JP2004501642A

JP2004501642A - 改変された糖タンパク質を生成するための方法

Info

Publication number: JP2004501642A
Application number: JP2002506194A
Authority: JP
Inventors: ガーングロス，　ティルマン　ユー．
Original assignee: グライコフィ，　インコーポレイテッド
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2004-01-22
Also published as: US20060177898A1; DE60114830D1; US20060078963A1; US20120322100A1; US20130295604A1; WO2002000879A3; DK1522590T3; JP2011167194A; CA2412701A1; EP1522590B1; ATE440959T1; EP1297172B1; DK1297172T3; US8211691B2; EP2339013B1; US20020137134A1; KR20030031503A; AU7684201A; EP2119793A1; US7981660B2

Abstract

ヒトにおける糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応を細胞に実行させる遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する細胞株が開発された。これらの操作された宿主において発現される組換えタンパク質は、ヒトの対応物に実質的に同一でない場合、より類似した糖タンパク質を得た。単細胞および多細胞の真菌を含む、Ｎ−グリカン含有の高マンノースを通常生成する下等真核生物は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＡｃ_２のようなＮ−グリカンまたはヒトグリコシル化経路に沿った他の構造を生成するために改変される。これは、以下の操作および／または選択の組み合わせを使用して達成される：真菌糖タンパク質の所望でない複合体構造の特徴を生成する特定の酵素を発現しない系統、活性が所望される場合に真菌中に存在する条件下で最適な活性を有するかまたは最適な活性が達成される場合に細胞小器官を標的化するかであるように選択される外因性酵素を発現する系統。

