JP5731827B2 - 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ - Google Patents

下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ Download PDF

Info

Publication number
JP5731827B2
JP5731827B2 JP2010549709A JP2010549709A JP5731827B2 JP 5731827 B2 JP5731827 B2 JP 5731827B2 JP 2010549709 A JP2010549709 A JP 2010549709A JP 2010549709 A JP2010549709 A JP 2010549709A JP 5731827 B2 JP5731827 B2 JP 5731827B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
antibody
host cell
nucleic acid
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2010549709A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2011514807A (ja
Inventor
チヤ，トンシン
ビルト，ステフアン
Original Assignee
グライコフィ， インコーポレイテッド
グライコフィ， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by グライコフィ， インコーポレイテッド, グライコフィ， インコーポレイテッド filed Critical グライコフィ， インコーポレイテッド
Publication of JP2011514807A publication Critical patent/JP2011514807A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5731827B2 publication Critical patent/JP5731827B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries

Description

（発明の背景）
（１）発明の分野
本発明は、酵母及び糸状真菌などの下等真核生物の表面上に組換えタンパク質又はタンパク質ライブラリーをディスプレイするための方法に関する。この方法は、ライブラリー中のタンパク質のアレイから所望の特性を有する特定のタンパク質を同定するために、下等真核生物中の組換えタンパク質のライブラリーをスクリーニングするのに有用である。前記方法は、下等真核生物中に抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングするのに特に有用である。
（２）関連技術の記述
モノクローナル抗体の発見は、ヒトｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡライブラリーからの抗体の選択を誘導するために抗体を作製するためのハイブリドーマ技術から進化してきた。これは、１つには、抗体の効力を向上させるために、抗体の結合親和性及び特異性の改善を加工したいという願望から生じた。このため、コンビナトリアルライブラリースクリーニング及び選択法は、タンパク質の認識特性を変化させるための一般的なツールとなった（Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２７７９−２７８２（１９９７）：Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５））。インビトロで抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングすることができれば、抗体抗原相互作用の強さ及び特異性に対する改善された調節が約束される。
抗体ライブラリーを構築及びスクリーニングするために最も広く用いられている技術は、バクテリオファージ外被タンパク質へのポリペプチド融合物として目的のタンパク質を発現させ、その後、固定化された又は可溶性のビオチン化されたリガンドへの結合によってスクリーニングされるファージディスプレイである。融合物は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）と称され、ファージの先端に３から５コピー存在する微量な外被タンパク質に対して最も一般的に作製される。このようにして構築されたファージは、表現型（ディスプレイされた抗体の結合活性）及び遺伝子型（その抗体をコードする遺伝子）の両方を１つのパッケージ中に保有するコンパクトな遺伝的「ユニット」と考えることができる。ファージディスプレイは、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、短いペプチド及び酵素に対して首尾よく適用されてきた（Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４３１−４３６（１９９５）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）；Ｌａｄｎｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４２６−４３０（１９９５）；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）；Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２８−５１（１９９６）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＆ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１１ １３−１１１７（１９９３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：５２−６８（１９９６））。
所望の結合特性を有する抗体は、「パニング」と呼ばれる工程において、固定化された抗原への結合によって選択される。非特異的抗体を有するファージは洗浄によって除去され、次いで、結合したファージが溶出され、イー・コリの感染によって増幅される。このアプローチは、多くの抗原に対する抗体を作製するために適用されてきた。
それにも関わらず、ファージディスプレイは幾つかの欠点を有している。抗体ファージディスプレイライブラリーのパニングは強力な技術であるが、広く首尾よく適用することを制約する幾つかの固有の困難を有している。例えば、幾つかの真核生物性の分泌タンパク質及び細胞表面タンパク質は、細菌細胞中では利用できない、グリコシル化又は大規模なジスルフィド異性化などの翻訳後修飾を必要とする。さらに、ファージディスプレイの性質のため、リガンド結合タンパク質の定量的及び直接的な区別を行えない。例えば、極めて強い抗体抗原相互作用を破壊するために必要とされる溶出条件は、ファージ粒子を非感染性とするのに十分にファージ粒子を変性させるほど一般に激烈であるので（例えば、低ｐＨ、高い塩）、パニングによって、極めて高い親和性の抗体（Ｋｄ＜＝１ｎＭ）を単離することは困難である。さらに、固体表面への抗原の物理的固定化が必要とされるために、多くの人為的な障害が生じる。例えば、高い抗原表面密度は、真の親和性を覆い隠してしまう結合力効果を導入する。また、物理的な係留は抗原の翻訳及び回転的エントロピーを低下させて、抗体結合に際してより小さなＤＳをもたらし、その結果、可溶性抗原に対する結合親和性と比べて、結合親和性を過大評価し、混合及び洗浄操作における変動に由来する大きな効果が再現性の困難さをもたらす。さらに、ファージ粒子当り１つ又は２、３個の抗体が存在するに過ぎないので、大幅な確率的変動が導入され、類似の親和性を有する抗体間での区別が不可能となる。例えば、効率的な識別のために、６倍又はそれ以上の親和性の差がしばしば必要とされる（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＆ Ｗｅｉｌｌ，’９３）。最後に、集団は、より急速に増殖する野生型ファージによって追い抜かれ得る。特に、ｐＩＩＩはファージ生活環に直接関与しているので、幾つかの抗体又は結合された抗原の存在は結合されたファージの増幅を妨害し、又は遅延させる。
幾つかの細菌細胞表面ディスプレイ法が開発されている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０４４４−１０４４８（１９９３）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４（１９９７））。しかしながら、原核生物の発現系の使用は、時折、予測不能な発現の偏りを導入する（Ｋｎａｐｐｉｋ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：８１−８９（１９９５）；Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１９０７−１１９１１（１９９５）；Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６９：２８４８７−２８４９３（１９９４））し、細菌の莢膜の多糖層は、このような系を小分子リガンドへ限定する拡散障壁を与える（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：２８５−３１５（１９９６））。イー・コリは、高分子結合反応を立体的に妨害し得るリポ多糖層又は莢膜を有している。実際、細菌のカプセルの推定される生理的機能は、細胞を免疫系から遮蔽するために、細胞膜への高分子の拡散を制約することである（ＤｉＲｉｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．４７：４８１−５３２，（１９７８））。イー・コリの周辺質は、抗体断片の折畳み及び集合のための区画として進化してきたわけではないので、イー・コリ中での抗体の発現は、通例、極めてクローン依存性であり、幾つかのクローンは良好に発現するが、他のクローンは全く発現しない。このような変動は、イー・コリの表面上に発現された抗体ライブラリー中の全ての可能な配列が概ね等しく呈示されていることに関して懸念をもたらす。さらに、ファージディスプレイは、抗体の特異性又は親和性に影響を及ぼし得るグリコシル化などの幾つかの重要な翻訳後修飾を許容しない。循環しているモノクローナル抗体の約１／３は、可変領域中に１つ又はそれ以上のＮ結合型グリカンを含有している。幾つかの事例において、可変領域中のこれらのＮ−グリカンは抗体機能において重要な役割を果たし得ると考えられている。
酵母細胞などの真核細胞に依拠する別の選択系の開発によって、新しい治療薬の発見が促進される。抗体をディスプレイするＢ細胞と抗体をディスプレイする酵母細胞間の構造は類似しているので、糸状ファージを用いて得られるものより、インビボ親和性成熟の緊密な類似を与える。さらに、酵母を用いて得られる増殖培養の容易さ及び遺伝的操作のたやすさのため、巨大な集団に突然変異を導入し、素早くスクリーニングすることが可能となる。哺乳動物体内の状態と比べて、酵母培養に関して、結合及び選択の物理化学的条件は、ｐＨ、温度及びイオン強度の幅広い範囲内で変化し得、抗体操作実験における自由度がさらに増大する。コンビナトリアルタンパク質ライブラリーをスクリーニングするための酵母表面ディスプレイ系の開発が記載されている。
米国特許第６，３００，０６５号及び同第６，６９９，６５８号は、コンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングするための酵母表面ディスプレイ系及び抗体抗原解離速度論に基づくスクリーニングの開発を記載している。前記系は、酵母細胞表面係留タンパク質に融合された抗体又は抗体断片を発現するベクターで酵母を形質転換し、抗体又は抗体断片の変異体の多様化された集団を作製するために突然変異導入を使用し、次いで、所望の強化された表現型特性を有する抗体又は抗体断片を産生する細胞をスクリーニングし、選択することを基礎としている。米国特許第７，１３２，２７３号は、様々な酵母細胞壁係留タンパク質及び細胞壁上に外来酵素又はポリペプチドを固定化するために酵母細胞壁係留タンパク質を使用する表面発現系を開示している。
米国出願公開２００５／０１４２５６２号は、インビボでの相同的組換えを介して、抗体などのタンパク質の高度に多様なライブラリーを作製し、酵母中でのツーハイブリッド法を用いて、タンパク質、ペプチド及び核酸標的に対してこれらのライブラリーをスクリーニングするために提供された組成物、キット及び方法を開示する。標的タンパク質又はペプチドに対して検査タンパク質のライブラリーをスクリーニングするための方法は、酵母細胞中で検査タンパク質のライブラリーを発現させること（各検査タンパク質は、その配列がライブラリー内で変動する第一のポリペプチドサブユニット、第一のポリペプチドとは独立にライブラリー内でその配列が変動する第二のポリペプチドサブユニット並びに第一及び第二のポリペプチドサブユニットを連結するリンカーペプチドから構成される融合タンパク質である。）、検査タンパク質を発現する酵母細胞中で１つ又はそれ以上の標的核酸タンパク質を発現させること（標的融合タンパク質の各々は、標的ペプチド又はタンパク質を含む。）、並びにレポーター遺伝子がその中で発現されている酵母細胞を選択すること（レポーター遺伝子の発現は、標的融合タンパク質への検査融合タンパク質の結合によって活性化される。）を含む。
興味深いのは、Ｆｌｏ１ｐアンカー系を用いたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞表面ディスプレイ系の構築を開示する「Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：９８９−９９３（２００６）」；Ｆｌｏ１ｐアンカー系を用いたピキア・パストリス細胞表面ディスプレイ系中でのアデノレギュリンのディスプレイを開示する「Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：１０３−１０８（２００７）」；エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−アグルチニンのＣ末端半分に融合されたＫ．ラクティス黄色酵素のディスプレイを開示する「Ｍｅｒｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：４１８−４２１（２００４）」；α−アグルチニンを用いたピキア・パストリスの表面上へのタンパク質のディスプレイを開示する「Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔ２３， Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ８−１１， ２００６）」；特定のレクチンを結合するタンパク質を同定するために酵母ディスプレイ系を使用することを開示する「Ｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ＢＶＢＭＢ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ， Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２，２００５）」；その後に検出手段を用いて同定することができる分泌産物を結合する捕捉部分を細胞表面に結合させることによって、細胞によって分泌される産物を基礎として細胞を同定するための方法を開示する米国特許第７，１６６，４２３号；特定の抗体を発現する細胞を同定するために、細胞の表面にプロテインＡ又はＧを付着させるためのビオチン−アビジン系を開示する米国特許出願公開２００４／０２１９６１１号；捕捉部分及びタンパク質が細胞の表面上にディスプレイされる複合体を形成する、表面捕捉部分及びタンパク質を細胞中に発現させることによって（捕捉部分とタンパク質は、細胞の表面上にディスプレイされる複合体を形成する。）、特定のタンパク質を発現する細胞を同定する方法を開示する米国特許第６，９１９，１８３号；細胞中で発現される細胞表面係留タンパク質に融合された結合タンパク質からなる融合タンパク質を用いて、酵母又は真菌の表面上にタンパク質を固定化する方法を開示する米国特許第６，１１４，１４７号である。
米国特許第６，３００，０６５号明細書 米国特許第６，６９９，６５８号明細書 米国特許第７，１３２，２７３号明細書 米国特許出願公開２００５／０１４２５６２号明細書 米国特許第７，１６６，４２３号明細書 米国特許出願公開２００４／０２１９６１１号明細書 米国特許第６，９１９，１８３号明細書 米国特許第６，１１４，１４７号明細書
Ｅｌｌｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、１９９７年、ｐｐ．２７７９−２７８２ Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９、１９９５年、ｐｐ．９４−１２３ Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６、１９９５年、ｐｐ．４３１−４３６ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１９９７年、ｐｐ．６２−７０ Ｌａｄｎｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３、１９９５年、ｐｐ．４２６−４３０ Ｌｏｗｍａｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０、１９９１年、ｐｐ．１０８３２−１０８３８ Ｍａｒｋｌａｎｄ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７、１９９６年、ｐｐ．２８−５１ Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１１、１９９３年、ｐｐ．１３−１１１７ Ｗａｎｇ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７、１９９６年、ｐｐ．５２−６８ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＆ Ｗｅｉｌｌ，’９３ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１９９３年、ｐｐ．１０４４４−１０４４８ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１９９７年、ｐｐ．２９−３４ Ｋｎａｐｐｉｋ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８、１９９５年、ｐｐ．８１−８９ Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、１９９５年、ｐｐ．１１９０７−１１９１１ Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６９、１９９４年、ｐｐ．２８４８７−２８４９３ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０、１９９６年、ｐｐ．２８５−３１５ ＤｉＲｉｅｎｚｏ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．４７、１９７８年、ｐｐ．４８１−５３２ Ｔａｎｉｎｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２、２００６年、ｐｐ．９８９−９９３ Ｒｅｎ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５、２００７年、ｐｐ．１０３−１０８ Ｍｅｒｇｌｅｒ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３、２００４年、ｐｐ．４１８−４２１ Ｊａｃｏｂｓ他、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔ２３， Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ８−１１， ２００６） Ｒｙｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ＢＶＢＭＢ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ， Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２，２００５）
癌の治療、腫瘍の画像化、敗血症などのヒト疾病の診断及び治療のために抗体を操作することの潜在的な応用は、広範囲にわたる。これらの応用に関しては、高い親和性（すなわち、Ｋｄ ＜１０ｎＭ）及び高い特異性を有する抗体が極めて望ましい。これまでに論述されている伝聞的証拠及び論理的な考察は、ファージディスプレイ又は細菌ディスプレイ系はナノモル濃度を下回る親和性の抗体を一貫して作製する可能性はないことを示唆する。現在まで、酵母ディスプレイがこの間隙を埋めており、従って、商業的及び医学的に極めて重要な鍵となる技術であるべきである。
効果的なタンパク質ディスプレイが、タンパク質の組換え産生のための、特に、モノクローナル抗体の組換え産生のための遺伝的に強化された酵母株の開発を促進する改善されたベクター及び宿主細胞株に基づいて、ピキア・パストリス（Ｐｈｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母及び糸状真菌に対するさらなるタンパク質発現系の開発が望ましい目標である。
（発明の要旨）
本発明は、検出のために接近可能な形態で、下等真核生物の表面上にタンパク質を発現及びディスプレイするための方法を提供する。この方法を蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）と組み合わせることによって、別の分子に対する増加した若しくは減少した親和性、触媒活性、変化した特異性又は条件的結合を有するタンパク質を発現する細胞を選択するための手段が得られる。前記方法は、酵母又は糸状真菌などの下等真核生物中に抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングするのに特に有能である。
さらなる態様において、第一の結合部分への下等真核生物細胞表面係留タンパク質の遺伝的融合及び前記第一の結合部分に対結合することができる第二の結合部分への目的のポリペプチドの遺伝的融合の方法が提供される。遺伝的融合物を含む核酸は、宿主細胞中に形質転換される。遺伝的融合物の発現は、第一の結合部分が第二の結合部分を結合し、細胞表面に目的のタンパク質を提示する細胞表面係留タンパク質を提供する。目的のタンパク質が抗体である場合、免疫系中のＢ細胞による抗体の細胞表面ディスプレイを効果的に模倣することができる。
さらなる態様において、第一の及び第二の結合部分は、安定なタンパク質複合体の形成に関与しているホモ二量体又はヘテロ二量体タンパク質の配列に由来するアダプターペプチドである。特定の実施形態において、これらのペプチドは、ＧＡＢＡＢ−Ｒ１／ＧＡＢＡ−Ｒ２受容体を含むコイルドコイルペプチドなどの二量体複合体を形成することができるコイルドコイルペプチドである。
本発明の一態様において、第一のアダプターペプチドへＮ末端又はＣ末端が融合された宿主細胞壁結合タンパク質と及び前記第一のアダプターペプチドへ対結合することができる第二のアダプターペプチドへそのＣ末端が融合されている検査されるべきタンパク質とを発現する核酸で下等真核生物宿主細胞を形質転換すること；第一の標識で宿主細胞を標識すること（第一の標識は、検査されるべきタンパク質を発現する宿主細胞と会合又は結合し、及び検査されるべきタンパク質を発現していない宿主細胞と会合又は結合しない。）；第一の標識が会合している宿主細胞を選択すること；並びに前記第一の標識を定量すること（前記第一の標識の高い出現は、検査されるべきタンパク質が所望の結合特性を有していることを示唆し、及び前記第一の標識の低い出現は、検査されるべきタンパク質が検査されるべきタンパク質が所望の結合特性を有していないことを示唆する。）を含む、所望の結合特性を有するタンパク質を選択するための方法が提供される。
本発明のさらなる実施形態は、以下の工程をさらに含む。第二の標識で宿主細胞を標識すること（第二の標識は、検査されるべき及び核酸によってコードされるタンパク質に融合されたエピトープタグを発現する宿主細胞と会合又は結合し、並びに核酸によってコードされるエピトープタグを発現していない宿主細胞と会合又は結合していない。）；第二の標識を定量すること（第二の標識の出現は、宿主細胞表面上の検査されるべきエピトープタグ付加タンパク質の多数の発現されたコピーを示唆する。）；及び第二の標識の出現に対して標準化された第一の標識の出現を測定するために、第二の標識の定量と第一の標識の前記定量を比較すること（第二の標識の出現と比較した第一の標識の高い出現は、検査されるべきタンパク質が所望の結合特性を有することを示唆する。）。
本発明の別のさらなる実施形態は、以下の工程を含む。検査されるべきタンパク質への結合に関して、第一の標識と競合する第三の標識で宿主細胞を標識すること；酵母細胞を第一の標識で標識すること；前記第一の標識を定量すること；宿主細胞を第二の標識で標識すること；第二の標識を定量すること；及び第二の標識の出現に対して標準化された第一の標識の出現を測定するために、第二の標識の定量と第一の標識の前記定量を比較すること（第二の標識の出現と比較した第一の標識の低い出現は、検査されるべきタンパク質が所望の結合特性を有することを示唆する。）。
本発明の一実施形態において、第一の標識はリガンドに付着された蛍光性標識であり、及び第二の標識は抗体に付着された蛍光性標識である。標識が傾向性（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｔ）である場合には、定量工程は、フローサイトメトリー又は共焦点蛍光顕微鏡によって実施される。
本発明の別の態様は、本発明の方法を実施するためのベクター、第一のアダプターペプチドに融合された細胞壁結合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、及び第一のアダプターペプチドに対結合することができる第二のアダプターペプチドにそのＣ末端が融合された目的のタンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。この態様のさらなる実施形態は、宿主細胞中の目的のタンパク質に融合されたポリペプチドエピトープタグを発現するための手段を含む。さらなる実施形態は、細胞壁結合タンパク質がＧＰＩ係留された細胞表面係留タンパク質、特定の実施形態において、ＳＥＤ１タンパク質であることを提供する。
さらに、単一の停止コドンが抗体配列をコードする核酸と第二のアダプターペプチドをコードする核酸との間に配置されているベクターを用いて、上に記載されているように実施される、所望の結合特性を有する抗体及びその断片を選択する方法が提供される。ベクターは、第二のアダプターペプチドへ対結合することができる第一のアダプターペプチドへ、そのＮ末端又はＣ末端が融合された宿主細胞壁結合タンパク質を発現する核酸を含む下等真核生物宿主細胞中に形質転換される。ベクターから転写されたｍＲＮＡの翻訳は、停止コドンを通じて翻訳の通過読み取りを増加させる条件下で実施され、これにより、第二のアダプターに融合されている抗体の産生をもたらす。第一の標識での宿主細胞の標識（第一の標識は、所望の抗体を発現する宿主細胞へ会合又は結合し、及び所望の抗体を発現していない宿主細胞に会合又は結合しない。）によって、所望の抗体を産生する宿主細胞の同定及び選択が可能となる。所望抗体を産生する宿主細胞が選択及び単離された後、宿主細胞は、停止コドンを通じて翻訳の通過読み取りの増加をもたらさない条件下で増殖される。第二の条件下で、宿主細胞は、第二のアダプターペプチドに融合されていない抗体又はその断片を産生する。
従って、特定の態様において、（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；（ｂ）前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されたタンパク質をコードする核酸で前記宿主細胞を形質転換すること（タンパク質の変異体の多様化された集団をコードする宿主細胞の複数を作成するために、突然変異誘発が使用される。）；（ｃ）宿主細胞の表面上にディスプレイされているタンパク質へ特異的に結合し、及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていないタンパク質に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに（ｄ）前記検出手段が結合している宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上のタンパク質に結合された前記検出手段の存在は、前記タンパク質が下等真核生物細胞表面上にディスプレイ可能であることを示唆する。）を含む、下等真核生物宿主細胞表面上へのディスプレイ可能性に関してタンパク質を選択する方法が提供される。
さらなる態様において、（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；（ｂ）少なくとも１つの宿主細胞が細胞表面上に所望のタンパク質をディスプレイしていると考えられる宿主細胞の複数を作製するために、細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分にそれぞれ融合されているタンパク質をコードする核酸によって宿主細胞を形質転換すること；（ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望のタンパク質に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに（ｄ）所望のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離することを含む、宿主細胞の表面上に所望のタンパク質をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法が提供される。
さらなる態様において、（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；（ｂ）抗体の前記重鎖及び軽鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること（重鎖（ＨＣ）は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されおり、タンパク質の変異体の多様な集団をコードする宿主細胞の複数を作製するために、突然変異誘発が使用される。）；（ｃ）宿主細胞の表面上にディスプレイされている抗体へ特異的に結合し、及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていない抗体に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに（ｄ）前記検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上の抗体に結合された前記検出手段の存在は、前記宿主細胞が抗体を産生することを示唆する。）を含む、抗体を産生する方法が提供される。
さらなる態様において、（ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；（ｂ）少なくとも１つの宿主細胞が細胞表面上に所望の抗体をディスプレイしていると考えられる宿主細胞の複数を作製するために、抗体の前記重鎖及び軽鎖（ＬＣ）をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること（重鎖は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されている。）；（ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望の抗体に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに（ｄ）所望の抗体をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離することを含む、宿主細胞の表面上に所望の抗体をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法が提供される。
さらに、（ａ）その表面上に特異的な結合対の一員をディスプレイしている下等真核生物宿主細胞のライブラリーを準備すること、（特異的な結合対の一員は、合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片であり、前記ライブラリーは、（ｉ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備すること；（ｉｉ）特異的結合対の一員の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備すること（前記特異的結合対の一員の前記遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して偏っており、及び前記特異的結合対の一員は前記細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分を含む。）；（ｉｉｉ）前記下等真核生物細胞中で核酸配列の前記ライブラリーを発現させること（各特異的結合対の一員は、前記下等真核生物宿主細胞の前記表面にディスプレイされている。））；（ｂ）１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を目的の抗原と結合させることによって、目的の抗原に対して結合特異性を有する１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を選択すること（このようにして選択された各特異的結合対の一員は下等真核生物宿主細胞上にディスプレイされている。）を含む、特異的結合対の一員（該特異的結合対の一員は、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、及び目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片である。）を作製する方法が提供される。
さらなる態様において、特異的結合対の一員が合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインがフレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初の２つの超可変ループが実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインが変化されたＣＤＲ３ループを有する。さらなる態様において、変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインは他のＣＤＲループ中に変異を含有する。さらなる態様において、それぞれのヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループは無作為配列のものである。さらなる態様において、ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループは公知の標準構造のものであり、及び無作為配列要素を取り込む。結合対の一員は、完全サイズの若しくは完全な抗体又は一本鎖Ｆｖ抗体断片などの断片であり得る。
先述されている方法の何れか１つのさらなる態様において、第一の結合部分は第一のアダプターペプチドであり、並びに第二の結合部分は第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドは特異的な対相互作用を行うことができる。特定の態様において、前記第一及び第二のアダプターペプチドは特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである。さらなる態様において、コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用を行うことができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−２Ｒ２サブユニットである。
先述されている方法の何れか１つのさらなる態様において、細胞表面係留タンパク質はＧＰＩタンパク質、例えば、α−アグルチニン、ＣＷｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択されるＧＰＩタンパク質である。特定の態様において、細胞表面係留タンパク質はＳｅｄ１ｐである。
さらなる態様において、下等真核生物は、ピキア・パストリスなどの（但し、これに限定されない。）酵母である。
先述されている方法の何れか１つのさらなる態様において、捕捉部分及びタンパク質をコードする核酸の発現は恒常的であり、又は捕捉部分及びタンパク質をコードする核酸の発現は同時に誘導され、又は捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現は逐次に誘導される。
先述されている方法の何れか１つのさらなる態様において、宿主細胞中の糖タンパク質のＯ−グリコシル化は調節される。すなわち、Ｏ−グリカンの占有及びマンノース鎖の長さは低下する。酵母などの下等真核生物宿主細胞において、Ｏ−グリコシル化は、１つ若しくはそれ以上のタンパク質Ｏ−マンノシル転移酵素（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシル転移酵素遺伝子）（ＰＭＴ）をコードする遺伝子を除去することによって、又は１つ若しくはそれ以上のＰｍｔｐ阻害剤を含有する培地中で宿主を増殖させることによって調節することができる。さらなる態様において、宿主細胞はＰＭＴをコードする遺伝子の１つ又はそれ以上の除去を含み、宿主細胞は１つ又はそれ以上のＰｍｔｐ阻害剤を含む培地中で培養される。Ｐｍｔｐ阻害剤には、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されない。使用することができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン」−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸及び５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン」−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。さらなる態様において、宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼの分泌を誘導するシグナルペプチドを有するα−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸をさらに含む。別の態様において、１つ又はそれ以上の内在性マンノシル転移酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は、分泌されたα−１，２−マンノシダーゼ及び／若しくはＰＭＴ阻害剤の付与と組み合わせることができ、又は分泌されたα−１，２−マンノシダーゼ及び／若しくはＰＭＴ阻害剤の付与に代えることができる。
先述されている方法の何れか１つのさらなる態様において、宿主細胞には、β−マンノシル転移酵素遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３及びＢＭＴ４）の１つ若しくはそれ以上を欠失若しくは崩壊させることによって（米国特許出願公開２００６／０２１１０８５号参照）、又は干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを用いて、β−マンノシル転移酵素の１つ若しくはそれ以上をコードするＲＮＡの翻訳を失わせることによって、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作された下等真核生物細胞（例えば、ピキア・パストリスなどの酵母）がさらに含まれる。
本明細書中の方法の何れか１つのさらなる態様において、宿主細胞には、ホスホマンノシル転移酵素遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂの一方又は両方を欠失又は崩壊させることによって、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作されており（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号及び同第７，２５９，００７号参照）、さらなる態様において、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失若しくは崩壊させること又は干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを用いて、ホスホマンノシル転移酵素の１つ若しくはそれ以上をコードするＲＮＡの翻訳を除去することも含み得る下等真核生物細胞（例えば、ピキア・パストリスなどの酵母）がさらに含まれ得る。
さらなる態様において、宿主細胞は、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカン及び高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾されており、複合Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡＣ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、ハイブリッドＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、並びに高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される。
定義
本明細書中に別段の定義がなければ、本発明に関して使用される科学及び技術用語及び表現は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。一般に、関連して使用されている命名法並びに本明細書中に記載されている生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリッド形成の技術は、本分野において周知のものであり、一般的に使用されている。本発明の方法及び技術は、別段の記載がなければ、本分野において周知の慣用的方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている一般的な及びより具体的な様々な参考文献中に記載されているように、一般に実施される。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２， ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９９０）； Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）； Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．， Ｆｒｅｅｈｏｌｄ， ＮＪ； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ＶｏＩ Ｉ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ ＩＩ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）； Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）」を参照されたい。
本明細書中に挙げられている全ての公報、特許及び他の参考文献の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有するものと理解しなければならない。
本明細書において使用される、「Ｎ−グリカン」及び「糖型」という用語は互換的に使用され、Ｎ結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基へのアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって付着されているものを表す。Ｎ結合型糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上に見出される主な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖基のプロセッシングは、小胞体の管腔内で同時翻訳的に起こり、Ｎ結合型糖タンパク質に関しては、ゴルジ装置中で継続する。
