JPH07196925A - Pegヒドラゾンおよびpegオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体 - Google Patents
Pegヒドラゾンおよびpegオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体Info
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- JPH07196925A JPH07196925A JP5340709A JP34070993A JPH07196925A JP H07196925 A JPH07196925 A JP H07196925A JP 5340709 A JP5340709 A JP 5340709A JP 34070993 A JP34070993 A JP 34070993A JP H07196925 A JPH07196925 A JP H07196925A
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- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒドラジン、ヒドラジンカルボキシレート、
セミカルバジド、チオセミカルバジド、炭酸ジヒドラジ
ド、カルバジド、チオカルバジド、およびアリールヒド
ラジド誘導体ならびに水溶性有機ポリマー、例えば、ポ
リエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ
リオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断
片、デキストラン、多糖類、ポリアミノ酸、およびポリ
ビニルアルコールのオキシルアミン誘導体を包含する水
溶性ポリマー試薬、並びに、ポリペプチドをPEGまた
は上記他の水溶性有機ポリマーで変性する方法。 【効果】 ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少
しないでポリペプチドを水溶性ポリマーの結合により変
性することができる。
セミカルバジド、チオセミカルバジド、炭酸ジヒドラジ
ド、カルバジド、チオカルバジド、およびアリールヒド
ラジド誘導体ならびに水溶性有機ポリマー、例えば、ポ
リエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ
リオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断
片、デキストラン、多糖類、ポリアミノ酸、およびポリ
ビニルアルコールのオキシルアミン誘導体を包含する水
溶性ポリマー試薬、並びに、ポリペプチドをPEGまた
は上記他の水溶性有機ポリマーで変性する方法。 【効果】 ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少
しないでポリペプチドを水溶性ポリマーの結合により変
性することができる。
Description
【0001】本発明は、タンパク質上のアルデヒド基と
ヒドラゾン結合を形成するように変性される水溶性ポリ
マー、例えば、モノメトキシポリ(エチレングリコー
ル)に関しそして、また、これらの水溶性ポリマーによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
ヒドラゾン結合を形成するように変性される水溶性ポリ
マー、例えば、モノメトキシポリ(エチレングリコー
ル)に関しそして、また、これらの水溶性ポリマーによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
【0002】本発明は、オキシム結合を形成するように
変性されるこのような水溶性ポリマー、およびこれによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
変性されるこのような水溶性ポリマー、およびこれによ
り変性されたタンパク質分子に関する。
【0003】タンパク質および他の同様な有機分子は、
水溶性有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール
(PEG)への共有結合の接合により化学的に変性する
ことができる。このようなタンパク質接合体の生成は、
水溶性ポリマーの結合により望ましい性質がポリペプチ
ドに付与されるので、重要である。これらの望ましい性
質は、例えば、水溶液中の溶解度の増加、貯蔵の間の安
定性の増加、免疫原性の減少、酵素的分解に対する抵抗
の増加、より広範な種類の薬物投与系との適合性、およ
びin vivo半減期の増加である。PEGまたは他
の水溶性ポリマーでポリペプチドを誘導化することによ
って生ずるこれらの性質は、ポリペプチドを身体に注射
する治療剤として使用するとき、あるいはポリペプチド
を検定において、通常免疫検定において、問題の化合物
の検出および/または定量のために使用するとき、こと
に重要である。
水溶性有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール
(PEG)への共有結合の接合により化学的に変性する
ことができる。このようなタンパク質接合体の生成は、
水溶性ポリマーの結合により望ましい性質がポリペプチ
ドに付与されるので、重要である。これらの望ましい性
質は、例えば、水溶液中の溶解度の増加、貯蔵の間の安
定性の増加、免疫原性の減少、酵素的分解に対する抵抗
の増加、より広範な種類の薬物投与系との適合性、およ
びin vivo半減期の増加である。PEGまたは他
の水溶性ポリマーでポリペプチドを誘導化することによ
って生ずるこれらの性質は、ポリペプチドを身体に注射
する治療剤として使用するとき、あるいはポリペプチド
を検定において、通常免疫検定において、問題の化合物
の検出および/または定量のために使用するとき、こと
に重要である。
【0004】糖タンパク質の炭水化物部分を通してタン
パク質にリポーター基、リガンドなどを結合することは
記載された[ウェーバー(Weber)、P.およびホ
フ(Hof)、L.(1975)バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
(Biochem.Biophys.Res.Com
m.)65、1298−1302;オ’シャンネッシイ
(O’Shannessy)、D.J.、ドウバーセン
(Dobersen)、M.J.およびクアーレス(Q
uarles)、R.H.(1984)イムノロジー・
レターズ(Immunol.Lett.)8、273−
277;オ’シャンネッシイ(O’Shanness
y)、D.J.およびクアーレス(Quarles)、
R.H.(1985)ジャーバル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー(J.Appl.Bioche
m.)7、347−355;チュア(Chua)、M.
−M.、ファン(Fan)、S.−T.、およびカルシ
ュ(Karush)、F.(1984)バイオヒミカ・
エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochim.Bi
ophys.Acta)、800、291−300;
オ’シャンネッシイ(O’Shannessy)、D.
J.およびウィルチェク(Wilchek)、M.(1
990)アナリティカル・バイオケミストリー(Ana
lyt.Biochem.)191、1−8;コッペル
(Koppel)、G.A.(1990)バイオコンジ
ュゲイト・ケミストリー(Bioconjgate C
hem.)1、13−23]。ある数の基、例えば、ビ
オチン、蛍光プローブ、抗ガン化合物、および固体の支
持体がこの方法において共有結合された。
パク質にリポーター基、リガンドなどを結合することは
記載された[ウェーバー(Weber)、P.およびホ
フ(Hof)、L.(1975)バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
(Biochem.Biophys.Res.Com
m.)65、1298−1302;オ’シャンネッシイ
(O’Shannessy)、D.J.、ドウバーセン
(Dobersen)、M.J.およびクアーレス(Q
uarles)、R.H.(1984)イムノロジー・
レターズ(Immunol.Lett.)8、273−
277;オ’シャンネッシイ(O’Shanness
y)、D.J.およびクアーレス(Quarles)、
R.H.(1985)ジャーバル・オブ・アプライド・
バイオケミストリー(J.Appl.Bioche
m.)7、347−355;チュア(Chua)、M.
−M.、ファン(Fan)、S.−T.、およびカルシ
ュ(Karush)、F.(1984)バイオヒミカ・
エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochim.Bi
ophys.Acta)、800、291−300;
オ’シャンネッシイ(O’Shannessy)、D.