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
米国仮出願第６０／２１４，３５８号（２０００年６月２８日出願）、同第６０／２１５，６３８号（２０００年６月３０日出願）、および同第６０／２７９，９９７号（２００１年３月３０日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、真菌または他の真核微生物を遺伝的に改変し、動物細胞（特に、ヒト細胞）により産生される糖タンパク質と同様のグリコシル化パターンを有する、ヒトまたは動物の治療剤として有用なグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を産生させる方法および組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
（グリコシル化経路）
デノボ合成されたタンパク質は、翻訳後修飾として公知の、細胞中でさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖残基が酵素的に付加され得る。このプロセスはグリコシル化として公知である。共有結合したオリゴ糖側鎖を有する得られるタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として公知である。細菌は、代表的に、タンパク質をグルコシル化せず；グリコシル化が生じる場合、それは、通常、タンパク質の非特異的な部位で生じる（ＭｏｅｎｓおよびＶａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７　１６８（３）：１６９−１７５）。
【０００４】
真核生物は、一般的に、タンパク質のアスパラギン残基（特に、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示す）に存在するアスパラギン）の側鎖に特定のオリゴ糖を結合する。糖部分（Ｎ−グリカンとして公知である）の結合後、インビボでさらなる修飾がなされ得る。代表的に、これらの修飾は、カスケードとして公知の、酵素反応の順序付けられた系列を通じて生じる。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）および異なるグリコシル基質を提供し、その結果、糖側鎖の最終的な組成は、宿主に依存して顕著に変化し得る。
【０００５】
例えば、糸状真菌および酵母（下等真核生物）のような微生物は、代表的に、付加的なマンノースおよび／またはマンノシルリン酸糖を付加する。得られるグリカンは、「高マンノース」型またはマンナンとして公知である。対照的に、動物細胞では、新生のオリゴ糖側鎖が切り詰められて、いくつかのマンノース残基を除去し、そして下等真核生物のＮ−グリカンにおいて代表的には生じないさらなる糖残基により伸長され得る。例えば、Ｒ．Ｋ．Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３０、１９３−２００；Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９８、２０、１１７１−１１７７；Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１７、１１１６−１１２１；Ｍ．Ｍａｌｉｓｓａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０００、２６７、１６９−１７３；Ｊａｒｖｉｓら、１９９８、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ　ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５２８−５３３；およびＭ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７、９、Ｓ２９−Ｓ３５、を参照のこと。
【０００６】
ヒトおよび動物において産生されるＮ−グリカンは、一般的に、複合Ｎ−グリカンと呼ばれる。複合Ｎ−グリカンは、代表的に、内部コア構造Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２に連結されたシアリルラクトサミン配列を有する２〜６つの外側分枝を有する構造を意味する。複合Ｎ−グリカンは、以下のようなオリゴ糖が終端とＧｌｃＮＡｃ残基とガラクトース（Ｇａｌ）残基とが交互に並ぶ少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の分枝を有する：例えば、ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２−３／６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−；ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−（ムチンのみ）；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−（血液型Ｈ群）。硫酸エステルは、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃ残基上に生じ得、そしてリン酸エステルは、マンノース残基上に生じ得る。ＮｅｕＡｃ（Ｎｅｕ：ノイラミン酸；Ａｃ：アセチル）は、Ｏ−アセチル化され得るか、またはＮｅｕＧｌ（Ｎ−グルコシルノイラミン酸）により置換され得る。複合Ｎ−グリカンはまた、ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（Ｆｕｃ）を二等分する鎖内置換を有し得る。
【０００７】
ヒトのグリコシル化は、小胞体（ＥＲ）において連続する一式の反応により開始し、コアオリゴ糖構造を生じ、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ中のアスパラギン残基でデノボ合成されたタンパク質上に移される（図１Ａを参照のこと）。グルコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらなるプロセシングがＥＲにおいて生じ、その後、未完成の糖タンパク質が初期ゴルジ装置に移され、そこで、さらなるマンノース残基が、ゴルジ特異的１，２−マンノシダーゼにより除去される。プロセシングは、タンパク質がゴルジを通って出て行くまで続く。中間ゴルジにおいて、多くの修飾酵素（Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ　Ｉ、ＧｎＴ　ＩＩ、ＧｎＴ　ＩＩＩ、ＧｎＴ　ＩＶ、ＧｎＴ　Ｖ、ＧｎＴ　ＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランスフェラーゼを含む）が、特定の糖残基を付加および除去する（図１Ｂを参照のこと）。最終的にトランスゴルジにおいて、Ｎ−グリカンは、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）による作用を受け、完成した糖タンパク質は、ゴルジ装置から放出される。動物糖タンパク質のタンパク質Ｎ−グリカンは、二触角、三触角、または四触角構造を有し、そして代表的にガラクトース、フコース、およびＮ−アセチルグルコサミンを含み得る。一般的に、Ｎ−グリカンの末端残基は、シアル酸からなる。ヒトＮ−グリカンの代表的な構造を、図１Ｂに示す。
【０００８】
（糖ヌクレオチド前駆体）
動物糖タンパク質のＮ−グリカンは、代表的に、ガラクトース、フコース、および末端シアル酸を含む。これらの糖は、一般的に、酵母および糸状真菌において産生される糖タンパク質には見出されない。ヒトにおいては、ヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−フコースなど）の全範囲が、一般的に、サイトゾルにおいて合成され、そしてゴルジに輸送され、そこで、これらはグリコシルトランスフェラーゼによりコアオリゴ糖に取り付けられる（ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ、１９８１　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９１（２）：Ａ４０６−Ａ４０６；ＳｏｍｍｅｒｓおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ　１９８２　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１８）：８１１−８１７；ＰｅｒｅｚおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ　１９８７　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ　１３８：７０９−７１５）。
【０００９】
グリコシル転移反応は、代表的に、副産物（ヌクレオシド二リン酸または一リン酸）を生成する。一リン酸は、交互輸送機構によりヌクレオシド三リン酸糖と交換に直接的に搬出され得、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、排出される前にヌクレオシド一リン酸および無機リン酸塩を生じるように、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）により切断される必要がある。この反応は、効果的なグリコシル化のために重要である：例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＤＰａｓｅは、マンノシル化に必須であることが見出された。しかし、ＧＤＰａｓｅは、ＵＤＰに対して９０％減少した活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら、１９９４　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１）：２０７−２１１α）。下等真核生物は、代表的に、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を欠く。なぜならそれらは、ゴルジに基づく糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を使用しないからである。（ＵＤＰ−ガラクトースから）細胞壁多糖にガラクトース残基を付加することが見出された酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅは、特異的なＵＤＰａｓｅ活性を有することが見出されており、このことは、このような酵素についての必要条件を示唆する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅら、１９９４）。ＵＤＰは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであることが公知であり、そしてこのグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔におけるグリコシルトランスフェラーゼの阻害を防止するために重要であることが示唆される（Ｋｈａｔａｒａら、１９７４）。Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ、Ｐ．ら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４）：１４５６４−１４５６７；Ｂｅａｕｄｅｔ、Ｌ．ら、１９９８　Ａｂｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ、ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ．２９２：３９７−４１３を参照のこと。
【００１０】
（グリコシル化酵素の区画化）
グリコシルトランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ＥＲおよびゴルジ装置の内部（内腔）表面に並び、それによって、ＥＲおよびゴルジ網を通して進行するにつれて糖タンパク質の連続的なプロセシングを可能にする触媒表面を提供する。シス、中間部、トランスゴルジの複数の区画ならびにトランスゴルジ網（ＴＧＮ）は、種々の場を提供し、その場において、順序付けられた系列のグリコシル化反応が起こり得る。糖タンパク質は、ＥＲにおける合成から後期ゴルジまたはＴＧＮにおける完全な成熟化に進行するにつれて、種々のグリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼに順次曝され、それによって特異的なＮ−グリカン構造が合成され得る。この酵素は、代表的に、触媒ドメイン、幹領域、膜貫通領域、およびＮ末端の細胞質テールを含む。後者の３つの構造的要素は、グリコシル化酵素を適切な位置に向かわせる役割を担う。
【００１１】
ある生物由来の局在系列は、他の生物において機能し得る。例えば、ラット由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（α−２，６−ＳＴ）（ラットトランスゴルジに局在することが公知の酵素）の膜貫通領域は、酵母ゴルジにおいてレポーター遺伝子（インベルターゼ）もまた局在することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、１９９５）。しかし、全長のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの一部とまさに同一の膜貫通領域が、ＥＲにおいて保持され、そして酵母のゴルジにさらに輸送されなかった（Ｋｒｅｚｄｏｒｎら、１９９４）。ヒト由来の全長ＧａｌＴは、明らかに高い転写レベルにも関わらず、酵母において合成すらされなかった。他方、インベルターゼレポーターに融合された同一のヒトＧａｌＴの膜貫通領域は、低い産生レベルにも関わらず、酵母ゴルジへの局在化を指示し得た。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよびその共同研究者は、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（Ｍｎｔｌ）の２８アミノ酸、Ｎ末端細胞質テールを含む領域、膜貫通領域、および幹領域の８アミノ酸の、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインへの融合が、活性なＧａｌＴのゴルジ局在化のために十分であることを示した（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−５４８９）。他のガラクトシルトランスフェラーゼは、特定のオルガネラに位置する酵素との相互作用に依存するようである。なぜなら、それらの膜貫通領域の除去後、それらは、なお適切に局在し得るからである。
【００１２】
グリコシル化酵素の不適切な局在化は、その経路におけるその酵素の適切な機能作用を妨げ得る。例えば、多くのα−１，２−マンノシダーゼを有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＥａｄｅｓおよびＨｉｎｔｚ、２０００　Ｇｅｎｅ　２５５（１）：２５−３４）は、ＧｎＴＩ活性の高い全体的なレベルにも関わらず、ウサギＧｎＴＩ遺伝子を用いて形質転換された場合、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２にＧｌｃＮＡｃを付加しない（Ｋａｌｓｎｅｒら、１９９５）。ＧｎＴＩが、活発には発現されないが、不正確に局在化されて、その結果、この酵素は、両方の基質：糖タンパク質の未完成のＮ−グリカンおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、と接触しないものであり得る。あるいは、この宿主生物が、ゴルジにおいて十分なレベルのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供しないものであり得る。
【００１３】
（治療的に使用される糖タンパク質）
ヒトまたは他の動物から単離されるタンパク質の有意な画分がグリコシル化される。治療的に使用されるタンパク質の中で、約７０％がグリコシル化される。しかし、治療タンパク質が微生物宿主（例えば、酵母）で生成され、そして内因性経路を用いてグリコシル化される場合、代表的には、その治療効率が大きく減少する。このような糖タンパク質は、代表的には、ヒトにおいて免疫原性であり、そして投与後にインビボで減少した半減期を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ、１９９７）。
【００１４】
ヒトおよび動物における特異的レセプターは、末端マンノース残基を認識し得、そして血流からのタンパク質の迅速なクリアランスを促進し得る。さらなる副作用としては、タンパク質のフォールディング、可溶性、プロテアーゼに対する感受性、輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、区画化、分泌、他のタンパク質または因子による認識、抗原性、またはアレルゲン性における変化が挙げられ得る。従って、動物宿主系において治療糖タンパク質を生成して、糖グリコシル化のパターンが、ヒトまたは意図されたレシピエント種におけるパターンと同一であるか、または少なくとも類似するようにすることが必要である。ほとんどの場合、哺乳動物宿主系（例えば、哺乳動物細胞培養物）が使用される。
【００１５】
（治療糖タンパク質を生成するためのシステム）
適切な糖形態を有し、そして満足な治療効果を有する治療タンパク質を生成するために、動物または植物に基づく発現系が使用されている。利用可能なシステムとしては、以下が挙げられる：
１．チャイニースハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞およびマウス骨肉腫細胞（Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９８　Ａｕｇ；４８（８）：８７０−８８０）；
２．トランスジェニック動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、マウスなど（Ｄｅｎｔｅ　Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．１９８９　Ｒｅｓ．３００：８５−９８、Ｒｕｔｈｅｒら、１９８８　Ｃｅｌｌ　５３（６）：８４７−８５６；Ｗａｒｅ、Ｊ．ら、１９９３　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　６９（６）：１１９４−１１９４；Ｃｏｌｅ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９４　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５−２６５）；
３．植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ、タバコなど）（Ｓｔａｕｂら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１８（３）：３３３−３３８）（ＭｃＧａｒｖｅｙ、Ｐ．Ｂ．ら、１９９５　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３（１３）：１４８４−１４８７；Ｂａｒｄｏｒ、Ｍ．ら、１９９９　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　４（９）：３７６−３８０）；
４．昆虫細胞（組換えバキュロウイルス（例えば、鱗翅類細胞に感染するＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多発性核多角体病ウイルス）と組み合わせたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉなど）（Ａｌｔｍａｎｓら、１９９９　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６（２）：１０９−１２３）。
【００１６】
上記宿主系において発現された組換えヒトタンパク質は、なお、非ヒト糖形態を含み得る（Ｒａｊｕら、２０００　Ａｎｎａｌｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８３（２）：１２３−１３２）。特に、Ｎ−グリカンの画分は、ヒト糖タンパク質において代表的に見出される末端シアル酸を欠き得る。実質的な試みは、構成がヒト形態に対してできるだけ近いように、または他の治療的利点を有するように糖タンパク質を得るプロセスを開発することに関する。特定の糖形態を有する糖タンパク質が、例えば、治療タンパク質の標的化において特に有用であり得る。例えば、グリカン側鎖への１つ以上のシアル酸残基の付加は、投与後のインビボでの治療糖タンパク質の寿命を増大させ得る。従って、哺乳動物宿主細胞は、細胞において発現される糖タンパク質における末端シアル酸の程度を増大するように遺伝的に操作され得る。あるいは、シアル酸が、シアル酸トランスフェラーゼおよび適切な基質を用いて、投与前にインビトロで目的のタンパク質に結合体化され得る。さらに、増殖培地組成の変更およびヒトグリコシル化に関与する酵素の発現が、ヒト形態により密に似る糖タンパク質を生成するために用いられてきた（Ｓ．Ｗｅｉｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１７、１１１６−１１２１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｎｏｅら、１９９８　Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４８（８）：８７０−８８０；Ｗｅｉｋｅｒｔ、Ｐａｒａｃら、１９９９：ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＧｏｏｃｈｅｅ　１９９４　Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５４６−５４９；ＹａｎｇおよびＢｕｔｌｅｒ　２０００　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６８（４）：３７０−３８０）。あるいは、培養ヒト細胞が使用され得る。
【００１７】
しかし、既存のシステムの全てが、顕著な欠点を有する。特定の治療タンパク質のみが動物または植物系における発現のために適切である（例えば、任意の細胞傷害性効果または増殖に対して有害な他の効果のないもの）。動物および植物細胞培養系は、通常、非常に遅く、しばしば、目的のタンパク質の任意の有用な量を生成するために、注意深く制御された条件下で１週間にわたる増殖を必要とする。それにもかかわらず、タンパク質収量は、微生物発酵プロセス由来の収量と不利に比較される。さらに、細胞培養系は、代表的には、複雑でかつ高価な栄養素および補因子（例えば、ウシ胎仔血清）を必要とする。さらに、増殖は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）によって制限され得る。
【００１８】
さらに、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）はウイルス感染または汚染に非常に感受性である。いくつかの場合、ウイルスまたは他の感染因子は、培養物の増殖を補償し得るが、他の場合では、因子は、治療タンパク質産物をその意図された用途に値しないものとするヒト病原体であり得る。さらに、多くの細胞培養プロセスは、複雑で温度感受性の動物由来の増殖培地成分の使用を必要とし、これらは、病原体（例えば、ウシの海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオン）を保持し得る。このような病原体は、検出するのが困難であり、かつ／または増殖培地を補償することなく除去または滅菌することが困難である。任意の場合において、治療タンパク質を生成するための動物細胞の使用は、産物が安全であることを保証するために高価な質の制御を必要とする。
【００１９】
トランスジェニック動物はまた、高い容量の治療タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、組織プラスミノゲン活性化因子、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、コラーゲン、フィブリノーゲンなど）を製造するために使用され得る。トランスジェニックヤギおよび他のトランスジェニック動物（マウス、ヒツジ、雌牛など）は乳汁において高濃度で治療タンパク質を生成するために遺伝的に操作され得るが、このプロセスは、バッチ毎に厳密な質の制御を受けなければならないので高価である。動物は、種々の動物またはヒト病原体（細菌、ウイルス、真菌、およびプリオンを含む）を寄生させ得る。スクラピーおよびウシの海綿状脳症の場合、試験は、感染を除外するために約１年を費やし得る。従って、治療化合物の生成は、好ましくは、十分に制御された滅菌環境（例えば、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎｇ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）条件下）において実施される。しかし、このような環境において動物を維持することは、一般に容易ではない。さらに、発酵槽において増殖した細胞は、１つの十分に特徴付けられたＭａｓｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ（ＭＣＢ）に由来するが、トランスジェニック動物技術は、異なる動物に依存し、そして従って、本質的に不均一である。さらに、外因性因子（例えば、異なる食物摂取、疾患、および群内での均一性の欠如）が最終産物のグリコシル化パターンをもたらし得る。例えば、ヒトにおいては、異なる食事習慣が異なるグリコシル化パターンを生じることが知られている。
【００２０】
トランスジェニック植物が、治療的に価値のあるタンパク質を得るための潜在的な供給源として開発されている。しかし、植物における高レベルのタンパク質発現は、遺伝子サイレンシング（高度に発現されるタンパク質の遺伝子が続く植物世代においてダウンレギュレートされる機構）を受ける。さらに、植物は、キシロースおよび／またはα−１，３結合フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに付加し、動物と構造が異なり、哺乳動物において免疫原性である糖タンパク質を生じる（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｍａｒｚら、１９９５　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（２）；１５０−１５５）。さらに、滅菌またはＧＭＰ環境において植物を生育させることは一般に実際的でなく、そして植物組織からのタンパク質の回収は、発酵微生物からの回収よりも高価である。
【００２１】
（真核微生物を用いる糖タンパク質生成）
従って、適切な発現系がないことは、組換えヒト糖タンパク質の低コストでかつ安全な生成のための大きな障害である。微生物の発酵を介する糖タンパク質の生成は、既存の系に比較して多数の利点を与える。例えば、発酵に基づくプロセスは、以下を与え得る：（ａ）高濃度のタンパク質を迅速に生成する；（ｂ）滅菌された十分に制御された生成条件（例えば、ＧＭＰ条件）を使用することができる；（ｃ）簡易な化学的に規定された増殖培地を使用することができる；（ｄ）遺伝子操作が容易である；（ｅ）ヒトまたは動物の病原体の汚染がない；（ｆ）広範に種々のタンパク質（毒性などに起因して細胞培養ではあまり発現されないタンパク質を含む）を発現できる；（ｇ）タンパク質回収が容易である（例えば、培地への分泌を介する）。さらに、一般に、発酵設備は、細胞培養設備よりも組み立てるのにずっと費用がかからない。
【００２２】
しかし、上述のように、細菌（組換えタンパク質を生成するために一般に使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのような種を含む）は、真核生物のように特定の様式でタンパク質をグリコシル化しない。種々のメタノール資化性酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が、真核生物発現系として特に有用である。なぜなら、高い細胞密度に増殖することができ、かつ／または大量の組換えタンパク質を分泌できるからである。しかし、上述のように、これらの真核微生物において発現される糖タンパク質は、動物における糖タンパク質とはＮ−グリカン構造において実質的に異なる。このことにより、多くの有用な糖タンパク質の生成のための宿主として酵母または糸状菌を使用することが妨げられていた。
【００２３】
いくつかの試みが、真核生物性の微生物のグリコシル化経路を改変して、哺乳動物の治療剤としての用途にさらに適切な糖タンパク質を提供するためになされてきた。例えば、いくつかのグルコシルトランスフェラーゼが、別個にクローン化され、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴ　Ｉ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴ　Ｉ）および他の真菌類（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９９、Ｋａｌｓｎｅｒら、１９９５　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２（３）：３６０〜３７０、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、１９９５）で発現されてきた。しかし、ヒトの特性を有するＮ−グリカンは、得られていない。
【００２４】
酵母は、種々のマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、１，３−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＭＮＮ１）（ＧｒａｈａｍおよびＥｍｒ、１９９１　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２０７−２１８）、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＮＮ４およびＭＮＮ６）および内在性のグリコシル化反応に関与するさらなる酵素）を産生する。これらの遺伝子の多くは、個々に欠失され、変更されたグリコシル化反応プロファイルを有する生存可能な生物を生じる。
例を、表１に示す。
【００２５】
【表１】