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、及び「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す。）という共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノース（ｔｒｉａｍｍｎｏｓｅ）コア」、「五糖コア」又は「少量マンノースコア（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ ｃｏｒｅ）」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃΝＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、分岐成分（例えば、高マンノース、複合又はハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５つ又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、１，３マンノースアームに付着された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに付着された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを典型的に有する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸又は誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」又は「ＮｅｕＡｃ」（「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表し、及び「Ａｃ」はアセチルを表す。）で場合によって修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基も有し得る。複合Ｎ−グリカンは、「二分岐」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換も有し得る。複合Ｎ−グリカンは、「多重アンテナ式グリカン」としばしば称される「トリマンノースコア」上に複数のアンテナも有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６マンノースアーム上にゼロ又はそれ以上のマモースを有する。様々なＮ−グリカンは、「糖型」とも称される。
本明細書において使用される略号は、本分野で一般的に使用されるものであり、例えば、上記、糖の略号を参照されたい。他の一般的な略号には、全てペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を表す「ＰＮＧアーゼ」又は「グリカナーゼ」又は「グルコシダーゼ」が含まれる。
「作用可能に連結された」発現調節配列という用語は、目的の遺伝子を調節するために、発現調節配列が目的の遺伝子と隣接している連結及び目的の遺伝子を調節するために、トランスに又は距離を隔てて作用する発現調節配列を表す。
「発現調節配列」又は「制御配列」という用語は互換的に使用され、本明細書において使用される場合、それらが作用可能に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすために必要なポリヌクレオチド配列を表す。発現調節配列は、核酸配列の転写、転写後現象及び翻訳を調節する配列である。発現調節配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び所望である場合、タンパク質の分泌を増強する配列が含まれる。このような調節配列の性質は、宿主生物において異なる。原核生物では、このような調節配列には、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が一般に含まれる。「調節配列」という用語には、その存在が発現のために不可欠である全ての成分が最小限含まれ、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含まれ得る。
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換えベクターがその中に導入される細胞を表すものとする。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫をも表すことが意図されることを理解すべきである。突然変異又は環境的な影響の何れかのために、ある種の修飾がその後の世代で起こり得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があり得るが、本明細書中で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖された細胞株であり得、又は生きた組織若しくは生物中に存在する細胞であり得る。
「真核生物」という用語は、有核細胞又は生物を表し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核生物細胞を含む。
「下等真核生物細胞」という用語には、酵母及び糸状真菌が含まれる。酵母及び糸状真菌には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス）（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・マイニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）オガタエア・マイニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンデリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フサリウム・グラニューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピキア種、あらゆるサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、あらゆるクルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、あらゆるアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、あらゆるフサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれるが、これらに限定されない。
「特異的結合対」という用語は、天然由来の又は合成的に作製された分子の対（それぞれが、特異的結合対の一員である。）を表す。分子の対の一方は、特異的に結合するその表面上の領域又は空洞を有しており、従って、対が互いに特異的に結合するという特性を有するように、他方の分子の特定の空間的及び極性的構成と相補的と定義される。特異的な結合対の種類の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡである。
本明細書において使用される「抗体」、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン分子」という用語は互換的に使用される。各免疫グロブリン分子は、その特異的抗原への結合を可能とする特有の構造を有しているが、本明細書に記載されているように、全ての免疫グロブリンは同じ総合的構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を有しており、各対は１つの「軽」鎖（ＬＣ）（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（ＨＣ）（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。軽鎖（ＬＣ）は、κ又はλの何れかとして分類される。重鎖（ＨＣ）は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、それぞれ、抗体のイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして規定する。
軽鎖及び重鎖は、可変領域及び定常領域へ細分される（全般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９、Ｃｈ．７を参照。）。各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全な状態の抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性又は二重特異的抗体を除き、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、３つの超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖から得られるＣＤＲはフレームワークによって並置されており、特異的なエピトープへの結合を可能にする。この用語には、天然に存在する形態並びに断片及び誘導体が含まれる。この用語の範囲には、免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤが含まれる。この用語の範囲には、ＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４も含まれる。この用語は、最も広義に使用され、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む。）及び複数のエピトープ又は抗原に結合する抗体組成物を含む。この用語は、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む。））、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）及び抗体断片（ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部を含有し又は含有するように修飾されている限り）又はこれらの変形物を包含する。イムノアドヘシン（米国特許出願公開２００４０１３６９８６号）、Ｆｃ融合物及び抗体様分子などの、Ｆｃ領域のみを含む分子が、この用語に含まれる。あるいは、これらの用語は、Ｎ結合型グリコシル化部位を少なくとも含有する少なくともＦａｂ領域の抗体断片を表し得る。
「Ｆｃ」断片という用語は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する抗体の「断片結晶化された」Ｃ末端領域を表す（図１）。「Ｆａｂ」断片という用語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬドメインを含有する抗体の「断片抗原結合」領域を表す（図１参照）。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、微量に存在する可能性がある天然に存在する変異を除き、集団を構成する各抗体が同一である。）から得られた抗体を表す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して誘導される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通例含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各ｍＡｂは抗原上の単一の決定基に対して誘導される。その特異性に加えて、ハイブリドーマ培養によって合成することが可能であり、他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に均質な集団から取得されている抗体の性質を表し、何れかの特定の方法による抗体の産生を要求するものと解釈してはならない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５」によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製さ得、又は組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ他に対する米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）。
断片が標的分子への特異的結合能を保つ限り、「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語の範囲に属する「断片」という用語には、様々なプロテアーゼでの消化によって産生された断片、化学的切断及び／又は化学的解離によって産生された断片及び組換え的に産生された断片が含まれる。このような断片に属するのは、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である。本明細書の以下において、「免疫グロブリン」という用語には、「断片」という用語も含まれる。
免疫グロブリンには、種間キメラ及びヒト化抗体；抗体融合物；ダイアボディ（二重特異的抗体）、一本鎖ダイアボディ及びイントラボディ（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ， ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｉｎｃ．， １９９８参照）などのヘテロマー抗体複合体及び抗体融合物など、配列が修飾されているが、標的分子への特異的結合能を保つ免疫グロブリン又は断片がさらに含まれる。
「触媒性抗体」という用語は、生化学的反応を触媒することができる免疫グロブリン分子を表す。触媒性抗体は本分野において周知であり、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ他に対する米国特許出願第７，２０５，１３６号；同第４，８８８，２８１号；同第５，０３７，７５０号、Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩ他に対する米国特許出願第５，７３３，７５７号；同第５，９８５，６２６号及び同第６，３６８，８３９号に記載されている。
本明細書において使用される「実質的に〜からなる」という用語は、表記整数又は整数の群を含むことを表すが、表記されている整数に実質的に影響を与え又は表記されている整数を実質的に変化させる修飾又は他の整数を除外するものと理解される。Ｎ−グリカンの種に関して、表記されているＮ−グリカン「から実質的になる」という用語は、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接連結されているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてそのＮ−グリカンがフコシル化されているかどうかを問わず、Ｎ−グリカンを含むものと理解される。
本明細書において使用される「主に」という用語又は「主な」若しくは「主要である」などの変形語は、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ又はＨＰＬＣによって分析されるＰＮＧアーゼで糖タンパク質が処理された後の全ての中性Ｎ−グリカン及び放出されたグリカンのうち最高のモルパーセント（％）を有するグリカン種を意味するものと理解される。換言すれば、「主に」という用語は、特異的な糖型などの個別の実体が他のあらゆる個別の実体より高いモルパーセントで存在するものと定義される。例えば、組成物が４０モルパーセントの種Ａ、３５モルパーセントの種Ｂ及び２５モルパーセントの種Ｃからなる場合には、組成物は主に種Ａを含み、種Ｂが次に主要な種である。幾つかの宿主細胞は、マンノシルホスファートなどの中性Ｎ−グリカン及び帯電したＮ−グリカンを含む組成物を産生し得る。従って、糖タンパク質の組成物は、帯電した及び帯電していない又は中性のＮ−グリカンの複数を含み得る。本発明において、糖タンパク質の組成物は、主なＮ−グリカンが決定されている組成物中の中性のＮ−グリカンの全ての複数という文脈に属する。従って、本明細書において使用される「主なＮ−グリカン」は、組成物中の複数の中性Ｎ−グリカンの全てのうち、主なＮ−グリカンが特定の構造のものであることを意味する。
本明細書において使用されるフコース又はガラクトースなどの特定の糖残基「を実質的に含まない」という用語は、糖タンパク質組成物がこのような残基を含有するＮ−グリカンを実質的に欠如することを表すために使用される。純度に関して表現される実質的に存在しないとは、このような糖残基を含有するＮ−グリカン構造の量が１０％を超えない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満である（％は、重量又はモル％である。）ことを意味する。従って、本発明の糖タンパク質組成物中のＮ−グリカン構造の実質的に全ては、フコース若しくはガラクトース又は両方を含まない。
本明細書において使用される、フコース又はガラクトースなどの特定の糖残基の検出可能な量が何れの時点においてもＮ−グリカン構造上に存在しない場合、糖タンパク質組成物は、このような糖残基を「欠如する」又は「欠如している」。例えば、本発明の好ましい実施形態において、糖タンパク質組成物は、酵母（例えば、ピキア種、サッカロミセス種、クルイベロミセス種、アスペルギルス種）などの上に定義されている下等真核生物によって産生され、これらの生物の細胞はフコシル化されたＮ−グリカン構造を産生するために必要とされる酵素を有していないので、「フコースを欠如する」。従って、「フコースが実質的に存在しない」という用語は、「フコースを欠如する」という用語を包含する。しかしながら、ある時点で組成物がフコシル化されたＮ−グリカン構造を含有し、又は上に記載されているようなフコシル化されたＮ−グリカン構造の限定的な検出可能な量を含有する場合でさえ、組成物は、「実質的にフコースを含まない」ことがあり得る。
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体の排除（貪食作用）、Ｂ細胞による抗体産生及びＩｇＧ血清半減期などの、抗体及び抗体−抗原複合体の免疫系の細胞との相互作用及び様々な応答は、それぞれ、以下に定義されている。Ｄａｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４；Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ， １９９５， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４； Ｃｏｘ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ２００１， Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：３３９−３４５；Ｈｅｙｍａｎ，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８：１５７−１６１；及びＲａｖｅｔｃｈ， １９９７， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１２１−１２５。
図１は、目的の遺伝子−コイルドコイルペプチド融合物と二量体を形成する細胞壁アンカーの候補−コイルドコイルペプチド融合タンパク質を発現するように操作された酵母細胞を図解する。２つの融合タンパク質ヘテロ二量体は、人工のジスルフィド結合によってロックされている。 図２Ａは、シグナル配列、ＧＲ２コイルドコイルペプチド、Ｍｙｃタグ及びＧＰＩアンカー融合タンパク質からなる融合タンパク質発現構築物を図解する。図２Ｂは、ＳＥＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示しており、αアミラーゼシグナルペプチドには下線が付されており、ＧＲ２コイルドコイルペプチド配列は太字で記載されており、ｍｙｃ−タグ配列は斜字体で記載されており、エス・セレビシアエＳＥＤ１配列は通常のフォントで記載されている。 図２Ａは、シグナル配列、ＧＲ２コイルドコイルペプチド、Ｍｙｃタグ及びＧＰＩアンカー融合タンパク質からなる融合タンパク質発現構築物を図解する。図２Ｂは、ＳＥＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示しており、αアミラーゼシグナルペプチドには下線が付されており、ＧＲ２コイルドコイルペプチド配列は太字で記載されており、ｍｙｃ−タグ配列は斜字体で記載されており、エス・セレビシアエＳＥＤ１配列は通常のフォントで記載されている。 図３は、ＡＯＸ１プロモーターの調節下にある、ピキア・パストリスシグナル配列、ｍｙｃタグ、ＧＲ２コイルドコイルペプチド及び細胞壁係留タンパク質ＳＥＤからなる融合タンパク質を発現するｐＧＬＹ３０３３の地図を示している。 図４は、宿主の糖操作された酵母上に抗体又は抗体断片をディスプレイするためのコイルドコイルペプチドＧＲ１に融合されたモノクローナル抗体又は抗体断片を作製するために使用することができる３つの異なる構築物を図解する。構築物ＡはＦａｂ断片ディスプレイフォーマットであり、構築物Ｂは完全長抗体ディスプレイフォーマットであり、構築物Ｃは抗体重鎖とコイルドコイル（ＧＲ１）の間に停止コドンを含有する。ＡＯＸ１はＡＯＸ１プロモーターであり、ＳＳはシグナルペプチドであり、Ｌｃは軽鎖であり、ＴＴは転写終結配列であり、Ｆｄは重鎖可変断片であり、ＣＨ２及びＣＨ３は重鎖定常ドメインであり、ＨＡはヘマグルチニンであり、Ｈｉｓはポリヒスチジンであり、ＧＲ１はコイルドコイルペプチドである。 図５は、Ｆａｂ断片ディスプレイプラスミドｐＧＬＹ３９１５の地図を示している。 図６は、完全長抗体ディスプレイプラスミドｐＧＬＹ３９４１の地図を示している。 図７は、ヤギ抗ヒトＨ＋ＬＩｇＧＡｌｅｘａ４８８又は蛍光色素が連結された抗原によって、酵母細胞表面上のディスプレイされた抗体又は抗体断片の検出を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図８ＡからＪは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片を過剰発現し、異なるＧＰＩ細胞壁係留タンパク質ｐＧＬＹ３０１５（ＣＷＰ２）、ｐＧＬＹ３０３３（ＳｃＳＥＤ１）、ｐＧＬＹ３０３４（ＳｃＳＥＤ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３５（ＰｐＳＰＩ１）、ｐＧＬＹ３０３６（ＰｐＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３７（ＳｃＧＡＳ１）、ｐＧＬＹ３０３８（ＳｃＧＡＳ１末端切断）、ｐＧＬＹ３０３９（ＨｐＴＩＰ）及びｐＧＬＹ３０４０（ＨｐＴＩＰ末端切断）に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドの発現プラスミドで形質転換された、糖操作を施されたピキア・パストリスＹＧＬＹ４１０２の蛍光顕微鏡写真を示している。 図９ＡからＣは、異なるＦａｂ断片をディスプレイする糖操作されたピキア・パストリスの蛍光顕微鏡画像を示している。図９Ａ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗ＤＫＫ１Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞；図９Ｂ、ＳＥＤ１ＧＰＩ−タンパク質細胞壁アンカーを過剰発現していない、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２分泌Ｆａｂ断片；図９Ｃ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞。全てのこれらの細胞を抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識し、同じ露出時間を用いて写真を撮影した。 図９ＡからＣは、異なるＦａｂ断片をディスプレイする糖操作されたピキア・パストリスの蛍光顕微鏡画像を示している。図９Ａ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗ＤＫＫ１Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞；図９Ｂ、ＳＥＤ１ＧＰＩ−タンパク質細胞壁アンカーを過剰発現していない、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２分泌Ｆａｂ断片；図９Ｃ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞。全てのこれらの細胞を抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識し、同じ露出時間を用いて写真を撮影した。 図９ＡからＣは、異なるＦａｂ断片をディスプレイする糖操作されたピキア・パストリスの蛍光顕微鏡画像を示している。図９Ａ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗ＤＫＫ１Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞；図９Ｂ、ＳＥＤ１ＧＰＩ−タンパク質細胞壁アンカーを過剰発現していない、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２分泌Ｆａｂ断片；図９Ｃ、ピキア・パストリスＧＳ２．０抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞。全てのこれらの細胞を抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識し、同じ露出時間を用いて写真を撮影した。 図１０は、幾つかの蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）実験の重ね合わせを示している。抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片及びα−ＤＫＫ１Ｆａｂ断片を発現する蛍光標識された細胞を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。Ｘ軸：蛍光強度、Ｙ軸：分別された事象の数。抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片の蛍光平均は、抗ＤＫＫ１集団の蛍光平均より有意に高い。標識されていない細胞は左の方にあり、バックグラウンド検出の領域を表す。 図１１は、それぞれ、細胞表面にディスプレイされた抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を発現する異なる集団比のＦＡＣＳ分析を示す。１：１（赤）及び１：１０（緑）の抗Ｈｅｒ２：抗ＤＫＫ１の比のみが、２つの異なる集団の検出を可能とする。１：１００（青）及び１：１０００（茶色）のより高い比では、明瞭な亜集団は観察できない。 図１２ＡからＣは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を発現する細胞の分布を示している。図１２Ａ：減少する蛍光の５つの領域（Ｃ１からＣ５）から細胞を単離した。図１２Ｂは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を１：１の比として混合したときの、異なる蛍光強度を有する細胞の２つの集団を示している。図１２Ｃ：細胞の正体を決定するために、細胞を播種し、コロニーＰＣＲによって分析した。 図１２ＡからＣは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を発現する細胞の分布を示している。図１２Ａ：減少する蛍光の５つの領域（Ｃ１からＣ５）から細胞を単離した。図１２Ｂは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を１：１の比として混合したときの、異なる蛍光強度を有する細胞の２つの集団を示している。図１２Ｃ：細胞の正体を決定するために、細胞を播種し、コロニーＰＣＲによって分析した。 図１２ＡからＣは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を発現する細胞の分布を示している。図１２Ａ：減少する蛍光の５つの領域（Ｃ１からＣ５）から細胞を単離した。図１２Ｂは、抗Ｈｅｒ２及び抗ＤＫＫ１を１：１の比として混合したときの、異なる蛍光強度を有する細胞の２つの集団を示している。図１２Ｃ：細胞の正体を決定するために、細胞を播種し、コロニーＰＣＲによって分析した。 図１３は、ＦＡＣＳの３ラウンドにわたる、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片発現細胞の濃縮を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１４ＡからＦは、通過読み取り停止コドン構築物を用いた抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするピー・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４並びに抗Ｈｅｒ２完全長ｍＡｂをディスプレイするＹＧＬＹ６７２２の蛍光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析を示している。細胞は、ヤギ抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識する。Ｇ４１８は、停止コドンの通過読み取りを増加させる抗生物質である。ＹＧＬＹ６７３２は、バックグラウンド蛍光のレベルを測定するために使用された非ディスプレイ非標識酵母である。図１４からＥは、図１４Ｆ中に示されているＦＡＣＳ分析における試料ＡからＥの蛍光顕微鏡を示している。 図１５ＡからＤは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片（ＧＲ１に融合された重鎖）を同時発現し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＹＧＬＹ２６９６バックグラウンドの宿主細胞の幾つかのクローンの蛍光を示している。ＹＧＬＹ５１４９−１５秒の露出（図１５Ａ）、ＹＧＬＹ５１５２−１５秒の露出（図１５Ｂ）、ＹＧＬＹ６６９３−３０秒の露出（図１５Ｃ）及びＹＧＬＹ６６９４−３０秒の露出（図１５Ｄ）。 図１５ＡからＤは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片（ＧＲ１に融合された重鎖）を同時発現し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＹＧＬＹ２６９６バックグラウンドの宿主細胞の幾つかのクローンの蛍光を示している。ＹＧＬＹ５１４９−１５秒の露出（図１５Ａ）、ＹＧＬＹ５１５２−１５秒の露出（図１５Ｂ）、ＹＧＬＹ６６９３−３０秒の露出（図１５Ｃ）及びＹＧＬＹ６６９４−３０秒の露出（図１５Ｄ）。 図１５ＡからＤは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片（ＧＲ１に融合された重鎖）を同時発現し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＹＧＬＹ２６９６バックグラウンドの宿主細胞の幾つかのクローンの蛍光を示している。ＹＧＬＹ５１４９−１５秒の露出（図１５Ａ）、ＹＧＬＹ５１５２−１５秒の露出（図１５Ｂ）、ＹＧＬＹ６６９３−３０秒の露出（図１５Ｃ）及びＹＧＬＹ６６９４−３０秒の露出（図１５Ｄ）。 図１５ＡからＤは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片（ＧＲ１に融合された重鎖）を同時発現し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＹＧＬＹ２６９６バックグラウンドの宿主細胞の幾つかのクローンの蛍光を示している。ＹＧＬＹ５１４９−１５秒の露出（図１５Ａ）、ＹＧＬＹ５１５２−１５秒の露出（図１５Ｂ）、ＹＧＬＹ６６９３−３０秒の露出（図１５Ｃ）及びＹＧＬＹ６６９４−３０秒の露出（図１５Ｄ）。 図１６は、ヒト化されたシャペロン株ＹＧＬＹ２６９６の系統図を示している。 図１７ＡからＢは、Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞中のディスプレイされたＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖が適切に集合されたことを示している。軽鎖及び重鎖特異的な蛍光色素連結抗体で、Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞を標識した。フローサイトメトリー分析は、ディスプレイされたＦａｂ断片重鎖の発現がディスプレイされた軽鎖発現と合致することを示しており、Ｆａｂ断片の適切な集合を示唆する。図１７ＡＹＧＬＹ７７６２細胞（１Ｄ０５）；図１７ＢＹＧＬＹ７７６４細胞（１Ｈ２３）。 図１７ＡからＢは、Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞中のディスプレイされたＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖が適切に集合されたことを示している。軽鎖及び重鎖特異的な蛍光色素連結抗体で、Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞を標識した。フローサイトメトリー分析は、ディスプレイされたＦａｂ断片重鎖の発現がディスプレイされた軽鎖発現と合致することを示しており、Ｆａｂ断片の適切な集合を示唆する。図１７ＡＹＧＬＹ７７６２細胞（１Ｄ０５）；図１７ＢＹＧＬＹ７７６４細胞（１Ｈ２３）。 図１８は、抗原標識された細胞のフローサイトメトリー分析を示している。本明細書に記載されている方法を用いて、酵母表面上に抗ＣＤ２０及び抗ＰＣＳＫ９（１Ｄ０５及び１Ｈ２３）Ｆａｂ断片をディスプレイした。蛍光色素が連結された抗原及び包括的抗体検出によって、細胞を標識した。パネルＡは、標識の前に、１：１の比で混合した場合に、α―ＣＤ２０及び抗ＰＣＳＫ９（１Ｄ０５）がディスプレイされた細胞のプロファイルを示している。パネルＢでは、高親和性（１Ｄ０５）及び低親和性（１Ｈ２３）抗ＰＣＳＫ９Ｆａｂ断片を発現している細胞のフローサイトメトリープロファイルを同じ写真の中に重ね合わせた。 図１９ＡからＢは、抗原親和性に基づいて、Ｆａｂ断片をディスプレイする混合細胞集団のＦＡＣＳ分別を示している。図１９Ａは、蛍光色素で標識されたＰＣＳＫ−９抗原を使用した場合の、非結合Ｆａｂ断片（α−ＣＤ２０）をディスプレイする細胞から結合Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイする細胞のＦＡＣＳ分別を示している。１：１，０００、１：１０，０００及び１：１００，０００の１Ｄ０５：α−ＣＤ２０の比で細胞を混合し、次いで、最大２ラウンド分別した。図１９Ｂは、蛍光色素が標識されたＰＣＳＫ−９抗原を使用した場合の、低親和性Ｆａｂ断片（１Ｈ２３）をディスプレイする細胞から高親和性結合Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイする細胞のＦＡＣＳ分別を示している。細胞は、１：１０，０００及び１：１００，０００の１Ｄ０５：１Ｈ２３比で混合し、２ラウンドの分別を行った。 図１９ＡからＢは、抗原親和性に基づいて、Ｆａｂ断片をディスプレイする混合細胞集団のＦＡＣＳ分別を示している。図１９Ａは、蛍光色素で標識されたＰＣＳＫ−９抗原を使用した場合の、非結合Ｆａｂ断片（α−ＣＤ２０）をディスプレイする細胞から結合Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイする細胞のＦＡＣＳ分別を示している。１：１，０００、１：１０，０００及び１：１００，０００の１Ｄ０５：α−ＣＤ２０の比で細胞を混合し、次いで、最大２ラウンド分別した。図１９Ｂは、蛍光色素が標識されたＰＣＳＫ−９抗原を使用した場合の、低親和性Ｆａｂ断片（１Ｈ２３）をディスプレイする細胞から高親和性結合Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイする細胞のＦＡＣＳ分別を示している。細胞は、１：１０，０００及び１：１００，０００の１Ｄ０５：１Ｈ２３比で混合し、２ラウンドの分別を行った。 図２０は、軽鎖Ｃ１κ及びＧＲ２に融合された重鎖ＣＨ１をコードし、ピキア・パストリスのＴＲＰ２遺伝子坐へプラスミドを標的誘導するｐＧＬＹ３９５８の地図を示している。プラスミドｐＧＬＹ５１０８、ｐＧＬＹ５１１０及びｐＧＬＹ５１０７を作製するために、このプラスミドを使用した。 図２１は、１Ｄ０５抗ＰＣＳＫ９Ｆａｂ断片をコードするプラスミドｐＧＬＹ５１０８の地図を示している。 図２２は、１Ｈ２３抗ＰＣＳＫ９Ｆａｂ断片をコードするプラスミドｐＧＬＹ５１１０の地図を示している。 図２３は、抗ＣＤ２０Ｇｅｎｍａｂ抗体をコードするプラスミドｐＧＬＹ５１０７の地図を示している。
（発明の詳細な記述）
本発明は、下等真核生物宿主細胞（例えば、酵母又は糸状真菌細胞）などの真核生物宿主細胞の表面上にタンパク質の多様なライブラリーをディスプレイすることができるタンパク質ディスプレイ系を提供する。前記組成物及び方法は、発見（すなわち、スクリーニング）又は分子進化プロトコールに関して、タンパク質の集合物をディスプレイするのに特に有用である。前記方法の顕著な特徴は、目的のタンパク質が表面係留タンパク質に融合されている融合タンパク質として目的のタンパク質を発現させる必要なしに、宿主細胞の表面上に目的のタンパク質をディスプレイすることができるディスプレイ系を提供することである。
一般に、第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に結合することができる第二の結合部分に融合されたタンパク質をコードする核酸で前記宿主細胞を形質転換すること（タンパク質の変異体の多様化された集団をコードする宿主細胞の複数を作成するために、突然変異誘発が使用される。）；宿主細胞の表面上にディスプレイされているタンパク質へ特異的に結合し、及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていないタンパク質に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに前記検出手段が結合している宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上のタンパク質に結合された前記検出手段が存在することは、前記タンパク質が下等真核生物細胞表面上にディスプレイ可能であることを示唆する。）を含む、下等真核生物細胞表面上へのディスプレイ可能性に関してタンパク質を選択する方法が提供される。
第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；少なくとも１つの宿主細胞が細胞表面上に所望のタンパク質をディスプレイしていると考えられる宿主細胞の複数を作製するために、細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されているタンパク質をコードする核酸によって宿主細胞を形質転換すること；細胞表面上にディスプレイされた所望のタンパク質に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに所望のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離することを含む、宿主細胞の表面上に所望のタンパク質をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法がさらに提供される。
従って、図１に示されているように、前記系は少なくとも２つの成分を含む。第一の成分は、特定の実施形態において、第一の結合部分（特定の態様において、第二のアダプターペプチドへ対結合することができるアダプターペプチドを含む。）に融合された宿主細胞の表面に結合し又は組み込むことができる細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現するヘルパーベクターである。第一のアダプターペプチドが第二のアダプターペプチドと相互作用することができるように、第一の結合部分又はアダプターペプチドは、細胞外環境に露出された細胞表面係留タンパク質の末端に位置している。第二の成分は、目的のタンパク質を発現するベクター又は目的のタンパク質が選択されるべきそのライブラリー（例えば、抗体又はその断片を発現するベクターのライブラリー）である。ベクターは、第二のアダプターペプチドが目的のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合されている融合タンパク質として、目的のタンパク質を発現する。
両成分は、相同的組換えによって、宿主細胞のゲノム中に核酸を組み込むベクター中に提供することができる。相同的組換えは、二重クロスオーバー又は単一クロスオーバー相同的組換えであり得る。ロールイン単一クロスオーバー相同的組換えは、「Ｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５）」中に記載されている。各成分は、ゲノム中の同じ遺伝子坐又はゲノム中の別個の遺伝子坐に組み込まれ得る。あるいは、一方又は両方の成分は、宿主細胞中に一過性に発現させることができる。
前記方法は、所望の親和性又は結合力の抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ断片）、触媒性抗体を含む特定の酵素活性又は基質特異性を有する酵素、特定のリガンドに対する特定の特異性を有する受容体及び異種タンパク質に融合された抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質を含む（但し、これに限定されない。）融合タンパク質などの（但し、これらに限定されない。）所望の結合特性を有するタンパク質の選択を可能にする。一般に、前記方法は、そのＮ末端又はＣ末端が第一の結合部分（第二のアダプターペプチドへの対結合を可能にするアダプターペプチドなど）に融合された宿主細胞壁結合タンパク質を発現する第一の核酸とそのＮ末端又はＣ末端が第二の結合部分（第一のアダプターペプチドへの対結合を可能にするアダプターペプチドなど）に融合された検査されるべきタンパク質を発現する第二の核酸とで下等真核生物宿主細胞を形質転換することを含む。第一及び第二の核酸は、同じプロモーター又は別個に誘導可能な異なるプロモーターへ作用可能に連結され得る。好ましくは、目的のタンパク質は、細胞表面への分泌経路を通じた融合タンパク質のシャトルを促進する細胞性シグナルペプチドへ融合される。第一の核酸の発現は、細胞壁結合融合タンパク質の産生をもたらし、細胞壁結合融合タンパク質は細胞表面に輸送され、次いで、細胞外環境へ露出された第一の結合部分によって、細胞の表面に結合する。第二の核酸の発現は、目的のタンパク質の融合タンパク質の産生をもたらし、融合タンパク質は、分泌経路を通じて輸送され、細胞から分泌される。しかしながら、目的のタンパク質に融合された第二の結合部分は細胞壁結合タンパク質に融合された第一の結合部分との特異的相互作用を形成するので、目的のタンパク質の融合タンパク質は分泌されるにつれて、細胞表面上に保持される。
抗体及びＦａｂ断片を含む（但し、これらに限定されない。）特異的結合対の特定の一員を産生する細胞を同定及び選択するためのライブラリー法がさらに提供される。従って、さらなる態様において、特異的結合対の一員（該特異的結合対の一員は、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、及び目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片である。）であるタンパク質を作製する方法。この方法は、その表面上に特異的な結合対の一員をディスプレイしている下等真生物宿主細胞のライブラリーを準備すること（特異的な結合対の一員は合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片である。）を含む。ライブラリーは、第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備し、及び特異的な結合対の一員の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備することによって作製され、特異的結合対の一員の遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに関して偏っており、特異的な結合対の一員は細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分を含む。核酸配列の前記ライブラリーは、各特異的結合対の一員が前記下等真核生物細胞の前記表面にディスプレイされるように、下等真核生物細胞中で発現される。次いで、目的の抗原に対する結合特異性を有する１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を産生する細胞は、１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を目的の抗原と結合させることによって選択される。
