante la transformación de la suspensión de
células de café, se efectuó una reacción PCR final con la Pfu
ADN polimerasa, empleando los cebadores: UPSAL1, que tiene la
secuencia nucleica SEQ ID NO: 16, y el UPSAL2, que tiene la
secuencia nucleica SEQ ID NO: 17. Ambos nucleótidos contienen un
sitio de restricción SalI y reconocen las secuencias de ADN
del vector pCR Script Amp SK (+) que flanquea el promotor 11S y las
regiones de ADN del terminador NOS (TNOS). Además, este sitio de
restricción está ausente de la secuencia que se intentó introducir
en el T-ADN del plásmido binario. Estos productos
de la PCR se clonaron de nuevo en el vector
pCR-Script Amp SK (+) el cual se digirió con
SalI para verificar que este sitio de restricción flanquea
las cassettes. Los plásmidos obtenidos fueron llamados pALP414 y
pALP50, y eran derivados respectivamente de pALPHA1 y pALPHA9.
Se secuenciaron las cassettes de la
\alpha-galactosidasa contenidas en los vectores
pALP414 y pALP50, para verificar su integridad, particularmente
para confirmar que ninguna mutación o reordenamiento puntuales
habían ocurrido durante los ciclos de la ampliación mediante PCR.
Estas cassettes fueron purificadas a continuación mediante
digestión de los vectores pALP414 y pALP50 con la enzima de
restricción SalI y fueron clonadas independientemente en el
plásmido derivado pBin19, que guarda similitud con el vector
descrito por Leroy et al. (Plant Cell Rep. 19 (1999),
382-389), excepto que el gen cry1Ac está
ausente. Con el fin de hacer esto, el vector se digirió con la
enzima de digestión SalI, la cual reconoce un único sitio
entre los genes uidA y csrl-1, y se desfosforiló.
Después de esta unión, se seleccionaron los vectores pBIA121,
pBIA126 y pBIA9. En el vector pBIA121, la cassette SalI
obtenida a partir del pALP414 se clona en la orientación [LB]
intrón Gus > p11S (largo) cADN antisentido de la
\alpha-galactosidasa > csrl-1 [RB]. Sin
embargo, la misma cassette se clonó en la orientación inversa en el
vector pBIA126. Por otro lado, la cassette SalI obtenida a
partir del pALP50 clonado en el vector pBIA9 está en la siguiente
orientación: [LB] intrón Gus > p11S (corto) cADN antisentido de
la \alpha-galactosidasa > csrl-1
[RB].
Los vectores binarios de transformación pBIA121,
pBIA126 y pBIA9 descritos más arriba se introdujeron
independientemente en el desguarnecido Agrobacterium tumefaciens
cepa LBA4404 de acuerdo con el método de transformación directa
descrito por An et al. (Plant Mol. Biol. Manuel, Gelvin,
Schilperoort y Verma Eds. Kluwer Academic Publishers Dordrecht,
Holanda, A3 (1993), 1-19). Para cada
transformación, los clones recombinantes de Agrobacterium
tumefaciens fueron seleccionados en medio LB suplementado con
canamicina (50 \mug/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y
rifampicina (50 \mug/ml).
Con el fin de comprobar la estructura de los
plásmidos introducidos en el Agrobacterium
tumefaciens, se extrajeron los mismos mediante la técnica de
la minipreparación rápida y a continuación fueron analizados
mediante un mapeado de restricción después de la transformación
inversa en E. coli cepa XL2 Azul MRF'.
Se prepararon cultivos de hojas de explantes, y
se subcultivaron cada cinco semanas durante 3 a 5 meses hasta que
aparecieron embriones somáticos en el borde o en los explantes. Los
embriones somáticos se cosecharon en el estadio torpedo, se
practicó un corte con un escalpelo estéril y se sumergieron durante
dos horas en una solución 0,9% de NaCl conteniendo
Agrobacterium tumefaciens recombinante cepa LBA4404 a
una OD_{600nm} de 0,3 a 0,5. El cocultivo se efectuó en la
oscuridad en un medio MS semisólido sin hormonas durante tres días
y a continuación se lavaron en medio MS líquido conteniendo
cefotaxima (1 gr/litro) durante 3 a 5 horas con constante pero
suave agitación. Los embriones se cultivaron en medio semisólido con
5 \muM de BAP, 90 \muM de sucrosa en presencia de cefotaxima
(400 mg/litro) en condiciones de poca luz (16 horas de fotoperíodo
por día). Después de un período de 3 a 4 semanas, fueron
transferidos a un medio MS selectivo suplementado con cefotaxima
(400 mg/litro) y chlorsulfurón (80 mg/litro). A continuación fueron
transferidos cada mes a un nuevo medio selectivo hasta la
regeneración de los callos. Los embriones transformados creciendo
alrededor de los callos, fueron cultivados a continuación en el
medio MS semisólido con vitaminas Morel (1 \muM de BAP y 30
\muM de sucrosa), para inducir su germinación. Después de este
paso, fueron transferidos en el medio de enraizamiento
correspondiente al medio descrito anteriormente pero sin BAP.