さらに、日本国特許出願公開番号８−３３６３８７号は、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体株を開示する。このＯＣＨ１遺伝子は、１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードし、これは、マンノースをグリカン構造Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２に加え、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２を生じる。次いで、このＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、インビボにおけるさらなるマンノシル化のための基質であり、これは、酵母の特徴的な高マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ）糖タンパク質を生じ、そして代表的には、１つのＮ−グリカン当たり少なくとも３０〜４０マンノース残基を有し得る。ＯＣＨ１変異体株において、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２でグリコシル化されたタンパク質が蓄積して、高マンノシル化は生じない。しかし、構造Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２は、動物のグリコシル化酵素（例えば、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ）に対する基質ではなく、従って、この方法はヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生に有用ではない。
【００２６】
Ｍａｒｔｉｎｅｔら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８，２０（１２），１１７１〜１１７７）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中でのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼの発現を報告した。モデルタンパク質のＮ−グリカンからのいくつかのマンノースの切り取りが観察された。しかし、このモデルタンパク質は、Ｎ−グリカン複合体の生成についての中間体として必要である構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有するＮ−グリカンを有さなかった。従って、この方法は、ヒトまたは動物のグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生については有用ではない。
【００２７】
同様に、Ｃｈｉｂａら（１９９８）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼを、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させた。シグナルペプチド配列（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）が、外来性マンノシダーゼ中に操作されて、小胞体中での保持が促進される。さらに、この酵母宿主は、タンパク質の高マンノシル化に関連する以下の３つの酵素活性を欠失する変異体である：１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）；１，３−マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ１）；およびマンノシルホスフェートトランスフェラーゼ（ＭＮＮ４）。従って、この三重変異体宿主のＮ−グリカンは、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてより多く見出される高マンノース形態よりも、むしろＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造からなっていた。操作されたマンノシダーゼの存在下において、モデルタンパク質（カルボキシペプチダーゼＹ）のＮ−グリカンを切断し、２７モル％Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、２２モル％Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、２２モル％Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２、２９モル％Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２からなる混合物を得た。内在性細胞壁糖タンパク質の切断はそれほど効率的ではなく、Ｎ−グリカンの１０モル％のみが所望されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を有する。
【００２８】
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリカンのみが、さらなるヒトの糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）への酵素による変換に対して感受性であり、この方法は、ヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生について効率的ではない。単一のＮグリコシル化部位を有するタンパク質において、少なくとも７３モル％は、不正確な構造を有する。２つまたは３つのＮグリコシル化部位を有するタンパク質において、それぞれ、少なくとも９３モル％または９８モル％が、不正確な構造を有する。このような低い変換効率は治療剤の産生にとって不充分である。これは、特に、異なる糖形態を有するタンパク質の分離が、典型的には費用がかかり、かつ困難であるからである。
【００２９】
真菌類宿主に由来するさらなるヒト様糖タンパク質を産生する目的で、ＭａｒａｓおよびＣｏｕｎｔｅｒａｓの米国特許第５，８３４，２５１号は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のハイブリッド糖タンパク質を産生するための方法を開示する。ハイブリットＮ−グリカンは、コアのＭａｎα１−６アーム上にマンノース残基のみ、およびＭａｎα１−３アーム上に１つまたは２つの複合体アンテナを有する。この構造は有用性を有するが、この方法は、多くの酵素的工程がインビトロで実施されなければならず、これにより費用がかかり、そして時間も費やされるとういう不利益を有する。単離された酵素は、調製および維持のために費用がかかり、独特かつ費用のかかる基質（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを必要とし得、そして使用条件下で活性消失および／またはタンパク質分解される傾向にある。
【００３０】
従って、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓおよび他の下等真核生物（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉ）において発現される組換え糖タンパク質のグリコシル化のヒト化のための系および方法を提供することが、本発明の目的である。
【００３１】
（発明の要旨）
一連の酵素反応（これは、ヒトの糖タンパク質のプロセシングを模倣する）を達成することを可能にする遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する細胞株を開発した。これらの操作された宿主において発現される組換えタンパク質は、ヒトの対応物に対して実質的に同一ではないが、より類似する糖タンパク質を産生する。通常は高マンノース含有Ｎ−グリカンを産生する下等真核生物（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉのような単細胞真菌類および多細胞真菌類を含む）は改変されて、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはヒトのグリコシル化経路に沿った他の構造のようなＮ−グリカンを産生する。これは、株の操作および／または選択の組み合わせを使用することによって達成される：真菌類の糖タンパク質の特徴である望まない複雑な構造をつくる特定の酵素を発現しない株、活性が所望される真菌内で存在する条件下で至適な活性を有する異種酵素を発現するようにか、または至適な活性が達成される細胞内小器官に標的化されるように選択された外来性酵素を発現する株、およびその組み合わせ。ここで、この遺伝的に操作された真核生物が、「ヒト様」糖タンパク質を産生するために必要とされる複数の異種酵素を発現する。
【００３２】
第１の実施形態において、この微生物は、５．１と８．０との間（好ましくは、５．９と７．５との間）の至適ｐＨを有する外来性α−１，２−マンノシダーゼ酵素を発現するように操作される。代替的に好ましい実施形態において、この外来性酵素は、その宿主生物体の小胞体またはゴルジ装置に標的化され、ここで、これは、例えば、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のようなＮ−グリカンを切断し、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を産生する。この後者の構造は有用である。なぜならば、これは、哺乳動物（特に、ヒト）で形成される構造と同一であり；これは、インビボおよび／またはインビトロにおける、さらなるグリコシル化反応のための基質であり、これが、哺乳動物（特に、ヒト）で形成されるＮ−グリカンと類似であるかまたは同一である最終的なＮ−グリカンを産生し；そして、これは、酵母および他の微生物においてインボで起こり、糖タンパク質に哺乳動物における高い免疫原性を与える高マンノシル化反応の基質ではないからである。
【００３３】
第２の実施形態において、真核生物性の微生物のグリコシル化経路が以下によって改変される：（ａ）外来性グリコシル化酵素をコードする、少なくとも２つの遺伝子を含むＤＮＡライブラリーを構築すること；（ｂ）この微生物を、このライブラリーによって形質転換し、少なくとも２つの別個の異種グリコシル化酵素を発現する遺伝的に混在した集団を生成すること；（ｃ）所望のグリコシル化表現型を有する微生物を、この集団から選択すること。好ましい実施形態において、このＤＮＡライブラリーは、各々がタンパク質局在化配列と、グリコシル化活性に関連する触媒活性とをコードするキメラ遺伝子を含む。この方法を使用して改変された生物は、哺乳動物（特に、ヒト）に類似するか、または同一であるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の産生に有用である。
【００３４】
第３の実施形態において、このグリコシル化経路は、改変されて、糖ヌクレオチド輸送因子酵素を発現する。好ましい実施形態において、ヌクレオチドジホスファターゼ酵素がまた発現される。この輸送因子およびジホスファターゼは、適切な区画にグリコシル化酵素に適切な基質を提供し、競合的産物阻害を減少し、そして、ヌクレオシドジホスファターゼの除去を促進することによって、操作されたグリコシル化工程の効率を改善する。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載の、方法および組換え下等真核生物株が使用され、「ヒト化糖タンパク質」が産生される。この組換え下等真核生物は、高次のマンノース構造の産生に関与する１つ以上の酵素を発現しない下等真核生物を操作することによって、産生して、ヒト様の糖を産生するために必要な酵素を発現する。本明細書中で使用される場合、下等真核生物は、単細胞性真菌類または線状菌である。本明細書中で使用される場合、「ヒト化糖タンパク質」とは、４つ未満の残基を含むＮ−グリカンに結合するタンパク質をいい、そして少なくともの５つのマンノース残基を有するこの合成中間体（これはまた、有用であり、さらにインビトロで操作され得る）をいう。好ましい実施形態において、組換え下等真核生物株で産生される糖タンパク質は、少なくとも２７モル％のＭａｎ５中間体を含む。これは、より良好なマンノシダーゼ（すなわち、タンパク質がグリコシル化される部位において、この生物中に存在する条件下で至適な活性を有するように選択される酵素）でクローニングすることによってか、または活性が所望される場合に細胞小器官にこの酵素を標的化することによって達成される。
【００３６】
好ましい実施形態において、高次のマンノース構造の産生に関与する１つ以上の酵素を発現しない真核生物が使用される。これらの株は、操作され得るか、または、多くのこのような変異体（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓおける高マンノシル化−マイナス（ＯＣＨ１）変異体）の１つが、酵母においてすでに記載されている。
【００３７】
この株が同時に操作された１つの酵素であり得るか、または潜在的に有用な酵素をコードする遺伝子のライブラリーが生成され得、そして至適な活性を伴うかまたは最も「ヒト様」である糖タンパク質を産生する酵素を有するこれらの株が選択され得る。
【００３８】
付着されるＮ−グリカンＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有する糖タンパク質を産生する下等真核生物は、特に有用である。なぜならば（ａ）これらは高い程度のマンノシル化（例えば、１つのＮ−グリカン当たり８を超えるマンノース、または特に３０〜４０のマンノース）を欠失しており、これはヒトにおける免疫原性を減少し；そして（ｂ）このＮ−グリカンが、さらなるグリコシル化反応の基質であり、（例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を形成するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によって）よりヒト様の糖形態さえも形成するからである。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、少なくとも一過的に、インビボにて高収率で形成されなければならない。なぜならば、全てのこれに続くグリコシル化反応は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２またはこの誘導体を必要とするからである。従って、高比率のＮ−グリカンがＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有する、２７モル％を超える、より好ましくは、５０〜１００モル％の糖タンパク質の収率が得られる。従って、例えば、ＭａｒａｓおよびＣｏｎｔｅｒａｓの米国特許第５，８３４，２５１号の方法を使用するインビトロでのさらなるグリコシル化反応を実施することが可能である。好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応が、インビボで実施される。その高度に好ましい実施形態において、グリコシル化酵素の活性形態は、小胞体および／またはゴルジ装置において発現される。
【００３９】
（宿主微生物）
酵母および線状菌の両方は、細胞内にあり、そして分泌される、組換えタンパク質の産生のために首尾良く使用される（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ、Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ　２０００ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２４（１）４５−６６；Ｈａｒｋｋｉ，Ａら，１９８９　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７（６）：５９６；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．ら，１９９２　Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐｅｒｓ　Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３：１２１−ＢＩＯＴ；Ｓｖｅｔｉｎａ，Ｍ．ら，２０００　Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：２４５−２５１。
【００４０】
酵母および真菌類におけるグリコシル化は、ヒトにおけるグリコシル化と非常に異なっているが、いくつかの共通のエレメントが共有される。第１の工程、新生のタンパク質へのコアオリゴ糖構造の移入は、酵母、真菌類、植物およびヒトを含む全ての真核生物において高度に保存されている（図１Ａおよび図１Ｂを比較のこと）。しかし、続くこのコアオリゴ糖のプロセシングは、酵母において有意に異なり、そして、いくつかのマンノース糖の付加を含む。この工程は、ゴルジにおいて存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＴ１、ＭＮＮ１など）によって触媒され、マンノース糖をコアオリゴ糖に連続して付加する。この得られた構造は、ヒト類似タンパク質の産生にとって望ましいものではなく、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を低減するか、またはこれを除去することが所望される。マンノシルトランスフェラーゼ活性が欠損している、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（例えば、ｏｃｈ１変異体またはｍｎｎ９変異体）が、非致死的であり、そして酵母のオリゴ糖の中で減少したマンノース含有量を提示することが示される。他のオリゴ糖プロセシング酵素（例えば、マンノシルホスフェートトラスフェラーゼ）はまたは、宿主の特定の内因性グリコシル化パターンに依存して、除去され得る。望まない内因性グリコシル化反応の低減後に、Ｎ−グリカン複合体の形成は宿主系中へと操作される必要がある。これは、いくつかの酵素および糖ヌクレオチド輸送因子の安定発現を必要とする。さらに、成熟グリコシル化構造の連続的なプロシングを確認するような様式で、これらの酵素を位置付ける必要がある。
【００４１】
（標的糖タンパク質）
本明細書中に記載の方法は、糖タンパク質、特に、ヒトにおいて治療的に使用される糖タンパク質の産生に有用である。このような治療タンパク質は、代表的には、注射手段、経口手段、経肺手段、または他の手段によって投与される。
【００４２】
適切な標的糖タンパク質の例としては、以下が含まれるが、これらに限定しなされない：エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、および顆粒球ＣＳＦ）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびヒトプロテインＣ）、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、チマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、表皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆阻害因子−１およびオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）。
【００４３】
（Ｎ−グリカン　Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を含む、糖タンパク質を産生方法）
第１の工程は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の特異的な前駆体構造を産生することが可能な下等真核生物の選択または生成を含む。このＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によって、インビボＧｌｃＮＡｃを受容することが可能である。この工程は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の特定の異性体構造の形成を必要とする。この構造は、細胞内にて高収率（３０％の余剰）で形成される必要がある。なぜならば、全ての続く操作は、この前駆体の存在を条件とするからである。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、Ｎ−グリカン複合体形成に必要であるが、しかし、これらの存在は決して十分ではない。なぜならば、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、異なる異性体形態で存在し得、これはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩに対する基質としての役割を果たしても、果たさなくてもよい。ほとんどの、グリコシル化反応は完全ではなく、従って、特定のタンパク質は、一般にその表面において異なった炭水化物構造（すなわち、糖形態）の範囲を含む。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のような特定の構造の微量（５％未満）の存在のみでは、実際の信頼性はほとんどない。必要とされているものは、高収率（約３０％を超える）での特定のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ受容中間体（構造Ｉ）の形成である。この中間体の形成は必要であり、ついで、Ｎ−グリカン複合体のインビボ合成を可能にする。
【００４４】
このような下等真核生物を、天然に存在するかあるいは遺伝子操作で生じた真菌または下等真核生物から選択し得、インビトロでこの構造を提供する。下等真核生物が、総Ｎ−グリカンのうち１．８％を超えるこのような構造をインビトロで産生することを示されておらず（Ｍａｒａｓら、１９９７）、そして遺伝的に操作された生物体が好ましい。米国特許第５、５９５、９００号に記載の方法のような方法を使用して、目的の標的生物体内で、特定のグリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼおよび糖ヌクレオチド輸送因子の存在または非存在を同定し得る。
【００４５】
（１，２−αマンノシダーゼのような真菌性グリコシル化酵素の不活性化）
本明細書中に記載の方法を使用して、以下の広範囲の下等真核生物のグリコシル化を操作し得る：例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉなど。Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、必要とされる操作工程を例示する。他の下等真核生物と同様に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、そのＥＲ中にＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２構造を保持し、１，２−マンノシダーゼでＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を産生する。次いで、いくつかのマンノシルトランスフェラーゼ作用を介して、この構造は、マンナンとして公知の高マンノシル化構造（Ｍａｎ_＞９ＧｌｃＮＡｃ_２）に変換される。さらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、炭水化物構造に対するマンノシルホスフェートトランスフェラーゼの作用を介して非末端リン酸基を付加し得る。これは、哺乳動物細胞で見出された反応とは逆であり、これは、これらの付加とは対照的にマンノース糖の除去を含む。存在するＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造を高マンノシル化する真菌類の能力を除去することは重要である。これは、高マンノシル化しない真菌を選択するか、またはこのような真菌を操作するかのいずれかによって達成され得る。
【００４６】
このプロセスに関与する遺伝子が、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓで同定され、そして、変異をこれらの遺伝子の中で生成することによって、「望まない」糖形態の産生を低減し得る。このような遺伝子は、他の下等真核生物（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において見出される、存在するマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ１）に対する相同性によってか、または、宿主株を変異誘発し、減少したマンノシル化を有する表現型ついて選択することによって同定され得る。公知のマンノシルトランスフェラーゼおよびマンノシルフォスファターゼトランスフェラーゼの間の相同性に基づいて、ＰＣＲプライマー（この例は、表２に示される）を設計し得るか、または、標的生物のＤＮＡライブラリーにおけるホモログを同定するためのプローブとしてこのような酵素をコードする遺伝子フラグメントを使用し得る。あるいは、関連する生物種において特定の表現型を補完し得る。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を得るために、以下の工程を実施し得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体は、温度感性であり、上昇した温度においては遅く増殖する。従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＣＨ１の機能的なホモログを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＣＨ１変異体を相補体化することによって同定し得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのこのような変異体は、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで見出され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＹＥＡＳＴＤ．ｐｈｐ３にて市販されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＤＮＡライブラリーで形質転換された後に、上昇した温度における正常な増殖の表現型を提示する変異体は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１ホモログを保持し得る。このようなライブラリーは、適切な制限酵素を用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体ＤＮＡを部分的に消化し得、そして、この制限酵素を不活化した後に、この消化されたＤＮＡを適切なベクターに連結することによって生成し得、ここで、このベクターは適合可能な制限酵素で消化されている。適切なベクターは、ｐＲＳ３１４またはｐＦＬ４４Ｓである。ここで、ｐＲＳ３１４は、Ｔｒｐ１マーカー（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．およびＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２２，１９〜２７頁）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づいた低コピー（ＣＥＮ６／ＡＲＳ４）プラスミドであり、ｐＦＬ４４Ｓは、ＵＲＡ３マーカー（Ｂｏｎｎｅａｕｄ，Ｎ．ら、１９９１、Ｙｅａｓｔ　７、６０９−６１５頁）を含む改変ｐＵＣ１９に基づいた高コピー（２μ）プライスミドである。このようなベクターは、学術的な研究者によって一般的に使用され、また類似のベクターが、多くの異なる供給業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｐａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手可能である。例としては、ｐＹＥＳ／ＧＳ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ製の２μ複製開始点に基づく酵母発現ベクター）またはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製のＹｅｐ２４クローニングビヒクルである。染色体ＤＮＡおよびこのベクターの連結後に、このＤＮＡライブラリーを、特定の変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に形質転換し得、対応する表現型の補正について選択し得る。野生型表現型を回復するＤＮＡフラグメントのサブクローニングおよび配列決定の後、このフラグメントを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１によってコードされる遺伝子産物の活性を除去し得る。
【００４７】
あるいは、目的の特定の真菌の完全ゲノム配列が、公知である場合、ＮＣＢＩ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔなどのようないくつかの供給源から利用可能である、公的に利用可能なＤＮＡデータベースを検索することによって簡単にこのような遺伝子を同定し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の公知の１，６マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＯＣＨ１）で所定のゲノム配列またはデータベースを検索することによって、このようなゲノムにおいて、高度の確実性で、１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子をコードする、高い相同性の遺伝子の同定をし得る。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のいくつかの公知のマンノシルトランスフェラーゼに対するホモログは、これらのアプローチのいずれか１つを使用して同定されている。これらの遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質のマンノシル化に関与する遺伝子に類似の機能を有し、従って、これらの欠失を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは類似のグリコシル化経路を有する任意の他の真菌のグリコシル化パターンを操作し得る。
【００４８】
一旦、所定の標的遺伝子配列が、決定されると、遺伝子ノックアウトの作製は、酵母および真菌の分子生物分野において十分に確立された技術であり、そして当業者であれば誰でも実施し得る（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎｓ，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１９４巻、２８１頁）。事実、宿主生物体の選択は、このような宿主に対する良好な形質転換および遺伝子破壊技術の利用可能性によって影響を受け得る。いくつかのマンノシルトランスフェラーゼが、ノックアウトされる必要がある場合、ＡｌａｎｉおよびＫｌｅｃｋｎｅｒによって開発された方法は、ＵＲＡ３マーカーの反復使用により、全ての所望ではない内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性を連続して除去することを可能にする。この技術は、他のものによって洗練されたが、基本的に、対選択マーカーに隣接する、２つの反復ＤＮＡ配列の使用を含む。例えば：ＵＲＡ３を、マーカーとして使用して、構築物を組み込んだ形質転換体の選択を保証し得る。ＵＲＡ３マーカーを直接反復と隣接させることによって、構築物が組み込まれ、それによって、標的遺伝子を破壊された形質転換体を最初に選択し得る。形質転換体の単離およびこれらの特徴付けの後、５’ＦＯＡに耐性である形質転換体を第２ランドで対選択し得る。５’ＦＯＡを含むプレート上で生存し得るコロニーは、以前に言及した反復に関与する交差現象を介して再びＵＲＡ３マーカーを失う。従って、このアプローチは、同じマーカーの反復使用を可能にし、そしてさらなるマーカーを必要とすることなく複数の遺伝子の破壊を容易にする。
【００４９】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中の特定のマンノシルトランスフェラーゼ（例えば、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ（ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、またはｌｂｄ変異を相補する遺伝子））の除去は、主にＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２を合成するこの生物体の操作された株の作製を可能にし、従って、グリコシル化パターンをより複雑なヒト糖形態構造により密に類似するようにさらに改変するために使用され得る。この方法の好ましい実施形態は、既知の生化学的グリコシル化活性をコードする、既知のＤＮＡ配列を利用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける類似または同一の生化学的機能を除去し、その結果、得られた遺伝的に改変されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のグリコシル化構造は、改変される。
【００５０】
（表２）
【００５１】
【表２】