さらなる態様において、特異的結合対の一員は、合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに前記合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインは、フレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域及びＶＨドメイン及びＶＬドメインの両者の最初の２つの超過変ループは実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインは変化されたＣＤＲ３ループを有する。さらなる態様において、変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインは他のＣＤＲループ中に変異を含有する。さらなる態様において、各ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループは無作為な配列のものである。さらなる態様において、ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループは、公知の標準構造のものであり、無作為な配列要素を取り込む。結合対の一員は完全なサイズの若しくは完全な抗体又は一本鎖Ｆｖ抗体断片などの断片であり得る。
目的の所望のタンパク質を発現する宿主細胞の検出は、目的のタンパク質と会合又は結合し及び目的のタンパク質を発現していない宿主細胞とは会合又は結合しない第一の標識で宿主細胞を標識することによって達成することができる。例えば、目的のタンパク質が抗体である場合には、第一の標識は目的の抗体によって特異的に認識される抗原であり得る。第一の標識と会合している宿主細胞を選択し、宿主細胞と会合した第一の標識の量を定量する。第一の標識が多量に出現することは、目的のタンパク質が望ましい結合特性を有することを示唆し、第一の標識が少量出現することは、目的のタンパク質が望ましい結合特性を有さないことを示唆する。
さらなる態様は、上記宿主細胞を第二の標識で標識する工程を含み、第二の標識は目的のタンパク質に融合されたエピトープタグを発現する宿主細胞と会合又は結合し、及びエピトープタグを発現しない宿主細胞と会合又は結合しない。宿主細胞と会合した第二の標識の量を定量する。宿主細胞と会合した第二の標識の量は、エピトープタグが付加された目的のタンパク質の発現された多数のコピーが宿主細胞表面上に多数存在することを示唆し、第一の標識の定量を第二の標識の定量と比較することによって、第二の標識の量に対して標準化された第一の標識の量を可能にし、第二の標識の発生に比べて高い第一の標識の出現は検査されるべきタンパク質が望ましい結合特性を有することを示唆している。
別の態様は、目的のタンパク質への結合に関して、第一の標識と競合する第三の標識で上記宿主細胞を標識する工程を含む。この態様において、宿主細胞は第一の標識で標識され、宿主細胞と会合した第一の標識の量を定量する。次いで、宿主細胞を第二の標識で標識し、宿主細胞と会合した第二の標識の量を定量する。第二の標識の出現に対して標準化された第一の標識の出現を測定するために、第二の標識の定量と第一の標識の前記定量の比較が行われ、第二の標識の出現と比較した第一の標識の低い出現は、目的のタンパク質が所望の結合特性を有することを示唆する。
さらなる態様において、第一の標識は目的のタンパク質に対して特異的なリガンドに付着された蛍光標識であり、第二の標識は目的のタンパク質に対して特異的な抗体に付着された蛍光標識である。標識が蛍光性である場合には、定量工程は、フローサイトメトリー又は共焦点蛍光顕微鏡によって実施される。さらなる態様において、第一の標識は目的のタンパク質に対して特異的なリガンドに付着された蛍光標識であり、目的のタンパク質を産生しない宿主細胞から目的のタンパク質を発現する宿主を分離するために、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）が使用される。
さらに、単一の停止コドンが抗体配列をコードする核酸と第二のアダプターペプチドをコードする核酸との間に配置されているベクターを用いて、上に記載されているように実施される、所望の結合特性を有する抗体及びその断片を選択する方法が提供される。ベクターは、第二のアダプターペプチドへ対結合することができる第一アダプターペプチドへ、そのＮ末端又はＣ末端が融合された宿主細胞壁結合タンパク質を発現する核酸を含む下等真核生物宿主細胞中に形質転換される。ベクターによってコードされるｍＲＮＡの翻訳は、停止コドンを通過する翻訳の読み取りを増加させる条件下で実施され、これにより、第二のアダプターに融合されている抗体を産生する。第一の標識での宿主細胞の標識（第一の標識は、所望の抗体を発現する宿主細胞へ会合又は結合し、及び所望の抗体を発現していない宿主細胞に会合又は結合しない。）によって、所望の抗体を産生する宿主細胞の同定及び選択が可能となる。所望抗体を産生する宿主細胞が選択及び単離された後、宿主細胞は、停止コドンを通過した翻訳の読み取りの増加をもたらす条件下で増殖される。第二の条件下で、宿主細胞は、第二のアダプターペプチドに融合されていない抗体又はその断片を産生する。
図４は、宿主細胞中に導入され、適切な条件下で宿主細胞が増殖されたときに、宿主細胞は、所望の完全長抗体を選択するために重鎖に融合された第二のアダプターペプチドを含む完全長抗体を産生することができるように、酵母などの下等真核生物中で使用するために設計された発現カセットＣを示している。しかしながら、産生条件下において、構築物は、重鎖が第二のアダプターペプチドに融合されていない抗体の産生を可能にする。従って、発現カセットＣは、第二のアダプターペプチドをコードする核酸を除去するために、抗体をコードする核酸を再度クローニングする必要性をなくす。発現カセットＣでは、第二のアダプターペプチドのＮ末端へ、Ｃ末端が融合された重鎖を含む融合タンパク質をコードする第二のＯＲＦは、重鎖をコードする核酸配列の末端と停止コドンの通過読み取りが誘導性である第二のアダプターペプチドをコードする核酸との間に単一の停止コドンをさらに含む。多くの条件下で、構築物から転写されたｍＲＮＡの翻訳は、主として、単一の停止コドンにおいて終結し、従って、第二のアダプターペプチドに融合されていない完全長抗体の産生をもたらす。しかしながら、抗生物質Ｇ４１８の存在下では、停止コドンを通過する翻訳の読み取りが増加する。しかしながら、抗生物質の存在下でさえ、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていない完全長抗体の発現が主な種である。一般に、翻訳の誤りは無作為なアミノ酸の挿入をもたらす。この割合的な通過読み取りは、完全長抗体の発現可能性を反映し得る。分泌された完全長抗体及び細胞表面に捕捉された完全長抗体融合物の両方をモニターすることによって、高産生宿主細胞に関してスクリーニングを行うことができる。従って、抗生物質の存在下において、完全長抗体の集団は、重鎖−アダプターペプチド融合タンパク質を含む。従って、所望の抗体に関して抗体のライブラリーをスクリーニングする場合、抗生物質の存在下で宿主細胞を増殖させる。重鎖−アダプターペプチド融合タンパク質を含む完全長抗体は、細胞の表面上の細胞表面係留タンパク質に融合された第一のアダプターペプチドへのヘテロ二量体化によって細胞表面に捕捉される。次いで、適切な検出手段によって、所望の抗体を検出することができる。しかしながら、重鎖がアダプターペプチドに融合されていない完全長抗体を作製する場合、所望の抗体を産生することが同定された宿主細胞を抗生物質の不存在下で増殖させる。発現カセットＣの後ろの前置物（ｐｒｅｍｉｓｅ）は、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていないＦａｂ断片を産生するように適合させることができ、酵素及び受容体タンパク質などの他のタンパク質種とともに使用するように適合させることができる。
Ｉ．アダプターの一般的な特徴
ディスプレイ系の構築におけるさらなる検討事項は、対相互作用をすることができる２つのアダプターをコードするアダプターペプチドの対を選択することである。アダプターペプチドの一方をコードする核酸はベクターによって担持される目的の外来タンパク質をコードする核酸とインフレームに挿入されるのに対して、他方をコードする核酸は、宿主細胞の外壁又は膜に付着することができる細胞表面係留タンパク質をコードする核酸とインフレームに融合される。「対相互作用」とは、２つのアダプターが相互作用し、互いに結合して、安定な複合体を形成することができることを意味する。安定な複合体は、宿主細胞の外側表面上に存在する目的のタンパク質の検出を可能にするのに十分に長期間存続しなければならない。複合体又は二量体は、形成の時点とディスプレイされたポリペプチドを検出する時点の間に存在し又は導入されるいかなる条件にも耐えることができなければならず、これらの条件は、実施されているアッセイ又は反応の関数である。安定な複合体又は二量体は、この定義の他の要件を満たす限り、不可逆的又は可逆的であり得る。従って、一過性の複合体又は二量体が反応混合物中で形成し得るが、自発的に解離し、遺伝子パッケージの外側表面上にディスプレイされた検出可能なポリペプチドを生成しない場合には、一過性の複合体又は二量体は安定な複合体には当らない。
第一及び第二のアダプター間での対相互作用は、共有又は非共有相互作用であり得る。非共有相互作用は、共有結合の形成をもたらさない全ての退出する安定な結合を包含する。非共有的相互作用の非限定的な例には、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス力、両親媒性ペプチドの立体的な噛み合いが含まれる。これに対して、共有的相互作用は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合、２つの炭素含有分子間のＣ−Ｃ結合、炭素とそれぞれ酸素又は水素含有分子間のＣ−Ｏ又はＣ−Ｈ及び酸素とホスファート含有分子間のＯ−Ｐ結合などの（但し、これらに限定されない。）共有結合の形成をもたらす。
ディスプレイ系の発現及びヘルパーベクターを構築するために利用可能なアダプターペプチドは、様々な源に由来し得る。一般に、安定な多量体の形成に関与するあらゆるタンパク質配列が候補アダプターペプチドである。従って、これらのペプチドは、あらゆるホモ多量体又はヘテロ多量体タンパク質複合体に由来し得る。代表的なホモ多量体タンパク質は、ホモ二量体受容体（例えば、血小板由来増殖因子ホモ二量体ＢＢ（ＰＤＧＦ）、ホモ二量体転写因子（例えば、Ｍａｘホモ二量体、ＮＦ−κＢｐ６５（ＲｅｌＡ）ホモ二量体）及び増殖因子（例えば、ニューロトロフィンホモ二量体）である。ヘテロ多量体タンパク質の非限定的な例は、プロテインキナーゼとＳＨ２ドメイン含有タンパク質（Ｃａｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）； Ｃａｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６０２９−２６０３２（１９９５））、ヘテロ二量体転写因子とヘテロ二量体受容体の複合体である。
現在使用されているヘテロ二量体転写因子は、α−Ｐａｌ／Ｍａｘ複合体及びＨｏｘ／Ｐｂｘ複合体である。Ｈｏｘは、胚形成の間に前方−後方軸のパターン形成に関与する転写因子の巨大なファミリーを占める。Ｈｏｘタンパク質は、保存された３つのαヘリックスホメオドメインを有するＤＮＡを結合する。特異的なＤＮＡ配列に結合するために、Ｈｏｘタンパク質はＰｂｘホメオドメインなどのヘテロ−パートナーの存在を必要とする。Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ他は、Ｈｏｘ−Ｐｂｘ複合体の形成がどのようにして起こり、この複合体がＤＮＡにどのように結合するかを理解するために、ＨｏｘＢ１−Ｐｂｘ１−ＤＮＡ三元複合体の２．３５オングストローム結晶構造を解明した。構造は、各タンパク質のホメオドメインがＤＮＡの反対側上の隣接する認識配列に結合することを示している。ヘテロ二量体化は、ＨｏｘＢ１のホメオドメインに対してＮ末端の６アミノ酸ヘキサペプチドとヘリックス３とヘリックス１及び２の間に形成されたＰｂｘ１中のポケット間に形成された接触を通じて起こる。Ｐｂｘ１ホメオドメインのＣ末端伸長は、ヘリックス１に対して圧縮してより大きな４ヘリックスのホメオドメインを形成するαヘリックスを形成する（Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ９６：５８７−５９７（１９９９）； Ｗｏｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：５２１−５３０）。
多数のヘテロ二量体受容体も同定されている。多数のヘテロ二量体受容体には、増殖因子（例えば、ヘレギュリン）、神経伝達物質（例えば、γ−アミノ酪酸）及び他の有機又は無機性小分子（例えば、ミネラルコルチコイド、グルココルチコイド）に結合するものが含まれるが、これらに限定されない。現在使用されているヘテロ二量体受容体は、核ホルモン受容体（Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ． Ａ ９３：４６０４−４６０７（１９９６））、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ２受容体複合体並びに受容体のオピオイド（Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：ＲＣ１１０（２０００））； Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３９９：６９７−７００（１９９９））、ムスカリン、ドーパミン、セロトニン、アデノシン／ドーパミン及びＧＡＢＡＢファミリーなどの（但し、これらに限定されない。）Ｇタンパク質共役型受容体である。公知のヘテロ二量体受容体の大半は、そのＣ末端配列がヘテロ二量体形成を媒介することが見出されている。
Ｌ及びＨ鎖の二量体化に関与している抗体鎖に由来するペプチドは、本ディスプレイ系を構築するためのアダプターとしても使用することができる。これらのペプチドには、Ｌ又はＨ鎖の定常領域配列が含まれるが、これらに限定されない。さらに、アダプターペプチドは、抗原結合部位配列及びその結合抗原に由来し得る。このような事例では、対の一方のアダプターは、対応する抗原残基を含有する他方のアダプターによって認識される（すなわち、安定に会合することができる）抗原結合部位アミノ酸残基を含有する。
遺伝子の巨大なファミリーに関する豊富な遺伝学的及び生化学的データに基づいて、当業者は、過度な実験操作なしに、本ディスプレイ系を構築するための適切なアダプターペプチドを選択及び取得することができる。
所望される場合、新規ヘテロ多量体タンパク質から得られる配列をアダプターとして使用することができる。このような状況では、ヘテロ多量体の形成に関与する候補ペプチドの同定は、過度の実験操作なしに、あらゆる遺伝学的又は生化学的アッセイによって決定することができる。さらに、コンピュータモデル化及び検索技術は、関連する遺伝子及び無関係の遺伝子中に出現する一般的なドメインの配列相同性に基づいて、ヘテロ多量体ペプチド配列の検出をさらに促進する。相同性検索を可能にするプログラムの非限定的な例は、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、Ｆａｓｔａ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｐａｃｋａｇｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｃｌｕｓｔｌａｗ、ＴＯＦＦＥＥ、ＣＯＢＬＡＴＨ、Ｇｅｎｔｈｒｅａｄｅｒ及びＭｅｇＡｌｉｇｎである。標的受容体又はそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含有するあらゆる配列データベースを配列分析のために使用することができる。一般的に使用されるデータには、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ及びＨＴＧＳが含まれるが、これらに限定されない。
ヘテロ二量体化配列に由来する本アダプターは、その物理的特性に基づいて、さらに性質決定することができる。現行のヘテロ二量体化配列は、ヘテロ二量体の主要な形成をもたらす、ホモ二量体の実質的な排除への対親和性を示す。好ましくは、主要な形成は、生理的な緩衝液条件及び／又は生理的な体温下での形成を可能にする少なくとも６０％のヘテロ二量体、より好ましくは、少なくとも８０％のヘテロ二量体、より好ましくは、８５から９０％のへテロ二量体、より好ましくは９０から９５％の間のへテロ二量体、さらに好ましくは、９６から９９％の間のヘテロ二量体を含有するヘテロ多量体プールをもたらす。本発明のある実施形態において、アダプター対のヘテロ二量体化配列の少なくとも１つは、生理的な緩衝液及び／又は生理的な体温中でホモ二量体を実質的に形成することができない。「実質的にできない」とは、単独で検査された場合に、選択したヘテロ二量体化配列が、「Ｋａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３−１３２６９（１９９９）」に詳述されているインビトロ沈降実験において又はインビボツーハイブリッド酵母分析（例えば、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａ；．，Ｎａｔｕｒｅ３９６：６７９−６８２（１９９８））において、ホモ二量体の検出可能な量を生じないことを意味する。さらに、個々のヘテロ二量体化配列は、宿主細胞中で発現させることができ、宿主細胞中のホモ二量体の不存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及び免疫沈降などの（但し、これらに限定されない。）様々なタンパク質分析によって示され得る。インビトロアッセイは、生理的な緩衝液条件下で、及び／又は好ましくは生理的体温で実施されなければならない。一般に、生理的な緩衝液は、塩の生理的濃度を含有し、約６．５から約７．８、好ましくは、約７．０から約７．５の範囲の中性ｐＨになるように調整される。
上記の物理特性を示すアダプター対の例は、ＧＡＢＡＢ−Ｒ１／ＧＡＢＡＢ−Ｒ２受容体である。これら２つの受容体は、生理的な条件（例えば、インビボ）下で及び生理的な体温で、ホモ二量体を実質的に形成することができない。Ｋｕｎｅｒ他及びＷｈｉｔｅ他による研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：７４−７７（１９９９））；Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６７９−６８２（１９９８））は、インビボでのＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２のヘテロ二量体化特異性を示した。実際に、Ｗｈｉｔｅ他は、このヘテロ二量体受容体対の排他的な特異性に基づいて、ＧＡＢＡＢ−Ｒ２を酵母細胞からクローニングすることができた。上記Ｋａｍｍｅｒｅ他によるインビトロ研究は、ＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２のＣ末端配列は何れも、生理的な体温でアッセイした場合に、生理的な緩衝液条件でホモ二量体を形成することができないことを示した。具体的には、Ｋａｍｍｅｒｅｒ他は、単独で検査した場合に、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２のヘテロ二量体化配列は、生理的な条件下で及び生理的な体温（例えば、３７℃）で、単量体の分子量において沈降することを、沈降実験によって示した。等モル濃度の量で混合された場合に、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２へテロ二量体化配列は、２つの配列のヘテロ二量体に対応する分子量において沈降する（Ｋａｍｍｅｒｅｒ他の表１参照）。しかしながら、ＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２のＣ末端配列をシステイン残基に連結すると、ジスルフィド結合の形成を介して、ホモ二量体が生じ得る。
アダプターは、その二次構造に基づいてさらに特徴付けることができる。本アダプターは、コイルドコイルへリックス構造を採る両親媒性ペプチドからなる。ヘリックスコイルドコイルは、タンパク質中の主なサブユニットオリゴマー化配列の１つである。一次配列分析によって、全てのタンパク質残基の約２から３％がコイルドコイルを形成することが明らかとなっている（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：１１７９−１１８９（１９９７））。よく性質決定されたコイルドコイル含有タンパク質には、細胞骨格ファミリー（例えば、α−ケラチン、ビメンチン）、細胞骨格運動ファミリー（例えば、ミオシン、キネシン及びダイネイン）、ウイルス膜タンパク質（例えば、エボラ又はＨＩＶの膜タンパク質）、ＤＮＡ結合タンパク質及び細胞表面受容体（例えば、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２）の一員が含まれる。本発明のコイルドコイルアダプターは、２つのグループ、すなわち、左巻き及び右巻きのコイルドコイルへ広く分類することができる。左巻きのコイルドコイルは、「ａｂｃｄｅｆｇ」と表記される７連リピートを特徴とし、無極性の残基の出現は、第１（ａ）及び第４（ｄ）位に優先的に位置する。これら２つの位置の残基は、他の鎖の残基と互いに組み合わさって、緊密に適合した疎水性の殻を形成する「ノブと穴」のジグザグパターンを典型的に構成する。これに対して、コイルドコイルの末端を覆う第２（ｂ）、第３（ｃ）及び第６（ｆ）位は、好ましくは、帯電した残基である。帯電したアミノ酸の例には、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性残基並びにアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミンなどの酸性残基が含まれる。ヘテロ二量体コイルドコイルを設計するのに適した非帯電又は無極性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニンが含まれるが、これらに限定されない。非帯電残基は通例疎水性コアを形成するが、全体的なヘリックスコイルドコイル構造を安定化させるために、コア位置にさえ帯電した残基を含むヘリックス間及びヘリックス内の塩橋を使用し得る（Ｂｕｒｋｈａｒｄ ｅｔ ａｌ（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１１６７２−１１６７７）。コイルドコイルの様々な長さを使用し得るが、本コイルドコイルアダプターは、好ましくは２から１０の７連リピートを含有する。より好ましくは、アダプターは、３つから８つの７連リピートを含有し、さらに好ましくは、４つから５つの７連リピートを含有する。
最適なコイルドコイルアダプターを設計する際には、ペプチドの二次構造を予想する様々な既存のコンピュータソフトウェアプログラムを使用することができる。コンピュータ分析の実例は、アミノ酸配列を既知の二本鎖コイルドコイルのデータベース中の配列と比較し、高い確率のコイルドコイルの連なりを予想するＣＯＩＬＳアルゴリズムを使用する（Ｋａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１３２６３４３２６９（１９９９））。
多量体形成に関与する多様なコイルドコイルを、本ディスプレイ系におけるアダプターとして使用することができる。本コイルドコイルは、ヘテロ二量体受容体に由来する。従って、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体１及び２に由来するコイルドコイルアダプターを包含する。一態様において、本コイルドコイルアダプターは、ＧＡＢＡＢ受容体１及びＧＡＢＡＢ受容体２のＣ末端配列を含む。別の態様において、本アダプターは少なくとも３０アミノ酸残基の２つの異なるポリペプチドから構成され、そのうち一方は、配列番号１３（ＧＲ１）に図示されている同等の長さの直鎖配列と実質的に同一であり、他方は、配列番号１１（ＧＲ２）に図示されている同等の長さの直鎖ペプチド配列と実質的に同一である。
本コイルドコイルアダプターの別のクラスは、ロイシンジッパーである。本分野において、ロイシンジッパーは、６つのアミノ酸によって互いに隔てられている４から５個のロイシン残基を含有する約３５アミノ酸の連なりとして定義されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｎｄ Ａｂｅｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：２４（１９８９））。ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子産物などの様々な真核生物のＤＮＡ結合タンパク質中に存在することが見出されている。これらのタンパク質では、ロイシンジッパーは、ロイシンジッパーを含有するタンパク質が安定なホモ二量体及び／又はへテロ二量体を形成し得る二量体化界面を作出する。２つの原癌遺伝子ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎによってコードされるタンパク質産物の分子的分析は、このような優先的なヘテロ二量体形成の事例を明らかにした（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６９５（１９８９）； Ｎａｋａｂｅｐｐｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５５：９０７（１９８８）； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１７３（１９８９））。Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域を含む合成ペプチドは、ヘテロ二量体形成を媒介することも示されており、合成ペプチドのアミノ末端は、それぞれ、分子間ジスルフィド結合を可能にするシステイン残基を含み、ヘテロ二量体の形成は、ホモ二量体化の実質的排除に対して起こる。
本発明のロイシンジッパーアダプターは、７連リピート（ロイシン−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６）ｎ（Ｘは、慣用の２０アミノ酸の何れかであり得るが、α−ヘリックス形成能を有するアミノ酸、例えば、アラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びリジンである可能性が最も高く、ｎは２又はそれ以上であり得るが、典型的には、ｎは３から１０であり、好ましくは、４から８、より好ましくは４から５である。）として知られる一般的な構造式を有する。現在、配列は、Ｆｏｓ又はＪｕｎロイシンジッパーである。
本明細書において、両配列が実質的なアミノ酸又はヌクレオチド配列の相同性を示せば、ペプチドの直鎖配列は、別の直鎖配列と「実質的に同一」である。一般に、実質的に同一な配列は、相同的領域の並置後、少なくとも約６０％互いに同一である。一般に、配列は少なくとも約７０％同一であり、より具体的には、配列は少なくとも約８０％同一であり、より具体的には、配列は少なくとも約９０％同一であり、より具体的には、配列は、少なくとも約９５％同一であり、さらに具体的には、配列は１００％同一である。
ポリペプチド配列が実質的に同一であるかどうかを決定する際に、比較されるポリペプチドの機能性を保持する配列が特に好ましい。機能性は、対するアダプターと安定な複合体を形成する能力及びアダプターとインフレームに融合されたポリペプチドのディスプレイを促進する能力などの様々な基準によって確立され得る。
本アダプターは、修飾されたロイシンジッパー及び本明細書中に例示されているポリペプチド配列と機能的に等価であるＧＡＢＡＢヘテロ二量体化ペプチド配列を含む。特定の実施形態において、対したアダプターに改善された安定性及び／又はディスプレイ効率を与える被修飾ポリペプチドが使用される。被修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するもの及びヘテロ二量体化特異性を著しく有害に変化させないアミノ酸の１つ又はそれ以上の欠失又は付加を有するものが含まれる。置換は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を変化又は修飾することから、対相互作用が維持される限りにおいて、領域を完全に再設計することまで多岐にわたり得る。アミノ酸置換が存在する場合、アミノ酸置換は、好ましくは、ペプチドの折り畳み又は機能的特性に対して悪影響を与えない保存的置換である。その中に保存的置換を施すことができる機能的に関連するアミノ酸の群は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。本発明のポリペプチドは、グリコシル化された又はグリコシル化されていない形態であり得、翻訳後修飾され得（例えば、アセチル化及びリン酸化）、又は合成的に修飾され得る（例えば、標識基の付着）。
１つのｃ−ｆｏｓジッパーは、ＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬ（配列番号１）である。１つのｃ−Ｊｕｎジッパーは、ＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬ（配列番号２）である。これらのジッパーのより長い形態は、以下のとおりである。ｃ−ｆｏｓ：ＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡ（配列番号３）。ｃ−Ｊｕｎ：ＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮ（配列番号４）。
別のｃ−Ｊｕｎジッパーも使用され得る。これらのジッパーは、ホモ二量体を形成する低下した能力を有するが、なおｃ−Ｆｏｓとヘテロ二量体を形成する（Ｓｍｅａｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２０９１−２１００）。
低下したヘテロ二量体化能力を有する幾つかのｃ−Ｊｕｎジッパーには、以下のものが含まれる。
ＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＦＮＭＬＲＥＱＦＡＱＬ（配列番号５）；
ＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＦ（配列番号６）；
ＬＥＥＫＶＫＴＦＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＦ（配列番号７）；
ＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＨＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬ（配列番号８）。
本発明のアダプター配列は、慣用の組換えクローニング法を用いて、及び／又は化学合成によって得ることができる。十分に確立された制限及び連結技術を用いて、様々なＤＮＡ源から適切なアダプター配列を切り出し、それぞれ、発現及びヘルパーベクターを作製するために、外来遺伝子配列及び外側表面配列とインフレームに組み込むことができる。
好ましくは、第二のアダプター配列は、得られた外来性融合ポリペプチド上に構造的な妨害が存在する場合、構造的な妨害を最小限に抑えるように、発現ベクター中に挿入される。第一のアダプターは外来性遺伝子配列の５’又は３’に融合させることができるのに対して、図４は、アダプターペプチド配列（すなわち、ＧＡＢＡＢ受容体１由来のヘテロ二量体化配列）が外来遺伝子配列の３’末端へインフレームに融合されている構築物を図示する。
同様に、第一のアダプターペプチド配列は、細胞表面係留タンパク質の完全性が不確定でない位置において、第二のベクター中に挿入される。アダプター配列は、コード領域を破壊せずに、外側表面配列の５’又は３’に融合することができる。図２は、アダプター配列（すなわち、ＧＡＢＡＢ受容体２に由来するヘテロ二量体化配列）が細胞表面係留タンパク質ＳＥＤ１の５’末端にインフレームに配置されているベクターを図示する。
ＩＩ．宿主細胞
経済的に培養することができ、高い収率を与え、適切に修飾された場合に、適切なグリコシル化を行うことができるので、一般に、酵母などの下等真核生物がタンパク質、特に糖タンパク質の発現のために使用される。特に、酵母は、迅速な形質転換を可能にする確立された遺伝学、検査されたタンパク質局在化戦略及び容易な遺伝子ノックアウト技術を提供する。適切なベクターは、所望に応じて、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素を含むプロモーター及び複製起点、終結因子などの発現調節配列を有する。
本明細書において、本発明は、メチル栄養性酵母ピキア・パストリスを用いて示されているが、他の有用な下等真核生物宿主細胞には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエ・ファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・マイヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・マイヌータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ））、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オパンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルキュウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラックノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フサリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれる。ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）及びハンセニュラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの様々な酵母は、高い細胞密度まで増殖し、組換えタンパク質の多量を分泌することができるので、これらは、細胞培養に特に適している。同様に、アスペルギルス・ニガー、フサリウム種、ニューロスポラ・クラッサ及びその他などの糸状真菌は、産業的規模で本発明の糖タンパク質を産生するために使用することができる。下等真核生物の場合には、捕捉部分の発現を誘導する条件下で、約１．５から３日の間、細胞を定型的に増殖させる。捕捉部分の発現を阻害しながらの免疫グロブリン発現の誘導は、約１から２日間である。その後、目的の免疫グロブリンをディスプレイする細胞に関して、細胞を分析する。
下等真核生物、特に、酵母及び糸状真菌は、グリコシル化パターンがヒト様であり又はヒト化されている糖タンパク質を発現するように、遺伝的に修飾することができる。このように、特定の所望される糖型が組成物中で主要である糖タンパク質組成物を作製することができる。これは、ＵＳ２００４／００１８５９０に記載されているように、選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、及び／又は宿主細胞を遺伝的に操作し、及び／又は哺乳動物のグリコシル化経路の全部若しくは一部を模倣するための外来性酵素を供給することによって達成することができる。所望であれば、グリコシル化のさらなる遺伝子操作は、糖タンパク質がコアフコシル化あり又はなしに産生され得るように実施することができる。糖タンパク質の主要な糖型が組成物中の糖タンパク質の３０モル％を上回って存在し得るように、これらの細胞が糖タンパク質の高度に均質な組成物を産生することができる点で、下等真核生物宿主細胞の使用はさらに有利である。特定の態様において、主要な糖型は、組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、最も好ましくは、８０モル％を上回って存在し得る。
下等真核生物、特に、酵母は、グリコシル化パターンがヒト様であり又はヒト化されている糖タンパク質を発現するように、遺伝的に修飾することができる。これは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ他のＵＳ２００４／００１８５９０によって記載されているように、選択された内在性グリコシル化酵素を除去することによって、及び／又は外来性酵素を供給することによって達成することができる。例えば、宿主細胞は、その活性が枯渇されなければ糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシル転移酵素活性が枯渇されるように選択又は操作することができる。
一実施形態において、宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にα１，２−マンノシダーゼ活性を標的とするように選択されたα１，２−マンノシダーゼ触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質組成物が産生される。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む糖タンパク質を産生することができる下等真核生物宿主細胞を開示する。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ活性を標的誘導するように選択されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質組成物が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む糖タンパク質を産生することができる下等真核生物宿主細胞を開示する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質を産生するために、上記細胞中で産生された糖タンパク質は、インビトロでヘキサミニダーゼで処理することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にマンノシダーゼＩＩ活性を標的化するように選択されたマンノシダーゼＩＩ触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質組成物が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、及び主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を有する糖タンパク質を産生することができる下等真核生物宿主細胞を開示する。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質を産生するために、上記細胞中で産生された糖タンパク質は、インビトロでヘキサミニダーゼで処理することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され、宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩ活性を標的誘導するように選択されたＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質組成物が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む糖タンパク質を産生することができる下等真核生物宿主細胞を開示する。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質を産生するために、上記細胞中で産生された糖タンパク質は、インビトロにおいてヘキサミニダーゼで処理することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にガラクトシル転移酵素活性を標的誘導するように選択されたガラクトシル転移酵素触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質又はこれらの混合物、例えば、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はこれらの混合物を含む組換え糖タンパク質組成物が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む糖タンパク質を産生することができる下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生するために、インビトロにおいて、ガラクトシダーゼで処理することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にシアリル転移酵素（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を標的誘導するように選択されたシアリル転移酵素触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はこれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質が産生される。酵母及び糸状真菌などの下等真核生物宿主細胞に関しては、宿主細胞はＮ−グリカンへ転移するためにＣＭＰ−シアル酸を与えるための手段をさらに含むことが有用である。米国特許公開２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示し、米国特許出願公開２００６／０２８６６３７号は、シアル化された糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示する。Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖型又はこれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生するために、上記細胞中で産生された糖タンパク質は、インビトロにおいてノイラミニダーゼで処理することができる。
米国特許出願公開２００４／０７４４５８号及び２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ＧｎＴＩＩＩ）及び／又は多重アンテナ状（ＧｎＴＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を作製するために、前述の宿主細胞の何れの１つも、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ及びＧｎＴＩＸからなる群から選択される１つ又はそれ以上のＧｌｃＮＡｃ転移酵素をさらに含むことができる。
さらなる実施形態において、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は、ガラクトシル転移酵素触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にガラクトシル転移酵素活性を標的誘導するように選択されたガラクトシル転移酵素触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＧａｌＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を主に含む組換え糖タンパク質が産生される。
さらなる実施形態において、ＧａｌＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は、シアリル転移酵素触媒性ドメインと本来会合していない細胞性標的誘導シグナルペプチドに融合され及び宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置にシアリル転移酵素活性を標的化するように選択されたシアリル転移酵素触媒性ドメインをさらに含む。組換え糖タンパク質が宿主細胞の小胞体又はゴルジ装置を通過することによって、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖型を含む組換え糖タンパク質が産生される。
様々な前記宿主細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クルイベロミセス・ラクティス及びムス・ムスキュラス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）及びＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）などの１つ又はそれ以上の糖輸送体をさらに含む。酵母及び糸状真菌などの下等真核生物宿主細胞は上記輸送体を欠如しているので、酵母及び糸状真菌などの下等真核生物宿主細胞が上記輸送体を含むように遺伝子操作されていることが好ましい。
