JP2005343882A

JP2005343882A - ヒアルロン酸産生促進剤、アクアポリン合成促進剤、及び皮膚外用剤組成物

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Publication number: JP2005343882A
Application number: JP2004197413A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Yoshida; 浩之吉田; Momoko Furukawa; 桃子古川; Shintaro Inoue; 紳太郎井上; Ryoichi Komaki; 亮一駒木; Miho Okui; 美保奥井; Kohei Yamazaki; 恒平山崎; Yoshinobu Sugiyama; 義宣杉山
Original assignee: Kanebo Cosmetics Inc
Current assignee: Kanebo Cosmetics Inc
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2005-12-15

Abstract

【課題】細胞によるヒアルロン酸産生能を促進させることにより、皮膚の老化防止あるいはヒアルロン酸の異常分解を伴う疾病の治療に使用でき、しかも人体に対する影響の少ない、安全なヒアルロン酸産生促進剤を提供する。また細胞自身が元来持っているヒアルロン酸合成能を高めることにより皮膚機能を根本的に改善でき、更にアクアポリン合成を促進することにより、皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善することのできる皮膚外用剤組成物を提供する。
【解決手段】アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤及びアクアポリン合成促進剤、並びにアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は培養細胞又は生体中のヒアルロン酸産生を促進するヒアルロン酸産生促進剤に関し、また化粧料、医薬品等に配合し、皮膚のヒアルロン酸産生能を高めることのできるヒアルロン酸産生促進剤に関する。また本発明は、皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚に対する優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止等が期待されるアクアポリン合成促進剤に関し、そして更に本発明は、当該ヒアルロン酸産生促進作用及びアクアポリン合成促進作用を有する物質と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを含有することにより、皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善することのできる皮膚外用剤組成物に関する。

ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害などの外力への抵抗、及び、細菌感染の防止など多くの機能を有している（非特許文献１参照）。

一方、老化により表皮細胞間のヒアルロン酸染色強度が低下し（非特許文献２参照）、また紫外線照射による光弾力線維症（ｓｏｌａｒｅｌａｓｔｏｓｉｓ）部のヒアルロン酸はほとんど検出されない（非特許文献３〜４参照）ことが報告されており、その結果として皮膚の乾燥、ハリ、弾力性の低下、ひいては皺の増加を引き起こすと考えられている。このような状態を改善すべく、ヒアルロン酸を配合した化粧料を塗布することにより皮膚表面の保湿性を保つ方法がとられてきたが、高分子であるヒアルロン酸は皮膚を透過しないことから根本的改善は期待できない。したがって細胞自身が元来もっているヒアルロン酸合成能を高めることにより皮膚機能を根本的に改善する物質の開発が期待されている。

また、関節液中のヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬへと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（非特許文献５参照）。

また、化膿性関節炎や痛風性関節炎などでも慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献６参照）。

上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の性状改善をするために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチ患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと、上記の改善が認められている（非特許文献７参照）。

同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性関節症においても、ヒアルロン酸の関節注入療法により上記の改善効果が報告されている（非特許文献８参照）。

しかし、上記疾患の治療は長期にわたり、しかも医師の処方を必要とする。したがって、日常の生活の中で手軽に治療できるヒアルロン酸産生促進剤を含有する軟膏あるいはゲルが望まれていた。

また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒアルロン酸が著しく増加することが知られており（非特許文献９参照）、熱傷の初期の治療薬としても、ヒアルロン酸産生促進剤が期待されている。

ヒト細胞のヒアルロン酸を産生促進する薬剤としてはインシュリン様成長因子−１や上皮成長因子（非特許文献１０参照）及びインターロイキン−１（非特許文献１１参照）などのサイトカイン、あるいはフォルボールエステル（非特許文献１２参照）などが知られているが、いずれも化粧品、入浴剤や医薬品として安心して使用できるものではない。

また最近の研究により、ヒアルロン酸を高めることが皮膚に対して優れた効果を示すことに加え、皮膚細胞に存在するアクアポリン（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ：以下、ＡＱＰと略記する）が重要な皮膚生理機能を担うことが明らかとなった。

ＡＱＰは、水チャンネルとも呼ばれ、水を選択的に透過させる膜たんぱく質として知られている。これまでにヒトでは１１種類のＡＱＰ遺伝子（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１０）が発見され、このうちＡＱＰ３、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９は水だけでなくグリセロールや尿素などの非イオン性小分子も透過させる。また、ヒト組織でのＡＱＰ発現分布をみると、ほとんどの臓器に複数のＡＱＰが存在していることが明らかとなっている。