（遺伝子操作された宿主へのマンノシダーゼの取り込み）
本明細書中に記載されるプロセスは、複合Ｎ−グリカンを生成するために、このような構造を改変する目的でこのような構造を高収率で得ることを可能にする。適切なＭａｎ_２ＧｌｃＮＡｃ_２構造を得るための首尾よいスキームは、高レベルの適切なＭａｎ_２ＧｌｃＮＡｃ_２構造を得るための以下の２つの平行したアプローチを含まなければならない：（１）内因性マンノシルトランスフェラーゼ活性の減少および（２）マンノシダーゼによって１，２−α−マンノースの除去。この方法と先行技術を区別するものは、これらの２つの問題を直接的に扱うことである。Ｃｈｉｂａおよび共同研究者の研究が、実証するように、Ａ．ｓａｉｔｏｉ由来の真菌マンノシダーゼの存在をＥＲへと操作することによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２構造をＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２異性体に還元し得る。これのアプローチの欠点は、以下の２つの要素である：（１）不十分な量のＭａｎ_２ＧｌｃＮＡｃ_２が、細胞外糖タンパク質画分に形成される（１０％）こと、および（２）インビボで形成されるＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造が、事実、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＧｌｃＮＡｃを受け入れ得ることが明らかではないこと。いくつかのグリコシル化部位が、所望のタンパク質に存在する場合、正確な形態でこのようなタンパク質を得る確率（Ｐ）は、Ｐ＝（Ｆ）^ｎの関係に従う。ここでｎは、グリコシル化部位の数と等価であり、そしてＦは、所望の糖形態割合と等価である。３つのグリコシル化部位を有する糖タンパク質は、全てのそのグリコシル化部位における複合Ｎ−グリカンおよびハイブリッドＮ−グリカンのプロセシングについての適切な前駆体を提供する、０．１％の機会を有する（これらは、このようなアプローチの商業的な価値を制限する）。
【００５２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよびゴルジ装置において活性である多くの酵素は、６．５と７．５との間の至適ｐＨを有する（表３を参照のこと）。組換えマンノシダーゼの作用によってマンノシル化を減少させる以前の全てのアプローチは、約ｐＨ５．０の至適ｐＨを有する酵素に集中しているが（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，１９９８およびＣｈｉｂａら，１９９８）、これらの酵素の活性は、ｐＨ７．０で１０％未満に減少し、従って、使用の時点（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲおよび初期ゴルジ）において不十分な活性を提供する可能性がある。好ましいプロセスは、インビボでマンノシダーゼを利用する。ここでマンノシダーゼの至適ｐＨは、同じオルガネラに局在する他の代表的なマーカー酵素の平均至適ｐＨの１．４ｐＨ単位内である。特定のオルガネラに標的化される酵素の至適ｐＨは、酵素単位あたり最大の活性が得られるように、同じオルガネラに見出される他の酵素の至適ｐＨと一致されるべきである。表３は、種々の供給源由来のマンノシダーゼの活性およびそれぞれの至適ｐＨを要約する。表４は、それらの位置を要約する。
【００５３】
（表３．マンノシダーゼおよびそれらの至適ｐＨ）
【００５４】
【表３】