宿主細胞には、β−マンノシル転移酵素遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３及びＢＭＴ４）の１つ又はそれ以上を欠失又は破壊することによって、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を（米国特許公開２００６／０２１１０８５号参照）、及びホスホマンノシル転移酵素遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂの一方又は両方を欠失又は破壊することによって（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号及び同第７，２５９，００７号参照）（さらなる態様において、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失又は破壊することも含み得る。）、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を削除するように遺伝子操作された下等真核生物細胞（例えば、ピキア・パストリスなどの酵母）がさらに含まれる。破壊には、特定の酵素をコードする読み取り枠を破壊すること、又は読み取り枠の発現を破壊すること、又は干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを用いて、β−マンノシル転移酵素及び／又はホスホマンノシル転移酵素の１つ若しくはそれ以上をコードするＲＮＡの翻訳を無効にすることが含まれる。宿主細胞には、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞の何れか１つがさらに含まれ得る。
宿主細胞には、タンパク質Ｏ−マンノシル転移酵素（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシル転移酵素遺伝子（ＰＭＴ）の１つ若しくはそれ以上を欠失若しくは破壊することによって（米国特許第５，７１４，３７７号参照）、又は国際出願公開ＷＯ２００７０６１６３１に開示されているように、Ｐｍｔｐ阻害剤及び／若しくはα−マンノシダーゼの存在下で増殖して、又は両方によって、糖タンパク質のＯ−グリコシル化を調節するように遺伝子操作されている下等真核生物宿主細胞（例えば、ピキア・パストリスなどの酵母）がさらに含まれる。破壊には、Ｐｍｔｐをコードする読み取り枠を破壊すること、又は読み取り枠の発現を破壊すること、又は干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを用いて、Ｐｍｔｐの１つ若しくはそれ以上をコードするＲＮＡの翻訳を無効にすることが含まれる。宿主細胞には、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞の何れか１つがさらに含まれ得る。
Ｐｍｔｐ阻害剤には、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されない。使用することができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン」−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸及び５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン」−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。
特定の実施形態において、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能又は発現が低下され、破壊され、又は欠失される。例えば、特定の実施形態において、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３及びＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能若しくは発現が、低下され、破壊され、若しくは欠失され、又は宿主細胞は、１つ若しくはそれ以上のＰＭＴ阻害剤の存在下で培養される。さらなる実施形態において、宿主細胞は１つ又はそれ以上のＰＭＴ遺伝子の欠失又は破壊を含み、宿主細胞は、１つ又はそれ以上のＰｍｔｐ阻害剤の存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様において、宿主細胞は分泌されたα−１，２−マンノシダーゼも発現する。
ＰＭＴの欠失若しくは破壊及び／又はＰｍｔｐ阻害剤は、Ｏ−グリコシル化の占有を低下させることによって、すなわち、グリコシル化された糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を低下させることによってＯ−グリコシル化を調節する。細胞によって分泌されるα−１，２−マンノシダーゼ（ｍａｎｎｏｓｏｄａｓｅ）のさらなる添加は、糖タンパク質上のＯ−グリカンのマンノース鎖の長さを低下させることによってＯ−グリコシル化を調節する。従って、ＰＭＴ欠失若しくは破壊及び／又はＰｍｔｐ阻害剤を分泌されたα−１，２−マンノシダーゼの発現と組み合わせることは、占有及び鎖長を低下させることによって、Ｏ−グリコシル化を調節する。特定の異種の糖タンパク質（例えば、Ｆａｂ及び抗体）は、効率性の異なる程度で、発現され及びゴルジ装置を通過して輸送され得、従って、ＰＭＴの欠失又は破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤及びα−１，２−マンノシダーゼの特定の組み合わせを必要とし得るので、特定の状況において、ＰＭＴの欠失又は破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤及びα−１，２−マンノシダーゼの特定の組み合わせは経験的に決定される。別の態様において、１つ又はそれ以上の内在性マンノシル転移酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は、分泌されたα−１，２−マンノシダーゼ及び／若しくはＰＭＴ阻害剤の付与と組み合わせることができ、又は分泌されたα−１，２−マンノシダーゼ及び／若しくはＰＭＴ阻害剤の付与に代えることができる。
従って、Ｏ−グリコシル化の調節は、よりよい総収率で又は適切に集合された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞中で特定の糖タンパク質を産生するのに有用であり得る。完全な抗体及びＦａｂ断片は分泌経路を横切り、細胞表面に輸送されるので、Ｏ−グリコシル化の低下又は除去は、完全な抗体及びＦａｂ断片の集合及び輸送に対して有益な効果を有するように思われる。従って、Ｏ−グリコシル化がその中で調節される細胞では、適切に集合された抗体又はＦａｂ断片の収率は、Ｏ−グリコシル化がその中で調節されていない宿主細胞中で得られる収率を上回って増加する。
さらに、Ｏ−グリコシル化は、抗体又はＦａｂ断片の抗原に対する親和性及び／又は結合力に対して効果を有し得る。これは、抗体又はＦａｂを作製するための最終的な宿主細胞が抗体を選択するために選択された宿主細胞と同じでない場合に特に重要であり得る。例えば、Ｏ−グリコシル化は、抗原に対する抗体又はＦａｂ断片の親和性を妨害し得、従って、Ｏ−グリコシル化は抗体又はＦａｂ断片が抗原を結合する能力を妨害し得るので、Ｏ−グリコシル化がなければ抗原に対して高い親和性を有し得る抗体又はＦａｂ断片が同定されない場合があり得る。他の事例では、Ｏ−グリコシル化は抗原に対する抗体又はＦａｂ断片の結合力を妨害するので、抗原に対して高い結合力を有する抗体又はＦａｂ断片が同定されない場合があり得る。前記２つの事例では、抗体又はＦａｂ断片を同定及び選択するための宿主細胞は、別の細胞種、例えば、酵母又は真菌細胞（例えば、ピキア・パストリス宿主細胞）のものであったので、哺乳動物細胞株中で産生された場合に特に効果的であり得る抗体又はＦａｂ断片が同定されない場合があり得る。酵母中でのＯ−グリコシル化は、哺乳動物細胞中のＯ−グリコシル化とは著しく異なり得ることが周知である。野生型酵母のＯ−グリコシル化を哺乳動物中のムチン型又はジストログリカン型のＯ−グリコシル化と比較した場合に、このことが特に妥当する。特定の事例において、Ｏ−グリコシル化は、抗原に対する抗体又はＦａｂ断片の親和性又は結合力を妨害するのではなく、増強させ得る。産生宿主中において、もはや、Ｏ−グリコシル化は、抗原に対する増強された親和性又は結合力を引き起こした種類ではないので、産生宿主細胞が抗体又はＦａｂ断片を同定及び選択するために使用される宿主細胞と異なる場合に（例えば、同定及び選択が酵母中で行われ、並びに産生宿主は哺乳動物細胞である。）、この効果は望ましくない。従って、Ｏ−グリコシル化を調節することによって、宿主細胞のＯ−グリコシル化系によって影響を受けている抗体又はＦａｂ断片を同定及び選択せずに、抗原に対する抗体又はＦａｂ断片の親和性又は結合力に基づいて、特定の抗原に対して特異性を有する抗体又はＦａｂ断片を同定及び選択するために、本明細書中の材料及び方法を使用することが可能になり得る。従って、Ｏ−グリコシル化を調節することは、哺乳動物細胞株中で最終的に産生される抗体又はＦａｂ断片を同定及び選択するための酵母又は真菌宿主細胞の有用性をさらに増強する。
幾つかの状況において、抗体及びＦａｂの収率は、哺乳動物若しくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることによって、又は１つ若しくはそれ以上の哺乳動物若しくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で、１つ若しくはそれ以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を置換することによって改善することができる。さらに、宿主細胞中での哺乳動物又はヒトシャペロンタンパク質の発現は、細胞中でのＯ−グリコシル化を調節し得る。従って、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が低下又は除去されており、及びシャペロンタンパク質の少なくとも１つの哺乳動物又はヒト相同体をコードするベクターが宿主細胞中で発現される本明細書の宿主細胞がさらに含まれる。内在性宿主細胞シャペロン及び哺乳動物又はヒトシャペロンタンパク質がその中で発現されている宿主細胞も含まれる。さらなる態様において、下等真核生物宿主細胞は酵母又は糸状真菌宿主細胞である。収率を改善し、及び組換えタンパク質のＯ−グリコシル化を低下又は調節するために、ヒトシャペロンタンパク質がその中に導入されている宿主細胞のシャペロンの使用の例は、２００８年２月２０日に出願された米国仮出願６１／０６６４０９号及び２００８年８月１２日に出願された６１／１８８，７２３号に開示されている。上記と同様に、内在性シャペロンタンパク質の１つ若しくはそれ以上をコードする遺伝子を、１つ若しくはそれ以上の哺乳動物若しくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること又は上記の１つ若しくはそれ以上の哺乳動物若しくはヒトシャペロンタンパクを過剰発現することに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシル転移酵素（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能又は発現が低下され、破壊され又は欠失されている下等真核生物宿主細胞がさらに含まれる。特定の実施形態において、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３及びＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能が低下され、破壊され、又は欠失される。
従って、本明細書に開示されている方法は、主なＮ−グリカンが複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカン及び高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択され、複合Ｎ−グリカンがＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され；ハイブリッドＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及びＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され；並びに高マンノースＮ−グリカンがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される、Ｎ−グリカン組成を持たない糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾されたあらゆる宿主細胞を使用し得る。特定の態様において、Ｎ−グリカンの組成は、約３９％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；４０％のＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；及び６％のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２又は約６０％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；１７％のＧａｌ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及び５％のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２又はこの間の混合物を含む。
酵母細胞が１，６−マンノシル転移酵素活性をディスプレイしない（すなわち、ｏｃｈ１ｐをコードするＯＣＨ１遺伝子が破壊若しくは欠失され、又はＯｃｈ１ｐの活性が無能力化されている。）上記実施形態では、宿主細胞は接合することができない。従って、形質転換の効率に応じて、軽鎖及び重鎖の潜在的なライブラリー多様性は、約１０３から１０６の間の多様性の重鎖ライブラリー及び約１０３から１０６の多様性の軽鎖ライブラリーに限定されるように見受けられる。しかしながら、重鎖／軽鎖ライブラリーを発現する宿主細胞を作製するために、重鎖ライブラリーを発現する宿主細胞を、軽鎖ライブラリーを発現する宿主細胞に接合させることができるので、接合することができる酵母宿主細胞では、多様性は約１０６から１０１２まで増加させ得る。従って、特定の実施形態において、宿主細胞は、１，６−マンノシル転移酵素活性をディスプレイする（すなわち、機能的なｏｃｈ１ｐをコードするＯＣＨ１遺伝子を有する）が、細胞表面上に抗体又はその断片をディスプレイするために、本明細書に記載されているように修飾されているピキア・パストリスなどの酵母細胞である。これらの実施形態において、宿主細胞は、その固有のグリコシル化経路を有する宿主細胞であり得る。
完全な抗体又は抗体重鎖のＦｃ領域（例えば、Ｆａｂ断片）を発現する実施形態において、抗体又はその重鎖断片をコードする核酸分子は、分子の２９７位のアスパラギン残基（グリコシル化部位）をコードするコドンを何れかの他のアミノ酸残基をコードするコドンで置換するために修飾されている。一般的な置換には、アラニン、グルタミン及びアスパラギン酸が含まれるが、これらに限定されない。従って、宿主細胞中で産生される抗体又はその断片は、アスパラギン−２９７位でグリコシル化されていない。この実施形態において、重鎖ライブラリーをディスプレイする宿主細胞は軽鎖ライブラリーをディスプレイする宿主細胞に接合され、得られたコンビナトリアルライブラリーは、本明細書に教示されているようにスクリーニングされる。前記抗体又はその断片はアスパラギン−２９７のＮ−グリコシル化を欠如しているので、所望の抗原に対する抗体親和性を妨害し得るアスパラギン−２９７に連結された宿主細胞の非ヒト酵母Ｎ−グリカンは、組換え抗体又はその断片上に存在しない。目的の抗原に対して所望の親和性を有する抗体又は断片を産生する細胞が選択される。抗体又はその断片の重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子が細胞から除去され、２９７位のアスパラギン残基を再導入するために、重鎖をコードする核酸分子が修飾される。これによって、ヒト様Ｎ−グリカン（例えば、先述されているように、高マンノース、ハイブリッド又は複合Ｎ−グリカン）を有する糖タンパク質を作製するように操作された哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯなど）又は下等真核生物（例えば、ピキア・パストリス）宿主細胞中に、抗体又はその断片をコードする核酸分子が導入されたときに、抗体又はその断片の２９７位での適切なヒト様グリコシル化が可能になる。
一般に、本発明を実施するために使用される宿主細胞は下等真核生物宿主細胞（例えば、酵母又は糸状真菌細胞）であるが、本明細書中の方法は高等真核生物細胞を使用するように適宜改変できることが想定される。従って、特定の実施形態において、免疫グロブリンの組換え発現及びディスプレイに対して使用される細胞系は、あらゆる高等真核生物細胞、組織、動物界からの生物、例えば、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックウサギ、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞及びヒト細胞株でもあり得る。動物細胞の例には、ＳＣ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０、ＮＳＯ細胞及びこれらの誘導物が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞には、ドロソフィラ・メラノガスター起源の細胞が含まれる。さらに、これらの細胞は、細胞が特定のＮ−グリカン又は主に特定のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを作製できるように遺伝子操作され得る。例えば、米国特許第６，９４９，３７２号は、昆虫細胞中でシアル化された糖タンパク質を作製する方法を開示する。Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−６２２（２００４），Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：６８０−６８８（２００６）， Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１７：１０４−１１８（２００６）並びに米国特許出願公開２００５／０２１６９５８号及び同２００７／００２０２６０号は、その上のＮ−グリカンがフコースを欠如し、又は低下したフコースを有する免疫グロブリンを産生することができる哺乳動物細胞を開示する。
特定の実施形態において、高等真核生物細胞、組織、生物は、植物界、例えば、ムギ、コメ、トウモロコシ、タバコなど由来でもあり得る。あるいは、例えば、属フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグナム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マルシャンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）及びシャエロカルポス（Ｓｙａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）の種から、コケ植物細胞を選択することができる。植物細胞の例は、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のコケ植物細胞であり、これは、ＷＯ２００４／０５７００２及びＷＯ２００８／００６５５４に開示されている。植物細胞を使用する発現系は、細胞が主に特定のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを産生できるようにするために変化されたグリコシル化経路を有するようにさらに操作することができる。例えば、細胞は、非機能的なフコシル転移酵素を有し、若しくはコアフコシル転移酵素を有さず、及び／又は非機能的なキシロシル転移酵素を有し、若しくはキシロシル転移酵素を有さず、及び／又は非機能的なβ１，４−ガラクトシル転移酵素を有し、若しくはβ１，４−ガラクトシル転移酵素を有さないように遺伝子操作させ得る。あるいは、ガラクトース、フコース及び／又はキシロースは、残基を除去する酵素での処理によって、免疫グロブリンから除去することができる。本分野において公知であるＮ−グリカンからのガラクトース、フコース及び／又はキシロース残基の放出をもたらすあらゆる酵素、例えば、α−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼおよびα−フコシダーゼを使用することができる。あるいは、１，３−フコシル転移酵素及び／又は１，２−キシロシル転移酵素及び／又は１，４−ガラクトシル転移酵素によって基質として使用されることができない修飾されたＮ−グリカンを合成する発現系を使用することができる。植物細胞中のグリコシル化経路を修飾するための方法は、米国特許出願公開２００４／００１８５９０号に開示されている。
本明細書中に開示されている方法は、哺乳動物、昆虫及び植物細胞中において使用するために適切に改変することができる。哺乳動物、昆虫又は植物細胞中での発現カセットの発現を制御するために選択された制御可能なプロモーターは、選択された細胞種中での機能性に関して選択されるべきである。適切な制御可能なプロモーターの例には、テトラサイクリン制御可能プロモーター（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ ＆ Ｈｉｌｌｅｎ， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３１０９−３１２１（２００３）参照）、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター及びカナマイシン制御可能系が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、実施例中に記載されている発現カセット中に例示されているプロモーターを置換することができる。捕捉部分は、選択された細胞種中での使用に適した細胞表面係留タンパク質に融合させることができる。ＧＰＩタンパク質を含む細胞表面係留タンパク質が、哺乳動物、昆虫及び植物細胞に関して周知である。ＧＰＩによって係留された融合タンパク質は、「Ｋｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏ．８：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ｊｅｎｋｉｎｓ．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ） ｐｐ．１８７−２００（１９９９）」によって記載されている。安定な組換え体を作製するために、発現カセットを宿主細胞ゲノム中に組み込むためのゲノム標的化配列は、実施例中に例示されているゲノム標的化及び組み込み配列を置換することができる。安定な及び一過性に形質移入された哺乳動物、昆虫、植物宿主細胞を作製するための形質移入法が本分野において周知である。形質移入された宿主細胞が本明細書に開示されているように構築されたら、目的の免疫グロブリンの発現に関して、細胞をスクリーニングし、本明細書に開示されているように選択することができる。
ＩＩＩ．グリコシルホスファチジルイノシトールによって係留された（ＧＰＩ）タンパク質
下等な真核生物の細胞は、タンパク質を発現する細胞の細胞壁上に発現されたタンパク質が効果的にディスプレイされるように、発現されたタンパク質を細胞壁へ係留し又は繋ぎ止めることに関与するＧＰＩタンパク質の系を有する。例えば、サッカロミセス・セレビシアエ中に、６６のＧＰＩタンパク質の候補が同定されている（ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ２０：７８１−７９６（２００３）参照）。本明細書中の方法において使用され得るＧＰＩタンパク質には、例えば、サッカロミセス・セレビシアエＣＷＰ１、ＣＷＰ２、ＳＥＤ１、ＧＡＳ１、ピキア・パストリスＳＰ１、ＧＡＳ１及びエッチ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＴＩＰ１が含まれる。さらなるＧＰＩタンパク質も有用であり得る。適切なＧＰＩタンパク質は、本明細書中に記載及び例示されている本発明の方法及び材料を用いて同定することができる。
適切なＧＰＩタンパク質の選択は、宿主細胞中で産生される組換えタンパク質及び組換えタンパク質上で行われる翻訳後修飾に依存する。例えば、特定のグリコシル化パターンを有する抗体又はその断片の作製は、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する組換え宿主細胞の使用を伴う。主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリコシル化を有する抗体又はその断片を産生するための系内において最も適切なＧＰＩタンパク質は、主にＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリコシル化を有する抗体又はそのを産生するための系内において最も適切なＧＰＩタンパク質で必ずしもなくてもよい。さらに、あるエピトープ又は抗原に対して特異的な抗体又はその断片を産生するための系内において最も適したＧＰＩは、別のエピトープ又は抗原に対して特異的な抗体又はその断片を産生するための系内において最も適切なＧＰＩタンパク質で必ずしもなくてもよい。さらに、ｓｃＦｖなどの抗体断片を産生するための系内において最も適したＧＰＩは、必ずしも、完全長抗体を産生するための系内において最も適したＧＰＩタンパク質でなくてもよい。
従って、特定の組換えタンパク質を産生するために使用されるべき宿主細胞を構築するためのライブラリー法がさらに提供される。一般に、組換えタンパク質を産生することが望まれる宿主は、宿主細胞によって産生される組換えタンパク質に付与される所望の特徴に基づいて選択される。例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリコシル化を主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞が選択される。次いで、１つ又はそれ以上のアダプターに融合されたＧＰＩタンパク質をコードするベクターのライブラリーが提供される。次いで、ライブラリー中の各宿主細胞種がある特定のＧＰＩ−アダプター融合タンパク質を発現するように、ＧＰＩ−アダプター融合タンパク質をコードするベクターのライブラリー中のベクターの１つで、ライブラリーを構成する各宿主細胞が形質移入され、宿主細胞のライブラリーが構築される。次いで、所望のタンパク質又は所望のタンパク質に機能若しくは構造が類似するタンパク質をコードするベクターで、ライブラリーの各宿主細胞種が形質転換される。宿主細胞の表面上に組換えタンパク質の最良の提示をもたらす宿主細胞が、所望の組換えタンパク質を産生するための宿主細胞として選択される。
一般に、本明細書中に開示されている方法において使用されるＧＰＩタンパク質は、結合部分又はアダプターペプチドのＣ末端にそのＮ末端が融合されたＧＰＩタンパク質を含むキメラタンパク質又は融合タンパク質である。結合部分又はアダプターペプチドのＮ末端は、ＧＰＩ融合タンパク質が細胞表面（ＧＰＩ融合タンパク質は細胞表面において分泌された後、細胞表面に結合される。）への分泌経路を通じて輸送され得るようにするシグナル配列のＣ末端に融合される。幾つかの態様において、ＧＰＩ融合タンパク質は完全なＧＰＩタンパク質を含み、別の態様において、ＧＰＩ融合タンパク質は細胞表面への結合を可能とするＧＰＩタンパク質の一部を含む。
Ｖ．制御配列
本明細書中に開示されている方法を実施する際に使用し得る制御配列には、シグナル配列、プロモーター及び転写終結配列が含まれる。使用される制御配列は宿主細胞のものと同じ若しくは近縁の種若しくは属に由来するものであり、又は選択された宿主細胞種の中で作動可能なものであることが一般に好ましい。シグナル配列の例には、サッカロミセス・セレビシアエのインベルターゼ、アスペルギルス・ニガーのアミラーゼ及びグルコアミラーゼ、ヒト血清アルブミン、クルイベロミセス・マキシアナスのイヌリナーゼ及びピキア・パストリスの接合因子及びＫａｒ２が含まれる。酵母及び糸状真菌中で有用であることが本明細書において示されたシグナル配列には、サッカロミセス・セレビシアエ由来のα接合因子プレ配列及びプレプロ配列並びに多数の他の種由来のシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。
プロモーターの例には、アルコールによって制御されるプロモーター、テトラサイクリンによって制御されるプロモーター、ステロイドによって制御されるプロモーター（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、エクジソン、レチノイド、甲状腺）、金属によって制御されるプロモーター、病原体によって制御されるプロモーター、温度によって制御されるプロモーター及び光によって制御されるプロモーターなどの（但し、これらに限定されない。）、数多くの種から得られるプロモーターが含まれる。本分野において周知の制御可能なプロモーター系の具体例には、金属誘導性プロモーター系（例えば、酵母銅メタロチオネインプロモーター）、植物除草剤安全化物質（ｓａｆｎｅｒ）によって活性化されるプロモーター系、植物の熱誘導性プロモーター系、植物及び哺乳動物のステロイド誘導性プロモーター系、Ｃｙｍレプレッサー−プロモーター系（Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．Ａｌｂａｎｙ， ＮＹ）、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、ベンゾアート誘導性プロモーター系（ＷＯ２００４／０４３８８５参照）及びレトロウイルス誘導性プロモーター系が含まれるが、これらに限定されない。本分野において周知の他の具体的な制御可能なプロモーター系には、テトラサイクリンによって制御可能な系（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ ＆ Ｈｉｌｌｅｎ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：３１０９−３１２１（２００３）参照）、ＲＵ４８６誘導性の系、エクジソン誘導性の系及びカナマイシン制御可能な系が含まれる。より低級な真核生物特異的プロモーターには、サッカロミセス・セレビシアエＴＥＦ−１プロモーター、ピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター、ピキア・パストリスＧＵＴ１プロモーター、ＰＭＡ−１プロモーター、ピキア・パストリスＰＣＫ−１プロモーター並びにピキア・パストリスＡＯＸ−１及びＡＯＸ−２プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分及び免疫グロブリンの一時的発現のために、ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分をコードする核酸分子に作用可能に連結されたピキア・パストリスＧＵＴ１プロモーター及び免疫グロブリンをコードする核酸分子に作用可能に連結されたピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーターが有用であることが、本明細書の実施例中に示されている。
転写終結配列の例には、サッカロミセス・セレビシアエのチトクロムＣ終結因子並びにピキア・パストリスＡＬＧ３及びＰＭＡ１終結因子などの（但し、これらに限定されない。）、多数の種及びタンパク質から得られる転写終結因子が含まれる。
ＶＩ．目的のタンパク質をコードする核酸配列
本発明の方法は、さらなる研究のために興味がもたれるあらゆる遺伝子とともに使用することができる。本明細書中に開示された方法によって与えられる利点のために、方法及び材料は糖タンパク質をコードする遺伝子を使用する。特に興味深いのは、モノクローナル抗体及びＦａｂ断片などのその機能的断片；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤなどの（但し、これらに限定されない。）免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片などの抗体断片；Ｆｃ融合タンパク質；触媒性抗体、ラクダ又はラマの抗体；エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω及び顆粒球−ＣＳＦなどのサイトカイン；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及びヒトタンパク質Ｃなどの凝固因子；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；ウロキナーゼ；キマーゼ及び尿素トリプシン阻害剤；ＩＧＦ結合タンパク質；上皮成長因子；成長ホルモン放出因子；ナネキシンＶ融合タンパク質；アンギオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体阻害因子−１及びオステオプロテジェリンなどの（但し、これらに限定されない。）、公知の治療的有用性を有するヒト糖タンパク質である。
所望の糖タンパク質をコードする核酸は、幾つかの源から取得することができる。ｃＤＮＡ配列は、保存された領域に対するプライマーを用いて、糖タンパク質を発現することが知られた細胞株から増幅することができる（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）参照）。核酸は、科学文献中の配列に基づいて、新規に合成することも可能である。核酸は、所望の配列を包含する重複するオリゴヌクレオチドの伸長によって合成することもできる（例えば、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １３：３５３−３６０（２０００）参照）。細胞によって産生され、分泌された場合、活性を有する糖タンパク質の産生には、タンパク質の適切な折り畳みを必要とする。有効な分子シャペロンタンパク質の存在が必要であり得、又は有効な分子シャペロンタンパク質の存在が適切に折り畳まれたタンパク質を産生及び分泌する細胞の能力を増強し得る。
免疫グロブリンをコードする核酸分子は、脾臓及び肝臓細胞並びにインビボ又はインビトロ源の何れかから得られる、抗原刺激された抗体産生細胞などのあらゆる適切な源から取得することができる。入手源に関わらず、細胞のＶＨ及びＶＬｍＲＮＡは、ＶＨ及びＶＬｃＤＮＡ配列へ逆転写される。逆転写は、免疫グロブリンをコードするＤＮＡ分子の複数を含有するｃＤＮＡライブラリーを作製するために、単一の工程で、又は場合によって、逆転写／ＰＣＲの組み合わせ操作で実施し得る。（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９６（１９９１）参照）。核酸分子は、科学文献中の配列に基づいて、新規に合成することも可能である。核酸分子は、所望の配列を包含する重複するオリゴヌクレオチドの伸長によって合成することもできる（例えば、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １３：３５３−３６０（２０００）参照）。ヒト化された免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーは、あらゆる源からの１つ又はそれ以上のライブラリー中のｃＤＮＡから相補性決定領域（ＣＤＲ）をＰＣＲ増幅し、ヒト化された免疫グロブリンの複数をコードするｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ヒト免疫グロブリンフレームワークをコードする核酸分子中に、ＰＣＲ増幅されたＣＤＲをコードする核酸分子を組み込むことによって構築することができる（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第６，６３２，９２７号及び同第６，８７２，３９２号参照）。キメラ免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーは、ある種から得られるｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡから可変領域をＰＣＲ増幅し、キメラ免疫グロブリンの複数をコードするｃＤＮＡライブラリーを作製するために、別の種から得られる免疫グロブリン定常領域をコードする核酸分子上に、ＰＣＲ増幅された可変領域をコードする核酸分子を統合することによって構築することができる（例えば、米国特許第５，８４３，７０８号参照）。免疫グロブリンと免疫グロブリンを特異的に結合することができる結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分とを発現する本明細書中に開示されている宿主細胞の複数を作製するために、無作為突然変異導入（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：，２０２９−２０３４（２０００）；Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９７：， １０７０１−１０７０５（２０００）； Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９７：， ５３８７−５３９２（２０００））、インビトロＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：， ３８９−３９１（１９９４）； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９１：， １０７４７−１０７５１（１９９４））、インビボＤＮＡシャフリング（Ｓｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３２：ｅ３６（２００４））及び部位特異的組換え（Ｒｅｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：，１１４９７−１１５０２（１９８２）；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ７８：， ２８４８−２８５２（１９８１）； Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１：， ２２６５−２２６６（１９９３）； Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ ＆ Ｂｒａｄｂｕｒｙ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８：， ７５−８０（２０００））など、タンパク質ライブラリー中に多様性を作出するために開発されてきた様々な方法を使用し、又は適宜に改変することができる。
細胞によって産生及び分泌された場合、活性を有する糖免疫グロブリンの産生には、タンパク質の適切な折り畳みを必要とする。イー・コリでは、抗体の複雑さ及び大きなサイズが、発現された軽鎖及び重鎖ポリペプチドの適切な折り畳み及び集合に対する障害となり、完全な状態の抗体の生成率を低くする。有効な分子シャペロンタンパク質の存在が必要であり得、又は有効な分子シャペロンタンパク質の存在は、細胞が適切に折り畳まれたタンパク質を産生及び分泌する能力を増強し得る。酵母中での免疫グロブリンの作製を改善するための分子シャペロンタンパク質の使用は、米国特許第５，７７２，２４５号；米国特許第５，７００，６７８号及び米国特許第５，８７４，２４７号；米国出願公開２００２／００６８３２５号；Ｔｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３３０３−２３３０９（２０００）；Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ， Ｍａｒｔｉｘ Ｂｉｏｌ．１９：２９−３６（２０００）；Ｖａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１６：２５１−２６０（２００５）；Ｉｎａｎａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９３：７７１−７７８（２００５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１０９０−１０９５（２００６）；Ｄａｍａｓｃｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３８１−３８９（２００６）；Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５４：２３４−２３９（２００７）；及び２００８年２月２０日に出願された同時係属中の出願逐次番号６１／０６６，４０９に開示されている。
本明細書において使用される場合、前記方法は、免疫グロブリン及び完全な損傷されていない免疫グロブリンを結合することができる結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現するように修飾され得る細胞系のあらゆる種類から得られる宿主細胞を使用することができる。本発明の範囲内において、「細胞」という用語は、個別の細胞、組織、臓器、昆虫細胞、トリ細胞、爬虫類細胞、哺乳動物細胞、ハイブリドーマ細胞、一次培養細胞、連続する細胞株、幹細胞、植物細胞、酵母細胞、糸状真菌細胞及び／又はグリコシル化された免疫グロブリンを発現及びディスプレイする組換え細胞などの遺伝子操作された細胞の培養を意味する。
ＶＩＩ．アダプターによって誘導されたディスプレイ系の使用
本明細書に開示されているアダプターによって誘導されたディスプレイ系によって、適切な下等真核生物宿主細胞の表面上への単量体及び多量体ポリペプチドのディスプレイが可能となる。このディスプレイ系は、様々な目的のために、無作為の又は所定のポリペプチド、完全長タンパク質及びタンパク質ドメインのライブラリーを作製するために使用することもできる。例えば、エピトープ及びミモトープの地図を作成し、様々な標的タンパク質のアンタゴニスト及びアゴニストを同定し、抗体を操作し、抗体の特異性を最適化し、及び新規結合活性を作出するために、ディスプレイされたライブラリーを使用することができる。
従って、被検因子と適切な下等真核生物宿主細胞の表面上にディスプレイされている外来性ポリペプチドとの間の特異的相互作用の存在を検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）外来性ポリペプチドを提示する本ディスプレイ系の下等真核生物宿主細胞を準備する工程；（ｂ）安定なポリペプチド−因子複合体を産生するのに適した条件下で、前記下等真核生物宿主細胞を被検因子と接触させる工程；及び（ｃ）下等真核生物宿主細胞の表面上での安定なポリペプチド−因子複合体の形成を検出し、これにより、特異的な相互作用の存在を検出する工程を含む。
「被検因子」という用語には、単純な又は複雑な有機又は無機分子、タンパク質、炭水化物、脂質、ポリヌクレオチド又はこれらの組み合わせなどの生物学的又は化学的化合物が含まれることが意図されるが、これらに限定されるものではない。様々なコア構造に基づいて、例えば、オリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー並びに合成有機化合物などの、多岐にわたる化合物を合成することが可能であり、これらも、「因子」という用語に含まれる。さらに、様々な天然の源が、植物又は動物抽出物など、スクリーニングのための化合物を与え得る。必ずしも常に明示的に記載されているわけではないが、前記因子は単独で使用され、又は本発明のスクリーニングによって同定された因子と同じ若しくは異なる生物学的活性を有する別の因子と組み合わせて使用されることを理解すべきである。特定の実施形態において、前記因子は、細胞のシグナル伝達経路を調節することができるものなどの、候補診断薬及び／又は治療薬である。
別の実施形態において、本発明は、所望の特性を有するポリペプチドを取得する方法を提供する。この方法は、（ａ）本発明のディスプレイ系の選択可能なライブラリーを準備する工程；及び（ｂ）その表面上に所望の特性を有するポリペプチドをディスプレイする少なくとも１つの下等真核生物宿主細胞を得るために、選択可能なライブラリーをスクリーニングする工程を含む。前記方法は、所望の特性を有するポリペプチドをディスプレイする下等真核生物宿主細胞を単離する工程をさらに含み得る。下等真核生物宿主細胞のこのような単離は、所望のポリペプチドをコードする下等真核生物宿主細胞からヌクレオチド配列を取得することを含み得る。所望の特性は、目的の因子へ特異的に結合するポリペプチドの能力を包含する。所望の特性を有する選択されたポリペプチドは、以下の分子、すなわち、抗原結合単位、細胞表面受容体、受容体リガンド、細胞質タンパク質、分泌タンパク質、核タンパク質及びこれらの機能的モチーフの１つ又はそれ以上のクラスに属し得る。検査されるべき特異的因子の選択及びディスプレイされるべき外来性ポリペプチドのライブラリーは、スクリーニングアッセイの意図される目的に依存する。
