ES2365000T3 - Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos. - Google Patents

Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos. Download PDF

Info

Publication number
ES2365000T3
ES2365000T3 ES01928395T ES01928395T ES2365000T3 ES 2365000 T3 ES2365000 T3 ES 2365000T3 ES 01928395 T ES01928395 T ES 01928395T ES 01928395 T ES01928395 T ES 01928395T ES 2365000 T3 ES2365000 T3 ES 2365000T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nesp
peg
preparation
pegylated
mono
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01928395T
Other languages
English (en)
Inventor
Olaf Boris Kinstler
Colin V. Gegg
Aimee Freeman
Thomas Charles Boone
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2365000T3 publication Critical patent/ES2365000T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Una preparación de nueva proteína estimulante de eritropoyetina químicamente modificada (NESP), opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde dicha NESP es modificada químicamente con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(N-vinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes, y en donde la preparación es al menos 90% conjugado de polímero:proteína, y a lo sumo 10% de proteína que no ha reaccionado.

Description

Antecedentes de la invención
La nueva proteína estimulante de eritropoyetina (NESP) es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilada que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO que provee dos cadenas adicionales de carbohidrato. Más específicamente, la NESP contiene dos cadenas adicionales de carbohidrato enlazadas a N en los residuos aminoácidos 30 y 88 (numeración correspondiente a la secuencia de EPO humana) (ver la Solicitud PCT No. US 94/09257 (WO 9505465)).
La NESP es biológicamente distinta de EPO, tiene una vida media en suero más larga y una actividad biológica más alta in vivo; Egrie et al., ASH 97, Blood, 90:56a (1997). La NESP ha mostrado tener un incremento de 3 veces en la vida media en suero en ratones, ratas, perros y humanos; Id. En ratones, una vida media en suero más larga y una actividad más alta in vivo permite una dosificación menos frecuente (una vez a la semana o una vez cada dos semanas) en comparación con rHuEPO para obtener la misma respuesta biológica; Id.
Un estudio farmacocinético demostró que, consistente con los estudios en animales, la NESP tiene una vida media en suero significativamente mayor que rHuEPO en pacientes con insuficiencia renal crónica, lo cual sugiere que se puede emplear también un programa de dosificación menos frecuente en humanos; MacDougall, et al., J American Society of Nephrology, 8:268A (1997). Un programa de dosificación menos frecuente sería más conveniente tanto para médicos como para pacientes, y sería particularmente útil para aquellos pacientes que se administraron la medicación por sí mismos. Otras ventajas de una dosificación menos frecuente pueden incluir una menor cantidad de fármaco es introducida a los pacientes, una reducción en la naturaleza o severidad de los pocos efectos secundarios observados con la administración de rHuEPO, y una mayor conformidad.
Aunque una vida media extendida de NESP ofrece la ventaja de una dosificación menos frecuente con relación a EPO, todavía existen indicaciones potenciales, tales como quimioterapia, que puede requerir incluso de una vida media terapéutica más prolongada quee la que demuestra actualmente la NESP.
Una aproximación común utilizada a menudo para extender las vidas medias de las proteínas in vivo es la conjugación química de un polímero soluble en agua, tal como polietilén glicol (PEG), con la proteína de interés (véase M. L. Rucci et al, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 5, 1991 páginas 133 - 151, N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 10, 1993, páginas 91 - 114). Generalmente, las moléculas de polietilén glicol se conectan a la proteína a través de un grupo reactivo encontrado sobre la proteína. Grupos amino, tales como aquellos sobre residuos de lisina o en el N-terminal, son convenientes para tal acoplamiento.
Se ha utilizado una variedad de métodos para unir las moléculas de polietilén glicol con la proteína (PEGilación). Por ejemplo, Royer (Patente de los Estados Unidos No. 4.002.531) establece que se utilizó alquilación reductiva para la unión de moléculas de polietilén glicol con una enzima. Davis et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4.179.337) divulga conjugados de PEG:proteína que involucran, por ejemplo, enzimas e insulina. Shaw (Patente de los Estados Unidos No. 4.904.584) divulga la modificación de la cantidad de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilén glicol a través de grupos reactivos amina. Hakimi et al. (Patente de los Estados Unidos No. 5.834.594) divulga conjugados de PEG:proteína solubles en agua sustancialmente no inmunogénicos, que involucran por ejemplo, las proteínas IL-2, interferón alfa, e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al. involucran la utilización de enlazadores únicos para conectar los diferentes grupos amino libres en la proteína con PEG. Kinstler et al. (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.824.784 y 5.985.265) enseña métodos que permiten proteínas selectivamente modificadas químicamente en el N-terminal y análogos de las mismas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso. En forma muy importante, estas proteínas modificadas tienen ventajas con relación a la estabilidad de la proteína, e igualmente ofrecen ventajas en el procesamiento.
Los enfoques de PEGilación tales como los descritos anteriormente se aplican tradicionalmente a proteínas no glicosiladas derivadas de sistemas de expresión bacterianos con el propósito de hacer mejoras en solubilidad y en la vida media circulante in vivo (tales propiedades son conferidas típicamente a proteínas glicosiladas (glicoproteínas) a través de las estructuras funcionales de carbohidrato añadidas en el transcurso de la expresión eucariota). Los efectos de PEGilación sobre las vidas medias in vivo de proteínas no glicosiladas se presentan generalmente a través de la deriva de las propiedades fisicoquímicas y dinámicas de PEG que confieren un mayor volumen hidrodinámico y masa total al conjugado, reduciendo así la tasa de aclaramiento renal. Los beneficios adicionales incluyen típicamente mayor solubilidad y menor inmunogenicidad para el conjugado. Sin embargo, no todas las proteínas responden igualmente a la PEGilación y no existe garantía de un mejor desempeño.
La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una proteína altamente glicosilada, por ejemplo, NESP, puede ser PEGilada para proveer una composición farmacéutica con un perfil de duración incluso más dramáticamente sostenido que la NESP, permitiendo una dosis cada 4 - 6 semanas para elevar los hematocritos y tratar la anemia, y por lo tanto proporcionar una tremenda ventaja terapéutica.
imagen1
Resumen de la invención
La presente invención se relaciona con una preparación de NESP químicamente modificada (o un análogo de la misma) y con métodos relacionados.
La presente invención se relaciona adicionalmente con una preparación de NESP químicamente modificada en el N-terminal (o un análogo de la misma).
La presente invención se relaciona adicionalmente con una preparación de NESP químicamente modificada representada como una población mixta ya sea de isoformas posicionales monosustituidas o formas polisustituidas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 describe la estrategia de diseño para la PEGilación de NESP: (A) el tamaño del polímero de PEG varía entre 5 kD, 20 kD y 30 kD; (B) la conformación del polímero PEG puede ser bien lineal o ramificada con pesos moleculares totales de PEG de 10 kD, 20 kD o 40 kD; y (C) las preparaciones de PEG:NESP con diferentes grados de sustitución pueden ser aisladas para incluir: mono-PEG, di-PEG o, en algunos casos, tri-PEG de NESP.