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲまたはゴルジ装置においてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を得るために高マンノース構造を切り取ることを試みる場合、（１）十分に近い至適ｐＨ（すなわち、ｐＨ５．２とｐＨ７．８との間）を有し、そして（２）ＧｎＴＩによるＧｌｃＮＡｃのその後の付加を受け入れるために必要とされる特定の異性体のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２構造を産生する（単独または協調的に）ことが知られている、任意の酵素または酵素の組み合わせが選択され得る。インビトロにおいてＧｎＴ　ＩによりＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２に変換され得る構造を産生することを示す任意の酵素または酵素の組み合わせは、適切な選択を構成する。この知識は、科学文献から得られるか、または、潜在的なマンノシダーゼが、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＡをＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＡに変換し得ることを決定し、次いで得られたＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＰＡ構造が、インビトロにおいてＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を与えるためにＧｎＴ　ＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃについての基質として役立ち得るか否かを試験することによって実験的に得られる。例えば、ヒト供給源またはマウス供給源由来のマンノシダーゼＩＡは、適切な選択である。
【００５５】
（ＥＲおよびゴルジにおける１，２−マンノシダーゼ活性）
クローン化された外来性マンノシダーゼの作用によるマンノシル化を減少する以前のアプローチは、構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有する十分な割合（例えば、２７モル％より多い）のＮ−グルカンを有する糖タンパク質を得るのに失敗している（Ｍａｒｔｉｎｅｔら，１９９８およびＣｈｉｂａら，１９９８）。これらの酵素は、新生糖タンパク質を変換するのに効果的であるようにＥＲまたはゴルジ装置において十分に機能するはずである。先行技術において利用される２つのマンノシダーゼ（Ａ．ｓａｉｔｏｉおよびＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来）は、５．０の至適ｐＨを有するが、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＲおよびゴルジ装置において活性である多くの酵素は、６．５と７．５との間の至適ｐＨを有する（表３を参照のこと）。タンパク質のグルコシル化は、非常に進歩して、効率的なプロセスであるので、ＥＲおよびゴルジの内部ｐＨはまた、約６〜８の範囲であることが結論され得る。ｐＨ７．０において、先行技術において使用されるマンノシダーゼの活性は、１０％未満に減少し、これは、インビボでのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の効果的な産生に不十分である。
【００５６】
（表４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種々のグリコシル化関連酵素の細胞局在および至適ｐＨ）
【００５７】
【表４】