ＶＩＩＩ．所望の結合特異性又は親和性を示す抗体の単離
本明細書のディスプレイ系の最も強力な応用の１つは、抗体操作の分野におけるその使用である。結合特異性及び親和性の明白な喪失なしに、ｓｃＦｖ抗原結合単位を下等真核生物宿主細胞の表面上に発現させ得ることが示されている（例えば、米国特許第６，３００，０６５号参照）。完全長抗体は、例えば、ハイブリドーマ及びＣＨＯ細胞の表面に捕捉及び結合させ得ることも示されている（例えば、米国特許第６，９１９，１８３号及び同第７，１６６，４２３号参照）。多くの多様な抗原に対する抗体及びその断片がファージディスプレイ技術を用いて首尾よく単離されてきたが、下等真核生物宿主細胞中で抗体及びその断片を産生するための強固なディスプレイ系に対する要望がなお存在する。ヒト様のグリコシル化パターンを有する抗体及びその断片を産生するための強固なディスプレイ系を有することが特に望ましい。様々なヒト様のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する遺伝子操作された下等真核生物は、米国特許第７，０２９，８７２号並びに、例えばＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３； １４４１ １４４３（２００６）； Ｗｉｌｄｔ ａｎｄ Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．３：１１９−１２８（２００５）； Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ＧｌｙｃｏＢｉｏｌ．７５７−７６６（２００４）； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５（２００６）； Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４（１９９８）；及びＭａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． １６：９９−１０７（１９９９）に記載されている。
本ディスプレイ系は、特定のグリコシル化パターンを有する抗体の極めて多様なレパートリーの提示を可能とするので、この応用に特に適している。多くの態様において、本ディスプレイ系は天然の免疫系を模倣する。抗原によって誘導された刺激は、クローニングされた抗体Ｈ及びＬ鎖のディスプレイライブラリーから高親和性結合物質を選択することによって達成することができる。Ｂ細胞の発達時にＨ及びＬ鎖遺伝子の組換えの間に起こる鎖の多数の並べ替えは、ＤＮＡ及びタンパク質としてクローニングされたＨ及びＬ鎖をシャッフルすることによって、並びに部位特異的組換えの使用を通じて模倣することができる（Ｇｅｏｆｆｏｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ１５１：１０９−１１３（１９９４））。Ｈ及びＬ鎖のＣＤＲ領域中に変異を導入することによっても、体細胞変異を合致させることができる。
所望の結合特異性又は親和性を有する抗体又はその断片は、「パニング」として知られる親和性選択の一形態を用いて同定することができる（Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８８） Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８）。まず、抗体又はその断片のライブラリーを、目的の抗原とともに温置した後、結合された抗体又はその断片によって抗原を捕捉する。次いで、このようにして回収された抗体又はその断片を増幅し、再度、抗原への結合に関して選択して、目的の抗原を結合する抗体又はその断片を濃縮することができる。選択単離の１巡又はそれ以上の後に、所望の特異性又は結合力を有する抗体又はその断片の単離が可能となる。従って、所望の抗体又はその断片を発現する稀な宿主細胞は、１つの実験において、１０４を上回る異なる個体から容易に選択することができる。次いで、個別の宿主細胞クローンのヌクレオチド配列によって、結合抗体又はその断片の一次構造を推測する。ヒトＶＨ及びＶＬ領域がディスプレイされた抗体又はその断片中で使用される場合、本ディスプレイ系は、非ヒト抗体又はその断片のさらなる操作なしに、ヒト抗体の選択を可能とする。
ＩＸ．改善された結合特異性又は親和性を有する抗体及びその断片を含む新規タンパク質の作製
本ディスプレイ系を用いて、標的タンパク質に対して高い親和性及び特異性を有するポリペプチド（抗体又はその断片など）をディスプレイする複製可能な宿主細胞を取得することができる。このような宿主細胞は、第二のアダプターペプチドに融合された抗体又はその断片をコードする第一のポリヌクレオチドと及び第二のアダプターペプチドと対相互作用をすることができる第一のアダプターペプチドに融合された細胞表面係留タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドとを有する。第一のポリヌクレオチドの存在によって、組換え発現及び結合タンパク質のその後の操作が容易になる。例えば、親ポリヌクレオチドに似た変化された配列の精緻なレパートリーを作製するために、カセット突然変異導入、エラープローンＰＣＲ又はシャフリングによって第一のポリヌクレオチドを変異させることができる。新規抗体又はその断片の精緻なレパートリーをスクリーニングすると、改善された結合特異性又は親和性を示すものを同定することができる。
Ｘ．抗原性エピトープのマッピング
伝統的に、抗原のエピトープマッピングは、物理化学的分析に著しく依拠してきた。これらのアプローチには、（１）様々なプロテアーゼを用いて、精製された抗原を断片化し、反応性断片を同定し、及び反応性断片を配列決定すること；（２）抗原結合ユニットとの残基の相互作用が修飾から保護される化学的修飾実験；（３）抗原の一次構造に対応する一連のペプチドを合成すること；並びに（４）ＮＭＲ又はＸ線結晶学を用いた、直接的な物理的性質決定が含まれる。これらの方法は全て、大量の労働を必要とし、高情報量分析に一般には適していない。本明細書に開示されているような下等真核生物ディスプレイは、抗原性エピトープを局在化させるための極めて効率的で、強固な代替策を提供する。抗原の一部をコードするＤＮＡの断片は、本発現ベクターによる外来性ポリペプチドとして発現させることができる。次いで、何れのディスプレイされた断片が抗体と反応するかを決定するために、抗体を用いて、下等真核生物宿主細胞を調べることができる。ディスプレイ技術のこの応用は、本分野において広く使用されており、様々な分子の抗原性エピトープを首尾よく決定することが示されている。
ＸＩ．結合エピトープのマッピング
本ディスプレイ系は、抗原結合部位の特異性をマッピングするための無作為なペプチドライブラリーを提示するために使用することもできる。無作為なペプチドライブラリーは、エピトープ及びミモトープをそこから操作によって確定することができる配列の源を表す。このようなライブラリーを用いて、抗原−抗体相互作用に対するペプチド競合物質を同定及び取得し、従って、多数の抗体又はその断片の接近可能な及び／又は機能的な部位の地図を作成することができる。
ＸＩＩ．本発明のベクターを含むキット
本発明は、適切なパッケージ中に、本発明の発現及びヘルパーベクターを含有するキットも包含する。各キットは、ベクターの宿主細胞中への送達を可能にする試薬を必ず含む。ベクターの送達を促進する試薬の選択は、使用される特定の形質移入又は感染法に応じて変動し得る。キットは、外来性配列及びタンパク質産物を検出するための標識されたポリヌクレオチドプローブ又はタンパク質性プローブを作製するのに有用な試薬も含有し得る。各試薬は、固体形態で供給することができ、又は在庫の保存に適し、及び実験を実施する際に、その後反応培地中に交換若しくは添加するのに適した液体緩衝液中に溶解／懸濁することができる。適切なパッケージが提供される。キットは、前記操作において有用であるさらなる成分を場合によって提供し得る。これらの場合によって使用される成分には、緩衝液、捕捉試薬、発色試薬、標識、反応性表面、検出するための手段、対照試料、指示書及び解釈に関する情報が含まれるが、これらに限定されない。
以下の実施例では、異種のヒトタンパク質は、種ピキア・パストリスの宿主細胞中で発現される。以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを目的とする。
（実施例１）
目的は、様々な哺乳動物のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されたピキア・パストリス株のために特別に設計された新規酵母ディスプレイ法を開発することであった。この実施例では、細胞壁中のタンパク質を係留する付着された糖ホスホチジルイノシトール（ＧＰＩ）翻訳後修飾を内在的に含有する細胞表面係留タンパク質のＮ末端をコードする核酸を、検査タンパク質に融合された第二のコイルドコイルペプチドとヘテロ二量体を形成することができる第一のコイルドコイルペプチドをコードする核酸に連結した。使用された特異的細胞表面係留タンパク質は、ＧＰＩタンパク質予想ソフトウェアを用いて同定された細胞壁又は形質膜タンパク質のパネルをスクリーニングすることによって同定されたＳｅｄ１ｐであった。
ＧＰＩタンパク質のＮ末端に融合されたコイルドコイルペプチドＧＡＢＡＢ−Ｒ２（配列番号１９）及び抗体又はＦａｂ断片のＣ末端に融合されたＧＡＢＡＢ−Ｒ１（配列番号２１）をアダプターペプチドとして用いて、ＧＰＩタンパク質及び検査抗体及びＦａｂ断片をコードする発現カセットを構築した。ＧＡＢＡＢ−Ｒ１（ＧＲ１）及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２（ＧＲ２）は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体ＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２に由来する。ＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットのヘテロ二量体化は機能的なＧＡＢＡＢ受容体の形成にとって必須である。各個別のサブユニットは、ヘテロ二量体の形成を媒介するその細胞内Ｃ末端ドメイン内に３０アミノ酸残基の１つの連なりを含有している。（Ｋａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１３２６３−９（１９９９））。機能的なＧＡＢＡＢ受容体のヘテロ二量体化は、平行コイルドコイルαへリックスによって媒介される。３つのさらなるアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｇｌｙ及びＣｙｓがＧＲ１の末端に付着された。ＧＲ１の末端のＣｙｓは、ディスプレイＦａｂ断片ＣＨ１のＣ末端に融合されたＧＲ２の末端のＣｙｓとともにジスルフィド結合を生成する。２つのＧｌｙは、ヘテロ二量体の柔軟性を増加させると考えられる。
細胞表面係留タンパク質ライブラリーをコードする発現カセットの構築は、以下のとおりであった。候補細胞表面係留タンパク質は、文献に従って、エス・セレビシアエ、ピー・パストリス及びエッチ・ポリモルファから選択され、ＩＭＰ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｌｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｄｒ． Ｂｏｈｒ−Ｇａｓｓｅ ７， １０３０ Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）から入手可能なＧＰＩタンパク質予想ソフトウェアを用いて、細胞表面係留タンパク質としてさらに同定された。分析のために、１０個のタンパク質を選択した。
下表１は、分析のために選択された１０個のＧＰＩタンパク質及び該タンパク質の末端切断された変異形の関連する部分のアミノ酸配列を示している。高度に発現された遺伝子が望ましいので、発現を改善する試みで、タンパク質の幾つかに対して、候補核酸配列の３’末端の末端切断を施した。ＧＰＩタンパク質の全てに関して、ＧＰＩタンパク質に対する内在性シグナル配列をコードする核酸は除去した。従って、表１中に示されているアミノ酸配列は、内在性シグナルペプチドに対するアミノ酸配列を含まない。表１中に示されているアミノ酸配列中の太字のアミノ酸は、Ω部位を表す。Ω部位は、ＧＰＩがタンパク質に付着する領域である。ＧＰＩタンパク質は、係留の部位に基づいて、ＧＰＩ係留された形質膜タンパク質（ＧＰＩ−ＰＭＰ）及びＧＰＩ依存性細胞表面係留タンパク質（ＧＰＩ−ＣＷＰ）という２つの型に分類された。
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
ピキア・パストリスのコドン使用に従って、係留タンパク質の各々をコードする核酸をコドン最適化した。核酸の５’末端にＳａｌＩ制限部位を作製するために、タンパク質をコードする核酸の５’末端に、バリン及びアスパラギン酸ジペプチド（ＶＤ）をコードする核酸を添加した。これらのＧＰＩタンパク質の各々の内在性シグナルペプチドを、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のα−アミラーゼシグナルペプチドと置換した。シグナルペプチドをコードするＤＮＡはＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴ ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴ ＧＴＴＣＴＴＧＴＡＣ ＧＧＡＴＴＧＣＡＡＧ ＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣ ＡＧＣＴＴＴＧＧＣＴ（配列番号３３）であり、シグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＶＡＷＷＳＬＦＬＹ ＧＬＱＶＡＡＰＡＬＡ（配列番号３４）を有する。
係留タンパク質発現及び細胞表面局在化のさらなる最適化は、細胞表面にＧＰＩタンパク質を最もよく局在化させるシグナルペプチドを同定するために、係留タンパク質のＮ末端に融合されたＮ末端シグナルペプチドのライブラリーのスクリーニングを通じて達成され得る。各構築物に対して、シグナルペプチドをコードする核酸とＧＰＩタンパク質をコードする核酸の間に、アミノ酸配列ＴＳＲＬＥＧＬＱＳＥ ＮＨＲＬＲＭＫＩＴＥ ＬＤＫＤＬＥＥＶＴＭ ＱＬＱＤＶＧＧＣ（配列番号１９）を有するＧＲ２コイルドコイルペプチドをコードする核酸を挿入した。カセットは、ＧＲ２コイルドコイルペプチドとＧＰＩタンパク質をコードする核酸の間に挿入されたｍｙｃエピトープをコードする核酸をさらに含んだ。ｍｙｃエピトープは常に存在するわけではないが、市販の抗ｍｙｃ抗体を用いて、細胞表面に付着された、発現されたＧＰＩタンパク質の検出を容易にするためのエピトープを提供するために、発現カセット中に含められた。
図２Ａは、ＧＲ２コイルドコイルペプチドに融合されたエス・セレビシアエＳＥＤ１ＧＰＩタンパク質の例を示している。融合タンパク質は、アスペルギルス・ニガーα−アミラーゼシグナルペプチド、その後にＧＲ２コイルドコイルペプチド、その後にＭｙｃタグ及び最後にＳＥＤ１ＧＦＰアンカータンパク質（その内在性シグナルペプチドを持たない。）からなる。図２Ｂは、融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）を示している。図３は、ＳＥＤ１融合タンパク質をコードする代表的なプラスミドマップを示している。ＳＥＤ１融合タンパク質は、細胞中で発現されると、細胞の表面へ輸送され、そこで、ＧＲ２コイルドコイルペプチドが細胞外に配向されるように細胞壁に結合され、ＧＲ２コイルドコイルペプチドへ接近可能なＧＲ１コイルドコイルペプチドを含有する細胞外環境において、あらゆるタンパク質の結合のために利用可能となる。上記核酸配列の全ては、ピキア・パストリスのコドン使用に従ってコドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔＡＧによって合成された。表２は、構築されたＧＲ２にＧＰＩタンパク質がその中で融合されている代表的な多数の細胞表面係留発現カセット含有プラスミドを示している。
ＧＰＩ係留タンパク質発現カセットに対する組み込み部位として、ピキア・パストリスＵＲＡ６遺伝子坐を選択した。ピキア・パストリスゲノムＤＮＡからＵＲＡ６遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中にクローニングしてプラスミドｐＧＬＹ１８４９を作製した。クローニングのために、遺伝子内のサイレント変異によってＢｇｌ２及びＥｃｏＲＩ部位を変異させた。プラスミドｐＧＬＹ２１８４の核酸を標的とするＴＲＰ２を、ｐＧＬＹ１８４９由来のピキア・パストリスＵＲＡ６遺伝子と置換した。さらに、ピキア・パストリスＡＲＧ１選択マーカーを、プラスミドｐＧＦＩ８から得られた亜ヒ酸塩／エステルマーカーカセットで置き換えた。最終のプラスミドをｐＧＦＩ３０ｔと名付け、表２中に示されているプラスミドを作製するために使用した。
Figure 0005731827
抗体及びＦａｂ断片発現カセットは、以下のように構築した。図４は、抗体又はその断片を作製するために構築された３つの異なる抗体発現カセットを図示する。発現カセットＡは、２つの別個に発現された読み取り枠（ＯＲＦ）を含む。第一のＯＲＦは、軽鎖をコードし、第二のＯＲＦは、ＧＲ１コイルドコイルペプチドへＣ末端が融合された重鎖のＦｄ領域を含む融合タンパク質をコードする。各ＯＲＦは、融合タンパク質の発現が誘導性に発現されることを可能とするＡＯＸ１プロモーターへ作用可能に連結されている。発現が誘導されると、この発現カセットは、軽鎖及びＧＲ１コイルドコイルペプチドへそのＣ末端が融合されたＦｄ断片からなるＦａｂ断片を産生することができる。Ｆａｂ断片は、細胞表面上に存在するＧＰＩタンパク質へ融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドによるヘテロ二量体化によって捕捉され得る。次いで、適切な検出手段によって、所望のＦａｂ断片を検出することができる。図５は、その中で発現カセットＡがＨｅｒ２抗原に対して特異的であるＦａｂをコードする構築されたプラスミドのプラスミド地図を示している。
発現カセットＢは、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合された完全長抗体を産生することができる。第一のＯＲＦは、軽鎖をコードし、第二のＯＲＦは、ＧＲ１コイルドコイルタンパク質へＣ末端が融合された重鎖を含む融合タンパク質をコードする。各ＯＲＦは、ＡＯＸ１プロモーターへ作用可能に連結されている。発現が誘導されると、この発現カセットは、軽鎖及びＧＲ１コイルドコイルペプチドへそのＣ末端が融合された重鎖からなる完全長抗体を産生することができる。完全長抗体は、細胞の表面上に存在するＧＰＩタンパク質へ融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドによるヘテロ二量体化によって捕捉され得る。次いで、適切な検出手段によって、所望の抗体を検出することができる。
発現カセットＢの限界は、産生された完全長抗体が重鎖に融合されたＧＲ１コイルドコイルペプチドを常に含むことである。この限界は、治療目的が予定される抗体にとっては望ましくない場合があり得る。従って、新しい発現カセットは、所望の抗体を産生する宿主細胞から、所望の抗体をコードする核酸を単離すること、及びＧＲ１コイルドコイルペプチドをコードする核酸を含まず、従って、重鎖のＣ末端に融合されたＧＲ１コイルドコイルペプチドを持たない完全長抗体を産生する発現カセット中に前記核酸を再クローニングすることによって構築しなければならない。この限界を回避するために、発現カセットＣを設計した。
適切な条件下にある発現カセットＣは、所望の完全長抗体を選択するために、重鎖に融合されたＧＲ１コイルドコイルペプチドを含む完全長抗体を産生することができる。しかしながら、産生条件下では、発現カセットは、重鎖がＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていない所望の抗体を産生する。従って、発現カセットＣは、所望の抗体をコードする核酸を再クローニングする必要を回避する。発現カセットＣでは、ＧＲ１コイルドコイルペプチドのＮ末端へ、Ｃ末端が融合された重鎖を含む融合タンパク質をコードする第二のＯＲＦは、重鎖をコードする核酸配列の末端とＧＲ１コイルドコイルペプチドをコードする核酸との間に単一の停止コドンをさらに含み、その中では、停止コドンを通過した読み取りは誘導性である。通常、停止コドンは、ｍＲＮＡテンプレートのデコーディングを終結させるためにリボソームにシグナルを伝達する。酵母では、非効率的な終結によって、翻訳は継続し、通過した読み取りの頻度は酵母株及び選択した停止コドンに応じて変動する。カセットは、停止コドンが完全長抗体をコードする核酸と同じ翻訳領域内に存在し、コイルドコイルペプチドＧＲ１をコードする核酸から停止コドンが隔てられるように設計されている。従って、多くの条件下で、発現カセットから転写されたｍＲＮＡの翻訳は、主に、単一の停止コドンで停止し、従って、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていない完全長抗体の産生をもたらす。しかしながら、抗生物質４１８の存在下では、停止コドンを通過した読み取りによる翻訳は増加し、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合された完全長抗体の産生をもたらす。しかしながら、抗生物質の存在下でさえ、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていない完全長抗体の発現が主要な種である。この割合的な通過読み取りは、完全長抗体の発現可能性を反映し得る。分泌された完全長抗体及び細胞表面に捕捉された完全長抗体融合物の両方をモニターすることによって、高産生宿主細胞に関してスクリーニングを行うことができる。従って、抗生物質の存在下において、完全長抗体の集団は、重鎖−ＧＲ１コイルオドコイルペプチド融合タンパク質を含む。従って、所望の抗体に関して抗体のライブラリーをスクリーニングする場合、宿主細胞は抗生物質の存在下で増殖させる。重鎖ＧＲ１融合タンパク質を含む完全長抗体は、細胞の表面上のＧＰＩタンパク質に融合されたＧＲ２コイルドコイルペプチドへのヘテロ二量体化によって、細胞表面に捕捉される。次いで、適切な検出手段によって、所望の抗体を検出することができる。しかしながら、重鎖がＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていない完全長抗体の作製に関しては、所望の抗体を産生することが同定された宿主細胞を抗生物質の不存在下で増殖させる。発現カセットＣの後ろの前置物は、ＧＲ１コイルドコイルペプチドに融合されていないＦａｂ断片を産生するように適合させることができる。図６は、その中で発現カセットＣがＨｅｒ２抗原に対して特異的である完全長抗体をコードする構築されたプラスミドの地図を示している。表３は、ＧＲ１に融合されたＦａｂ（Ａ）又は抗体（Ｂ）をコードする発現カセットを含有する構築された多数の代表的なプラスミドを示す。表３には、発現カセットＣを含むプラスミドも示されている。
Figure 0005731827
プラスミドｐＧＬＹ３０２８及びｐＧＬＹ３９１５。抗ｈｅｒ２抗体の重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２２及び２３に示されている。ＧＲ１に融合された抗ｈｅｒ２Ｆａｂ重鎖及びＳｃαＭＴプレプロシグナル配列をコードする核酸配列が、配列番号５１に示されている。ＳｃαＭＴプレプロシグナル配列（配列番号４９）に融合された抗ｈｅｒ２軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５２に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９２６。抗ＤＫＫ１抗体の重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２４及び２５に示されている。ＧＲ１に融合された抗ＤＫＫ１Ｆａｂ重鎖及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列をコードする核酸配列が、配列番号５３に示されている。アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列（配列番号３３）に融合された抗ＤＫＫ１軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５４に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９１６。抗ＣＤ２０抗体の重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２６及び２７に示されている。抗ＣＤ２０、Ｃ２Ｂ８、ＧＲ１に融合されたＦａｂ重鎖及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列をコードする核酸配列が、配列番号５５に示されている。抗ＣＤ２０、Ｃ２Ｂ８、アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５６に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９１７−３９２０。抗Ｃ２０Ｆａｂ抗体のフレーム移植された重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２８及び２９に示されている。抗ＣＤ２０、フレーム移植された、ＧＲ１に融合されたＦａｂ重鎖及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列をコードする核酸配列が、配列番号５７に示されている。抗ＣＤ２０、フレーム移植された、アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５８に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９３９及び４１。抗ｈｅｒ２抗体の重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２２及び２３に示されている。ＧＲ１に融合された抗ｈｅｒ２完全長重鎖及びＳｃαＭＴプレプロシグナル配列をコードする核酸配列が、配列番号５９に示されている（ｐＧＬＹ３９３９）。ＧＲ１及びＳｃαＭＴプレプロシグナル配列に融合された、重鎖をコードするＯＲとＧＲ１コードするＯＲＦとの間に単一の停止コドンを有する抗ｈｅｒ２完全長重鎖をコードする核酸配列が、配列番号６０に示されている（ｐＧＬＹ３９４１）。両プラスミド中のＳｃαＭＴプレプロシグナル配列に融合された抗ｈｅｒ２軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５２に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９４２。抗ＣＤ２０抗体の重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２６及び２７に示されている。ＧＲ１及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された、重鎖をコードするＯＲＦとＧＲ１をコードするＯＲＦとの間に単一の停止コドンを有する抗ＣＤ２０、Ｃ２Ｂ８完全長重鎖をコードする核酸配列が、配列番号６１に示されている。抗ＣＤ２０、Ｃ２Ｂ８、アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号５６に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９４３。抗ＣＤ２０抗体のＧｅｎｍａｂ重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号３０及び３１に示されている。ＧＲ１及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された、重鎖をコードするＯＲＦとＧＲ１をコードするＯＲＦとの間に単一の停止コドンを有する抗ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂ完全長重鎖をコードする核酸配列が、配列番号６２に示されている。抗ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂ、アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号６３に示されている。
プラスミドｐＧＬＹ３９４４。ＧＲ１及びアスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された、重鎖をコードするＯＲＦとＧＲ１をコードするＯＲＦとの間に単一の停止コドンを有する抗ＣＤ２０完全長重鎖をコードする核酸配列が、配列番号６４に示されている。アスペルギルス・ニガーαアミラーゼシグナル配列に融合された抗ＣＤ２０軽鎖をコードする核酸配列が、配列番号６５に示されている。
Ｆａｂ及び抗体−ＧＲ１融合タンパク質発現カセット並びにＧＰＩタンパク質−ＧＲ２融合タンパク質発現カセットの酵母中での同時発現
ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２融合タンパク質及びＦａｂ又は抗体−ＧＲ１融合タンパク質をコードする発現カセットを含有するプラスミドを糖操作された酵母中に形質転換するために、２つの異なる方法を使用した。
第一のアプローチでは、ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２融合タンパク質発現カセットを含有し、及び第一の選択マーカーを含有するプラスミドベクターをピー・パストリス中に形質転換し、ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２発現カセットを有するコロニーを選択するための選択手段とともに培地上に播種した。次いで、ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２融合タンパク質の存在に関して、陽性コロニーをスクリーニングするために、コロニーＰＣＲを使用する。最後に、Ｆａｂ又は抗体−ＧＲ１融合発現カセットを含有し、及び第二の選択マーカーを付与するための遺伝子を含有するプラスミドを用いてこれらの細胞を形質転換し、第二の選択手段の存在下で細胞を増殖させることによって、組換え細胞を同定した。第二のアプローチでは、抗体又はＦａｂ−ＧＲ１融合タンパク質発現カセットを含有するプラスミドを、まず、糖操作されたピキア・パストリス中に形質転換し、その後、ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２融合タンパク質発現カセットを含有するプラスミドで形質転換する。
図３は、ＧＰＩタンパク質−ＧＲ２発現カセット及びマーカー遺伝子としてのエス・セレビシアエＡＲＲ３遺伝子を含有するプラスミドベクターの例であるプラスミドｐＧＬＹ３０３３を示す。エス・セレビシアエ由来のＡＲＲ３遺伝子は、亜ヒ酸塩／エステルの存在下で増殖されている細胞へ亜ヒ酸塩／エステル耐性を付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ， Ｙｅａｓｔ， １３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−０６６（１９９７））。図５及び６は、Ｆａｂ−ＧＲ１（図５）又は抗体−ＧＲ１（図６）融合タンパク質発現カセットを含有するプラスミドの例を示している。Ｆａｂ−ＧＲ１又は完全抗体−ＧＲ１融合発現カセットを含有する図５及び６中に示されているプラスミドは、ＴＲＰ２遺伝子坐の中に組み込むためにベクターを標的誘導するために、ピキア・パストリス中のＴＲＰ２遺伝子坐の一部に相同的な核酸と及び抗生物質Ｚｅｏｃｉｎへの耐性を付与する遺伝子も含有する。この核酸内でベクターが直鎖化されている場合には、プラスミドベクターは、ＴＲＰ２遺伝子坐中への単一の交差相同組換えを可能とする。従って、図５及び６に示されているベクターによって、組換えピキアパストリス株は、細胞のゲノム中に組み込まれたＦａｂ又は抗体ＧＲ１融合発現カセットを用いて作製することが可能となる。
表４は、作製された多数の代表的な酵母株を示している。全ての株は、ＧＳ２．０バックグラウンド内に存在した。ＧＳ２．０株は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン（株ＹＧＬＹ６３８及びＹＧＬＹ２６９６）を有する糖タンパク質を産生する糖操作されたピキア・パストリス株である。主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する株は、例えば、米国特許第７，０２９，８７２号及び「Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）」中に記載されている。株ＹＧＬＹ２６９６は、さらに、内在性シャペロンタンパク質ＰＤＩをコードする遺伝子が欠失されており、ヒトＰＤＩシャペロンタンパク質をコードする核酸を発現し、ＰＥＰ４遺伝子坐の中に挿入されたヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードする核酸をさらに含むＧＳ２．０株である（下記実施例６参照）。
Figure 0005731827
ＯＤ６００が２になるまで、ＢＭＧＹ培地５０ｍＬ中で上記ピキア・パストリス株を増殖させる。１Ｍソルビトールで細胞を３回洗浄し、１Ｍソルビトール１ｍＬ中に再懸濁する。約１から２μｇの直鎖化されたプラスミドをこれらの形質転換受容性細胞と混合する。ピキア・パストリス中への核酸の電気穿孔専用の製造業者のプログラムを使用し、ＢｉｏＲａｄ電気穿孔装置を用いて形質転換を行う。回収培地１ｍＬを細胞に添加し、次いで、３００μｇ／ｍＬゼオシンを加えたＭＧ又は５０μｇ／ｍＬ亜ヒ酸塩／エステルを加えたＹＰＧの上に細胞を播種する。
Ｆａｂをディスプレイする酵母の増殖及び誘導。
９６ディープウェルプレート中のＢＭＧＹ６００μＬ又は２５０ｍＬの振盪フラスコ中のＢＭＧＹ５０ｍＬを用いて、Ｆａｂ−ＧＲ１融合タンパク質発現カセット及びＧＰＩタンパク質−ＧＲ２発現カセットの両方で形質転換された、糖操作された酵母を２日間接種した。遠心によって細胞を集め、上清を廃棄した。ＷＯ２００７／０６１６３１に教示されている方法に従って、ＢＭＭＹ３００μＬ又は２５ｍＬ中で、Ｐｍｔｉ−３阻害剤とともに一晩温置することによって細胞を誘導する。米国特許７，１０５，５５４号及び国際特許公開２００７０６１６３１に記載されているように、Ｐｍｔｉ−３は、３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド；３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒドである。
ヤギ抗ヒト重鎖及び軽鎖（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ４８８連結抗体によって、誘導された細胞を標識し、（図７に図示されているように）蛍光顕微鏡を用いて観察した。誘導後、１．５ｍＬ管中での遠心によって、ＯＤ６００が０．５から１の細胞を集めた。ＰＢＳ１ｍＬで２回細胞を濯ぎ、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８の０．５ｍＬ（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中の１：５００）を添加する。あるいは、抗原を検出するために、フルオレシン標識された二次抗体を使用することができる。検出抗体を除去するために、管を３７℃で１時間回転させ、遠心し、ＰＢＳ１ｍＬで３回濯いだ。ＰＢＳの約５０から１００μＬを管に添加し、細胞を混合し、蛍光顕微鏡で１０μＬの分取試料を観察し、写真撮影した（図７参照）。
発現カセットが抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ−ＧＲ１融合タンパク質をコードする上記記載に従って、ライブラリー中のＧＰＩ係留された９個のタンパク質のうち、完全長サッカロミセス・セレビシアエＳＥＤ１を発現する細胞が最も強烈なシグナルを有し、エス・セレビシアエＣＷＰ２がこれに次ぐことが明らかにされた（図８ＡからＪ参照）。図１５ＡからＤは、ＹＧＬＹ５１４９、ＹＧＬＹ５１５２、ＹＧＬＹ６６９３及びＹＧＬＹ６６９４が全て、ＳＥＤ１アンカーに融合されたＧＲ２を用いて細胞表面に捕捉された抗ＣＤ２０Ｆａｂを発現したことを示している。従って、残りの実施例のために、細胞表面係留タンパク質として、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質を選択した。
（実施例２）
糖操作されたピキア・パストリスの表面上にディスプレイされた２つの異なるＦａｂ−ＧＲ１融合タンパク質の発現レベルは、完全長の対応物の発現レベルと相関した。
糖操作されたピキア・パストリス中で両者が発現された場合、抗Ｈｅｒ２完全長モノクローナル抗体の発現レベルは、抗ＤＫＫ１完全長モノクローナル抗体より一般に５倍大きい。完全長抗Ｈｅｒ２抗体を発現するピキア・パストリスは抗体約１．３ｇ／Ｌを産生することができるのに対して、完全長抗ＤＫＫ１抗体を発現するピキア・パストリスは、３Ｌの発酵装置中で約２００ｍｇ／Ｌを産生する。本実施例では、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ−ＧＲ１融合タンパク質及び抗ＤＫＫ１−ＧＲ１融合タンパク質Ｆａｂを発現させ、実施例１に記載されているように、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質を発現する糖操作されたピキア・パストリス株２．０の表面上にディスプレイした。抗ｈｅｒ２重及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２２及び２３に示されている。抗ＤＫＫ１重及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２４及び２５に示されている。
２つのＦａｂの発現レベルを測定するために、実施例２に記載されている方法に従って、ヤギ抗ヒトＨ＋ＬＡｌｅｘａ４８８で細胞を標識し、写真撮影した。図９は、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂと抗ＤＫＫ１Ｆａｂの間の蛍光強度の差を示している。抗Ｈｅｒ２Ｆａｂを発現する細胞は、抗ＤＫＫ１Ｆａｂを発現する細胞より、細胞の表面上にずっと強いシグナルを示した。図９Ａでは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂ−ＧＲ１融合タンパク質の両方を発現するピキア・パストリスＧＳ２．０株を示している。図９Ｂは、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂを発現するが、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質を発現しないピキア・パストリスＧＳ２．０株を示す。図９Ｃは、ＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質及び抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ−ＧＲ１融合タンパク質の両方を発現するピキア・パストリスＧＳ２．０株を示している。全てのこれらの細胞を抗ヒトＨ＆ＬＡｌｅｘａ４８８で標識し、同じ露出時間を用いて写真を撮影した。図９Ｂは、ＧＰＩタンパク質アンカーがないと、細胞はＦａｂをディスプレイすることができないことを明瞭に示している。図９ＡからＣは、蛍光シグナルの強度がＦａｂの発現レベルを反映することも示している。弱く発現された抗ＤＫＫ１Ｆａｂは弱いシグナルを有し、より高い発現の抗体はより強いシグナルを有している。この結果は、完全長抗ＤＫＫ１及び抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体に対して観察された発現レベルと相関している。
（実施例３）
細胞の表面上にディスプレイされた抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂを発現する細胞を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。それぞれ蛍光標識された抗Ｈｅｒ２又は抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする糖操作された酵母を実施例１及び２に記載されているように調製した。細胞種の両方が検出抗体で標識されていない対照を調製した。フローサイトメトリー分析を用いて、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂをディスプレイする細胞が抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞と比べてより強い蛍光強度を有することが見出され、両細胞種は対応する非標識対照中で生じるシグナルと比べて、より強いシグナルを有していた。図１０では、これらの実験から得られた蛍光強度が合算された。図は、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂをディスプレイする細胞及び抗体ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞の間の蛍光強度の差を示しており、検出標識：抗Ｈｅｒ２Ｆａｂをディスプレイする細胞の不存在下にある同じ細胞は、抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞より著しくより高い蛍光強度を示した。これらの結果は、実施例３中の蛍光顕微鏡観察と一致していた。
抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ（株ＹＧＬＹ４１４５）及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂ（株ＹＧＬＹ４１４６）をディスプレイする細胞の混合物の蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）のプロファイルは、以下のようにして実施した。抗Ｈｅｒ２Ｆａｂをディスプレイする細胞及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞を、以下の比、すなわち、１：１、１：１０、１：１００及び１：１，０００で一緒に混合した。混合の前に、ヤギ抗ヒトＨ＋ＬＡｌｅｘａ４８８で細胞を標識した。図１１は、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂをディスプレイする細胞及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞という細胞の２つの別個の集団が１：１の比で見られることを示している。混合比が上昇するにつれて、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ集団の蛍光強度が減少する。１：１００及び１：１，０００のより高い比では、細胞の２つの別個の集団はもはや認められない。
蛍光の高いレベルから低いレベルまでの観察された分布にわたって細胞の多様性について、さらに詳しい洞察を得るために、第二の実験を行った。抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞（それぞれ、株ＹＧＬＹ４１４５及びＹＧＬＹ４１４６）を、１：１の比で混合した（図１２Ａ参照）。強度スペクトルにわたって、減少する蛍光の５つの領域（図１２Ｂ：領域Ｃ１からＣ５）から細胞集団を単離し、播種した。細胞の各集団に関して、領域中の主なＦａｂを決定するために、各抗体に対して特異的なＰＣＲプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって９６のコロニーを分析した。得られた結果は、高い蛍光シグナルに関する分別が高発現抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ細胞の濃縮をほぼ専らもたらすのに対して、低蛍光に関する単離は、低発現細胞（この場合、抗ＤＫＫ１Ｆａｂ発現細胞）の濃縮をもたらす（図１２Ｃ）ことを確認した。
（実施例４）
この実施例は、低レベルのＦａｂ産生細胞のより大きな集団から高Ｆａｂ産生細胞の集団に関して単離及び濃縮するためのＦＡＣＳの使用を例示する。