表皮でのＡＱＰの発現については、本発明者らの最近の研究により、培養ヒトケラチノサイト及びモデル皮膚表皮でのＡＱＰ３、ＡＱＰ５、ＡＱＰ９遺伝子の発現が報告されている。このうち培養ヒトケラチノサイトでのＡＱＰ３の発現は高浸透圧ストレスにより増加することから、ＡＱＰ３はケラチノサイトの水環境を制御する一つの重要な因子と考えられる（非特許文献１３参照）。またＡＱＰ３遺伝子欠損マウスの皮膚では、角層水分量、皮膚粘弾性、バリアー機能回復の低下が認められ、ＡＱＰ３が皮膚物性及び皮膚生理機能に深く関与していることが示された（非特許文献１４参照）。したがって、アクアポリンの産生促進は、皮膚の乾燥を抑え、はりを整え、バリアー機能を強化すると期待できる。しかしながら、アクアポリン合成促進作用を十分に有し、安全性が高く、皮膚などへの適用性の良好なアクアポリン合成促進剤は知られていない。
「ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ」、１９９１年、第８巻、ｐ．３４６「Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ」、１９９４年、第１０２巻、ｐ．３８５「臨皮（５増）」、１９９７年、第５１巻、ｐ．５３「ＮａｇｏｙａＭｅｄ．Ｊ．」、１９９７年、第４１巻、ｐ．２７「ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ」、１９６７年、第１０巻、ｐ．３５７「結合組織」、１９８４年、金原出版、ｐ．４８１「炎症」、１９９１年、第１１巻、ｐ．１６「結合組織と疾患」、１９８０年、講談社、ｐ．２４６「結合組織と疾患」、１９８０年、講談社、ｐ．１５３「ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ」、１９８９年、第１０１４巻、ｐ．３０５「日本産科婦人科学会雑誌」、１９８９年、第４１巻、ｐ．１９４３「ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ」、１９８３年、第１４８巻、ｐ．３７７「ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ」、２００１年、第１５２２巻、ｐ．８２−８８「ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ」、２００２年、第２９巻、ｐ．１４３

したがって本発明の目的とするところは、細胞によるヒアルロン酸産生能を促進させることにより、皮膚の老化防止あるいはヒアルロン酸の異常分解を伴う疾病の治療に使用でき、しかも人体に対する影響の少ない、安全なヒアルロン酸産生促進剤を提供するにある。

また本発明の目的とするところは、皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚に対する優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止の用途に使用することができるアクアポリン合成促進剤を提供するにある。

また本発明は、細胞自身が元来持っているヒアルロン酸合成能を高めることにより皮膚機能を根本的に改善でき、そして更に皮膚細胞のアクアポリン合成を促進することにより、皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善することのできる皮膚外用剤組成物を提供することを目的とする。

上述の目的は、アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤及びアクアポリン合成促進剤によって達成され、更にアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物が、皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善する効果に優れることを見出した。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤［アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油］をヒト皮膚線維芽細胞の培養系に添加すると、濃度依存的にヒアルロン酸産生が促進される（後記試験例−１参照）。したがって、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、線維芽細胞に作用し、病的あるいは生理的に低下した、皮膚などの結合組織のヒアルロン酸産生を促進することができる。またアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物は、極めて低濃度でアクアポリン合成促進効果を示す（後記試験例−２参照）。また当該ヒアルロン酸産生促進剤と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを組み合わせて配合することにより、ヒアルロン酸の産生量が増加し、更にアクアポリン合成も促進されることにより、優れた皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善する効果を得ることができる。

以下、本発明の構成について詳説する。

本発明に用いられるアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）は、北半球に分布を持つ植物で、秋に紫色の花をつける。この植物から得られる抽出物又は精油は、花全体又は雌芯頭から得られるものでもよい。抽出物は溶媒抽出法、又は液化炭酸ガス、液化ブタンガスなどの液化ガス抽出法あるいは超臨界ガス抽出法などにより得ることができる。その際の溶剤としては、水又はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール類、アセトンなどのケトン類、酢酸エチルなどのエステル類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ヘキサン、ペンタン及びベンゼンなどの芳香族化合物類の、一種単独又は二種以上の混合物から選択することができる。また精油は上記方法又は水蒸気蒸留などにより得ることができる。

また本発明に用いられるアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油は、抽出溶媒溶液のまま、又は水蒸気蒸留物のままでも良く、あるいは、常法により濃縮、乾固、ろ過、再抽出等を行っても良い。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、それ自身で、培養細胞又は生体細胞に適用して、ヒアルロン酸産生を促進することができるが、化粧料、医薬の組成物等の皮膚外用剤組成物に配合して用いても良い。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤、アクアポリン合成促進剤、及びそれを含有する皮膚外用剤組成物の形態は、液剤、固形剤あるいは半固形剤のいずれでもよく、好ましくは軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダー、トワレ、発布剤、香水及び入浴剤等が挙げられ、また適用する皮膚としては頭皮を含む人体上の皮膚全てに利用が期待できる。