La Figura 2 describe las diferentes químicas de reacción para la PEGilación de NESP: (A) alquilación reductiva de NESP con PEG-aldehído; (B) acilación de NESP con éster N-succinimidilo de PEG; y (C) PEGilación de las cadenas laterales de polisacárido de NESP por medio de oxidación limitada con peryodato del carbohidrato con el aldehído resultante que reaccionó con PEGhidrazida para formar un enlace de hidrazona seguido por posterior reducción con cianoborohidruro de sodio para estabilizar el enlace.
La Figura 3 es una gráfica que describe los datos de actividad in vivo de diferentes conjugados de poli-PEG:NESP de 5 kD vs. NESP no modificada (■). Las muestras -▲-, -▼-, -●-, y -♦- son mezclas de poli-PEG:NESP de 5 kD con grados progresivamente menores de sustitución. El grafica el % de absorción de hierro vs. los ng/mL administrados.
La Figura 4 es una gráfica que describe la prolongación de niveles elevados de hemoglobina (HGB) en respuesta al tratamiento con diferentes conjugados de PEG:NESP con relación a NESP no modificada. Se representa gráficamente una inyección única en bolo de 100 μg/kg de NESP (♦), conjugado de mono-PEG:NESP lineal de 20 kD derivado de metoxi-PEG activado con éster de NHS (■), conjugado lineal de 20 kD (80% de mono-PEG:NESP y 20% de di-PEG:NESP) derivado por medio de alquilación reductiva de PEG activado por aldehído (▼), y un control salino (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. # de días después del tratamiento.
La Figura 5 es una gráfica que describe la prolongación de niveles elevados de reticulocitos en respuesta al tratamiento con diferentes conjugados de PEG:NESP con relación a NESP no modificada. Inyección única en bolo de 100 μg/kg de NESP (O), conjugados de mono-PEG:NESP lineal de 20 kD (●), de mono-PEG:NESP lineal de 5 kD (▼) y de di-PEG:NESP de 5 kD (♦) derivados por medio de alquilación reactiva de metoxi-PEG activado por aldehído, un conjugado de mono-PEG:NESP ramificado de 20 kD (■) a partir de PEG activado con éster de NHS, y un control salino (A). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 6 es una gráfica que describe la prolongación de niveles elevados de hemoglobina en respuesta al tratamiento con diferentes conjugados de PEG:NESP con relación a la NESP no modificada. Inyección única en bolo de 100 μg/kg de NESP (O), conjugados de mono-PEG:NESP lineal de 20 kD (●), de mono-PEG:NESP lineal de 5 kD (▼) y de di-PEG:NESP (♦) derivados por medio de alquilación reductiva a partir de metoxi-PEG activado por aldehído y un conjugado de mono-PEG:NESP ramificado de 20 kD (■) a partir de PEG activado por el éster de NHS. Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 7 describe un cromatograma en una columna HP de Sefarosa Q del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD. La columna era una HP de Sefarosa Q HiTrap que utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a 200 mM para eluir el producto.
La Figura 8 describe un cromatograma en columna de Q Sefarosa HP del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD. La columna era una HP de Sefarosa Q HiTrap que utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a 200 mM para eluir el producto.
La Figura 9 describe un cromatograma en columna de Q Sefarosa HP del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD. La columna era una HP de Sefarosa Q HiTrap que utilizó un gradiente lineal de NaCl 50 mM a 200 mM para eluir el producto.
La Figura 10 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 3 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
imagen2
La Figura 11 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 10 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 12 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 30 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●) vs. 30 μg/kg de NESP no modificada (O). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 13 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 3 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 14 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 10 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 15 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones anémicos después de inyecciones únicas en bolo de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 30 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●) vs. 30 μg/kg de NESP no modificada (O). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 16 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 3 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 17 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 10 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 18 es una gráfica que describe la respuesta de reticulocitos de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 30 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●) vs. 30 μg/kg NESP no modificada (O). Se representa gráficamente el recuento absoluto de reticulocitos vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 19 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 3 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 3 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 20 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 10 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 10 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 21 es una gráfica que describe la respuesta de hemoglobina de ratones normales después de inyecciones únicas en bolo de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD (▼), de 30 μg/kg del conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD (■), y de 30 μg/kg de la mezcla del conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD (●) vs. 30 μg/kg NESP no modificada (O). Se representa gráficamente HGB (g/dL) vs. el # de días después del tratamiento.
La Figura 22 describe cromatogramas de HPLC de exclusión por tamaño del poli-PEG:NESP de 5 kD (—), el mono-PEG:NESP de 20 kD (- - -) y el mono-PEG:NESP de 30 kD (---). La columna de SEC era una Tosohaas TSK 3000 SWx1 (5 micrones - 7,8 mm X 30 cm) que utilizó NaHPO4 100 mM, 1etanol al 10%, NaCl 150 mM, pH 6,9, para eluir los productos.
imagen3
Descripción detallada de la invención
Para descubrir si la vida media terapéutica in vivo de una glicoproteína tal como NESP sería benéfica a partir de la PEGilación, se sintetizaron una variedad de diferentes conjugados de PEG:NESP y se analizaron in vivo durante una eritropoyesis prolongada.
Con el propósito tanto de optimizar los efectos potenciales de la PEGilación como de identificar los sitios preferidos y la química de las uniones de PEG, se empleó una estrategia de diseño en donde se varió tanto la longitud y conformación del polímero, como el grado y los sitios de unión (ver la Figura 1).
Los métodos para preparar la NESP PEGilada de la presente invención generalmente comprenden las etapas de (a) hacer reaccionar NESP con polietilén glicol (tal como un éster reactivo o un derivado de PEG-aldehído) bajo condiciones mediante las cuales NESP se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener el(los) producto(s) de reacción. Debido a que los sitios específicos de modificación de NESP pueden alterar significativamente la actividad intrínseca del conjugado, se exploraron tres diferentes químicas de PEGilación (ver la Figura 2). El primer enfoque utiliza alquilación reductiva para conjugar PEG-aldehído (O-(3-Oxopropil)-O’-metilpolietilén glicol) a una amina primaria de NESP. Bajo condiciones apropiadas, este enfoque ha demostrado que produce conjugados de PEG predominantemente modificados a través de la α-amina en el N-terminal de la proteína. Debido a que el PEG se enlaza a través de una amina secundaria por medio de alquilación reductiva existe la posibilidad de conservar la carga en el N-terminal de la proteína.
La segunda química aplicada a la PEGilación de NESP fue la acilación de las aminas primarias de NESP utilizando el éster de la NHS de metoxi-PEG (O-[(N-Succinimidiloxicarbonil)-metil]-O’-metilpolietilén glicol). En contraste con la química anterior, la acilación con metoxi-PEG-NHS resulta en un enlace amida que eliminará la carga de la amina primaria original.
La química final de unión evaluada utiliza una oxidación suave de NESP bajo condiciones seleccionadas para orientar el diol que pende de la penúltima unidad de glicosilo del ácido siálico para oxidación hasta un aldehído. El glicoaldehído resultante reaccionó luego con una metoxi-PEG-hidrazida (O-(Hidrazinocarbonilmetil)-O’-metilpolietilén glicol) para formar una hidrazona semi-estable entre el PEG y NESP. La hidrazona fue posteriormente reducida por medio de cianoborohidruro de sodio para producir un conjugado estable de PEG:NESP.