蛍光標識された抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ及び抗ＤＫＫ１Ｆａｂをディスプレイする細胞を標識し、１：１０００の比で混合し、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光の最も高い１％の細胞を単離した（図１３中の左のヒストグラムの右端）。細胞を選択培地上に播種し、３から４日間温置した。次いで、ＢＭＧＹ培地でプレートを洗浄することによって、細胞を収集し、ＢＭＭＹで再度誘導した。再誘導された細胞を標識し、その後、分別した。この分別の第二のラウンドによって、細胞の２つの異なる集団が得られた（図１３、真ん中のストグラム）。最高及び最低の蛍光を有する細胞を単離し、分別の最初のラウンドにおけると同様に、再び、増殖、収集、誘導及び標識を行った。フローサイトメトリーを用いて、これら２つの集団を再び分析した（図１３、右側のヒストグラム）。次いで、高い及び低い蛍光強度の端から得られた細胞を単離し、増殖した。より高い蛍光シグナルの集団は典型的な抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片プロファイルを与えたのに対して、より低い蛍光強度の集団は、図１２Ｂに示されているものと極めて似通った抗ＤＫＫ１Ｆａｂ断片プロファイルを示した。従って、分別の３つのラウンドにおいて、本発明者らは、１：１０００（抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片：抗ＤＫＫ１Ｆａｂ断片）希釈物から、抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片の高いレベルを発現する細胞の異なる集団を単離し、濃縮することができた。これらの実験は、Ｆａｂ断片の特定の集団に関して単離及び濃縮するために、細胞分別に基づいたアプローチの多用途性及び能力を明瞭に示している。本明細書中の方法は、抗体の特定の集団を発現する細胞に関して単離及び濃縮を行うために使用することができる。
（実施例５）
この実施例は、本明細書に開示されている方法を用いた、完全長抗体の表面ディスプレイを例示する。
図６は、完全長抗Ｈｅｒ２抗体をコードする最後のコドンの後に、翻訳領域内に挿入された単一の停止コドンが存在し、発現カセットＣに関して実施例１で論述されている停止コドンの通過読み取り法を用いて、酵母細胞表面上に完全長抗体をディスプレイするために使用することができる、ＧＲ１に融合された抗Ｈｅｒ２抗体をコードする発現カセットを含むプラスミドｐＧＬＹ３９４１を示す。
ｐＧＬＹ３９４１を含有するピキア・パストリス株ＹＧＬＹ６７２４は、停止コドンの翻訳上の通過読み取りをもたらす条件下でタンパク質が産生されたときに、完全長抗Ｈｅｒ２抗体−ＧＲ１コイルドコイル融合タンパク質をディスプレイする（配列番号３２参照）。ｐＧＬＹ３９３９（Ｈｅｒ２抗体とＧＲ１ペプチドに対するコード配列の間に停止コドンが存在しない。）を含有するピキア・パストリス株ＹＧＬＹ６７２２も、完全長抗Ｈｅｒ２抗体−ＧＲ１コイルドコイル融合物をディスプレイする。培地中の抗生物質Ｇ４１８の量を増加させながら、ＹＧＬＹ６７２４を増殖させた。Ｇ４１８は、翻訳の終結を阻害することにより、停止コドンの通過読み取りを増加させ、蛍光強度を増加させる。２つの抗体の発現レベルを測定するために、実施例２に記載されている方法に従って、ヤギ抗ヒトＨ＋ＬＡｌｅｘａ４８８で細胞を標識し、写真を撮影した。図１４ＡからＦは、顕微鏡観察及びＦＡＣＳによって、抗Ｈｅｒ２完全長抗体を表面上にディスプレイし、蛍光及びＦＡＣＳ分析を用いて検出できることを示す。
（実施例６）
株ＹＧＬＹ２６９６において、内在性ＰＤＩをコードする遺伝子はヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換され、ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードする核酸分子はＰＥＰ４遺伝子坐の中に挿入された。内在性グリコシル化経路を変化させて、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎグリカンを有する糖タンパク質を産生させるために、この株をさらに操作した。株ＹＧＬＹ２６９６は、同時係属中の２００８年２月２０日に出願された出願逐次番号６１／０６６，４０９及び２００８年８月１２日に出願された６１／１８８，７２３に開示されており、両出願の全体が本明細書に組み込まれる。この株は、免疫グロブリンを産生し、低下したＯ−グリコシル化を有する免疫グロブリンを産生するのに有用であることが示された。株ｙＧＬＹ２６９６の構築は、以下の工程を含んだ。
ヒトＰＤＩタンパク質をコードする発現カセット及びピキア・パストリスＰＤＩ１をコードする遺伝子をヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換するためのピキア・パストリスＰＤＩ１遺伝子へプラスミドベクターを標的誘導するための核酸分子を含む発現／組み込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築は、以下のとおりであり、図８に示されている。ヒトＰＤＩ１をコードするｃＤＮＡは、プライマーｈＰＤＩ／ＵＰ１：５’ＡＧＣＧＣ ＴＧＡＣＧ ＣＣＣＣＣ ＧＡＧＧＡ ＧＧＡＧＧ ＡＣＣＡＣ３’（配列番号３５）及びｈＰＤＩ／ＬＰ−ＰａｃＩ：５’ＣＣＴＴＡ ＡＴＴＡＡ ＴＴＡＣＡ ＧＴＴＣＡ ＴＣＡＴＧ ＣＡＣＡＧ ＣＴＴＴＣ ＴＧＡＴＣ ＡＴ ３’（配列番号３６）、ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）及びヒト肝臓ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間の１サイクル、９５℃２０秒間、５８℃３０秒間及び７２℃１．５分間の２５サイクル後に、７２℃１０分間の１サイクルであった。プラスミドベクターｐＧＬＹ６１８を作製するために、得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１中にクローニングした。ヒトＰＤＩ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３７及び３８に示されている。
ピキア・パストリスＰＤＩ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３９及び４０に示されている。ピキア・パストリスＰＤＩ１の５’及び３’領域を含む核酸分子の単離は、ピキア・パストリスゲノムＤＮＡから得られる領域のＰＣＲ増幅によって行った。５’領域は、プライマーＰＢ２４８：５’ＡＴＧＡＡ ＴＴＣＡＧ ＧＣＣＡＴ ＡＴＣＧＧ ＣＣＡＴＴ ＧＴＴＴＡ ＣＴＧＴＧ ＣＧＣＣＣ ＡＣＡＧＴ ＡＧ ３’（配列番号４１）；ＰＢ２４９：５’ＡＴＧＴＴ ＴＡＡＡＣ ＧＴＧＡＧ ＧＡＴＴＡ ＣＴＧＧＴ ＧＡＴＧＡ ＡＡＧＡＣ ３’（配列番号４２）を用いて増幅した。３’領域は、プライマーＰＢ２５０：５’ＡＧＡＣＴ ＡＧＴＣＴ ＡＴＴＴＧ ＧＡＧＡＣ ＡＴＴＧＡ ＣＧＧＡＴ ＣＣＡＣ ３’（配列番号４３）；ＰＢ２５１：５’ＡＴＣＴＣ ＧＡＧＡＧ ＧＣＣＡＴ ＧＣＡＧＧ ＣＣＡＡＣ ＣＡＣＡＡ ＧＡＴＧＡ ＡＴＣＡＡ ＡＴＴＴＴ Ｇ−３’（配列番号４４）を用いて増幅した。ピキア・パストリス株ＮＲＲＬ−１１４３０ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅のために使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間の１サイクル、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間及び７２℃２．５分間の２５サイクル後に、７２℃１０分間の１サイクルであった。それぞれ、プラスミドベクターｐＧＬＹ６２０及びｐＧＬＹ６１７を作製するために、得られたＰＣＲ断片ＰｐＰＤＩ１（５’）及びＰｐＰＤＩ１（３’）を別々にプラスミドベクターｐＣＲ２．１中にクローニングした。ｐＧＬＹ６７８を構築するために、プラスミドベクターをピキア・パストリスＡＲＧ３遺伝子坐へ標的誘導する組み込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２４のＤＮＡ断片ＰｐＡＲＧ３−５’及びＰｐＡＲＧ−３’を、それぞれ、プラスミドベクターｐＧＬＹ６７８をＰＤＩ１遺伝子坐へ標的誘導し、ＰＤＩ１遺伝子坐の発現を破壊するＤＮＡ断片ＰｐＰＤＩ（５’）及びＰｐＰＤＩ（３’）で置換した。
次いで、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子がピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ）の調節下に置かれているプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を作製するために、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８中にクローニングした。発現／組み込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、５’末端のＮｏｔＩ制限酵素部位及び平滑３’末端を有するサッカロミセス・セレビシアエα接合因子（ＭＦ）前配列シグナルペプチド（ＳｃαＭＦプレシグナルペプチド）をコードする核酸分子とＡｆｅＩ及びＰａｃＩによってプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８から放出されて、ＮｏｔＩ及びＰａｃＩを用いて消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８中に、平滑５’末端及び３’末端のＰａｃＩ部位を有する核酸分子を産生するヒトＰＤＩをコードする核酸分子を含む発現カセットとを連結することによって構築した。得られた組み込み／発現プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、ピキア・パストリスプロモーターへ作用可能に連結されたヒトＰＤＩ１／ＳｃａＭＦプレシグナルペプチド融合タンパク質をコードする発現カセット及びＰＤＩ１遺伝子坐を崩壊させ、ＰＤＩ１遺伝子中に発現カセットを組み込むためのピキア・パストリスＰＤＩ１遺伝子坐へプラスミドベクターを標的とするための核酸分子配列を含む。図２は、プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を図解する。ＳｃαＭＦプレシグナルペプチドののヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４９及び５０に示されている。
ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードする発現／組み込みベクターｐＧＬＹ２２３３の構築は以下のとおりであり、図３に示されている。ヒトＧＲＰ９４は、プライマーｈＧＲＰ９４／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣ ＴＧＡＣＧ ＡＴＧＡＡ ＧＴＴＧＡ ＴＧＴＧＧ ＡＴＧＧＴ ＡＣＡＧＴ ＡＧ−３’；（配列番号４５）；及びｈＧＲＰ９４／ＬＰ１：５’−ＧＧＣＣＧ ＧＣＣＴＴ ＡＣＡＡＴ ＴＣＡＴＣ ＡＴＧＴＴ ＣＡＧＣＴ ＧＴＡＧＡ ＴＴＣ ３’；（配列番号４６）を用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間の１サイクル、９５℃２０秒間、５５℃２０秒間及び７２℃２．５分間の２５サイクル後に、７２℃１０分間の１サイクルであった。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６を作製するために、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１中にクローニングした。ヒトＧＲＰ９４のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４７及び４８に示されている。
ヒトＧＲＰ９４をコードする核酸分子は、ＡｆｅＩ及びＦｓｅＩを有するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６から放出された。次いで、この核酸分子を、上述のようにＮｏｔＩ及び平滑末端を有するＳｃαＭＰプレシグナルペプチドをコードする核酸分子へ連結し、ピキア・パストリスＰＥＰ４の５’及び３’領域（それぞれ、ＰｐＰＥＰ４−５’及びＰｐＰＥＰ４−３’領域）を含む核酸分子を有するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３１をＮｏｔＩ及びＦｓｅＩで消化して、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９をＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩを用いて、プラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７からＰｐＰＤＩ１プロモーターを含有するＤＮＡ断片を除去し、このＤＮＡ断片をｐＧＬＹ２２２９中に連結してｐＧＬＹ２２３３を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３は、ピキア・パストリスＰＤＩプロモーターの調節下にあるヒトＧＲＰ９４融合タンパク質をコードし、ＰＥＰ４遺伝子坐を破壊し、発現カセットをＰＥＰ４遺伝子坐中へ組み込むために、ゲノムのＰＥＰ４遺伝子坐へプラスミドベクターを標的誘導するためのピキア・パストリスＰＥＰ４遺伝子の５’及び３’領域を含む。図３は、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を図解している。
プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２、ｐＧＬＹ１８９６及びｐＧＦＩ２０７ｔの構築は、以下のとおりであった。全てのトリコデルマ・リーゼイα−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドベクターは、発現がピキア・パストリスＧＡＰプロモーターの調節下にあり、及びプラスミドベクターの組み込みがピキア・パストリスＰＲＯ１遺伝子坐へ標的誘導されており、及び選択がピキア・パストリスＵＲＡ５遺伝子を使用している、エス・セレビシアエαＭＡＴプレシグナルペプチド（ＳｃαＭＰプレシグナルペプチド）に融合されたティー・リーゼイα−１，２−マンノシダーゼ触媒性ドメイン（国際出願公開ＷＯ２００７０６１６３１を参照）をコードするｐＧＦＩ１６５に由来した。プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５の地図が、図４に示されている。
ｐＧＦＩ１６５中のＧＡＰプロモーターをピキア・パストリスＡＯＸ１（ＰｐＡＯＸ１）プロモーターで置換することによって、プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２を作製した。これは、ｐＧＬＹ２０２８から得られるＥｃｏＲＩ（平滑末端化合される。）−ＢｇｌＩＩ断片としてＰｐＡＯＸ１プロモーターを単離し、ＮｏｔＩ（平滑末端化合される。）及びＢｇｌＩＩを用いて消化されたｐＧＦＩ１６５中に挿入することによって達成された。プラスミドベクターの組み込みはピキア・パストリスＰＲＯ１遺伝子坐への組み込みであり、選択はピキア・パストリスＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の地図が、図５に示されている。
プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５中に挿入されたエス・セレビシアエＭＮＮ２膜挿入リーダーペプチド融合タンパク質（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）参照）に融合されたマウスα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットを含有する（図５）。ＸｈｏＩ（及び末端が平滑化されている。）及びＰｍｅＩで消化されたｐＧＬＹ１４３３から得られるＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２−マウスＭＮＳＩ発現カセットを単離し、ＰｍｅＩで消化されたｐＧＦＩ１６５中へ断片を挿入することによって、これを達成した。プラスミドベクターの組み込みはピキア・パストリスＰＲＯ１遺伝子坐への組み込みであり、選択はピキア・パストリスＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６の地図が、図４に示されている。
ＵＲＡ５選択マーカーが、亜ヒ酸塩／エステルに対する耐性を付与するエス・セレビシアエＡＲＲ３（ＳｃＡＲＲ３）遺伝子で置換されていることを除き、プラスミドベクターｐＧＦ１２０７ｔはｐＧＬＹ１８９６に類似する。ＡｓｃＩ（ＡｓｃＩ末端は平滑化されている。）及びＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＦＩ１６６からＳｃＡＲＲ３遺伝子を単離し、ＳｐｅＩで消化され、ＳｐｅＩ末端が平滑化され、ＢｇｌＩＩＩで消化されたｐＧＬＹ１８９６中に断片を挿入することによって、これが達成された。プラスミドベクターの組み込みはピキア・パストリスＰＲＯ１遺伝子坐への組み込みであり、選択はサッカロミセス・セレビシアエＡＲＲ３遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＦＩ２００７ｔの地図が、図４に示されている。エス・セレビシアエ由来のＡＲＲ３遺伝子は、亜ヒ酸塩／エステルの存在下で増殖されている細胞へ亜ヒ酸塩／エステルを付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ， Ｙｅａｓｔ， １３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−０６６（１９９７））。
上記発現／組み込みベクターでの酵母の形質移入は、以下のとおりであった。約０．２から６の間のＯＤになるまで、ＹＰＤ培地５０ｍＬ（酵母抽出物（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））中で一晩、ピキア・パストリス株を増殖させた。氷上での３０分間の温置後、２５００から３０００ｒｐｍで５分間の遠心によって、細胞を沈降させた。溶媒を除去し、氷冷した無菌の１Ｍソルビトール０．５ｍＬ中に再懸濁する前に、氷冷した無菌の１Ｍソルビトールで細胞を３回洗浄した。直鎖化されたＤＮＡ（５から２０μｇ）１０μＬ及び細胞懸濁液１００μＬを電気穿孔キュベット中に合わせて、氷上で５分間温置した。電気穿孔は、予め設定されたピキア・パストリスプロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）に従って、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ中で行い、その後直ちに、ＹＰＤＳ回収培地（１Ｍソルビトールを加えたＹＰＤ培地）１ｍＬを添加した。選択培地上に細胞を播種する前に、室温（２６℃）で、４時間から一晩、形質移入された細胞を回収した。
細胞株の作製は以下のとおりであり、図６に示されている。以前に記載されている方法（例えば、Ｎｅｔｔ ａｎｄ Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：１２４４（２００３）参照）を用いて、株ｙＧＬＹ２４−１（ｕｒａ５デルタ：：ＭＥＴ１ｏｃｈ１デルタ：：ｌａｃＺｂｍｔ２デルタ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１デルタ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１デルタｍｎｎ４デルタ：：ｌａｃＺｍｅｔ１６デルタ：：ｌａｃＺ）を構築した。ＢＭＴ２遺伝子は、「Ｍｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）」及び米国特許出願公開２００６０２１１０８５号に開示されている。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ｍｎｎ４Ｌ１遺伝子（ｍｎｎ４ｂとも称される。）は米国特許第７．２５９，００７号に開示されている。ｍｎｎ４は、ｍｎｎ４Ｌ２又はｍｎｎ４ａを表す。遺伝子型において、Ｋ１ＭＮＮ２−２はクルベロミセス・ラクティスＧｌｃＮＡｃトランスポーターであり、ＭｍＳＬＣ３５Ａ３はムス・ムスキュラス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧｌｃＮＡｃ輸送体である。ＵＲＡ５の欠失は、ｙＧＬＹ２４−１株をウラシルに対して栄養要求性にし（米国特許出願公開２００４／０２２９３０６号参照）、その後に得られるヒト化されたシャペロン株を構築するために使用した。本明細書の実施例において、ピキア・パストリスゲノムの特定の遺伝子坐中に、様々な発現カセットが組み込まれたが、本発明の実施は組み込みのために使用される遺伝子坐には非依存的であることが理解される。発現カセットの組み込みのために、本明細書中に開示されている遺伝子坐以外の遺伝子坐を使用することが可能である。適切な組み込み部位には、米国特許出願公開２００７００７２２６２号に列記されているものが含まれ、並びにサッカロミセス・セレビシアエ及び他の酵母又は真菌に対して公知の遺伝子坐に対する相同体が含まれる。
内在性ピキア・パストリスＰＤＩ遺伝子の不存在下で、ピキア・パストリス細胞中で発現されたヒトＰＤＩ１の有効性を調べるために、株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４を作製した。株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４（ｈｕＰＤＩ）は、以下のように構築した。恒常的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２でｙＧＬＹ２４−１を形質移入することによって、株ｙＧＬＹ７０２を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、株ｙＧＬＹ７０２をウラシルに対して原栄養性にするピキア・パストリスＵＲＡ５をコードする発現カセットも含有した。ピキア・パストリスＰＤＩ１遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子によって安定に置換されており、株がウラシルに対して栄養要求性であるように株ｙＧＬＹ７０４を作製するために、ｙＧＬＹ７０２を５−ＦＯＡプレート上で対比選択することによって、ＵＲＡ５発現カセットを除去した。
プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２（ピキア・パストリスＡＯＸＩプロモーター（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳｌ）及びサッカロミセス・セレビシアエαＭＡＴプレシグナル配列へ作用可能に連結されたトリコデルマ・リーゼイマンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセットを含む。）をｙＧＬＹ７０４のＰＲＯ１遺伝子坐の中に形質移入することによって、株ｙＧＬＹ７３３を作製した。この株は、ヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換されたピキア・パストリスＰＤ１をコードする遺伝子を有し、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットを有しており、ＵＲＡ５栄養要求性である。ＰｐＡＯＸ１プロモーターは、細胞がメタノールの存在下で増殖されたときに、過剰発現を可能とする。
各々がプラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔ中のピキア・パストリスＧＡＰＤＨプロモーターへ作用可能に連結されたＴｒＭＮＳ１及びマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットを、ピキア・パストリスゲノム中の５’ＰＲＯ１遺伝子坐ＵＴＲにおいて対照株ｙＧＬＹ７３３中に組み込むことによって、株ｙＧＬＹ７６２を構築した。この株は、ヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換されたピキア・パストリスＰＤ１をコードする遺伝子を有しており、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットを有しており、ＵＲＡ５栄養要求性である。
株ｙＧＬＹ２６７７は、５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７６２を対比選択することによって作製した。この株は、ヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換されたピキア・パストリスＰＤ１をコードする遺伝子を有しており、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットを有しており、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＧＡＰＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットを有しており、ＵＲＡ５栄養要求性である。
株ｙＧＬＹ２６９６は、ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３をＰＥＰ４遺伝子坐の中に組み込むことによって作製された。この株は、ヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換されたピキア・パストリスＰＤ１をコードする遺伝子を有しており、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットを有しており、ＰＲＯ１遺伝子坐の中に組み込まれたＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットを有しており、ＰＥＰ４遺伝子坐の中に組み込まれたヒトＧＲＰ６４を有しており、ＵＲＡ５原栄養性である。このシャペロンヒト化された株の系統図が、図１６に示されている。
（実施例７）
Ｆａｂ断片１Ｈ２３及び１Ｄ０５（ＰＣＳＫ９、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシン／ケクシン９型に対して特異的な低及び高親和性Ｆａｂ断片）並びに抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片Ｇｅｎｍａｂを作製するための、様々な抗体重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドｐＧＬＹ５１０７、ｐＧＬＹ５１０８及びｐＧＬＹＳ１１０の構築は、以下のとおりであった。
ピキア・形質転換選択のためのマーカーとしてゼオシンを用いて、ＦａｂディスプレイベクターｐＧＬＹ３９５８（図２０）を構築した。ＩｇＧ１ＣＨ１ドメイン、リンカー及びＧＲ１コイルドコイルペプチド及びＩｇＧ１κ軽鎖の定常領域をコードする核酸分子はコドン最適化されており、ピキア・パストリスのコドン使用にしたがって、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子は何れも、ピキアＡＯＸ１プロモーター下にある。異なる抗体可変領域クローニングのために、ユニークな部位ＥｃｏＲ１及びＸｈｏ１を作製した。同様に、軽鎖の可変領域のクローニングを容易にするために、ＡＯＸ１プロモーターと軽鎖の定常領域の間に、Ｐｓｔ１及びＫｐｎ１部位を添加した。
１Ｄ０５、１Ｈ２３及び抗ＣＤ２０Ｇｅｎｍａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸分子をコドン最適化し、逆翻訳し、そのアミノ酸配列に基づて、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。アスペルギルス・アミラーゼシグナル配列（配列番号３３）をコードする核酸分子を、遺伝子合成の間に、１Ｈ２３重鎖及び軽鎖をコードする読み取り枠（それぞれ、配列番号７０及び７２）の５’末端へインフレームに付加した。重鎖をコードする読み取り枠は、ＧＲ１をコードするヌクレオチド配列も含んだ。サッカロミセス・セレビシア接合因子プレシグナルペプチド（α−ＭＡＴ−プロ；配列番号４９）シグナル配列をコードする核酸分子を、遺伝子合成の間に、１Ｄ０５重鎖及び軽鎖をコードする読み取り枠（それぞれ、配列番号６６及び６８）の５’末端へインフレームに付加した。重鎖をコードする読み取り枠は、ＧＲ１をコードするヌクレオチド配列も含んだ。合成の間、重鎖をコードする核酸分子の５’にＥｃｏＲ１部位が導入され、軽鎖をコードする核酸分子の５’末端にＰｓｔ１部位が導入された。それぞれ、重鎖及び軽鎖定常領域の保存されたアミノ酸をコードする核酸分子を用いて、重鎖及び軽鎖の３’末端にＸｈｏ１及びＫｐｎ１部位を作製した。４片の連結を用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸分子をｐＧＬＹ３９５（図２１）中に同時にクローニングした。１Ｄ０５重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドｐＧＬＹ５１０８（図２１）、１Ｈ２３重鎖及び軽鎖をコードするｐＧＬＹ５１０９（図２２）及び抗ＣＤ２０Ｇｅｎｍａｂの軽鎖及び重鎖をコードするｐＧＬＹ５１０７（図２３）。作製されたプラスミドの正体を確認するために、コロニーＰＣＲ、酵素消化及びＤＮＡ配列決定を用いた。配列番号６６によってコードされるシグナルペプチドを有する１Ｄ０５重鎖のアミノ酸配列が、配列番号６７に示されている。配列番号６８によってコードされるシグナルペプチドを有する１Ｄ０５軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号６９に示されている。配列番号７０によってコードされるシグナルペプチドを有する１Ｈ２３重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７１に示されている。配列番号７２によってコードされるシグナルペプチドを有する１Ｈ２３軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７３に示されている。ＰＣＳＫ９のアミノ酸配列は、配列番号７４に示されている。
１Ｄ０５、１Ｈ２３及び抗ＣＤ２０ＧｅｎｍａｂＦａｂディスプレイ株を作製するための酵母形質転換は以下のとおりであった。３７℃でのＳｐｅ１消化によって、プラスミドｐＧＬＹ５１０７、ｐＧＬＹ５１０８及びｐＧＬＹ５１１０を直鎖化し、ゲル電気泳動によって直鎖化を確認した。冷エタノールを使用する標準的な操作を用いて、ＤＮＡを沈降させた。ＯＤ６００の１から２の間の細胞密度になるまで、ピキア・宿主ＹＧＬＹ５０７９（ＹＧＬＹ２６９６中でＳｃＳＥＤ１−ＧＲ２融合タンパク質を発現する。）を一晩ＢＭＧＹ培地５０ｍＬ中で増殖させた。細胞を形質転換受容性にするために、冷たい無菌水及び１Ｍソルビトールで細胞を３回洗浄した。直鎖化されたＤＮＡを形質転換受容性細胞と混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ電気穿孔機を用いてショックを与えた。次いで、ショックを与えた細胞に、回収培地１ｍＬを添加し、室温で１から２時間、細胞を温置した。次いで、形質転換体を選択するための適切なＺｅｏｃｉｎ濃度とともに、細胞をＹＰＧプレート上に播種した。産生された株が、表５に示されている。
Figure 0005731827
（実施例８）
酵母中で発現された重鎖及び軽鎖の集合には問題が存在し得ることが、サッカロミセス・セレビシアエに関して報告されている。従って、細胞表面上にディスプレイされたＦａｂ断片の完全性を決定するために、細胞表面上にディスプレイされたＦａｂ断片中の軽鎖に対する重鎖の比を測定した。
（１Ｄ０５Ｆａｂ断片重鎖及び軽鎖を発現する）株ＹＧＬＹ７７６２及び（１Ｈ２３Ｆａｂ断片重鎖及び軽鎖を発現する）株ＹＧＬＹ７７６４をＭＢＧＹ２００ｍＬ中で増殖させ、Ｍｉｃｒｏ２４細胞培養及び誘導の記述に従って、Ｍｉｃｒｏ２４バイオリアクター中で発現を誘導した。次いで、誘導された酵母培養物の約２０から４０μＬを除去し、ブロッキング溶液１ｍＬを試料に添加し、１０，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、ブロッキング溶液１ｍＬで細胞沈降物を３回洗浄した。ＯＤ６００を測定し、所望の最終容積中で１のＯＤ６００を得るために必要とされる容積を計算する。（通常、最終容積は、約２００μＬである。）。ブロッキング溶液：ＯｍｎｉＰｕｒから得たＢＳＡ６０ｇ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０の２００ｍＬ、１０×ＰＢＳ２００ｍＬ（Ｏｍｎｉ Ｐｕｒから入手）及び２リットルになるまでｄＨ２Ｏ。
重鎖のＦｄ領域を介してディスプレイされたＦａｂを検出するために、ストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（２ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｌｏｔ番号５３７２９Ａ）が結合された抗ヒトＩｇＧ２Ｆｄビオチン連結抗体（ＣＡＬＴＡＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コード番号ＭＨ１５２２、ロット番号４４３４０８Ａ：抗重鎖抗体）を使用し、軽鎖を検出するために、抗ヒトκアロフィコシアニン連結抗体（ＣＡＬＴＡＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃｏｄｅ番号ＭＨ１０５１５、ロット番号３５８８９７Ａ：抗軽鎖抗体）を使用した。一般に、暗所に保たれた回転装置上で、３０分間、室温で、抗重鎖抗体の３μＬを細胞とともに温置した。次いで、３％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ緩衝液で細胞を４回洗浄した。この後、ＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の３μＬ及び抗軽鎖抗体３μＬを添加し、暗所での回転装置上において、３０分間、室温で混合物を温置した。次いで、３％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ緩衝液で細胞を３回洗浄した。ＦＡＣＳによって、細胞を分析した。ＦｌｕｏＪｏを用いて、軽鎖及び重鎖（Ｆｄ）の蛍光強度をプロットした。
フローサイトメトリー分析は、ディスプレイされた重鎖がディスプレイされた軽鎖と対応することを示した。これは、細胞がＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖を適切に集合し、ディスプレイされたことを示す図１７Ａ及び１７Ｂに示されている。サッカロミセス・セレビシアエに対して報告された結果と異なり、Ｆａｂ断片をコードする核酸分子は特定の遺伝子坐の中に組み込まれ、自律的に複製するプラスミド中に与えられたものとは異なり、重鎖及び軽鎖の一定した発現をもたらす。さらに、重鎖及び軽鎖のＯ−グリコシル化を調節する条件下で（すなわち、宿主細胞シャペロンタンパク質及び／又はＯ−グリコシル化のＰｍｔｉ−３阻害剤の代わりに、ヒトシャペロンタンパク質が存在）、細胞を増殖させた。Ｐｍｔｉ−３阻害剤は、Ｏ−グリコシル化の占有率（すなわち、Ｆａｂ又は抗体分子上の総Ｏ−グリカンの数）を低下させる。Ｆａｂ又は抗体分子上のＯ−グリカンの鎖長を調節するために、細胞は、サッカロミセス・セレビシアエαＭＡＴプレシグナルペプチドに連結されたティー・リーゼイα−１，２−マンノシダーゼ（ｍａｎｎｓｏｄａｓｅ）触媒性ドメインをさらに発現する。
細胞培養及びＭｉｃｒｏ２４中での誘導
室温で２日間、通常の振盪フラスコ中のＢＭＧＹ培地２００ｍＬ中で、酵母ディスプレイ細胞を増殖した。酵母培養物を遠心し、容器を傾けて不要な上清を捨てる。実験に応じて、１００と２００の間のＯＤ６００になるように、残りの細胞ペレットを新鮮な誘導培地（処方に関しては、下記を参照）中に懸濁する。得られた培養物の約４．５ｍＬをＡｐｐｌｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒカセットのウェル中に接種し、カセットを密封するために気体透過性の低蒸発接着性膜を使用する。６．５のｐＨ設定点で、８００ｒｐｍの一定した撹拌速度を用いて、誘導された細胞を走行させる。各ウェルに、ｌｖｖｍの連続流を通気する（４．５ｍＬ／分）。これらの条件下で、培養物は、約１６から２０時間で２．５％メタノールを通例消費する。１６から２０時間後に又は溶解された酸素の放出が観察されたときに、１％から２．５％メタノールのさらなる塊を添加するので、細胞は誘導開始中に留まる。誘導の所望の長さが達成されたら、Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒを停止させ、標識のために、培養物をウェルから取り出すことができる。
Figure 0005731827
（実施例８）
この実施例は、前記方法が目的のＦａｂの抗体をディスプレイしていない細胞から目的の抗体又はＦａｂ断片をディスプレイする細胞を分別できることを示す。
第一の実験において、抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片（ＹＧＬＹ７７６１）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞を、抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片（ＹＧＬＹ７７６２）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞と混合した。
２４℃で２４時間、株ＹＧＬＹ７７６２、ＹＧＬＹ７７６１及びＹＧＬＹ７７６４を温置し、前述のように、ＭＢＢＹ及びＰＭＴ阻害剤を用いて、Ｍｉｃｒｏ２４中で発現を１８時間誘導した。誘導された細胞を採集し、５０ｍＬの管の中に移し、４℃で５分間、２５００ｒｐｍで遠心した。容器を傾けて上清画分を捨て、ブロッキング溶液５０ｍＬ中にペレットを再懸濁した。細胞を前述のように沈降させ、細胞ペレットをブロッキング溶液５０ｍＬ中でもう１回洗浄し、細胞を沈降させた。ペレットをブロッキング溶液中に再懸濁し、約３ＯＤ単位を与えるために、ＯＤ６００をブロッキング溶液で調整した。次いで、細胞を１：１の比で混合し、次いで、室温で１時間、蛍光物質が連結されたＰＣＳＫ９抗原（Ａｌｅｘａ６４７連結）及び室温で３０分間、蛍光物質が連結された包括的Ｈ＋Ｌ抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８連結）で順次標識した。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリープロファイルを決定した。
図１８Ａは、１：１の比で混合されたときの、抗ＣＤ２０Ｆａｂをディスプレイする細胞及び抗ＰＣＳＫ−９（１Ｄ０５）Ｆａｂをディスプレイする細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。図は、方法が２つの異なる細胞集団を分離できることを示している。
図１８Ｂでは、高親和性抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞及び低親和性抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片（１Ｈ２３）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞を、それぞれ、蛍光物質が連結された抗原で別々に標識し、それぞれに対するフローサイトメトリープロファイルを決定した。図１８Ｂは、高及び低親和性Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞に対するＦＡＣＳプロファイルの重ね合わせを示す。パネルは、抗原に対する親和性に基づいて細胞を分別するために前記方法を使用できることを示している。
（実施例９）
この実施例は、前記方法が目的のＦａｂの抗体をディスプレイしていない細胞の大多数から目的の抗体又はＦａｂ断片をディスプレイする細胞を分別できることを示す。
第一の実験において、抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞を、抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞と混合した。細胞集団を１：１，０００、１：１０，０００及び１：１００，０００の比で混合した。次いで、室温で１時間、蛍光物質が連結されたＰＣＳＫ９抗原（Ａｌｅｘａ６４７連結）及び室温で３０分間、蛍光物質が連結された包括的Ｈ＋Ｌ抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８連結）で、細胞の各比率を順次標識した。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリープロファイルを決定した。
最高の１％蛍光に対応する領域（抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片に対して予想された領域）から得られた細胞を単離した。細胞を選択培地上に播種し、３から４日間温置した。次いで、ＢＭＧＹ培地でプレートを洗浄することによって、細胞を収集し、ＢＭＭＹで再誘導した。再誘導された細胞を標識し、その後、分別した。この分別の最初のラウンドによって、細胞の２つの異なる集団が得られた（図１９Ａ）。
１：１０，０００及び１：１００，０００希釈物に関して、最高の蛍光を有する細胞を単離し、分別の最初のラウンドにおけると同様に、再び、増殖、収集、誘導及び標識を行った。フローサイトメトリーを用いて、これらの細胞を再び分析した（図１９Ａ）。例えば、図１８のパネルＡは、１：１の比で混合されたときの、抗ＣＤ２０Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞及び抗ＰＣＳＫ−９（１Ｄ０５）Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。結果は、分別の２巡後に、ＰＣＳＫ−９に対して特異的なＦａｂ断片に関して濃縮された細胞集団を調製することができることを示している。
第二の実験において、高親和性抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片（１Ｄ０５）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞を、低親和性抗ＰＣＳＫ−９Ｆａｂ断片（１Ｈ２３）をディスプレイするように操作されたピキア・パストリス細胞と混合した。細胞集団を１：１０，０００及び１：１００，０００の比で混合した。室温で１時間、蛍光物質が連結されたＰＣＳＫ９抗原（Ａｌｅｘａ６４７連結）で細胞を標識した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリープロファイルを決定した。
最高の１％蛍光に対応する領域（高親和性１Ｄ０５Ｆａｂ断片に対して予想された領域）から得られた細胞を単離した。細胞を選択培地上に播種し、３から４日間温置した。次いで、ＢＭＧＹ培地でプレートを洗浄することによって、細胞を収集し、ＢＭＭＹで再度誘導した。再誘導された細胞を標識し、その後、分別した。この分別の最初のラウンドによって、細胞の２つの異なる集団が得られた（図１９Ｂ）。
１：１０，０００及び１：１００，０００希釈物に関して、最高の蛍光を有する細胞を単離し、分別の最初のラウンドにおけると同様に、再び、増殖、収集、誘導及び標識を行った。フローサイトメトリーを用いて、これらの細胞を再び分析した（図１９Ｂ）。参照のために、図１８Ｂは、高及び低親和性Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞に対するＦＡＣＳプロファイルの重ね合わせを示す。結果は、高親和性Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞を、低親和性Ｆａｂ断片をディスプレイする細胞の大過剰から分離できることを示す。
本実施例におけるこれらの実験は、抗体又はＦａｂ断片の特定の集団に関して単離及び濃縮を行うために、細胞分別に基づいたアプローチの多用途性及び能力を明瞭に示している。本明細書中の方法は、抗体又はＦａｂ断片の特定の集団を発現する細胞に関して単離及び濃縮を行うために使用することができる。
配列の簡単な説明
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
Figure 0005731827
本明細書では、例示された実施形態を参照しながら本発明が記載されているが、本発明は例示された実施形態に限定されないことを理解すべきである。本分野において通常の技術を有し、及び本明細書中の教示を入手できる者は本発明の範囲に属するさらなる改変及び実施形態を認識する。従って、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (79)