また本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びアクアポリン合成促進剤は、Ｎ−アセチルグルコサミンと組み合わせて配合することにより、ヒアルロン酸の産生量が増加し、更にアクアポリン合成も促進されることにより、優れた皮膚のハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を予防又は改善することのできる皮膚外用剤組成物が得られる。

本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミンは、合成物や発酵産物、カニ、えびなどのキチン分解から得られる分解産物等、いずれのものに限定されるものではない。

尚、本発明のヒアルロン酸産生促進剤、アクアポリン合成促進剤及び皮膚外用剤組成物には上記の他に、タール系色素、酸化鉄等の着色顔料、パラベン、フェノキシエタノール等の防腐剤、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状シリコン等のシリコン油、パラフィン、ワセリン等の炭化水素類、オリーブスクワラン、米スクワラン、米胚芽油、ホホバ油、ヒマシ油、紅花油、オリーブ油、マカデミアナッツ油、ヒマワリ油等の植物油、ミツロウ、モクロウ、カルナバロウ等のロウ類、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸セチル、イソステアリン酸イソステアリル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油、エタノール等の低級アルコール類、セタノール、ベヘニルアルコール、ステアリルアルコール、長鎖分岐脂肪族アルコール等の高級アルコール類、コレステロール、フィトステロール、分岐脂肪酸コレステロールエステル、マカデミアナッツ脂肪酸フィトステリルエステル等のステロール類及び誘導体、硬化油等の加工油類、ステアリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、イソ型長鎖脂肪酸、アンテイソ型長鎖脂肪酸等の高級脂肪酸、リモネン、水素添加ビサボロール等のテルペン類、トリカプリル・カプリン酸グリセリル、２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリイソ型長鎖脂肪酸グリセリル、トリパルミチン酸グリセリル等のトリグリセリド、セチル硫酸ナトリウム、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸塩等の陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン多価アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、多価アルコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、変性シリコン、蔗糖エステル等の非イオン性界面活性剤、テトラアルキルアンモニウム塩等の陽イオン性界面活性剤、ベタイン型、スルホベタイン型、スルホアミノ酸型等の両性界面活性剤、レシチン、リゾフォスファチジルコリン、セラミド、セレブロシド等の天然系界面活性剤、酸化チタン、酸化亜鉛等の顔料、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウム、塩化カルシウム等の無機塩類、クエン酸ナトリウム、酢酸カリウム、琥珀酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ジクロロ酢酸、メバロン酸、グリチルリチン酸等の有機酸及びその塩、塩酸エタノールアミン、硝酸アンモニウム、塩酸アルギニン、ジイソプロピルアミン塩、尿素、デカルボキシカルノシン等の有機アミン類及びその塩、エデト酸等のキレート剤、キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ペクチン、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、寒天等の増粘剤、水酸化カリウム、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン等の中和剤、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルフォン酸塩等の紫外線吸収剤、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マルビトール、ジグリセリン、ラフィノース等の多価アルコール、各種アミノ酸、アスコルビン酸、ビオチン、トコフェロール等のビタミン類及びアスコルビン酸硫酸エステル塩、アスコルビン酸燐酸エステル塩、ニコチン酸トコフェロール等のビタミン誘導体等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。

また更には、レチノイド等の表皮ヒアルロン酸産生促進剤、ジイソプロピルアミンジクロロ酢酸、ナイアシン、メバロン酸、温泉水、メタケイ酸ナトリウム、等の角化促進剤、β−ヒドロキシ−γ−アミノ酪酸、メバロン酸等のバリアー増強剤、ヒアルロン酸、グルコサミン、グルクロン酸、グリセロール、尿素、多価アルコール等の保湿剤等を適宜配合することにより荒れ肌、皺予防効果をいっそう高めることができる。

本発明に用いられるアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油のヒアルロン酸産生促進剤、アクアポリン合成促進剤及び皮膚外用剤組成物中における含有量は、その形態により異なり、一概には規定できないが、適用組成物全体を１００％（Ｗ／Ｗ）として、乾燥固形分換算で０．０００００１〜０．０１％（Ｗ／Ｗ）が好ましく、更に好ましくは０．００００１〜０．００１％（Ｗ／Ｗ）である。含有量が０．０００００１〜０．０１％（Ｗ／Ｗ）の範囲内であると、ヒアルロン酸産生効果及びアクアポリン合成促進効果が十分に得られ、しかも使用時の感触が良好で、また個々の剤型を安定に保つことができる。すなわち含有量が０．０００００１％未満では、効果が十分に発揮されない場合があり、０．０１％を超えて配合しても含有量に見合った効果が得られない場合がある。但し、入浴剤のように使用時に希釈されるものの場合は、更に含有量を増やすことができる。