Los métodos actuales proveen cada uno una mezcla de conjugado de polímero:proteína, lo que significa que únicamente se observan moléculas del conjugado de polímero:proteína. Como se estableció por medio del mapeo de péptidos y la secuenciación del N-terminal, un ejemplo más abajo proporciona una preparación que es al menos 90% conjugado de polímero:proteína, y un máximo de 10% de proteína no reaccionada. Preferiblemente, el material PEGilado es al menos 95% de la preparación (como en el ejemplo de trabajo más adelante) y más preferiblemente, el material PEGilado es 99% de la preparación o más. El conjugado de polímero:proteína tiene actividad biológica y las actuales preparaciones PEGiladas de NESP suministradas aquí son aquellas que son suficientemente homogéneas para mostrar las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo, de fácil aplicación clínica para la predicción de muchas farmacocinéticas.
También se puede escoger preparar una mezcla de moléculas del conjugado de polímero:proteína, y la ventaja aportada aquí es que se puede seleccionar la proporción del conjugado de mono-polímero:proteína para incluir en la mezcla. Por lo tanto, si se desea, se puede preparar una mezcla de diferentes proteínas con diferentes cantidades de estructuras funcionales poliméricas unidas (es decir, di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar dichos conjugados con el conjugado de mono-polímero:proteína preparado utilizando los actuales métodos, y tener una mezcla con una proporción predeterminada del conjugado de mono-polímero:proteína.
Los experimentos iniciales diseñados para evaluar y optimizar las estequiometrías de reacción de PEG:proteína revelaron que la PEGilación por medio de alquilación reductiva utilizando PEG-aldehído fue sorprendentemente algo ineficiente, requiriendo relaciones molares sustancialmente más altas de PEG con respecto a la proteína que lo típicamente observado con proteínas no glicosiladas. En forma similar, la acilación con ésteres de PEG-NHS fue también más lenta y menos eficiente de lo esperado. Fue evidente por lo tanto que la PEGilación de proteínas no glicosiladas no era necesariamente predictiva de la PEGilación de proteínas glicosiladas y que era necesario una optimización adicional de las condiciones de reacción.
Las moléculas de polímeros contempladas para uso en los enfoques de PEGilación descritos aquí pueden ser seleccionadas entre polímeros solubles en agua o una mezcla de los mismos. El polímero soluble en agua se puede seleccionar del grupo que consiste en, por ejemplo, polietilén glicol, monometoxi-polietilén glicol, dextrano, poli-(Nvinil pirrolidona), homopolímeros de propilén glicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), dextrano, HPMA, Fleximer™, y polivinil alcohol. El polímero seleccionado debe ser soluble en agua para que la proteína a la cual está unida no precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Para las reacciones de acilación, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un solo grupo éster reactivo. Para la presente alquilación reductiva, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un solo grupo aldehído reactivo. Un reactivo preferido PEG-aldehído es polietilén glicol propionaldehído, que es estable en agua, o derivados mono ariloxi o alcoxi C1-C10 de los mismos (ver, la Patente de los Estados Unidos No. 5.252.714).
imagen4
El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable.
Un polímero soluble en agua particularmente preferido para su uso aquí es polietilén glicol, abreviado como PEG. Como se lo utiliza aquí, se entiende que polietilén glicol abarca cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para formar derivados de otras proteínas, tales como mono-alcoxi(C1-C10)- o ariloxi-polietilén glicol.
La proporción de moléculas de polietilén glicol con respecto a moléculas de proteína variará, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (en términos de eficiencia de la reacción en la que no hay exceso de proteína o de polímero sin reaccionar) se determinará por medio del peso molecular del polietilén glicol seleccionado y la cantidad de grupos reactivos disponibles (típicamente grupos amino ∞ o imagen5 ). En lo que respecta al peso molecular, entre más alto el peso molecular del polímero, menor el número de moléculas de polímero que pueden estar unidas a la proteína. En forma similar, se debe tener en cuenta la ramificación del polímero cuando se optimizan estos parámetros. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular (o cuantas más ramificaciones tenga) mayor será la relación polímero:proteína. En la presente invención, se evaluaron diferentes longitudes de polímeros PEG lineales (5 kD, 20 kD y 30 kD). En forma similar, se evaluaron también conjugados de polímeros PEG ramificados en dos brazos (10 kD, 20 kD y 40 kD). A partir de cada preparación, se aislaron muestras de PEG:NESP mono y disustituidas para investigar los efectos de sitios secundarios de PEGilación.
En general, para las reacciones de PEGilación contempladas aquí, el peso molecular promedio preferido es aproximadamente de 2 kDa hasta aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica ± 1 kDa). Más preferiblemente, el peso molecular promedio es aproximadamente de 5 kDa hasta aproximadamente 40 kDa. La proporción de polímero soluble en agua con respecto a NESP estará generalmente en el rango de 1:1 para mono-PEG, 2:1 para di-PEG etc., y las proporciones de masa para PEG:proteína serían de 1:7 para mono-PEG de 5 kD hasta 1:1,3 para mono-PEG de 30 kD.
El método para obtener la preparación PEGilada de NESP puede ser purificación del material PEGilado de una población de moléculas no PEGiladas de NESP. Por ejemplo, más abajo se presenta un ejemplo donde se separa NESP mono y/o di-PEGilada utilizando cromatografía de intercambio iónico por tamaño. La cromatografía de exclusión por tamaño se usa como herramienta analítica para caracterizar los productos purificados.
La presente invención también provee un método para obtener selectivamente NESP químicamente modificada en el N-terminal. El método comprende alquilación reductiva que aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el N-terminal) disponibles por derivatización en una proteína particular. Bajos las condiciones apropiadas de reacción, se logra una derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el N-terminal con un polímero que contiene un grupo carbonilo. La reacción se lleva a cabo a un pH que permite tomar ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos ε-amino de los residuos de lisina y aquellos del grupo αamino del residuo del N-terminal de la proteína. Por medio de tal formación de derivados selectiva se controla la unión de un polímero soluble en agua con una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el N-terminal de la proteína y no se presenta modificación significativa de otros grupos reactivos, tal como grupos amino de cadena lateral de lisina. La preparación será superior al 80% del conjugado de mono-polímero:proteína, y más preferiblemente superior al 95% del conjugado de mono-polímero:proteína.
La NESP de la presente invención es un análogo de EPO hiperglicosilado que contiene dos sitios de glicosilación adicionales con una cadena adicional de carbohidrato unida a cada sitio. Se construyó la NESP utilizando mutagénesis dirigida al sitio y expresada en células huésped de mamífero. Los detalles de la producción de NESP se encuentran en la Solicitud PCT de propiedad compartida No. US 94/09257 (WO 9505465). Se introdujeron nuevos sitios de glicosilación enlazados a N para rHuEPO por medio de alteraciones en la secuencia de ADN para codificar los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr en la cadena de polipéptido. Se transfectó ADN que codifica NESP en células huésped de Ovario de Hámster Chino (CHO) y se analizó el polipéptido expresado por la presencia de cadenas adicionales de carbohidrato. En una modalidad preferida, la NESP tendrá dos cadenas de carbohidrato adicionales enlazadas a N en los residuos 30 y 88. La numeración de la secuencia de aminoácidos es la de la eritropoyetina humana (EPO). La secuencia de aminoácidos de la NESP es la descrita en la SEQ ID NO: 1. Se entiende que NESP tendrá el complemento normal de sitios de glicosilación enlazados a N y enlazados a O además de los sitios nuevos.