J.およびウィルチェク(Wilchek)、M.(1
990)アナリティカル・バイオケミストリー(Ana
lyt.Biochem.)191、1−8;コッペル
(Koppel)、G.A.(1990)バイオコンジ
ュゲイト・ケミストリー(Bioconjgate C
hem.)1、13−23]。ある数の基、例えば、ビ
オチン、蛍光プローブ、抗ガン化合物、および固体の支
持体がこの方法において共有結合された。
【0005】米国特許第4,847,325号は、PE
G−アミン、PEG−ヒドラジドまたはPEG−ヒドラ
ジンを合成しそしてそれを糖タンパク質に結合する可能
性を記載している。しかしながら、これらのPEG−誘
導体が合成されたこと、これらのPEG−誘導体が酸化
された糖タンパク質を変性することができること、およ
びこれらの推定上のPEG−タンパク質の生ずる生物学
的性質がなんでありうるかということについての実験の
証拠は与えられていない。
G−アミン、PEG−ヒドラジドまたはPEG−ヒドラ
ジンを合成しそしてそれを糖タンパク質に結合する可能
性を記載している。しかしながら、これらのPEG−誘
導体が合成されたこと、これらのPEG−誘導体が酸化
された糖タンパク質を変性することができること、およ
びこれらの推定上のPEG−タンパク質の生ずる生物学
的性質がなんでありうるかということについての実験の
証拠は与えられていない。
【0006】コウガン(Kogan)による刊行物、
T.P.、シンセティック・コミュニケーションズ(S
ynthetic Communications)、
22(16)、2417−2424(1992)には、
モノメトキシポリ(エチレングリコール)−ヒドラジド
の合成が記載されている。
T.P.、シンセティック・コミュニケーションズ(S
ynthetic Communications)、
22(16)、2417−2424(1992)には、
モノメトキシポリ(エチレングリコール)−ヒドラジド
の合成が記載されている。
【0007】酵素のペルオキシダーゼはその炭水化物基
を通してPEGで変性された[ウルチゴイティ(Urr
utigoity)、M.およびソウペ(Soupp
e)、J.(1989)バイオカタリシス(Bioca
talysis)2、145−149]。この変性にお
いて、PEG−ジアミンを酸化されたペルオキシダーゼ
と反応させ、そして生ずるイミンをホウ水素化物で還元
して、PEGとタンパク質上の炭水化物基との間で安定
な結合を形成した。3分子のPEG−20,000をこ
の酵素に結合した。この方法においてPEG−ジアミン
を使用するときの起こり得る問題は、架橋剤として機能
するPEGジアミンとタンパク質分子の間で起こる分子
間の架橋である。PEG−ジアミンを使用する他の欠点
は、タンパク質に結合された各PEG−ジアミンについ
て2つの利用可能なアルデヒド基が消費され、こうして
PEGに組み込みのための部位の潜在的数が低下するこ
とである。
を通してPEGで変性された[ウルチゴイティ(Urr
utigoity)、M.およびソウペ(Soupp
e)、J.(1989)バイオカタリシス(Bioca
talysis)2、145−149]。この変性にお
いて、PEG−ジアミンを酸化されたペルオキシダーゼ
と反応させ、そして生ずるイミンをホウ水素化物で還元
して、PEGとタンパク質上の炭水化物基との間で安定
な結合を形成した。3分子のPEG−20,000をこ
の酵素に結合した。この方法においてPEG−ジアミン
を使用するときの起こり得る問題は、架橋剤として機能
するPEGジアミンとタンパク質分子の間で起こる分子
間の架橋である。PEG−ジアミンを使用する他の欠点
は、タンパク質に結合された各PEG−ジアミンについ
て2つの利用可能なアルデヒド基が消費され、こうして
PEGに組み込みのための部位の潜在的数が低下するこ
とである。
【0008】mPEG誘導体を形成するヒドラゾンの外
に、また、1系列のオキシム形成mPEG誘導体が合成
される。オキシムはヒドロキシルアミンまたはオキシル
アミンの誘導体とアルデヒド基またはケトン基との反応
により形成される。ポリスチレン置換ベンゾフェノンオ
キシムは、固相ペプチド合成のための支持体として使用
された[デグラド(DeGrado)、W.F.および
カイザー(Kaiser)、E.T.(1980)、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J.O
rg.Chem.)45、1295−1300]。この
例において、生長するペプチド鎖をエステル結合を介し
てオキシム基にカップリングする。置換されたオキシム
結合は非常に安定であり、そして非置換のアルドキシム
でさえ反応を生ずるためにシリカゲルの存在下に100
℃において60時間を必要とするベックマン転位に対し
てすぐれた安定性を示す[マーチ(March)、J.
(1985)アドバンスド・オーガニック・ケミストリ
ー(Advanced Organic Chemis
try)、ニューヨーク−ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ(John Wiely & Sons)、p9
87−989]。オキシム結合はモルホリノドキソルビ
シンを抗体にカップリングするために使用された[ムエ
ラー(Mueller)、B.M.、ラシドロ(Wra
sidlo)、W.A.およびレイスフェルド(Rei
sfeld)、R.A.(1990)バイオコンジュゲ
イト・ケミストリー(Bioconjgate Che
m.)1、325−330]。この例において、モルホ
リノドキソルビシンのケトン基をアミノオキシ酢酸と反
応させた。新しくカップリングした遊離酸の基は活性化
され、そしてモルホリノドキソルビシンはモノクローナ
ル抗体上のリジンの遊離アミノ基に結合された。
に、また、1系列のオキシム形成mPEG誘導体が合成
される。オキシムはヒドロキシルアミンまたはオキシル
アミンの誘導体とアルデヒド基またはケトン基との反応
により形成される。ポリスチレン置換ベンゾフェノンオ
キシムは、固相ペプチド合成のための支持体として使用
された[デグラド(DeGrado)、W.F.および
カイザー(Kaiser)、E.T.(1980)、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J.O
rg.Chem.)45、1295−1300]。この
例において、生長するペプチド鎖をエステル結合を介し
てオキシム基にカップリングする。置換されたオキシム
結合は非常に安定であり、そして非置換のアルドキシム
でさえ反応を生ずるためにシリカゲルの存在下に100
℃において60時間を必要とするベックマン転位に対し
てすぐれた安定性を示す[マーチ(March)、J.