α−１，２−マンノシダーゼ酵素は、５．１と８．０との間のｐＨに至適活性を有するはずである。好ましい実施形態において、この酵素は、５．９と７．５との間のｐＨで至適活性を有する。至適ｐＨは、インビトロアッセイ条件下で決定され得る。好ましいマンノシダーゼとしては、適切な至適ｐＨを有する表３に列挙されるマンノシダーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＩＡ（ゴルジ）、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＩＢ（ゴルジ）、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫細胞（ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ）、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ、マウスＩＢ（ゴルジ）およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、単一のクローニングされたマンノシダーゼ遺伝子が、宿主生物体において発現される。しかし、いくつかの場合、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の十分な産生を達成するために、いくつかの異なるマンノシダーゼ遺伝子または１つの特定の遺伝子のいくつかのコピーを発現されることが所望され得る。複数の遺伝子が、使用される場合において、コードされたマンノシダーゼは、全て５．１〜８．０または特に５．９と７．５との間の好ましい範囲内に至適ｐＨを有するべきである。特定の好ましい実施形態において、マンノシダーゼ活性は、ＥＲまたはシスゴルジに標的化され、そこでグリコシル化の初期反応が生じる。
【００５８】
（複合Ｎ−グリカンの形成）
プロセスの第２の工程は、ゴルジ装置へのグルコシルトランスフェラーゼの発現を操作することによる、新生炭化水素構造への糖の連続的な付加を含む。このプロセスは、第１に、初期または中間ゴルジ装置におけるＧｎＴ　Ｉの機能的な発現およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの十分な供給を保証することが必要である。
【００５９】
（組み込み部位）
この遺伝子操作の努力の最終的な目的は、工業的な発酵プロセスにおいて十分に実施し得る頑強なタンパク質産生株であるので、真菌染色体への複数の遺伝子の組み込みは、注意深い計画が必要である。操作される株は、おそらく、異なる範囲の遺伝子で形質転換されなければならず、そしてこれらの遺伝子は、所望の活性が発酵プロセスを通して維持されることを保証するために安定な様式において形質転換されなければならない。以下の酵素活性の任意の組み合わせが、真菌タンパク質発現宿主に操作される必要がある：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的輸送因子（例えば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆体についてのシンポートおよびアンチポート輸送因子）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素ならびにＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のような活性化オリゴ糖前駆体の合成に関与する酵素。同時に、非ヒトグリコシル化反応に特徴的であることが公知の酵素をコードする多くの遺伝子は、欠失される必要がある。
【００６０】
（特定のオルガネラへのグリコシルトランスフェラーゼの標的化）
グリコシルトランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ＥＲおよびゴルジ装置の内部（内腔）表面に並び、それによって糖タンパク質が、ＥＲおよびゴルジ装置ネットワークを通って進む場合、糖タンパク質の連続的なプロセシングを可能にする「触媒的な」表面を提供する。事実、シスゴルジ、中間ゴルジおよびトランスゴルジならびにトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）の複数の区画は、異なる場を提供し、ここで、順序付けられた連続するグリコシル化反応が生じ得る。糖タンパク質が、ＥＲでの合成から後期ゴルジまたはＴＧＮでの十分な成熟まで進む場合、異なるグルコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼに連続的に曝露され、その結果、特定の炭化水素構造が、合成され得る。これらの酵素が、それぞれのオルガネラに保持および係留される正確な機構を明らかにするために多くの研究がなされてきた。進化した絵（ｅｖｏｌｖｉｎｇ　ｐｉｃｔｕｒｅ）は、複雑であるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域および細胞質テイルが、個々にまたは協調して、個々のオルガネラの膜に酵素を指向し、それによってその位置に関連する触媒的ドメインを局在化することを示唆する。
【００６１】
標的化配列は、標的化配列および標的化される酵素の選択のためのライブラリーに関して以下にさらに詳細に考察されるように、科学文献および公的データベースにおいて周知であり、そして記載される。
【００６２】
（改変されたグリコシル化経路を産生するライブラリーを作製するための方法）
外来性のグリコシル化酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子を含むライブラリーは、宿主生物体に形質転換され、遺伝的に混合された集団を作製する。次いで、所望のグリコシル化表現型を有する形質転換体は、混合された集団から選択される。好ましい実施形態において、宿主生物体は、酵母（特に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、そして宿主グリコシル化経路は、１つ以上のヒトまたは動物グリコシル化酵素の作動的な発現によって改変され、ヒト糖形態に類似または同一のタンパク質Ｎ−グリカンを生成する。特定の好ましい実施形態において、ＤＮＡライブラリーは、グリコシル化に関与する種々の細胞の部位（特に、ＥＲ、シスゴルジ、中間ゴルジまたはトランスゴルジ）に対する標的化配列とグリコシル化酵素の融合体をコードする遺伝子構築物を含む。
【００６３】
この方法を使用してもたらされ得るグリコシル化に対する改変の例は、以下である：（１）タンパク質Ｎ−グリカンとしてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を得るために、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２からマンノース残基を切り取るように真核微生物を操作すること；（２）ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの作用によってＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を付加するように真核微生物を操作すること；（３）Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ　Ｉ、ＧｎＴ　ＩＩ、ＧｎＴ　ＩＩＩ、ＧＮＴ　ＩＶ、ＧｎＴ　Ｖ、ＧｎＴ　ＶＩ）、マンノシダーゼＩＩ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ　Ｔ）またはシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）のような酵素を機能的に発現するように真核微生物を操作すること。
【００６４】
この方法を繰り返すことによって、徐々に、複雑なグルコシル化経路が、標的微生物に操作され得る。１つの好ましい実施形態において、宿主生物体は、グルコシル化活性をコードする配列を含むＤＮＡライブラリーを用いて２回またそれより多く形質転換される。所望の表現型の選択は、形質転換の各回の後、あるいは、いくつかの形質転換体が、生じた後、実施され得る。複雑なグリコシル化経路は、この様式において迅速に操作され得る。
【００６５】
（ＤＮＡライブラリー）
グリコシル化酵素をコードする少なくとも２つの外来性遺伝子を含むＤＮＡライブラリーを構築することが必要であるオープンリーディングフレーム配列に加えて、宿主生物体への形質転換において遺伝子の効果的な転写および翻訳を保証し得るような、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リボソーム結合部位および他の機能的配列を各ライブラリー構築物を提供することが一般に、好ましい。宿主が、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、適切なプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＤＡＳおよびＰ４０プロモーターが挙げられる。各構築物に少なくとも１つの選択マーカー（例えば、薬剤耐性を与える遺伝子または宿主代謝破壊を相補する遺伝子）を提供することもまた好ましい。マーカーの存在は、その後の形質転換体の選択に有用である；例えば、酵母において、ＵＲＡ３、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡまたはＳＨＢＬＥ遺伝子が、使用され得る。
【００６６】
いくつかの場合において、ライブラリーは、既存の遺伝子または野生型遺伝子から直接的に構築され得る。しかし、好ましい実施形態において、ＤＮＡライブラリーは、２つ以上のサブライブラリーの融合体から構築される。サブライブラリーのインフレーム連結によって、有用な標的化されるグリコシル化活性をコードする多数の新規の遺伝的構築物を作製することを可能にする。例えば、１つの有用なサブライブラリーは、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼのような酵素の任意の組み合わせをコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、この酵素は、ヒト起源であるが、他の哺乳動物、動物または真菌の酵素もまた、有用である。好ましい実施形態において、遺伝子は、短縮化されて、酵素の触媒ドメインをコードするフラグメントを与える。内因性の標的化配列を除去することによって、次いで、この酵素は、他の細胞部位に再指向され得、そして発現され得る。このような触媒ドメインの選択は、その触媒ドメインが、引き続いて活性である、特定の環境の知識によって導かれ得る。例えば、特定のグリコシル化酵素が、後期ゴルジにおいて活性であり、そして後期ゴルジにおける宿主生物体の全ての公知の酵素が、特定の至適ｐＨを有する場合、そのｐＨにおいて十分な活性を示す触媒ドメインが、選択される。
【００６７】
別の有用なサブライブラリーは、ＥＲ、ゴルジ、またはトランスゴルジ網内の特定の位置へのタンパク質の局在化を生じるシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。これらのシグナル配列は、宿主生物体および他の関連生物体または非関連生物体から選択され得る。ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質は、代表的に、例えば、細胞質末尾（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）、およびステム領域（ｓｒ）をコードするＮ末端配列を含み得る。ｃｔ配列、ｔｍｄ配列、およびｓｒ配列は、個々に十分であるかまたは細胞小器官の内側（管腔側）の膜に対するアンカータンパク質と組合される。従って、シグナル配列のサブライブラリーの好ましい実施形態は、これらのタンパク質由来のｃｔ配列、ｔｍｄ配列、および／またはｓｒ配列を含む。いくつかの場合において、変動する長さのｓｒ配列を有するサブライブラリーを提供することが望ましい。これは、細胞質領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するプライマーを使用し、そしてステム領域の種々の部分に結合する一連の対向プライマーを利用するＰＣＲによって達成され得る。シグナル配列のなお他の有用な供給源としては、回収シグナルペプチド（例えば、テトラペプチドのＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ）が挙げられ、これらは、ＥＲまたはゴルジに逆行して輸送されるタンパク質のＣ末端で代表的に見出される。シグナル配列のなお他の供給源としては、（ａ）ＩＩ型膜タンパク質、（ｂ）表３に列挙した酵素、（ｃ）ゴルジに局在化する膜貫通ヌクレオチド糖質輸送因子、および（ｄ）表５に参照される配列、が挙げられる。
【００６８】
（表５：有用な区画標的化配列の供給源）
【００６９】
【表５】