La NESP de la presente invención puede incluir también cambios conservadores de aminoácidos en uno o más residuos en la SEQ ID NO: 1. Estos cambios no dan como resultado la adición de una cadena de carbohidrato y tendrán poco efecto sobre la actividad biológica del análogo.
En general, comprendidas en la presente invención están las composiciones farmacéuticas que contienen cantidades efectivas de proteína o productos derivados de la invención junto con diluyentes, estabilizadores, preservantes, solubilizadores, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes con diferente contenido amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como agentes detergentes y solubilizantes (por ejemplo, Polisorbato 20, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), preservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol bencílico) y sustancias a granel (por ejemplo, lactosa, manitol); ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435:1712. Una cantidad efectiva de ingrediente activo es una cantidad terapéutica, profiláctica, o efectiva para diagnóstico, que puede ser determinada fácilmente por una persona capacitada en el arte tomando en consideración factores tales como el peso corporal, la edad, y el objetivo terapéutico o profiláctico.
imagen6
Las composiciones de PEG:NESP de la presente invención pueden incluir también un agente amortiguador para mantener el pH de la solución dentro de un rango deseado. Los agentes preferidos incluyen acetato de sodio, fosfato de sodio, y citrato de sodio. También se pueden utilizar las mezclas de estos agentes amortiguadores. La cantidad de agente amortiguador útil en la composición depende en gran medida del amortiguador particular utilizado y del pH de la solución. Por ejemplo, el acetato es un amortiguador más eficiente a pH 5 que a pH 6 de tal manera que se puede utilizar menos acetato en una solución a pH 5 que a pH 6. El rango de pH preferido para las composiciones de la presente invención es pH 3,0 - 7,5.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir además un agente para ajuste de la isotonicidad para hacer la solución isotónica y más compatible para inyección. El agente más preferido es cloruro de sodio dentro de un rango de concentración de 0 - 150 mM.
Como se lo utiliza aquí, y cuando se contemplan conjugados de PEG:NESP, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que produce un incremento en hematocritos que produce un beneficio a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de una cantidad de factores, incluyendo la condición física general del paciente y la causa subyacente de la anemia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de rHuEPO para un paciente que sufre de insuficiencia renal crónica es de 50 a 150 unidades/kg tres veces por semana. La cantidad de rHuEPO usada para terapia produce una tasa aceptable de incremento de hematocritos y mantiene los hematocritos en un nivel benéfico (usualmente de forma aproximada al menos 30% y típicamente en un rango del 30% al 36%). Puede determinarse fácilmente una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones por alguien capacitado en el arte utilizando materiales y procedimientos disponibles públicamente.
La invención provee para su administración conjugados de PEG:NESP menos frecuentemente que NESP y/o EPO. La frecuencia de la dosificación variará dependiendo de la condición que está siendo tratada, pero en general será aproximadamente una vez por 4 - 6 semanas. Se entiende que las frecuencias de las dosis actualmente utilizadas pueden variar algo con respecto a las frecuencias divulgadas aquí debido a variaciones en las respuestas por parte de diferentes individuos a los conjugados de PEG:NESP; se entiende que el término "aproximadamente" refleja tales variaciones.
La presente invención puede utilizarse por lo tanto para estimular la producción de glóbulos rojos y corregir los niveles deprimidos de glóbulos rojos. Más comúnmente, los niveles de glóbulos rojos disminuyen debido a la anemia. Entre las condiciones tratables por medio de la presente invención se incluyen anemia asociada con una declinación o pérdida de la función del riñón (insuficiencia renal crónica), anemia asociada con terapia mielosupresora, tal como con fármacos antivirales o quimioterapéuticos (tales como AZT), anemia asociada con el progreso de cánceres no mieloides, y anemia asociada con infecciones virales (tales como el VIH). También pueden tratarse condiciones que pueden conducir a anemia en un individuo por lo demás sano, tal como una pérdida anticipada de sangre durante una cirugía. En general, cualquier condición que pueda ser tratada con rHuEPO y/o NESP puede también ser tratada con los conjugados de PEG:NESP de la invención.
La invención también prevé la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro con el propósito de mantener una mayor eritropoyesis durante la terapia. La cantidad que va a ser suministrada puede determinarse fácilmente por alguien capacitado en el arte con base en la terapia con rHuEPO.
Los conjugados de PEG:NESP preparados de acuerdo con la presente invención se administran preferiblemente por medio de una inyección intraperitoneal, subcutánea, o intramuscular. Sin embargo, sería claro para alguien capacitado en el arte que también se podrían utilizar efectivamente otras rutas de suministro usando las composiciones de la presente invención.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención. El Ejemplo 1 describe la preparación y el análisis de los conjugados de PEG:NESP preparados por medio del acoplamiento ya sea de metoxi-PEG-hidracidas de 5 KD o de 20 kD con NESP a través de aldehídos generados en las cadenas de carbohidrato de NESP por oxidación con peryodato de sodio. El Ejemplo 2 describe la preparación y el análisis de conjugados de PEG:NESP preparados utilizando polímeros PEG de 20 kD como ésteres de NHS-PEG y aldehídos de PEG para producir conjugados de PEG-NESP por acilación y alquilación reductiva respectivamente. El Ejemplo 3 demuestra los efectos sobre la actividad del grado de sustitución y las variaciones del tamaño del polímero y conformación para diferentes conjugados de PEG:NESP. El Ejemplo 4 describe la eficacia de tres conjugados de PEG:NESP: mono-PEG:NESP de 20 kD; la mezcla de poli-PEG:NESP de 5 kD; y mono-PEG:NESP de 30 kD, como se examinó con tres dosis diferentes con relación a una NESP de control, en un modelo anémico de ratón. En el Ejemplo 5, se evaluaron tres conjugados diferentes de PEG-NESP en un bioensayo con un ratón normal para comparar y contrastar su potencial eritropoyético y duración.
imagen7
Ejemplo 1
Los conjugados de PEG:NESP fueron producidos por acoplamiento bien de hidracidas de metoxi-PEG de 5 kD o de 20 kD a NESP a través de los aldehídos generados en las cadenas de carbohidratos de NESP por oxidación con peróxido de sodio. El grado de modificación fue controlado variando la concentración del peryodato de sodio durante la oxidación.
Los conjugados fueron preparados oxidando primero NESP (2 - 4 mg/ml en acetato de sodio 50 mM) ya sea con meta-peryodato de sodio 1 mM o 10 mM (Sigma) durante treinta minutos a temperatura ambiente en acetato de sodio 100 mM, pH 5,6. Se remueve luego el peryodato por cambio de amortiguador en acetato de sodio 100 mM, pH 5,4. Se añade luego hidrazida de metoxi-PEG (Shearwater Polymers) con un exceso molar de 5 - 100 veces de polímero:proteína, preferiblemente con un exceso de 100 veces. Se redujo aún más el enlace de hidrazona intermedio por medio de la adición de cianoborohidruro de sodio 15 mM (Sigma) y se permitió que reaccionara durante la noche a 4°C. Se fraccionaron luego los conjugados resultantes por medio de FPLC de exclusión por tamaño utilizando una columna Superdex 75, de 26 mm x 60 cm (Pharmacia) eluida con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. Las preparaciones resultantes están en el rango de tamaño de -40 kD a -200 kD, de acuerdo a lo estimado por SDS-PAGE.