(1985)アドバンスド・オーガニック・ケミストリ
ー(Advanced Organic Chemis
try)、ニューヨーク−ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ(John Wiely & Sons)、p9
87−989]。オキシム結合はモルホリノドキソルビ
シンを抗体にカップリングするために使用された[ムエ
ラー(Mueller)、B.M.、ラシドロ(Wra
sidlo)、W.A.およびレイスフェルド(Rei
sfeld)、R.A.(1990)バイオコンジュゲ
イト・ケミストリー(Bioconjgate Che
m.)1、325−330]。この例において、モルホ
リノドキソルビシンのケトン基をアミノオキシ酢酸と反
応させた。新しくカップリングした遊離酸の基は活性化
され、そしてモルホリノドキソルビシンはモノクローナ
ル抗体上のリジンの遊離アミノ基に結合された。
【0009】ある数のタンパク質はPEGにより変性さ
れてきている。概観については、イナダ、Y.、ヨシモ
ト、T.、マツシマ、A.およびサイトウ、Y.(19
86)トレンズ・バイオテクノロジー(Trends
Biotechnol.)4:68−73を参照のこ
と。この分野において、下に列挙するように、ある数の
特許が発行されそして出願が公開された:米国特許第
4,179,337号;米国特許第4,609,546
号;米国特許第4,261,973号;米国特許第4,
055,635号;米国特許第3,960,830号;
米国特許第4,415,665号;米国特許第4,41
2,989号;米国特許第4,002,531号;米国
特許第4,414,147号;米国特許第3,788,
948号;米国特許第4,732,863号;米国特許
第4,745,180号;欧州特許(EP)第152,
847号;欧州特許(EP)第98,100号、198
4年1月11日公開。上の特許および特許公開明細書
は、また、他の水溶性ポリマーのタンパク質変性剤の使
用を記載しており、これらは次のものを包含するが、こ
れらに限定されない:ポリプロピレングリコール(PP
G)、ポリオキシエチル化ポリオール(POP)、ヘパ
リン、ヘパリン断片、デキストラン、多糖類、ポリアミ
ノ酸、例えば、プロリン、ポリビニルアルコール(PV
A)および他の水溶性有機ポリマー。
れてきている。概観については、イナダ、Y.、ヨシモ
ト、T.、マツシマ、A.およびサイトウ、Y.(19
86)トレンズ・バイオテクノロジー(Trends
Biotechnol.)4:68−73を参照のこ
と。この分野において、下に列挙するように、ある数の
特許が発行されそして出願が公開された:米国特許第
4,179,337号;米国特許第4,609,546
号;米国特許第4,261,973号;米国特許第4,
055,635号;米国特許第3,960,830号;
米国特許第4,415,665号;米国特許第4,41
2,989号;米国特許第4,002,531号;米国
特許第4,414,147号;米国特許第3,788,
948号;米国特許第4,732,863号;米国特許
第4,745,180号;欧州特許(EP)第152,
847号;欧州特許(EP)第98,100号、198
4年1月11日公開。上の特許および特許公開明細書
は、また、他の水溶性ポリマーのタンパク質変性剤の使
用を記載しており、これらは次のものを包含するが、こ
れらに限定されない:ポリプロピレングリコール(PP
G)、ポリオキシエチル化ポリオール(POP)、ヘパ
リン、ヘパリン断片、デキストラン、多糖類、ポリアミ
ノ酸、例えば、プロリン、ポリビニルアルコール(PV
A)および他の水溶性有機ポリマー。
【0010】最近の特許公開明細書(WO90/128
74)は、EPOが遺伝子操作により導入されたシステ
イン残基を含有するmPEG−EPOの製造を記載して
いる。次いで、システイン特異的mPEG試薬を遺伝子
操作された遊離スルフヒドリル基に共有結合する。ただ
1つのmPEG分子をEPOの中に組み込むことがで
き、そしてこの組み込みの証拠は提示されなかった。ま
た、生ずるmPEG−EPOの生物学的または生物物理
的性質は記載されなかった。
74)は、EPOが遺伝子操作により導入されたシステ
イン残基を含有するmPEG−EPOの製造を記載して
いる。次いで、システイン特異的mPEG試薬を遺伝子
操作された遊離スルフヒドリル基に共有結合する。ただ
1つのmPEG分子をEPOの中に組み込むことがで
き、そしてこの組み込みの証拠は提示されなかった。ま
た、生ずるmPEG−EPOの生物学的または生物物理
的性質は記載されなかった。
【0011】エリトロポイエチンは赤血球の生産を調節
する糖タンパク質である。エリトロポイエチンは、赤血
球の前駆体上のリセプターに結合することによって、そ
の生物学的性質を発揮する[クランツ(Krant
z)、S.B.、血液(Blood)、77:419−
434(1991)]。エリトロポイエチンのそのリセ
プターへの結合は、赤血球の前駆体を成熟赤血球に増殖
および分化させる。他の成長因子、例えば、インターロ
イキン3または顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子は、また、コファクター、例えば、鉄、葉酸および
ビタミンB12と一緒に、赤血球生成に関係する。現
在、エリトロポイエチンは、透析および透析前の両者の
患者における慢性腎不全の貧血およびHIV感染の貧血
における使用およびジドブジンの治療と組み合わせた使
用のために承認されている。エリトロポイエチンの現在
の研究されている使用として、ガンの貧血、外科前の血
液の自己提供、および周縁外科のアジュバントの治療が
ある。
する糖タンパク質である。エリトロポイエチンは、赤血
球の前駆体上のリセプターに結合することによって、そ
の生物学的性質を発揮する[クランツ(Krant
z)、S.B.、血液(Blood)、77:419−
434(1991)]。エリトロポイエチンのそのリセ
プターへの結合は、赤血球の前駆体を成熟赤血球に増殖
および分化させる。他の成長因子、例えば、インターロ
イキン3または顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子は、また、コファクター、例えば、鉄、葉酸および
ビタミンB12と一緒に、赤血球生成に関係する。現
在、エリトロポイエチンは、透析および透析前の両者の
患者における慢性腎不全の貧血およびHIV感染の貧血
における使用およびジドブジンの治療と組み合わせた使
用のために承認されている。エリトロポイエチンの現在
の研究されている使用として、ガンの貧血、外科前の血
液の自己提供、および周縁外科のアジュバントの治療が
ある。
【0012】エリトロポイエチンは、2つのジサルファ
イド架橋を含む165アミノ酸から成る。エリトロポイ
エチンはタンパク質の主鎖から発する4つの炭水化物鎖
を有する。炭水化物基のうちの3つはN結合であり、そ
してアスパラギン24、38および83に結合してい
る。また、セリン126に固定された1つのO結合炭水
化物基が存在する。炭水化物鎖は枝分かれしており、そ
してフコース、ガラクトース、N−アセチルガラクトサ
ミン、N−アセチルグルコサミン、マンノース、および
シアル酸から成る。エリトロポイエチンの炭水化物の組
成は、ササキ、H.、ボスナー(Boshner)、
B.、デル(Dell)、A.およびフクダ、M.(1
987)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)262、12059
−12076により決定されたように、不均質である。
炭水化物基はタンパク質の重量の約40%である。エリ
トロポイエチン上の炭水化物基は、エリトロポイエチン
の溶解度を増加しそしてその血清半減期を延長すると信
じられる。
イド架橋を含む165アミノ酸から成る。エリトロポイ
エチンはタンパク質の主鎖から発する4つの炭水化物鎖
を有する。炭水化物基のうちの3つはN結合であり、そ
してアスパラギン24、38および83に結合してい
る。また、セリン126に固定された1つのO結合炭水