Para comprobar la efectividad de la
transformación, los callos, yemas, raíces y hojas fueron
regularmente comprobados para determinar la expresión del reporter
uidA mediante un ensayo histoquímico GUS (Jefferson et
al., J. EMBO 6 (1987), 3901 - 3907.
Después de este procedimiento, se seleccionaron
varias plantas individuales y se propagaron in vitro mediante
micro-cortes. Algunos de ellos se transfirieron al
invernadero para conseguir su desarrollo. No se observó ninguna
anomalía morfológica.
Embriones somáticos fueron también inducidos a
partir de explantes de hojas para detectar la presencia de ARNm
anti-sentido de
\alpha-galactosidasa. Proteínas de almacenamiento
de café 11S fueron detectadas en embriones somáticos (Yuffa
et al., Plant Cell Rep. 13 (1994)
197-202) sugiriendo que el promotor csp1 es
activo en este tejido. Si este es el caso, análisis de embriones
somáticos inducidos de hojas de plantas transgénicas de café,
deberían permitir la detección de la presencia de ARNm antisentido
de la \alpha-galactosidasa, más pronto que en las
habas.
A continuación, se extrajo el total de los ARN a
partir de 100 mg de embriones somáticos transformados como se ha
descrito anteriormente y se comprobaron mediante
RT-PCR empleando el kit sistema Access
RT-PCR (Promega, USA). En primer lugar, la
presencia de ARNm específico 11S se confirmó efectuando una
RT-PCR empleando los cebadores situados en la
secuencia codificadora ADNc de la 11S. Esto se realizó empleando los
cebadores SO11 correspondientes a la secuencia SEQ ID NO:18 y
SO2-1 correspondiente a la secuencia SEQ ID NO: 19.
El cebador SO11 corresponde a la secuencia entre los nucleótidos
1035 y 1059 de la secuencia publicada por Marraccini et al.,
supra. Por otro lado, el cebador SO2-1
corresponde a los últimos 24 nucleótidos de la secuencia publicada.
La síntesis de la primera cadena del ADNc (paso de transcripción
inversa) fue efectuada como describe el proveedor (45 minutos,
48ºC). Se emplearon los siguientes parámetros para la reacción de la
PCR: 45 ciclos (60 segundos a 94ºC para el paso de
desnaturalización, 90 segundos a 52ºC durante el paso de
reasociación, 4 minutos a 68ºC para el paso de estiramiento) con
una extensión final a 68ºC durante 7 minutos.
A partir de este experimento se obtuvo un
producto de la PCR de 1590 bp correspondientes a la secuencia de
ADNc de la 11S, flanqueada por los cebadores SO11 y
SO2-1. El resultado confirmó que el ARNm de la 11S
estaba ausente en todo el tejido analizado, a saber, raíces, hojas
y flores, pero estaba efectivamente presente en embriones somáticos
de Coffea canephora, así como en las habas, a 27
WAF.
En segundo lugar, se comprobó la presencia del
ARNm sentido de la \alpha-galactosidasa,
efectuando una reacción de RT-PCR empleando sólo el
cebador B33, correspondiente a la secuencia SEQ ID NO:21 durante la
fase de transcripción inversa (condición 1). Este cebador
corresponde a la secuencia complementaria de los nucleótidos 1286 a
1314 de la secuencia SEQ ID NO:1.
En paralelo, la detección del mARN antisentido de
la \alpha-galactosidasa se efectuó empleando
solamente el cebador B11 durante la fase de la transcripción
inversa (condición 2). Este cebador corresponde a la secuencia
entre los nucleótidos 50 y 78 de la secuencia SEQ ID NO:1. Después
de la transcripción inversa (45 minutos, 48ºC) la mezcla de
reacción se trató a 94ºC durante 1 minuto para inactivar la
transcriptasa inversa de MMLV. El oligonucleótido ausente, B11 en
la condición 1, y B33 en la condición 2, se añadió y la reacción
continuó mediante una PCR: 45 ciclos (60 segundos a 94ºC para el
paso de desnaturalización, 90 segundos a 45ºC para el paso de
reasociación, 4 minutos a 68ºC para el paso de elongación) con una
extensión final a 68ºC durante 7 minutos. Empleando células
somáticas a partir de C. arabica no transformada, se observó
un producto de amplificación de 1310 bp para el experimento de la
condición 1, pero no para la condición 2. Sin embargo, para
embriones somáticos obtenidos de una plantita de café transformada
mediante el vector pBIA9, fue posible detectar un producto de
amplificación durante la condición experimental 2, confirmando la
presencia del ARNm antisentido de la
\alpha-galactosidasa.