Las muestras de PEG:NESP fueron analizadas por el enlazamiento del receptor en un formato EIA in vitro. El ensayo in vitro es un ensayo de desplazamiento en donde los conjugados de PEG:NESP compiten por el enlazamiento del receptor de EPO con un conjugado de EPO-HRP utilizado como reportero. Los resultados del ensayo in vitro sugieren que los conjugados de PEG:NESP tenían una menor afinidad aparente por el receptor de la NESP.
Se evaluó luego la bioactividad de diferentes conjugados de PEG:NESP in vivo monitoreando la ingesta de hierro en roedores después de una única dosis subcutánea del conjugado. En el ensayo, se condicionan previamente los ratones en una cámara hiperbárica para suprimir la expresión de eritropoyetina endógena, luego se los dosifica con una inyección única subcutánea en bolo de NESP o un conjugado de PEG:NESP. Después de cinco días, los ratones recibieron una inyección intravenosa del isótopo Fe59 como trazador para monitorear la entrada de hierro en los glóbulos rojos. Dos días después de la administración de Fe59, se sacrifican los animales y se analiza la ingesta de hierro en función de la dosis.
Inicialmente, se analizaron diferentes reservas de conjugados de poli-PEG:NESP de 5 kD con diferentes grados de PEGilación por la ingesta de hierro en función de la dosis de conjugado. Los resultados del ensayo in vivo están descritos en la Figura 3, y demostraron que los conjugados de PEG:NESP preparados por acoplamiento de la hidrazida de PEG con NESP oxidada se desempeñan en forma comparable a NESP sola en el bioensayo de ingesta de hierro.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la preparación y análisis de conjugados de PEG:NESP preparados utilizando ésteres de NHSPEG y aldehídos de PEG producidos a partir de polímeros PEG de 20 kD. Se optimizaron las estequiometrías de reacción y las condiciones del amortiguador para que cada química produjera conjugados de mono-PEG:NESP de 20 kD con buen rendimiento. Se preparó también un derivado de mono-PEG:NESP de 20 kD por acilación de NESP con el éster de metoxi-PEG-NHS de 20 kD, así como una mezcla (~ 80%/20%) del derivado de mono/di-PEG:NESP de 20 kD por medio de alquilación reductiva de NESP con metoxi-PEG-aldehído de 20 kD.
La reacción con metoxi-PEG-aldehído (Shearwater Polymers) puede ser llevada a cabo a un pH 4 - 6 siendo óptimo un pH 5,2. La concentración de NESP en la mezcla de reacción fue de 4 mg/ml en acetato de sodio 50 mM. El exceso molar usado de PEG-aldehído fue de 5 - 20 veces, y se añadió cianoborohidruro de sodio hasta una concentración final de 15 mM. Se agitó la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente y luego durante 18 horas a 5°C. Después de completarse la reacción, se diluyó la mezcla hasta una conductividad de menos de 5 mS/cm, el pH se elevó hasta 7,0, y se cargó la mezcla en una columna HP de Sefarosa Q (Pharmacia). Se eluyeron los productos de la columna utilizando un gradiente lineal de NaCl 50 mM hasta NaCl 200 mM amortiguados en Bis-Tris-Propano 10 mM, pH 7,0. Esta purificación permite la separación de especies con base en la cantidad de moléculas de PEG unidas a NESP.
La reacción con éster de NHS activado por PEG, metoxi-SPA-PEG (Shearwater Polymers), fue llevada a cabo a pH 8,0 con una concentración de NESP de 2 - 4 mg/ml en amortiguador de Bicina 50 mM. Se añadió una solución amortiguada de NESP a 10 - 20 equivalentes molares de PEG. Se agitó la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de que se completó la reacción, se diluyó la mezcla hasta una conductividad de menos de 5 mS/cm, el pH se elevó hasta 7,0, y se cargó la muestra sobre una columna QHP (Pharmacia). Los productos fueron eluidos con un gradiente lineal de NaCl 50 mM hasta NaCl 200 mM amortiguados en Bis-Tris-Propano 10 mM, pH 7,0.
Los dos conjugados aislados de PEG:NESP, uno mono-PEG:NESP de 20 kD (NHS) y una mezcla (~ 80%/20%) de mono/di-PEG:NESP de 20 kD (aldehído) fueron luego probados en un bioensayo in vivo en múrido. El bioensayo en múrido mide reticulocitos, precursores de glóbulos rojos, y hemoglobina como monitores de eritropoyesis en respuesta a una dosis única de NESP o de PEG:NESP en ratones normales. Específicamente, el ensayo mide la intensidad y la duración de una respuesta incrementada de hemoglobina y de reticulocitos resultante de inyecciones subcutáneas en bolo de 100 μg/kg en ratones hembra BDF 1. Los resultados del ensayo están descritos en la Figura
imagen8
5 4, y los resultados del estudio indicaron un incremento significativo y la prolongación de la respuesta de hemoglobina de los conjugados de PEG:NESP con relación a una dosis equivalente de NESP sola.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra los efectos sobre la actividad del grado de sustitución y las variaciones del tamaño y conformación del polímero para conjugados de PEG:NESP.
10 Utilizando tanto químicas basadas en metoxi-PEG-aldehído como en metoxi-PEG-NHS, se sintetizaron una variedad de conjugados de PEG:NESP a partir de polímeros lineales de 5 kD, 20 kD y 30 kD así como de polímeros ramificados de 10 kD, 20 kD y 40 kD. A partir de estas reacciones, se aislaron cromatográficamente preparaciones de PEG:NESP monosustituidas y disustituidas y se las probó durante una eritropoyesis prolongada en el bioensayo con ratones.
15 La reacción con metoxi-PEG-aldehído (Shearwater Polymers) se realizó con una concentración de NESP de 4 mg/ml y un exceso molar de 25 veces de PEG en NaOAc 20 mM, pH 5,0, con la adición de cianoborohidruro de sodio hasta una concentración final de 20 mM. Se agitó la reacción durante la noche a 4°C, se diluyó 4 veces con Tris 20 mM, pH 7,2, y se ajustó el pH hasta un pH 7,4 con NaOH. Se cargó luego la mezcla de reacción diluida sobre una columna HP de Sefarosa Q HiTrap de 5 ml (Pharmacia). Se resolvieron las isoformas PEGiladas de NESP por medio
20 de elución con un gradiente de NaCl 0 - 150 mM en Tris 20 mM, pH 7,2.
La reacción con éster de metoxi-PEG-NHS (Shearwater Polymers) se realizó con una concentración de NESP de 4 mg/ml y un exceso molar de 5 - 7 veces de PEG en amortiguador de Bicina 50 mM, pH 8. Se agitó la reacción durante la noche a 4°C, se diluyó 4 veces con Tris 20 mM, pH 7,2, y se ajustó el pH hasta un pH 7,4 con NaOH. Se cargó luego la mezcla de reacción diluida sobre una columna HP de Sefarosa Q HiTrap de 5 ml (Pharmacia). Se
25 resolvieron las isoformas PEGiladas de NESP por medio de elución con un gradiente de NaCl 0 - 150 mM en Tris 20 mM, pH 7,2 (ver las Figuras 5-7).