化物基が存在する。炭水化物鎖は枝分かれしており、そ
してフコース、ガラクトース、N−アセチルガラクトサ
ミン、N−アセチルグルコサミン、マンノース、および
シアル酸から成る。エリトロポイエチンの炭水化物の組
成は、ササキ、H.、ボスナー(Boshner)、
B.、デル(Dell)、A.およびフクダ、M.(1
987)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.)262、12059
−12076により決定されたように、不均質である。
炭水化物基はタンパク質の重量の約40%である。エリ
トロポイエチン上の炭水化物基は、エリトロポイエチン
の溶解度を増加しそしてその血清半減期を延長すると信
じられる。
【0013】ポリペプチドが水溶性ポリマーに共有結合
で接合することができること、およびポリペプチドを変
性することができる程度に関して、いくつかの制限が存
在する。異なる水溶性ポリマー試薬は、問題のポリペプ
チド中のアミノ酸残基へのカップリングを提供する官能
基に関して変化する。特定の官能基は、水溶性ポリマー
を特定のアミノ酸残基にカップリングさせる。
で接合することができること、およびポリペプチドを変
性することができる程度に関して、いくつかの制限が存
在する。異なる水溶性ポリマー試薬は、問題のポリペプ
チド中のアミノ酸残基へのカップリングを提供する官能
基に関して変化する。特定の官能基は、水溶性ポリマー
を特定のアミノ酸残基にカップリングさせる。
【0014】異なる性質を有するmPEG試薬、例え
ば、スクシニミジルカーボネート−PEG、スクシニミ
ジルスクシネート−PEG、イミデート−PEG、塩化
シアヌル酸−PEG、カルボニルジイミダゾール−PE
G、およびPEG−フェニルカーボネート誘導体(4−
ニトロフェノールおよび2,4,5−トリクロロフェノ
ール)を使用するリジン残基の変性は記載された。この
出願は、異なるリジン変性PEG誘導体に類似する、酸
化された炭水化物基に対して異なる特異性をもつ、新規
な炭水化物PEG変性剤を含む。
ば、スクシニミジルカーボネート−PEG、スクシニミ
ジルスクシネート−PEG、イミデート−PEG、塩化
シアヌル酸−PEG、カルボニルジイミダゾール−PE
G、およびPEG−フェニルカーボネート誘導体(4−
ニトロフェノールおよび2,4,5−トリクロロフェノ
ール)を使用するリジン残基の変性は記載された。この
出願は、異なるリジン変性PEG誘導体に類似する、酸
化された炭水化物基に対して異なる特異性をもつ、新規
な炭水化物PEG変性剤を含む。
【0015】糖タンパク質、すなわち、1または2以上
の炭水化物分子に共有結合で接合したポリペプチドは、
ポリペプチド上に炭水化物分子が存在するために、ポリ
ペプチドの水溶性ポリマーの誘導化の異なる方法を提供
する追加の機会を与える。水溶性ポリマーの試薬は、糖
タンパク質のアミノ酸ポリペプチド主鎖、すなわち、ポ
リペプチド上に存在する種々の官能基と反対に、糖タン
パク質の炭水化物部分に直接カップリングすることがで
きる。電荷の置換、立体障害、活性部位におけるアミノ
酸残基が異なるために、そして水溶性ポリマー変性糖タ
ンパク質のポリペプチド成分の構造および機能を混乱さ
せうる他の問題のために、水溶性試薬をポリペプチド主
鎖のアミノ酸にカップリングするよりむしろ糖タンパク
質の炭水化物部分にカップリングすることは有利である
ことがある。
の炭水化物分子に共有結合で接合したポリペプチドは、
ポリペプチド上に炭水化物分子が存在するために、ポリ
ペプチドの水溶性ポリマーの誘導化の異なる方法を提供
する追加の機会を与える。水溶性ポリマーの試薬は、糖
タンパク質のアミノ酸ポリペプチド主鎖、すなわち、ポ
リペプチド上に存在する種々の官能基と反対に、糖タン
パク質の炭水化物部分に直接カップリングすることがで
きる。電荷の置換、立体障害、活性部位におけるアミノ
酸残基が異なるために、そして水溶性ポリマー変性糖タ
ンパク質のポリペプチド成分の構造および機能を混乱さ
せうる他の問題のために、水溶性試薬をポリペプチド主
鎖のアミノ酸にカップリングするよりむしろ糖タンパク
質の炭水化物部分にカップリングすることは有利である
ことがある。
【0016】糖タンパク質の炭水化物部分へカップリン
グすることができる水溶性ポリマーの試薬を提供するこ
とによって、他のアミノ酸残基におけるカップリングを
通して悪影響を受けるであろうタンパク質の生物学的活
性に実質的に悪影響を及ぼさないで、水溶性ポリマーを
タンパク質に共有結合で接合することが可能である。本
発明は、ポリペプチド上のアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ基、例えば、ケトン、ラクトール、活
性化されたカルボン酸または活性化されたカルボン酸誘
導体とヒドラゾン結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体、すなわち、水溶性ポリマーの試薬でポリペプチ
ドを変性する方法および組成物を提供する。ポリエチレ
ングリコール(PEG)および他の水溶性ポリマーの新
規なヒドラジド、セミカルバジド、アリールヒドラジ
ド、チオセミカルバジド、ヒドラジドカルボキシレー
ト、炭酸ジヒドラジド、カルバジド、およびチオカルバ
ジドの誘導体が提供される。1種または2種以上の水溶
性ポリマーの試薬を個々のポリペプチドまたは同様な有
機分子にカップリングさせて、ポリペプチドを水溶性ポ
リマーに結合するヒドラゾンを形成することができる。
グすることができる水溶性ポリマーの試薬を提供するこ
とによって、他のアミノ酸残基におけるカップリングを
通して悪影響を受けるであろうタンパク質の生物学的活
性に実質的に悪影響を及ぼさないで、水溶性ポリマーを
タンパク質に共有結合で接合することが可能である。本
発明は、ポリペプチド上のアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ基、例えば、ケトン、ラクトール、活
性化されたカルボン酸または活性化されたカルボン酸誘
導体とヒドラゾン結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体、すなわち、水溶性ポリマーの試薬でポリペプチ
ドを変性する方法および組成物を提供する。ポリエチレ
ングリコール(PEG)および他の水溶性ポリマーの新
規なヒドラジド、セミカルバジド、アリールヒドラジ
ド、チオセミカルバジド、ヒドラジドカルボキシレー
ト、炭酸ジヒドラジド、カルバジド、およびチオカルバ
ジドの誘導体が提供される。1種または2種以上の水溶
性ポリマーの試薬を個々のポリペプチドまたは同様な有
機分子にカップリングさせて、ポリペプチドを水溶性ポ
リマーに結合するヒドラゾンを形成することができる。
【0017】本発明の他の面は、ヒドラゾン結合の水溶
性ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパ
ク質、とくに糖タンパク質を提供することである。
性ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパ
ク質、とくに糖タンパク質を提供することである。
【0018】また、前述のアルデヒドまたは同様に反応
性の基とオキシム結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体でポリペプチドを変性する方法および組成物を開
示する。ポリエチレングリコール(PEG)および他の
水溶性ポリマーの、下に列挙するするような、新規なオ
キシルアミン誘導体を提供し、そしてここで1種または
2種以上の水溶性ポリマーの試薬を個々のポリペプチド
または同様な有機分子にカップリングさせて、ポリペプ
チドを水溶性ポリマーに結合するオキシムを形成するこ
とができる。
性の基とオキシム結合を形成する水溶性有機ポリマーの
誘導体でポリペプチドを変性する方法および組成物を開
示する。ポリエチレングリコール(PEG)および他の
水溶性ポリマーの、下に列挙するするような、新規なオ
キシルアミン誘導体を提供し、そしてここで1種または