いずれにせよ、シグナル配列は、宿主中に操作されるべき酵素活性に適切なシグナル配列から選択されることが非常に好ましい。例えば、新生Ｎ−グリカンの末端シアリル化（ヒトにおいて後期ゴルジで生じるプロセス）をし得る改変された微生物の発生過程において、後期ゴルジタンパク質由来のシグナル配列のサブライブラリーを利用することが望ましい。同様に、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を与える、α−１，２−マンノシダーゼによるＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のトリミングは、ヒトにおける複雑なＮ−グリカン形成の初期の工程である。従って、操作された宿主微生物のＥＲまたは初期ゴルジ中でこの反応を生じさせることが望ましい。ＥＲまたは初期ゴルジの残留シグナルをコードするサブライブラリーが用いられる。
【００７０】
好ましい実施形態において、次いで、ＤＮＡライブラリーは、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするＤＮＡを含むサブライブラリーとの、シグナル配列をコードするＤＮＡを含むサブライブラリーのインフレーム連結によって構築される。得られたライブラリーは、融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。いくつかの場合において、融合タンパク質のＮ末端にシグナル配列を提供することが望ましいか、または他の場合において、Ｃ末端にシグナル配列を提供することが望ましい。いくつかの場合において、シグナル配列は、酵素のオープンリーディングフレーム内に挿入され得、但し、個々の折り畳まれたドメインのタンパク質構造は破壊されない。
【００７１】
本方法は、宿主に形質転換されたＤＮＡライブラリーが広い多様性の配列を含む場合、最も有効であり、これによって少なくとも１つの形質転換体が所望の表現型を提示する確率を増加させる。従って、形質転換の前に、ＤＮＡライブラリーまたは構成要素のサブライブラリーは、遺伝子シャッフリング、エラー傾向性（ｅｒｒｏｒ　ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、またはインビトロでの変異誘発に１回以上供され得る。
【００７２】
（形質転換）
次いで、ＤＮＡライブラリーは、宿主生物体に形質転換される。酵母において、ＤＮＡ移入の任意の簡便な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化リチウム法、またはスフェロプラスト法）が、用いられ得る。高密度の発酵に適切な安定な株を産生するために、宿主の染色体中にＤＮＡライブラリー構築物を組み込むことが望ましい。好ましい実施形態において、組込みは、当該分野で公知の技術を用いて相同組換えによって生じる。例えば、ＤＮＡライブラリーエレメントは、宿主生物体の配列に対して相同な隣接配列とともに提供される。この様式において、組込みは、所望の遺伝子または必須遺伝子の破壊なしに、宿主のゲノム中の規定の部位に生じる。特に好ましい実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、宿主染色体中の望ましくない遺伝子の部位に組み込まれ、この遺伝子の破壊または欠失をもたらす。例えば、ＯＣＨ１遺伝子、ＭＮＮ１遺伝子、またはＭＮＮ４遺伝子の部位中への組込みは、糖タンパク質の酵母の高マンノシル化に関連する酵素の発現を抑制しながら、所望のライブラリーＤＮＡの発現を可能にする。他の実施形態において、ライブラリーＤＮＡは、染色体、プラスミド、レトロウイルスベクター、または宿主ゲノムへのランダムな組込みを介して宿主に導入され得る。いかなる場合においても、安定に形質転換された宿主生物体の迅速な選択を可能にするために、各ライブラリーＤＮＡ構築物とともに少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むことが一般的に望ましい。リサイクル可能なマーカー遺伝子（例えば、ｕｒａ３）（これは、マーカー遺伝子についてかまたはマーカー遺伝子に対して選択可能である）は、特に適切である。
【００７３】
（選択プロセス）
ＤＮＡライブラリーを用いた宿主株の形質転換の後、所望のグリコシル化表現型を示す形質転換体が、選択される。選択は、単一工程においてか、またはいずれかの種々のアッセイおよび／もしくは検出方法を用いる、一連の表現型の富化および／または枯渇の工程によって実施され得る。表現型の特徴付けは、手動でかまたは自動化ハイスループットスクリーニング装置を用いて実施され得る。一般に、宿主微生物は、種々の糖タンパク質が局在する細胞表面上のタンパク質Ｎ−グリカンを提示する。従って、インタクトな細胞は、これらの細胞を所望のＮ−グリカンに特異的に結合するレクチンまたは抗体に曝露することによって、所望のグリコシル化表現型についてスクリーニングされ得る。多種多様なオリゴ糖特異的レクチンは、市販されている（ＥＹ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）。あるいは、ヒトまたは動物のＮ−グリカンに特異的な抗体は、市販されているか、または標準的技術を用いて産生され得る。適切なレクチンまたは抗体は、レポーター分子（例えば、発色団、フルオロフォア、放射性同位体、または色素生産性基質を有する酵素（Ｇｕｉｌｌｅｎら，１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５（１４）：７８８８−７８９２））に結合体化され得る。次いで、スクリーニングする工程は、分析方法（例えば、分光光度法、蛍光定量法、蛍光活性セルソーター法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）、またはシンチレーションカウンター法）を用いて実施され得る。他の場合において、形質転換された細胞から単離された糖タンパク質またはＮ−グリカンを分析する必要性があり得る。タンパク質の単離は、当該分野で公知の技術によって実施され得る。単離されたＮ−グリカンが必要とされる場合、酵素（例えば、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））を用いて、糖タンパク質からＮ−グリカンを切断し得る。次いで、単離されたタンパク質またはＮ−グリカンは、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、質量分析、または他の適切な手段によって分析され得る。米国特許番号第５，５９５，９００号は、所望の細胞外炭水化物構造を有する細胞を同定し得るいくつかの方法を教示している。所望の形質転換体の選択の前に、望ましくない表現型を有する細胞の形質転換された集団を枯渇させることが望まれ得る。例えば、本方法を用いて、機能的マンノシダーゼ活性を細胞中に操作する場合、所望の形質転換体は、細胞の糖タンパク質において低レベルのマンノースを有する。形質転換された集団を培地中でマンノースの致死的な放射線同位体に曝露することは、望ましくない表現型（すなわち、高レベルで組み込まれたマンノース）を有する形質転換体の集団を枯渇させる。あるいは、望ましくないＮ−グリカンに対する細胞傷害性レクチンまたは抗体を用いて、望ましくない表現型の形質転換された集団を枯渇させ得る。
【００７４】
（ゴルジ装置に糖ヌクレオチド前駆体を提供するための方法）
ゴルジにおいて十分に機能するグリコシルトランスフェラーゼについて、酵素は、十分な濃度の適切なヌクレオチド糖とともに提供される必要があり、新生糖タンパク質に付加された糖部分の高エネルギードナーである。適切な区画へのこれらのヌクレオチド糖は、宿主微生物における糖ヌクレオチド輸送因子をコードする外因性遺伝子を発現することによって提供される。輸送因子酵素の選択は、用いられる外因性グリコシルトランスフェラーゼの性質によって影響される。例えば、ＧｌｕＮＡｃトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子を必要とし得るか、フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰフコース輸送因子を必要とし得るか、ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰガラクトース輸送因子を必要とし得るか、またはシアル酸トランスフェラーゼは、ＣＭＰシアル酸輸送因子を必要とし得る。
【００７５】
付加された輸送因子タンパク質は、細胞質ゾルからゴルジ装置へとヌクレオチド糖を輸送し、ここで、このヌクレオチド糖は、グリコシルトランスフェラーゼによって、例えば、Ｎ−グリカンを伸長するように反応され得る。この反応は、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸（例えば、ＵＤＰ、ＧＤＰ、またはＣＭＰ）を遊離する。ヌクレオシド二リン酸の蓄積がグリコシルトランスフェラーゼのさらなる活性を阻害する場合、ヌクレオチドジホスファターゼをコードする遺伝子の発現コピーを提供することもまた、頻繁に望ましい。このジホスファターゼ（適切な場合、ＵＤＰまたはＧＤＰに特異的）は、ヌクレオシド一リン酸および無機リン酸を得るために二リン酸ヌクレオシドを加水分解する。ヌクレオシド一リン酸は、グリコトランスフェラーゼを阻害せず、そしていかなる場合でも、内因性細胞系によってゴルジから輸送される。適切な輸送因子酵素（これは、代表的には、哺乳動物起源の輸送因子酵素である）は、以下に記載される。
【００７６】
（実施例）
上記の一般方法の使用は、以下の非限定的な実施例を参照することによって理解され得る。好ましい実施形態の例をまた、表６に要約する。
【００７７】
（実施例１：インシュリンを産生するためのα−１，２−マンノシダーゼを用いたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの操作）
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（複雑なＮ−グリカン形成のための必須の中間体）を得るためのＭａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２のトリミングのために必要である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体を、ａｏｘプロモーターの制御下で分泌ヒトインターフェロンαを発現するように操作する。ＤＮＡライブラリーを、初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、ヒトマンノシダーゼＩＢ（α−１，２−マンノシダーゼ）の触媒ドメインとのインフレーム連結によって構築する。次いで、このＤＮＡライブラリーを、宿主生物体に形質転換し、遺伝的に混合された集団を生じ、ここで、個々の形質転換体は、インターフェロンβおよびこのライブラリー由来の合成マンノシダーゼ遺伝子をそれぞれ発現する。個々の形質転換体コロニーを培養し、そしてインターフェロンの産生をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下、９０％を超えるこの分泌タンパク質は、インターフェロンβを含む。上清を精製して、塩および低分子量の夾雑物をＣ_１８シリカ逆相クロマトグラフィーによって除去する。適切に標的化された活性α−１，２−マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを含むインターフェロンβを産生し、これは、親株のインターフェロンと比較して低減した分子量を有する。インターフェロンβを含む精製した上清を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、そして所望の形態のインターフェロンβを発現するコロニーを同定する。
【００７８】
（実施例２：ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを発現するための株の操作）
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性は、複雑なＮ−グリカンの成熟に必要である。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩによる末端α−１，３マンノース残基へのＧｌｃＮＡｃの付加後、マンノシダーゼＩＩによってトリミングのみされ得る（これはヒト糖形態の形成に必要な工程である）（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，１９９１　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　１（５）：４５３−４６１）。従って、ライブラリーを、適切に標的化するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを含むよう調製する。宿主生物体は、株（例えば、高マンノシル化を欠く酵母（例えばＯＣＨ１変異体））であり、ゴルジおよび／またはＥＲに基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを提供し、そしてゴルジおよび／またはＥＲに構造Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２のＮ−グリカンを提供する。ＤＮＡライブラリーを用いた宿主の形質転換後、形質転換体を、細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有するか、あるいは最高の末端ＧｌｃＮＡｃ含有量を有するタンパク質を分泌する形質転換体についてスクリーニングする。このようなスクリーニングを、視覚的方法（例えば、染色手順）、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体、またはレクチンを用いて実施する。あるいは、所望の形質転換体は、末端マンノース残基に特異的な特定のレクチンの低減した結合を示す。
【００７９】
（実施例３：マンノシダーゼＩＩを用いた株の操作）
別の実施例において、微生物におけるヒト糖形態を生成するために、マンノシダーゼＩＩの作用によって構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２から２つの残っている末端マンノースを除去することが望ましい。シスゴルジおよび中間（ｍｅｄｉａｌ）ゴルジ局在化シグナルをコードする配列を含むＤＮＡライブラリーを、インフレームでマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードするライブラリーに融合させる。宿主生物体は、株（例えば、これは、高マンノシル化を欠く酵母（例えば、ＯＣＨ１変異体））であり、そしてゴルジおよび／またはＥＲにおいて構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２を有するＮ−グリカンを提供する。形質転換後、所望のグリコシル化表現型を有する生物体を、選択する。インビトロでのアッセイを１つの方法において用いる。所望の構造ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（しかし、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２は、望ましくない）は、酵素ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩのための基質である。したがって、単一コロニーを、この基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）存在下でインビトロでこの酵素を用いてアッセイし得る。ＵＤＰの遊離を、ＨＰＬＣまたはＵＤＰについての酵素アッセイのいずれかによって決定する。あるいは、放射性標識化ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いる。
【００８０】
前述のインビトロでのアッセイを、ハイスループットスクリーニング装置を用いて個々のコロニーにおいて好都合に実施する。あるいは、レクチン結合アッセイを用いる。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの低減した結合は、所望の表現型を有する形質転換体の選択を可能にする。例えば、Ｇａｌａｎｔｕｓ　ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３−マンノースに特異的に結合し、この濃度は、作動可能に発現したマンノシダーゼＩＩ活性の存在下で低減する。１つの適切な方法において、固体アガロース支持体（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより利用可能）に接着したＧ．ｎｉｖａｌｉｓレクチンを用いて、高レベルの末端α−１，３マンノースを有する細胞の形質転換された集団を枯渇させる。
【００８１】
（実施例４：シアル酸トランスフェラーゼを発現するための生物体の操作）
酵素α２，３−シアル酸トランスフェラーゼおよびα２，６−シアル酸トランスフェラーゼは、末端のシアル酸を、新生ヒトＮ−グリカン中のガラクトース残基に付加し、成熟糖タンパク質をもたらす。ヒトにおいて、この反応は、トランスゴルジまたはＴＧＮにおいて生じる。従って、ＤＮＡライブラリーを、シアル酸トランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする配列の、トランスゴルジまたはＴＧＮ局在化シグナルをコードする配列とのインフレームの融合によって構築する。宿主生物体は、株（例えば、高マンノース化を欠く酵母（例えば、ＯＣＨ１変異体））であり、これは、トランスゴルジまたはＴＧＮにおいて末端のガラクトース残基を有するＮ−グリカンを提供し、そしてトランスゴルジまたはＴＧＮにおける十分な濃度のＣＭＰシアル酸を提供する。形質転換に続いて、所望の表現型を有する形質転換体を、末端にシアル酸を有するＮ−グリカンに特異的な蛍光抗体を用いて選択する。
【００８２】
（実施例５：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子を発現するために株を操作する方法）
ヒトゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子のｃＤＮＡは、Ｉｓｈｉｄａおよび共同研究者らによってクローニングされた（Ｉｓｈｉｄａ，Ｎ．ら，１９９９　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（１）：６８−７７）。Ｇｕｉｌｌｅｎおよび共同研究者らは、ゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送を欠損したＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ変異体の表現型補正によって、イヌ腎臓のゴルジＵＤＰＧｌｃＮＡｃ輸送因子をクローニングした（Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｅ．ら，１９９８）。従って、哺乳動物のゴルジＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子遺伝子は、酵母のゴルジ装置を発現し、そしてこれを機能的に標的化するタンパク質についての全ての必要な情報を有する。
【００８３】
（実施例６：ＧＤＰ−フコース輸送因子を発現するように株を操作する方法）
ラット肝臓のゴルジ膜のＧＤＰ−フコース輸送因子は、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．およびＣ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ　１９９９　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５５９６−３５６００によって同定され、そして精製された。対応する遺伝子を、標準的技術（例えば、縮重ＤＮＡプローブを用いたＮ末端の配列決定法およびサザンブロット法）を用いて同定し得る。次いで、インタクトな遺伝子を、フコシルトランスフェラーゼもまた発現する宿主の微生物において発現させ得る。
【００８４】
（実施例７：ＵＤＰ−ガラクトース輸送因子を発現するように株を操作する方法）
ヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）輸送因子は、クローニングされ、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて活性であることが示された（Ｋａｉｎｕｍａ，Ｍ．ら，１９９９　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　９（２）：１３３−１４１）。第２のヒトＵＤＰ−ガラクトース輸送因子（ｈＵＧＴ１）は、クローニングされ、そしてチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞において機能的に発現された。Ａｏｋｉ，Ｋ．ら，１９９９　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（５）：９４０−９５０。同様に、Ｓｅｇａｗａおよび共同研究者らは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅからＵＤＰ−ガラクトース輸送因子形態をクローニングした（Ｓｅｇａｗａ，Ｈ．ら，１９９９　Ｆｅｂｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４５１（３）：２９５−２９８）。
【００８５】
（ＣＭＰ−シアル酸輸送因子）
ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送因子（ｈＣＳＴ）は、Ａｏｋｉおよび共同研究者ら（１９９９）によって、クローニングされ、そしてＬｅｃ　８　ＣＨＯ細胞において発現された。ハムスターＣＭＰ−シアル酸輸送因子の分子クローニングもまた、達成された（ＥｃｋｈａｒｄｔおよびＧｅｒａｒｄｙ　Ｓｃｈａｈｎ　１９９７　Ｅｕｒ．Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８（１）：１８７−１９２）。マウスのＣＭＰ−シアル酸輸送因子の機能的発現は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，Ｐ．ら，１９９７　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２６１６−１２６１９によって達成された。
【００８６】
（表６．真核微生物（例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるグリコシル化を改変するための方法の好ましい実施形態の例）
【００８７】
【表６】