SEQ ID NO. 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 3: (BETA 1)
\vskip1.000000\baselineskip
ATGGTGAAGTCTCCAGG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 4: (BETA 3)
\vskip1.000000\baselineskip
TCACTGTGGGGTTAGGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 5: (BETA 100)
\vskip1.000000\baselineskip
TGCTCCACAAAGCAGTGGCAATT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 6: (BETA 101)
\vskip1.000000\baselineskip
ATTTATTGACTTAATCTCTTCAA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO.7: 210-1
\vskip1.000000\baselineskip
CGGGGTACCCCGCCTCTTTTCTTTTGGAGTACAAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 8: BAGUS 2
\vskip1.000000\baselineskip
CGCGGATCCGCGTCTCTGACAACAGAGGAGAGTGT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 9: KpnI
\vskip1.000000\baselineskip
CGGGGTACCCCG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 10: BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
CGCGGATCCGCG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 11: UP213-1
\vskip1.000000\baselineskip
CGGGGTACCCCGACAAAAGATTGAACAATACATGTC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 12: TNOS 1
\vskip1.000000\baselineskip
CGCGGATCCGCGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 13: TNOS 2
\vskip1.000000\baselineskip
CGGGGTACCCCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 14: BETA 100B1
\vskip1.000000\baselineskip
CGCGGATCCGCGTGCTCCACAAAGCAGTGGCAATT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 15: BETA 101B1
\vskip1.000000\baselineskip
CGCGGATCCGCGATTTATTGACTTAATCTCTTCAA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 16: UPSAL1
\vskip1.000000\baselineskip
CACGCGTCGACGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 17: UPSAL2
\vskip1.000000\baselineskip
GGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 18: SO11
\vskip1.000000\baselineskip
TTCTTTTGTTCCTCGGCTGTTTG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 19: SO2-1
\vskip1.000000\baselineskip
CCAAACATCAAACTTCTCGCAATC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 20: (BETA 11)
\vskip1.000000\baselineskip
ATGGCCGCTGCTTATTACTACCTTTTT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO. 21: (BETA 33)
\vskip1.000000\baselineskip
TCACTGTGGGGTTAGGACATACATTTT
<110> Societé des Produits Nestlé S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Planta de café con actividad reducida
de \alpha-D-galactosidasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 80331WO
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 01124160
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-10-10
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PantentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtgaagt ctccagg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 3
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactgtggg gttagga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 100
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctccacaa agcagtggca att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 101
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttattgac ttaatctctt caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 210-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggggtaccc cgcctctttt cttttggagt acaag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BAGUS 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cgtctctgac aacagaggag agtgt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> KpnI
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggggtaccc cg
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BamHI
\vskip0.400000\baselineskip
<400>10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cg
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador UP213-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggggtaccc cgacaaaaga ttgaacaata catgtc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TNOS 1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cggagctcga atttccccga tcgtt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TNOS 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggggtaccc cggaattccc gatctagtaa catag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 100B1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cgtgctccac aaagcagtgg caatt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BETA 101B1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cgatttattg acttaatctc ttcaa
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador UPSAL 1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipgggccccccc tcgaggtcga cgg
\hfill23
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\hfill23
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\hfill24
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\hskip-.1em\dddseqskipatggccgctg cttattacta ccttttt
\hfill27
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\hskip-.1em\dddseqskiptcactgtggg gttaggacat acatttt
\hfill27
Claims (6)
1. Una planta de café transgénica que contiene
una célula de planta de café, que produce galactomananos, la cual
célula ha sido modificada por la introducción en la célula de una
construcción génica que contiene un ácido nucleico que se
transcribe a un ácido ribonucleico, el cual es antisentido al ARNm,
ó una parte del mismo, derivado del gen de la
\alpha-D-galactosidasa, de tal
forma que el nivel endógeno de la actividad de
\alpha-galactosidasa está reducida, de forma que
la ramificación de la galactosa de los galactomananos aumenta.
2. La planta de café de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que se transcribe a
ácido ribonucleico, el cual es antisentido al ARNm o una parte del
mismo, derivado del gen de la
\alpha-D-galactosidasa, está bajo
el control de un promotor constitutivo o inducible.
3. La planta de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde el promotor es el promotor csp1 del café.
4. Un método para la preparación de café soluble,
el cual comprende el paso del empleo de habas de café derivadas de
una planta de café de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
5. Un método para incrementar la solubilidad del
café, el cual comprende el paso del empleo de habas de café
derivadas de una planta de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
6. Empleo de habas derivadas de una planta de
café, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes para la preparación de café soluble.
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