また、培養細胞にヒアルロン酸又はアクアポリンを産生させる時は、アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油の場合、細胞の培養液中に、乾燥固形分換算で０．０００１％（Ｗ／Ｗ）以上含有させるのが好ましく、更に好ましくは、０．００１％〜０．１％である。

本発明に用いられるＮ−アセチルグルコサミンの皮膚外用剤組成物中における含有量は、皮膚外用剤組成物総量を基準として、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｗ）とするのが好ましく、特に好ましくは０．０１〜５％（Ｗ／Ｗ）である。

実施例に先立って、本発明の効果を示す試験例を記載する。尚、各試験に用いる試薬の調製法及び測定法は次の通りである。

・培養表皮細胞
ヒト正常表皮角化細胞は市販品（Ｅｐｉｄｅｒｃｅｌｌ／新生児***：クラボウ社製）を用いた。

・表皮細胞培養用培地
ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ（和光純薬社より購入）をベースとし、ハイドロコーチゾン（０．５μｍｏｌ／Ｌ）、エタノールアミン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ホスホエタノールアミン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍＬ）、及びＥＧＦ（上皮細胞成長因子：１０ｎｇ／ｍＬ）を加えたＫ−ＧＭ培地を調製した。培養には、これにＢＰＥ（牛脳下垂体抽出液、クラボウ社より購入）を培地１ｍＬ当たり４μＬ添加し、表皮細胞培養用培地とした。

・プロナーゼ溶液
２００μｇ／ｍＬプロナーゼ（カルビオケム−ベーリング・コーポレイション社製、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０２％アジ化ナトリウム含有０．５ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）。

（試験例−１）ヒアルロン酸産生促進作用
１．試験化合物：サフラン抽出物［Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓから得られたサフランパウダーを９９％エタノールに浸漬後、不溶物をろ過し、その後エタノールを除去したもの（収率１８．９％）］、及びＮ−アセチルグルコサミン

２．試験方法：
・細胞培養
正常ヒト表皮細胞の細胞数を表皮細胞培養用培地にて２．０×１０^４個／ｍＬに調整し、２４穴プレート（ファルコン社製）に１．０ｍＬずつ播種した。培養は、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下３７℃で行い、培養４日目に試料を添加した。さらに３日間培養後、培養上清を回収し上清中のヒアルロン酸量を求めた。

・ヒアルロン酸産生量の測定
培養上清０．６３ｍＬにプロナーゼ溶液０．０７ｍＬを加え、３７℃で１８時間静置した後、１００℃で１０分間加熱処理し、プロナーゼを失活させた。次に、反応液０．０１ｍＬからヒアルロン酸プレート「中外」（中外診断科学社製）を用い、添付説明書に従いヒアルロン酸量を測定した。尚、試料添加は各群ｎ＝３で試験を行い、結果はそれぞれの平均値を用いた。

３．試験結果：種々濃度のサフラン抽出物を添加したときの培養上清中のヒアルロン酸産生量を測定した（表１）。
その結果、サフラン抽出物を添加することにより、用量依存的に表皮細胞のヒアルロン酸産生量が上昇することが分かった。
またサフラン抽出物とＮ−アセチルグルコサミンとを同時添加することにより、更にヒアルロン酸産生量が上昇することが分かった。（表２）

（試験例−２）アクアポリン合成促進作用
１．試験化合物：サフラン抽出物［Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓから得られたサフランパウダーを９９％エタノールに浸漬後、不溶物をろ過し、その後エタノールを除去したもの（収率１８．９％）］

２．試験方法：
・試料添加と表皮細胞抽出液の調製
ヒト正常表皮角化細胞の細胞数を表皮細胞培養用培地にて１．０×１０^５個／ｍＬに調整し、６０ｍｍシャーレ（ファルコン社製）に３．０ｍＬずつ播種した。培養は、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下３７℃で行い、培養５日目に試料を添加し、更に１日間培養した。培養後、培地を除きＰＢＳで洗浄、再びＰＢＳを加えセルスクレーパー［住友ベークライト社製］で細胞を１．５ｍＬチューブに回収し遠心によりＰＢＳを除く。次に沈殿物に５００μＬの抽出バッファー［ＰＢＳにコンプリートミニプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を加えて調製］を添加し超音波処理装置［ＨａｎｄｙＳｏｎｉｃＵＲ−２０Ｐ（ＴＯＭＹＳＥＩＫＯ社製）］で細胞を破砕、その後遠心により粗膜画分は更に溶出バッファー［抽出バッファーに終濃度０．１％になるようにＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を調製］に再懸濁し、これを細胞抽出液とした。

