CN115590017B - 一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法 - Google Patents

一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法，属于***冷冻技术领域。本发明在***冷冻前采用含二甲双胍的培养液进行预处理；然后将预处理后的***置于20％乙二醇溶液中进行平衡处理，再置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，并投入液氮冷冻保存。本发明的方法可有效降低猪***线粒体温度，降低细胞膜流动性，且不影响孤雌激活后胚胎发育，可恢复解冻后***线粒体温度，有效改善解冻存活率，提高冷冻***利用效率，具有广泛的应用前景。

Description

一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法
技术领域
本发明属于***冷冻技术领域，特别是涉及一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法。
背景技术
猪成熟***冷冻对种质资源库建立及生物医学研究均具有重要意义。目前，猪***冷冻存活率较低，不同实验室冻存效率差异较大(10％-70％)，冷冻效率无法满足生产需要，仍停留在科研阶段，亟需开发有效的超低温保存方法。
近年来，人们发现脂肪颗粒(Lipid Droplets,LDS，脂肪以颗粒形式存在)的大量沉积可造成***抗冻性降低。不同物种***脂滴含量不同，例如猪***中的平均脂肪含量为161ng，将近是羊***(89ng)的2倍，牛***(63ng)的3倍，小鼠(4ng)和人***的40倍。在恒温动物中，细胞线粒体的产能一部分以ATP的形式参与细胞代谢，另一部分则以热能的形式释放来维持细胞的温度。当线粒体呼吸链负荷运转时，线粒体的温度可达50℃左右，这也意味着利用超低温冷冻技术进行冷冻时，对线粒体的损伤要远远大于其它细胞器。
二甲双胍是2型糖尿病的一线治疗药物，可通过增加外周组织，如肝脏及骨骼肌的葡萄糖吸收以维持葡萄糖稳态，因此广泛应用于胰岛素抵抗及2型糖尿病的治疗中。体内实验发现二甲双胍可逆转高脂饮食小鼠的超重、高糖、高脂及葡萄糖不耐受性。二甲双胍对***线粒体温度的影响及其在冷冻技术的应用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种能够有效降低线粒体温度的化合物，并评估其在***冷冻中的作用，以期降低冷冻解冻过程中剧烈温度变化对线粒体的损伤，从而提高解冻后***质量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明目的之一是提供一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法，包括如下步骤：
(1)***冷冻前采用培养液进行预处理，所述培养液含二甲双胍；
(2)将预处理后的***置于20％乙二醇(EG)溶液中进行平衡处理，然后置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，然后将***置于Cryotop载杆前端，每根Cryotop可冷冻10-20枚***(根据操作人员熟练程度进行调整)投入液氮冷冻保存。
进一步地，所述***的制备过程，包括如下步骤：
采集卵巢表面直径3～8mm卵泡中的卵丘-***复合体(COCs)，用TL-HEPES-0.3％BSA液清洗三次，再在体外成熟液中成熟培养42～44h至MⅡ期；成熟的COCs移入含0.1％透明质酸酶的H199液中迅速消化，除去颗粒细胞获得体外成熟的***。
其中，体外成熟液为含2.78mM D-葡萄糖，0.91mM丙酮酸钠，0.57mM半胱氨酸，50mg/mL链霉素，75mg/mL青霉素，10％猪***(从猪卵巢卵泡内吸取的液体)，0.01U/mL促卵泡激素(FSH)，0.01U/mL促***(LH)，10ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)的TCM-199液。
H199液为含0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠盐(HEPES-NA)，5mM NaHCO3，50mg/mL链霉素，65mg/mL青霉素的TCM-199液。
进一步地，步骤(1)所述培养液为Tyrode's lactate(TL)-HEPES-0.3％BSA液。