2種以上の水溶性ポリマーの試薬を個々のポリペプチド
または同様な有機分子にカップリングさせて、ポリペプ
チドを水溶性ポリマーに結合するオキシムを形成するこ
とができる。
【0019】本発明の他の面は、オキシルアミン水溶性
ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパク
質、とくに糖タンパク質を提供することである。
ポリマーの誘導体の共有結合により変性されたタンパク
質、とくに糖タンパク質を提供することである。
【0020】本発明の水溶性ポリマーの試薬は、ポリエ
チレングリコールのホモポリマー、ポリプロピレングリ
コールのホモポリマー、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー(ここで前記ホモポリマー
およびコポリマーは置換されていないか、あるいは1端
においてアルキル基で置換されている)、ポリオキシエ
チル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポ
リビニルエチルエーテル、およびα,β−ポリ[(2−
ヒドロキシエチル)−DL−アスパルトアミド]および
他の水溶性有機ポリマーの誘導体のヒドラゾン結合およ
びオキシム結合を形成する誘導体を包含する。ポリエチ
レングリコールの水溶性ポリマーは、末端ヒドロキシル
基の1つがR基で変性されたポリエチレングリコール、
すなわち、RO−PEG(ここでRはアルキル、アリー
ル、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、ベン
ゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキル、
シクロアルキルアリールなどであることができる)を包
含する。列挙した水溶性ポリマーはPにより表されるこ
とにの単なる例示である。特別に記載した水溶性ポリマ
ーの種々の誘導体がまた考えられるが、ただし誘導体は
水溶性である。より好ましくは、水溶性ポリマーPはポ
リエチレングリコールおよびその誘導体から成る群より
選択され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ル(mPEG)はとくに好ましい(タンパク質の間の架
橋を回避するために)。
チレングリコールのホモポリマー、ポリプロピレングリ
コールのホモポリマー、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー(ここで前記ホモポリマー
およびコポリマーは置換されていないか、あるいは1端
においてアルキル基で置換されている)、ポリオキシエ
チル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポ
リビニルエチルエーテル、およびα,β−ポリ[(2−
ヒドロキシエチル)−DL−アスパルトアミド]および
他の水溶性有機ポリマーの誘導体のヒドラゾン結合およ
びオキシム結合を形成する誘導体を包含する。ポリエチ
レングリコールの水溶性ポリマーは、末端ヒドロキシル
基の1つがR基で変性されたポリエチレングリコール、
すなわち、RO−PEG(ここでRはアルキル、アリー
ル、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、ベン
ゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキル、
シクロアルキルアリールなどであることができる)を包
含する。列挙した水溶性ポリマーはPにより表されるこ
とにの単なる例示である。特別に記載した水溶性ポリマ
ーの種々の誘導体がまた考えられるが、ただし誘導体は
水溶性である。より好ましくは、水溶性ポリマーPはポ
リエチレングリコールおよびその誘導体から成る群より
選択され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテ
ル(mPEG)はとくに好ましい(タンパク質の間の架
橋を回避するために)。
【0021】本発明の水溶性ポリマーによる水溶性ポリ
マーの誘導化のための問題のポリペプチドは、ホルモ
ン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵素、ワ
クチンの抗原、および抗体を包含する。エリトロポイエ
チン(EPO)、ことに組み換えエリトロポイエチン、
およびその前駆体、中間体および模倣物の水溶性ポリマ
ーの誘導化はとくに重要である。
マーの誘導化のための問題のポリペプチドは、ホルモ
ン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵素、ワ
クチンの抗原、および抗体を包含する。エリトロポイエ
チン(EPO)、ことに組み換えエリトロポイエチン、
およびその前駆体、中間体および模倣物の水溶性ポリマ
ーの誘導化はとくに重要である。
【0022】本発明の他の面は、部分的に酸化され、引
き続いて(i)モノメトキシポリ(エチレングリコー
ル)(mPEG)のセミカルバジド誘導体と組み合わせ
て、エリトロポイエチンの1分子当たり17〜25mP
EG分子を含有するmPEG誘導化エリトロポイエチン
分子(ヒドラゾン結合を通して接合された)を生成し、
(ii)mPEGのカルボキシレートヒドラジド誘導体
と組み合わせて、約22〜32mPEG/EPOを含有
する誘導化EPO(ヒドラゾン結合を通して接合され
た)を生成し、そして(iii)mPEGのオキシルア
ミン誘導体と組み合わせて、約3〜36mPEG/EP
Oを含有する誘導化EPO(オキシム結合を通して接合
された)を生成する(すべてはゲル濾過の保持時間によ
り測定した)エリトロポイエチンを提供することであ
る。
き続いて(i)モノメトキシポリ(エチレングリコー
ル)(mPEG)のセミカルバジド誘導体と組み合わせ
て、エリトロポイエチンの1分子当たり17〜25mP
EG分子を含有するmPEG誘導化エリトロポイエチン
分子(ヒドラゾン結合を通して接合された)を生成し、
(ii)mPEGのカルボキシレートヒドラジド誘導体
と組み合わせて、約22〜32mPEG/EPOを含有
する誘導化EPO(ヒドラゾン結合を通して接合され
た)を生成し、そして(iii)mPEGのオキシルア
ミン誘導体と組み合わせて、約3〜36mPEG/EP
Oを含有する誘導化EPO(オキシム結合を通して接合
された)を生成する(すべてはゲル濾過の保持時間によ
り測定した)エリトロポイエチンを提供することであ
る。
【0023】本発明の他の面は、本発明の水溶性ポリマ
ーの試薬との共有結合の接合のためにポリペプチドを活
性化する方法を提供することである。
ーの試薬との共有結合の接合のためにポリペプチドを活
性化する方法を提供することである。
【0024】定義 用語「水溶性ポリマーの試薬」は、ここにおいて使用す
るとき、ポリペプチドへの水溶性ポリマーの共有結合の
接合を提供する官能基を含有するように変性された水溶
性ポリマーを意味する。
るとき、ポリペプチドへの水溶性ポリマーの共有結合の
接合を提供する官能基を含有するように変性された水溶
性ポリマーを意味する。
【0025】用語「ポリペプチド」は、ここにおいて使
用するとき、より大きいポリペプチド(しばしばタンパ
ク質と呼ばれる)、小さいペプチド、および糖タンパク
質を包含する種々の大きさのポリペプチドを意味する。
用するとき、より大きいポリペプチド(しばしばタンパ
ク質と呼ばれる)、小さいペプチド、および糖タンパク
質を包含する種々の大きさのポリペプチドを意味する。
【0026】用語「酸化活性化可能な基」は、ここにお
いて使用するとき、官能基を酸化条件に暴露した後、本
発明の化合物のヒドラジド部分またはオキシルアミン部
分と反応する官能基、ポリオール、ラクトール、アミ
ン、フェノール、カルボン酸またはカルボン酸の誘導体
を意味する。糖タンパク質であるポリペプチド上に存在
する酸化活性化可能な基は、糖タンパク質の炭水化物部
分上に存在するか、あるいは糖タンパク質のアミノ酸残
基部分上に存在することができる。酸化活性化可能な基