・ウェスタンブロッティング
（１）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
細胞抽出液８μＬ、４倍濃縮ＳＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）４μＬ、１０倍濃縮ＳａｍｐｌｅＲｅｄｕｃｉｎｇＡｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）１．６μＬ、水２．４μＬを混合し、７０℃、１０分加熱後、電気泳動に供した。電気泳動は４−１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ（インビトロジェン社製）を用い、ＮｕＰＡＧＥＧｅｌｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）の添付説明書にしたがった。

（２）タンパク質のＰＶＤＦ膜への転写
転写は、ＸｃｅｌｌＩＩＢｌｏｔＭｏｄｕｌｅ（インビトロジェン社製）を使用し、添付説明書にしたがった。ＰＶＤＦ膜はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（ミリポア社製）を使用した。

（３）免疫学的検出
転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング試薬（５％濃度にスキムミルクを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳに溶解した試薬）に室温で３０分浸した後、ブロッキング試薬で３０００倍に希釈したヒトアクアポリン−３抗体と４℃で２４ｈｒ反応させた。尚、ヒトアクアポリン−３抗体は、ヒトアクアポリン−３アミノ酸配列のＣ末端側ペプチドを合成し、これを免疫したウサギの血清より作製し、希釈倍率は適切な検出シグナルを得るために事前に設定した。次に、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で振盪洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで２０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）と室温で４５分反応させた。最後に、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で振盪洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い添付説明書にしたがいシグナルを検出した。結果を図１に示す。尚、Ｔｗｅｅｎ−２０は、ＵｎｉｑｅｍａＡｍｅｒｉｃａｓ社の商品名である。

３．試験結果
試料無添加群（比較実験例１）と比べ、サフラン抽出物０．００１％添加群（実験例１）、０．００３％添加群（実験例２）、０．０１％添加群（実験例３）では顕著な検出シグナル強度の増加が認められた。これより明らかなように、本発明に係るサフラン抽出物は極めて低濃度でアクアポリン合成促進効果を有することが認められた。

以下に本発明の実施例を挙げる。尚、表中の値は質量％を示す。また実施例中で用いたサフラン抽出物は、上記試験例で用いたものと同一のものである。

実施例１〜４（クリーム）
下記に示す組成でクリームを調製した。

調製法：成分（Ａ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合液Ｉ）。
これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合液ＩＩ）。
つぎに、混合液Ｉに、徐々に混合液ＩＩを加えて、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。

実施例５〜８（ローション）
下記に示す組成でローションを調製した。

調製法：各成分を混合溶解して、ローションを調製した。

実施例９〜１０（入浴剤）

調製法：各成分を混合し、入浴剤を調製した。尚、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。

実施例１１〜１４（軟膏）

調製法：上記（Ｂ）の各成分を湯浴で８０℃に加温しながら混合し，これを、８０℃に加温した上記（Ａ）の各成分の混合物中に攪拌しながら徐々に加えた。
次に、ホモジナイザー（ＴｏｋｕｓｙｕｋｉｋａＫｏｇｙｏｕ社製）で２．５分間激しく攪拌（２５００ｒｐｍ）して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却して軟膏を得た。

実施例１８〜２１（ゲル）

調製法：（Ａ）を一部の水（Ｄ）で膨潤させ、残りの水（Ｄ）で成分（Ｃ）を溶解させた後、両者を均一に混合した（混合液Ｉ）。
成分（Ｂ）を均一に混合解させた（混合液ＩＩ）。
混合液Ｉに混合液ＩＩを加えて分散し、ゲルを得た。

実施例１９〜２２（ヘアトニック）

調製法：香料可溶化剤で香料を溶解した後、常温で攪拌しながらエタノールに加えて溶解し、成分（Ｂ）を順次加えて溶解した（混合液Ｉ）。
成分（Ｃ）を溶解させ，攪拌しながら混合液Ｉに加えて均−にした後、ろ過してヘアトニックを得た。

ヒト正常表皮角化細胞におけるサフラン抽出物のアクアポリン合成促進効果を示す図である。

Claims

アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油を含有することを特徴とするアクアポリン合成促進剤。
アヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物又は精油と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。