【００８８】
【表７】

グリコシル化を改変するための方法において使用され得るさらなる方法および試薬は、以下の文献に記載される：例えば、米国特許第５，９５５，４２２号；同第４，７７５，６２２号；同第６，０１７，７４３号；同第４，９２５，７９６号；同第５，７６６，９１０号；同第５，８３４，２５１号；同第５，９１０，５７０号；同第５，８４９，９０４号；同第５，９５５，３４７号；同第５，９６２，２９４号；同第５，１３５，８５４号；同第４，９３５，３４９号；同第５，７０７，８２８号；および同第５，０４７，３３５号。
【００８９】
適切な酵母発現系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのような供給源から獲得され得る。ベクターは、種々の供給源から市販される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、代表的な真菌性Ｎ−グリコシル化経路の概念図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、ヒトＮ−グリコシル化経路の概念図である。

Claims

糖タンパク質上のＮ−グリカンに対して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない下等真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２炭水化物構造の生成のための１以上の酵素を該宿主細胞に導入する工程を包含し、ここで、インビボでＧｎＴ１の基質として働き得る少なくとも３０％のＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２が該宿主細胞内で生成される、方法。
少なくとも１つの前記酵素が、前記炭水化物構造が生成される前記宿主細胞中の位置のｐＨで最適な活性を有するように選択される、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの前記酵素が、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の平均至適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に至適ｐＨを有するように選択される、請求項２に記載の方法。
前記酵素が、通常は該酵素に結合しない細胞標的化シグナルペプチドによって標的化される、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの導入された酵素が、前記宿主細胞の小胞体、初期ゴルジ、中間ゴルジ、後期ゴルジ、またはトランスゴルジ網に標的化される、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの前記酵素が、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
前記酵素が、ゴルジ装置または小胞体に優勢に局在するマンノシダーゼである、請求項５に記載の方法。
前記糖タンパク質が、６個未満のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
前記糖タンパク質が、４個未満のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
前記糖タンパク質が、ガラクトース、シアル酸およびフコースからなる群より選択される１以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
前記糖タンパク質が、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む、少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、前記宿主が、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉからなる群より選択される、方法。
前記宿主が、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される１以上の酵素の活性を欠損している、請求項１に記載の方法。
前記宿主が、１，６マンノシルトランスフェラーゼ；１，３マンノシルトランスフェラーゼ；および１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現しない、請求項１３に記載の方法。
前記宿主が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体である、請求項１に記載の方法。
前記宿主が、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ輸送因子を発現する、請求項１に記載の方法。
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼまたはＧＤＰ特異的ジホスファターゼを発現する、請求項１に記載の方法。
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記単離された糖タンパク質を、少なくとも１回のさらなるインビトロのグリコシル化反応に供し、続いて前記宿主からの単離に供する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２炭水化物構造の生成のための１以上の酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２またはＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２からのＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２の生成に関与する１以上のマンノシダーゼ酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つのコードされたマンノシダーゼ酵素が、該マンノシダーゼ酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的酵素の平均至適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に至適ｐＨを有するか、または５．１〜８．０の間のｐＨで最適な活性を有する、請求項２１に記載の方法。
前記マンノシダーゼ酵素が、５．９〜７．５の間のｐＨで最適な活性を有する、請求項２２に記載の方法。
前記マンノシダーゼ酵素が、マウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．に由来するα−１，２−マンノシダーゼである、請求項２２に記載の方法。
少なくとも１つの酵素が、該酵素の触媒ドメインと細胞標的化シグナルペプチドとの間の融合タンパク質を形成することによって局在化される、請求項２０に記載の方法。
前記融合タンパク質が、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントとのインフレームのライゲーションによって形成される少なくとも１つの遺伝子構築物によってコードされる、請求項２５に記載の方法。
前記触媒ドメインが、ＧｎＴ　Ｉ、ＧｎＴ　ＩＩ、ＧｎＴ　ＩＩＩ、ＧｎＴ　ＩＶ、ＧｎＴ　Ｖ、ＧｎＴ　ＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびＳＴからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、ここで、該触媒ドメインが、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的酵素の平均至適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に至適ｐＨを有するか、または５．１〜８．０の間のｐＨで最適な活性を有する、請求項２０に記載の方法。
前記核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子、ＵＤＰ−ガラクトース輸送因子、ＧＤＰ−フコース輸送因子、ＣＭＰ−シアル酸輸送因子、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１以上の酵素をコードする、請求項２０に記載の方法。
前記宿主が、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送因子を発現する、請求項２０に記載の方法。
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼまたはＧＤＰ特異的ジホスファターゼを発現する、請求項２０に記載の方法。
糖タンパク質上のＮ−グリカンに対して１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない下等真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、ＤＮＡライブラリーに由来する少なくとも１つのグリコシル化酵素を発現する、遺伝的に混合された細胞集団を生成するために該ライブラリーで宿主細胞を形質転換する工程を包含し、ここで、該ライブラリーは、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、これらのうち少なくとも１つが、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントにインフレームでライゲーションされた、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含む、方法。
前記混合された細胞集団から、所望のヒト様グリコシル化表現型を生成する細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
請求項３２に記載の方法であって、前記選択が、以下：（ａ）質量分析法；（ｂ）液体クロマトグラフィー；（ｃ）蛍光活性セルソーター、分光光度計、蛍光定量計またはシンチレーションカウンターを使用する細胞の特徴づけ；（ｄ）所望のオリゴ糖部分に特異的な親和性を有するレクチンまたは抗体に対する宿主細胞の曝露；ならびに（ｅ）糖、抗体およびレクチンからなる群より選択される細胞傷害性分子または放射性分子に対する細胞の曝露、からなる群より選択される１以上の方法によって、グリコシル化タンパク質または単離されたＮ−グリカンを分析する工程を包含する、方法。
前記ライブラリーが、以下：遺伝子シャッフリング、インビトロの変異誘発およびエラー傾向性のポリメラーゼ連鎖反応、から選択される技術に予め供せられた、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子構築物を含む、請求項３１に記載の方法。
酵素活性をコードする前記ＤＮＡフラグメントが、マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、およびＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される活性を有し、ここで、前記細胞標的化シグナルペプチドが、該酵素を小胞体、シスゴルジ、中間ゴルジおよびトランスゴルジからなる群より選択される宿主細胞の細胞小器官に優勢に局在させる、請求項３１に記載の方法。
前記ライブラリーが、グリコシル化酵素をコードする少なくとも１つの野生型遺伝子を含む、請求項３１に記載の方法。
請求項１または３１に記載の方法によって生成される、宿主細胞。
請求項１または３１に記載の方法によって生成される、ヒト様糖タンパク質。
少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含むＤＮＡライブラリーであって、ここで、少なくとも１つの遺伝子構築物が、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントとインフレームでライゲーションされた、細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含む、ＤＮＡライブラリー。