TL-HEPES-0.3％BSA液含6.662g/L NaCl，0.238g/L KCl，0.168g/L NaHCO3，0.046g/L KH2PO4，2.383g/L HEPES，0.022g/L丙酮酸钠，1.121g/L乳酸钠，2.186g/L山梨醇，0.01g/L链霉素，0.05g/L青霉素，0.102g/L MgCl2·6H2O，0.294g/L CaCl2·2H2O，3g/LBSA。
进一步地，所述培养液含有400μM二甲双胍。
进一步地，步骤(1)所述预处理的时间为1h。
进一步地，步骤(2)所述平衡处理的时间为3min。
进一步地，步骤(2)所述玻璃化冷冻液为EDFS40，所述冷冻的时间为30～40s。
本发明的有益效果：
本发明通过二甲双胍降低线粒体温度，从而提高***冷冻效果，其中，二甲双胍可显著降低***线粒体温度，降低细胞膜流动性，且不影响***发育能力。冷冻前经二甲双胍预处理可改善解冻后***脂滴超微结构，有助于线粒体温度恢复，提高解冻后存活率，有效提高冷冻***利用率，对***冷冻保存效率的提高具有重要意义和广泛应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同浓度二甲双胍处理对猪***线粒体温度的影响，A图为线粒体温度探针MTY荧光染色图，B图为荧光强度比较；
图2为二甲双胍对猪***发育的影响，A图为***成熟及孤雌胚胎发育图，B、C图为对照组与二甲双胍处理组卵裂率及囊胚发育率比较；
图3为二甲双胍处理对猪***质膜流动性的影响，A图为质膜漂白后荧光在不同时间的恢复情况，B图为质膜漂白后荧光强度随时间的变化情况；
图4为二甲双胍对猪冷冻***存活的影响，A为新鲜***FDA染色；B为常规冷冻解冻***FDA染色；C为二甲双胍预处理后冷冻解冻***FDA染色；
图5为二甲双胍对解冻***线粒体温度的影响，A图为解冻***中MTY探针荧光染色，B图为对照组、冷冻组、二甲双胍预处理冷冻组MTY荧光强度比较；
图6为二甲双胍对解冻***脂滴超微结构的影响，A为新鲜***；B为常规冷冻解冻***；C为二甲双胍预处理后冷冻解冻***；
图7为不同浓度鱼藤酮处理对猪***线粒体温度的影响，A图为经不同浓度鱼藤酮处理的***MTY荧光染色；B图为不同组别***MTY荧光强度比较；
图8为鱼藤酮处理对猪***发育的影响，A图为不同组别***体外成熟、卵裂及囊胚图片；B、C图为对照组及鱼藤酮处理组卵裂率及囊胚率比较；
图9为不同浓度寡霉素处理对猪***线粒体温度的影响，A图为经不同浓度寡霉素处理的***MTY染色；B图为不同组别***MTY荧光强度比较；
图10为不同浓度寡霉素处理对猪***发育的影响，A图为经不同浓度寡霉素处理的***成熟、卵裂及囊胚发育图；B、C图为不同处理组卵裂率及囊胚率比较；
图11为寡霉素处理对猪冷冻***存活的影响，A为新鲜***FDA染色；B为常规冷冻解冻***FDA染色；C为寡霉素处理后冷冻解冻***FDA染色；
图12为不同浓度UK5099处理对猪***线粒体温度的影响，A图为经不同浓度UK5099处理的***MTY染色；B图为不同组别***MTY荧光强度比较；
图13为不同浓度UK5099处理对猪***发育的影响，A图为经不同浓度UK5099处理的***成熟、卵裂及囊胚发育图；B、C图为不同处理组卵裂率及囊胚率比较；
图14为UK5099处理对猪冷冻***存活的影响，A为新鲜***FDA染色；B为常规冷冻解冻***FDA染色；C为UK5099预处理后冷冻解冻***FDA染色。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
以下实施例中，***的制备过程为：
从屠宰场收集新鲜卵巢(均来自青年母猪)，于30～37℃下0.9％(m/v)NaCl溶液(含75μg/mL青霉素G、50μg/mL链霉素)中2h内带回实验室，采集卵巢表面直径3～8mm卵泡中的卵丘-***复合体(COCs)，用TL-HEPES-0.3％BSA洗3次，挑选有卵丘细胞3层以上且胞质均匀的COCs置于四孔板(Nunc，Denmark，Φ60mm)中培养。在5％CO2的空气、38.5℃、饱和湿度的二氧化碳培养箱(Thermo Electron Corporation,USA)中，置于体外成熟液中成熟培养42～44h至MⅡ期。成熟的COCs移入含0.1％透明质酸酶的H199液(含0.01M HEPES，0.01M HEPES-NA，5mM NaHCO3，50mg/mL链霉素，65mg/mL青霉素的TCM-199液)中迅速消化，除去颗粒细胞获得体外成熟的***。
实施例1
1、二甲双胍预处理：