Se emplearon estos esquemas de proceso para cada uno de los polímeros lineales de 5 kD, 20 kD y 30 kD así como los ésteres ramificados de PEG-NHS de 10 kD, 20 kD y 40 kD. Los diferentes conjugados están enlistados en la Tabla 1 a continuación:
TABLA 1
Polímero de PEG
Química de Conjugación Grado de Sustitución
Lineal de 5 kD Lineal de 20 kD Lineal de 20 kD Lineal de 30 kD Lineal de 30 kD
Éster de mPEG-NHS Éster de mPEG-NHS Éster de mPEG-NHS Éster de mPEG-NHS Éster de mPEG-NHS mono/di-PEG mono-PEG di-PEG mono-PEG di-PEG
Lineal de 5 kD Lineal de 5 kD Lineal de 20 kD Lineal de 30 kD Lineal de 30 kD
mPEG-aldehído mPEG-aldehído mPEG-aldehído mPEG-aldehído mPEG-aldehído mono-PEG di-PEG mono-PEG mono-PEG di-PEG
Ramificado de 10 kD Ramificado de 20 kD Ramificado de 40 kD
Éster ramificado de mPEG-NHS Éster ramificado de mPEG-NHS Éster ramificado de mPEG-NHS mono/di-PEG mono-PEG mono-PEG
Ramificado de 20 kD
mPEG-aldehído mono-PEG
imagen9
Ramificado de 40 kD
mPEG-aldehído mono-PEG
Lineal de 5 kD
mPEG-hidrazida alto (>7 PEG)
Lineal de 5 kD
mPEG-hidrazida bajo (1-5 PEG)
Lineal de 20 kD
mPEG-hidrazida alto (>7 PEG)
Lineal de 20 kD
mPEG-hidrazida medio (-4-7 PEG)
Lineal de 20 kD
mPEG-hidrazida bajo (1-5 PEG)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cada isoforma purificada fue probada entonces en un bioensayo in vivo en un múrido por una actividad eritropoyética prolongada medida por cambios en las determinaciones de reticulocitos y hemoglobina después de inyecciones únicas subcutáneas en bolo de 100 μg/kg en ratones BDF 1 hembra normales. Cada conjugado monosustituido de PEG:NESP de las series poliméricas lineal y ramificada mostraron una prolongación significativa y comparable del efecto eritropoyético (ver las Figuras 8 y 9). Los conjugados disustituidos de PEG:NESP de los polímeros PEG de 20 kD y 30 kD fueron considerablemente menos activos, pero inesperadamente, el conjugado disustituido de PEG:NESP de 5 kD demostró una actividad equivalente a la contraparte monosustituida. Todos los conjugados monosustituidos, ramificados de PEG:NESP demostraron actividad prolongada comparable a la de los conjugados análogos monosustituidos lineales de PEG:NESP.
Estos ejemplos demuestran por lo tanto la duración mejorada de la estimulación eritropoyética por una variedad de conjugados de PEG:NESP utilizando inyecciones en bolo de una sola dosis en modelos de ratón normal.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe la eficacia de tres conjugados de PEG:NESP: mono-PEG:NESP de 20 kD; la mezcla de poli-PEG:NESP de 5 kD; y mono-PEG:NESP de 30 kD, como se examinó con tres dosis diferentes con relación a una NESP de control, en un modelo de ratón anémico.
Para inducir una condición anémica, se trataron previamente los ratones con cisplatino a razón de 1 mg/kg/día durante 3 días, seguido por un período de descanso de 7 días. Después de 3 ciclos de diez días, se dosificaron los ratones con inyecciones únicas en bolo de 30 μg/kg, 10 μg/kg o 3 μg/kg de los conjugados de mono-PEG:NESP de 20 kD, de mono-PEG:NESP de 30 kD o el poli-PEG:NESP de 5 kD y se comparó con una NESP sola de control a razón de 30 μg/kg. Se monitorearon los niveles de reticulocito y de hemoglobina en función del tiempo y en respuesta a la dosis individual de cada fármaco (ver las Figuras 10 - 15).
Estos datos demuestran las ventajas inesperadas de una reducción 3 veces de la dosis e incrementos significativos en la vida media eritropoyética para los conjugados de PEG:NESP con relación a NESP sola, en que los resultados demuestran una dependencia clara de la dosis tanto por la magnitud como por la duración ya sea de la respuesta del reticulocito o de la hemoglobina a los conjugados de PEG:NESP. En algunos casos el conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD parece superar modestamente al conjugado de poli-PEG:NESP de 5 kD, que supera modestamente al conjugado de mono-PEG:NESP de 20 kD, sugiriendo que el conjugado de mono-PEG:NESP de 30 kD podría ser una configuración preferida.
Ejemplo 5
En este ejemplo, se evaluaron tres diferentes conjugados de PEG-NESP en un bioensayo con un ratón normal para comparar y contrastar su potencial eritropoyético y duración. Los tres compuestos analizados fueron: mono-PEG:NESP de 30 kD derivado por acilación con el éster de PEG-NHS de 30 kD, el mono-PEG:NESP de 20 kD derivado por alquilación reductiva con el PEG-aldehído de 20 kD y la mezcla de poli-PEG:NESP de 5 kD derivada por alquilación reductiva con el PEG-aldehído de 5 kD. Cada conjugado de PEG:NESP fue probado como una dosis subcutánea única en bolo a razón de 30 μg/kg, 10 μg/kg o 3 μg/kg. Se utilizó NESP no modificada como control a razón de 30 μg/kg en una inyección única en bolo. La respuesta eritropoyética y la duración fueron monitoreadas en función del recuento de reticulocitos o la concentración de hemoglobina (ver las Figuras 16 - 21) en función del tiempo. Estos datos muestran que todas las tres formas de PEG:NESP son capaces de inducir una fuerte respuesta eritropoyética con una reducción significativa e la dosis. Además, estos conjugados de PEG:NESP demuestran una eficacia prolongada con relación a la NESP no modificada.
Materiales y métodos
La presente NESP puede ser preparada de acuerdo con la Solicitud PCT No. US 94/09257 (WO-A-9505465).
Los conjugados preparados aquí fueron caracterizados también utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) como herramienta analítica. La columna SEC era una Tosohaas TSK 3000 SWx1 (5 micras - 7,8 mm X 30 cm) que utilizó NaHPO4 100 mM, etanol al 10%, NaCl 150 mM, pH 6,9, para eluir los productos. En la Figura 22 se describe un cromatograma representativo.
imagen10
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> AMGEN INC.
5 <120> NUEVAS COMPOSICIONES QUÍMICAMENTE MODIFICADAS DE PROTEÍNA QUE ESTIMULAN ERITROPOYETINA Y MÉTODOS
<130> A-682
<140> [Aún No Asignada]
<141> 2001-04-06 10 <160> 1
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 165
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 1
imagen5
imagen11

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una preparación de nueva proteína estimulante de eritropoyetina químicamente modificada (NESP), opcionalmente en un diluyente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde dicha NESP es modificada químicamente con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(N-vinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes, y en donde la preparación es al menos 90% conjugado de polímero:proteína, y a lo sumo 10% de proteína que no ha reaccionado.
  2. 2.
    Una preparación de la reivindicación 1 que es al menos 95% conjugado de polímero:proteína y a lo sumo 5% de proteína que no ha reaccionado.