  1. 下等真核生物宿主細胞表面上へのディスプレイ可能性に関してタンパク質を選択する方法であって、
    （ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
    （ｂ）前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されたタンパク質をコードする核酸で前記宿主細胞を形質転換すること、但し、前記タンパク質をコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在し、タンパク質の変異体の多様化された集団をコードする宿主細胞の複数を作製するために、突然変異誘発が使用される。；
    （ｃ）前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされているタンパク質へ特異的に結合し及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていないタンパク質に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに
    （ｄ）前記検出手段が結合している宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上のタンパク質に結合された前記検出手段の存在は、前記タンパク質が下等真核生物細胞表面上にディスプレイ可能であることを示唆する。）；
    を含む、方法。
  2. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項１の方法。
  3. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項２の方法。
  4. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用可能なＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項３の方法。
  5. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項１の方法。
  6. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項５の方法。
  7. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項１の方法。
  8. 下等真核生物が酵母である、請求項１の方法。
  9. 酵母がピキア・パストリスである、請求項８の方法。
  10. タンパク質が免疫グロブリンである、請求項１の方法。
  11. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項１の方法。
  12. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項１の方法。
  13. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項１の方法。
  14. 宿主細胞の表面上に所望のタンパク質をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法であって、
    （ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
    （ｂ）細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分にそれぞれ融合されているタンパク質をコードする核酸によって宿主細胞を形質転換すること、但し、前記タンパク質をコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在する；
    （ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望のタンパク質に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに
    （ｄ）所望のタンパク質をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること；
    を含む、方法。
  15. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項１４の方法。
  16. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項１５の方法。
  17. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用を行うことができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項１６の方法。
  18. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項１４の方法。
  19. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項１４の方法。
  20. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項１４の方法。
  21. 下等真核生物が酵母である、請求項１４の方法。
  22. 酵母がピキア・パストリスである、請求項２１の方法。
  23. 所望のタンパク質が免疫グロブリンである、請求項１４の方法。
  24. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項１４の方法。
  25. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項１４の方法。
  26. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項１４の方法。
  27. 抗体を産生する方法であって、
    （ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
    （ｂ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること、但し、重鎖は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されており、前記重鎖をコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在し、抗体の変異体の変化を受けた集団をコードする宿主細胞の複数を作製するために、突然変異誘発が使用される。；
    （ｃ）前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされている抗体へ特異的に結合し、及び前記宿主細胞の前記表面上にディスプレイされていない抗体に結合しない検出手段と前記宿主細胞の複数を接触させること；並びに
    （ｄ）前記検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること（前記宿主細胞の前記表面上の抗体に結合された前記検出手段の存在は、前記宿主細胞が抗体を産生することを示唆する。）；
    を含む、方法。
  28. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項２７の方法。
  29. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項２８の方法。
  30. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項２９の方法。
  31. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項２７の方法。
  32. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項２７の方法。
  33. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項２７の方法。
  34. 下等真核生物が酵母である、請求項２７の方法。
  35. 酵母がピキア・パストリスである、請求項２７の方法。
  36. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項２７の方法。
  37. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項２７の方法。
  38. 捕捉部分及びタンパク質の変異体をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項２７の方法。
  39. 宿主細胞の表面上に所望の抗体をディスプレイする組換え下等真核生物宿主細胞を選択する方法であって、
    （ａ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する宿主細胞を準備すること；
    （ｂ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換すること、但し、重鎖は前記細胞表面係留タンパク質に融合された前記第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されており、前記重鎖をコードする核酸と第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在し；
    （ｃ）細胞表面上にディスプレイされた所望の抗体に特異的に結合する検出手段と形質転換された宿主細胞を接触させること；並びに
    （ｄ）所望の抗体をディスプレイする宿主細胞を選択するために、検出手段が結合されている宿主細胞を単離すること；
    を含む、方法。
  40. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項３９の方法。
  41. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項４０の方法。
  42. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項４１の方法。
  43. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項３９の方法。
  44. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項３９の方法。
  45. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項３９の方法。
  46. 下等真核生物が酵母である、請求項３９の方法。
  47. 酵母がピキア・パストリスである、請求項４６の方法。
  48. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が恒常的である、請求項３９の方法。
  49. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が同時に誘導される、請求項３９の方法。
  50. 捕捉部分及び前記タンパク質をコードする核酸の発現が逐次に誘導される、請求項３９の方法。
  51. 特異的結合対の一員（該特異的結合対の一員は、抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、及び目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片である。）を作製する方法であって、
    （ａ）その表面上に特異的な結合対の一員をディスプレイしている下等真核生物宿主細胞のライブラリーを準備すること、（特異的な結合対の一員は合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片であり、（前記ライブラリーは、
    （ｉ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備すること；
    （ｉｉ）特異的結合対の一員の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備すること、但し、前記特異的結合対の一員の前記遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して偏っており、ＶＨは、前記細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されており、前記ＶＨをコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在する。；
    （ｉｉｉ）前記下等真核生物宿主細胞中で核酸配列の前記ライブラリーを発現させること（これにより、各特異的結合対の一員は下等真核生物宿主細胞の前記表面にディスプレイされる。）；
    によって作製される。）；及び
    （ｂ）１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を目的の抗原と結合させることによって、目的の抗原に対して結合特異性を有する１つ又はそれ以上の特異的結合対の一員を選択すること（このようにして選択された各特異的結合対の一員は下等真核生物宿主細胞上にディスプレイされている。）；
    を含む、方法。
  52. 特異的結合対要素の一員が合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインがフレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初の２つの超可変ループが実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインが変化されたＣＤＲ３ループを有する、請求項５１の方法。
  53. 変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインが他のＣＤＲループ中に変異を含有する、請求項５２の方法。
  54. 各ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが無作為配列のものである、請求項５１の方法。
  55. ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが公知の標準構造のものであり、及び無作為配列要素を取り込む、請求項５１の方法。
  56. ディスプレイされた特異的結合対の一員が一本鎖Ｆｖ抗体断片を含む、請求項５１の方法。
  57. ディスプレイされた特異的結合対の一員が抗体を含む、請求項５１の方法。
  58. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、及び第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用をすることができる、請求項５１の方法。
  59. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項５８の方法。
  60. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項５９の方法。
  61. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項５１の方法。
  62. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項６１の方法。
  63. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項５１の方法。
  64. 下等真核生物が酵母である、請求項５１の方法。
  65. 酵母がピキア・パストリスである、請求項６４の方法。
  66. 抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含み、並びに目的の抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片を作製する方法であって、
    （ａ）合成ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインを含む抗体又は抗体断片をその表面上にディスプレイする下等真核生物宿主細胞のライブラリーを準備すること（該ライブラリーは、
    （ｉ）第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分を発現する下等真核生物宿主細胞を準備すること；
    （ｉｉ）抗体又は抗体断片の遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを準備すること、但し、前記抗体又は抗体断片の前記遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して偏っており、ＶＨは、前記細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されており、前記ＶＨをコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在し、；及び
    （ｉｉｉ）前記下等真核生物宿主細胞中で核酸配列の前記ライブラリーを発現させること（これにより、各抗体又は抗体断片は下等真核生物宿主細胞の前記表面にディスプレイされる。）；
    によって作製される。）及び
    （ｂ）１つ又はそれ以上の抗体又は抗体断片を目的の抗原と結合させることによって、目的の抗原に対して結合特異性を有する１つ又はそれ以上の抗体又は抗体断片を選択すること（このようにして選択された各抗体又は抗体断片は下等真核生物宿主細胞上にディスプレイされている。）；
    を含む、方法。
  67. 抗体又は抗体断片が合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインを含み、並びに合成ヒト抗体ＶＨドメイン及び合成ヒト抗体ＶＬドメインがフレームワーク領域及び超可変ループを含み、フレームワーク領域並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初の２つの超可変ループが実質的にヒト生殖系列であり、並びにＶＨドメイン及びＶＬドメインが変化されたＣＤＲ３ループを有する、請求項６６の方法。
  68. 変化されたＣＤＲ３ループを有することに加えて、ヒト合成抗体ＶＨ及びＶＬドメインが他のＣＤＲループ中に変異を含有する、請求項６７の方法。
  69. 各ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが無作為配列のものである、請求項６６の方法。
  70. ヒト合成抗体ＶＨドメインＣＤＲループが公知の標準構造のものであり、及び無作為配列要素を取り込む、請求項６６の方法。
  71. 第一の結合部分が第一のアダプターペプチドであり、並びに第二の結合部分が第二のアダプターペプチドであり、並びに第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用を行うことができる、請求項６６の方法。
  72. 第一及び第二のアダプターペプチドが特異的な対相互作用可能なコイルドコイルペプチドである、請求項７１の方法。
  73. コイルドコイルペプチドが特異的な対相互作用をすることができるＧＡＢＡＢ−Ｒ１及びＧＡＢＡＢ−Ｒ２サブユニットである、請求項７２の方法。
  74. 細胞表面係留タンパク質がＧＰＩタンパク質である、請求項６６の方法。
  75. 細胞表面係留タンパク質がα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐからなる群から選択される、請求項７４の方法。
  76. 細胞表面係留タンパク質がＳｅｄ１ｐである、請求項６６の方法。
  77. 下等真核生物が酵母である、請求項６６の方法。
  78. 酵母がピキア・パストリスである、請求項７７の方法。
  79. 第一の結合部分に融合された細胞表面係留タンパク質を含む捕捉部分をコードする核酸並びに抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含む下等真核生物宿主細胞であって、前記重鎖は、細胞表面係留タンパク質に融合された第一の結合部分と特異的に相互作用することができる第二の結合部分に融合されており、前記重鎖をコードする核酸と前記第二の結合部分をコードする核酸との間に停止コドンが存在する、前記宿主細胞。
JP2010549709A 2008-03-03 2009-02-20 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ Expired - Fee Related JP5731827B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6796508P 2008-03-03 2008-03-03
US61/067,965 2008-03-03
PCT/US2009/034631 WO2009111183A1 (en) 2008-03-03 2009-02-20 Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015029650A Division JP2015130868A (ja) 2008-03-03 2015-02-18 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2011514807A JP2011514807A (ja) 2011-05-12
JP5731827B2 true JP5731827B2 (ja) 2015-06-10