の例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒド
ロキシルであるが、これに限定されない。ヒドロキシル
基は、使用する誘導体に依存して、ヒドラジド反応性ア
ルデヒドまたはオキシルアミン反応性アルデヒドに酸化
することができる。
いて使用するとき、官能基を酸化条件に暴露した後、本
発明の化合物のヒドラジド部分またはオキシルアミン部
分と反応する官能基、ポリオール、ラクトール、アミ
ン、フェノール、カルボン酸またはカルボン酸の誘導体
を意味する。糖タンパク質であるポリペプチド上に存在
する酸化活性化可能な基は、糖タンパク質の炭水化物部
分上に存在するか、あるいは糖タンパク質のアミノ酸残
基部分上に存在することができる。酸化活性化可能な基
の例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒド
ロキシルであるが、これに限定されない。ヒドロキシル
基は、使用する誘導体に依存して、ヒドラジド反応性ア
ルデヒドまたはオキシルアミン反応性アルデヒドに酸化
することができる。
【0027】用語「部分的酸化」は、ここにおいて使用
するとき、酸化されるポリペプチドの生物学的活性を完
全には壊滅させない程度に進行する酸化のプロセスを意
味する。
するとき、酸化されるポリペプチドの生物学的活性を完
全には壊滅させない程度に進行する酸化のプロセスを意
味する。
【0028】用語「接合のために活性化された」は、こ
こにおいてポリペプチドに関して使用するとき、ポリペ
プチドの部分的酸化を意味し、ここで酸化の程度は少な
くとも1つの酸化活性化可能な基を本発明の水溶性ポリ
マーの試薬の1つのヒドラジド部分またはオキシルアミ
ン部分(または同様な官能基の部分)と化学的に反応す
ることができる官能基に変換するために十分である。
こにおいてポリペプチドに関して使用するとき、ポリペ
プチドの部分的酸化を意味し、ここで酸化の程度は少な
くとも1つの酸化活性化可能な基を本発明の水溶性ポリ
マーの試薬の1つのヒドラジド部分またはオキシルアミ
ン部分(または同様な官能基の部分)と化学的に反応す
ることができる官能基に変換するために十分である。
【0029】用語「生物学的活性」は、ここにおいて使
用するとき、次のものを包含する化合物の生物学的に関
係する性質を意味する:酵素的活性、リセプター(抗体
を包含する)に結合する能力、リガンドに結合する能
力、免疫応答を誘発する能力、治療学的活性など。
用するとき、次のものを包含する化合物の生物学的に関
係する性質を意味する:酵素的活性、リセプター(抗体
を包含する)に結合する能力、リガンドに結合する能
力、免疫応答を誘発する能力、治療学的活性など。
【0030】用語「抗体」は、ここにおいて使用すると
き、天然の免疫グロブリンの配列をもつポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体の両者、合成の抗体誘導
体などを包含する;抗体は種々の標識、蛍光、放射性、
酵素、ビオチン/アビジンなどに接合するように修飾す
ることができる。合成の抗体は、突然変異させかつ変更
された結合特異性について選抜された天然の免疫グロブ
リンの配列、典型的には1本鎖の、遺伝的に修飾された
細菌により生産された、種々の免疫グロブリン遺伝子誘
導化ポリペプチド、修飾された一定領域を含有するよう
に修飾された抗体などを包含する;このような抗体の形
成の原理に基づく合成の抗体誘導体の概観は、ウィンタ
ー(Winter)およびミルステイン(Milste
in)、ネイチャー(Nature)、349:293
−299(1991)に記載されている。
き、天然の免疫グロブリンの配列をもつポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体の両者、合成の抗体誘導
体などを包含する;抗体は種々の標識、蛍光、放射性、
酵素、ビオチン/アビジンなどに接合するように修飾す
ることができる。合成の抗体は、突然変異させかつ変更
された結合特異性について選抜された天然の免疫グロブ
リンの配列、典型的には1本鎖の、遺伝的に修飾された
細菌により生産された、種々の免疫グロブリン遺伝子誘
導化ポリペプチド、修飾された一定領域を含有するよう
に修飾された抗体などを包含する;このような抗体の形
成の原理に基づく合成の抗体誘導体の概観は、ウィンタ
ー(Winter)およびミルステイン(Milste
in)、ネイチャー(Nature)、349:293
−299(1991)に記載されている。
【0031】本発明は、水溶性ポリマーに結合するよう
にポリペプチドを変性するとき使用するための,水溶性
ポリマー、例えば、PEG、すなわち、ポリエチレング
リコールのヒドラジンまたはオキシルアミンの誘導体で
ある、新規なポリペプチド変性試薬を提供する。本発明
の水溶性ポリマーの試薬は、種々の水溶性ポリマーを問
題のポリペプチドに共有結合するために使用できる。本
発明の水溶性ポリマーのヒドラジンおよびオキシルアミ
ン誘導体,すなわち、水溶性ポリマーの試薬は、問題の
タンパク質上に存在するアルデヒド基または他の適当な
官能基との反応を通してタンパク質に共有結合すること
ができる。アルデヒド基は、ポリペプチド上のヒドロキ
シル基(または他の酸化活性化可能な基)を部分的に酸
化することによって導入できる。酸化活性化可能な基の
例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒドロ
キシル基を包含する。適当な酸化、すなわち、部分的酸
化の方法は、問題のポリペプチドを酸化剤、例えば、過
ヨウ素酸塩または当業者に知られている他の酸化剤で処
理するか、あるいは問題のタンパク質の部分上で酸化反
応を触媒することができる酵素、例えば、ガラクトース
オキシダーゼを添加することを包含する。本発明の他の
面は、試薬の分子、すなわち、本発明の水溶性ポリマー
のヒドラジンまたはオキシルアミン誘導体により、1種
または2種以上の水溶性ポリペプチドに共有結合するよ
うに、変性されたポリペプチドを提供することである。
にポリペプチドを変性するとき使用するための,水溶性
ポリマー、例えば、PEG、すなわち、ポリエチレング
リコールのヒドラジンまたはオキシルアミンの誘導体で
ある、新規なポリペプチド変性試薬を提供する。本発明
の水溶性ポリマーの試薬は、種々の水溶性ポリマーを問
題のポリペプチドに共有結合するために使用できる。本
発明の水溶性ポリマーのヒドラジンおよびオキシルアミ
ン誘導体,すなわち、水溶性ポリマーの試薬は、問題の
タンパク質上に存在するアルデヒド基または他の適当な
官能基との反応を通してタンパク質に共有結合すること
ができる。アルデヒド基は、ポリペプチド上のヒドロキ
シル基(または他の酸化活性化可能な基)を部分的に酸
化することによって導入できる。酸化活性化可能な基の
例は、糖タンパク質の炭水化物部分上に存在するヒドロ
キシル基を包含する。適当な酸化、すなわち、部分的酸
化の方法は、問題のポリペプチドを酸化剤、例えば、過
ヨウ素酸塩または当業者に知られている他の酸化剤で処
理するか、あるいは問題のタンパク質の部分上で酸化反
応を触媒することができる酵素、例えば、ガラクトース
オキシダーゼを添加することを包含する。本発明の他の
面は、試薬の分子、すなわち、本発明の水溶性ポリマー
のヒドラジンまたはオキシルアミン誘導体により、1種
または2種以上の水溶性ポリペプチドに共有結合するよ
うに、変性されたポリペプチドを提供することである。
【0032】水溶性ポリマーをポリペプチドにカップリ
ングするために有用な化合物の好ましい式は次の通りで
ある:
ングするために有用な化合物の好ましい式は次の通りで
ある:
【0033】
【化21】ヒドラジン誘導体 (I) P−O−CH2−CO−NHNH2 ヒドラジン誘導体; (II) P−O−CO−NHNH2 ヒドラジンカルボキシレート誘導体; (III) P−NH−CO−NHNH2 セミカルバジド誘導体; (IV) P−NH−CS−NHNH2 チオセミカルバジド誘導体; (V) P−NHCO−NHNHCO−NHN
