JPH07196925A - Ｐｅｇヒドラゾンおよびｐｅｇオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体 - Google Patents
Ｐｅｇヒドラゾンおよびｐｅｇオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体Info
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- JPH07196925A JPH07196925A JP5340709A JP34070993A JPH07196925A JP H07196925 A JPH07196925 A JP H07196925A JP 5340709 A JP5340709 A JP 5340709A JP 34070993 A JP34070993 A JP 34070993A JP H07196925 A JPH07196925 A JP H07196925A
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- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒドラジン、ヒドラジンカルボキシレート、
セミカルバジド、チオセミカルバジド、炭酸ジヒドラジ
ド、カルバジド、チオカルバジド、およびアリールヒド
ラジド誘導体ならびに水溶性有機ポリマー、例えば、ポ
リエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ
リオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断
片、デキストラン、多糖類、ポリアミノ酸、およびポリ
ビニルアルコールのオキシルアミン誘導体を包含する水
溶性ポリマー試薬、並びに、ポリペプチドをＰＥＧまた
は上記他の水溶性有機ポリマーで変性する方法。 【効果】 ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少
しないでポリペプチドを水溶性ポリマーの結合により変
性することができる。
セミカルバジド、チオセミカルバジド、炭酸ジヒドラジ
ド、カルバジド、チオカルバジド、およびアリールヒド
ラジド誘導体ならびに水溶性有機ポリマー、例えば、ポ
リエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ
リオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断
片、デキストラン、多糖類、ポリアミノ酸、およびポリ
ビニルアルコールのオキシルアミン誘導体を包含する水
溶性ポリマー試薬、並びに、ポリペプチドをＰＥＧまた
は上記他の水溶性有機ポリマーで変性する方法。 【効果】 ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少
しないでポリペプチドを水溶性ポリマーの結合により変
性することができる。
Description
【０００１】本発明は、タンパク質上のアルデヒド基と
ヒドラゾン結合を形成するように変性される水溶性ポリ
マー、例えば、モノメトキシポリ（エチレングリコー
ル）に関しそして、また、これらの水溶性ポリマーによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
ヒドラゾン結合を形成するように変性される水溶性ポリ
マー、例えば、モノメトキシポリ（エチレングリコー
ル）に関しそして、また、これらの水溶性ポリマーによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
【０００２】本発明は、オキシム結合を形成するように
変性されるこのような水溶性ポリマー、およびこれによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
変性されるこのような水溶性ポリマー、およびこれによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
【０００３】タンパク質および他の同様な有機分子は、
水溶性有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）への共有結合の接合により化学的に変性する
ことができる。このようなタンパク質接合体の生成は、
水溶性ポリマーの結合により望ましい性質がポリペプチ
ドに付与されるので、重要である。これらの望ましい性
質は、例えば、水溶液中の溶解度の増加、貯蔵の間の安
定性の増加、免疫原性の減少、酵素的分解に対する抵抗
の増加、より広範な種類の薬物投与系との適合性、およ
びｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加である。ＰＥＧまたは他
の水溶性ポリマーでポリペプチドを誘導化することによ
って生ずるこれらの性質は、ポリペプチドを身体に注射
する治療剤として使用するとき、あるいはポリペプチド
を検定において、通常免疫検定において、問題の化合物
の検出および／または定量のために使用するとき、こと
に重要である。
水溶性有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）への共有結合の接合により化学的に変性する
ことができる。このようなタンパク質接合体の生成は、
水溶性ポリマーの結合により望ましい性質がポリペプチ
ドに付与されるので、重要である。これらの望ましい性
質は、例えば、水溶液中の溶解度の増加、貯蔵の間の安
定性の増加、免疫原性の減少、酵素的分解に対する抵抗
の増加、より広範な種類の薬物投与系との適合性、およ
びｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加である。ＰＥＧまたは他
の水溶性ポリマーでポリペプチドを誘導化することによ
って生ずるこれらの性質は、ポリペプチドを身体に注射
する治療剤として使用するとき、あるいはポリペプチド
を検定において、通常免疫検定において、問題の化合物
の検出および／または定量のために使用するとき、こと
に重要である。
【０００４】糖タンパク質の炭水化物部分を通してタン
パク質にリポーター基、リガンドなどを結合することは
記載された［ウェーバー（Ｗｅｂｅｒ）、Ｐ．およびホ
フ（Ｈｏｆ）、Ｌ．（１９７５）バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．）６５、１２９８−１３０２；オ’シャンネッシイ
（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ）、Ｄ．Ｊ．、ドウバーセン
（Ｄｏｂｅｒｓｅｎ）、Ｍ．Ｊ．およびクアーレス（Ｑ
ｕａｒｌｅｓ）、Ｒ．Ｈ．（１９８４）イムノロジー・
レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）８、２７３−
２７７；オ’シャンネッシイ（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓ
ｙ）、Ｄ．Ｊ．およびクアーレス（Ｑｕａｒｌｅｓ）、
Ｒ．Ｈ．（１９８５）ジャーバル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）７、３４７−３５５；チュア（Ｃｈｕａ）、Ｍ．
−Ｍ．、ファン（Ｆａｎ）、Ｓ．−Ｔ．、およびカルシ
ュ（Ｋａｒｕｓｈ）、Ｆ．（１９８４）バイオヒミカ・
エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、８００、２９１−３００；
オ’シャンネッシイ（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ）、Ｄ．
Ｊ．およびウィルチェク（Ｗｉｌｃｈｅｋ）、Ｍ．（１
９９０）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１９１、１−８；コッペル
（Ｋｏｐｐｅｌ）、Ｇ．Ａ．（１９９０）バイオコンジ
ュゲイト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ Ｃ
ｈｅｍ．）１、１３−２３］。ある数の基、例えば、ビ
オチン、蛍光プローブ、抗ガン化合物、および固体の支
持体がこの方法において共有結合された。
パク質にリポーター基、リガンドなどを結合することは
記載された［ウェーバー（Ｗｅｂｅｒ）、Ｐ．およびホ
フ（Ｈｏｆ）、Ｌ．（１９７５）バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．）６５、１２９８−１３０２；オ’シャンネッシイ
（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ）、Ｄ．Ｊ．、ドウバーセン
（Ｄｏｂｅｒｓｅｎ）、Ｍ．Ｊ．およびクアーレス（Ｑ
ｕａｒｌｅｓ）、Ｒ．Ｈ．（１９８４）イムノロジー・
レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）８、２７３−
２７７；オ’シャンネッシイ（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓ
ｙ）、Ｄ．Ｊ．およびクアーレス（Ｑｕａｒｌｅｓ）、
Ｒ．Ｈ．（１９８５）ジャーバル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）７、３４７−３５５；チュア（Ｃｈｕａ）、Ｍ．
−Ｍ．、ファン（Ｆａｎ）、Ｓ．−Ｔ．、およびカルシ
ュ（Ｋａｒｕｓｈ）、Ｆ．（１９８４）バイオヒミカ・
エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、８００、２９１−３００；
オ’シャンネッシイ（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ）、Ｄ．
Ｊ．およびウィルチェク（Ｗｉｌｃｈｅｋ）、Ｍ．（１
９９０）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１９１、１−８；コッペル
（Ｋｏｐｐｅｌ）、Ｇ．Ａ．（１９９０）バイオコンジ
ュゲイト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ Ｃ
ｈｅｍ．）１、１３−２３］。ある数の基、例えば、ビ
オチン、蛍光プローブ、抗ガン化合物、および固体の支
持体がこの方法において共有結合された。
【０００５】米国特許第４，８４７，３２５号は、ＰＥ
Ｇ−アミン、ＰＥＧ−ヒドラジドまたはＰＥＧ−ヒドラ
ジンを合成しそしてそれを糖タンパク質に結合する可能
性を記載している。しかしながら、これらのＰＥＧ−誘
導体が合成されたこと、これらのＰＥＧ−誘導体が酸化
された糖タンパク質を変性することができること、およ
びこれらの推定上のＰＥＧ−タンパク質の生ずる生物学
的性質がなんでありうるかということについての実験の
証拠は与えられていない。
Ｇ−アミン、ＰＥＧ−ヒドラジドまたはＰＥＧ−ヒドラ
ジンを合成しそしてそれを糖タンパク質に結合する可能
性を記載している。しかしながら、これらのＰＥＧ−誘
導体が合成されたこと、これらのＰＥＧ−誘導体が酸化
された糖タンパク質を変性することができること、およ
びこれらの推定上のＰＥＧ−タンパク質の生ずる生物学
的性質がなんでありうるかということについての実験の
証拠は与えられていない。
【０００６】コウガン（Ｋｏｇａｎ）による刊行物、
Ｔ．Ｐ．、シンセティック・コミュニケーションズ（Ｓ
ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、
２２（１６）、２４１７−２４２４（１９９２）には、
モノメトキシポリ（エチレングリコール）−ヒドラジド
の合成が記載されている。
Ｔ．Ｐ．、シンセティック・コミュニケーションズ（Ｓ
ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、
２２（１６）、２４１７−２４２４（１９９２）には、
モノメトキシポリ（エチレングリコール）−ヒドラジド
の合成が記載されている。
【０００７】酵素のペルオキシダーゼはその炭水化物基
を通してＰＥＧで変性された［ウルチゴイティ（Ｕｒｒ
ｕｔｉｇｏｉｔｙ）、Ｍ．およびソウペ（Ｓｏｕｐｐ
ｅ）、Ｊ．（１９８９）バイオカタリシス（Ｂｉｏｃａ
ｔａｌｙｓｉｓ）２、１４５−１４９］。この変性にお
いて、ＰＥＧ−ジアミンを酸化されたペルオキシダーゼ
と反応させ、そして生ずるイミンをホウ水素化物で還元
して、ＰＥＧとタンパク質上の炭水化物基との間で安定
な結合を形成した。３分子のＰＥＧ−２０，０００をこ
の酵素に結合した。この方法においてＰＥＧ−ジアミン
を使用するときの起こり得る問題は、架橋剤として機能
するＰＥＧジアミンとタンパク質分子の間で起こる分子
間の架橋である。ＰＥＧ−ジアミンを使用する他の欠点
は、タンパク質に結合された各ＰＥＧ−ジアミンについ
て２つの利用可能なアルデヒド基が消費され、こうして
ＰＥＧに組み込みのための部位の潜在的数が低下するこ
とである。
を通してＰＥＧで変性された［ウルチゴイティ（Ｕｒｒ
ｕｔｉｇｏｉｔｙ）、Ｍ．およびソウペ（Ｓｏｕｐｐ
ｅ）、Ｊ．（１９８９）バイオカタリシス（Ｂｉｏｃａ
ｔａｌｙｓｉｓ）２、１４５−１４９］。この変性にお
いて、ＰＥＧ−ジアミンを酸化されたペルオキシダーゼ
と反応させ、そして生ずるイミンをホウ水素化物で還元
して、ＰＥＧとタンパク質上の炭水化物基との間で安定
な結合を形成した。３分子のＰＥＧ−２０，０００をこ
の酵素に結合した。この方法においてＰＥＧ−ジアミン
を使用するときの起こり得る問題は、架橋剤として機能
するＰＥＧジアミンとタンパク質分子の間で起こる分子
間の架橋である。ＰＥＧ−ジアミンを使用する他の欠点
は、タンパク質に結合された各ＰＥＧ−ジアミンについ
て２つの利用可能なアルデヒド基が消費され、こうして
ＰＥＧに組み込みのための部位の潜在的数が低下するこ
とである。
【０００８】ｍＰＥＧ誘導体を形成するヒドラゾンの外
に、また、１系列のオキシム形成ｍＰＥＧ誘導体が合成
される。オキシムはヒドロキシルアミンまたはオキシル
アミンの誘導体とアルデヒド基またはケトン基との反応
により形成される。ポリスチレン置換ベンゾフェノンオ
キシムは、固相ペプチド合成のための支持体として使用
された［デグラド（ＤｅＧｒａｄｏ）、Ｗ．Ｆ．および
カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、Ｅ．Ｔ．（１９８０）、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４５、１２９５−１３００］。この
例において、生長するペプチド鎖をエステル結合を介し
てオキシム基にカップリングする。置換されたオキシム
結合は非常に安定であり、そして非置換のアルドキシム
でさえ反応を生ずるためにシリカゲルの存在下に１００
℃において６０時間を必要とするベックマン転位に対し
てすぐれた安定性を示す［マーチ（Ｍａｒｃｈ）、Ｊ．
（１９８５）アドバンスド・オーガニック・ケミストリ
ー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、ニューヨーク−ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ｐ９
８７−９８９］。オキシム結合はモルホリノドキソルビ
シンを抗体にカップリングするために使用された［ムエ
ラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）、Ｂ．Ｍ．、ラシドロ（Ｗｒａ
ｓｉｄｌｏ）、Ｗ．Ａ．およびレイスフェルド（Ｒｅｉ
ｓｆｅｌｄ）、Ｒ．Ａ．（１９９０）バイオコンジュゲ
イト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ Ｃｈｅ
ｍ．）１、３２５−３３０］。この例において、モルホ
リノドキソルビシンのケトン基をアミノオキシ酢酸と反
応させた。新しくカップリングした遊離酸の基は活性化
され、そしてモルホリノドキソルビシンはモノクローナ
ル抗体上のリジンの遊離アミノ基に結合された。
に、また、１系列のオキシム形成ｍＰＥＧ誘導体が合成
される。オキシムはヒドロキシルアミンまたはオキシル
アミンの誘導体とアルデヒド基またはケトン基との反応
により形成される。ポリスチレン置換ベンゾフェノンオ
キシムは、固相ペプチド合成のための支持体として使用
された［デグラド（ＤｅＧｒａｄｏ）、Ｗ．Ｆ．および
カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、Ｅ．Ｔ．（１９８０）、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４５、１２９５−１３００］。この
例において、生長するペプチド鎖をエステル結合を介し
てオキシム基にカップリングする。置換されたオキシム
結合は非常に安定であり、そして非置換のアルドキシム
でさえ反応を生ずるためにシリカゲルの存在下に１００
℃において６０時間を必要とするベックマン転位に対し
てすぐれた安定性を示す［マーチ（Ｍａｒｃｈ）、Ｊ．
（１９８５）アドバンスド・オーガニック・ケミストリ
ー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、ニューヨーク−ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ｐ９
８７−９８９］。オキシム結合はモルホリノドキソルビ
シンを抗体にカップリングするために使用された［ムエ
ラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）、Ｂ．Ｍ．、ラシドロ（Ｗｒａ
ｓｉｄｌｏ）、Ｗ．Ａ．およびレイスフェルド（Ｒｅｉ
ｓｆｅｌｄ）、Ｒ．Ａ．（１９９０）バイオコンジュゲ
イト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ Ｃｈｅ
ｍ．）１、３２５−３３０］。この例において、モルホ
リノドキソルビシンのケトン基をアミノオキシ酢酸と反
応させた。新しくカップリングした遊離酸の基は活性化
され、そしてモルホリノドキソルビシンはモノクローナ
ル抗体上のリジンの遊離アミノ基に結合された。
【０００９】ある数のタンパク質はＰＥＧにより変性さ
れてきている。概観については、イナダ、Ｙ．、ヨシモ
ト、Ｔ．、マツシマ、Ａ．およびサイトウ、Ｙ．（１９
８６）トレンズ・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）４：６８−７３を参照のこ
と。この分野において、下に列挙するように、ある数の
特許が発行されそして出願が公開された：米国特許第
４，１７９，３３７号；米国特許第４，６０９，５４６
号；米国特許第４，２６１，９７３号；米国特許第４，
０５５，６３５号；米国特許第３，９６０，８３０号；
米国特許第４，４１５，６６５号；米国特許第４，４１
２，９８９号；米国特許第４，００２，５３１号；米国
特許第４，４１４，１４７号；米国特許第３，７８８，
９４８号；米国特許第４，７３２，８６３号；米国特許
第４，７４５，１８０号；欧州特許（ＥＰ）第１５２，
８４７号；欧州特許（ＥＰ）第９８，１００号、１９８
４年１月１１日公開。上の特許および特許公開明細書
は、また、他の水溶性ポリマーのタンパク質変性剤の使
用を記載しており、これらは次のものを包含するが、こ
れらに限定されない：ポリプロピレングリコール（ＰＰ
Ｇ）、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ヘパ
リン、ヘパリン断片、デキストラン、多糖類、ポリアミ
ノ酸、例えば、プロリン、ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）および他の水溶性有機ポリマー。
れてきている。概観については、イナダ、Ｙ．、ヨシモ
ト、Ｔ．、マツシマ、Ａ．およびサイトウ、Ｙ．（１９
８６）トレンズ・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）４：６８−７３を参照のこ
と。この分野において、下に列挙するように、ある数の
特許が発行されそして出願が公開された：米国特許第
４，１７９，３３７号；米国特許第４，６０９，５４６
号；米国特許第４，２６１，９７３号；米国特許第４，
０５５，６３５号；米国特許第３，９６０，８３０号；
米国特許第４，４１５，６６５号；米国特許第４，４１
２，９８９号；米国特許第４，００２，５３１号；米国
特許第４，４１４，１４７号；米国特許第３，７８８，
９４８号；米国特許第４，７３２，８６３号；米国特許
第４，７４５，１８０号；欧州特許（ＥＰ）第１５２，
８４７号；欧州特許（ＥＰ）第９８，１００号、１９８
４年１月１１日公開。上の特許および特許公開明細書
は、また、他の水溶性ポリマーのタンパク質変性剤の使
用を記載しており、これらは次のものを包含するが、こ
れらに限定されない：ポリプロピレングリコール（ＰＰ
Ｇ）、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ヘパ
リン、ヘパリン断片、デキストラン、多糖類、ポリアミ
ノ酸、例えば、プロリン、ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）および他の水溶性有機ポリマー。
【００１０】最近の特許公開明細書（ＷＯ９０／１２８
７４）は、ＥＰＯが遺伝子操作により導入されたシステ
イン残基を含有するｍＰＥＧ−ＥＰＯの製造を記載して
いる。次いで、システイン特異的ｍＰＥＧ試薬を遺伝子
操作された遊離スルフヒドリル基に共有結合する。ただ
１つのｍＰＥＧ分子をＥＰＯの中に組み込むことがで
き、そしてこの組み込みの証拠は提示されなかった。ま
た、生ずるｍＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的または生物物理
的性質は記載されなかった。
７４）は、ＥＰＯが遺伝子操作により導入されたシステ
イン残基を含有するｍＰＥＧ−ＥＰＯの製造を記載して
いる。次いで、システイン特異的ｍＰＥＧ試薬を遺伝子
操作された遊離スルフヒドリル基に共有結合する。ただ
１つのｍＰＥＧ分子をＥＰＯの中に組み込むことがで
き、そしてこの組み込みの証拠は提示されなかった。ま
た、生ずるｍＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的または生物物理
的性質は記載されなかった。
【００１１】エリトロポイエチンは赤血球の生産を調節
する糖タンパク質である。エリトロポイエチンは、赤血
球の前駆体上のリセプターに結合することによって、そ
の生物学的性質を発揮する［クランツ（Ｋｒａｎｔ
ｚ）、Ｓ．Ｂ．、血液（Ｂｌｏｏｄ）、７７：４１９−
４３４（１９９１）］。エリトロポイエチンのそのリセ
プターへの結合は、赤血球の前駆体を成熟赤血球に増殖
および分化させる。他の成長因子、例えば、インターロ
イキン３または顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子は、また、コファクター、例えば、鉄、葉酸および
ビタミンＢ１２と一緒に、赤血球生成に関係する。現
在、エリトロポイエチンは、透析および透析前の両者の
患者における慢性腎不全の貧血およびＨＩＶ感染の貧血
における使用およびジドブジンの治療と組み合わせた使
用のために承認されている。エリトロポイエチンの現在
の研究されている使用として、ガンの貧血、外科前の血
液の自己提供、および周縁外科のアジュバントの治療が
ある。
する糖タンパク質である。エリトロポイエチンは、赤血
球の前駆体上のリセプターに結合することによって、そ
の生物学的性質を発揮する［クランツ（Ｋｒａｎｔ
ｚ）、Ｓ．Ｂ．、血液（Ｂｌｏｏｄ）、７７：４１９−
４３４（１９９１）］。エリトロポイエチンのそのリセ
プターへの結合は、赤血球の前駆体を成熟赤血球に増殖
および分化させる。他の成長因子、例えば、インターロ
イキン３または顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子は、また、コファクター、例えば、鉄、葉酸および
ビタミンＢ１２と一緒に、赤血球生成に関係する。現
在、エリトロポイエチンは、透析および透析前の両者の
患者における慢性腎不全の貧血およびＨＩＶ感染の貧血
における使用およびジドブジンの治療と組み合わせた使
用のために承認されている。エリトロポイエチンの現在
の研究されている使用として、ガンの貧血、外科前の血
液の自己提供、および周縁外科のアジュバントの治療が
ある。
【００１２】エリトロポイエチンは、２つのジサルファ
イド架橋を含む１６５アミノ酸から成る。エリトロポイ
エチンはタンパク質の主鎖から発する４つの炭水化物鎖
を有する。炭水化物基のうちの３つはＮ結合であり、そ
してアスパラギン２４、３８および８３に結合してい
る。また、セリン１２６に固定された１つのＯ結合炭水
化物基が存在する。炭水化物鎖は枝分かれしており、そ
してフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、および
シアル酸から成る。エリトロポイエチンの炭水化物の組
成は、ササキ、Ｈ．、ボスナー（Ｂｏｓｈｎｅｒ）、
Ｂ．、デル（Ｄｅｌｌ）、Ａ．およびフクダ、Ｍ．（１
９８７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１２０５９
−１２０７６により決定されたように、不均質である。
炭水化物基はタンパク質の重量の約４０％である。エリ
トロポイエチン上の炭水化物基は、エリトロポイエチン
の溶解度を増加しそしてその血清半減期を延長すると信
じられる。
イド架橋を含む１６５アミノ酸から成る。エリトロポイ
エチンはタンパク質の主鎖から発する４つの炭水化物鎖
を有する。炭水化物基のうちの３つはＮ結合であり、そ
してアスパラギン２４、３８および８３に結合してい
る。また、セリン１２６に固定された１つのＯ結合炭水
化物基が存在する。炭水化物鎖は枝分かれしており、そ
してフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、および
シアル酸から成る。エリトロポイエチンの炭水化物の組
成は、ササキ、Ｈ．、ボスナー（Ｂｏｓｈｎｅｒ）、
Ｂ．、デル（Ｄｅｌｌ）、Ａ．およびフクダ、Ｍ．（１
９８７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６２、１２０５９
−１２０７６により決定されたように、不均質である。
炭水化物基はタンパク質の重量の約４０％である。エリ
トロポイエチン上の炭水化物基は、エリトロポイエチン
の溶解度を増加しそしてその血清半減期を延長すると信
じられる。
【００１３】ポリペプチドが水溶性ポリマーに共有結合
で接合することができること、およびポリペプチドを変
性することができる程度に関して、いくつかの制限が存
在する。異なる水溶性ポリマー試薬は、問題のポリペプ
チド中のアミノ酸残基へのカップリングを提供する官能
基に関して変化する。特定の官能基は、水溶性ポリマー
を特定のアミノ酸残基にカップリングさせる。
で接合することができること、およびポリペプチドを変
性することができる程度に関して、いくつかの制限が存
在する。異なる水溶性ポリマー試薬は、問題のポリペプ
チド中のアミノ酸残基へのカップリングを提供する官能
基に関して変化する。特定の官能基は、水溶性ポリマー
を特定のアミノ酸残基にカップリングさせる。
【００１４】異なる性質を有するｍＰＥＧ試薬、例え
ば、スクシニミジルカーボネート−ＰＥＧ、スクシニミ
ジルスクシネート−ＰＥＧ、イミデート−ＰＥＧ、塩化
シアヌル酸−ＰＥＧ、カルボニルジイミダゾール−ＰＥ
Ｇ、およびＰＥＧ−フェニルカーボネート誘導体（４−
ニトロフェノールおよび２，４，５−トリクロロフェノ
ール）を使用するリジン残基の変性は記載された。この
出願は、異なるリジン変性ＰＥＧ誘導体に類似する、酸
化された炭水化物基に対して異なる特異性をもつ、新規
な炭水化物ＰＥＧ変性剤を含む。
ば、スクシニミジルカーボネート−ＰＥＧ、スクシニミ
ジルスクシネート−ＰＥＧ、イミデート−ＰＥＧ、塩化
シアヌル酸−ＰＥＧ、カルボニルジイミダゾール−ＰＥ
Ｇ、およびＰＥＧ−フェニルカーボネート誘導体（４−
ニトロフェノールおよび２，４，５−トリクロロフェノ
ール）を使用するリジン残基の変性は記載された。この
出願は、異なるリジン変性ＰＥＧ誘導体に類似する、酸
化された炭水化物基に対して異なる特異性をもつ、新規
な炭水化物ＰＥＧ変性剤を含む。
【００１５】糖タンパク質、すなわち、１または２以上
の炭水化物分子に共有結合で接合したポリペプチドは、
ポリペプチド上に炭水化物分子が存在するために、ポリ
ペプチドの水溶性ポリマーの誘導化の異なる方法を提供
する追加の機会を与える。水溶性ポリマーの試薬は、糖
タンパク質のアミノ酸ポリペプチド主鎖、すなわち、ポ
リペプチド上に存在する種々の官能基と反対に、糖タン
パク質の炭水化物部分に直接カップリングすることがで
きる。電荷の置換、立体障害、活性部位におけるアミノ
酸残基が異なるために、そして水溶性ポリマー変性糖タ
ンパク質のポリペプチド成分の構造および機能を混乱さ
せうる他の問題のために、水溶性試薬をポリペプチド主
鎖のアミノ酸にカップリングするよりむしろ糖タンパク
質の炭水化物部分にカップリングすることは有利である
ことがある。
の炭水化物分子に共有結合で接合したポリペプチドは、
ポリペプチド上に炭水化物分子が存在するために、ポリ
ペプチドの水溶性ポリマーの誘導化の異なる方法を提供
する追加の機会を与える。水溶性ポリマーの試薬は、糖
タンパク質のアミノ酸ポリペプチド主鎖、すなわち、ポ
リペプチド上に存在する種々の官能基と反対に、糖タン
パク質の炭水化物部分に直接カップリングすることがで
きる。電荷の置換、立体障害、活性部位におけるアミノ
酸残基が異なるために、そして水溶性ポリマー変性糖タ
ンパク質のポリペプチド成分の構造および機能を混乱さ
せうる他の問題のために、水溶性試薬をポリペプチド主
鎖のアミノ酸にカップリングするよりむしろ糖タンパク
質の炭水化物部分にカップリングすることは有利である
ことがある。
【００１６】糖タンパク質の炭水化物部分へカップリン
グすることができる水溶性ポリマーの試薬を提供するこ
とによって、他のアミノ酸残基におけるカップリングを
通して悪影響を受けるであろうタンパク質の生物学的活
性に実質的に悪影響を及ぼさないで、水溶性ポリマーを
タンパク質に共有結合で接合することが可能である。本
発明は、ポリペプチド上のアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ基、例えば、ケトン、ラクトール、活
性化されたカルボン酸または活性化されたカルボン酸誘
導体とヒドラゾン結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体、すなわち、水溶性ポリマーの試薬でポリペプチ
ドを変性する方法および組成物を提供する。ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）および他の水溶性ポリマーの新
規なヒドラジド、セミカルバジド、アリールヒドラジ
ド、チオセミカルバジド、ヒドラジドカルボキシレー
ト、炭酸ジヒドラジド、カルバジド、およびチオカルバ
ジドの誘導体が提供される。１種または２種以上の水溶
性ポリマーの試薬を個々のポリペプチドまたは同様な有
機分子にカップリングさせて、ポリペプチドを水溶性ポ
リマーに結合するヒドラゾンを形成することができる。
グすることができる水溶性ポリマーの試薬を提供するこ
とによって、他のアミノ酸残基におけるカップリングを
通して悪影響を受けるであろうタンパク質の生物学的活
性に実質的に悪影響を及ぼさないで、水溶性ポリマーを
タンパク質に共有結合で接合することが可能である。本
発明は、ポリペプチド上のアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ基、例えば、ケトン、ラクトール、活
性化されたカルボン酸または活性化されたカルボン酸誘
導体とヒドラゾン結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体、すなわち、水溶性ポリマーの試薬でポリペプチ
ドを変性する方法および組成物を提供する。ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）および他の水溶性ポリマーの新
規なヒドラジド、セミカルバジド、アリールヒドラジ
ド、チオセミカルバジド、ヒドラジドカルボキシレー
ト、炭酸ジヒドラジド、カルバジド、およびチオカルバ
ジドの誘導体が提供される。１種または２種以上の水溶
性ポリマーの試薬を個々のポリペプチドまたは同様な有
機分子にカップリングさせて、ポリペプチドを水溶性ポ
リマーに結合するヒドラゾンを形成することができる。
【００１７】本発明の他の面は、ヒドラゾン結合の水溶
性ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパ
ク質、とくに糖タンパク質を提供することである。
性ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパ
ク質、とくに糖タンパク質を提供することである。
【００１８】また、前述のアルデヒドまたは同様に反応
性の基とオキシム結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体でポリペプチドを変性する方法および組成物を開
示する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の
水溶性ポリマーの、下に列挙するするような、新規なオ
キシルアミン誘導体を提供し、そしてここで１種または
２種以上の水溶性ポリマーの試薬を個々のポリペプチド
または同様な有機分子にカップリングさせて、ポリペプ
チドを水溶性ポリマーに結合するオキシムを形成するこ
とができる。
性の基とオキシム結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体でポリペプチドを変性する方法および組成物を開
示する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の
水溶性ポリマーの、下に列挙するするような、新規なオ
キシルアミン誘導体を提供し、そしてここで１種または
２種以上の水溶性ポリマーの試薬を個々のポリペプチド
または同様な有機分子にカップリングさせて、ポリペプ
チドを水溶性ポリマーに結合するオキシムを形成するこ
とができる。
【００１９】本発明の他の面は、オキシルアミン水溶性
ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパク
質、とくに糖タンパク質を提供することである。
ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパク
質、とくに糖タンパク質を提供することである。
【００２０】本発明の水溶性ポリマーの試薬は、ポリエ
チレングリコールのホモポリマー、ポリプロピレングリ
コールのホモポリマー、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマー
およびコポリマーは置換されていないか、あるいは１端
においてアルキル基で置換されている）、ポリオキシエ
チル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポ
リビニルエチルエーテル、およびα，β−ポリ［（２−
ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］および
他の水溶性有機ポリマーの誘導体のヒドラゾン結合およ
びオキシム結合を形成する誘導体を包含する。ポリエチ
レングリコールの水溶性ポリマーは、末端ヒドロキシル
基の１つがＲ基で変性されたポリエチレングリコール、
すなわち、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキル、アリー
ル、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、ベン
ゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキル、
シクロアルキルアリールなどであることができる）を包
含する。列挙した水溶性ポリマーはＰにより表されるこ
とにの単なる例示である。特別に記載した水溶性ポリマ
ーの種々の誘導体がまた考えられるが、ただし誘導体は
水溶性である。より好ましくは、水溶性ポリマーＰはポ
リエチレングリコールおよびその誘導体から成る群より
選択され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ル（ｍＰＥＧ）はとくに好ましい（タンパク質の間の架
橋を回避するために）。
チレングリコールのホモポリマー、ポリプロピレングリ
コールのホモポリマー、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマー
およびコポリマーは置換されていないか、あるいは１端
においてアルキル基で置換されている）、ポリオキシエ
チル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポ
リビニルエチルエーテル、およびα，β−ポリ［（２−
ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］および
他の水溶性有機ポリマーの誘導体のヒドラゾン結合およ
びオキシム結合を形成する誘導体を包含する。ポリエチ
レングリコールの水溶性ポリマーは、末端ヒドロキシル
基の１つがＲ基で変性されたポリエチレングリコール、
すなわち、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキル、アリー
ル、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、ベン
ゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキル、
シクロアルキルアリールなどであることができる）を包
含する。列挙した水溶性ポリマーはＰにより表されるこ
とにの単なる例示である。特別に記載した水溶性ポリマ
ーの種々の誘導体がまた考えられるが、ただし誘導体は
水溶性である。より好ましくは、水溶性ポリマーＰはポ
リエチレングリコールおよびその誘導体から成る群より
選択され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ル（ｍＰＥＧ）はとくに好ましい（タンパク質の間の架
橋を回避するために）。
【００２１】本発明の水溶性ポリマーによる水溶性ポリ
マーの誘導化のための問題のポリペプチドは、ホルモ
ン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵素、ワ
クチンの抗原、および抗体を包含する。エリトロポイエ
チン（ＥＰＯ）、ことに組み換えエリトロポイエチン、
およびその前駆体、中間体および模倣物の水溶性ポリマ
ーの誘導化はとくに重要である。
マーの誘導化のための問題のポリペプチドは、ホルモ
ン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵素、ワ
クチンの抗原、および抗体を包含する。エリトロポイエ
チン（ＥＰＯ）、ことに組み換えエリトロポイエチン、
およびその前駆体、中間体および模倣物の水溶性ポリマ
ーの誘導化はとくに重要である。
【００２２】本発明の他の面は、部分的に酸化され、引
き続いて（ｉ）モノメトキシポリ（エチレングリコー
ル）（ｍＰＥＧ）のセミカルバジド誘導体と組み合わせ
て、エリトロポイエチンの１分子当たり１７〜２５ｍＰ
ＥＧ分子を含有するｍＰＥＧ誘導化エリトロポイエチン
分子（ヒドラゾン結合を通して接合された）を生成し、
（ｉｉ）ｍＰＥＧのカルボキシレートヒドラジド誘導体
と組み合わせて、約２２〜３２ｍＰＥＧ／ＥＰＯを含有
する誘導化ＥＰＯ（ヒドラゾン結合を通して接合され
た）を生成し、そして（ｉｉｉ）ｍＰＥＧのオキシルア
ミン誘導体と組み合わせて、約３〜３６ｍＰＥＧ／ＥＰ
Ｏを含有する誘導化ＥＰＯ（オキシム結合を通して接合
された）を生成する（すべてはゲル濾過の保持時間によ
り測定した）エリトロポイエチンを提供することであ
る。
き続いて（ｉ）モノメトキシポリ（エチレングリコー
ル）（ｍＰＥＧ）のセミカルバジド誘導体と組み合わせ
て、エリトロポイエチンの１分子当たり１７〜２５ｍＰ
ＥＧ分子を含有するｍＰＥＧ誘導化エリトロポイエチン
分子（ヒドラゾン結合を通して接合された）を生成し、
（ｉｉ）ｍＰＥＧのカルボキシレートヒドラジド誘導体
と組み合わせて、約２２〜３２ｍＰＥＧ／ＥＰＯを含有
する誘導化ＥＰＯ（ヒドラゾン結合を通して接合され
た）を生成し、そして（ｉｉｉ）ｍＰＥＧのオキシルア
ミン誘導体と組み合わせて、約３〜３６ｍＰＥＧ／ＥＰ
Ｏを含有する誘導化ＥＰＯ（オキシム結合を通して接合
された）を生成する（すべてはゲル濾過の保持時間によ
り測定した）エリトロポイエチンを提供することであ
る。
【００２３】本発明の他の面は、本発明の水溶性ポリマ
ーの試薬との共有結合の接合のためにポリペプチドを活
性化する方法を提供することである。
ーの試薬との共有結合の接合のためにポリペプチドを活
性化する方法を提供することである。
【００２４】定義 用語「水溶性ポリマーの試薬」は、ここにおいて使用す
るとき、ポリペプチドへの水溶性ポリマーの共有結合の
接合を提供する官能基を含有するように変性された水溶
性ポリマーを意味する。
るとき、ポリペプチドへの水溶性ポリマーの共有結合の
接合を提供する官能基を含有するように変性された水溶
性ポリマーを意味する。
【００２５】用語「ポリペプチド」は、ここにおいて使
用するとき、より大きいポリペプチド（しばしばタンパ
ク質と呼ばれる）、小さいペプチド、および糖タンパク
質を包含する種々の大きさのポリペプチドを意味する。
用するとき、より大きいポリペプチド（しばしばタンパ
ク質と呼ばれる）、小さいペプチド、および糖タンパク
質を包含する種々の大きさのポリペプチドを意味する。
【００２６】用語「酸化活性化可能な基」は、ここにお
いて使用するとき、官能基を酸化条件に暴露した後、本
発明の化合物のヒドラジド部分またはオキシルアミン部
分と反応する官能基、ポリオール、ラクトール、アミ
ン、フェノール、カルボン酸またはカルボン酸の誘導体
を意味する。糖タンパク質であるポリペプチド上に存在
する酸化活性化可能な基は、糖タンパク質の炭水化物部
分上に存在するか、あるいは糖タンパク質のアミノ酸残
基部分上に存在することができる。酸化活性化可能な基
の例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒド
ロキシルであるが、これに限定されない。ヒドロキシル
基は、使用する誘導体に依存して、ヒドラジド反応性ア
ルデヒドまたはオキシルアミン反応性アルデヒドに酸化
することができる。
いて使用するとき、官能基を酸化条件に暴露した後、本
発明の化合物のヒドラジド部分またはオキシルアミン部
分と反応する官能基、ポリオール、ラクトール、アミ
ン、フェノール、カルボン酸またはカルボン酸の誘導体
を意味する。糖タンパク質であるポリペプチド上に存在
する酸化活性化可能な基は、糖タンパク質の炭水化物部
分上に存在するか、あるいは糖タンパク質のアミノ酸残
基部分上に存在することができる。酸化活性化可能な基
の例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒド
ロキシルであるが、これに限定されない。ヒドロキシル
基は、使用する誘導体に依存して、ヒドラジド反応性ア
ルデヒドまたはオキシルアミン反応性アルデヒドに酸化
することができる。
【００２７】用語「部分的酸化」は、ここにおいて使用
するとき、酸化されるポリペプチドの生物学的活性を完
全には壊滅させない程度に進行する酸化のプロセスを意
味する。
するとき、酸化されるポリペプチドの生物学的活性を完
全には壊滅させない程度に進行する酸化のプロセスを意
味する。
【００２８】用語「接合のために活性化された」は、こ
こにおいてポリペプチドに関して使用するとき、ポリペ
プチドの部分的酸化を意味し、ここで酸化の程度は少な
くとも１つの酸化活性化可能な基を本発明の水溶性ポリ
マーの試薬の１つのヒドラジド部分またはオキシルアミ
ン部分（または同様な官能基の部分）と化学的に反応す
ることができる官能基に変換するために十分である。
こにおいてポリペプチドに関して使用するとき、ポリペ
プチドの部分的酸化を意味し、ここで酸化の程度は少な
くとも１つの酸化活性化可能な基を本発明の水溶性ポリ
マーの試薬の１つのヒドラジド部分またはオキシルアミ
ン部分（または同様な官能基の部分）と化学的に反応す
ることができる官能基に変換するために十分である。
【００２９】用語「生物学的活性」は、ここにおいて使
用するとき、次のものを包含する化合物の生物学的に関
係する性質を意味する：酵素的活性、リセプター（抗体
を包含する）に結合する能力、リガンドに結合する能
力、免疫応答を誘発する能力、治療学的活性など。
用するとき、次のものを包含する化合物の生物学的に関
係する性質を意味する：酵素的活性、リセプター（抗体
を包含する）に結合する能力、リガンドに結合する能
力、免疫応答を誘発する能力、治療学的活性など。
【００３０】用語「抗体」は、ここにおいて使用すると
き、天然の免疫グロブリンの配列をもつポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体の両者、合成の抗体誘導
体などを包含する；抗体は種々の標識、蛍光、放射性、
酵素、ビオチン／アビジンなどに接合するように修飾す
ることができる。合成の抗体は、突然変異させかつ変更
された結合特異性について選抜された天然の免疫グロブ
リンの配列、典型的には１本鎖の、遺伝的に修飾された
細菌により生産された、種々の免疫グロブリン遺伝子誘
導化ポリペプチド、修飾された一定領域を含有するよう
に修飾された抗体などを包含する；このような抗体の形
成の原理に基づく合成の抗体誘導体の概観は、ウィンタ
ー（Ｗｉｎｔｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４９：２９３
−２９９（１９９１）に記載されている。
き、天然の免疫グロブリンの配列をもつポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体の両者、合成の抗体誘導
体などを包含する；抗体は種々の標識、蛍光、放射性、
酵素、ビオチン／アビジンなどに接合するように修飾す
ることができる。合成の抗体は、突然変異させかつ変更
された結合特異性について選抜された天然の免疫グロブ
リンの配列、典型的には１本鎖の、遺伝的に修飾された
細菌により生産された、種々の免疫グロブリン遺伝子誘
導化ポリペプチド、修飾された一定領域を含有するよう
に修飾された抗体などを包含する；このような抗体の形
成の原理に基づく合成の抗体誘導体の概観は、ウィンタ
ー（Ｗｉｎｔｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４９：２９３
−２９９（１９９１）に記載されている。
【００３１】本発明は、水溶性ポリマーに結合するよう
にポリペプチドを変性するとき使用するための，水溶性
ポリマー、例えば、ＰＥＧ、すなわち、ポリエチレング
リコールのヒドラジンまたはオキシルアミンの誘導体で
ある、新規なポリペプチド変性試薬を提供する。本発明
の水溶性ポリマーの試薬は、種々の水溶性ポリマーを問
題のポリペプチドに共有結合するために使用できる。本
発明の水溶性ポリマーのヒドラジンおよびオキシルアミ
ン誘導体，すなわち、水溶性ポリマーの試薬は、問題の
タンパク質上に存在するアルデヒド基または他の適当な
官能基との反応を通してタンパク質に共有結合すること
ができる。アルデヒド基は、ポリペプチド上のヒドロキ
シル基（または他の酸化活性化可能な基）を部分的に酸
化することによって導入できる。酸化活性化可能な基の
例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒドロ
キシル基を包含する。適当な酸化、すなわち、部分的酸
化の方法は、問題のポリペプチドを酸化剤、例えば、過
ヨウ素酸塩または当業者に知られている他の酸化剤で処
理するか、あるいは問題のタンパク質の部分上で酸化反
応を触媒することができる酵素、例えば、ガラクトース
オキシダーゼを添加することを包含する。本発明の他の
面は、試薬の分子、すなわち、本発明の水溶性ポリマー
のヒドラジンまたはオキシルアミン誘導体により、１種
または２種以上の水溶性ポリペプチドに共有結合するよ
うに、変性されたポリペプチドを提供することである。
にポリペプチドを変性するとき使用するための，水溶性
ポリマー、例えば、ＰＥＧ、すなわち、ポリエチレング
リコールのヒドラジンまたはオキシルアミンの誘導体で
ある、新規なポリペプチド変性試薬を提供する。本発明
の水溶性ポリマーの試薬は、種々の水溶性ポリマーを問
題のポリペプチドに共有結合するために使用できる。本
発明の水溶性ポリマーのヒドラジンおよびオキシルアミ
ン誘導体，すなわち、水溶性ポリマーの試薬は、問題の
タンパク質上に存在するアルデヒド基または他の適当な
官能基との反応を通してタンパク質に共有結合すること
ができる。アルデヒド基は、ポリペプチド上のヒドロキ
シル基（または他の酸化活性化可能な基）を部分的に酸
化することによって導入できる。酸化活性化可能な基の
例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒドロ
キシル基を包含する。適当な酸化、すなわち、部分的酸
化の方法は、問題のポリペプチドを酸化剤、例えば、過
ヨウ素酸塩または当業者に知られている他の酸化剤で処
理するか、あるいは問題のタンパク質の部分上で酸化反
応を触媒することができる酵素、例えば、ガラクトース
オキシダーゼを添加することを包含する。本発明の他の
面は、試薬の分子、すなわち、本発明の水溶性ポリマー
のヒドラジンまたはオキシルアミン誘導体により、１種
または２種以上の水溶性ポリペプチドに共有結合するよ
うに、変性されたポリペプチドを提供することである。
【００３２】水溶性ポリマーをポリペプチドにカップリ
ングするために有用な化合物の好ましい式は次の通りで
ある：
ングするために有用な化合物の好ましい式は次の通りで
ある：
【００３３】
【化２１】ヒドラジン誘導体 （Ｉ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 ヒドラジン誘導体； （ＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 ヒドラジンカルボキシレート誘導体； （ＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 セミカルバジド誘導体； （ＩＶ） Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮＨ2 チオセミカルバジド誘導体； （Ｖ） Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨＮＨＣＯ−ＮＨＮ
Ｈ2 炭酸ジヒドラジド誘導体； （ＶＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ2 カルバジド誘導体； （ＶＩＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＳＮＨＮＨ2 チオカルバジド誘導体； （ＶＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2 アリールヒドラジド誘導体； （ＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−Ｎ
ＨＮＨ2 ヒドラジド誘導体；オキシルアミン誘導体 （ＸＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ
ＮＨ2； （ＸＸＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＳ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸＩＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2； （ＸＸＩＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ2ＯＮＨ2； （ＸＸＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ
2−ＯＮＨ2； （ＸＸＶＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−
ＣＨ2−ＯＮＨ2； および （ＸＸＶＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＣＨ2−
ＯＮＨ2。
Ｈ2 炭酸ジヒドラジド誘導体； （ＶＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ2 カルバジド誘導体； （ＶＩＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＳＮＨＮＨ2 チオカルバジド誘導体； （ＶＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2 アリールヒドラジド誘導体； （ＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−Ｎ
ＨＮＨ2 ヒドラジド誘導体；オキシルアミン誘導体 （ＸＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ
ＮＨ2； （ＸＸＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＳ−ＯＮ
Ｈ2； （ＸＸＩＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2； （ＸＸＩＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ2ＯＮＨ2； （ＸＸＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ
2−ＯＮＨ2； （ＸＸＶＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−
ＣＨ2−ＯＮＨ2； および （ＸＸＶＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＣＨ2−
ＯＮＨ2。
【００３４】Ｐは上の式において水溶性有機ポリマーを
表す。問題の水溶性有機ポリマーはポリマーの主鎖に結
合したヒドロキシルを有し、そして既知の水溶性ポリマ
ーから選択することができ、これらの水溶性ポリマー次
のものを包含するが、これらに限定されない：（ａ）デ
キストランおよびデキストラン誘導体、例えば、硫酸デ
キストラン、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、およびカル
ボキシメチルデキストリン、（ｂ）セルロースおよびセ
ルロース誘導体、例えば、メチルセルロースおよびカル
ボキシメチルセルロース、（ｃ）澱粉およびデキストリ
ン、および澱粉の誘導体およびヒドロイラクテス（ｈｙ
ｄｒｏｙｌａｃｔｅｓ）、（ｄ）ポリアルキレングリコ
ールおよびその誘導体、例えば、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールの
ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコ
ールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコ
ポリマーは置換されていないか、あるいは１端において
アルキル基で置換されている）、（ｅ）ヘパリンおよび
ヘパリンの断片、（ｆ）ポリビニルアルコールおよびポ
リビニルエチルエーテル、（ｇ）ポリビニルピロリド
ン、（ｈ）α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−
ＤＬ−アスパルトアミド］、および（ｉ）ポリオキシエ
チル化ポリオール。好ましくは、水溶性ポリマーＰは、
デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリン
およびデキストリン誘導体、より好ましくはポリエチレ
ングリコールおよびその誘導体から選択される。ポリエ
チレングリコールの水溶性ポリマーは、末端のヒドロキ
シルの１つがＲ基で変性されたポリエチレングリコー
ル、すなわち、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキル、ア
リール、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、
ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキ
ル、シクロアルキルアリールなどであることができる）
を包含する。列挙した水溶性ポリマーは、Ｐにより表さ
れる水溶性ポリマーの単なる例示である。特別に記載し
た水溶性ポリマーの種々の誘導体が、また、考えられる
が、ただし誘導体は水溶性である。より好ましくは、水
溶性ポリマーＰはポリエチレングリコールおよびその誘
導体から成る群より選択され、ポリエチレングリコール
のモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）はとくに好ましい
（タンパク質の間の架橋を回避するために）。本発明の
水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプチドは
薬物として使用するとき、ポリマーＰは無毒であるべき
である。
表す。問題の水溶性有機ポリマーはポリマーの主鎖に結
合したヒドロキシルを有し、そして既知の水溶性ポリマ
ーから選択することができ、これらの水溶性ポリマー次
のものを包含するが、これらに限定されない：（ａ）デ
キストランおよびデキストラン誘導体、例えば、硫酸デ
キストラン、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、およびカル
ボキシメチルデキストリン、（ｂ）セルロースおよびセ
ルロース誘導体、例えば、メチルセルロースおよびカル
ボキシメチルセルロース、（ｃ）澱粉およびデキストリ
ン、および澱粉の誘導体およびヒドロイラクテス（ｈｙ
ｄｒｏｙｌａｃｔｅｓ）、（ｄ）ポリアルキレングリコ
ールおよびその誘導体、例えば、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールの
ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコ
ールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコ
ポリマーは置換されていないか、あるいは１端において
アルキル基で置換されている）、（ｅ）ヘパリンおよび
ヘパリンの断片、（ｆ）ポリビニルアルコールおよびポ
リビニルエチルエーテル、（ｇ）ポリビニルピロリド
ン、（ｈ）α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−
ＤＬ−アスパルトアミド］、および（ｉ）ポリオキシエ
チル化ポリオール。好ましくは、水溶性ポリマーＰは、
デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリン
およびデキストリン誘導体、より好ましくはポリエチレ
ングリコールおよびその誘導体から選択される。ポリエ
チレングリコールの水溶性ポリマーは、末端のヒドロキ
シルの１つがＲ基で変性されたポリエチレングリコー
ル、すなわち、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキル、ア
リール、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、
ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキ
ル、シクロアルキルアリールなどであることができる）
を包含する。列挙した水溶性ポリマーは、Ｐにより表さ
れる水溶性ポリマーの単なる例示である。特別に記載し
た水溶性ポリマーの種々の誘導体が、また、考えられる
が、ただし誘導体は水溶性である。より好ましくは、水
溶性ポリマーＰはポリエチレングリコールおよびその誘
導体から成る群より選択され、ポリエチレングリコール
のモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）はとくに好ましい
（タンパク質の間の架橋を回避するために）。本発明の
水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプチドは
薬物として使用するとき、ポリマーＰは無毒であるべき
である。
【００３５】式Ｉ〜ＩＸの化合物は、一般に、次の式で
表される：
表される：
【００３６】
【化２２】 式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｑは−ＮＨＮＨ2および
−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2から成る群より選択され、そして
Ｙは−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、
−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨ
ＮＨ−から成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリ
マーである（化合物Ｉ〜ＩＸにおけるように）。
−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2から成る群より選択され、そして
Ｙは−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、
−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨ
ＮＨ−から成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリ
マーである（化合物Ｉ〜ＩＸにおけるように）。
【００３７】式ＸＩＸ〜ＸＸＶＩＩの化合物は、一般
に、次の式で表される：
に、次の式で表される：
【００３８】
【化２３】Ｐ−Ｙ−Ｘ−Ｑ 式中、ＸはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＣＨ2またはＣＨＯＨであ
り、Ｑは−ＯＮＨ2−および−ＣＨ2−ＯＮＨ2−から成
る群より選択され、そしてＹは−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−
Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ−、−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−および−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ−から
成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリマーである
（化合物ＸＩＸ〜ＸＸＶＩＩにおけるように）。
り、Ｑは−ＯＮＨ2−および−ＣＨ2−ＯＮＨ2−から成
る群より選択され、そしてＹは−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−
Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ−、−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−および−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ−から
成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリマーである
（化合物ＸＩＸ〜ＸＸＶＩＩにおけるように）。
【００３９】式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、Ｖ
ＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの分子に加えて、本発明は式
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ
およびＩＸの分子との反応により変性されたポリペプチ
ドを包含する。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、
ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの水溶性ポリマーの試薬に
より変性されたポリペプチドは、それぞれ、式Ｘ、Ｘ
Ｉ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩ
ＩおよびＸＶＩＩＩによりを表すことができる：
ＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの分子に加えて、本発明は式
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ
およびＩＸの分子との反応により変性されたポリペプチ
ドを包含する。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、
ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの水溶性ポリマーの試薬に
より変性されたポリペプチドは、それぞれ、式Ｘ、Ｘ
Ｉ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩ
ＩおよびＸＶＩＩＩによりを表すことができる：
【００４０】
【化２４】ヒドラジド変性ポリペプチド （Ｘ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ、 （ＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n−
Ｚ、 （ＸＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n
−Ｚ、 （ＸＩＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n
−Ｚ、 （ＸＩＶ） [Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨ−ＮＨＮＨＣＯ−
ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 （ＸＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ、 （ＸＶＩ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＳＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ、 （ＸＶＩＩ）［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ、および （ＸＶＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−
ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 式中、Ｐは前述したような水溶性ポリマーであり、Ｚは
前述したようなポリペプチドであり、そしてｎは１〜ｘ
の範囲の数を表し、ここでｘはポリペプチドＺの中に存
在する酸化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリ
マーの試薬とＺとの間で形成されたヒドラゾン結合中の
Ｃは、もとからＺ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬で
はない。
−］n−Ｚ、 （ＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n−
Ｚ、 （ＸＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n
−Ｚ、 （ＸＩＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n
−Ｚ、 （ＸＩＶ） [Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨ−ＮＨＮＨＣＯ−
ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 （ＸＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ、 （ＸＶＩ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＳＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ、 （ＸＶＩＩ）［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ、および （ＸＶＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−
ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 式中、Ｐは前述したような水溶性ポリマーであり、Ｚは
前述したようなポリペプチドであり、そしてｎは１〜ｘ
の範囲の数を表し、ここでｘはポリペプチドＺの中に存
在する酸化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリ
マーの試薬とＺとの間で形成されたヒドラゾン結合中の
Ｃは、もとからＺ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬で
はない。
【００４１】式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸ
ＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩ
の分子に加えて、本発明はまた式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸ
Ｉ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶ
ＩおよびＸＸＶＩＩとの反応により変性されたポリペプ
チドを包含する。式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、
ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶ
ＩＩの水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプ
チドは、それぞれ、式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸ
Ｘ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩ
Ｖ、ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩによりを表すことができ
る。
ＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩ
の分子に加えて、本発明はまた式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸ
Ｉ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶ
ＩおよびＸＸＶＩＩとの反応により変性されたポリペプ
チドを包含する。式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、
ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶ
ＩＩの水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプ
チドは、それぞれ、式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸ
Ｘ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩ
Ｖ、ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩによりを表すことができ
る。
【００４２】
【化２５】オキシルアミン変性ポリペプチド （ＸＸＶＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮ
＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＩＸ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−
ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ; （ＸＸＸＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＳ
−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ; （ＸＸＸＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ； （ＸＸＸＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸＩＶ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−
ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸＶ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)
−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ；および （ＸＸＸＶＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＣＨ2
− ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 式中、Ｐは前述したような水溶性ポリマーであり、Ｚは
前述したようなポリペプチドであり、そしてｎは範囲１
〜Ｘの数であり、Ｘはポリペプチドの中に存在するの酸
化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリマーの試
薬とＺとの間で形成されたオキシム結合中の炭素原子
は、もとからＺ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬では
ない。
＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＩＸ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−
ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ; （ＸＸＸＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＳ
−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ; （ＸＸＸＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ； （ＸＸＸＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸＩＶ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−
ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ； （ＸＸＸＶ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)
−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ；および （ＸＸＸＶＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＣＨ2
− ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ、 式中、Ｐは前述したような水溶性ポリマーであり、Ｚは
前述したようなポリペプチドであり、そしてｎは範囲１
〜Ｘの数であり、Ｘはポリペプチドの中に存在するの酸
化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリマーの試
薬とＺとの間で形成されたオキシム結合中の炭素原子
は、もとからＺ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬では
ない。
【００４３】ポリペプチドはポリペプチド分子当たりｘ
までの水溶性ポリマーカップリングにより変性すること
ができるが、所定のポリペプチドをｘより少ない水溶性
ポリマー分子で変性することが望ましいことがある。ポ
リペプチドを最大数の水溶性ポリマー、すなわち、ｘ水
溶性ポリマー／ポリペプチド分子で誘導化することは望
ましくない。なぜなら、あるポリマーについて、ポリペ
プチドの分子当たりの水溶性ポリマーの数を増加する
と、変性しないポリペプチドに比較して、生物学的活性
が減少することがあるからである。例えば、水溶性ポリ
マー変性ＥＰＯで得られたいくつかの結果について、図
２、４、５、９、１０および１１を参照のこと。
までの水溶性ポリマーカップリングにより変性すること
ができるが、所定のポリペプチドをｘより少ない水溶性
ポリマー分子で変性することが望ましいことがある。ポ
リペプチドを最大数の水溶性ポリマー、すなわち、ｘ水
溶性ポリマー／ポリペプチド分子で誘導化することは望
ましくない。なぜなら、あるポリマーについて、ポリペ
プチドの分子当たりの水溶性ポリマーの数を増加する
と、変性しないポリペプチドに比較して、生物学的活性
が減少することがあるからである。例えば、水溶性ポリ
マー変性ＥＰＯで得られたいくつかの結果について、図
２、４、５、９、１０および１１を参照のこと。
【００４４】式Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、
ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩのヒドラゾン
結合化合物および式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、
ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、Ｘ
ＸＸＶおよびＸＸＸＶＩのオキシム結合化合物における
ように、糖タンパク質分子に結合した水溶性ポリマー分
子の数を測定する異なる方法は、異なる結果を与えるこ
とがある。この出願の目的のために、ポリペプチドを所
定の数の水溶性ポリマー分子／タンパク質分子により誘
導化したと言うとき、与えた水溶性ポリマーの数はゲル
濾過クロマトグラフィーの保持時間により測定した実験
的に決定した数値である。
ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩのヒドラゾン
結合化合物および式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、
ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、Ｘ
ＸＸＶおよびＸＸＸＶＩのオキシム結合化合物における
ように、糖タンパク質分子に結合した水溶性ポリマー分
子の数を測定する異なる方法は、異なる結果を与えるこ
とがある。この出願の目的のために、ポリペプチドを所
定の数の水溶性ポリマー分子／タンパク質分子により誘
導化したと言うとき、与えた水溶性ポリマーの数はゲル
濾過クロマトグラフィーの保持時間により測定した実験
的に決定した数値である。
【００４５】式Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、
ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩの化合物の合
成は、ヒドラゾン結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのヒドラゾン結
合が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の
混合物を生ずることがある。同様に、式ＸＸＶＩＩＩ、
ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩ
Ｉ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩの化合物の
合成は、オキシム結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのオキシム結合
が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の混
合物を生ずることがある。ポリマーＰは変化する量の多
数の同一単位からなるので、Ｐの分子量はかなり変化す
ることがあることが分かるであろう。さらに、Ｐが所定
の分子量を有すると言うとき、その分子量は近似値のみ
であり、分子の中に存在するサブユニットの数に関し
て、互いに異なる分子Ｐの集団の平均分子量を反映する
ことがある。一般に、Ｐは約２００〜２００，０００、
好ましくは７００〜３０，０００、より好ましくは２，
０００〜１２，０００の範囲の分子量を有するであろ
う。Ｐについて適当な分子量は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、
ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの分子お
よび式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、Ｘ
ＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶおよび
ＸＸＸＶＩの分子をポリペプチドにカップリングすると
き、変性すべき特定のポリペプチドおよび選択した特定
の水溶性ポリマーに従い変化するであろう。個々のポリ
ペプチド分子を、１種または２種以上の異なる水溶性ポ
リマーにより、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、
ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ（ヒドラゾン）の化合物、
または式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩ
Ｉ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩ（オ
キシム）、またはヒドラゾンおよびオキシムの任意の組
み合わせの異なる態様との反応により誘導化することが
できる。
ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩの化合物の合
成は、ヒドラゾン結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのヒドラゾン結
合が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の
混合物を生ずることがある。同様に、式ＸＸＶＩＩＩ、
ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩ
Ｉ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩの化合物の
合成は、オキシム結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのオキシム結合
が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の混
合物を生ずることがある。ポリマーＰは変化する量の多
数の同一単位からなるので、Ｐの分子量はかなり変化す
ることがあることが分かるであろう。さらに、Ｐが所定
の分子量を有すると言うとき、その分子量は近似値のみ
であり、分子の中に存在するサブユニットの数に関し
て、互いに異なる分子Ｐの集団の平均分子量を反映する
ことがある。一般に、Ｐは約２００〜２００，０００、
好ましくは７００〜３０，０００、より好ましくは２，
０００〜１２，０００の範囲の分子量を有するであろ
う。Ｐについて適当な分子量は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、
ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの分子お
よび式ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、Ｘ
ＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶおよび
ＸＸＸＶＩの分子をポリペプチドにカップリングすると
き、変性すべき特定のポリペプチドおよび選択した特定
の水溶性ポリマーに従い変化するであろう。個々のポリ
ペプチド分子を、１種または２種以上の異なる水溶性ポ
リマーにより、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、
ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ（ヒドラゾン）の化合物、
または式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩ
Ｉ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩ（オ
キシム）、またはヒドラゾンおよびオキシムの任意の組
み合わせの異なる態様との反応により誘導化することが
できる。
【００４６】本発明の利点は、ポリペプチドの生物学的
活性を実質的に減少しないで、あるいは従来知られてい
る化学的カップリング法および化合物により同様な数の
同一の水溶性ポリマー／ポリペプチド分子の結合により
減少される生物学的活性の減少を低くして、ポリペプチ
ドを水溶性ポリマーの結合により変性することができる
ということである。ＥＰＯの生物学的活性の面は、赤血
球の形成の刺激を包含する。ＥＰＯの生物学的活性は、
クランツ（Ｋｒａｎｔｚ）、Ｓ．Ｂ．血液（Ｂｌｏｏ
ｄ）、７７：４１９−４３４（１９９１）に詳細に説明
されている。
活性を実質的に減少しないで、あるいは従来知られてい
る化学的カップリング法および化合物により同様な数の
同一の水溶性ポリマー／ポリペプチド分子の結合により
減少される生物学的活性の減少を低くして、ポリペプチ
ドを水溶性ポリマーの結合により変性することができる
ということである。ＥＰＯの生物学的活性の面は、赤血
球の形成の刺激を包含する。ＥＰＯの生物学的活性は、
クランツ（Ｋｒａｎｔｚ）、Ｓ．Ｂ．血液（Ｂｌｏｏ
ｄ）、７７：４１９−４３４（１９９１）に詳細に説明
されている。
【００４７】本発明の他の利点は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの化
合物または式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩ
ＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩの
化合物により変性されたポリペプチドが、リジンの変性
のために頻繁に使用されている（本発明の以前におい
て）ｍＰＥＧの活性エステルを使用して水溶性ポリマー
をポリペプチドに接合することによって同一ポリペプチ
ドを同一程度に変性するときより、より大きい程度の生
物学的活性を保持することができるということである。
こうして、本発明は、水溶性ポリマーの共有結合の接合
に関連する利点を有すると同時に変性に関連する生物学
的活性の損失を最小にした変性されたポリペプチドを提
供する。結局、水溶性ポリマーによりいっそう高度に誘
導化することができ、こうしてそうでなければより高い
程度の誘導化に関連する利点を有するポリペプチドを製
造することができ、そしてこれらのポリペプチドは従来
の方法を使用して少ない程度に水溶性ポリマーにより誘
導化されたポリペプチドと同一レベルか、あるいはそれ
より高いレベルの生物学的活性を有する。
Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの化
合物または式ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩ
ＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩの
化合物により変性されたポリペプチドが、リジンの変性
のために頻繁に使用されている（本発明の以前におい
て）ｍＰＥＧの活性エステルを使用して水溶性ポリマー
をポリペプチドに接合することによって同一ポリペプチ
ドを同一程度に変性するときより、より大きい程度の生
物学的活性を保持することができるということである。
こうして、本発明は、水溶性ポリマーの共有結合の接合
に関連する利点を有すると同時に変性に関連する生物学
的活性の損失を最小にした変性されたポリペプチドを提
供する。結局、水溶性ポリマーによりいっそう高度に誘
導化することができ、こうしてそうでなければより高い
程度の誘導化に関連する利点を有するポリペプチドを製
造することができ、そしてこれらのポリペプチドは従来
の方法を使用して少ない程度に水溶性ポリマーにより誘
導化されたポリペプチドと同一レベルか、あるいはそれ
より高いレベルの生物学的活性を有する。
【００４８】タンパク質へＰＥＧをカップリングするた
めのＰＥＧ−アミンの代わりにＰＥＧのヒドラゾン形成
誘導体（および他の水溶性ポリマー）を使用するとき得
られる他の利点は、ヒドラジドまたはオキシルアミン
（または同様な化合物）のアルデヒドへのカップリング
が、それぞれ、ヒドラゾンまたはオキシムを生ずるとい
うことであるが、アミンを介するカップリングはイミン
を生成し、これはヒドラゾンまたはオキシムより安定性
に劣り、そして還元して安定な誘導体を生成することが
必要である。こうして、ヒドラゾン形成化合物の代わり
にアミンを使用するとき、余分の工程を必要とする。
めのＰＥＧ−アミンの代わりにＰＥＧのヒドラゾン形成
誘導体（および他の水溶性ポリマー）を使用するとき得
られる他の利点は、ヒドラジドまたはオキシルアミン
（または同様な化合物）のアルデヒドへのカップリング
が、それぞれ、ヒドラゾンまたはオキシムを生ずるとい
うことであるが、アミンを介するカップリングはイミン
を生成し、これはヒドラゾンまたはオキシムより安定性
に劣り、そして還元して安定な誘導体を生成することが
必要である。こうして、ヒドラゾン形成化合物の代わり
にアミンを使用するとき、余分の工程を必要とする。
【００４９】本発明の他の利点は、他の水溶性ポリマー
の誘導体を使用するときより高いレベルの水溶性ポリマ
ーを糖タンパク質に結合することができるということで
ある。セミカルバジド（式ＩＩＩ）、チオセミカルバジ
ド（式ＩＶ）および炭酸ジヒドラジド（式Ｖ）誘導体
は、本発明の匹敵するヒドラジド誘導体より高い反応性
をもつので、とくに重要である。ここに記載するセミカ
ルバジド、チオセミカルバジドおよびカルボキシレート
ヒドラジドを使用するＥＰＯの誘導化を包含する反応
は、ＥＰＯの各分子について約３１〜３４までのｍＰＥ
Ｇ分子の付加を生じたが、ＥＰＯの対応するヒドラジド
誘導体を使用する同様な反応はＥＰＯの各分子について
約６〜１２分子のＥＰＯの付加を生じた。炭酸ジヒドラ
ジドおよびヒドラジドカルボキシレート誘導体とＥＰＯ
との間の反応は、ＥＰＯの各分子について２２までのｍ
ＰＥＧ分子の付加を生じた。ＥＰＯの各分子について約
２０ｍＰＥＧ分子をｍＰＥＧのヒドラジド誘導体が組み
込むようにするために、非常に強い酸化条件、例えば、
５０ミリモルの過ヨウ素酸塩、室温において６０分のイ
ンキュベーションを必要とした。主題のｍＰＥＧセミカ
ルバジドおよびチオセミカルバジド誘導体は、いっそう
温和な酸化条件、例えば、１０ミリモルの過ヨウ素酸
塩、０℃において５〜１５分間、の下に、同様な程度に
ＰＥＧで変性されたＥＰＯを生成するために使用するこ
とができた。強い酸化条件は多数のポリペプチドの構造
および生物学的性質悪影響を及ぼすことがあり、こうし
てＰＥＧセミカルバジド、炭酸ジヒドラジド、ヒドラジ
ドカルボキシレートおよびチオセミカルバジド誘導体
は、ポリペプチドをＰＥＧ（または他の水溶性ポリマ
ー）で変性するためにとくに適当な化合物であることが
ある。
の誘導体を使用するときより高いレベルの水溶性ポリマ
ーを糖タンパク質に結合することができるということで
ある。セミカルバジド（式ＩＩＩ）、チオセミカルバジ
ド（式ＩＶ）および炭酸ジヒドラジド（式Ｖ）誘導体
は、本発明の匹敵するヒドラジド誘導体より高い反応性
をもつので、とくに重要である。ここに記載するセミカ
ルバジド、チオセミカルバジドおよびカルボキシレート
ヒドラジドを使用するＥＰＯの誘導化を包含する反応
は、ＥＰＯの各分子について約３１〜３４までのｍＰＥ
Ｇ分子の付加を生じたが、ＥＰＯの対応するヒドラジド
誘導体を使用する同様な反応はＥＰＯの各分子について
約６〜１２分子のＥＰＯの付加を生じた。炭酸ジヒドラ
ジドおよびヒドラジドカルボキシレート誘導体とＥＰＯ
との間の反応は、ＥＰＯの各分子について２２までのｍ
ＰＥＧ分子の付加を生じた。ＥＰＯの各分子について約
２０ｍＰＥＧ分子をｍＰＥＧのヒドラジド誘導体が組み
込むようにするために、非常に強い酸化条件、例えば、
５０ミリモルの過ヨウ素酸塩、室温において６０分のイ
ンキュベーションを必要とした。主題のｍＰＥＧセミカ
ルバジドおよびチオセミカルバジド誘導体は、いっそう
温和な酸化条件、例えば、１０ミリモルの過ヨウ素酸
塩、０℃において５〜１５分間、の下に、同様な程度に
ＰＥＧで変性されたＥＰＯを生成するために使用するこ
とができた。強い酸化条件は多数のポリペプチドの構造
および生物学的性質悪影響を及ぼすことがあり、こうし
てＰＥＧセミカルバジド、炭酸ジヒドラジド、ヒドラジ
ドカルボキシレートおよびチオセミカルバジド誘導体
は、ポリペプチドをＰＥＧ（または他の水溶性ポリマ
ー）で変性するためにとくに適当な化合物であることが
ある。
【００５０】ｍＰＥＧの新規な系列のオキシルアミン誘
導体を合成し、そしてＥＰＯの酸化された炭水化物基と
反応させた。ｍＰＥＧ−オキシルアミンのあるものは、
酸化された炭水化物に対して高い反応性を示した。ま
た、より低い数のｍＰＥＧをＥＰＯの中に導入すること
ができ、そしてこれらは、セミカルバジドおよびカルボ
キシレートヒドラジド（ヒドラゾン形成）ｍＰＥＧ誘導
体を使用するとき見られるような、高いｉｎ ｖｉｖｏ
活性をなおあたえることができた。このより低い数のｍ
ＰＥＧの組み込みは、より短くかつより温和な酸化条件
を使用できるということにおいて有利である。また、よ
り少ない量のｍＰＥＧ誘導体を変性反応において使用で
きる。
導体を合成し、そしてＥＰＯの酸化された炭水化物基と
反応させた。ｍＰＥＧ−オキシルアミンのあるものは、
酸化された炭水化物に対して高い反応性を示した。ま
た、より低い数のｍＰＥＧをＥＰＯの中に導入すること
ができ、そしてこれらは、セミカルバジドおよびカルボ
キシレートヒドラジド（ヒドラゾン形成）ｍＰＥＧ誘導
体を使用するとき見られるような、高いｉｎ ｖｉｖｏ
活性をなおあたえることができた。このより低い数のｍ
ＰＥＧの組み込みは、より短くかつより温和な酸化条件
を使用できるということにおいて有利である。また、よ
り少ない量のｍＰＥＧ誘導体を変性反応において使用で
きる。
【００５１】同様に、式ＸＸＩ、式ＸＸＩＶおよび式Ｘ
ＸＩＩＩの化合物を使用するとき、式ＸＩＸオキシルア
ミン誘導体に比較して、とくに高いレベルの水溶性ポリ
マーが糖タンパク質に結合される。ここに記載する式Ｘ
ＸＩおよび式ＸＸＩＶを使用するＥＰＯの誘導化を包含
する反応は、それぞれ、ＥＰＯの各分子について１８〜
１９までのｍＰＥＧ／ＥＰＯおよび３１ｍＰＥＧ分子の
付加を生じたが、ＥＰＯの対応する式ＸＸＩＩおよびＸ
ＩＸオキシルアミン誘導体を使用する同様な反応はＥＰ
Ｏの各分子について約３〜４分子のｍＰＥＧの付加を生
じた。多分より重要なことには、生ずるオキシルアミン
誘導化ＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活性は、ＥＰＯへの水
溶性ポリマーのいっそう適度なレベルの結合においてさ
え、驚くべきほどに高い（下の説明および図１７を参
照）。これに関して、式ＸＸＩＩの１２のｍＰＥＧ単離
した分画の生物学的活性はとくに重要である（図１６お
よび１７を参照）。
ＸＩＩＩの化合物を使用するとき、式ＸＩＸオキシルア
ミン誘導体に比較して、とくに高いレベルの水溶性ポリ
マーが糖タンパク質に結合される。ここに記載する式Ｘ
ＸＩおよび式ＸＸＩＶを使用するＥＰＯの誘導化を包含
する反応は、それぞれ、ＥＰＯの各分子について１８〜
１９までのｍＰＥＧ／ＥＰＯおよび３１ｍＰＥＧ分子の
付加を生じたが、ＥＰＯの対応する式ＸＸＩＩおよびＸ
ＩＸオキシルアミン誘導体を使用する同様な反応はＥＰ
Ｏの各分子について約３〜４分子のｍＰＥＧの付加を生
じた。多分より重要なことには、生ずるオキシルアミン
誘導化ＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活性は、ＥＰＯへの水
溶性ポリマーのいっそう適度なレベルの結合においてさ
え、驚くべきほどに高い（下の説明および図１７を参
照）。これに関して、式ＸＸＩＩの１２のｍＰＥＧ単離
した分画の生物学的活性はとくに重要である（図１６お
よび１７を参照）。
【００５２】酸化された炭水化物基へのｍＰＥＧのカッ
プリングを経て高い活性をもつ長く作用するｍＰＥＧ−
ＥＰＯを発生する可能性は、選択したｍＰＥＧ誘導体に
依存する。あるｍＰＥＧ炭水化物変性誘導体は、最適量
のｍＰＥＧをＥＰＯ上に結合するために十分な程度に反
応性ではない。あるｍＰＥＧ誘導体は、生ずる結合の安
定性のために、ＥＰＯ上への大きい量の組み込みを必要
とする。最適量のｍＰＥＧの組み込みは、セミカルバジ
ド誘導体について約１７〜２５、より好ましくは約２２
であり、そしてカルボキシレートヒドラジドについて約
２２〜３２、より好ましくは約３１である。ｍＰＥＧ−
オキシルアミンの反応性は約３〜３６ｍＰＥＧ／ＥＰＯ
である。
プリングを経て高い活性をもつ長く作用するｍＰＥＧ−
ＥＰＯを発生する可能性は、選択したｍＰＥＧ誘導体に
依存する。あるｍＰＥＧ炭水化物変性誘導体は、最適量
のｍＰＥＧをＥＰＯ上に結合するために十分な程度に反
応性ではない。あるｍＰＥＧ誘導体は、生ずる結合の安
定性のために、ＥＰＯ上への大きい量の組み込みを必要
とする。最適量のｍＰＥＧの組み込みは、セミカルバジ
ド誘導体について約１７〜２５、より好ましくは約２２
であり、そしてカルボキシレートヒドラジドについて約
２２〜３２、より好ましくは約３１である。ｍＰＥＧ−
オキシルアミンの反応性は約３〜３６ｍＰＥＧ／ＥＰＯ
である。
【００５３】本発明の水溶性ポリマーの試薬を使用して
種々のポリペプチドまたは同様な分子を変性することが
でき、ここで同様な分子はアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ同様な官能基を含有し、例えば、ケト
ン、ラクトール、活性化カルボン酸または活性化カルボ
ン酸誘導体であり、ヒドロキシル基の酸化、問題のポリ
ペプチド（ポリペプチドが糖タンパク質であるとき炭水
化物部分、および一次配列の中に存在するアミノ酸残
基、例えば、セリン、スレオニン、ヒドロキシルリジン
のＮ末端を包含する）上に存在する他の酸化活性化可能
な基の酸化、あるいは酸化処理の前後にポリペプチド上
に存在するヒドラジンまたはオキシルアミンの反応性基
と化学的に反応することができる。問題のポリペプチド
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、サイト
カイン、成長因子、ホルモン、酵素、タンパク質または
ペプチドのリガンドなどを包含する。本発明のヒドラゾ
ン結合またはオキシム結合を形成する水溶性ポリマーの
試薬の分子により変性するための問題のポリペプチド
は、それらの天然源、遺伝子操作した細胞、例えば、Ｅ
ＰＯ生産のために発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ
細胞から単離することができるか、あるいは種々のｉｎ
ｖｉｔｒｏ合成法により生成することができる。本発
明の目的にとくに好ましいポリペプチドは、ＥＰＯ、お
よびその前駆体、中間体および模倣物（ヒトまたは組み
換え体であるかどうかにかかわらず）。
種々のポリペプチドまたは同様な分子を変性することが
でき、ここで同様な分子はアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ同様な官能基を含有し、例えば、ケト
ン、ラクトール、活性化カルボン酸または活性化カルボ
ン酸誘導体であり、ヒドロキシル基の酸化、問題のポリ
ペプチド（ポリペプチドが糖タンパク質であるとき炭水
化物部分、および一次配列の中に存在するアミノ酸残
基、例えば、セリン、スレオニン、ヒドロキシルリジン
のＮ末端を包含する）上に存在する他の酸化活性化可能
な基の酸化、あるいは酸化処理の前後にポリペプチド上
に存在するヒドラジンまたはオキシルアミンの反応性基
と化学的に反応することができる。問題のポリペプチド
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、サイト
カイン、成長因子、ホルモン、酵素、タンパク質または
ペプチドのリガンドなどを包含する。本発明のヒドラゾ
ン結合またはオキシム結合を形成する水溶性ポリマーの
試薬の分子により変性するための問題のポリペプチド
は、それらの天然源、遺伝子操作した細胞、例えば、Ｅ
ＰＯ生産のために発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ
細胞から単離することができるか、あるいは種々のｉｎ
ｖｉｔｒｏ合成法により生成することができる。本発
明の目的にとくに好ましいポリペプチドは、ＥＰＯ、お
よびその前駆体、中間体および模倣物（ヒトまたは組み
換え体であるかどうかにかかわらず）。
【００５４】本発明の水溶性ポリマーの試薬を使用して
ほとんどのポリペプチドを変性することができるが、
（１）薬物として使用するためにポリペプチド、および
（２）検定において使用するためにポリペプチドを変性
することはとくに重要である。検定において使用するた
めのポリペプチドは、特異的に結合するタンパク質、特
異的に結合するタンパク質、および酵素を包含する。特
異的に結合するタンパク質とは、抗体、ホルモンリセプ
ター、レクチンなどを包含する。
ほとんどのポリペプチドを変性することができるが、
（１）薬物として使用するためにポリペプチド、および
（２）検定において使用するためにポリペプチドを変性
することはとくに重要である。検定において使用するた
めのポリペプチドは、特異的に結合するタンパク質、特
異的に結合するタンパク質、および酵素を包含する。特
異的に結合するタンパク質とは、抗体、ホルモンリセプ
ター、レクチンなどを包含する。
【００５５】種々のポリペプチドを、本発明の水溶性ポ
リマーの試薬およびそれらの使用する本発明の方法によ
り、異なる水溶性ポリマーにカップリングするように、
異なる変性度に変性することができる。変化するパラメ
ーター、例えば、（１）個々のポリペプチド分子にカッ
プリングする水溶性ポリマーの数、これはＥＰＯに対す
る誘導化ｍＰＥＧの活性および生ずるｍＰＥＧ−ＥＰＯ
の生物学的活性に依存する；例えば、約３〜３６分子の
ｍＰＥＧ／ＥＰＯの反応性、（２）水溶性ポリマーの分
子量、例えば、２，０００〜１２，０００ダルトン、
（３）水溶性ポリマーの構造、例えば、モノメトキシポ
リ（エチレングリコール）、（４）水溶性ポリマーの試
薬と問題のポリペプチドとの間の反応を実施する反応条
件、例えば、温度および期間、および（５）変性のため
のポリペプチドを共有結合の接合のために活性化する酸
化条件、例えば、１０〜４０μｍｏｌ／ｍｇのタンパク
質の範囲の濃度における過ヨウ素酸塩は、生ずる水溶性
ポリマー変性ポリペプチドの生物学的性質に影響を及ぼ
すことがある。
リマーの試薬およびそれらの使用する本発明の方法によ
り、異なる水溶性ポリマーにカップリングするように、
異なる変性度に変性することができる。変化するパラメ
ーター、例えば、（１）個々のポリペプチド分子にカッ
プリングする水溶性ポリマーの数、これはＥＰＯに対す
る誘導化ｍＰＥＧの活性および生ずるｍＰＥＧ−ＥＰＯ
の生物学的活性に依存する；例えば、約３〜３６分子の
ｍＰＥＧ／ＥＰＯの反応性、（２）水溶性ポリマーの分
子量、例えば、２，０００〜１２，０００ダルトン、
（３）水溶性ポリマーの構造、例えば、モノメトキシポ
リ（エチレングリコール）、（４）水溶性ポリマーの試
薬と問題のポリペプチドとの間の反応を実施する反応条
件、例えば、温度および期間、および（５）変性のため
のポリペプチドを共有結合の接合のために活性化する酸
化条件、例えば、１０〜４０μｍｏｌ／ｍｇのタンパク
質の範囲の濃度における過ヨウ素酸塩は、生ずる水溶性
ポリマー変性ポリペプチドの生物学的性質に影響を及ぼ
すことがある。
【００５６】本発明の好ましい態様において、共有結合
の接合のためのポリペプチドの活性化は、変性のための
タンパク質を過ヨウ素酸塩（０．１〜１，０００μｍｏ
ｌ／ｍｇタンパク質）と１分〜３日の範囲の期間の間、
より好ましくは０．５〜５０μｍｏｌの過ヨウ素酸塩／
ｍｇのタンパク質と５分〜１８０分の範囲の間混合する
ことによって実施する。本発明の好ましい態様におい
て、接合のための活性化は変性のためのタンパク質を過
ヨウ素酸塩と−１０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃の
範囲の温度において混合することによって実施する。
の接合のためのポリペプチドの活性化は、変性のための
タンパク質を過ヨウ素酸塩（０．１〜１，０００μｍｏ
ｌ／ｍｇタンパク質）と１分〜３日の範囲の期間の間、
より好ましくは０．５〜５０μｍｏｌの過ヨウ素酸塩／
ｍｇのタンパク質と５分〜１８０分の範囲の間混合する
ことによって実施する。本発明の好ましい態様におい
て、接合のための活性化は変性のためのタンパク質を過
ヨウ素酸塩と−１０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃の
範囲の温度において混合することによって実施する。
【００５７】本発明の好ましい態様において、変性のた
めのタンパク質がＥＰＯであるとき、ＥＰＯを式ＩＩ〜
ＶＩＩの化合物、好ましくは式ＩＩ〜Ｖの化合物で誘導
化し、式ＩＩＩの化合物、セミカルバジド、および式Ｉ
Ｉの化合物、カルボキシレートヒドラジドはとくに好ま
しく、ここで水溶性ポリマーＰはモノメトキシポリエチ
レングリコール（ｍＰＥＧ）であり、そしてＥＰＯの各
分子は３〜３６、より好ましくは１７〜２５分子のモノ
メトキシポリエチレングリコール（セミカルバジドの場
合において）、およびより好ましくは２２〜３２分子の
モノメトキシポリエチレングリコール（カルボキシレー
トヒドラジドの場合において）により誘導化し、そして
使用するｍＰＥＧは約５０００ダルトンの平均分子量を
有する。ｍＰＥＧ５０００セミカルバジド変性ＥＰＯの
製造のために好ましい反応条件は、０〜３０℃において
５〜６０分間および０．５〜５０μｍｏｌの過ヨウ素酸
塩／ｍｇのＥＰＯ（酸化剤として過ヨウ素酸塩を使用す
る）である。本発明の水溶性ポリマーの試薬および方法
により変性するためのＥＰＯは、好ましくは遺伝子操作
した細胞から、より好ましくはＥＰＯを生産するように
遺伝学的に変性されたＣＨＯ細胞から得られる。ＥＰＯ
の変性に好ましい水溶性ポリマーの試薬および方法を使
用することによって、ＥＰＯの予期せざるほどに延長さ
れた生物学的半減期が得られ、そして増加したヘマトク
リットのレベルを見るすることができる、例えば、図
２、４および５を参照。
めのタンパク質がＥＰＯであるとき、ＥＰＯを式ＩＩ〜
ＶＩＩの化合物、好ましくは式ＩＩ〜Ｖの化合物で誘導
化し、式ＩＩＩの化合物、セミカルバジド、および式Ｉ
Ｉの化合物、カルボキシレートヒドラジドはとくに好ま
しく、ここで水溶性ポリマーＰはモノメトキシポリエチ
レングリコール（ｍＰＥＧ）であり、そしてＥＰＯの各
分子は３〜３６、より好ましくは１７〜２５分子のモノ
メトキシポリエチレングリコール（セミカルバジドの場
合において）、およびより好ましくは２２〜３２分子の
モノメトキシポリエチレングリコール（カルボキシレー
トヒドラジドの場合において）により誘導化し、そして
使用するｍＰＥＧは約５０００ダルトンの平均分子量を
有する。ｍＰＥＧ５０００セミカルバジド変性ＥＰＯの
製造のために好ましい反応条件は、０〜３０℃において
５〜６０分間および０．５〜５０μｍｏｌの過ヨウ素酸
塩／ｍｇのＥＰＯ（酸化剤として過ヨウ素酸塩を使用す
る）である。本発明の水溶性ポリマーの試薬および方法
により変性するためのＥＰＯは、好ましくは遺伝子操作
した細胞から、より好ましくはＥＰＯを生産するように
遺伝学的に変性されたＣＨＯ細胞から得られる。ＥＰＯ
の変性に好ましい水溶性ポリマーの試薬および方法を使
用することによって、ＥＰＯの予期せざるほどに延長さ
れた生物学的半減期が得られ、そして増加したヘマトク
リットのレベルを見るすることができる、例えば、図
２、４および５を参照。
【００５８】他の好ましい態様において、ＥＰＯを式Ｘ
Ｘ〜ＸＸＶＩＩの化合物、より好ましくは式ＸＸＩ〜Ｘ
ＸＩＶの化合物で誘導化し、ここで水溶性ポリマーＰは
ｍＰＥＧであり、そしてＥＰＯの各分子を、式ＸＸＩ、
ＸＸＩＶおよびＸＸＩＩＩについて、それぞれ、約１８
〜１９ｍＰＥＧ、３１ｍＰＥＧおよび１７ｍＰＥＧで誘
導化する。これらの結果は使用するｍＰＥＧが約５００
０ダルトンの平均分子量を有するとき得られた。式ＸＸ
ＩＩＩの化合物は１２ｍＰＥＧの分画を有し、この分画
は２２ｍＰＥＧセミカルバジドおよび３１ｍＰＥＧカル
ボキシレートヒドラジドに匹敵するｉｎ ｖｉｖｏ生物
学的活性を有した。式ＸＸＩ、ＸＸＩＶおよびＸＸＩＩ
Ｉについての反応性（ｍＰＥＧの分子数／ＥＰＯ）は、
同一反応条件下に、ＰＥＧヒドラジドについてのそれを
越えた。ｍＰＥＧ５０００オキシムの製造のための好ま
しい反応条件は、より高いｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性
を生成するために、対応するヒドラジドの場合より、い
っそう温和な酸化条件、例えば、より短い酸化時間また
はより低い酸化剤の濃度であることができる。
Ｘ〜ＸＸＶＩＩの化合物、より好ましくは式ＸＸＩ〜Ｘ
ＸＩＶの化合物で誘導化し、ここで水溶性ポリマーＰは
ｍＰＥＧであり、そしてＥＰＯの各分子を、式ＸＸＩ、
ＸＸＩＶおよびＸＸＩＩＩについて、それぞれ、約１８
〜１９ｍＰＥＧ、３１ｍＰＥＧおよび１７ｍＰＥＧで誘
導化する。これらの結果は使用するｍＰＥＧが約５００
０ダルトンの平均分子量を有するとき得られた。式ＸＸ
ＩＩＩの化合物は１２ｍＰＥＧの分画を有し、この分画
は２２ｍＰＥＧセミカルバジドおよび３１ｍＰＥＧカル
ボキシレートヒドラジドに匹敵するｉｎ ｖｉｖｏ生物
学的活性を有した。式ＸＸＩ、ＸＸＩＶおよびＸＸＩＩ
Ｉについての反応性（ｍＰＥＧの分子数／ＥＰＯ）は、
同一反応条件下に、ＰＥＧヒドラジドについてのそれを
越えた。ｍＰＥＧ５０００オキシムの製造のための好ま
しい反応条件は、より高いｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性
を生成するために、対応するヒドラジドの場合より、い
っそう温和な酸化条件、例えば、より短い酸化時間また
はより低い酸化剤の濃度であることができる。
【００５９】本発明は、また、本発明の水溶性ポリマー
の試薬との接合、すなわち、共有結合の接合のためにポ
リペプチドを活性化する方法を提供する。接合のために
ポリペプチドを活性化するこれらの方法は、問題のピペ
ロニルを部分的に酸化に酸化する工程からなる。部分的
酸化は、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸塩および当業者に
知られている他の酸化剤を添加するか、あるいは問題の
ポリペプチドの部分上で酸化反応を触媒することができ
る酵素、例えば、ガラクトースオキシダーゼを添加する
ことによって達成できる。接合のための活性化のために
ポリペプチドを部分的に酸化する好ましい方法は、０．
１〜１，０００μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質の範囲の濃
度で過ヨウ素酸塩を１分〜３日の範囲の期間の間、より
好ましくは０．５〜５０μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質の
範囲の濃度で過ヨウ素酸塩を５分〜１８０分の範囲の期
間の間添加することによる。活性化を実施する温度は好
ましくは−１０〜５０℃の範囲、より好ましくは０〜３
０℃の範囲である。
の試薬との接合、すなわち、共有結合の接合のためにポ
リペプチドを活性化する方法を提供する。接合のために
ポリペプチドを活性化するこれらの方法は、問題のピペ
ロニルを部分的に酸化に酸化する工程からなる。部分的
酸化は、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸塩および当業者に
知られている他の酸化剤を添加するか、あるいは問題の
ポリペプチドの部分上で酸化反応を触媒することができ
る酵素、例えば、ガラクトースオキシダーゼを添加する
ことによって達成できる。接合のための活性化のために
ポリペプチドを部分的に酸化する好ましい方法は、０．
１〜１，０００μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質の範囲の濃
度で過ヨウ素酸塩を１分〜３日の範囲の期間の間、より
好ましくは０．５〜５０μｍｏｌ／ｍｇのタンパク質の
範囲の濃度で過ヨウ素酸塩を５分〜１８０分の範囲の期
間の間添加することによる。活性化を実施する温度は好
ましくは−１０〜５０℃の範囲、より好ましくは０〜３
０℃の範囲である。
【００６０】ここに記載する高分子、例えば、ポリペプ
チド、水溶性ポリマーおよびそれらの誘導体の任意のも
のの塩類は、このような分子が種々のｐＨの水溶液の中
に存在する（またはそれから単離された）とき、天然に
存在するであろう。示した生物学的活性を有するポリペ
プチドおよび他の高分子のすべての塩類は、本発明の範
囲内に入ると考えられる。このような塩類の例は、カル
ボン酸残基のアルカリ金属、アルカリ土類金属および他
の金属の塩類、アミノ残基の酸付加塩（例えば、ＨＣ
ｌ）、および同一分子内のカルボン酸およびアミノ残基
の間の反応により形成した両性イオンを包含する。本発
明の化合物は単独で投与することができるが、一般に、
意図する投与のルートおよび標準的製剤学的実施に関し
て選択された製剤学的担体または希釈剤と混合して投与
されるであろう。調製物は非経口的に、例えば、動脈内
または静脈内に注射することができる。この調製物は、
また、経口的、皮下または筋肉内のルートで供給するこ
とができる。非経口的投与のために、それらは、例え
ば、無菌の水溶液の形態で使用することができ、この水
溶液は他の溶質、例えば、この溶液を等張とするために
十分な塩類またはグルコースを含有することができる。
チド、水溶性ポリマーおよびそれらの誘導体の任意のも
のの塩類は、このような分子が種々のｐＨの水溶液の中
に存在する（またはそれから単離された）とき、天然に
存在するであろう。示した生物学的活性を有するポリペ
プチドおよび他の高分子のすべての塩類は、本発明の範
囲内に入ると考えられる。このような塩類の例は、カル
ボン酸残基のアルカリ金属、アルカリ土類金属および他
の金属の塩類、アミノ残基の酸付加塩（例えば、ＨＣ
ｌ）、および同一分子内のカルボン酸およびアミノ残基
の間の反応により形成した両性イオンを包含する。本発
明の化合物は単独で投与することができるが、一般に、
意図する投与のルートおよび標準的製剤学的実施に関し
て選択された製剤学的担体または希釈剤と混合して投与
されるであろう。調製物は非経口的に、例えば、動脈内
または静脈内に注射することができる。この調製物は、
また、経口的、皮下または筋肉内のルートで供給するこ
とができる。非経口的投与のために、それらは、例え
ば、無菌の水溶液の形態で使用することができ、この水
溶液は他の溶質、例えば、この溶液を等張とするために
十分な塩類またはグルコースを含有することができる。
【００６１】経口的モードの投与のために、的のＥＰＯ
組成物は錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、散剤、シロップ
剤、エリキシル、水溶液および水性懸濁液などの形態で
使用することができる。錠剤の場合において、使用でき
る担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリ
ン酸の塩類を包含する。種々の崩壊剤、例えば、澱粉、
および滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを錠剤
において普通に使用する。カプセル剤の形態で投与する
ために、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポ
リエチレングリコールである。水溶液を経口的使用のた
めに必要とするとき、ある種の甘味剤および／または香
味剤を添加できる。
組成物は錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、散剤、シロップ
剤、エリキシル、水溶液および水性懸濁液などの形態で
使用することができる。錠剤の場合において、使用でき
る担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリ
ン酸の塩類を包含する。種々の崩壊剤、例えば、澱粉、
および滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを錠剤
において普通に使用する。カプセル剤の形態で投与する
ために、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポ
リエチレングリコールである。水溶液を経口的使用のた
めに必要とするとき、ある種の甘味剤および／または香
味剤を添加できる。
【００６２】ＥＰＯの治療に対して応答する疾患の状態
の処置においてヒトに投与するために、処方する医師は
所定のヒトの被検体のために適当な投与量を究極的に決
定し、そしてこれは体重、年令および個体の応答ならび
に患者の疾患の性質およびひどさに従い変化することが
期待される。ペギレイテッド（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）形
態の薬物の投与量は、一般に、天然の薬物のために使用
される量であることができるが、ある場合において、こ
れらの限界外の投与量を投与することが好ましいか、あ
るいは必要であることがある。
の処置においてヒトに投与するために、処方する医師は
所定のヒトの被検体のために適当な投与量を究極的に決
定し、そしてこれは体重、年令および個体の応答ならび
に患者の疾患の性質およびひどさに従い変化することが
期待される。ペギレイテッド（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）形
態の薬物の投与量は、一般に、天然の薬物のために使用
される量であることができるが、ある場合において、こ
れらの限界外の投与量を投与することが好ましいか、あ
るいは必要であることがある。
【００６３】また、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｖ
Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ、および式ＸＩＸ、Ｘ
Ｘ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸ
Ｖ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩの水溶性ポリマーの試薬
を別々にまたは種々の組み合わせで、キットの形態で供
給して、問題のポリペプチドの便利なかつ再現性ある誘
導化を提供することが重要である。問題のキットは式
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ
またはＩＸの水溶性ポリマーの試薬、あるいは式ＸＩ
Ｘ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、
ＸＸＶ、ＸＸＶＩまたはＸＸＶＩＩの水溶性ポリマーの
試薬、緩衝剤、酸化剤、反応インディケーター化合物、
タンパク質濃度媒質試薬、例えば、フラッドフォード
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイのために、などからなる
溶液を含有することができる。キットの中に含まれる化
合物は、再現性を提供しかつ誤差を最小とするために、
好ましくは前以て媒質した部分および前以て混合した溶
液で提供される。キットは、また、好ましくは取扱説明
書を含有する。取扱説明書は主題の方法を実施するとき
の種々の工程に関するものである。
Ｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ、および式ＸＩＸ、Ｘ
Ｘ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸ
Ｖ、ＸＸＶＩおよびＸＸＶＩＩの水溶性ポリマーの試薬
を別々にまたは種々の組み合わせで、キットの形態で供
給して、問題のポリペプチドの便利なかつ再現性ある誘
導化を提供することが重要である。問題のキットは式
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ
またはＩＸの水溶性ポリマーの試薬、あるいは式ＸＩ
Ｘ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、
ＸＸＶ、ＸＸＶＩまたはＸＸＶＩＩの水溶性ポリマーの
試薬、緩衝剤、酸化剤、反応インディケーター化合物、
タンパク質濃度媒質試薬、例えば、フラッドフォード
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイのために、などからなる
溶液を含有することができる。キットの中に含まれる化
合物は、再現性を提供しかつ誤差を最小とするために、
好ましくは前以て媒質した部分および前以て混合した溶
液で提供される。キットは、また、好ましくは取扱説明
書を含有する。取扱説明書は主題の方法を実施するとき
の種々の工程に関するものである。
【００６４】水溶性ポリマーの誘導体の合成 次の本発明の化合物の合成は例示であり、そして本発明
を限定することを意図しない。有機化学における当業者
は例示した合成についての種々の変化を案出することが
できるであろう。
を限定することを意図しない。有機化学における当業者
は例示した合成についての種々の変化を案出することが
できるであろう。
【００６５】ヒドラゾン形成ｍ−ＰＥＧの合成 ｍＰＥＧ−ヒドラジドの合成 ｍＰＥＧ−ヒドラジドを合成するいくつかの方法が存在
する。２つの方法を示す。
する。２つの方法を示す。
【００６６】ｍＰＥＧ５０００酸（２０．８ｇ、４ｍｍ
ｏｌ）を３０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、そして
１５ｍｌのジクロロメタン中のｔ−ブチルカルバゼート
（２．６４ｇ、８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１０ｍｌ
のジメチルホルムアミド中に溶解した１．６８ｇ（８ｍ
ｍｏｌ）のジシクロヘキシルカーボジイミドを添加し
た。室温において反応を一夜進行させた後、反応混合物
を濾過した。濾液を濃縮し、そして生ずる残留物をジク
ロロメタン中に取った。エーテルを添加してｍＰＥＧ−
ｔ−ブチル−カルバゼートを沈澱させ、これを濾過し、
そして乾燥した。生成物をジクロロメタン／トリフルオ
ロ酢酸（１：１）混合物の中に入れた。４０分後、溶液
を濃縮し、ジクロロメタンの中に再溶解し、そしてエー
テルを添加した。生成物を濾過により回収した。収量１
７．７ｇ。ＩＲ：（Ｃ＝Ｏ）１７３０、１７００。分
析、Ｎについての計算値：０．５５。実測値：Ｎ、０．
４４。下に示す別法はｍＰＥＧ−アルコールをエステル
に転化した。次いで、ｍＰＥＧ−エステルをヒドラジン
で加水分解してｍＰＥＧ−ヒドラジドを生成する。ｍＰ
ＥＧ−エステルの合成は、ロイアー（Ｒｏｙｅｒ）、
Ｇ．Ｐ．およびアナンサーマイア（Ａｎａｎｔｈｅｒｍ
ａｉａｈ）、Ｇ．Ｍ．（１９７９）ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１０１、３３９４−３３９５の手
順に類似する。
ｏｌ）を３０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、そして
１５ｍｌのジクロロメタン中のｔ−ブチルカルバゼート
（２．６４ｇ、８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１０ｍｌ
のジメチルホルムアミド中に溶解した１．６８ｇ（８ｍ
ｍｏｌ）のジシクロヘキシルカーボジイミドを添加し
た。室温において反応を一夜進行させた後、反応混合物
を濾過した。濾液を濃縮し、そして生ずる残留物をジク
ロロメタン中に取った。エーテルを添加してｍＰＥＧ−
ｔ−ブチル−カルバゼートを沈澱させ、これを濾過し、
そして乾燥した。生成物をジクロロメタン／トリフルオ
ロ酢酸（１：１）混合物の中に入れた。４０分後、溶液
を濃縮し、ジクロロメタンの中に再溶解し、そしてエー
テルを添加した。生成物を濾過により回収した。収量１
７．７ｇ。ＩＲ：（Ｃ＝Ｏ）１７３０、１７００。分
析、Ｎについての計算値：０．５５。実測値：Ｎ、０．
４４。下に示す別法はｍＰＥＧ−アルコールをエステル
に転化した。次いで、ｍＰＥＧ−エステルをヒドラジン
で加水分解してｍＰＥＧ−ヒドラジドを生成する。ｍＰ
ＥＧ−エステルの合成は、ロイアー（Ｒｏｙｅｒ）、
Ｇ．Ｐ．およびアナンサーマイア（Ａｎａｎｔｈｅｒｍ
ａｉａｈ）、Ｇ．Ｍ．（１９７９）ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１０１、３３９４−３３９５の手
順に類似する。
【００６７】
【化２６】
【００６８】典型的な合成において、ｍＰＥＧ−ＯＨを
高真空炉中で約５時間８５℃において乾燥した。冷却
後、５ｇのｍＰＥＧ−ＯＨ（分子量＝５０００、１ｍｍ
ｏｌ）を５ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し
た。２６．４ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウ
ムに、１ｍｌの乾燥テトラヒドロフランを添加した。ｍ
ＰＥＧ５０００溶液をＮａＨに滴々添加した。この混合
物をアルゴン雰囲気中で室温において１時間撹拌した。
この時間の間、溶液はオレンジ色になった。ブロモアセ
チル酸ベンジルエステル（２．２９ｇ、１０ｍｍｏｌ）
を１ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、そして
この溶液をｍＰＥＧ５０００混合物に滴々添加した。反
応混合物を室温においてアルゴン雰囲気下に一夜撹拌
し、次いで濾過した。冷エーテルを濾液に添加してｍＰ
ＥＧ５０００−ベンジルエステルを沈澱させ、そして固
体を集め、そして乾燥した。収量４．５ｇ。ＩＲ：（Ｃ
＝Ｏ）１７５２。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル
濾過により精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。
高真空炉中で約５時間８５℃において乾燥した。冷却
後、５ｇのｍＰＥＧ−ＯＨ（分子量＝５０００、１ｍｍ
ｏｌ）を５ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し
た。２６．４ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウ
ムに、１ｍｌの乾燥テトラヒドロフランを添加した。ｍ
ＰＥＧ５０００溶液をＮａＨに滴々添加した。この混合
物をアルゴン雰囲気中で室温において１時間撹拌した。
この時間の間、溶液はオレンジ色になった。ブロモアセ
チル酸ベンジルエステル（２．２９ｇ、１０ｍｍｏｌ）
を１ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、そして
この溶液をｍＰＥＧ５０００混合物に滴々添加した。反
応混合物を室温においてアルゴン雰囲気下に一夜撹拌
し、次いで濾過した。冷エーテルを濾液に添加してｍＰ
ＥＧ５０００−ベンジルエステルを沈澱させ、そして固
体を集め、そして乾燥した。収量４．５ｇ。ＩＲ：（Ｃ
＝Ｏ）１７５２。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル
濾過により精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。
【００６９】ｍＰＥＧ５０００−ベンジルエステルをヒ
ドラジンで処理してヒドラジドに転化した。典型的な実
験において、１．０ｇのｍＰＥＧ５０００−ベンジルエ
ステルをアルゴン雰囲気下に３ｍｌのメタノール／塩化
メチレン（５：１）中に溶解した。ヒドラジン（０．０
９１ｍｌ、２．９１ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶
液を室温において約７０時間撹拌した。この混合物をＬ
Ｈ−２０カラム上でおき、メタノール／塩化メチレン
（５：１）で溶離した。ｍＰＥＧ−ヒドラジドをヒドラ
ジドから分離し、そしてエーテルで沈澱させた。固体を
濾過により集めた。収量０．７８ｇ。ＩＲ（Ｈ2Ｎ−Ｃ
＝Ｏ）：１６６９。分析、Ｎについての計算値、０．５
５。実測値：Ｎ、０．３４。
ドラジンで処理してヒドラジドに転化した。典型的な実
験において、１．０ｇのｍＰＥＧ５０００−ベンジルエ
ステルをアルゴン雰囲気下に３ｍｌのメタノール／塩化
メチレン（５：１）中に溶解した。ヒドラジン（０．０
９１ｍｌ、２．９１ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶
液を室温において約７０時間撹拌した。この混合物をＬ
Ｈ−２０カラム上でおき、メタノール／塩化メチレン
（５：１）で溶離した。ｍＰＥＧ−ヒドラジドをヒドラ
ジドから分離し、そしてエーテルで沈澱させた。固体を
濾過により集めた。収量０．７８ｇ。ＩＲ（Ｈ2Ｎ−Ｃ
＝Ｏ）：１６６９。分析、Ｎについての計算値、０．５
５。実測値：Ｎ、０．３４。
【００７０】また、ｍＰＥＧ２０００−ヒドラジド、ｍ
ＰＥＧ６０００−ヒドラジド、ｍＰＥＧ８５００−ヒド
ラジド，およびｍＰＥＧ１２０００−ヒドラジドを前述
の手順により合成した。
ＰＥＧ６０００−ヒドラジド、ｍＰＥＧ８５００−ヒド
ラジド，およびｍＰＥＧ１２０００−ヒドラジドを前述
の手順により合成した。
【００７１】ｍＰＥＧ−ヒドラジンカルボキシレートの
合成
合成
【００７２】
【化２７】
【００７３】上のｍＰＥＧ５０００−ヒドラジンカルボ
キシレートは次のようにして合成した。メトキシポリオ
キシエチレンイミダゾリルカルボニル（シグマ・ケミカ
ル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から、２．５ｇ、
０．４９ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの塩化メチレン中でヒ
ドラジン（０．０７７ｍｌ、２．４５ｍｍｏｌ）で処理
した。室温において４時間後、反応混合物を濾過し、そ
して濾液を冷エーテルで処理した。収量２．２２ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１７１８。分析、Ｎについての計算値、
０．５５。実測値：Ｎ、０．５９５。
キシレートは次のようにして合成した。メトキシポリオ
キシエチレンイミダゾリルカルボニル（シグマ・ケミカ
ル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から、２．５ｇ、
０．４９ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの塩化メチレン中でヒ
ドラジン（０．０７７ｍｌ、２．４５ｍｍｏｌ）で処理
した。室温において４時間後、反応混合物を濾過し、そ
して濾液を冷エーテルで処理した。収量２．２２ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１７１８。分析、Ｎについての計算値、
０．５５。実測値：Ｎ、０．５９５。
【００７４】ｍＰＥＧ−セミカルバジドの合成
【００７５】
【化２８】
【００７６】上のｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドを
次のようにして合成した。ｍＰＥＧ５０００−アミン
を、ラジャセクハラン・ピライ（Ｒａｊａｓｅｋｈａｒ
ａｎＰｉｌｌａｉ）、Ｖ．Ｎ．およびムッター（Ｍｕｔ
ｔｅｒ）、Ｍ．（１９８０）ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、４
５、５３６４−５３７０に記載されているようにして合
成した。ｍＰＥＧ５０００−アミン（２ｇ、０．４ｍｍ
ｏｌ）を９ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、そして
０．２８ｍｌのトリエチルアミンを添加した。この混合
物にアルゴン雰囲気下にホスゲン（トルエン中、０．４
２ｍｌ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気
し、次いでアルゴンで泡立てて過剰のホスゲンを除去し
た。この溶液を濃縮し、そして残留物をジクロロメタン
中に溶解し、そして０．０６３ｍｌのヒドラジン（２ｍ
ｍｏｌ）を添加し、次いで２ｍｌのメタノールを添加し
た。反応を４時間通気し、次いで冷エーテルを添加し、
そして沈澱を濾過により取り出し、そして乾燥した。収
量１．５１ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６８３。分析、Ｎに
ついての計算値、０．８３。実測値：Ｎ、０．５６。
次のようにして合成した。ｍＰＥＧ５０００−アミン
を、ラジャセクハラン・ピライ（Ｒａｊａｓｅｋｈａｒ
ａｎＰｉｌｌａｉ）、Ｖ．Ｎ．およびムッター（Ｍｕｔ
ｔｅｒ）、Ｍ．（１９８０）ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、４
５、５３６４−５３７０に記載されているようにして合
成した。ｍＰＥＧ５０００−アミン（２ｇ、０．４ｍｍ
ｏｌ）を９ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、そして
０．２８ｍｌのトリエチルアミンを添加した。この混合
物にアルゴン雰囲気下にホスゲン（トルエン中、０．４
２ｍｌ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気
し、次いでアルゴンで泡立てて過剰のホスゲンを除去し
た。この溶液を濃縮し、そして残留物をジクロロメタン
中に溶解し、そして０．０６３ｍｌのヒドラジン（２ｍ
ｍｏｌ）を添加し、次いで２ｍｌのメタノールを添加し
た。反応を４時間通気し、次いで冷エーテルを添加し、
そして沈澱を濾過により取り出し、そして乾燥した。収
量１．５１ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６８３。分析、Ｎに
ついての計算値、０．８３。実測値：Ｎ、０．５６。
【００７７】また、前述の手順を使用して、ｍＰＥＧ２
０００、ｍＰＥＧ８５００、およびｍＰＥＧ１２０００
のセミカルバジドを合成した。
０００、ｍＰＥＧ８５００、およびｍＰＥＧ１２０００
のセミカルバジドを合成した。
【００７８】ｍＰＥＧ−チオセミカルバジドの合成 ５ｍｌのジクロロメタン中の１．５ｇのｍＰＥＧ５００
０−アミンに、０．１ｍｌのトリエチルアミン（０．７
５ｍｍｏｌ）および０．０７１ｇ（０．３ｍｍｏｌ）の
ジ−２−ピリジルチオノカーボネートを添加した。反応
を一夜通気し、次いで０．０４７ｍｌ（０．３ｍｍｏ
ｌ）のヒドラジンを添加した。４時間後、この混合物を
濾過し、そして濾液を冷エーテルで処理した。生成物を
濾過により集めた。収量１．３４ｇ。ＩＲ（Ｎ＝Ｈスト
レッチ）：３３３２。分析、Ｎについての計算値、０．
８３。実測値：Ｎ、０．２５５。
０−アミンに、０．１ｍｌのトリエチルアミン（０．７
５ｍｍｏｌ）および０．０７１ｇ（０．３ｍｍｏｌ）の
ジ−２−ピリジルチオノカーボネートを添加した。反応
を一夜通気し、次いで０．０４７ｍｌ（０．３ｍｍｏ
ｌ）のヒドラジンを添加した。４時間後、この混合物を
濾過し、そして濾液を冷エーテルで処理した。生成物を
濾過により集めた。収量１．３４ｇ。ＩＲ（Ｎ＝Ｈスト
レッチ）：３３３２。分析、Ｎについての計算値、０．
８３。実測値：Ｎ、０．２５５。
【００７９】ｍＰＥＧ−炭酸ジヒドラジドの合成 アルゴンでパージした反応フラスコに、２ｍｌのジクロ
ロメタン、０．０８４ｍｌのトリエチルアミン（０．６
ｍｍｏｌ）および０．０３ｇのトリホスゲン（０．１ｍ
ｍｏｌ）中のｔ−ブチルカルバゼート（０．０４ｇ、
０．３ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、４ｍｌのジクロ
ロメタン中の１．５ｇのｍＰＥＧ５０００−アミン
（０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気し、次
いで冷エーテルを添加して生成物を沈澱させた。生成物
を濾過により単離した。収量１．４４ｇ。保護したジヒ
ドラジド（０．６１ｇ）を室温において１０分間２ｍｌ
のトリフルオロ酢酸で処理した。トリフルオロ酢酸を除
去し、そして生ずる油を塩化メチレン中に溶解し、そし
て濃縮した。この工程を反復した。この油を塩化メチレ
ン中に溶解し、そして生成物を冷エーテルで沈澱させ
た。生成物を濾過により単離した。収量０．４１ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１６９５。分析、Ｎについての計算値、
１．３７。実測値：Ｎ、０．４１。
ロメタン、０．０８４ｍｌのトリエチルアミン（０．６
ｍｍｏｌ）および０．０３ｇのトリホスゲン（０．１ｍ
ｍｏｌ）中のｔ−ブチルカルバゼート（０．０４ｇ、
０．３ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、４ｍｌのジクロ
ロメタン中の１．５ｇのｍＰＥＧ５０００−アミン
（０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気し、次
いで冷エーテルを添加して生成物を沈澱させた。生成物
を濾過により単離した。収量１．４４ｇ。保護したジヒ
ドラジド（０．６１ｇ）を室温において１０分間２ｍｌ
のトリフルオロ酢酸で処理した。トリフルオロ酢酸を除
去し、そして生ずる油を塩化メチレン中に溶解し、そし
て濃縮した。この工程を反復した。この油を塩化メチレ
ン中に溶解し、そして生成物を冷エーテルで沈澱させ
た。生成物を濾過により単離した。収量０．４１ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１６９５。分析、Ｎについての計算値、
１．３７。実測値：Ｎ、０．４１。
【００８０】ｍＰＥＧ−アリールヒドラジドの合成
【００８１】
【化２９】
【００８２】上のｍＰＥＧ５０００−アリールヒドラジ
ドを次のようにして合成した。４−ヒドラジノ安息香酸
をジ−ｔ−ブチルピロカーボネートとジオキサン中で塩
基の存在下に０℃において反応させることによって、Ｂ
ｏｃ−ＮＨＮＨ−Ｃ6Ｈ4−ＣＯＯＨを調製した。保護し
たアリール酸ヒドラジン（０．３７８ｇ、１．５ｍｍｏ
ｌ）をｍＰＥＧ−アミン（１．５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）
とジクロロメタン／ジメチルホルムアミド溶液（４ｍ
ｌ、１：１）中で反応させた。また、ジシクロヘキシル
カーボジイミド（０．３１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．２ｇ、１．５ｍｍ
ｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２１ｍｌ、１．５
ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気し、次いで内容
物を濾過した。濾液をエーテルで処理し、そして沈澱を
集めた。沈澱をトリフルオロ酢酸で処理し、そして３０
分後、トリフルオロ酢酸を除去した。エーテルを油状残
留物に添加して、ｍＰＥＧ−アリールヒドラジン生成物
を沈澱させた。生成物を濾過により単離した。収量１．
１９ｇ。ＩＲ（Ｎ−Ｈ）：３２６７；（Ｃ＝Ｏ）：１６
５５；（Ｃ＝Ｏ）：１６０６。分析、Ｎについての計算
値、０．８２。実測値：Ｎ、０．５０。
ドを次のようにして合成した。４−ヒドラジノ安息香酸
をジ−ｔ−ブチルピロカーボネートとジオキサン中で塩
基の存在下に０℃において反応させることによって、Ｂ
ｏｃ−ＮＨＮＨ−Ｃ6Ｈ4−ＣＯＯＨを調製した。保護し
たアリール酸ヒドラジン（０．３７８ｇ、１．５ｍｍｏ
ｌ）をｍＰＥＧ−アミン（１．５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）
とジクロロメタン／ジメチルホルムアミド溶液（４ｍ
ｌ、１：１）中で反応させた。また、ジシクロヘキシル
カーボジイミド（０．３１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．２ｇ、１．５ｍｍ
ｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２１ｍｌ、１．５
ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜通気し、次いで内容
物を濾過した。濾液をエーテルで処理し、そして沈澱を
集めた。沈澱をトリフルオロ酢酸で処理し、そして３０
分後、トリフルオロ酢酸を除去した。エーテルを油状残
留物に添加して、ｍＰＥＧ−アリールヒドラジン生成物
を沈澱させた。生成物を濾過により単離した。収量１．
１９ｇ。ＩＲ（Ｎ−Ｈ）：３２６７；（Ｃ＝Ｏ）：１６
５５；（Ｃ＝Ｏ）：１６０６。分析、Ｎについての計算
値、０．８２。実測値：Ｎ、０．５０。
【００８３】オキシム形成ｍＰＥＧの合成 ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮＨ
2の合成
2の合成
【００８４】
【化３０】
【００８５】ｍＰＥＧ−５０００スクシンイミドエステ
ル（ＮＨＳ）（２．０ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌ
のジクロロメタン中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロ
キシカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加
し、次いで０．７ｍｌのトリエチルアミン（５ｍｍｏ
ｌ）を添加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテル
を添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄
し、そして乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジクロロメ
タン／トリフルオロ酢酸（１：１）混合物の中に入れ
た。６０分後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ
−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量１．２
ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７４１。分析、Ｎについての計
算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．１３。
ル（ＮＨＳ）（２．０ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌ
のジクロロメタン中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロ
キシカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加
し、次いで０．７ｍｌのトリエチルアミン（５ｍｍｏ
ｌ）を添加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテル
を添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄
し、そして乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジクロロメ
タン／トリフルオロ酢酸（１：１）混合物の中に入れ
た。６０分後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ
−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量１．２
ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７４１。分析、Ｎについての計
算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．１３。
【００８６】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
Ｏ−ＣＯ−ＯＮＨ2の合成
Ｏ−ＣＯ−ＯＮＨ2の合成
【００８７】
【化３１】
【００８８】ｍＰＥＧ５０００−オキシカルボニルイミ
ダゾール（２．０ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジ
クロロメタン中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシ
カルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、次
いで０．７ｍｌのトリエチルアミン（５ｍｍｏｌ）を添
加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジクロロメタン／ト
リフルオロ酢酸（１：２）混合物の中に入れた。６０分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール／塩化メ
チレン（５：１）で溶離した。収量１．２ｇ。ＩＲ（Ｃ
＝Ｏ）：１７４１。分析、Ｎについての計算値、０．２
８。実測値：Ｎ、０．１５。
ダゾール（２．０ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジ
クロロメタン中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシ
カルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、次
いで０．７ｍｌのトリエチルアミン（５ｍｍｏｌ）を添
加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジクロロメタン／ト
リフルオロ酢酸（１：２）混合物の中に入れた。６０分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール／塩化メ
チレン（５：１）で溶離した。収量１．２ｇ。ＩＲ（Ｃ
＝Ｏ）：１７４１。分析、Ｎについての計算値、０．２
８。実測値：Ｎ、０．１５。
【００８９】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2の合成
ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2の合成
【００９０】
【化３２】
【００９１】ｍＰＥＧ５０００−アミン（２．０ｇ、
０．４ｍｍｏｌ）をカルボニルイミダゾール（０．２３
ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）と一緒に１０ｍｌのクロロホル
ム中に溶解した。この反応は、ラヌチ（Ｒａｎｕｃｃ
ｉ）、Ｅ．およびフェルチ（Ｆｅｒｕｔｉ）、Ｐ．（１
９９１）マクロモレキュールス（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ）２４、３７４７−３７５２に記載されている
ｍＰＥＧ−アルコールのカルボニルイミダゾールによる
活性化の手順に従った。反応混合物を室温において２時
間撹拌し、次いで７ｍｌの水を添加し、そして有機層を
抽出した。水による抽出を５回反復した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、そしてこの塩を濾過した。濾液に
ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート（０．５３ｇ、
４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで０．７ｍｌのトリエチル
アミン（５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一夜撹
拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物（１．
５ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：２）
混合物の中に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。
この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに
精製し、メタノール／塩化メチレン（５：１）で溶離し
た。収量１．３ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７２６。分析、
Ｎについての計算値、０．５５。実測値：Ｎ、０．４
３。
０．４ｍｍｏｌ）をカルボニルイミダゾール（０．２３
ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）と一緒に１０ｍｌのクロロホル
ム中に溶解した。この反応は、ラヌチ（Ｒａｎｕｃｃ
ｉ）、Ｅ．およびフェルチ（Ｆｅｒｕｔｉ）、Ｐ．（１
９９１）マクロモレキュールス（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ）２４、３７４７−３７５２に記載されている
ｍＰＥＧ−アルコールのカルボニルイミダゾールによる
活性化の手順に従った。反応混合物を室温において２時
間撹拌し、次いで７ｍｌの水を添加し、そして有機層を
抽出した。水による抽出を５回反復した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、そしてこの塩を濾過した。濾液に
ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート（０．５３ｇ、
４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで０．７ｍｌのトリエチル
アミン（５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一夜撹
拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物（１．
５ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：２）
混合物の中に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。
この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに
精製し、メタノール／塩化メチレン（５：１）で溶離し
た。収量１．３ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７２６。分析、
Ｎについての計算値、０．５５。実測値：Ｎ、０．４
３。
【００９２】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＳ−ＯＮＨ2の合成
ＮＨ−ＣＳ−ＯＮＨ2の合成
【００９３】
【化３３】
【００９４】ｍＰＥＧ５０００−アミン（１．５ｇ、
０．３ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのジクロロメタン中に溶解
した。トリエチルアミン（０．１ｍｌ、０．７５ｍｍｏ
ｌ）を添加し、次いでジ−２−ピリジルチオノカーボネ
ート（０．０２８ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。
反応混合物を室温において２時間撹拌し、次いで７ｍｌ
の水を添加し、そして有機層を抽出した。水による抽出
を５回反復した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そ
してこの塩を濾過した。濾液にｔ−ブチルＮ−ヒドロキ
シカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、
次いでｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート（０．５
３ｇ、４ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌのトリエチルアミン
（３．７５ｍｍｏｌ）と一緒に添加した。反応混合物を
一夜撹拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
（１．６ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸
（１：１）混合物の中に入れた。３０分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。収量０．７２ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｓ）：１
６８４。分析、Ｎについての計算値、０．５５。実測
値：Ｎ、０．３０。
０．３ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのジクロロメタン中に溶解
した。トリエチルアミン（０．１ｍｌ、０．７５ｍｍｏ
ｌ）を添加し、次いでジ−２−ピリジルチオノカーボネ
ート（０．０２８ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。
反応混合物を室温において２時間撹拌し、次いで７ｍｌ
の水を添加し、そして有機層を抽出した。水による抽出
を５回反復した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そ
してこの塩を濾過した。濾液にｔ−ブチルＮ−ヒドロキ
シカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、
次いでｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート（０．５
３ｇ、４ｍｍｏｌ）を０．５ｍｌのトリエチルアミン
（３．７５ｍｍｏｌ）と一緒に添加した。反応混合物を
一夜撹拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
（１．６ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸
（１：１）混合物の中に入れた。３０分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。収量０．７２ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｓ）：１
６８４。分析、Ｎについての計算値、０．５５。実測
値：Ｎ、０．３０。
【００９５】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮＨ2の合成
ＯＮＨ2の合成
【００９６】
【化３４】
【００９７】ｍＰＥＧ５０００−トレシレート（２．０
ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジクロロメタン中に
溶解し、これにｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート
（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）および０．７ｍｌのトリエ
チルアミン（５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を４
５℃（還流）に加熱し、そして反応を一夜進行させた。
冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集
め、洗浄し、そして乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジ
クロロメタン／トリフルオロ酢酸（３：７）混合物の中
に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。この化合物
をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メ
タノール／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量
１．６ｇ。分析、Ｎについての計算値、０．２８。実測
値：Ｎ、０．１９。
ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジクロロメタン中に
溶解し、これにｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート
（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）および０．７ｍｌのトリエ
チルアミン（５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を４
５℃（還流）に加熱し、そして反応を一夜進行させた。
冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集
め、洗浄し、そして乾燥した。生成物（１．５ｇ）をジ
クロロメタン／トリフルオロ酢酸（３：７）混合物の中
に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。この化合物
をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メ
タノール／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量
１．６ｇ。分析、Ｎについての計算値、０．２８。実測
値：Ｎ、０．１９。
【００９８】別の合成はの通りである。ｔ−ブチルＮ−
ヒドロキシカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を
１ｍｌのテトラヒドロフランの中に入れ、次いでＮａＨ
（７８ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加した。数分後、
この溶液を５ｍｌのテトラヒドロフラン中のｍＰＥＧ５
０００−トレシレート（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）に
添加した。この混合物を４０℃に加熱し、そして反応を
一夜進行させた。冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
（１．５ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸
（３：７）混合物の中に入れた。６０分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。収量０．７５ｇ。分析、Ｎについての
計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．１０。
ヒドロキシカルバメート（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を
１ｍｌのテトラヒドロフランの中に入れ、次いでＮａＨ
（７８ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加した。数分後、
この溶液を５ｍｌのテトラヒドロフラン中のｍＰＥＧ５
０００−トレシレート（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）に
添加した。この混合物を４０℃に加熱し、そして反応を
一夜進行させた。冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
（１．５ｇ）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸
（３：７）混合物の中に入れた。６０分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール／塩化メチレン（５：
１）で溶離した。収量０．７５ｇ。分析、Ｎについての
計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．１０。
【００９９】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
【０１００】
【化３５】
【０１０１】ｍＰＥＧ５０００−アミン（２．０ｇ、
０．４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−アミノオキシ酢酸
（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−１−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート（１．１ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン（０．７ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）
を添加した。反応混合物を室温において約７２時間撹拌
し、次いで冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。集めた沈澱の
半分をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（３：７）混
合物の中に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精
製し、メタノール／塩化メチレン（５：１）で溶離し
た。生ずる黄色沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理
した。約２４時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾
液を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテル
で処理した。白色生成物が得られた。収量０．５ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１６７６。分析、Ｎについての計算値、
０．５５。実測値：Ｎ、０．５０。
０．４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−アミノオキシ酢酸
（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−１−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート（１．１ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン（０．７ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）
を添加した。反応混合物を室温において約７２時間撹拌
し、次いで冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。集めた沈澱の
半分をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（３：７）混
合物の中に入れた。６０分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をＬＨ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精
製し、メタノール／塩化メチレン（５：１）で溶離し
た。生ずる黄色沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理
した。約２４時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾
液を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテル
で処理した。白色生成物が得られた。収量０．５ｇ。Ｉ
Ｒ（Ｃ＝Ｏ）：１６７６。分析、Ｎについての計算値、
０．５５。実測値：Ｎ、０．５０。
【０１０２】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
【０１０３】
【化３６】
【０１０４】ｍＰＥＧ５０００−アルコール（２．０
ｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−アミノオキシ酢酸
（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−１−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート（１．１ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン（０．７ｍｌ、３．０９ｍｍｏ
ｌ）を添加した。反応混合物を室温において約２時間撹
拌し、次いでジメチルアミノピリジン（０．２４４ｇ、
２ｍｍｏｌ）を添加した。約４日後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理し
た。約２４時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾液
を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテルで
処理した。分析、Ｎについての計算値、０．２８。実測
値：Ｎ、０．１４。
ｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−アミノオキシ酢酸
（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−１−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート（１．１ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン（０．７ｍｌ、３．０９ｍｍｏ
ｌ）を添加した。反応混合物を室温において約２時間撹
拌し、次いでジメチルアミノピリジン（０．２４４ｇ、
２ｍｍｏｌ）を添加した。約４日後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理し
た。約２４時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾液
を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテルで
処理した。分析、Ｎについての計算値、０．２８。実測
値：Ｎ、０．１４。
【０１０５】集めた沈澱の半分をジクロロメタン／トリ
フルオロ酢酸（２：１）混合物の中に入れた。３０分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール／塩化メ
チレン（５：１）で溶離した。収量０．３ｇ。ＩＲ（Ｃ
＝Ｏ）：１７３４。
フルオロ酢酸（２：１）混合物の中に入れた。３０分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をＬＨ−２０カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール／塩化メ
チレン（５：１）で溶離した。収量０．３ｇ。ＩＲ（Ｃ
＝Ｏ）：１７３４。
【０１０６】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
【０１０７】
【化３７】
【０１０８】ｍＰＥＧ−５０００−エポキシド（１．０
ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ
中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート
（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜進
行させ、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。硫酸
ナトリウムを添加し、そして濾過した。冷エーテルをジ
クロロメタンの溶液に添加し、そして生ずる沈澱を濾過
により集め、洗浄し、そして乾燥した。この化合物をＬ
Ｈ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノ
ール／塩化メチレン（５：１）で溶離した。保護したｍ
ＰＥＧ−誘導体（０．２５ｇ）をジクロロメタン／トリ
フルオロ酢酸（１：１）混合物の中に入れた。３０分
後、この溶液を濃縮し、そしてジクロロメタン中に取っ
た。この化合物をエーテルから沈澱により単離した。収
量０．２ｇ。ＩＲ（Ｏ−Ｈ）：３４４７。分析、Ｎにつ
いての計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．２１。
ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ
中に溶解した。ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメート
（０．５３ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を一夜進
行させ、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。硫酸
ナトリウムを添加し、そして濾過した。冷エーテルをジ
クロロメタンの溶液に添加し、そして生ずる沈澱を濾過
により集め、洗浄し、そして乾燥した。この化合物をＬ
Ｈ−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノ
ール／塩化メチレン（５：１）で溶離した。保護したｍ
ＰＥＧ−誘導体（０．２５ｇ）をジクロロメタン／トリ
フルオロ酢酸（１：１）混合物の中に入れた。３０分
後、この溶液を濃縮し、そしてジクロロメタン中に取っ
た。この化合物をエーテルから沈澱により単離した。収
量０．２ｇ。ＩＲ（Ｏ−Ｈ）：３４４７。分析、Ｎにつ
いての計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．２１。
【０１０９】ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2の合成
【０１１０】
【化３８】
【０１１１】ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）
−ＣＨ2−ＯＮＨ−Ｂｏｃ（０．３ｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）を３ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシドの中に入れ、
２ｍｌの酢酸無水物を添加した。反応を室温において約
２４時間進行させ、次いで冷エーテルを添加した。生ず
る沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生
成物をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：１）混
合物の中に入れた。３０分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をエーテルから沈澱により単離した。収量０．
１８ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６９８。分析、Ｎについて
の計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．２０。
−ＣＨ2−ＯＮＨ−Ｂｏｃ（０．３ｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）を３ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシドの中に入れ、
２ｍｌの酢酸無水物を添加した。反応を室温において約
２４時間進行させ、次いで冷エーテルを添加した。生ず
る沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生
成物をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：１）混
合物の中に入れた。３０分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をエーテルから沈澱により単離した。収量０．
１８ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６９８。分析、Ｎについて
の計算値、０．２８。実測値：Ｎ、０．２０。
【０１１２】ｍＰＥＧ−オルニチンセミカルバジドの合
成 ｍＰＥＧ−０００−アミン（５．０ｇ、１ｍｍｏｌ）を
５ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして１０ｍｌ
の乾燥ジメチルホルムアミドを添加した。Ｆｍｏｃ−Ｏ
ｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ（３．１ｇ、５ｍｍｏｌ）を
添加した。室温において１時間後、この溶液を濃縮し
た。水を残留物に添加し、そしてこの溶液を濾過し、遠
心し、そして濾液して水溶液中の分散した固体を除去し
た。濾過した水溶液を濃縮し、そして残留物を塩化メチ
レン中に取り、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この
溶液を濾過した。濾液を冷エーテルで処理した。生ずる
沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。収量
３．３ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７１３、１６８０。この
化合物を２５％のピペラジン（塩化メチレン中）で３０
分間処理することによって、Ｆｍｏｃ基を除去した。冷
エーテルをこの溶液に添加して、ｍＰＥＧ−誘導体を沈
澱させた。沈澱を集め、洗浄し、そして乾燥した。１．
４ｇのｍＰＥＧ−誘導体を３ｍｌのジクロロメタンで溶
解させ、そして１ｍｌの酢酸無水物を添加することによ
って、遊離アルファアミノ基をアセチル化した。室温に
おいて１．７時間後、この溶液を濃縮した。生ずる固体
を塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（５：３）で処理
した。溶媒を除去し、そして生ずる油を塩化メチレン中
に取り、そして冷エーテルを添加した。形成した沈澱を
集め、洗浄し、そして乾燥した。収量１．１ｇ。ＩＲ
（Ｃ＝Ｏ）：１６８５。ｍＰＥＧ−誘導体を３ｍｌの乾
燥塩化メチレン中に溶解し、そしてトリエチルアミン
（０．５４ｍｌ、３．８４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで
トルエン中の１ｍｌのホスゲン（１．９２ｍｍｏｌ）お
よび追加の２ｍｌの乾燥塩化メチレンを添加した。反応
を室温において一夜進行させ、次いで溶媒を除去した。
残留物を３ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして
０．２ｍｌのヒドラゾン（５．７６ｍｍｏｌ）を添加し
た。溶液が透明になるまで、乾燥メタノールを添加した
（３．４ｍｌ）。室温において４時間後、この溶液を遠
心により透明にし、そして濃縮した。この化合物をＬＨ
−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量０．７
ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６７５。
成 ｍＰＥＧ−０００−アミン（５．０ｇ、１ｍｍｏｌ）を
５ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして１０ｍｌ
の乾燥ジメチルホルムアミドを添加した。Ｆｍｏｃ−Ｏ
ｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ（３．１ｇ、５ｍｍｏｌ）を
添加した。室温において１時間後、この溶液を濃縮し
た。水を残留物に添加し、そしてこの溶液を濾過し、遠
心し、そして濾液して水溶液中の分散した固体を除去し
た。濾過した水溶液を濃縮し、そして残留物を塩化メチ
レン中に取り、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この
溶液を濾過した。濾液を冷エーテルで処理した。生ずる
沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。収量
３．３ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１７１３、１６８０。この
化合物を２５％のピペラジン（塩化メチレン中）で３０
分間処理することによって、Ｆｍｏｃ基を除去した。冷
エーテルをこの溶液に添加して、ｍＰＥＧ−誘導体を沈
澱させた。沈澱を集め、洗浄し、そして乾燥した。１．
４ｇのｍＰＥＧ−誘導体を３ｍｌのジクロロメタンで溶
解させ、そして１ｍｌの酢酸無水物を添加することによ
って、遊離アルファアミノ基をアセチル化した。室温に
おいて１．７時間後、この溶液を濃縮した。生ずる固体
を塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（５：３）で処理
した。溶媒を除去し、そして生ずる油を塩化メチレン中
に取り、そして冷エーテルを添加した。形成した沈澱を
集め、洗浄し、そして乾燥した。収量１．１ｇ。ＩＲ
（Ｃ＝Ｏ）：１６８５。ｍＰＥＧ−誘導体を３ｍｌの乾
燥塩化メチレン中に溶解し、そしてトリエチルアミン
（０．５４ｍｌ、３．８４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで
トルエン中の１ｍｌのホスゲン（１．９２ｍｍｏｌ）お
よび追加の２ｍｌの乾燥塩化メチレンを添加した。反応
を室温において一夜進行させ、次いで溶媒を除去した。
残留物を３ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして
０．２ｍｌのヒドラゾン（５．７６ｍｍｏｌ）を添加し
た。溶液が透明になるまで、乾燥メタノールを添加した
（３．４ｍｌ）。室温において４時間後、この溶液を遠
心により透明にし、そして濃縮した。この化合物をＬＨ
−２０カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル／塩化メチレン（５：１）で溶離した。収量０．７
ｇ。ＩＲ（Ｃ＝Ｏ）：１６７５。
【０１１３】本発明を説明したが、次の実施例により本
発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しな
い。
発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しな
い。
【０１１４】
【実施例】ＥＰＯの変性（ヒドラジド法） 典型的な実験において、ＥＰＯ（０．５〜１．０ｍｇ）
（オーソ・バイオテク（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
を合計のｖｌｍ０．７８６ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナト
リウムｐＨ５．６の中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム
の十分な１０ｍｇ／ｍｌの溶液を添加して、過ヨウ素酸
ナトリウムの最終濃度を１０ｍＭにした。酸化を暗所で
０℃において３０分間進行させ、次いで０．３３ｍｌの
８０ｍＭのＮａ2ＣＯ3を添加した。５分後、この溶液を
濃縮し、そしてマイクロコンセントレイター中で１００
ｍＭの酢酸ナトリウムで３回洗浄した。最後の濃縮後、
酸化したＥＰＯ溶液を１００ｍＭの酢酸ナトリウムで
１．０ｍｌにした。ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジド（５
０ｍｇ）を酸化したＥＰＯに添加した。この混合物を室
温において一夜撹拌した。ｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯを
セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００−ＨＲ
カラム（１ｍｍ×４５ｍｍ）のゲル濾過により精製し、
０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝
液で溶離した。ｍＰＥＧ変性ＥＰＯの量をソルバックス
（ＺｏｒｂａｘR）ＧＦ−２５０またはＧＦ−４５０カ
ラムのＨＰＬＣゲル濾過により決定し、０．１Ｍのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７を使用した。６〜１２分子のｍＰＥＧ
がＥＰＯの各分子に結合していることが分かった。
（オーソ・バイオテク（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
を合計のｖｌｍ０．７８６ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナト
リウムｐＨ５．６の中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム
の十分な１０ｍｇ／ｍｌの溶液を添加して、過ヨウ素酸
ナトリウムの最終濃度を１０ｍＭにした。酸化を暗所で
０℃において３０分間進行させ、次いで０．３３ｍｌの
８０ｍＭのＮａ2ＣＯ3を添加した。５分後、この溶液を
濃縮し、そしてマイクロコンセントレイター中で１００
ｍＭの酢酸ナトリウムで３回洗浄した。最後の濃縮後、
酸化したＥＰＯ溶液を１００ｍＭの酢酸ナトリウムで
１．０ｍｌにした。ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジド（５
０ｍｇ）を酸化したＥＰＯに添加した。この混合物を室
温において一夜撹拌した。ｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯを
セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００−ＨＲ
カラム（１ｍｍ×４５ｍｍ）のゲル濾過により精製し、
０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝
液で溶離した。ｍＰＥＧ変性ＥＰＯの量をソルバックス
（ＺｏｒｂａｘR）ＧＦ−２５０またはＧＦ−４５０カ
ラムのＨＰＬＣゲル濾過により決定し、０．１Ｍのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７を使用した。６〜１２分子のｍＰＥＧ
がＥＰＯの各分子に結合していることが分かった。
【０１１５】ＥＰＯの変性（セミカルバジド法） 上のヒドラジド法と同一の手順を実施したが、ただし酸
化の反応時間を５分に減少し、そしてｍＰＥＧ−ヒドラ
ジドの量（５０ｍｇ）と比較して少ない量のｍＰＥＧ−
セミカルバジド（１０ｍｇ）を使用した。酸化時間を短
縮しかつより少ない量のｍＰＥＧを添加したにもかかわ
らず、より多くの（約１８）ｍＰＥＧ分子がＥＰＯに結
合した。より長い酸化時間（１５分）を使用しそしてよ
り多いｍＰＥＧ−セミカルバジドを添加する場合、使用
するｍＰＥＧの分子量に依存して約３０ｍＰＥＧ分子を
ＥＰＯに結合することができる。こうしてｍＰＥＧ−セ
ミカルバジドはｍＰＥＧ−ヒドラジドより反応性である
ように思われ、そして同様な反応条件下にｍＰＥＧ−ヒ
ドラジドで可能であるより多数のより多くのｍＰＥＧ分
子をＥＰＯに結合することができる。
化の反応時間を５分に減少し、そしてｍＰＥＧ−ヒドラ
ジドの量（５０ｍｇ）と比較して少ない量のｍＰＥＧ−
セミカルバジド（１０ｍｇ）を使用した。酸化時間を短
縮しかつより少ない量のｍＰＥＧを添加したにもかかわ
らず、より多くの（約１８）ｍＰＥＧ分子がＥＰＯに結
合した。より長い酸化時間（１５分）を使用しそしてよ
り多いｍＰＥＧ−セミカルバジドを添加する場合、使用
するｍＰＥＧの分子量に依存して約３０ｍＰＥＧ分子を
ＥＰＯに結合することができる。こうしてｍＰＥＧ−セ
ミカルバジドはｍＰＥＧ−ヒドラジドより反応性である
ように思われ、そして同様な反応条件下にｍＰＥＧ−ヒ
ドラジドで可能であるより多数のより多くのｍＰＥＧ分
子をＥＰＯに結合することができる。
【０１１６】炭水化物基上またはアミノ酸側鎖上におい
てｍＰＥＧでＥＰＯを変性する効果の比較は図１に示さ
れている。分析用ＨＰＬＣゲル濾過の条件を前述と同一
である。未変性のＥＰＯのクロマトグラムは図１ａに表
されている。１０．５分の保持時間をもつピークが見い
だされる。ＥＰＯをその炭水化物基上においてｍＰＥＧ
５０００で変性するとき（図１ｂ）、９．４分の保持時
間をもつ単一の大きいピークが未精製の反応生成物につ
いて見られる。リジンの側鎖と反応するｍＰＥＧ５００
０のスクシンイミドエステルとＥＰＯを反応させると
き、反応生成物の不均質塩化メチレンが得られる（７．
５〜１０．５分のピーク）。ＣＳＦ−１、インターロイ
キン−２およびβ−インターフェロンへのスクシンイミ
ドのカップリングを使用するｍＰＥＧの変性について同
様な不均質パターンが見いだされた（米国特許第４，８
４７，３２５号および米国特許第４，９１７，８８８
号）。また、スクシンイミドのカップリングでより低い
分子量の不純物が存在する（図１ｃ）。ｍＰＥＧのスク
シンイミド誘導体を使用する活性エステルのカップリン
グは、タンパク質にｍＰＥＧを結合する好ましい方法で
あった［ヌチ（Ｎｕｃｃｉ）、Ｍ．Ｌ．、ショル（Ｓｈ
ｏｒｒ）、Ｒ．およびアブチョウスキ（Ａｂｕｃｈｏｗ
ｓｋｉ）、Ａ．（１９９１）アドバンスド・ドラッグ・
デリバリー・リビューズ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ Ｒｅｖ．）、６、１３３−１５１］。また、
ＥＰＯを前述のセミカルバジド法を使用してｍＰＥＧ５
０００で誘導化した、生物学的実験の結果について図４
を参照。また、前述のセミカルバジド法を使用して、ｍ
ＰＥＧ１２０００で変性したＥＰＯ（図３参照）および
ｍＰＥＧ２０００で変性したＥＰＯ（図１０参照）を得
た。
てｍＰＥＧでＥＰＯを変性する効果の比較は図１に示さ
れている。分析用ＨＰＬＣゲル濾過の条件を前述と同一
である。未変性のＥＰＯのクロマトグラムは図１ａに表
されている。１０．５分の保持時間をもつピークが見い
だされる。ＥＰＯをその炭水化物基上においてｍＰＥＧ
５０００で変性するとき（図１ｂ）、９．４分の保持時
間をもつ単一の大きいピークが未精製の反応生成物につ
いて見られる。リジンの側鎖と反応するｍＰＥＧ５００
０のスクシンイミドエステルとＥＰＯを反応させると
き、反応生成物の不均質塩化メチレンが得られる（７．
５〜１０．５分のピーク）。ＣＳＦ−１、インターロイ
キン−２およびβ−インターフェロンへのスクシンイミ
ドのカップリングを使用するｍＰＥＧの変性について同
様な不均質パターンが見いだされた（米国特許第４，８
４７，３２５号および米国特許第４，９１７，８８８
号）。また、スクシンイミドのカップリングでより低い
分子量の不純物が存在する（図１ｃ）。ｍＰＥＧのスク
シンイミド誘導体を使用する活性エステルのカップリン
グは、タンパク質にｍＰＥＧを結合する好ましい方法で
あった［ヌチ（Ｎｕｃｃｉ）、Ｍ．Ｌ．、ショル（Ｓｈ
ｏｒｒ）、Ｒ．およびアブチョウスキ（Ａｂｕｃｈｏｗ
ｓｋｉ）、Ａ．（１９９１）アドバンスド・ドラッグ・
デリバリー・リビューズ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ Ｒｅｖ．）、６、１３３−１５１］。また、
ＥＰＯを前述のセミカルバジド法を使用してｍＰＥＧ５
０００で誘導化した、生物学的実験の結果について図４
を参照。また、前述のセミカルバジド法を使用して、ｍ
ＰＥＧ１２０００で変性したＥＰＯ（図３参照）および
ｍＰＥＧ２０００で変性したＥＰＯ（図１０参照）を得
た。
【０１１７】ＥＰＯを、また、ｍＰＥＧのチオセミカル
バジド、ヒドラジドカルボキシレートおよび炭酸ジヒド
ラジドの誘導体で変性した。ｍＰＥＧのこれらの誘導体
はｍＰＥＧのセミカルバジド誘導体に似た性能を示し、
ｍＰＥＧのヒドラジドと比較したとき、これらの誘導体
を使用して高いレベルのＥＰＯへのｍＰＥＧのカップリ
ングを得ることができた。ＥＰＯの酸化の他の条件、例
えば、温度の増加、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度の増
加、および反応時間の増加または減少は、これらの酸化
条件がＥＰＯの生物学的活性を損なわないかい、使用す
ることができる。ＥＰＯの大規模の変性(セミカルバジドまたはカルボキ
シレートヒドラジド法) ＥＰＯ（１２．０ｍｇ）（オーソ・バイオテク（Ｏｒｔ
ｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手した）を合計の体積
１．８ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５の
中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム（０．２１５ｍｌ）
を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。酸化を暗所で０℃
において２０分間進行させ、次いで０．０２ｍｌのエチ
レングリコールを添加し、そしてこの混合物を０℃にお
いて１０分間撹拌した。酸化したＥＰＯをセファデック
ス（ＳｅｐｈａｄｅｘR） Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ
×９ｃｍ）のゲル濾過により精製し、そして１００ｍＭ
の酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．３で溶離した。溶離さ
れた酸化ＥＰＯ（１０〜１１ｍｌ）をプールした。ｍＰ
ＥＧ５０００セミカルバジド（１００ｍｇ）を精製した
酸化ＥＰＯに添加した。この混合物を室温において一夜
撹拌した。ｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯをセファクリル
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００−ＨＲカラムのゲル
濾過により精製し、０．２ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍの
クエン酸ナトリウム、０．０２５％のアジ化ナトリウム
を含有する緩衝液ｐＨ７．０で溶離した。２００ｍｇの
ｍＰＥＧ５０００セミカルバジドを使用して、上の変性
を反復した。反応性は約２２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子
であった。
バジド、ヒドラジドカルボキシレートおよび炭酸ジヒド
ラジドの誘導体で変性した。ｍＰＥＧのこれらの誘導体
はｍＰＥＧのセミカルバジド誘導体に似た性能を示し、
ｍＰＥＧのヒドラジドと比較したとき、これらの誘導体
を使用して高いレベルのＥＰＯへのｍＰＥＧのカップリ
ングを得ることができた。ＥＰＯの酸化の他の条件、例
えば、温度の増加、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度の増
加、および反応時間の増加または減少は、これらの酸化
条件がＥＰＯの生物学的活性を損なわないかい、使用す
ることができる。ＥＰＯの大規模の変性(セミカルバジドまたはカルボキ
シレートヒドラジド法) ＥＰＯ（１２．０ｍｇ）（オーソ・バイオテク（Ｏｒｔ
ｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手した）を合計の体積
１．８ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５の
中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム（０．２１５ｍｌ）
を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。酸化を暗所で０℃
において２０分間進行させ、次いで０．０２ｍｌのエチ
レングリコールを添加し、そしてこの混合物を０℃にお
いて１０分間撹拌した。酸化したＥＰＯをセファデック
ス（ＳｅｐｈａｄｅｘR） Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ
×９ｃｍ）のゲル濾過により精製し、そして１００ｍＭ
の酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．３で溶離した。溶離さ
れた酸化ＥＰＯ（１０〜１１ｍｌ）をプールした。ｍＰ
ＥＧ５０００セミカルバジド（１００ｍｇ）を精製した
酸化ＥＰＯに添加した。この混合物を室温において一夜
撹拌した。ｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯをセファクリル
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００−ＨＲカラムのゲル
濾過により精製し、０．２ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍの
クエン酸ナトリウム、０．０２５％のアジ化ナトリウム
を含有する緩衝液ｐＨ７．０で溶離した。２００ｍｇの
ｍＰＥＧ５０００セミカルバジドを使用して、上の変性
を反復した。反応性は約２２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子
であった。
【０１１８】上で特定した反応成分の半分の量を使用
し、２００ｍｇのカルボキシレートヒドラジドを使用し
て、上の変性を反復した。反応性は約３０ｍＰＥＧ分子
／ＥＰＯ分子であった。
し、２００ｍｇのカルボキシレートヒドラジドを使用し
て、上の変性を反復した。反応性は約３０ｍＰＥＧ分子
／ＥＰＯ分子であった。
【０１１９】ＥＰＯの変性（オキシム法） Ａ．ｍＰＥＧ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ
Ｈ2 上の大規模のセミカルバジド法について同一の手順を実
施した。しかしながら、ｍＰＥＧ５０００セミカルバジ
ドの添加の代わりに、ｍＰＥＧ５０００−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（５０ｍｇ）を、２．１５
ｍｌの酸化ＥＰＯと室温において一夜混合した。ｍＰＥ
Ｇ５０００−ＥＰＯをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）Ｓ−２００−ＨＲカラムのゲル濾過により精製し、
０．２ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウ
ム、０．０２５％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液
ｐＨ７で溶離した。フェノメネックス・バイオセプ（Ｐ
ｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｂｉｏｓｅｐ）−Ｓｅｃ−Ｓ４０
００カラム（３０ｃｍ×０．０１７ｃｍ）を使用するＨ
ＰＬＣゲル濾過により決定して、約３１分子のｍＰＥＧ
５０００がＥＰＯの各分子に結合していることが分かっ
た。２５分子のｍＰＥＧ−ＥＰＯから成る少量の分画が
また単離され、そして生物学的試験のために使用した。
図１６、１８および１９を参照。
Ｈ2 上の大規模のセミカルバジド法について同一の手順を実
施した。しかしながら、ｍＰＥＧ５０００セミカルバジ
ドの添加の代わりに、ｍＰＥＧ５０００−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（５０ｍｇ）を、２．１５
ｍｌの酸化ＥＰＯと室温において一夜混合した。ｍＰＥ
Ｇ５０００−ＥＰＯをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）Ｓ−２００−ＨＲカラムのゲル濾過により精製し、
０．２ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウ
ム、０．０２５％のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液
ｐＨ７で溶離した。フェノメネックス・バイオセプ（Ｐ
ｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｂｉｏｓｅｐ）−Ｓｅｃ−Ｓ４０
００カラム（３０ｃｍ×０．０１７ｃｍ）を使用するＨ
ＰＬＣゲル濾過により決定して、約３１分子のｍＰＥＧ
５０００がＥＰＯの各分子に結合していることが分かっ
た。２５分子のｍＰＥＧ−ＥＰＯから成る少量の分画が
また単離され、そして生物学的試験のために使用した。
図１６、１８および１９を参照。
【０１２０】Ｂ．ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−ＯＮＨ2 ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2を使
用して、上のＥＰＯの変性を反復した。上の変性Ａにお
ける方法を使用して決定して、約１８〜１９分子のｍＰ
ＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合していることが分
かった。生物学的データを図１６、１８および１９に示
す。
Ｏ−ＯＮＨ2 ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2を使
用して、上のＥＰＯの変性を反復した。上の変性Ａにお
ける方法を使用して決定して、約１８〜１９分子のｍＰ
ＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合していることが分
かった。生物学的データを図１６、１８および１９に示
す。
【０１２１】Ｃ．ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2 ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2を使用して、上の
ＥＰＯの変性を反復した。上の変性Ａにおける方法を使
用して決定して、約１７分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰ
Ｏの各分子に結合していることが分かった。２２ｍＰＥ
Ｇ、１２ｍＰＥＧの２つの少量の分画がまた単離された
（を図１６、１８および１９）。
ＥＰＯの変性を反復した。上の変性Ａにおける方法を使
用して決定して、約１７分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰ
Ｏの各分子に結合していることが分かった。２２ｍＰＥ
Ｇ、１２ｍＰＥＧの２つの少量の分画がまた単離された
（を図１６、１８および１９）。
【０１２２】Ｄ．ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−Ｏ
ＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｏ−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯの変性を反復し
た。上の変性Ａにおける方法を使用して決定して、約３
分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合してい
ることが分かった。
ＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｏ−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯの変性を反復し
た。上の変性Ａにおける方法を使用して決定して、約３
分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合してい
ることが分かった。
【０１２３】Ｅ．ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ（Ｏ
Ｈ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｈ（ＯＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯ
の変性を反復した。上の変性Ａにおける方法を使用して
決定して、約３１分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各
分子に結合していることが分かった。
Ｈ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｈ（ＯＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯ
の変性を反復した。上の変性Ａにおける方法を使用して
決定して、約３１分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各
分子に結合していることが分かった。
【０１２４】Ｆ．ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ
Ｓ−ＯＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＳ−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯの変性を反
復した。上の変性Ａにおける方法を使用して決定して、
約４分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合し
ていることが分かった。
Ｓ−ＯＮＨ2 ＰＥＧ−オキシム誘導体ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＳ−ＯＮＨ2を使用して、上のＥＰＯの変性を反
復した。上の変性Ａにおける方法を使用して決定して、
約４分子のｍＰＥＧ５０００がＥＰＯの各分子に結合し
ていることが分かった。
【０１２５】ｍＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活性 変性したタンパク質の注射後に発生した赤血球の増加を
測定することによって、ｍＰＥＧ−ＥＰＯ誘導体をｉｎ
ｖｉｖｏの生物学的活性について検定した（エグリエ
（Ｅｇｒｉｅ）、Ｊ．Ｃ．、ストリックランド（Ｓｔｒ
ｉｃｋｌａｎｄ）、Ｔ．Ｗ．、レイン（Ｌａｎｅ）、
Ｊ．、アオキ、Ｋ．、コウヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ａ．
Ｍ．、スモーリング（Ｓｍａｌｌｉｎｇ）、Ｒ．、トレ
イル（Ｔｒａｉｌ）、Ｇ．、リン（Ｌｉｎ）、Ｆ．
Ｋ．、ブロウネ（Ｂｒｏｗｎｅ）、Ｊ．Ｋ．およびハイ
ネス（Ｈｉｎｅｓ）、Ｄ．Ｋ．（１９８６）イムノバイ
オロジー（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．）１７２：２１３−
２２４）。簡単に述べると、マウス（雌のＣＤ−１、週
齢８）に０．４μｇのタンパク質を連続する２日間に１
日１回腹腔内または皮下に注射した。血液をヘマトクリ
ットの読みのために抜き出した。
測定することによって、ｍＰＥＧ−ＥＰＯ誘導体をｉｎ
ｖｉｖｏの生物学的活性について検定した（エグリエ
（Ｅｇｒｉｅ）、Ｊ．Ｃ．、ストリックランド（Ｓｔｒ
ｉｃｋｌａｎｄ）、Ｔ．Ｗ．、レイン（Ｌａｎｅ）、
Ｊ．、アオキ、Ｋ．、コウヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ａ．
Ｍ．、スモーリング（Ｓｍａｌｌｉｎｇ）、Ｒ．、トレ
イル（Ｔｒａｉｌ）、Ｇ．、リン（Ｌｉｎ）、Ｆ．
Ｋ．、ブロウネ（Ｂｒｏｗｎｅ）、Ｊ．Ｋ．およびハイ
ネス（Ｈｉｎｅｓ）、Ｄ．Ｋ．（１９８６）イムノバイ
オロジー（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．）１７２：２１３−
２２４）。簡単に述べると、マウス（雌のＣＤ−１、週
齢８）に０．４μｇのタンパク質を連続する２日間に１
日１回腹腔内または皮下に注射した。血液をヘマトクリ
ットの読みのために抜き出した。
【０１２６】ｍＰＥＧのヒドラジド誘導体を介して結合
したｍＰＥＧ−ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏの生物学的活性
（ヘマトクリットのレベル）を図２、４および５および
表ＩおよびＩＩに示す。発見を要約すると、図２および
５が示すように、ｍＰＥＧのカップリングの最適な数は
明らかでなく、そして最良のｍＰＥＧ−ＥＰＯを得るた
めに合成および生物学的試験により決定しなくてはなら
ない。図４はヒドラジドおよびセミカルバジドのリンカ
ーを使用するｍＰＥＧのカップリングを比較する。ｍＰ
ＥＧ−ＥＰＯについてのより高くかつより長いヘマトク
リットのレベルは、セミカルバジドのリンカーを使用し
て得ることができた。観察された結果は、一部分、セミ
カルバジドのリンカーを使用して得ることができるｍＰ
ＥＧの組み込みのより高いレベルのためである。表Ｉ
は、組み込まれたｍＰＥＧの数および使用したｍＰＥＧ
の分子量の関数として、ｍＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活
性を示す。
したｍＰＥＧ−ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏの生物学的活性
（ヘマトクリットのレベル）を図２、４および５および
表ＩおよびＩＩに示す。発見を要約すると、図２および
５が示すように、ｍＰＥＧのカップリングの最適な数は
明らかでなく、そして最良のｍＰＥＧ−ＥＰＯを得るた
めに合成および生物学的試験により決定しなくてはなら
ない。図４はヒドラジドおよびセミカルバジドのリンカ
ーを使用するｍＰＥＧのカップリングを比較する。ｍＰ
ＥＧ−ＥＰＯについてのより高くかつより長いヘマトク
リットのレベルは、セミカルバジドのリンカーを使用し
て得ることができた。観察された結果は、一部分、セミ
カルバジドのリンカーを使用して得ることができるｍＰ
ＥＧの組み込みのより高いレベルのためである。表Ｉ
は、組み込まれたｍＰＥＧの数および使用したｍＰＥＧ
の分子量の関数として、ｍＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活
性を示す。
【０１２７】使用したｍＰＥＧの分子量およびカップリ
ングしたｍＰＥＧの量を比較する、異なるヒドラジドｍ
ＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活性を表Ｉに要約する。
ングしたｍＰＥＧの量を比較する、異なるヒドラジドｍ
ＰＥＧ−ＥＰＯの生物学的活性を表Ｉに要約する。
【０１２８】使用した異なるｍＰＥＧヒドラジドのリン
カーが表ＩＩにおいて比較されている。最適な量のｍＰ
ＥＧが組み込まれた異なるｍＰＥＧ５０００−ヒドラジ
ド誘導体で変性されたＥＰＯの生物学的活性を、表ＩＩ
に要約する。最適な量のｍＰＥＧまたは他の因子と十分
にカップリングすることができないために、すべての炭
水化物ｍＰＥＧ誘導体が、ＥＰＯにカップリングしたと
き、同一の生物学的活性を示すわけではない。生物学的
活性は各リンカーについて得られた最良の値である。
カーが表ＩＩにおいて比較されている。最適な量のｍＰ
ＥＧが組み込まれた異なるｍＰＥＧ５０００−ヒドラジ
ド誘導体で変性されたＥＰＯの生物学的活性を、表ＩＩ
に要約する。最適な量のｍＰＥＧまたは他の因子と十分
にカップリングすることができないために、すべての炭
水化物ｍＰＥＧ誘導体が、ＥＰＯにカップリングしたと
き、同一の生物学的活性を示すわけではない。生物学的
活性は各リンカーについて得られた最良の値である。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
【０１３１】マウスにおけるＥＰＯおよびｍＰＥＧ５０
００−ＥＰＯのヘマトクリットのレベルを図２に示す。
１２ＰＥＧ−ＥＰＯをｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドの
カップリングより作り、そしてこれは前述の実験の条件
下にこのｍＰＥＧ誘導体により達成できる最大の組み込
みを反映する。１８ＰＥＧおよび２８ＰＥＧのＥＰＯ
を、ｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドとのカップリン
グにより作った。ｍＰＥＧのセミカルバジド誘導体は、
このｍＰＥＧ誘導体を使用して組み込むことができるｍ
ＰＥＧの量が大きいために、ｍＰＥＧのヒドラジド誘導
体より非常にいっそうすぐれた生物学的活性を生ずる。
すべての３つのｍＰＥＧ−ＥＰＯは、天然のＥＰＯと比
較したとき、増加した最大の活性および延長した活性を
示す。こうして、タンパク質の炭水化物基をＰＥＧで変
性すると、非常にいっそう効力のある治療用タンパク質
を生成することができる。
００−ＥＰＯのヘマトクリットのレベルを図２に示す。
１２ＰＥＧ−ＥＰＯをｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドの
カップリングより作り、そしてこれは前述の実験の条件
下にこのｍＰＥＧ誘導体により達成できる最大の組み込
みを反映する。１８ＰＥＧおよび２８ＰＥＧのＥＰＯ
を、ｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドとのカップリン
グにより作った。ｍＰＥＧのセミカルバジド誘導体は、
このｍＰＥＧ誘導体を使用して組み込むことができるｍ
ＰＥＧの量が大きいために、ｍＰＥＧのヒドラジド誘導
体より非常にいっそうすぐれた生物学的活性を生ずる。
すべての３つのｍＰＥＧ−ＥＰＯは、天然のＥＰＯと比
較したとき、増加した最大の活性および延長した活性を
示す。こうして、タンパク質の炭水化物基をＰＥＧで変
性すると、非常にいっそう効力のある治療用タンパク質
を生成することができる。
【０１３２】実験において使用した種々のｍＰＥＧヒド
ラジド変性ＥＰＯのヘマトクリットのレベルへの作用に
ついての追加のデータについて、図８〜１５を参照のこ
と。図８〜１５に示された実験において使用したｍＰＥ
Ｇ変性ＥＰＯは、図２〜５に示す実験において使用した
他のｍＰＥＧ変性ＥＰＯ分子について本質的に記載し
た、適当な水溶性ポリマーの試薬を使用して調製した。
ラジド変性ＥＰＯのヘマトクリットのレベルへの作用に
ついての追加のデータについて、図８〜１５を参照のこ
と。図８〜１５に示された実験において使用したｍＰＥ
Ｇ変性ＥＰＯは、図２〜５に示す実験において使用した
他のｍＰＥＧ変性ＥＰＯ分子について本質的に記載し
た、適当な水溶性ポリマーの試薬を使用して調製した。
【０１３３】ｍＰＥＧのオキシム形成誘導体を介して結
合したｍＰＥＧ−ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性
（ヘマトクリットのレベル）を、図１６および１７に示
す。要約すると、図１６においてｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2
ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2（「Ａ」）およびｍＰＥＧ
−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｃ」）リンカーを使用するｍＰＥＧのカップリン
グが比較されている。ｍＰＥＧ−ＥＰＯのより高いヘマ
トクリットのレベルは、３１ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子
を有する「Ｃ」リンカー（ここにおいて式ＸＸＸＩＩＩ
に相当する）に比較して、１８ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分
子を有する「Ａ」リンカー（ここにおいて式ＸＸＸに相
当する）を使用して得ることができる。また、３１ｍＰ
ＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有する同一のリンカーに比較し
て、２５ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有する「Ｃ」リン
カー（ここにおいて式ＸＸＸＩＩＩ）のより高いヘマト
クリット活性は注目に値する。
合したｍＰＥＧ−ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性
（ヘマトクリットのレベル）を、図１６および１７に示
す。要約すると、図１６においてｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2
ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2（「Ａ」）およびｍＰＥＧ
−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｃ」）リンカーを使用するｍＰＥＧのカップリン
グが比較されている。ｍＰＥＧ−ＥＰＯのより高いヘマ
トクリットのレベルは、３１ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子
を有する「Ｃ」リンカー（ここにおいて式ＸＸＸＩＩＩ
に相当する）に比較して、１８ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分
子を有する「Ａ」リンカー（ここにおいて式ＸＸＸに相
当する）を使用して得ることができる。また、３１ｍＰ
ＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有する同一のリンカーに比較し
て、２５ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有する「Ｃ」リン
カー（ここにおいて式ＸＸＸＩＩＩ）のより高いヘマト
クリット活性は注目に値する。
【０１３４】図１７において、２２、１７および１２ｍ
ＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子のｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮＨ2（式ＸＸＩＩＩ）を使用するｍＰＥＧのカップ
リングが比較されている。最高のヘマトクリットのレベ
ルは最低のペギレイション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）の
程度において得られ、そしてヘマトクリットはペギレイ
ションの程度に逆比例して減少した。しかしながら、ｍ
ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2を使用するすべての
ｍＰＥＧリンカーにおいて、天然のＥＰＯに比較してよ
り高くかつ期間が増加した。
ＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子のｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮＨ2（式ＸＸＩＩＩ）を使用するｍＰＥＧのカップ
リングが比較されている。最高のヘマトクリットのレベ
ルは最低のペギレイション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）の
程度において得られ、そしてヘマトクリットはペギレイ
ションの程度に逆比例して減少した。しかしながら、ｍ
ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2を使用するすべての
ｍＰＥＧリンカーにおいて、天然のＥＰＯに比較してよ
り高くかつ期間が増加した。
【０１３５】式ＸＸＩＩＩの１２ｍＰＥＧ−ＥＰＯの生
物学的活性はことに注目に値する。ヒドラジド誘導体１
２ｍＰＥＧ−ＥＰＯは、オキシルアミン誘導化ＥＰＯの
それのようなヘマトクリットの増加の程度および期間を
生成しない。
物学的活性はことに注目に値する。ヒドラジド誘導体１
２ｍＰＥＧ−ＥＰＯは、オキシルアミン誘導化ＥＰＯの
それのようなヘマトクリットの増加の程度および期間を
生成しない。
【０１３６】ｍＰＥＧ−ＥＰＯへの抗体の結合 クリニゲン（ＣｌｉｎｉｇｅｎR）エリトロポイエチン
（ＥＰＯ）ＥＩＡ試験キットを使用して、ｍＰＥＧ−Ｅ
ＰＯの抗原性を決定した。簡単に述べると、このアッセ
イはＥＰＯに対してモノクローナル抗体で被覆したマイ
クロタイタープレートから成る。ＥＰＯまたはｍＰＥＧ
−ＥＰＯを被覆したプレートと相互作用させた。プレー
トを洗浄後、標識化したＥＰＯに対するポリクローナル
抗体をプレート上でインキュベーションした。基質の展
開後、プレートを読む。
（ＥＰＯ）ＥＩＡ試験キットを使用して、ｍＰＥＧ−Ｅ
ＰＯの抗原性を決定した。簡単に述べると、このアッセ
イはＥＰＯに対してモノクローナル抗体で被覆したマイ
クロタイタープレートから成る。ＥＰＯまたはｍＰＥＧ
−ＥＰＯを被覆したプレートと相互作用させた。プレー
トを洗浄後、標識化したＥＰＯに対するポリクローナル
抗体をプレート上でインキュベーションした。基質の展
開後、プレートを読む。
【０１３７】ヒドラジド誘導化ＥＰＯについてのＥＬＩ
ＳＡアッセイの結果を図３に示す。ｍＰＥＧ−ＥＰＯ
は、所定の分子量のｍＰＥＧについて結合した概算の数
として、表されている。例えば、１２ＰＥＧ−５Ｋは、
約１２分子の約５０００の分子量のｍＰＥＧがＥＰＯの
各分子にカップリングしたことを意味する。データが示
すように、ＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が増
加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。同様
にＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が増加するに
つれて、変性したＥＰＯの抗原性、すなわち、抗体の結
合は減少する。酸化したＥＰＯをｍＰＥＧのヒドラジド
誘導体と反応させることは、セミカルバジド、チオセミ
カルバジドおよび炭酸ジヒドラジドのＰＥＧ誘導体で見
られる高いカップリングレベルに到達しなかった。タン
パク質の抗原性の減少は、タンパク質の免疫原性の減少
と同様によく相関関係をもつ。こうして、ＥＰＯの炭水
化物基にカップリングしたｍＰＥＧ−ＥＰＯはタンパク
質に関係する潜在的な免疫原性を減少することがあり、
高いレベルでカップリングすることができるｍＰＥＧの
誘導体は最も有効である。
ＳＡアッセイの結果を図３に示す。ｍＰＥＧ−ＥＰＯ
は、所定の分子量のｍＰＥＧについて結合した概算の数
として、表されている。例えば、１２ＰＥＧ−５Ｋは、
約１２分子の約５０００の分子量のｍＰＥＧがＥＰＯの
各分子にカップリングしたことを意味する。データが示
すように、ＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が増
加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。同様
にＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が増加するに
つれて、変性したＥＰＯの抗原性、すなわち、抗体の結
合は減少する。酸化したＥＰＯをｍＰＥＧのヒドラジド
誘導体と反応させることは、セミカルバジド、チオセミ
カルバジドおよび炭酸ジヒドラジドのＰＥＧ誘導体で見
られる高いカップリングレベルに到達しなかった。タン
パク質の抗原性の減少は、タンパク質の免疫原性の減少
と同様によく相関関係をもつ。こうして、ＥＰＯの炭水
化物基にカップリングしたｍＰＥＧ−ＥＰＯはタンパク
質に関係する潜在的な免疫原性を減少することがあり、
高いレベルでカップリングすることができるｍＰＥＧの
誘導体は最も有効である。
【０１３８】ｍＰＥＧヒドラジド誘導体を使用する追加
のデータについては、図６を参照のこと。
のデータについては、図６を参照のこと。
【０１３９】オキシム誘導化ＥＰＯについてのＥＬＩＳ
Ａアッセイの結果は、図１８に示されている。データが
示すように、ＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が
増加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。比
較的低いカップリングレベルを生じたリンカー（１８Ｐ
ＥＧ−Ａ、１７ＰＥＧ−Ｂ、１２ＰＥＧ−Ｂ）と酸化し
たＥＰＯと反応させることは、比較的高いカップリング
レベルの配合物（２２ＰＥＧ−Ｂ、２５ＰＥＧ−Ｃおよ
び３１ＰＥＧ−Ｃ）で見られるような、免疫原性の大き
い減少を与えなかった。免疫原性を減少するタンパク質
の能力のこれらの差は、カップリングレベルに大きく基
づいて決定されるように思われることに注意すべきであ
る。（例えば、１２ＰＥＧ−Ｂおよび２２ＰＥＧ−Ｂの
比較）。こうして、オキシム結合を通してＥＰＯの炭水
化物基にカップリングしたｍＰＥＧはタンパク質に関係
する潜在的な免疫原性を減少することがあり、高いレベ
ルでカップリングすることができるｍＰＥＧの誘導体は
最も有効である。
Ａアッセイの結果は、図１８に示されている。データが
示すように、ＥＰＯにカップリングするｍＰＥＧの数が
増加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。比
較的低いカップリングレベルを生じたリンカー（１８Ｐ
ＥＧ−Ａ、１７ＰＥＧ−Ｂ、１２ＰＥＧ−Ｂ）と酸化し
たＥＰＯと反応させることは、比較的高いカップリング
レベルの配合物（２２ＰＥＧ−Ｂ、２５ＰＥＧ−Ｃおよ
び３１ＰＥＧ−Ｃ）で見られるような、免疫原性の大き
い減少を与えなかった。免疫原性を減少するタンパク質
の能力のこれらの差は、カップリングレベルに大きく基
づいて決定されるように思われることに注意すべきであ
る。（例えば、１２ＰＥＧ−Ｂおよび２２ＰＥＧ−Ｂの
比較）。こうして、オキシム結合を通してＥＰＯの炭水
化物基にカップリングしたｍＰＥＧはタンパク質に関係
する潜在的な免疫原性を減少することがあり、高いレベ
ルでカップリングすることができるｍＰＥＧの誘導体は
最も有効である。
【０１４０】セイヨウワサビペルオキシダーゼの変性：
ヒドラジド／セミカルバジドのカップリングの比較 セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は糖タンパ
ク質の酵素（オキシド−リダクターゼ）である。ＨＲＰ
をｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドまたはｍＰＥＧ５００
０−セミカルバジドで変性して、ＥＰＯ以外の他の糖タ
ンパク質が２つの異なる炭水化物の変性試薬の間で変性
の差を示すかどうかを明らかにした。典型的な実験にお
いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（２ｍｇ）を合
計の体積０．８ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ
５．６の中に入れた。十分な１０ｍｇ／ｍｌの過ヨウ素
酸ナトリウムの溶液を添加して、過ヨウ素酸ナトリウム
の最終濃度を１０ｍＭにした。０℃において酸化を１５
分間進行させ、次いで０．３３ｍｌの８０ｍＭのＮａ2
ＣＯ3を添加した。５分後、この溶液を濃縮し、そして
マイクロコンセントレーターの中で１００ｍＭの酢酸ナ
トリウムｐＨ４．２で３回洗浄した。次いで酸化したセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を半分に分割し、一
方の半分に３０ｍｇのｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドを
添加し、そして他方の半分に３０ｍｇのｍＰＥＧ５００
０−セミカルバジドを添加した。次いで、２つの酸化し
たセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を室温において
一夜撹拌した。ゾルバックス（ＺｏｒｂａｘR）ＧＦ−
２５０カラムのＨＰＬＣゲル濾過により０．１Ｍのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７を使用して、ＰＥＧの変性の程度を決
定した。ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドで変性したセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ７ＰＥＧ分子／ＨＲ
Ｐを有した；ｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドで変性
したセイヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ１９ＰＥＧ
分子／ＨＲＰを有した。こうして、その炭水化物基に結
合したＰＥＧをもつセイヨウワサビペルオキシダーゼの
変性は、同一の実験条件下に、ヒドラジドよりＰＥＧの
セミカルバジド誘導体を使用したとき、いっそう有効で
ある。
ヒドラジド／セミカルバジドのカップリングの比較 セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は糖タンパ
ク質の酵素（オキシド−リダクターゼ）である。ＨＲＰ
をｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドまたはｍＰＥＧ５００
０−セミカルバジドで変性して、ＥＰＯ以外の他の糖タ
ンパク質が２つの異なる炭水化物の変性試薬の間で変性
の差を示すかどうかを明らかにした。典型的な実験にお
いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（２ｍｇ）を合
計の体積０．８ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ
５．６の中に入れた。十分な１０ｍｇ／ｍｌの過ヨウ素
酸ナトリウムの溶液を添加して、過ヨウ素酸ナトリウム
の最終濃度を１０ｍＭにした。０℃において酸化を１５
分間進行させ、次いで０．３３ｍｌの８０ｍＭのＮａ2
ＣＯ3を添加した。５分後、この溶液を濃縮し、そして
マイクロコンセントレーターの中で１００ｍＭの酢酸ナ
トリウムｐＨ４．２で３回洗浄した。次いで酸化したセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を半分に分割し、一
方の半分に３０ｍｇのｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドを
添加し、そして他方の半分に３０ｍｇのｍＰＥＧ５００
０−セミカルバジドを添加した。次いで、２つの酸化し
たセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を室温において
一夜撹拌した。ゾルバックス（ＺｏｒｂａｘR）ＧＦ−
２５０カラムのＨＰＬＣゲル濾過により０．１Ｍのリン
酸塩緩衝液ｐＨ７を使用して、ＰＥＧの変性の程度を決
定した。ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジドで変性したセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ７ＰＥＧ分子／ＨＲ
Ｐを有した；ｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドで変性
したセイヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ１９ＰＥＧ
分子／ＨＲＰを有した。こうして、その炭水化物基に結
合したＰＥＧをもつセイヨウワサビペルオキシダーゼの
変性は、同一の実験条件下に、ヒドラジドよりＰＥＧの
セミカルバジド誘導体を使用したとき、いっそう有効で
ある。
【０１４１】半減期の決定 半減期の実験は、体重約０．３ｋｇの雄のスプレイクー
ダウレイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを使
用して実施した。３匹のラットを各化合物について使用
した。実験の詳細は次の通りである。各ラットに１μｇ
のＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯをＩＶ（静脈内）注射
した。ヒドラジド誘導化ｍＰＥＧ−ＥＰＯについて、使
用したｍＰＥＧ−ＥＰＯはｍＰＥＧ５０００−セミカル
バジド−１８であり、セミカルバジドを使用するＥＰＯ
の変性について上の節に本質的に記載するようにして調
製した。血液を各ラットから２、５、１５、９０分およ
び３、６、２４、４８、５４時間の時点において抜き出
した。血液をヘパリン添加した管の中に集め、そして血
漿を単離した。単離した血漿を、ＥＰＯ依存性細胞増殖
アッセイにおけるＥＰＯの生物学的活性について試験し
た。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細
胞系を使用した。このネズミの細胞系はＥＰＯリセプタ
ーを組み込み、そして増殖についてＥＰＯに依存する。
このアッセイは次のように実施した。細胞をＥＰＯの不
存在下に２４時間増殖させ（１０６／ｍｌ）、次いで異
なる濃度でＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯを細胞に添加
した。細胞を４２時間インキュベーションし、次いでト
リチウム化チミジンを細胞に添加した。６時間後、細胞
を収獲し、そして計数した。細胞の増殖はチミジンの吸
収の増加により決定した。結果を図７に示す。
ダウレイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを使
用して実施した。３匹のラットを各化合物について使用
した。実験の詳細は次の通りである。各ラットに１μｇ
のＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯをＩＶ（静脈内）注射
した。ヒドラジド誘導化ｍＰＥＧ−ＥＰＯについて、使
用したｍＰＥＧ−ＥＰＯはｍＰＥＧ５０００−セミカル
バジド−１８であり、セミカルバジドを使用するＥＰＯ
の変性について上の節に本質的に記載するようにして調
製した。血液を各ラットから２、５、１５、９０分およ
び３、６、２４、４８、５４時間の時点において抜き出
した。血液をヘパリン添加した管の中に集め、そして血
漿を単離した。単離した血漿を、ＥＰＯ依存性細胞増殖
アッセイにおけるＥＰＯの生物学的活性について試験し
た。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細
胞系を使用した。このネズミの細胞系はＥＰＯリセプタ
ーを組み込み、そして増殖についてＥＰＯに依存する。
このアッセイは次のように実施した。細胞をＥＰＯの不
存在下に２４時間増殖させ（１０６／ｍｌ）、次いで異
なる濃度でＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯを細胞に添加
した。細胞を４２時間インキュベーションし、次いでト
リチウム化チミジンを細胞に添加した。６時間後、細胞
を収獲し、そして計数した。細胞の増殖はチミジンの吸
収の増加により決定した。結果を図７に示す。
【０１４２】ＥＰＯ依存性細胞増殖アッセイを、オキシ
ム誘導化ｍＰＥＧ−ＥＰＯを使用して、前述したように
実施した。結果を図１９に示す。
ム誘導化ｍＰＥＧ−ＥＰＯを使用して、前述したように
実施した。結果を図１９に示す。
【０１４３】ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：貧血マウスのモ
デル このアッセイにおいて、マウスを連続する５日間ＴＮＦ
−アルファで注射することによって貧血とする。この貧
血を克服するために、ＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯ
（０．０３μｇ／投与）で同一の５日にわたってＳＣ
（皮下）注射するか、あるいはマウスにＴＮＦ−アルフ
ァを与える５日のうちのちょうど２日にＳＣ注射した。
結果を図１５に示す。
デル このアッセイにおいて、マウスを連続する５日間ＴＮＦ
−アルファで注射することによって貧血とする。この貧
血を克服するために、ＥＰＯまたはｍＰＥＧ−ＥＰＯ
（０．０３μｇ／投与）で同一の５日にわたってＳＣ
（皮下）注射するか、あるいはマウスにＴＮＦ−アルフ
ァを与える５日のうちのちょうど２日にＳＣ注射した。
結果を図１５に示す。
【０１４４】同等の態様 上の詳細な説明中に述べたすべての刊行物および特許を
ここにおいて引用によって加える。前述の詳細な説明は
当業者が本発明を実施するために十分であると考えられ
る。事実、分子生物学または関係する分野における当業
者にとって明らかな、本発明を実施するための前述の方
法の種々の変更は、特許請求の範囲の中に含まることを
意図する。
ここにおいて引用によって加える。前述の詳細な説明は
当業者が本発明を実施するために十分であると考えられ
る。事実、分子生物学または関係する分野における当業
者にとって明らかな、本発明を実施するための前述の方
法の種々の変更は、特許請求の範囲の中に含まることを
意図する。
【０１４５】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【０１４６】１．式：
【０１４７】
【化３９】 式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｑは−ＮＨＮＨ2および
−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2から成る群より選択され、そして
Ｙは−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、
−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨ
ＮＨ−から成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。
−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2から成る群より選択され、そして
Ｙは−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、
−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨ
ＮＨ−から成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。
【０１４８】２．前記化合物が、 式：
【０１４９】
【化４０】 （Ｉ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５０】
【化４１】（ＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５１】
【化４２】 （ＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５２】
【化４３】 （ＩＶ） Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５３】
【化４４】（Ｖ） Ｐ−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨＮ
ＨＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
ＨＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５４】
【化４５】 （ＶＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５５】
【化４６】 （ＶＩＩ） Ｐ−ＮＨＮＨＣＳＮＨＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０１５６】
【化４７】 （ＶＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、および 式：
【０１５７】
【化４８】（ＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2
−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 から成る群に属する上記第１項記載の化合物。
−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する化合物、 から成る群に属する上記第１項記載の化合物。
【０１５８】３．前記化合物が、式：
【０１５９】
【化４９】（ＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する上記第２項記載の化合物。
【０１６０】４．前記化合物が、式：
【０１６１】
【化５０】 （ＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する上記第２項記載の化合物。
【０１６２】５．前記化合物が、式：
【０１６３】
【化５１】 （ＩＶ） Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮＨ2 を有する上記第２項記載の化合物。
【０１６４】６．前記化合物が、式：
【０１６５】
【化５２】（Ｖ） Ｐ−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨＮ
ＨＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する上記第２項記載の化合物。
ＨＣＯ−ＮＨＮＨ2 を有する上記第２項記載の化合物。
【０１６６】７．前記ポリマーが、ポリエチレングリコ
ールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホモ
ポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコール
とのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコポリ
マーは置換されていないか、あるいは１端においてアル
キル基で置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチ
ルエーテル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）
−ＤＬ−アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲ
はアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイル、
アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテ
ル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールであるこ
とができる）、および前記ポリマーの誘導体から成る群
より選択される上記第２項記載の化合物。
ールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホモ
ポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコール
とのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコポリ
マーは置換されていないか、あるいは１端においてアル
キル基で置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチ
ルエーテル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）
−ＤＬ−アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲ
はアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイル、
アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテ
ル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールであるこ
とができる）、および前記ポリマーの誘導体から成る群
より選択される上記第２項記載の化合物。
【０１６７】８．前記水溶性ポリマーがポリエチレング
リコールまたはその誘導体である上記第７項記載の化合
物。
リコールまたはその誘導体である上記第７項記載の化合
物。
【０１６８】９．前記水溶性ポリマーがモノメトキシポ
リ（エチレングリコール）である上記第８項記載の化合
物。
リ（エチレングリコール）である上記第８項記載の化合
物。
【０１６９】１０．工程：ポリペプチドを変性のため上
記第１項記載の化合物と混合すること、からなる方法に
よって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
記第１項記載の化合物と混合すること、からなる方法に
よって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
【０１７０】１１．変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第１０項記載の変性ポリペプチド。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第１０項記載の変性ポリペプチド。
【０１７１】１２．変性のための前記ポリペプチドが抗
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第１１項
記載の変性ポリペプチド。
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第１１項
記載の変性ポリペプチド。
【０１７２】１３．変性のための前記ポリペプチドが酵
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第１１項記載の変性ポリペプチド。
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第１１項記載の変性ポリペプチド。
【０１７３】１４．変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第１１項記載の変性ポリペプチ
ド。
タンパク質である上記第１１項記載の変性ポリペプチ
ド。
【０１７４】１５．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第１４項記載の変性ポリペプチド。
チンである上記第１４項記載の変性ポリペプチド。
【０１７５】１６．前記方法が前記混合工程前に酸化剤
を添加する工程をさらに含む上記第９項記載の変性ポリ
ペプチド。
を添加する工程をさらに含む上記第９項記載の変性ポリ
ペプチド。
【０１７６】１７．上記第１０項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【０１７７】１８．上記第１５項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【０１７８】１９．式：
【０１７９】
【化５３】（Ｘ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ
Ｎ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
Ｎ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８０】
【化５４】（ＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮ＝Ｃ
Ｈ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
Ｈ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８１】
【化５５】（ＸＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮ＝
ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８２】
【化５６】（ＸＩＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮ＝
ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８３】
【化５７】（ＸＩＶ） [Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨ−ＮＨ
ＮＨＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＮＨＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８４】
【化５８】 （ＸＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８５】
【化５９】 （ＸＶＩ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＳＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０１８６】
【化６０】（ＸＶＩＩ）［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−Ｎ
ＨＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、および 式：
ＨＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、および 式：
【０１８７】
【化６１】（ＸＶＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ
2−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは
１〜ｘであり、ｘはＺ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてＰは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。
2−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは
１〜ｘであり、ｘはＺ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてＰは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。
【０１８８】２０．式：
【０１８９】
【化６２】 （Ｘ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０１９０】２１．ｎが２２〜３２である上記第２０項
記載の化合物。
記載の化合物。
【０１９１】２２．式：
【０１９２】
【化６３】（ＸＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮ＝Ｃ
Ｈ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
Ｈ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０１９３】２３．ｎが１７〜２５である上記第２２項
記載の化合物。
記載の化合物。
【０１９４】２４．式：
【０１９５】
【化６４】（ＸＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮ＝Ｃ
Ｈ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
Ｈ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０１９６】２５．式：
【０１９７】
【化６５】（ＸＩＩＩ） [Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨ−ＮＨ
ＮＨＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
ＮＨＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０１９８】２６．式：
【０１９９】
【化６６】 （ＸＩＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０２００】２７．式：
【０２０１】
【化６７】 （ＸＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＣＳＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第１９項記載の化合物。
【０２０２】２８．Ｐがポリエチレングリコールのホモ
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー（ここで前記ホモポリマーおよびコポリマーは置換
されていないか、あるいは１端においてアルキル基で置
換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリ
ビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−
アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る）および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第１９項記載の化合物。
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー（ここで前記ホモポリマーおよびコポリマーは置換
されていないか、あるいは１端においてアルキル基で置
換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリ
ビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−
アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る）および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第１９項記載の化合物。
【０２０３】２９．Ｚがホルモン、リンホカイン、サイ
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第１９項記載の化合
物。
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第１９項記載の化合
物。
【０２０４】３０．Ｚが糖タンパク質である上記第２９
項記載の化合物。
項記載の化合物。
【０２０５】３１．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第３０項記載の化合物。
チンである上記第３０項記載の化合物。
【０２０６】３２．Ｚがエリトロポイエチンである上記
第２２項記載の化合物。
第２２項記載の化合物。
【０２０７】３３．前記Ｐがモノメトキシポリ（エチレ
ングリコール）である上記第３２項記載の化合物。
ングリコール）である上記第３２項記載の化合物。
【０２０８】３４．モノメトキシポリ（エチレングリコ
ール）の平均分子量が２０００〜１２０００の範囲であ
る上記第３３項記載の化合物。
ール）の平均分子量が２０００〜１２０００の範囲であ
る上記第３３項記載の化合物。
【０２０９】３５．ｎが１０〜３６である上記第３４項
記載の化合物。
記載の化合物。
【０２１０】３６．ｎは２０〜３２である上記第３５項
記載の化合物。
記載の化合物。
【０２１１】３７．モノメトキシポリ（エチレングリコ
ール）の平均分子量が５０００である上記第３６項記載
の化合物。
ール）の平均分子量が５０００である上記第３６項記載
の化合物。
【０２１２】３８．工程、ポリペプチドを活性化のため
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶおよびＶから成る群より選択される化合物との
接合のためにポリペプチドを活性化する方法。
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶおよびＶから成る群より選択される化合物との
接合のためにポリペプチドを活性化する方法。
【０２１３】３９．前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム
である上記第３８項記載の方法。
である上記第３８項記載の方法。
【０２１４】４０．前記過ヨウ素酸塩がタンパク質１ｍ
ｇ当たり１０〜４０μｍｏｌの濃度で存在する上記第３
９項記載の方法。
ｇ当たり１０〜４０μｍｏｌの濃度で存在する上記第３
９項記載の方法。
【０２１５】４１．前記混合工程を−１０〜５０℃の範
囲の温度において実施する上記第４０項記載の方法。
囲の温度において実施する上記第４０項記載の方法。
【０２１６】４２．前記混合工程を０〜３０℃の範囲の
温度において実施する上記第４１項記載の方法。
温度において実施する上記第４１項記載の方法。
【０２１７】４３．前記混合工程が１分〜３日の期間の
間を必要とする上記第４２項記載の方法。
間を必要とする上記第４２項記載の方法。
【０２１８】４４．前記混合工程を１分〜６０分の期間
の間実施する上記第４３項記載の方法。
の間実施する上記第４３項記載の方法。
【０２１９】４５．工程、変性のためにポリペプチドを
上記第１項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合す
ること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチドを
製造する方法。
上記第１項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合す
ること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチドを
製造する方法。
【０２２０】４６．変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第４４項記載の方法。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第４４項記載の方法。
【０２２１】４７．変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第４６項記載の方法。
タンパク質である上記第４６項記載の方法。
【０２２２】４８．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第４７項記載の方法。
チンである上記第４７項記載の方法。
【０２２３】４９．混合工程前に、酸化剤をポリペプチ
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第４４
項記載の方法。
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第４４
項記載の方法。
【０２２４】５０．前記酸化剤が１０〜４０μｍｏｌの
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Ｐが４００
０〜１２０００の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポリ
マーが式
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Ｐが４００
０〜１２０００の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポリ
マーが式
【０２２５】
【化６８】 （ＩＩＩ） Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2 の化合物である上記第４９項記載の方法。
【０２２６】５１．上記第１項記載の水溶性ポリマーか
らなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するため
のキット。
らなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するため
のキット。
【０２２７】５２．酸化剤をさらに含む上記第５１項記
載のキット。
載のキット。
【０２２８】５３．変性のためのポリペプチドをさらに
含む上記第５１項記載のキット。
含む上記第５１項記載のキット。
【０２２９】５４．式：
【０２３０】
【化６９】Ｐ−Ｙ−Ｘ−Ｑ 式中、ＸはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＣＨ2またはＣＨＯＨであ
り、Ｑは−ＯＮＨ2−および−ＣＨ2−ＯＮＨ2−から成
る群より選択され、そしてＹは−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−
Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ−、−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−および−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ−から
成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。
り、Ｑは−ＯＮＨ2−および−ＣＨ2−ＯＮＨ2−から成
る群より選択され、そしてＹは−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−
Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ−、−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−および−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ−から
成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。
【０２３１】５５．前記化合物が、式：
【０２３２】
【化７０】 （ＸＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する化合物、式：
【０２３３】
【化７１】（ＸＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−
ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３４】
【化７２】（ＸＸＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ
−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３５】
【化７３】（ＸＸＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−
ＣＳ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
ＣＳ−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３６】
【化７４】 （ＸＸＩＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３７】
【化７５】（ＸＸＩＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ
−Ｏ−ＣＨ2ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
−Ｏ−ＣＨ2ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３８】
【化７６】（ＸＸＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、 式：
【０２３９】
【化７７】（ＸＸＶＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＨ
（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、および 式：
（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、および 式：
【０２４０】
【化７８】（ＸＸＶＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ
−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、から成る群に属する上記第５４項記載
の化合物。
−ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する化合物、から成る群に属する上記第５４項記載
の化合物。
【０２４１】５６．前記化合物が式：
【０２４２】
【化７９】（ＸＸＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ
−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
【０２４３】５７．前記化合物が式：
【０２４４】
【化８０】 （ＸＸＩＩＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
【０２４５】５８．前記化合物が式：
【０２４６】
【化８１】（ＸＸＩＶ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ
−ＣＯ−ＣＨ2ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
−ＣＯ−ＣＨ2ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
【０２４７】５９．前記化合物が式：
【０２４８】
【化８２】 （ＸＩＸ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−ＯＮＨ2 を有する上記第５５項記載の化合物。
【０２４９】６０．前記ポリマーが、ポリエチレングリ
コールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホ
モポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコー
ルとのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコポ
リマーは置換されていないか、あるいは１端においてア
ルキル基で置換されている）、ポリオキシエチル化ポリ
オール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエ
チルエーテル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチ
ル）−ＤＬ−アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここ
でＲはアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイ
ル、アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエー
テル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールである
ことができる）、および前記ポリマーの誘導体から成る
群より選択される上記第５５項記載の化合物。
コールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホ
モポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコー
ルとのコポリマー（ここで前記ホモポリマーおよびコポ
リマーは置換されていないか、あるいは１端においてア
ルキル基で置換されている）、ポリオキシエチル化ポリ
オール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエ
チルエーテル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチ
ル）−ＤＬ−アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここ
でＲはアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイ
ル、アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエー
テル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールである
ことができる）、および前記ポリマーの誘導体から成る
群より選択される上記第５５項記載の化合物。
【０２５０】６１．前記水溶性ポリマーがポリエチレン
グリコールまたはその誘導体である上記第６０項記載の
化合物。
グリコールまたはその誘導体である上記第６０項記載の
化合物。
【０２５１】６２．前記水溶性ポリマーがモノメトキシ
ポリ（エチレングリコール）である上記第８項記載の化
合物。
ポリ（エチレングリコール）である上記第８項記載の化
合物。
【０２５２】６３．工程：ポリペプチドを変性のため上
記第６１項記載の化合物と混合すること、からなる方法
によって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
記第６１項記載の化合物と混合すること、からなる方法
によって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
【０２５３】６４．変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第６３項記載の変性ポリペプチド。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第６３項記載の変性ポリペプチド。
【０２５４】６５．変性のための前記ポリペプチドが抗
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第６４項
記載の変性ポリペプチド。
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第６４項
記載の変性ポリペプチド。
【０２５５】６６．変性のための前記ポリペプチドが酵
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第６４項記載の変性ポリペプチド。
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第６４項記載の変性ポリペプチド。
【０２５６】６７．変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第６４項記載の変性ポリペプチ
ド。
タンパク質である上記第６４項記載の変性ポリペプチ
ド。
【０２５７】６８．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第６７項記載の変性ポリペプチド。
チンである上記第６７項記載の変性ポリペプチド。
【０２５８】６９．前記方法が前記混合工程前に酸化剤
を添加する工程をさらに含む上記第６２項記載の変性ポ
リペプチド。
を添加する工程をさらに含む上記第６２項記載の変性ポ
リペプチド。
【０２５９】７０．上記第６３項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【０２６０】７１．上記第６８項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【０２６１】７２．式：
【０２６２】
【化８３】（ＸＸＶＩＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＯ−ＯＮ ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＣＯ−ＯＮ ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６３】
【化８４】（ＸＸＩＸ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ
−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６４】
【化８５】（ＸＸＸ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
Ｈ−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６５】
【化８６】（ＸＸＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＳ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
Ｈ−ＣＳ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６６】
【化８７】（ＸＸＸＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６７】
【化８８】（ＸＸＸＩＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６８】
【化８９】（ＸＸＸＩＶ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式：
【０２６９】
【化９０】（ＸＸＸＶ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、および 式：
ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、および 式：
【０２７０】
【化９１】（ＸＸＸＶＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｏ−ＣＨ2− ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは１〜ｘであり、ｘ
はＺ上の酸化活性化可能な基の数であり、そしてＰは水
溶性ポリマーである、から成る群に属する化合物。
Ｏ−ＣＨ2− ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは１〜ｘであり、ｘ
はＺ上の酸化活性化可能な基の数であり、そしてＰは水
溶性ポリマーである、から成る群に属する化合物。
【０２７１】７３．式：
【０２７２】
【化９２】（ＸＸＸ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
Ｈ−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
【０２７３】７４．式：
【０２７４】
【化９３】（ＸＸＸＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
【０２７５】７５．式：
【０２７６】
【化９４】（ＸＸＸＩＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
【０２７７】７６．式：
【０２７８】
【化９５】（ＸＸＶＩＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＯ−ＯＮ ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
ＣＯ−ＯＮ ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する上記第７２項記載の化合物。
【０２７９】７７．Ｐがポリエチレングリコールのホモ
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー（ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは置
換されていないか、あるいは１端においてアルキル基で
置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポ
リビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−
アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る）および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第７２項記載の化合物。
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー（ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは置
換されていないか、あるいは１端においてアルキル基で
置換されている）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポ
リビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−
アスパルトアミド］、ＲＯ−ＰＥＧ（ここでＲはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る）および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第７２項記載の化合物。
【０２８０】７８．Ｚがホルモン、リンホカイン、サイ
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第７２項記載の化合
物。
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第７２項記載の化合
物。
【０２８１】７９．Ｚが糖タンパク質である上記第７４
項記載の化合物。
項記載の化合物。
【０２８２】８０．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第７９項記載の化合物。
チンである上記第７９項記載の化合物。
【０２８３】８１．Ｚがエリトロポイエチンである上記
第７６項記載の化合物。
第７６項記載の化合物。
【０２８４】８２．前記Ｐがモノメトキシポリ（エチレ
ングリコール）である上記第７７項記載の化合物。
ングリコール）である上記第７７項記載の化合物。
【０２８５】８３．モノメトキシポリ（エチレングリコ
ール）の平均分子量が２０００〜１２０００の範囲であ
る上記第７８項記載の化合物。
ール）の平均分子量が２０００〜１２０００の範囲であ
る上記第７８項記載の化合物。
【０２８６】８４．ｎが３〜３６である上記第８３項記
載の化合物。
載の化合物。
【０２８７】８５．ｎは８〜３１である上記第８４項記
載の化合物。
載の化合物。
【０２８８】８６．モノメトキシポリ（エチレングリコ
ール）の平均分子量が５０００である上記第８５項記載
の化合物。
ール）の平均分子量が５０００である上記第８５項記載
の化合物。
【０２８９】８７．工程、ポリペプチドを活性化のため
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物ＸＩＸ、Ｘ
ＸＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶから成る群より選択さ
れる化合物との接合のためにポリペプチドを活性化する
方法。
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物ＸＩＸ、Ｘ
ＸＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶから成る群より選択さ
れる化合物との接合のためにポリペプチドを活性化する
方法。
【０２９０】８８．前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム
である上記第８７項記載の方法。
である上記第８７項記載の方法。
【０２９１】８９．前記過ヨウ素酸塩がタンパク質１ｍ
ｇ当たり１０〜４０μｍｏｌの濃度で存在する上記第８
８項記載の方法。
ｇ当たり１０〜４０μｍｏｌの濃度で存在する上記第８
８項記載の方法。
【０２９２】９０．前記混合工程を−１０〜５０℃の範
囲の温度において実施する上記第８９項記載の方法。
囲の温度において実施する上記第８９項記載の方法。
【０２９３】９１．前記混合工程を０〜３０℃の範囲の
温度において実施する上記第９０項記載の方法。
温度において実施する上記第９０項記載の方法。
【０２９４】９２．前記混合工程が１分〜３日の期間の
間を必要とする上記第９１項記載の方法。
間を必要とする上記第９１項記載の方法。
【０２９５】９３．前記混合工程を１分〜６０分の期間
の間実施する上記第９２項記載の方法。
の間実施する上記第９２項記載の方法。
【０２９６】９４．工程、変性のためにポリペプチドを
上記第５４項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合
すること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチド
を製造する方法。
上記第５４項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合
すること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチド
を製造する方法。
【０２９７】９５．変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第９４項記載の方法。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第９４項記載の方法。
【０２９８】９６．変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第９４項記載の方法。
タンパク質である上記第９４項記載の方法。
【０２９９】９７．前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第９６項記載の方法。
チンである上記第９６項記載の方法。
【０３００】９８．混合工程前に、酸化剤をポリペプチ
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第９４
項記載の方法。
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第９４
項記載の方法。
【０３０１】９９．前記酸化剤が１０〜４０μｍｏｌの
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Ｐが４００
０〜１２，０００の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポ
リマーが式
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Ｐが４００
０〜１２，０００の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポ
リマーが式
【０３０２】
【化９６】（ＸＸＩ） Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ
−ＣＯ−ＯＮＨ2 の化合物である上記第９８項記載の方法。
−ＣＯ−ＯＮＨ2 の化合物である上記第９８項記載の方法。
【０３０３】１００．上記第５４項記載の水溶性ポリマ
ーからなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性する
ためのキット。
ーからなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性する
ためのキット。
【０３０４】１０１．酸化剤をさらに含む上記第１００
項記載のキット。
項記載のキット。
【０３０５】１０２．変性のためのポリペプチドをさら
に含む上記第１０１項記載のキット。
に含む上記第１０１項記載のキット。
【図１】図１ａは、ＥＰＯのＨＰＬＣクロマトグラムを
示す。図１ｂは、ｍＰＥＧ５０００のヒドラジン誘導体
のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１ｃは、ｍＰＥＧ
５０００のスクシンイミドエステルで変性したＥＰＯの
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
示す。図１ｂは、ｍＰＥＧ５０００のヒドラジン誘導体
のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１ｃは、ｍＰＥＧ
５０００のスクシンイミドエステルで変性したＥＰＯの
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】異なる量の結合したｍＰＥＧ（２８、１８およ
び１２のｍＰＥＧ／ＥＰＯ分子）を含有するｍＰＥＧ５
０００−ＥＰＯで処置したマウスのヘマトクリットのレ
ベルのグラフである。１８または２８ｍＰＥＧ５０００
／分子で誘導化したＥＰＯを、本発明のセミカルバジド
化合物を使用して誘導化する。１２ｍＰＥＧ５０００／
分子で誘導化したＥＰＯを、本発明のヒドラジド化合物
を使用して誘導化する。
び１２のｍＰＥＧ／ＥＰＯ分子）を含有するｍＰＥＧ５
０００−ＥＰＯで処置したマウスのヘマトクリットのレ
ベルのグラフである。１８または２８ｍＰＥＧ５０００
／分子で誘導化したＥＰＯを、本発明のセミカルバジド
化合物を使用して誘導化する。１２ｍＰＥＧ５０００／
分子で誘導化したＥＰＯを、本発明のヒドラジド化合物
を使用して誘導化する。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＰＯに対して特
異的なモノクローナル抗体と結合するＥＰＯ、ヒドラジ
ドｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯ（１２ＰＥＧ／ＥＰＯ）、
ヒドラジドｍＰＥＧ１２０００−ＥＰＯ（６ＰＥＧ／Ｅ
ＰＯ）、チオセミカルバジドｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯ
（２５ＰＥＧ／ＥＰＯ）、セミカルバジドｍＰＥＧ１２
０００−ＥＰＯ（１４ＰＥＧ／ＥＰＯ）、およびｍＰＥ
Ｇ１２０００−ＥＰＯ（２９ＰＥＧ／ＥＰＯ）の能力を
示すグラフである。
異的なモノクローナル抗体と結合するＥＰＯ、ヒドラジ
ドｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯ（１２ＰＥＧ／ＥＰＯ）、
ヒドラジドｍＰＥＧ１２０００−ＥＰＯ（６ＰＥＧ／Ｅ
ＰＯ）、チオセミカルバジドｍＰＥＧ５０００−ＥＰＯ
（２５ＰＥＧ／ＥＰＯ）、セミカルバジドｍＰＥＧ１２
０００−ＥＰＯ（１４ＰＥＧ／ＥＰＯ）、およびｍＰＥ
Ｇ１２０００−ＥＰＯ（２９ＰＥＧ／ＥＰＯ）の能力を
示すグラフである。
【図４】ｍＰＥＧ−ヒドラジド（ＨＹ）またはｍＰＥＧ
−セミカルバジド（ＳＣ）で変性したときのＥＰＯの生
物学的活性の比較を示すグラフである。ｍＰＥＧの２つ
の異なる分子量（８５００および５０００）を比較にお
いて使用した。マウスのアルブミンを対照として使用し
た。
−セミカルバジド（ＳＣ）で変性したときのＥＰＯの生
物学的活性の比較を示すグラフである。ｍＰＥＧの２つ
の異なる分子量（８５００および５０００）を比較にお
いて使用した。マウスのアルブミンを対照として使用し
た。
【図５】異なる量の結合したｍＰＥＧ（３４、２０およ
び１２のｍＰＥＧ）を含有するｍＰＥＧ８５００−ＥＰ
Ｏで処置したマウスのヘマトクリットのレベルを示すプ
ロットである。３４または２０のｍＰＥＧ８５００／分
子で誘導化したＥＰＯを、本発明のセミカルバジド化合
物を使用して誘導化する。１２ｍＰＥＧ８５００／分子
で誘導化したＥＰＯを、本発明のヒドラジド化合物で誘
導化する。マウスのアルブミンを対照として使用する。
び１２のｍＰＥＧ）を含有するｍＰＥＧ８５００−ＥＰ
Ｏで処置したマウスのヘマトクリットのレベルを示すプ
ロットである。３４または２０のｍＰＥＧ８５００／分
子で誘導化したＥＰＯを、本発明のセミカルバジド化合
物を使用して誘導化する。１２ｍＰＥＧ８５００／分子
で誘導化したＥＰＯを、本発明のヒドラジド化合物で誘
導化する。マウスのアルブミンを対照として使用する。
【図６】クリニゲン（ＣｌｉｎｉｇｅｎR）ＥＰＯ Ｅ
ＩＡ試験キットを使用するｍＰＥＧ変性ＥＰＯについて
のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。凡例
において、ＳＣ５−２４はＥＰＯの１分子当たり２４分
子のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変
性ＥＰＯを意味し、ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当た
り１８分子のｍＰＥＧセミカルバジドをもつセミカルバ
ジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味する。
ＩＡ試験キットを使用するｍＰＥＧ変性ＥＰＯについて
のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。凡例
において、ＳＣ５−２４はＥＰＯの１分子当たり２４分
子のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変
性ＥＰＯを意味し、ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当た
り１８分子のｍＰＥＧセミカルバジドをもつセミカルバ
ジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味する。
【図７】血漿中のＥＰＯの循環半減期を示すグラフであ
る。凡例において、ＳＣ５−１８−ｉｖは静脈内注射し
たＥＰＯの１分子当たり１８分子のｍＰＥＧをもつセミ
カルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＥＰ
Ｏ−ｉｖは静脈内注射を意味する。
る。凡例において、ＳＣ５−１８−ｉｖは静脈内注射し
たＥＰＯの１分子当たり１８分子のｍＰＥＧをもつセミ
カルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＥＰ
Ｏ−ｉｖは静脈内注射を意味する。
【図８】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトクリ
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当たり１８分子
のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ５−２２はＥＰＯの１分子当
たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＨＹ５−８
はＥＰＯの１分子当たり８分子のｍＰＥＧ５０００をも
つヒドラジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味する。
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当たり１８分子
のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ５−２２はＥＰＯの１分子当
たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＨＹ５−８
はＥＰＯの１分子当たり８分子のｍＰＥＧ５０００をも
つヒドラジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味する。
【図９】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトクリ
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ５−２４はＥＰＯの１分子当たり２４分子
のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＴＳ５−２５はＥＰＯの１分子当
たり２５分子のｍＰＥＧ５０００をもつチオセミカルバ
ジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＤＨ５
−２２はＥＰＯの１分子当たり２２分子のｍＰＥＧ５０
００をもつジヒドラジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ５−２４はＥＰＯの１分子当たり２４分子
のｍＰＥＧをもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＴＳ５−２５はＥＰＯの１分子当
たり２５分子のｍＰＥＧ５０００をもつチオセミカルバ
ジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＤＨ５
−２２はＥＰＯの１分子当たり２２分子のｍＰＥＧ５０
００をもつジヒドラジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図１０】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＴＳ５−１７はＥＰＯの１分子当たり１７分子
のｍＰＥＧ５０００をもつチオセミカルバジドｍＰＥＧ
５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ８．５−１２は
ＥＰＯの１分子当たり１２分子のｍＰＥＧ８５００をも
つチオセミカルバジドｍＰＥＧ８５００変性ＥＰＯを意
味し、用語ＳＣ２−１５はＥＰＯの１分子当たり１５分
子のｍＰＥＧ２０００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ２
０００変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブ
ミンの対照を意味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＴＳ５−１７はＥＰＯの１分子当たり１７分子
のｍＰＥＧ５０００をもつチオセミカルバジドｍＰＥＧ
５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ８．５−１２は
ＥＰＯの１分子当たり１２分子のｍＰＥＧ８５００をも
つチオセミカルバジドｍＰＥＧ８５００変性ＥＰＯを意
味し、用語ＳＣ２−１５はＥＰＯの１分子当たり１５分
子のｍＰＥＧ２０００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ２
０００変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブ
ミンの対照を意味する。
【図１１】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例は次の
通りである：用語ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当たり
１８分子のｍＰＥＧ５０００をもつｍＰＥＧ５０００セ
ミカルバジド変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ１２−１４
はＥＰＯの１分子当たり１４分子のｍＰＥＧ１２，００
０をもつチオセミカルバジドｍＰＥＧ１２，０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ５−２８はＥＰＯの１分子当
たり２８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＨＹ１２−
６はＥＰＯの１分子当たり６分子のｍＰＥＧ１２，００
０をもつヒドラジドｍＰＥＧ１２，０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例は次の
通りである：用語ＳＣ５−１８はＥＰＯの１分子当たり
１８分子のｍＰＥＧ５０００をもつｍＰＥＧ５０００セ
ミカルバジド変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ１２−１４
はＥＰＯの１分子当たり１４分子のｍＰＥＧ１２，００
０をもつチオセミカルバジドｍＰＥＧ１２，０００変性
ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ５−２８はＥＰＯの１分子当
たり２８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、用語ＨＹ１２−
６はＥＰＯの１分子当たり６分子のｍＰＥＧ１２，００
０をもつヒドラジドｍＰＥＧ１２，０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図１２】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ８．５−３４はＥＰＯの１分子当たり３４
分子のｍＰＥＧ８５００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ
８５００変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ１２−２９はＥ
ＰＯの１分子当たり２９分子のｍＰＥＧ１２，０００を
もつセミカルバジドｍＰＥＧ１２，０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語ＳＣ８．５−３４はＥＰＯの１分子当たり３４
分子のｍＰＥＧ８５００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ
８５００変性ＥＰＯを意味し、用語ＳＣ１２−２９はＥ
ＰＯの１分子当たり２９分子のｍＰＥＧ１２，０００を
もつセミカルバジドｍＰＥＧ１２，０００変性ＥＰＯを
意味し、Ｍ．Ａ．はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図１３】ＥＰＯまたはＥＰＯ誘導体を皮下または静脈
内に注射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを
示すグラフである。凡例は次の通りである：ＥＰＯ−Ｓ
Ｃは皮下注射したＥＰＯを意味し、ＥＰＯ−ｉｖは静脈
内注射したＥＰＯを意味し、ＳＣ５−２８−ＳＣは皮下
注射したＥＰＯの１分子当たり２８分子のｍＰＥＧ５０
００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯ
を意味し、ＳＣ５−２８−ｉｖは静脈内注射したＥＰＯ
の１分子当たり２８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミ
カルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＨＹ
１２−６−ＳＣは皮下注射したＥＰＯの１分子当たり６
分子のｍＰＥＧ１２，０００をもつヒドラジドジｍＰＥ
Ｇ１２，０００変性ＥＰＯを意味し、ＨＹ１２−６−ｉ
ｖは静脈内注射したＥＰＯの１分子当たり６分子のｍＰ
ＥＧ１２，０００をもつヒドラジドｍＰＥＧ１２，００
０変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．−ｓｃは皮下注射した
マウスのアルブミンの対照を意味し、Ｍ．Ａ．−ｉｖは
静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を意味する。
内に注射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを
示すグラフである。凡例は次の通りである：ＥＰＯ−Ｓ
Ｃは皮下注射したＥＰＯを意味し、ＥＰＯ−ｉｖは静脈
内注射したＥＰＯを意味し、ＳＣ５−２８−ＳＣは皮下
注射したＥＰＯの１分子当たり２８分子のｍＰＥＧ５０
００をもつセミカルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯ
を意味し、ＳＣ５−２８−ｉｖは静脈内注射したＥＰＯ
の１分子当たり２８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミ
カルバジドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＨＹ
１２−６−ＳＣは皮下注射したＥＰＯの１分子当たり６
分子のｍＰＥＧ１２，０００をもつヒドラジドジｍＰＥ
Ｇ１２，０００変性ＥＰＯを意味し、ＨＹ１２−６−ｉ
ｖは静脈内注射したＥＰＯの１分子当たり６分子のｍＰ
ＥＧ１２，０００をもつヒドラジドｍＰＥＧ１２，００
０変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．−ｓｃは皮下注射した
マウスのアルブミンの対照を意味し、Ｍ．Ａ．−ｉｖは
静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を意味する。
【図１４】０．１μｇのＥＰＯの多数／単一の投与で注
射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを示すグ
ラフである。凡例は次の通りである：ＥＰＯ×３ｓｃは
３回／週で皮下注射したＥＰＯを意味し、ＥＰＯ×ｉｖ
は３回／週で静脈内注射したＥＰＯを意味し、ＳＣ５−
２２×１ｓｃは１回／週で皮下注射したＥＰＯの１分子
当たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジ
ドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＳＣ５−２２
×１ｉｖは１回／週で静脈内注射したＥＰＯの１分子当
たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．×３は
３回／週で静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を
意味する。
射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを示すグ
ラフである。凡例は次の通りである：ＥＰＯ×３ｓｃは
３回／週で皮下注射したＥＰＯを意味し、ＥＰＯ×ｉｖ
は３回／週で静脈内注射したＥＰＯを意味し、ＳＣ５−
２２×１ｓｃは１回／週で皮下注射したＥＰＯの１分子
当たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジ
ドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、ＳＣ５−２２
×１ｉｖは１回／週で静脈内注射したＥＰＯの１分子当
たり２２分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジド
ｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯを意味し、Ｍ．Ａ．×３は
３回／週で静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を
意味する。
【図１５】ＥＰＯまたはＥＰＯ誘導体を注射した腫瘍壊
死因子α（ＴＮＦα）誘発貧血のマウスにおけるヘマト
クリットのレベルを示すグラフである。凡例は次の通り
である：ＴＮＦ（５）は５日間にわたって注射したＴＮ
Ｆを意味し、Ｔ＋ＥＰＯ（５）は５日間にわたって同時
に注射したＴＮＦおよびＥＰＯを意味し、Ｔ＋ＥＰＯ
（２）は５日間にわたって注射したＴＮＦおよび第１お
よび第４日に注射したＥＰＯを意味し、Ｔ＋ＳＣ５−１
８（５）は第１および第４日に注射したＥＰＯの１分子
当たり１８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジ
ドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯと同時に５日間にわたっ
て注射ＴＮＦを意味し、Ｍ−Ａはマウスのアルブミンの
対照を意味する。
死因子α（ＴＮＦα）誘発貧血のマウスにおけるヘマト
クリットのレベルを示すグラフである。凡例は次の通り
である：ＴＮＦ（５）は５日間にわたって注射したＴＮ
Ｆを意味し、Ｔ＋ＥＰＯ（５）は５日間にわたって同時
に注射したＴＮＦおよびＥＰＯを意味し、Ｔ＋ＥＰＯ
（２）は５日間にわたって注射したＴＮＦおよび第１お
よび第４日に注射したＥＰＯを意味し、Ｔ＋ＳＣ５−１
８（５）は第１および第４日に注射したＥＰＯの１分子
当たり１８分子のｍＰＥＧ５０００をもつセミカルバジ
ドｍＰＥＧ５０００変性ＥＰＯと同時に５日間にわたっ
て注射ＴＮＦを意味し、Ｍ−Ａはマウスのアルブミンの
対照を意味する。
【図１６】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、１８ＰＥＧ−ＡはＥＰＯの１分子当たり１８分子の
ｍＰＥＧをもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＯＮＨ2（本発明の式ＸＸＩ）で変性したＥＰＯを意
味し、３１ＰＥＧ−Ｃは３１ＰＥＧ／ＥＰＯをもつｍＰ
ＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ
2（本発明の式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯを意味し、
２５ＰＥＧ−Ｃは２５分子のｍＰＥＧ／ＥＰＯ分子をも
つｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−
ＯＮＨ2（本発明の式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯを意
味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、１８ＰＥＧ−ＡはＥＰＯの１分子当たり１８分子の
ｍＰＥＧをもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ
−ＯＮＨ2（本発明の式ＸＸＩ）で変性したＥＰＯを意
味し、３１ＰＥＧ−Ｃは３１ＰＥＧ／ＥＰＯをもつｍＰ
ＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ
2（本発明の式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯを意味し、
２５ＰＥＧ−Ｃは２５分子のｍＰＥＧ／ＥＰＯ分子をも
つｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−
ＯＮＨ2（本発明の式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯを意
味する。
【図１７】ＥＰＯの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、２２ＰＥＧ−Ｂは２２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を
もつオキシム誘導化ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（本発明の式ＸＸＩＩＩ）で変性したＥＰＯを意味
し、１７ＰＥＧ−Ｂは１７ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を
有する同一オキシムリンカーで変性したＥＰＯを意味
し、そして１２ＰＥＧ−Ｂは１２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ
分子を有する同一オキシムリンカーで変性したＥＰＯを
意味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、２２ＰＥＧ−Ｂは２２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を
もつオキシム誘導化ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（本発明の式ＸＸＩＩＩ）で変性したＥＰＯを意味
し、１７ＰＥＧ−Ｂは１７ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を
有する同一オキシムリンカーで変性したＥＰＯを意味
し、そして１２ＰＥＧ−Ｂは１２ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ
分子を有する同一オキシムリンカーで変性したＥＰＯを
意味する。
【図１８】ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＰＯに対して
特異的なモノクローナル抗体と結合するＥＰＯ、ｍＰＥ
Ｇ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ
2（「Ａ」）、ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１８ＰＥＧ
／ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（２２ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１７ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１２ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ2−ＯＮＨ2（「Ｃ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（３
１ＰＥＧ／ＥＰＯ）、およびｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2
−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（「Ｃ」）ｍＰＥＧ５０
００ ＥＰＯ（２５ＰＥＧ／ＥＰＯ）の能力を示すグラ
フである。
特異的なモノクローナル抗体と結合するＥＰＯ、ｍＰＥ
Ｇ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ
2（「Ａ」）、ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１８ＰＥＧ
／ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（２２ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１７ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（「Ｂ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（１２ＰＥＧ／
ＥＰＯ）、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ2−ＯＮＨ2（「Ｃ」）ｍＰＥＧ５０００ ＥＰＯ（３
１ＰＥＧ／ＥＰＯ）、およびｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2
−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（「Ｃ」）ｍＰＥＧ５０
００ ＥＰＯ（２５ＰＥＧ／ＥＰＯ）の能力を示すグラ
フである。
【図１９】ｍＰＥＧ−ＥＰＯを使用するＥＰＯ依存性細
胞増殖を示すグラフである。凡例において、１８ＰＥＧ
−Ａは１８ＰＥＧ／ＥＰＯをもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2
ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2（式ＸＸＩ）で変性したＥ
ＰＯを意味し、２２ＰＥＧ−Ｂは２２ｍＰＥＧ分子／Ｅ
ＰＯ分子をもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（式ＸＸＩＩＩ）で変性したＥＰＯを意味し、１７Ｐ
ＥＧ−Ｂは１７ｍＰＥＧ／ＥＰＯにおける式ＸＸＩＩＩ
を意味し、１２ＰＥＧ−Ｂは１２ｍＰＥＧ／ＥＰＯにお
ける式ＸＸＩＩＩを意味し、３１ＰＥＧ−Ｃは３１ＰＥ
Ｇ／ＥＰＯにおけるｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯ
を意味し、そして２５ＰＥＧ−Ｃは２５ｍＰＥＧ／ＥＰ
Ｏにおける式ＸＸＩＶを意味する。
胞増殖を示すグラフである。凡例において、１８ＰＥＧ
−Ａは１８ＰＥＧ／ＥＰＯをもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2
ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＯＮＨ2（式ＸＸＩ）で変性したＥ
ＰＯを意味し、２２ＰＥＧ−Ｂは２２ｍＰＥＧ分子／Ｅ
ＰＯ分子をもつｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＮＨ
2（式ＸＸＩＩＩ）で変性したＥＰＯを意味し、１７Ｐ
ＥＧ−Ｂは１７ｍＰＥＧ／ＥＰＯにおける式ＸＸＩＩＩ
を意味し、１２ＰＥＧ−Ｂは１２ｍＰＥＧ／ＥＰＯにお
ける式ＸＸＩＩＩを意味し、３１ＰＥＧ−Ｃは３１ＰＥ
Ｇ／ＥＰＯにおけるｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−
ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（式ＸＸＩＶ）で変性したＥＰＯ
を意味し、そして２５ＰＥＧ−Ｃは２５ｍＰＥＧ／ＥＰ
Ｏにおける式ＸＸＩＶを意味する。
【図２０】ｍＰＥＧ−ＥＰＯを使用するＥＰＯ依存性細
胞増殖を示すグラフである。凡例において、３１ｍＰＥ
Ｇは３１ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有するオキシム誘
導化ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2（本発明の式Ｉ
Ｉ）で変性したＥＰＯを意味する。
胞増殖を示すグラフである。凡例において、３１ｍＰＥ
Ｇは３１ｍＰＥＧ分子／ＥＰＯ分子を有するオキシム誘
導化ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮＨ2（本発明の式Ｉ
Ｉ）で変性したＥＰＯを意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 38/22
Claims (14)
- 【請求項１】 式： 【化１】 式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｑは−ＮＨＮＨ2および
−Ｃ6Ｈ4−ＮＨＮＨ2から成る群より選択され、そして
Ｙは−Ｏ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、
−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＮＨＣＯ−Ｎ−ＮＨ
ＮＨ−から成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。 - 【請求項２】 工程：ポリペプチドを変性のために請求
項１の化合物と混合すること、からなる方法によって製
造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。 - 【請求項３】 請求項２のポリペプチドおよび製剤学的
に許容されうる担体からなる組成物。 - 【請求項４】 式： 【化２】（Ｘ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨＮ
＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化３】（ＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ
−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化４】（ＸＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＮ＝Ｃ
Ｈ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化５】（ＸＩＩＩ） ［Ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＮ＝Ｃ
Ｈ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化６】（ＸＩＶ） [Ｐ−ＮＨＣＯ−ＮＨ−ＮＨＮ
ＨＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化７】 （ＸＶ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化８】 （ＸＶＩ） ［Ｐ−ＨＮＮＨＣＳＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化９】（ＸＶＩＩ）［Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ
Ｎ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、および 式： 【化１０】（ＸＶＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ
2−ＣＯ−ＮＨＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは
１〜ｘであり、ｘはＺ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてＰは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。 - 【請求項５】 工程、 ポリペプチドを活性化のために酸化剤と混合すること、
からなる、請求項１の化合物との接合のためにポリペプ
チドを活性化する方法。 - 【請求項６】 工程、 変性のためにポリペプチドを請求項１の水溶性ポリマー
の試薬化合物と混合すること、からなる、水溶性ポリマ
ー変性ポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項７】 請求項１の水溶性ポリマーからなる、ポ
リペプチドを水溶性ポリマーで変性するためのキット。 - 【請求項８】 式： 【化１１】Ｐ−Ｙ−Ｘ−Ｑ 式中、ＸはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、ＣＨ2またはＣＨＯＨであ
り、Ｑは−ＯＮＨ2−および−ＣＨ2−ＯＮＨ2−から成
る群より選択され、そしてＹは−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−
Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ−、−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−および−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ−から
成る群より選択され、そしてＰは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。 - 【請求項９】 工程：ポリペプチドを変性のため請求項
８の化合物と混合すること、からなる方法によって製造
された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。 - 【請求項１０】 請求項９のポリペプチドおよび製剤学
的に許容されうる担体からなる組成物。 - 【請求項１１】 式： 【化１２】（ＸＸＶＩＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＣＯ−ＯＮ ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１３】（ＸＸＩＸ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ
−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１４】（ＸＸＸ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＯ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１５】（ＸＸＸＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ
Ｈ−ＣＳ−ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１６】（ＸＸＸＩＩ） ［Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＯＮ＝ＣＨ−］n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１７】（ＸＸＸＩＩＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１８】（ＸＸＸＩＶ） [Ｐ-Ｏ-ＣＨ2ＣＨ2-Ｏ-Ｃ
Ｏ-ＣＨ2-ＯＮ＝ＣＨ-]n−Ｚ を有する化合物、 式： 【化１９】（ＸＸＸＶ） [Ｐ-Ｏ-ＣＨ2ＣＨ2-ＣＨ(Ｏ
Ｈ)-ＣＨ2-ＯＮ＝ＣＨ-]n−Ｚ を有する化合物、および 式： 【化２０】（ＸＸＸＶＩ） [Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ
Ｏ−ＣＨ2− ＯＮ＝ＣＨ−]n−Ｚ を有する化合物、式中、Ｚはポリペプチドであり、ｎは
１〜ｘであり、ｘはＺ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてＰは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。 - 【請求項１２】 工程、 ポリペプチドを活性化のために酸化剤と混合すること、
からなる、請求項８の化合物との接合のためにポリペプ
チドを活性化する方法。 - 【請求項１３】 工程、 変性のためにポリペプチドを請求項８の水溶性ポリマー
の試薬化合物と混合すること、からなる、水溶性ポリマ
ー変性ポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項１４】 請求項８の水溶性ポリマーからなる、
ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するためのキッ
ト。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US98773992A | 1992-12-09 | 1992-12-09 | |
| US987739 | 1992-12-09 | ||
| US4505293A | 1993-04-07 | 1993-04-07 | |
| US045052 | 1993-04-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196925A true JPH07196925A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=26722325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5340709A Pending JPH07196925A (ja) | 1992-12-09 | 1993-12-09 | Ｐｅｇヒドラゾンおよびｐｅｇオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07196925A (ja) |
| KR (1) | KR100254650B1 (ja) |
| AU (1) | AU5238393A (ja) |
| FI (1) | FI935485A (ja) |
| NO (1) | NO934477L (ja) |
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| JP2006522738A (ja) * | 2002-10-09 | 2006-10-05 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | エリスロポエチン：エリスロポエチンの改造および複合糖質化 |
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