Family

ID=41056330

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010549709A Expired - Fee Related JP5731827B2 (ja) 2008-03-03 2009-02-20 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ
JP2015029650A Withdrawn JP2015130868A (ja) 2008-03-03 2015-02-18 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015029650A Withdrawn JP2015130868A (ja) 2008-03-03 2015-02-18 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8877686B2 (ja)
EP (1) EP2263089B1 (ja)
JP (2) JP5731827B2 (ja)
CA (1) CA2715212A1 (ja)
WO (1) WO2009111183A1 (ja)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8637435B2 (en) 2007-11-16 2014-01-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Eukaryotic cell display systems
CA2714166A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycofi, Inc. Vectors and yeast strains for protein production
CA2715212A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Glycofi, Inc. Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes
US8067339B2 (en) * 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
WO2011053545A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Granulocyte-colony stimulating factor produced in glycoengineered pichia pastoris
US20120208208A1 (en) * 2009-10-30 2012-08-16 Ni Yan G Pcsk9 immunoassay
US10106598B2 (en) 2010-12-01 2018-10-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface, anchored Fc-bait antibody display system
CN103534392A (zh) * 2010-12-01 2014-01-22 默沙东公司 表面锚定的fc-诱饵抗体展示***
WO2012097313A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
US20140059718A1 (en) * 2011-01-17 2014-02-27 Philip Morris Products S.A. Vectors for nucleic acid expression in plants
WO2012115903A2 (en) * 2011-02-25 2012-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Yeast strain for the production of proteins with modified o-glycosylation
WO2013006244A1 (en) * 2011-06-08 2013-01-10 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against west nile virus with improved cns penetration
CN102276706B (zh) * 2011-07-29 2013-12-11 华南理工大学 毕赤酵母壁蛋白Gcw15及其表面展示***和构建方法
CN102276705B (zh) * 2011-07-29 2013-09-25 华南理工大学 毕赤酵母壁蛋白Gcw17及其表面展示***和构建方法
EP2758565A4 (en) * 2011-09-23 2015-03-04 Merck Sharp & Dohme Cell surface imaging of ligands for insulin and / or insulin growth factor 1 receptor and applications thereof
EP2847368B1 (en) 2012-05-11 2020-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface anchored light chain bait antibody display system
CN110042114A (zh) 2012-07-05 2019-07-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达和分泌***
US9470677B2 (en) 2013-11-28 2016-10-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Cell with surface coated with ANXA1 and use thereof
US10113164B2 (en) 2013-12-23 2018-10-30 Research Corporation Technologies, Inc. Pichia pastoris surface display system
WO2015113055A2 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Plant-derived antibodies and derivatives that reduce risk of antibody-dependent enhancement (ade) of infection
AR104368A1 (es) * 2015-04-03 2017-07-19 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-cd20- / anti-baff
WO2018041740A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Non-covalent display system using fimgt/dsf
US11795579B2 (en) 2017-12-11 2023-10-24 Abalone Bio, Inc. Yeast display of proteins in the periplasmic space
CN116041516A (zh) 2018-02-01 2023-05-02 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
PE20191049A1 (es) * 2019-04-26 2019-08-06 Univ Nacional Agraria La Molina Metodo para la construccion de una biblioteca de plasmidos, que permite la sintesis de oligopeptidos a partir de secuencias aleatorias en saccharomyces cerevisiae
WO2023051972A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for the generation and selection of a producer cell

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
AU3745285A (en) 1983-11-29 1985-06-13 Igen, Inc. Method of catalyzing chemical reactions
US5037750A (en) 1984-11-27 1991-08-06 Igen, Inc. Method for producing antibodies which catalyze chemical reactions
US5156965A (en) 1983-11-29 1992-10-20 Igen, Inc. Catalytic antibodies
IL86455A0 (en) 1987-06-01 1988-11-15 Takeda Chemical Industries Ltd Polypeptide and production thereof
US5843708A (en) 1988-01-05 1998-12-01 Ciba-Geigy Corporation Chimeric antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DE4226971C2 (de) 1992-08-14 1997-01-16 Widmar Prof Dr Tanner Modifizierte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
US7166423B1 (en) 1992-10-21 2007-01-23 Miltenyi Biotec Gmbh Direct selection of cells by secretion product
PT682710E (pt) 1993-02-10 2004-03-31 Unilever Nv Processo de isolamento utilizando proteinas imobilizadas com capacidades de ligacao especificas
US5733757A (en) 1995-12-15 1998-03-31 The Scripps Research Institute Aldolase catalytic antibody
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) * 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
EP0915903A4 (en) 1996-06-17 2002-09-04 Biodynamics Associates PROCESS AND KITS FOR PREPARING CONSTRUCTIONS OF MULTI-CONSTITUENT NUCLEIC ACIDS
US6949372B2 (en) 1999-03-02 2005-09-27 The Johns Hopkins University Engineering intracellular sialylation pathways
DK1283265T3 (da) 2000-05-17 2009-11-09 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Fremgangsmåde til fremstilling af protein med reduktion af mannosephosphat i sukkerkæden og glycoprotein fremstillet derved
US6406863B1 (en) 2000-06-23 2002-06-18 Genetastix Corporation High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast
US20050260729A1 (en) 2004-03-17 2005-11-24 Hamilton Stephen R Method of engineering a cytidine monophosphate-sialic acid synthetic pathway in fungi and yeast
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
KR100787073B1 (ko) 2000-06-28 2007-12-21 글리코파이, 인크. 변형된 당단백질의 제조방법
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
GB2383045A (en) 2000-07-26 2003-06-18 Korea Res Inst Of Bioscience Novel cell wall anchor proteins derived from yeast, genes thereof and cell surface expression systems using the same
GB0021421D0 (en) 2000-08-31 2000-10-18 Oxford Glycosciences Uk Ltd Compounds
BR0115912A (pt) 2000-12-05 2005-10-18 Penn State Res Found Métodos e composições para a produção altamente eficiente de proteìnas heterólogas em levedura
JP4323167B2 (ja) 2001-01-16 2009-09-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 分泌タンパク質を発現する細胞の単離
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
GB0118337D0 (en) 2001-07-27 2001-09-19 Lonza Biologics Plc Method for selecting antibody expressing cells
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
EP1438400B1 (en) * 2001-10-01 2009-06-17 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US7175983B2 (en) * 2001-11-02 2007-02-13 Abmaxis, Inc. Adapter-directed display systems
ES2402527T3 (es) 2001-12-27 2013-05-06 Glycofi, Inc. Procedimientos para obtener estructuras de carbohidrato de tipo mamífero mediante ingeniería genética
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
JP3906763B2 (ja) 2002-08-28 2007-04-18 アイシン精機株式会社 弁開閉時期制御装置
CA2549932C (en) 2002-12-20 2013-08-20 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
WO2005047461A2 (en) 2003-08-18 2005-05-26 The Regents Of The University Of California Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
JP4861830B2 (ja) 2003-12-24 2012-01-25 グライコフィ， インコーポレイテッド 糖タンパク質の産生において、グリカンのマンノシルリン酸化を除去する方法
US7479389B2 (en) 2004-03-02 2009-01-20 Glycofi, Inc. ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2, HIS5, HIS6 genes and methods for stable genetic integration
AU2005238308B8 (en) 2004-04-29 2009-10-08 Glycofi, Inc. Methods for reducing or eliminating alpha-mannosidase resistant glycans in the production of glycoproteins
EP1743938A1 (en) * 2005-07-12 2007-01-17 NascaCell IP GmbH Means and methods for displaying polypeptides on cells
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
JP4729385B2 (ja) 2005-11-08 2011-07-20 株式会社村上精機工作所 振動ふるい装置
CN101365783B (zh) 2005-11-15 2013-07-17 格利科菲公司 具有降低的o-糖基化的糖蛋白的产生
WO2007130520A2 (en) * 2006-05-04 2007-11-15 Abmaxis Inc. Cross-species and multi-species display systems
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
US8637435B2 (en) * 2007-11-16 2014-01-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Eukaryotic cell display systems
CA2714166A1 (en) 2008-02-20 2009-08-27 Glycofi, Inc. Vectors and yeast strains for protein production
CA2715212A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Glycofi, Inc. Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes
US8067339B2 (en) 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
DE102008037302A1 (de) 2008-08-11 2010-02-25 Samson Aktiengesellschaft Verfahren zum Überprüfen der Funktionsweise eines prozesstechnischen Feldgeräts und prozesstechnisches Feldgerät
US20100075326A1 (en) 2008-09-12 2010-03-25 Cornell University Yeast surface two-hybrid system for quantitative detection of protein-protein interactions
CN103534392A (zh) 2010-12-01 2014-01-22 默沙东公司 表面锚定的fc-诱饵抗体展示***

Also Published As

Publication number Publication date
CA2715212A1 (en) 2009-09-11
US20150211000A1 (en) 2015-07-30
WO2009111183A1 (en) 2009-09-11
EP2263089A4 (en) 2011-08-31
US9845464B2 (en) 2017-12-19
JP2015130868A (ja) 2015-07-23
EP2263089A1 (en) 2010-12-22
EP2263089B1 (en) 2015-01-28
US20100331192A1 (en) 2010-12-30
US8877686B2 (en) 2014-11-04
JP2011514807A (ja) 2011-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5731827B2 (ja) 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ
US20210317441A1 (en) Surface display of whole antibodies in eukaryotes
KR101930961B1 (ko) 피키아 파스토리스에서 생산된 치료 당단백질 상의 ｎ-글리코실화 부위 점유를 증가시키는 방법
EP2646606B1 (en) Surface-anchored fc-bait antibody display system
US10577600B2 (en) Surface anchored light chain bait antibody display system
US20140342932A1 (en) Functional cell surface display of ligands for the insulin and/or insulin growth factor 1 receptor and applications thereof
US11104721B2 (en) Surface, anchored FC-bait antibody display system
EP2814943A1 (en) Methods for reducing mannosyltransferase activity in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20120214

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20120702

RD07 Notification of extinguishment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7427

Effective date: 20120724

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131126

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140221

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140306

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140526

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20141118

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150218

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150317

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20150410

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5731827

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees