JP2003530361A

JP2003530361A - 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法

Info

Publication number: JP2003530361A
Application number: JP2001574155A
Authority: JP
Inventors: キンスラー，オラフ・ボリス; ゲツグ，コリン・ブイ; フリーマン，エイミー; ブーン，トーマス・チヤールズ
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2003-10-14
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: MXPA02009896A; EP1267942B1; AU5525601A; EP1267942A2; WO2001076640A3; US6586398B1; JP5334347B2; WO2001076640A2; US20060264377A1; US7262166B2; AR030276A1; CA2405716C; AU2001255256B2; ES2365000T3; TWI315988B; ATE510555T1; CA2405716A1; US20030166566A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、広義にはタンパク質の修飾の分野、より具体的には水溶性ポリマーの新規なエリスロポエチン刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）への結合に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景新規なエリスロポエチン刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）は、ｒＨｕＥＰＯのアミ
ノ酸配列中に５個の変化を有する、２個の追加的な炭水化物鎖を備えた過グリコ
シル化エリスロポエチンの類似体である。より具体的には、ＮＥＳＰは２個の追
加的なＮ結合型炭水化物鎖をアミノ酸残基３０および８８（番号はヒトのＥＰＯ
の配列に対応する）において含む（その全体が参照によって本明細書に組み込ま
れているＰＣＴＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＵＳ９４／０２９５７を参照
のこと）。ＮＥＳＰはＥＰＯとは生化学的に異なり、血清半減期がより長く、ｉ
ｎｖｉｖｏでの生物活性がより高い；Ｅｇｒｉｅ他、ＡＳＨ９７、Ｂｌｏｏｄ
、９０：５６ａ（１９９７）。ＮＥＳＰは、マウス、ラット、イヌおよび人間に
おいて血清半減期が約３倍増大することが示されている；同上の文献。マウスに
おいては、血清半減期がより長く、ｉｎｖｉｖｏでの活性がより高いことによ
り、ｒＨｕＥＰＯと比較して、同じ生物学的応答を得るために投与の頻度をより
少なくすること（１週間に１度あるいは１週間おきに１度）が可能である；同上
の文献。

【０００２】薬物動態の研究により、動物実験と一致して、ＮＥＳＰが慢性的な腎臓障害の
患者中でｒＨｕＥＰＯよりも大幅に長い血清半減期を有することが実証され、低
頻度投与スケジュールがヒトにおいても使用することができることが示唆された
；ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ他、ＪＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮ
ｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、８：２６８Ａ（１９９７）。低頻度投与スケジュールは、
内科医および患者の双方にとってより好都合であり、自己投与に関わっている患
者には特に有用であると思われる。低頻度投与の他の利点には、患者中に導入さ
れる薬剤が少ないこと、ｒＨｕＥＰＯの投与に見られるいくらかの副作用の性質
または激しさが低下すること、およびコンプライアンスが高まることがあってよ
い。

【０００３】ＮＥＳＰの半減期が延びることによって、ＥＰＯと比べて投与の頻度がより少
ないという利点が提供されているが、ＮＥＳＰが現在示しているよりも一層長い
治療半減期を必要とすると思われる化学療法などの潜在的な適応法が依然として
存在する。

【０００４】ｉｎｖｉｖｏでのタンパク質の半減期を延ばすためにしばしば使用される一
般的手法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーを当該の
タンパク質に化学的に結合させることである。一般に、ポリエチレングリコール
分子は、タンパク質上に見られる反応基を介してタンパク質に連結される。リジ
ン残基上、あるいはＮ末端などのアミノ基は、このような結合に好都合である。

【０００５】ポリエチレングリコール分子をタンパク質に結合させるために（ＰＥＧ化）、
さまざまな手法が使用されている。たとえば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００
２，５３１号）は、ポリエチレングリコール分子を酵素に結合させるために、還
元的アルキル化を使用したことを述べている。Ｄａｖｉｓ他（米国特許第４，１
７９，３３７号）は、たとえば酵素およびインシュリンを含むＰＥＧ−タンパク
質複合体を開示している。Ｓｈａｗ（米国特許第４，９０４，５８４号）は、反
応性アミン基を介してポリエチレングリコール分子を結合させるために、タンパ
ク質中のリジン残基の数を変更することを開示している。Ｈａｋｉｍｉ他（米国
特許第５，８３４，５９４号）は、たとえばタンパク質ＩＬ−２、インターフェ
ロンα、およびＩＬ−１ｒａを含む、免疫原性がほとんどない水溶性ＰＥＧ−タ
ンパク質複合体を開示している。Ｈａｋｉｍｉ他の方法は、独特のリンカーを利
用して、タンパク質中のさまざまな遊離アミノ基をＰＥＧに結合させることを含
む。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ他（米国特許第５，８２４，７８４号および５，９８５，
２６５号）は、Ｇ−ＣＳＦおよびコンセンサスインターフェロンを含めた、選択
的にＮ末端が化学修飾されたタンパク質およびその類似体を与える方法を教示し
ている。重要なことに、これらの修飾型タンパク質はタンパク質の安定性に関し
て利点を有し、加工上の利点も備えている。

【０００６】前記のようなＰＥＧ化の手法は、溶解性およびｉｎｖｉｖｏでの循環半減期
を改善するために（典型的にはこれらの性質は、真核生物における発現過程にお
いて付加される炭水化物部分によって、グリコシル化タンパク質（糖タンパク質
）に賦与される）、細菌の発現系から誘導される非グリコシル化タンパク質に対
して伝統的に適用されている。非グリコシル化タンパク質のｉｎｖｉｖｏでの
半減期に対するＰＥＧ化の影響は、ＰＥＧの物理化学的および動的性質から誘導
され、より大きな流体力学的体積および全質量が複合体に与えられ、したがって
腎クリアランスの割合を低下させると一般には考えられている。他の利点として
、典型的には、複合体の溶解性の増大および免疫原性の低下が含まれる。しかし
ながら、すべてのタンパク質がＰＥＧ化に等しく応答するわけではなく、性能が
改善される保証はない。

【０００７】本発明は、高度にグリコシル化されているタンパク質、たとえばＮＥＳＰをＰ
ＥＧ化することによって、ＮＥＳＰよりもさらに一層劇的な持続期間プロファイ
ルを有する薬剤組成物を提供し、ヘマトクリット値を上昇させ、貧血を治療する
ために４〜６週間毎に１度の投与を可能にし、したがって素晴らしい治療上の利
点を提供し得るという驚くべき発見に基づくものである。

【０００８】発明の概要本発明は、化学的に修飾されたＮＥＳＰ（またはその類似体）の実質的に均質
な調製物、および関連する方法に関する。

【０００９】さらに本発明は、Ｎ末端が化学的に修飾されたＮＥＳＰ（またはその類似体）
の実質的に均質な調製物に関する。

【００１０】さらに本発明は、モノ置換位置イソ形またはポリ置換形のいずれかの混合集団
として表される、化学的に修飾されたＮＥＳＰの調製物に関する。

【００１１】図面の簡単な説明図１は、ＮＥＳＰをＰＥＧ化するための設計戦略を示す図である。（Ａ）ＰＥ
Ｇポリマーのサイズを５ｋＤ、２０ｋＤおよび３０ｋＤで変える、（Ｂ）ＰＥＧ
ポリマーの形態は、ＰＥＧの合計分子量が１０ｋＤ、２０ｋＤまたは４０ｋＤで
ある、線状または分枝型のいずれかであってよい、さらに（Ｃ）置換の程度が異
なるＰＥＧとＮＥＳＰの調製物を単離して、モノＰＥＧ、ジＰＥＧ、またはある
場合にはトリＰＥＧＮＥＳＰを含ませることができる。

【００１２】図２は、ＮＥＳＰをＰＥＧ化するための、さまざまな反応化学的手法を示す図
である。（Ａ）ＰＥＧ−アルデヒドを用いるＮＥＳＰの還元型アルキル化、（Ｂ
）ＰＥＧのＮ−スクシニミジルエステルを用いるＮＥＳＰのアシル化、さらに（
Ｃ）炭水化物の制限的な過ヨウ素酸塩によるＮＥＳＰ多糖側鎖のＰＥＧ化、結果
として生じるアルデヒドをＰＥＧ−ヒドラジドと反応させてヒドラゾン複合体を
形成し、次にシアン水素化ホウ素ナトリウムを用いてさらに還元を行って、結合
を安定化させる。

【００１３】図３は、さまざまな５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体と、非修飾型ＮＥＳ
Ｐ（■）の、ｉｎｖｉｖｏでの活性データを示すグラフである。サンプル▲、
▼、●、および◆は５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰの混合物であり、置換の程度
が段階的に低くなっている。鉄の取り込み％を、投与した１ｍＬあたりのｎｇに
対してプロットする。

【００１４】図４は、非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用い
る治療に応答する、高いヘモグロビン（ＨＧＢ）レベルの持続を示すグラフであ
る。１回の大量注射で、ＮＥＳＰ（◆）、ＮＨＳ−エステル活性型メトキシ−Ｐ
ＥＧから誘導される２０ｋＤの線状モノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）、還元型
アルキル化によってアルデヒド活性型ＰＥＧから誘導される２０ｋＤの線状（８
０％までのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰおよび２０％のジＰＥＧ−ＮＥＳＰ）複合体（
▼）、および塩水コントロール（●）を１００μｇ／ｋｇ注射する。ＨＧＢ（ｇ
／ｄＬ）を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００１５】図５は、非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用い
る治療に応答する、高い網状赤血球レベルの持続を示すグラフである。１回の大
量注射で、ＮＥＳＰ（○）、２０ｋＤの線状モノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（●）、還元
型アルキル化によってアルデヒド活性型メトキシ−ＰＥＧから誘導される５ｋＤ
の線状モノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（▼）および５ｋＤの線状ジＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合
体（◆）、ＮＨＳ−エステル活性型ＰＥＧからの２０ｋＤの分枝型モノＰＥＧ−
ＮＥＳＰ（■）複合体、および塩水コントロール（▲）を１００μｇ／ｋｇ注射
する。絶対的な網状赤血球の数を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００１６】図６は、非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用い
る治療に応答する、高いヘモグロビンレベルの持続を示すグラフである。１回の
大量注射で、ＮＥＳＰ（○）、２０ｋＤの線状モノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（●）、還
元型アルキル化によってアルデヒド活性型メトキシ−ＰＥＧから誘導される５ｋ
Ｄの線状モノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（▼）および５ｋＤの線状ジＰＥＧ−ＮＥＳＰ複
合体（◆）、ＮＨＳ−エステル活性型ＰＥＧからの２０ｋＤの分枝型モノＰＥＧ
−ＮＥＳＰ複合体（■）を１００μｇ／ｋｇ注射する。ＨＧＢ（ｇ／ｄＬ）を、
治療後の日数＃に対してプロットする。

【００１７】図７は、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨ
Ｐカラムでのクロマトグラムを示す図である。このカラムは、５０ｍＭＮａＣ
ｌ〜２００ｍＭＮａＣｌの直線勾配を使用して生成物を溶離する、ＨｉＴｒａ
ｐＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムであった。

【００１８】図８は、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＨＰカラムでのクロマトグラムを示す図である。このカラムは、５０ｍＭＮａ
Ｃｌ〜２００ｍＭＮａＣｌの直線勾配を使用して生成物を溶離する、ＨｉＴｒ
ａｐＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムであった。

【００１９】図９は、３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＨＰカラムでのクロマトグラムを示す図である。このカラムは、５０ｍＭＮａ
Ｃｌ〜２００ｍＭＮａＣｌの直線勾配を使用して生成物を溶離する、ＨｉＴｒ
ａｐＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムであった。

【００２０】図１０は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、
および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射し
た後の、貧血マウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。絶対的な網状赤血
球の数を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２１】図１１は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
１０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋ
ｇ、および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ
注射した後の、貧血マウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。絶対的な網
状赤血球の数を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２２】図１２は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋ
ｇ、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、およ
び非修飾型ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、貧血マウスの網状赤
血球の応答を示すグラフである。絶対的な網状赤血球の数を、治療後の日数＃に
対してプロットする。

【００２３】図１３は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、
および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射し
た後の、貧血マウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ（ｇ／ｄ
Ｌ）を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２４】図１４は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
１０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋ
ｇ、および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ
注射した後の、貧血マウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ（
ｇ／ｄＬ）を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２５】図１５は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋ
ｇ、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、およ
び非修飾型ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、貧血マウスのヘモグ
ロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ（ｇ／ｄＬ）を、治療後の日数＃に対
してプロットする。

【００２６】図１６は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、
および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射し
た後の、正常なマウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。絶対的な網状赤
血球の数を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２７】図１７は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
１０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋ
ｇ、および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ
注射した後の、正常なマウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。絶対的な
網状赤血球の数を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００２８】図１８は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋ
ｇ、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、およ
び非修飾型ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、正常なマウスの網状
赤血球の応答を示すグラフである。絶対的な網状赤血球の数を、治療後の日数＃
に対してプロットする。

【００２９】図１９は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、
および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射し
た後の、正常なマウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ（ｇ／
ｄＬ）を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００３０】図２０は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
１０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋ
ｇ、および５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ
注射した後の、正常なマウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ
（ｇ／ｄＬ）を、治療後の日数＃に対してプロットする。

【００３１】図２１は、１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を
３０μｇ／ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋ
ｇ、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、およ
び非修飾型ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、正常なマウスのヘモ
グロビンの応答を示すグラフである。ＨＧＢ（ｇ／ｄＬ）を、治療後の日数＃に
対してプロットする。

【００３２】図２２は、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ（─）、２０ｋＤのモノＰＥＧ−Ｎ
ＥＳＰ（- - -）、および３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（…）の、サイズ排
除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。ＳＥＣカラムは、１００ｍＭＮａ
ＨＰＯ_４、１０％エタノール、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９を使用して生
成物を溶離する、ＴｏｓｏｈａａｓＴＳＫ３０００ＳＷｘｌ（５ミクロン
、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）であった。

【００３３】発明の詳細な説明ＮＥＳＰなどの糖タンパク質のｉｎｖｉｖｏでの治療的半減期がＰＥＧ化か
ら利便を得られるかどうかを発見するために、さまざまな異なるＰＥＧ−ＮＥＳ
Ｐ複合体を合成し、長時間持続する赤血球生成を求めてｉｎｖｉｖｏの試験を
した。

【００３４】ＰＥＧ化の潜在的な効果を最適化し、ＰＥＧ結合の好ましい部位および化学的
性質を同定するために、ポリマーの長さ、コンホメーション、および結合の程度
および部位を変える、設計戦略を採用した（図１を参照のこと）。

【００３５】本発明のＰＥＧ化ＮＥＳＰを調製するための方法は一般に、（ａ）ＮＥＳＰが
１つまたは複数のＰＥＧ基に結合する条件下で、ＮＥＳＰとポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）を反応させるステ
ップ、および（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。ＮＥＳＰ修飾の特異的部
位が複合体の本来の活性を大幅に変える可能性があるので、３種のＰＥＧ化の化
学的手法を調べた（図２を参照のこと）。第１の手法は、還元的アルキル化を使
用して、ＰＥＧ−アルデヒド（Ｏ−（３−オキソプロピル）−Ｏ’−メチルポリ
エチレングリコール）をＮＥＳＰの第一級アミンに結合させる。適切な条件下で
は、この手法によって、タンパク質のＮ末端のα−アミンを介して主に修飾され
たＰＥＧ複合体が生成することが実証された。ＰＥＧは還元的アルキル化によっ
て第二級アミンを介して結合しているので、タンパク質のＮ末端において電荷が
保存されている可能性がある。

【００３６】ＮＥＳＰのＰＥＧ化に適用される第２の化学的手法は、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ
−［（Ｎ−スクシニミジロキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチ
レングリコール）のＮＨＳ−エステルを使用する、ＮＥＳＰの第一級アミンのア
シル化であった。前の化学的手法とは対照的に、メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳを用
いるアシル化によってアミド結合が結果として生じ、これによって元の第一級ア
ミンから電荷が取り除かれると思われる。

【００３７】評価した最後の化学的手法結合では、アルデヒドへの酸化用の最後から２番目
のグリコシル単位シアル酸のペンダントジオールを標的にするために選択した条
件下で、ＮＥＳＰの穏やかな酸化を使用した。次いで結果として生じたグリコア
ルデヒドをメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジド（Ｏ−（ヒドラジノカルボニルメチル
）−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）と反応させて、ＰＥＧとＮＥＳＰの
間の半安定性のヒドラゾンを形成した。その後ヒドラゾンをシアノ水素化ホウ素
ナトリウムによって還元して、安定したＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を生成した。

【００３８】本発明の方法はそれぞれ、ポリマー−タンパク質複合体の実質的に均質な混合
物を提供する。本明細書で使用する「実質的に均質な」とは、ポリマー−タンパ
ク質複合体分子のみが観察されることを意味する。ペプチド地図およびＮ末端配
列決定によって確認されるように、以下の一例によって、少なくとも９０％がポ
リマー−タンパク質複合体であり、せいぜい１０％が未反応タンパク質である調
製物が提供される。ＰＥＧ化物質は少なくとも９５％がこの調製物であることが
好ましく（以下の作業実施例中のように）、ＰＥＧ化物質は９９％以上がこの調
製物であることが最も好ましい。ポリマー−タンパク質複合体は生物学的活性を
有しており、本明細書で提供する本発明の「実質的に均質な」ＰＥＧ化ＮＥＳＰ
調製物は、均質な調製物の利点、たとえばロット毎の薬物動態の予測における臨
床的な適用のしやすさを示すほど、充分均質な調製物である。

【００３９】ポリマー−タンパク質複合体分子の混合物を調製するために選択することもで
き、本明細書で提供する利点は、混合物中に含ませるためのモノポリマー−タン
パク質複合体の割合を選択することができることである。したがって、望むなら
ば、さまざまなタンパク質とさまざまな数の結合したポリマー部分（すなわちジ
、トリ、テトラなど）の混合物を調製し、前記複合体を本発明の方法を使用して
調製したモノポリマー−タンパク質複合体と結びつけ、混合物に所定の割合のモ
ノポリマー−タンパク質複合体を有させることができる。

【００４０】ＰＥＧ−タンパク質反応の化学量論を評価および最適化するために意図した最
初の実験によって、ＰＥＧ−アルデヒドを使用する還元型アルキル化によるＰＥ
Ｇ化は、驚くべきことに若干効率が悪く、非グリコシル化タンパク質について典
型的に観察されるよりも、相当大きなＰＥＧとタンパク質のモル比を必要とする
ことが明らかになった。同様に、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを用いるアシル化も、
予想よりも遅く効率が悪かった。したがって、非グリコシル化タンパク質のＰＥ
Ｇ化は必ずしもグリコシル化タンパク質のＰＥＧ化の前兆となるものではなく、
反応条件のさらなる最適化が必要であることは明らかであった。

【００４１】本明細書に記載するＰＥＧ化手法において使用することを企図するポリマー分
子は、水溶性ポリマーまたはその混合物の中から選択することができる。水溶性
ポリマーは、たとえばポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレング
リコール、デキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピウロリドン）、プロピレングリ
コールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、
ポリオキシエチル化ポリオール（たとえば、グリセロール）、デキストラン、Ｈ
ＰＭＡ、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（商標）、およびポリビニルアルコールからなる群か
ら選択することができる。選択するポリマーは、それが結合するタンパク質が生
理学的環境などの水性環境中で沈殿しないように、水溶性でなければならない。
アシル化反応については、選択するポリマーは１つの反応性エステル基を有して
いなければならない。本発明の還元型アルキル化については、選択するポリマー
は１つの反応性アルデヒド基を有していなければならない。好ましい反応性ＰＥ
Ｇ−アルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これ
は水に対して安定性があるか、あるいはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはその
アリロキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポ
リマーは分枝型であるかあるいは非分枝型であってよい。最終品調製物を治療用
に使用するために、ポリマーは薬剤として許容されるものであることが好ましい
。

【００４２】本明細書で使用するのに特に好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコー
ルであり、これをＰＥＧと略す。本明細書で使用するように、ポリエチレングリ
コールは、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシまたはアルコキシ−ポリエチレン
グリコールなどの他のタンパク質を誘導するために使用されている、ＰＥＧの任
意の形を含むことを意味する。

【００４３】ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子の割合は、反応混合物中のそれ
らの濃度と同様に変わるであろう。一般に、最適な比（過剰な未反応タンパク質
またはポリマーが存在しない反応の効率の点において）は、選択したポリエチレ
ングリコールの分子量、および利用可能な反応基（典型的にはαまたはεアミノ
基）の数によって決定される。分子量に関しては、ポリマーの分子量が大きくな
るほど、タンパク質に結合することができるポリマー分子の数は少なくなる。同
様に、これらのパラメータを最適化するときは、ポリマーの分枝化を考慮しなけ
ればならない。一般に、分子量が大きくなるほど（あるいは分枝が増えるほど）
、ポリマーとタンパク質の比は大きくなる。本発明では、いくつかの異なる線状
ＰＥＧポリマーの長さを評価した（５ｋＤ、２０ｋＤおよび３０ｋＤ）。同様に
、２アーム型分枝ＰＥＧポリマー（１０ｋＤ、２０ｋＤおよび４０ｋＤ）の複合
体も試験した。それぞれの調製物から、モノ置換およびジ置換ＰＥＧ−ＮＥＳＰ
のサンプルを単離して、ＰＥＧ化の第２の部位の影響を調べた。

【００４４】一般に、本明細書で企図するＰＥＧ化反応については、好ましい平均分子量は
約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という語は、±１ｋＤａを示す）。
より好ましくは、平均分子量は約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａである。一般に水溶性
ポリマーとＮＥＳＰの比は、モノＰＥＧについては１：１、ジＰＥＧについては
２：１などの範囲であり、ＰＥＧとタンパク質の質量比は、５ｋＤモノＰＥＧに
ついては〜１：７、３０ｋＤモノＰＥＧについては〜１：１．３であろう。

【００４５】ＰＥＧ化ＮＥＳＰ調製物を得る方法は、非ＰＥＧ化ＮＥＳＰ分子の集団からの
ＰＥＧ化物質の調製によるものであってよい。たとえば以下に示すのは、モノお
よび／またはジＰＥＧ化ＮＥＳＰをイオン交換サイズクロマトグラフィを使用し
て分離する一例である。サイズ排除クロマトグラフィを分析用ツールとして使用
して、精製した生成物を特徴付けする。

【００４６】本発明は、Ｎ末端が化学的に修飾されたＮＥＳＰを選択的に得るための方法も
提供する。この方法は還元的アルキル化を含み、このアルキル化は、特定のタン
パク質における誘導に利用可能な、異なるタイプの第一級アミノ基の特異な反応
性（リジンとＮ末端）を利用するものである。適切な反応条件下では、カルボニ
ル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導が行
われる。この反応は、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα
−アミノ基の間のｐＫ_ａの差を利用することができるｐＨで行う。このような選
択的な誘導によって、水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される−ポリ
マーとの結合は主にタンパク質のＮ末端で起こり、リジン側鎖アミノ基などの他
の反応基の大きな変化は起こらない。調製物は８０％を超えてモノポリマー−タ
ンパク質複合体であることが好ましく、９５％を超えてモノポリマー−タンパク
質複合体であることがさらに好ましい。

【００４７】本発明のＮＥＳＰは、それぞれの部位に追加的な炭水化物鎖が結合している２
個の追加のグリコシル化部位を含む、過グリコシル化ＥＰＯの類似体である。Ｎ
ＥＳＰは位置指定突然変異導入法を使用して構築され、哺乳動物の宿主細胞中で
発現した。ＮＥＳＰの生成の詳細は、共同所有するＰＣＴＡｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎＮｏ．ＵＳ９４／０２９５７中に提供されている。ｒＨｕＥＰＯの新しい
Ｎ結合グリコシル化部位は、ＤＮＡ配列を変えてアミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／
Ｔｈｒをポリペプチド鎖中にコードすることによって導入した。ＮＥＳＰをコー
ドするＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞にトランスフェ
クトし、発現したポリペプチドを追加的な炭水化物鎖の存在について分析した。
好ましい実施形態では、ＮＥＳＰは２つの追加的なＮ結合型炭水化物鎖を残基３
０および８８において有する。アミノ酸配列の番号は、ヒトのエリスロポエチン
（ＥＰＯ）のものである。ＮＥＳＰのアミノ酸配列は、配列番号１で示される配
列である。ＮＥＳＰは、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化部位、さらに新しい部
位の正常な相補性を有することが理解される。

【００４８】本発明のＮＥＳＰは、配列番号１中の１つまたは複数の残基において、保存性
アミノ酸変化体を含んでもよい。これらの変化体によって炭水化物鎖の追加が結
果としてもたらされることはなく、類似体の生物学的活性に影響を与えることは
ほとんどない。

【００４９】一般に、本発明に含まれるのは、有効量の本発明のタンパク質または誘導体生
成物、および薬剤として許容される希釈剤、安定剤、防腐剤、可溶化剤、乳濁剤
、アジュバントおよび／または担体を含む、薬剤組成物である。このような組成
物は、緩衝含有物（たとえばトリス−ＨＣｌ、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強
度がさまざまである希釈剤、洗浄剤および可溶化剤などの添加剤（たとえばポリ
ソルベート２０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、
メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（たとえばチメロゾール、ベンジルアルコー
ル）、およびバルキング物質（たとえばラクトース、マンニトール）を含む。た
とえば、参照によって本明細書に取り込まれている、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈＥｄ．（１９９０、
ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１８０４２）ペ
ージ１４３５：１７１２を参照のこと。活性成分の有効量とは、治療上、予防上
、あるいは診断上有効な量のことであり、身体重量、年齢、および治療的または
予防的目標などの要因を考慮することによって、この量は当業者により容易に決
定することができる。

【００５０】本発明のＰＥＧ−ＮＥＳＰ組成物は、溶液のｐＨを所望の範囲内に保つために
、緩衝剤を含んでもよい。好ましい緩衝剤には、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム、およびクエン酸ナトリウムがある。これらの緩衝剤の混合物を使用するこ
ともできる。組成物中において有用な緩衝剤の量は、使用する個々の緩衝液およ
び溶液のｐＨに大きく依存する。たとえば酢酸は、ｐＨ６よりもｐＨ５において
より有効な緩衝液であるので、ｐＨ５においてはｐＨ６よりも少量の酢酸を使用
してよい。本発明の組成物の好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜７．５である。

【００５１】本発明の組成物は、溶液を等張にし注射により適したものにするために、等張
性調節剤をさらに含んでよい。最も好ましい調節剤は、０〜１５０ｍＭの濃度範
囲内の塩化ナトリウムである。

【００５２】本明細書で使用するように、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を企図するとき、「治療
的に有効な量」とは、ヘマトクリット値を増大させ患者に利点を提供する量のこ
とである。この量は個体によって変わり、患者の全体的な身体状況および貧血の
根本的な原因を含めた、いくつかの要因に依存するであろう。たとえば、慢性的
な腎臓障害で苦しんでいる患者のｒＨｕＥＰＯの治療的に有効な量は、１週間に
３回、１ｋｇあたり５０〜１５０単位である。治療用に使用するｒＨｕＥＰＯの
量によって、許容可能なヘマトクリット値の増大の比率が与えられ、この量によ
ってヘマトクリット値が有益なレベル（通常は少なくとも約３０％、典型的には
３０％〜３６％の範囲）に保たれる。本発明の組成物の治療的に有効な量は、一
般的に利用可能な物質および手順を使用して、当業者によって容易に確かめるこ
とができる。

【００５３】本発明は、ＮＥＳＰおよび／またはＥＰＯよりも少ない頻度でＰＥＧ−ＮＥＳ
Ｐ複合体を投与することを提供する。投与の頻度は治療を受ける条件に応じて変
わるであろうが、一般には４〜６週間毎に約１回であろう。異なる個体によって
ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体への応答性が変わるために、実際に使用する投与の頻度
は本明細書で開示する頻度とは幾分変わってもよいことが理解され、「約」とい
う語はこのような変化を反映させることを意図するものであるしたがって本発明を使用して、赤血球細胞の生成を刺激し、低下した赤血球細
胞のレベルを正すことができる。最も一般的には、赤血球細胞のレベルは貧血の
ために低下する。本発明によって治療可能な状態には、腎臓機能の低下または損
失（慢性的な腎臓障害）を伴う貧血、化学療法または抗ウイルス薬剤（ＡＺＴな
ど）などの骨髄抑制治療を伴う貧血、非骨髄性のガンの進行を伴う貧血、および
ウイルス感染（ＨＩＶなど）を伴う貧血がある。正常では健康な個体において貧
血をもたらす可能性がある状態、手術中の血液の予期される損失なども治療可能
である。一般に、ｒＨｕＥＰＯおよび／またはＮＥＳＰを用いて治療可能な任意
の状態は、本発明のＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用いても治療することができる。

【００５４】本発明は、治療中により多くのエリスロポエチンを保つために、治療的に有効
な量の鉄を投与することも提供する。与えられる量は、ｒＨｕＥＰＯを用いる治
療に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。

【００５５】本発明に従って調製したＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、腹膜内、皮下、あるいは
筋肉内に注射することによって投与することが好ましい。しかしながら、本発明
の組成物を使用して、他の送達経路も有効に利用することができることは、当業
者には明らかであろう。

【００５６】本発明をより完全に例示するために以下の実施例を提供するが、これらの実施
例は本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。実施例１では、Ｐ
ＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の調製および試験を記載し、この複合体は、過ヨウ素酸ナ
トリウムの酸化によってＮＥＳＰの炭水化物鎖中に生成させたアルデヒドを介し
て、５ｋＤまたは２０ｋＤのメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジドをＮＥＳＰにカップ
リングさせることにより調製した。実施例２では、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の調
製および試験を記載し、この複合体は、ＮＨＳ−ＰＥＧエステルおよびＰＥＧ−
アルデヒドとして２０ｋＤのＰＥＧポリマーを使用して、それぞれアシル化およ
び還元的アルキル化によって、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を生成させることにより
調製した。実施例３では、置換の程度の働き、ポリマーサイズの変化、およびさ
まざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の形態に対する影響を実証する。実施例４では
、貧血のマウスモデルにおいてＮＥＳＰコントロールに対して３つの異なる用量
で調べた、３種のＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ、
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ混合物、および３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ
の効率を記載する。実施例５では、３つの異なるＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を正常
なマウスのバイオアッセイで評価して、そのエリスロポエチンポテンシャルおよ
び持続時間を比較および対比した。

【００５７】実施例１過ヨウ素酸ナトリウムの酸化によってＮＥＳＰの炭水化物鎖中に生成させたア
ルデヒドを介して、５ｋＤまたは２０ｋＤのメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジドをＮ
ＥＳＰにカップリングさせることにより、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を生成した。
修飾の程度は、酸化中に過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を変えることによって調節
した。

【００５８】最初にＮＥＳＰ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム中に２〜４ｍｇ／ｍｌ）を１ｍＭ
または１０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で、ｐＨ５．６の１
００ｍＭの酢酸ナトリウム中において室温で３０分間酸化することによって、複
合体を調製した。次いで過ヨウ素酸塩を、ｐＨ５．４の１００ｍＭの酢酸ナトリ
ウムに緩衝液を交換することによって取り除く。

【００５９】次いでメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジド（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅ
ｒｓ）を、ポリマー−タンパク質５〜１００倍モル過剰（１００倍を超えること
が好ましい）で加える。中間ヒドラゾン複合体を、１５ｍＭのシアノ水素化ホウ
素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を加えることによってさらに還元し、４℃で一晩反
応させた。次いで結果として生じた複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、２６ｍｍ
×６０ｃｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するサイズ排除ＦＰＬＣによっ
て画分し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２で溶
離した。結果として生じた調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したように
、サイズが〜４０ｋＤ〜２００ｋＤの範囲であった。

【００６０】ＰＥＧ−ＮＥＳＰのサンプルを、ｉｎｖｉｔｒｏでのＥＩＡフォーマットに
おいて受容体結合について試験した。このｉｎｖｉｔｒｏでのアッセイは置換
アッセイであり、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、レポーターとして使用するＥＰＯ
−ＨＲＰ複合体とＥＰＯ受容体の結合に関して競合する。このｉｎｖｉｔｒｏ
でのアッセイの結果によって、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、ＮＥＳＰ受容体に関
して見た目の親和性が低かったことを示す。

【００６１】次いでさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の生物学的活性を、複合体を１回皮
下投与した後に、げっ歯類における鉄の取り込みを観察することによってｉｎ
ｖｉｖｏで評価した。このアッセイでは、マウスを高圧酸素室中において予め条
件付けして、内因性エリスロポエチンの発現を抑制し、次いでＮＥＳＰまたはＰ
ＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を、１回の皮下への大量注射によって投与した。５日後、
トレーサーとしてのＦｅ^５９アイソトープをマウスに静脈注射して、赤血球細胞
中の鉄の取り込みを観察した。Ｆｅ^５９の投与の２日後、動物を殺傷し、鉄の取
り込みを用量の関数として分析した。

【００６２】最初に、ＰＥＧ化の程度がさまざまである５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合
体のいくつかのプールを、複合体用量の関数としての鉄の取り込みについて試験
した。このｉｎｖｉｖｏでのアッセイの結果は図３に示し、この結果によって
、ＰＥＧ−ヒドラジドを酸化ＮＥＳＰにカップリングさせることによって調製し
たＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、鉄の取り込みのバイオアッセイにおいてＮＥＳＰ
単独と同等に機能することが実証された。

【００６３】実施例２この実施例は、２０ｋＤのＰＥＧポリマーから生成したＮＨＳ−ＰＥＧエステ
ルおよびＰＥＧ−アルデヒドを使用して調製した、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の調
製および試験を記載する。それぞれの化学物質についての反応化学量論および緩
衝液条件を最適化して、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を良い収率で生
成した。２０ｋＤのメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルによるＮＥＳＰのアシル
化によって誘導される２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ、および還元的アルキル
化によって誘導される２０ｋＤのモノ／ジＰＥＧ−ＮＥＳＰの混合物（〜８０％
／２０％）を調製した。

【００６４】メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ）
との反応は、ｐＨ４〜６、最適にはｐＨ５．２で行うことができる。反応混合物
中のＮＥＳＰの濃度は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム中に４ｍｇ／ｍｌであった。
使用したモル過剰のＰＥＧアルデヒドは５〜２０倍であり、シアノ水素化ホウ素
ナトリウムを最終濃度１５ｍＭまで加えた。この反応物を周囲温度で１時間、次
いで５℃で１８時間攪拌した。反応の終了時に、混合物を５ｍＳ／ｃｍ未満の導
電率まで希釈し、ｐＨを７．０まで上昇させ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に混合物を載せた。５０ｍＭＮａＣｌ〜２００
ｍＭＮａＣｌの直線勾配を使用して生成物をカラムから溶離させ、１０ｍＭの
ビス−トリス−プロパン、ｐＨ７．０中において緩衝剤で処理した。この精製に
より、ＮＥＳＰに結合したＰＥＧ分子の数に基づいて、化学種を分離することが
できる。

【００６５】ＰＥＧ活性型ＮＨＳエステル、メトキシ−ＳＰＡ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔ
ｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ）との反応は、５０ｍＭのＢｉｃｉｎｅ緩衝液中におい
て２〜４ｍｇ／ｍｌのＮＥＳＰ濃度、ｐＨ８．０で行った。ＮＥＳＰの緩衝溶液
を、１０〜２０モル当量のＰＥＧに加えた。この反応物を周囲温度で１時間攪拌
した。反応の終了時に、混合物を５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率まで希釈し、ｐＨを
７．０まで上昇させ、ＱＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にサンプルを載せ
た。５０ｍＭＮａＣｌ〜２００ｍＭＮａＣｌの直線勾配で生成物をカラムか
ら溶離させ、１０ｍＭのビス−トリス−プロパン、ｐＨ７．０中において緩衝剤
で処理した。

【００６６】次いで２つの単離したＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥ
ＳＰ（ＮＨＳ）および２０ｋＤのモノ／ジＰＥＧ−ＮＥＳＰ（アルデヒド）の混
合物（〜８０％／２０％）を、ｉｎｖｉｖｏでのバイオアッセイでマウスにお
いて試験した。このマウスのバイオアッセイでは、正常なマウスにおいてＮＥＳ
ＰまたはＰＥＧ−ＮＥＳＰの１回の投与に応答するエリスロポエチンのモニター
としての、網状赤血球、赤血球の前駆体、およびヘモグロビンを測定する。具体
的には、このバイオアッセイでは、メスのＢＤＦ１マウスにおける１００μｇ／
ｋｇの皮下への大量注射の結果生じる、増大したヘモグロビンおよび網状赤血球
の応答の強度および持続期間を測定する。このアッセイの結果を図４中に示し、
この実験の結果によって、等用量のＮＥＳＰ単独と比べて、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複
合体からのヘモグロビン応答が大幅に増大し持続することが示された。

【００６７】実施例３この実施例では、置換の程度の働き、ポリマーサイズの変化、およびＰＥＧ−
ＮＥＳＰ複合体の形態に対する影響を実証する。

【００６８】メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒドとメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳの両方をベースと
する化学物質を使用して、５ｋＤ、２０ｋＤおよび３０ｋＤの線状ポリマー、お
よび１０ｋＤ、２０ｋＤおよび４０ｋＤの分枝型ポリマーから、さまざまなＰＥ
Ｇ−ＮＥＳＰ複合体を合成した。これらの反応物から、モノ置換およびジ置換Ｐ
ＥＧ−ＮＥＳＰの調製物をクロマトグラフィによって単離し、マウスのバイオア
ッセイにおいて長時間作用性のエリスロポエチンについて試験した。

【００６９】メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ）
との反応は、４ｍｇ／ｍｌのＮＥＳＰの濃度で行い、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐ
Ｈ５．０中ではＰＥＧが２５倍モル過剰であり、シアノ水素化ホウ素ナトリウム
を最終濃度２０ｍＭまで加えた。この反応物を４℃で一晩攪拌し、２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．２で４倍希釈し、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。次いで希釈
した反応混合物を、５ｍｌのＨｉＴｒａｐＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に載せた。ＰＥＧ化ＮＥＳＰのイソ形を、２０ｍＭ
トリス、ｐＨ７．２中で０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶離することに
より分解した。

【００７０】メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒ
ｓ）との反応は、４ｍｇ／ｍｌのＮＥＳＰの濃度で行い、５０ｍＭのＢｉｃｉｎ
ｅ緩衝液、ｐＨ８中ではＰＥＧが５〜７倍モル過剰であった。この反応物を４℃
で一晩攪拌し、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２で４倍希釈し、ＮａＯＨでｐＨを７
．４に調整した。次いで希釈した反応混合物を、５ｍｌのＨｉＴｒａｐＱＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に載せた。ＰＥＧ化Ｎ
ＥＳＰのイソ形を、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２中で０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ
勾配を用いて溶離することにより分解した（図５〜７を参照のこと）。これらのプロセススキームを、それぞれの５ｋＤ、２０ｋＤおよび３０ｋＤの線
状ポリマー、および１０ｋＤ、２０ｋＤおよび４０ｋＤの分枝型ＰＥＧ−ＮＨＳ
エステルについて使用した。さまざまな複合体を以下の表１に記載する。

【００７１】

【表１】

【００７２】次いでそれぞれの精製したイソ形を、正常なメスのＢＤＦ１マウスにおける１
００μｇ／ｋｇの皮下への１回の大量注射後の、網状赤血球およびヘモグロビン
測定における変化によって測定した長時間作用性のエリスロポエチン活性につい
て、マウスのｉｎｖｉｖｏでのバイオアッセイにおいて試験した。線状および
分枝型ポリマーシリーズからのそれぞれのモノ置換ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、
有意で同等なエリスロポエチン効果の持続を示した（図８および９を参照のこと
）。２０ｋＤおよび３０ｋＤのＰＥＧポリマーからのジ置換ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複
合体は非常に活性が低かったが、意外なことに５ｋＤのジ置換ＰＥＧ−ＮＥＳＰ
複合体は、モノ置換の相当物と等しい活性を示した。モノ置換、分枝型ＰＥＧ−
ＮＥＳＰ複合体はすべて、類似のモノ置換線状ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体と比べて
、より長期の活性を示した。

【００７３】したがってこれらの例は、正常なマウスモデルにおいて１回の大量注射を使用
して、さまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体によるエリスロポエチン刺激の時間が
長くなることを示す。

【００７４】実施例４この実施例では、貧血のマウスモデルにおいてＮＥＳＰコントロールに対して
３つの異なる濃度で調べた、３つのＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体：２０ｋＤのモノＰ
ＥＧ−ＮＥＳＰ、５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ混合物、および３０ｋＤのモノ
ＰＥＧ−ＮＥＳＰの効率を記載する。

【００７５】貧血状態を誘導するために、１ｍｇ／ｋｇ／１日のシスプラチニンで３日間、
次に残りの７日間、マウスを事前に処理した。３回の１０日間サイクルの後、３
０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは３μｇ／ｋｇの２０ｋＤのモノＰＥＧ−Ｎ
ＥＳＰ、３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰまたは５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ
複合体の１回の大量注射をマウスに行い、３０μｇ／ｋｇのＮＥＳＰ単独の対照
と比較した。時間の関数として、それぞれの薬剤の１回の投与に応じて、網状赤
血球およびヘモグロビンレベルを観察した（図１０〜１５を参照のこと）。

【００７６】これらのデータによって、ＮＥＳＰ単独と比べてＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体の用
量が３倍まで減少しエリスロポエチンの半減期が大幅に増大するという予期せぬ
利点が実証され、したがってこれらの結果によって、ＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体に
対する網状赤血球およびヘモグロビン応答の程度および持続時間についての、明
らかな用量依存性が実証される。いくつかの場合では、３０ｋＤのモノＰＥＧ−
ＮＥＳＰ複合体は、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰよりもわずかに効率が良い
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体よりもわずかに効率が良いようであり、こ
のことは、３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体が好ましい形態である可能性
があることを示唆する。

【００７７】実施例５この実施例では、３つの異なるＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を正常なマウスのバイ
オアッセイにおいて評価して、そのエリスロポエチンポテンシャルおよび持続時
間を比較および対比した。試験した３つの化合物は、３０ｋＤのＰＥＧ−ＮＨＳ
エステルとのアシル化によって誘導された３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ、２
０ｋＤのＰＥＧ−アルデヒドとの還元型アルキル化によって誘導された２０ｋＤ
のモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ、および５ｋＤのＰＥＧ−アルデヒドとの還元型アルキ
ル化によって誘導された５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ混合物であった。それぞ
れのＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を、３０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは３μｇ
／ｋｇの皮下用量で、１つのボーラスとして試験した。非修飾型ＮＥＳＰを、１
回の大量注射において３０μｇ／ｋｇでコントロールとして使用した。エリスロ
ポエチンの応答および持続時間を、網状赤血球数またはヘモグロビン濃度の関数
として（図１６〜２１を参照のこと）、時間の関数として観察した。これらのデ
ータによって、３つのＰＥＧ−ＮＥＳＰ形はすべて、強いエリスロポエチン応答
および大幅な用量の減少を誘導することができることが示される。さらにこれら
のＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体は、非修飾型ＮＥＳＰと比べてより持続的な効能を示
す。

【００７８】物質および方法本発明のＮＥＳＰは、前に参照によって組み込んだＰＣＴＡｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎＮｏ．ＵＳ９４／０２９５７に従って調製することができる。

【００７９】本明細書において調製した複合体は、分析用ツールとしてのサイズ排除ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用しても特徴付けた。ＳＥＣカラムは、１０
０ｍＭＮａＨＰＯ_４、１０％エタノール、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９
を使用して生成物を溶離する、ＴｏｓｏｈａａｓＴＳＫ３０００ＳＷｘｌ
（５ミクロン、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）であった。代表的なクロマトグラフを図
２２に示す。

【００８０】本発明をいくつかの好ましい実施形態で記載してきたが、当業者が変形形態お
よび変更形態を思い浮かべるであろうことは理解される。したがって添付の特許
請求の範囲は、特許請求する本発明の範囲内にある、このような均等な変形形態
すべてを含むことを意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＥＳＰをＰＥＧ化するための設計戦略を示す図である。

【図２】ＮＥＳＰをＰＥＧ化するための、さまざまな反応化学的手法を示す図である。

【図３】さまざまな５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体と、非修飾型ＮＥＳＰの、ｉ
ｎｖｉｖｏでの活性データを示すグラフである。

【図４】非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用いる治療に
応答する、高いヘモグロビン（ＨＧＢ）レベルの持続を示すグラフである。

【図５】非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用いる治療に
応答する、高い網状赤血球レベルの持続を示すグラフである。

【図６】非修飾型ＮＥＳＰに対してさまざまなＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体を用いる治療に
応答する、高いヘモグロビンレベルの持続を示すグラフである。

【図７】５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム
でのクロマトグラムを示す図である。

【図８】２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラ
ムでのクロマトグラムを示す図である。

【図９】３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラ
ムでのクロマトグラムを示す図である

【図１０】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３μｇ／ｋ
ｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、および５ｋ
ＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射した後の、貧
血マウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。

【図１１】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を１０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋｇ、および
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ注射した後
の、貧血マウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。

【図１２】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋｇ、５ｋＤ
のポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、および非修飾型
ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、貧血マウスの網状赤血球の応答
を示すグラフである。

【図１３】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３μｇ／ｋ
ｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、および５ｋ
ＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射した後の、貧
血マウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。

【図１４】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を１０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋｇ、および
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ注射した後
の、貧血マウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。

【図１５】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋｇ、５ｋＤ
のポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、および非修飾型
ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、貧血マウスのヘモグロビンの応
答を示すグラフである。

【図１６】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３μｇ／ｋ
ｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、および５ｋ
ＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射した後の、正
常なマウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。

【図１７】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を１０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋｇ、および
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ注射した後
の、正常なマウスの網状赤血球の応答を示すグラフである。

【図１８】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋｇ、５ｋＤ
のポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、および非修飾型
ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、正常なマウスの網状赤血球の応
答を示すグラフである。

【図１９】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３μｇ／ｋ
ｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３μｇ／ｋｇ、および５ｋ
ＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３μｇ／ｋｇ注射した後の、正
常なマウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。

【図２０】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を１０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を１０μｇ／ｋｇ、および
５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を１０μｇ／ｋｇ注射した後
の、正常なマウスのヘモグロビンの応答を示すグラフである。

【図２１】１回の大量注射で３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（▼）を３０μｇ／
ｋｇ、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体（■）を３０μｇ／ｋｇ、５ｋＤ
のポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ複合体混合物（●）を３０μｇ／ｋｇ、および非修飾型
ＮＥＳＰ（○）を３０μｇ／ｋｇ注射した後の、正常なマウスのヘモグロビンの
応答を示すグラフである。

【図２２】５ｋＤのポリＰＥＧ−ＮＥＳＰ（─）、２０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（-
- -）、および３０ｋＤのモノＰＥＧ−ＮＥＳＰ（…）の、サイズ排除ＨＰＬＣ
クロマトグラムを示す図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ゲツグ，コリン・ブイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、デルウツド・コート・487 (72)発明者フリーマン，エイミーアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、ロテーラ・ドライブ・1253 (72)発明者ブーン，トーマス・チヤールズアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、デイアー・バリー・アベニユー・3010 Ｆターム(参考） 4C076 BB11 CC14 CC41 EE06 EE25 EE38 EE59 FF31 4C084 AA01 BA42 CA59 DB56 NA12 ZA55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】薬剤として許容される希釈剤、担体またはアジュバント中に
場合によっては存在する、化学的に修飾されたＮＥＳＰの実質的に均質な調製物
。
【請求項２】前記ＮＥＳＰがデキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピウロリ
ドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプ
ロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオー
ルおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学的に修
飾されている請求項１に記載の調製物。
【請求項３】前記ＮＥＳＰまたはその類似体がポリエチレングリコールで
化学的に修飾されている請求項２に記載の調製物。
【請求項４】前記ポリエチレングリコールが約２ｋＤと１００ｋＤの間の
分子量を有する請求項３に記載の調製物。
【請求項５】前記ポリエチレングリコールが約５ｋＤと３０ｋＤの間の分
子量を有する請求項４に記載の調製物。
【請求項６】前記調製物がモノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰとポリ
ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの混合集団からなる請求項１に記載の調製物
。
【請求項７】前記調製物が少なくとも９５％のＮ末端モノポリエチレング
リコール化ＮＥＳＰおよび多くとも５％の非ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰ
からなる請求項１に記載の調製物。
【請求項８】前記ＮＥＳＰが配列番号１において同定される配列を有する
請求項１に記載の調製物。
【請求項９】（ａ）モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの実質的に均
質な調製物であって、前記モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰが、そのＮ末
端のみでＮＥＳＰ部分に結合したポリエチレングリコール部分からなる調製物、（ｂ）５％未満の非ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰ分子、および（ｃ）薬剤として許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む薬剤組成物。
【請求項１０】（ａ）モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの実質的に
均質な調製物であって、前記モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰが、前記Ｎ
ＥＳＰの炭水化物鎖中で生成されたアルデヒドを介してＮＥＳＰ部分に結合した
ポリエチレングリコール部分からなる調製物、（ｂ）５％未満の非ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰ分子、および（ｃ）薬剤として許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む薬剤組成
物。
【請求項１１】（ａ）モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの実質的に
均質な調製物であって、前記モノポリエチレングリコール化ＮＥＳＰが、メトキ
シ−ポリエチレングリコール−ＮＨＳ化学物質を使用してＮＥＳＰ部分に結合し
たポリエチレングリコール部分からなる調製物、（ｂ）５％未満の非ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰ分子、および（ｃ）薬剤として許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む薬剤組成物。
【請求項１２】（ａ）ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの実質的に均質
な調製物であって、前記ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰが、モノポリエチレ
ングリコール化ＮＥＳＰとポリポリエチレングリコール化ＮＥＳＰの混合集団を
含む調製物、（ｂ）５％未満の非ポリエチレングリコール化ＮＥＳＰ分子、および（ｃ）薬剤として許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む薬剤組成
物。
【請求項１３】造血障害を治療するための方法であって、治療的に有効な
用量の請求項１に記載の調製物を投与することを含む方法。