  3. 3.
    Una preparación de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 donde dicha NESP es químicamente modificada con polietilén glicol.
  4. 4.
    Una preparación de la reivindicación 3 donde dicho polietilén glicol tiene un peso molecular de aproximadamente entre 2 kD y 100 kD.
  5. 5.
    Una preparación de la reivindicación 4 en donde dicho polietilén glicol tiene un peso molecular de aproximadamente entre 5 kD y 30 kD.
  6. 6.
    Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha preparación está compuesta de una población mixta de NESP mono-PEGilada y NESP poli-PEGilada.
  7. 7.
    Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha preparación está compuesta de al menos 95% de NESP mono-PEGilada en el N-terminal y a lo sumo 5% de NESP no PEGilada.
  8. 8.
    Una preparación de la reivindicación 1 en donde dicha NESP tiene la secuencia identificada en la SEQ. ID No. 1.
  9. 9.
    Una composición farmacéutica que comprende:
    (a)
    una preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
    (b)
    un diluyente, estabilizador, preservante, solubilizador, emulsificante, adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable.
  10. 10.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 9 en donde la preparación comprende al menos 95% del conjugado de polímero:proteína y a lo sumo 5% de NESP que no ha reaccionado.
  11. 11.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:
    (a)
    una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP únicamente en el N-terminal de la misma y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y
    (b)
    un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
  12. 12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:
    (a)
    una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP a través de aldehídos generados en dichas cadenas de carbohidrato de NESP; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y
    (b)
    un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
  13. 13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:
    (a)
    una preparación de NESP mono-PEGilada, consistiendo dicha NESP mono-PEGilada en una estructura funcional de polietilén glicol conectada con una estructura funcional de NESP utilizando química de metoxi-PEG-NHS; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y
    (b)
    un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 y que comprende:
    (a)
    una preparación de NESP PEGilada, comprendiendo dicha NESP PEGilada una población mixta de NESP mono-PEGilada y de NESP poli-PEGilada; y menos de 5% de moléculas de NESP no PEGiladas; y
    (b)
    un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable.
    imagen1
  15. 15.
    Una preparación de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en un método para el tratamiento de un trastorno hematopoyético que comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de dicha preparación.
  16. 16.
    Un proceso para elaborar la preparación de la reivindicación 1 que comprende las etapas de:
    (a) hacer reaccionar la NESP con un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n
    5 vinil pirrolidona), polietilén glicoles, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y polivinil alcoholes bajo condiciones mediante las cuales la NESP se une a uno o más grupos de PEG; y
    (b) obtener el(los) producto(s) de reacción.
  17. 17. El proceso de la reivindicación 16 en donde la etapa (a) comprende alquilación reductiva para conjugar un PEG10 aldehído con una amina primaria de la NESP.
  18. 18.
    El proceso de la reivindicación 16 en la etapa (a) comprende acilación de las aminas primarias de NESP usando el éster de NHS de metoxi-PEG.
  19. 19.
    El proceso de la reivindicación 16 en donde la etapa (a) comprende
    (i) la oxidación suave de NESP bajo condiciones seleccionadas para orientar el diol que pende de la penúltima 15 unidad de glicosilo del ácido siálico para oxidación hasta un aldehído;
    (ii) la reacción del glicoaldehído resultante con una metoxi-PEG-hidrazida para formar una hidrazona semi-estable entre el PEG y NESP; y
    (iii) la reducción de la hidrazona por medio de cianoborohidruro de sodio para producir un conjugado estable de PEG:NESP.
ES01928395T 2000-04-07 2001-04-06 Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos. Expired - Lifetime ES2365000T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US545335 2000-04-07
US09/545,335 US6586398B1 (en) 2000-04-07 2000-04-07 Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2365000T3 true ES2365000T3 (es) 2011-09-20

Family

ID=24175806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01928395T Expired - Lifetime ES2365000T3 (es) 2000-04-07 2001-04-06 Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos.

Country Status (11)

Country Link
US (3) US6586398B1 (es)
EP (1) EP1267942B1 (es)
JP (1) JP5334347B2 (es)
AR (1) AR030276A1 (es)
AT (1) ATE510555T1 (es)
AU (2) AU5525601A (es)
CA (1) CA2405716C (es)
ES (1) ES2365000T3 (es)
MX (1) MXPA02009896A (es)
TW (1) TWI315988B (es)
WO (1) WO2001076640A2 (es)

Families Citing this family (232)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU763719B2 (en) 1997-12-08 2003-07-31 Merck Patent Gmbh Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CA2328076C (en) * 1998-04-15 2009-10-06 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
CN1810832B (zh) 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CA2380331C (en) * 1999-08-09 2012-11-20 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2399832C (en) * 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
PT1311285E (pt) * 2000-05-15 2005-06-30 Hoffmann La Roche Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina
AU2001271729B2 (en) * 2000-06-29 2007-01-04 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
KR20090010127A (ko) * 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE60239454D1 (de) 2001-05-03 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
PT1454138E (pt) * 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
WO2003055526A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
CA2496317C (en) * 2002-09-11 2014-02-18 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
AU2003273413A1 (en) * 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
RU2366664C2 (ru) * 2002-12-17 2009-09-10 Мерк Патент Гмбх Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2519092C (en) 2003-03-14 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. Branched water-soluble polymers and their conjugates
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
CA2520875A1 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
DK2599502T3 (en) * 2003-04-11 2017-04-18 Antriabio Inc Process for Preparation of Site-Specific Protein Conjugates
ATE540055T1 (de) * 2003-05-09 2012-01-15 Biogenerix Ag Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glykosylierungsmutanten des menschlichen wachstumshormons
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US7622552B2 (en) * 2003-08-05 2009-11-24 Almac Sciences (Scotland) Limited Ligation method
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
US20080274948A1 (en) * 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
EA010650B1 (ru) * 2003-09-29 2008-10-30 Уоррен Фармасьютикалз, Инк. Защищающие ткань цитокины для лечения и профилактики сепсиса и образования спаек
EP1675871A2 (en) 2003-10-10 2006-07-05 Xencor Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1694351A2 (en) * 2003-12-03 2006-08-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated follicle stimulating hormone
WO2005058366A2 (en) * 2003-12-10 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates
DK1699915T3 (da) 2003-12-30 2010-09-13 Augustinus Bader Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering
BRPI0417916A (pt) * 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
CN101072789B (zh) 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
AR048918A1 (es) * 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP2336192A1 (en) 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
WO2006010057A2 (en) * 2004-07-08 2006-01-26 Amgen Inc. Therapeutic peptides
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
US7597884B2 (en) * 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
KR20070085227A (ko) * 2004-08-09 2007-08-27 앨리오스 바이오파마 인크. 합성 초글리코실화, 프로테아제 저항성 폴리펩티드 변이체,경구 제제 및 이를 이용한 방법
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
AU2005286763A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-30 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Variants and chemically-modified variants of phenylalanine ammonia-lyase
HUE026826T2 (en) 2004-10-29 2016-07-28 Ratiopharm Gmbh Modeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP1848461A2 (en) * 2005-02-16 2007-10-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
CN101137396A (zh) * 2005-03-11 2008-03-05 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 由无活性初始材料制备生物活性糖蛋白
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
JP2009514814A (ja) * 2005-10-21 2009-04-09 シナジェバ・バイオファーマ・コーポレイション グリコール化およびグリコシル化された家禽類由来の治療用たんぱく質
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
EP1969007B1 (en) 2005-12-20 2013-08-28 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods for producing a composition
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP1834963A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-19 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
JP2009532351A (ja) 2006-03-31 2009-09-10 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ペグ化第ｖｉｉｉ因子
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
JO3324B1 (ar) * 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
US7531341B1 (en) 2006-06-12 2009-05-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7534595B2 (en) * 2006-06-12 2009-05-19 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
ES2516694T3 (es) 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
JP5723528B2 (ja) * 2006-08-04 2015-05-27 プロロング ファーマシューティカルズ エルエルシー 修飾されたエリスロポエチン
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
PT2101821E (pt) 2006-12-15 2014-10-03 Baxter Int Fator conjugado viia-ácido (poli)siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo
PE20130588A1 (es) * 2007-02-02 2013-05-21 Amgen Inc Hepcidina, antagonistas de la hepcidina y metodos de uso
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
CL2008002054A1 (es) 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
US8067548B2 (en) * 2007-07-26 2011-11-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
US7560263B2 (en) * 2007-08-17 2009-07-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US8383114B2 (en) * 2007-09-27 2013-02-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
US20100316702A1 (en) * 2008-01-08 2010-12-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for regulating erythropoeitin expression and ameliorating anemia and stimulating erythropoiesis
US9175078B2 (en) 2008-01-25 2015-11-03 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
CN103694337B (zh) 2008-02-08 2016-03-02 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
WO2009108806A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
CN103381267A (zh) 2008-04-14 2013-11-06 哈洛齐梅公司 修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
ES2487846T3 (es) 2008-05-01 2014-08-25 Amgen, Inc. Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso
WO2010014225A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Biomarin Pharmaceutical Inc. Assays for detection of phenylalanine ammonia-lyase and antibodies to phenylalanine ammonia-lyase
CA2737026C (en) 2008-09-26 2019-12-24 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
WO2010056981A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Massachusetts General Hospital Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6
ES2724588T3 (es) 2008-12-09 2019-09-12 Halozyme Inc Polipéptidos de PH20 soluble extendida y usos de los mismos
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
EP2459224B1 (en) * 2009-07-27 2016-06-01 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CA2769244A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
ES2578478T3 (es) 2009-09-17 2016-07-27 Baxalta Incorporated Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
ES2690542T3 (es) 2010-02-04 2018-11-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Método para purificar variantes de fenilalanina amoníaco-liasa procariotas
ES2545411T5 (es) 2010-06-07 2024-04-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármaco
CA2806058C (en) 2010-07-20 2016-09-13 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of anti-hyaluronan agents and methods for ameliorating or preventing the side-effects
JP2014510045A (ja) 2011-02-08 2014-04-24 ハロザイム インコーポレイテッド ヒアルロナン分解酵素の組成物および脂質製剤ならびに良性前立腺肥大症の治療のためのその使用
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
KR101676543B1 (ko) 2011-06-17 2016-11-15 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 분해효소를 이용한 연속적인 피하 인슐린 주입 방법
WO2013040501A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
CN103930142B (zh) 2011-10-14 2016-12-14 安姆根有限公司 注射器和装配方法
CA2853358A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
DK2797622T3 (en) 2011-12-30 2017-01-16 Halozyme Inc PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
RS57449B1 (sr) 2012-04-04 2018-09-28 Halozyme Inc Kombinovana terapija sa hijaluronidazom i taksanom koji ciljno deluje na tumor
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
WO2014160363A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Baylor Research Institute Surface modification of porcine islets
DK2968503T3 (en) 2013-03-15 2018-12-03 Intrinsic Lifesciences Llc ANTI-HEPCIDIN ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
PL3060275T3 (pl) 2013-10-24 2019-12-31 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
KR101414897B1 (ko) 2013-11-29 2014-07-04 씨제이헬스케어 주식회사 다베포에틴 알파의 정제 방법
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN112237662B (zh) 2014-06-03 2022-10-21 安姆根有限公司 药物递送***和使用方法
PL3186281T3 (pl) 2014-08-28 2019-10-31 Halozyme Inc Terapia skojarzona enzymem rozkładającym hialuronian i inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej
NZ730186A (en) 2014-09-22 2020-04-24 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
NZ730563A (en) 2014-10-14 2019-05-31 Halozyme Inc Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
RU2664588C2 (ru) * 2015-11-05 2018-08-21 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP3429663B1 (en) 2016-03-15 2020-07-15 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3592403A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
CN110446499A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
KR102268647B1 (ko) 2017-06-12 2021-06-23 한국코러스 주식회사 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법
US11541183B2 (en) 2017-06-22 2023-01-03 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B1 (en) 2017-10-06 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with combination assembly and related assembly method
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
SG11202002772VA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection
IL273638B1 (en) 2017-11-16 2024-06-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
WO2022063082A1 (zh) * 2020-09-22 2022-03-31 美国杰科实验室有限公司 一种糖基化修饰的***及其应用
CN112110982B (zh) * 2020-09-24 2021-12-07 科兴生物制药股份有限公司 一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
NO934477L (no) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
ZA946122B (en) * 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
JP4410852B2 (ja) * 1996-08-02 2010-02-03 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 単一の共有結合ｎ末端水溶性ポリマーを有するポリペプチド
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
AU5525601A (en) 2001-10-23
TWI315988B (en) 2009-10-21
WO2001076640A3 (en) 2002-06-27
JP5334347B2 (ja) 2013-11-06
JP2003530361A (ja) 2003-10-14
US6586398B1 (en) 2003-07-01
WO2001076640A2 (en) 2001-10-18
MXPA02009896A (es) 2003-03-27
US7262166B2 (en) 2007-08-28
AR030276A1 (es) 2003-08-20
EP1267942B1 (en) 2011-05-25
EP1267942A2 (en) 2003-01-02
CA2405716C (en) 2008-09-30
ATE510555T1 (de) 2011-06-15
CA2405716A1 (en) 2001-10-18
US20030166566A1 (en) 2003-09-04
AU2001255256B2 (en) 2006-04-13
US20060264377A1 (en) 2006-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2365000T3 (es) Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos.
AU2001255256A1 (en) Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US7893019B2 (en) G-CSF site-specific mono-conjugates
ES2224197T3 (es) Polipeptidos monopegilados n-terminalmente y procedimiento para su preparacion.
RU2324494C2 (ru) Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях
EP1330260B1 (en) Use of il-1 inhibitors and tnf antagonists, partially in combination with recombinant erythropoietins, for the treatment of anemia
JP2989002B2 (ja) 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
KR20020007296A (ko) Ｇｃｓｆ 결합체
JP4782834B2 (ja) 顆粒球コロニー刺激因子（ｇ−ｃｓｆ）の変異型およびその化学的に抱合されたポリペプチド
JP2006503821A (ja) エリスロポエチンの使用
JP2011132248A (ja) インターフェロンβを用いる慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシーの治療
EP1234583A1 (en) PEG-conjugates of HGF-NK4
US20030053982A1 (en) N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP2006513990A5 (es)
TW201703793A (zh) 聚乙二醇化介白素-11之組合物及方法
KR100808089B1 (ko) 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 화학적 접합물