将***分别置于含100μM、200μM、400μM、800μM二甲双胍的培养液中预处理1h；
培养液是TL-HEPES-0.3％BSA，其中含有400μM二甲双胍。
(1)***线粒体温度检测
在TL-HEPES-0.3％BSA液中添加100nM Mito Thermo Yellow染料并在37℃，5％CO2培养箱预热15min，将***移入预热后的染液于培养箱中15min，之后用TL-HEPES-0.3％BSA清洗3次，每次10min。用激光共聚焦显微镜检测荧光强度，并分析线粒体温度变化。
二甲双胍可有效降低线粒体产热，图1为不同浓度(100μM、200μM、400μM、800μM)二甲双胍处理1h对线粒体温度的影响，MTY是一种线粒体温度特异性探针，其荧光强度与线粒体温度成反比，如图1所示，400μM二甲双胍处理1h可使线粒体温度显著下降(P<0.05)。
(2)***孤雌激活
挑选排出第一极体且胞质均匀的成熟***进行孤雌激活。将***用预热的电激活液清洗3次，然后将***置于充满激活液的电极之间，电激活液为0.3M甘露醇，0.05mM CaCl2，0.1mM MgCl2，0.4％(m/v)BSA。用电融合仪(Fujihira Industry Co.Ltd，Tokyo，Japan)进行电激活，电场强度65V/mm，直流脉冲时程80μs，脉冲次数1次。激活后的***在含有5ug/mL细胞松弛素B和10ug/mL放线菌酮的PZM-3中于38.5℃，5％CO2培养4h后，置于平衡4h的PZM-3中继续培养，并记为0h，在48h和144h后分别观察卵裂率和囊胚率。如图2所示，二甲双胍预处理组卵裂率、囊胚发育率均与对照组无显著差异，表明二甲双胍不影响孤雌激活后胚胎发育。
(3)***膜流动性检测
***膜流动性采用荧光漂白恢复实验(FRAP)进行检测，首先将***置于含有细胞膜荧光探针Dil的TL-HEPES-0.3％BSA液中，在37℃，5％CO2培养箱入孵10min，孵完再用TL-HEPES-0.3％BSA液洗3遍，再将卵置于共聚焦小皿中，在共聚焦显微镜上进行FRAP实验。首先选择一个漂白区域，设置漂白前采集荧光图像3张，每张间隔5s；漂白荧光强度为100％，漂白时间为7.93s；漂白后恢复3min，每间隔5s采集一张荧光图像。对漂白区域荧光强度进行统计分析，并将数据进行归一化处理。如图3所示，二甲双胍预处理影响细胞膜流动性，使其流动性显著下降(P<0.05)。
2、冷冻及解冻：
将室温调至25±1℃，使试验用具及试剂得到充分平衡。试验在37℃恒温台上操作。将***移入20％EG溶液中平衡3min后，然后移入玻璃化溶液EDFS40中平衡30～40s，然后将***置于冷冻载体Cryotop上，每根Cryotop可冷冻10-20枚***(根据操作人员熟练度进行调整)，然后直接投入液氮冷冻保存(整个过程不超过1min)。解冻时，将Cryotop由液氮中取出后，立即将含有***部分直接浸入置于恒温台上(37℃)的含有1M蔗糖的PBS(含20％FBS)中作用1min，然后依次转移至含0.5M、0.25M蔗糖的PBS(含20％FBS)中作用3min、3min，再放入含20％FBS的PBS液恢复5min，然后用成熟培养液清洗三遍后置于成熟培养液恢复2小时备用。
(1)***解冻存活检测
***存活率检测采用FDA(二乙酸荧光素)染色法。将收集的***置于含2.5ug/mL FDA的TL-HEPES-0.3％BSA液中孵育1min，然后用TL-HEPES-0.3％BSA液洗涤3次，将***放在培养皿上，使用荧光显微镜进行观察统计，带有绿色荧光的***视为存活。
FDA染色法判断***解冻存活情况如图4和表1所示，400μM二甲双胍预处理1h后冷冻***存活率较传统冷冻组显著升高(81.36％vs.71.85％，P<0.05)。
表1二甲双胍预处理对猪***解冻存活率的影响
(2)二甲双胍对解冻***线粒体温度的影响
进一步分析二甲双胍预处理对解冻***线粒体温度的影响，如图5所示，常规冷冻***解冻后线粒体温度显著下降(P<0.01)，而二甲双胍预处理组***解冻后线粒体温度显著高于常规冷冻解冻组(P<0.01)。
(3)***脂滴超微结构观察
***经过DPBS洗涤，在含2.5％(m/v)戊二醛的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液中4℃固定过夜，经DPBS洗涤后，1％锇酸(四氧化锇)固定，DPBS洗涤，30％、50％、70％、80％、90％、100％丙酮梯度脱水，环氧树脂SPURR包埋-聚合，LKB-V型切片机切片(超薄切片厚度50nm(钻石刀)，电镜铜网上进行醋酸铀-柠檬酸铅的双染色，将载有样本的铜网放于玻璃皿中烘干待过夜，使用透射电子显微镜(TEM)，在80kv下采集图像(HITACHI,New Bio-TEM H-7500,Japan)。
如图6所示，常规冷冻组***脂滴体积大、数量多，二甲双胍预处理组***脂滴大小与新鲜组接近。
上述结果表明400μM二甲双胍可显著降低线粒体温度，降低冷冻-解冻过程中剧烈温度变化对线粒体功能的损伤，有利于解冻后***线粒体温度的恢复及细胞存活。
对比例1
鱼藤酮(Rotenone)对猪***线粒体温度及发育的影响
***采集、体外成熟、孤雌激活、线粒体温度检测等方法同实施例1，不同的是，将二甲双胍改为不同浓度的鱼藤酮(0.3μM、0.6μM、1μM)处理。
(1)鱼藤酮对猪***线粒体温度的影响
如图7所示，1μM鱼藤酮处理1h可使***线粒体温度显著降低(P<0.01)。
(2)鱼藤酮对***发育的影响
如图8所示，与对照组相比，鱼藤酮处理组孤雌激活后的卵裂率(P<0.01)、囊胚发育率(P<0.01)均显著下降。
对比例2
寡霉素(Oligomycin)对猪***线粒体温度的影响及其在***冷冻中的应用
***采集、体外成熟、线粒体温度检测、孤雌激活、冷冻解冻、***存活判定等同实施例1，不同的是，将二甲双胍改为不同浓度(0.5μM、1.5μM、2.5μM)的寡霉素处理。
(1)寡霉素对猪***线粒体温度的影响
如图9所示，0.5μM、1.5μM、2.5μM寡霉素处理1h均可使***线粒体温度显著降低(P<0.01)。
(2)寡霉素对***发育的影响
如图10所示，与对照组相比，不同浓度寡霉素处理组孤雌激活后的卵裂率均显著低于对照组(P<0.01)，1.5μM(P<0.01)、2.5μM(P<0.01)处理组囊胚发育显著低于对照组，0.5μM处理组囊胚发育率也较对照组明显下降。
(3)寡霉素预处理对冷冻***存活率的影响
新鲜组、冷冻组、寡霉素预处理组***解冻存活分析如图11所示，如表2可知，寡霉素预处理组***解冻存活率显著低于常规冷冻组(29.79％vs.71.85％，P<0.05)。
表2寡霉素预处理对猪***解冻存活的影响
对比例3
UK5099对猪***线粒体温度的影响及其在***冷冻中的应用
***采集、体外成熟、***线粒体温度检测、孤雌激活、冷冻解冻、***存活判定等同实施例1，不同的是，将二甲双胍预处理改为不同浓度(0.5μM、1μM、2μM、4μM)的UK5099处理。
(1)UK5099对猪***线粒体温度的影响
如图12所示，1μM(P<0.05)及2μM UK5099(P<0.01)处理1h均可使***线粒体温度显著降低。
(2)UK5099对***发育的影响
如图13所示，与对照组相比，1μM、2μM UK5099处理组孤雌激活后的卵裂率、囊胚率均与对照组无明显差异，但卵裂率、囊胚率随UK5099处理浓度的增加呈下降趋势。
(3)UK5099对冷冻***存活的影响
新鲜组、冷冻组、UK5099预处理组***解冻存活分析如图14所示，如表3可知，UK5099预处理冷冻组***解冻存活率与常规冷冻组无明显差异(67.50％vs.71.85％，P>0.05)。
表3 UK5099预处理对猪***解冻存活率的影响
综上，上述结果表明虽然鱼藤酮、寡霉素、UK5099具有调节线粒体温度的生物学作用，但鱼藤酮具有较大的细胞毒性，寡霉素可显著降低冷冻***存活率，UK5099不能有效改善冷冻***存活率，而400μM二甲双胍可显著降低猪***线粒体温度，降低细胞膜流动性，冷冻保存前经该浓度二甲双胍预处理可改善猪***脂滴超微结构，提高解冻后***线粒体温度，有效改善冷冻解冻***存活率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种通过降低线粒体温度提高***冷冻效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)***冷冻前采用培养液进行预处理，所述培养液含二甲双胍；
(2)将预处理后的***置于20％乙二醇溶液中进行平衡处理，然后置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，并投入液氮冷冻保存；
所述步骤(1)中培养液为TL-HEPES-0.3％BSA液；
所述培养液含有400μM二甲双胍；
所述步骤(1)中预处理的时间为1h；
所述步骤(2)中平衡处理的时间为3min；
所述步骤(2)中玻璃化冷冻液为EDFS40，所述冷冻的时间为30～40s。
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