H2 炭酸ジヒドラジド誘導体; (VI) P−NHNHCONHNH2 カルバジド誘導体; (VII) P−NHNHCSNHNH2 チオカルバジド誘導体; (VIII) P−NH−CO−C6H4−NHNH2 アリールヒドラジド誘導体; (IX) P−O−CO−CH2CH2−CO−N
HNH2 ヒドラジド誘導体;オキシルアミン誘導体 (XIX) P−O−CH2CH2−CO−ON
H2; (XX) P−O−CH2CH2−O−CO−ON
H2; (XXI) P−O−CH2CH2−NH−CO−O
NH2; (XXII) P−O−CH2CH2−O−CS−ON
H2; (XXIII) P−O−CH2CH2−ONH2; (XXIV) P−O−CH2CH2−NH−CO−C
H2ONH2; (XXV) P−O−CH2CH2−O−CO−CH
2−ONH2; (XXVI) P−O−CH2CH2−CH(OH)−
CH2−ONH2; および (XXVII) P−O−CH2CH2−CO−CH2−
ONH2。
H2 炭酸ジヒドラジド誘導体; (VI) P−NHNHCONHNH2 カルバジド誘導体; (VII) P−NHNHCSNHNH2 チオカルバジド誘導体; (VIII) P−NH−CO−C6H4−NHNH2 アリールヒドラジド誘導体; (IX) P−O−CO−CH2CH2−CO−N
HNH2 ヒドラジド誘導体;オキシルアミン誘導体 (XIX) P−O−CH2CH2−CO−ON
H2; (XX) P−O−CH2CH2−O−CO−ON
H2; (XXI) P−O−CH2CH2−NH−CO−O
NH2; (XXII) P−O−CH2CH2−O−CS−ON
H2; (XXIII) P−O−CH2CH2−ONH2; (XXIV) P−O−CH2CH2−NH−CO−C
H2ONH2; (XXV) P−O−CH2CH2−O−CO−CH
2−ONH2; (XXVI) P−O−CH2CH2−CH(OH)−
CH2−ONH2; および (XXVII) P−O−CH2CH2−CO−CH2−
ONH2。
【0034】Pは上の式において水溶性有機ポリマーを
表す。問題の水溶性有機ポリマーはポリマーの主鎖に結
合したヒドロキシルを有し、そして既知の水溶性ポリマ
ーから選択することができ、これらの水溶性ポリマー次
のものを包含するが、これらに限定されない:(a)デ
キストランおよびデキストラン誘導体、例えば、硫酸デ
キストラン、P−アミノ架橋デキストリン、およびカル
ボキシメチルデキストリン、(b)セルロースおよびセ
ルロース誘導体、例えば、メチルセルロースおよびカル
ボキシメチルセルロース、(c)澱粉およびデキストリ
ン、および澱粉の誘導体およびヒドロイラクテス(hy
droylactes)、(d)ポリアルキレングリコ
ールおよびその誘導体、例えば、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールの
ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコ
ールとのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコ
ポリマーは置換されていないか、あるいは1端において
アルキル基で置換されている)、(e)ヘパリンおよび
ヘパリンの断片、(f)ポリビニルアルコールおよびポ
リビニルエチルエーテル、(g)ポリビニルピロリド
ン、(h)α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−
DL−アスパルトアミド]、および(i)ポリオキシエ
チル化ポリオール。好ましくは、水溶性ポリマーPは、
デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリン
およびデキストリン誘導体、より好ましくはポリエチレ
ングリコールおよびその誘導体から選択される。ポリエ
チレングリコールの水溶性ポリマーは、末端のヒドロキ
シルの1つがR基で変性されたポリエチレングリコー
ル、すなわち、RO−PEG(ここでRはアルキル、ア
リール、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、
ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキ
ル、シクロアルキルアリールなどであることができる)
を包含する。列挙した水溶性ポリマーは、Pにより表さ
れる水溶性ポリマーの単なる例示である。特別に記載し
た水溶性ポリマーの種々の誘導体が、また、考えられる
が、ただし誘導体は水溶性である。より好ましくは、水
溶性ポリマーPはポリエチレングリコールおよびその誘
導体から成る群より選択され、ポリエチレングリコール
のモノメチルエーテル(mPEG)はとくに好ましい
(タンパク質の間の架橋を回避するために)。本発明の
水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプチドは
薬物として使用するとき、ポリマーPは無毒であるべき
である。
表す。問題の水溶性有機ポリマーはポリマーの主鎖に結
合したヒドロキシルを有し、そして既知の水溶性ポリマ
ーから選択することができ、これらの水溶性ポリマー次
のものを包含するが、これらに限定されない:(a)デ
キストランおよびデキストラン誘導体、例えば、硫酸デ
キストラン、P−アミノ架橋デキストリン、およびカル
ボキシメチルデキストリン、(b)セルロースおよびセ
ルロース誘導体、例えば、メチルセルロースおよびカル
ボキシメチルセルロース、(c)澱粉およびデキストリ
ン、および澱粉の誘導体およびヒドロイラクテス(hy
droylactes)、(d)ポリアルキレングリコ
ールおよびその誘導体、例えば、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレング
リコールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールの
ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコ
ールとのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコ
ポリマーは置換されていないか、あるいは1端において
アルキル基で置換されている)、(e)ヘパリンおよび
ヘパリンの断片、(f)ポリビニルアルコールおよびポ
リビニルエチルエーテル、(g)ポリビニルピロリド
ン、(h)α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−
DL−アスパルトアミド]、および(i)ポリオキシエ
チル化ポリオール。好ましくは、水溶性ポリマーPは、
デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリン
およびデキストリン誘導体、より好ましくはポリエチレ
ングリコールおよびその誘導体から選択される。ポリエ
チレングリコールの水溶性ポリマーは、末端のヒドロキ
シルの1つがR基で変性されたポリエチレングリコー
ル、すなわち、RO−PEG(ここでRはアルキル、ア
リール、アルキルアリール、アロイル、アルカノイル、
ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロアルキ
ル、シクロアルキルアリールなどであることができる)
を包含する。列挙した水溶性ポリマーは、Pにより表さ
れる水溶性ポリマーの単なる例示である。特別に記載し
た水溶性ポリマーの種々の誘導体が、また、考えられる
が、ただし誘導体は水溶性である。より好ましくは、水
溶性ポリマーPはポリエチレングリコールおよびその誘
導体から成る群より選択され、ポリエチレングリコール
のモノメチルエーテル(mPEG)はとくに好ましい
(タンパク質の間の架橋を回避するために)。本発明の
水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプチドは
薬物として使用するとき、ポリマーPは無毒であるべき
である。
【0035】式I〜IXの化合物は、一般に、次の式で
表される:
表される:
【0036】
【化22】 式中、XはOまたはSであり、Qは−NHNH2および
−C6H4−NHNH2から成る群より選択され、そして
Yは−O−、−OCH2−、−NH−、−NHNH−、
−O−CO−CH2CH2−および−NHCO−N−NH
NH−から成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリ
マーである(化合物I〜IXにおけるように)。
−C6H4−NHNH2から成る群より選択され、そして
Yは−O−、−OCH2−、−NH−、−NHNH−、
−O−CO−CH2CH2−および−NHCO−N−NH
NH−から成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリ
マーである(化合物I〜IXにおけるように)。
【0037】式XIX〜XXVIIの化合物は、一般
に、次の式で表される:
に、次の式で表される:
【0038】
【化23】P−Y−X−Q 式中、XはC=O、C=S、CH2またはCHOHであ
り、Qは−ONH2−および−CH2−ONH2−から成
る群より選択され、そしてYは−O−CH2CH2−、−
O−CH2CH2−O−、−O−CH2CH2−N−、−O
−CH2CH2−S−および−O−CH2CH2CH−から
成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリマーである
(化合物XIX〜XXVIIにおけるように)。
り、Qは−ONH2−および−CH2−ONH2−から成
る群より選択され、そしてYは−O−CH2CH2−、−
O−CH2CH2−O−、−O−CH2CH2−N−、−O
−CH2CH2−S−および−O−CH2CH2CH−から
成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリマーである
(化合物XIX〜XXVIIにおけるように)。
【0039】式I、II、III、IV、V、VI、V
II、VIIIおよびIXの分子に加えて、本発明は式
I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII
およびIXの分子との反応により変性されたポリペプチ
ドを包含する。式I、II、III、IV、V、VI、
VII、VIIIおよびIXの水溶性ポリマーの試薬に
より変性されたポリペプチドは、それぞれ、式X、X
I、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVI
IおよびXVIIIによりを表すことができる:
II、VIIIおよびIXの分子に加えて、本発明は式
I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII
およびIXの分子との反応により変性されたポリペプチ
ドを包含する。式I、II、III、IV、V、VI、
VII、VIIIおよびIXの水溶性ポリマーの試薬に
より変性されたポリペプチドは、それぞれ、式X、X
I、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVI
IおよびXVIIIによりを表すことができる:
【0040】
【化24】ヒドラジド変性ポリペプチド (X) [P−O−CH2−CO−NHN=CH
−]n−Z、 (XI) [P−O−CO−NHN=CH−]n−
Z、 (XII) [P−NH−CO−NHN=CH−]n
−Z、 (XIII) [P−NH−CS−NHN=CH−]n
−Z、 (XIV) [P−NHCO−NH−NHNHCO−
NHN=CH−]n−Z、 (XV) [P−HNNHCON=CH−]n−Z、 (XVI) [P−HNNHCSN=CH−]n−Z、 (XVII)[P−NH−CO−C6H4−NHN=CH
−]n−Z、および (XVIII) [P−O−CO−CH2CH2−CO−
NHN=CH−]n−Z、 式中、Pは前述したような水溶性ポリマーであり、Zは
前述したようなポリペプチドであり、そしてnは1〜x
の範囲の数を表し、ここでxはポリペプチドZの中に存
在する酸化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリ
マーの試薬とZとの間で形成されたヒドラゾン結合中の
Cは、もとからZ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬で
はない。
−]n−Z、 (XI) [P−O−CO−NHN=CH−]n−
Z、 (XII) [P−NH−CO−NHN=CH−]n
−Z、 (XIII) [P−NH−CS−NHN=CH−]n
−Z、 (XIV) [P−NHCO−NH−NHNHCO−
NHN=CH−]n−Z、 (XV) [P−HNNHCON=CH−]n−Z、 (XVI) [P−HNNHCSN=CH−]n−Z、 (XVII)[P−NH−CO−C6H4−NHN=CH
−]n−Z、および (XVIII) [P−O−CO−CH2CH2−CO−
NHN=CH−]n−Z、 式中、Pは前述したような水溶性ポリマーであり、Zは
前述したようなポリペプチドであり、そしてnは1〜x
の範囲の数を表し、ここでxはポリペプチドZの中に存
在する酸化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリ
マーの試薬とZとの間で形成されたヒドラゾン結合中の
Cは、もとからZ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬で
はない。
【0041】式XIX、XX、XXI、XXII、XX
III、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVII
の分子に加えて、本発明はまた式XIX、XX、XX
I、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXV
IおよびXXVIIとの反応により変性されたポリペプ
チドを包含する。式XIX、XX、XXI、XXII、
XXIII、XXIV、XXV、XXVIおよびXXV
IIの水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプ
チドは、それぞれ、式XXVIII、XXIX、XX
X、XXXI、XXXII、XXXIII、XXXI
V、XXXVおよびXXXVIによりを表すことができ
る。
III、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVII
の分子に加えて、本発明はまた式XIX、XX、XX
I、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXV
IおよびXXVIIとの反応により変性されたポリペプ
チドを包含する。式XIX、XX、XXI、XXII、
XXIII、XXIV、XXV、XXVIおよびXXV
IIの水溶性ポリマーの試薬により変性されたポリペプ
チドは、それぞれ、式XXVIII、XXIX、XX
X、XXXI、XXXII、XXXIII、XXXI
V、XXXVおよびXXXVIによりを表すことができ
る。
【0042】
【化25】オキシルアミン変性ポリペプチド (XXVIII) [P−O−CH2CH2−CO−ON
=CH−]n−Z; (XXIX) [P−O−CH2CH2−O−CO−
ON=CH−]n−Z; (XXX) [P−O−CH2CH2−NH−CO
−ON=CH−]n−Z; (XXXI) [P−O−CH2CH2−NH−CS
−ON=CH−]n−Z; (XXXII) [P−O−CH2CH2−ON=CH
−]n−Z; (XXXIII) [P−O−CH2CH2−NH−CO
−CH2−ON=CH−]n−Z; (XXXIV) [P−O−CH2CH2−O−CO−
CH2−ON=CH−]n−Z; (XXXV) [P−O−CH2CH2−CH(OH)
−CH2−ON=CH−]n−Z;および (XXXVI) [P−O−CH2CH2−CO−CH2
− ON=CH−]n−Z、 式中、Pは前述したような水溶性ポリマーであり、Zは
前述したようなポリペプチドであり、そしてnは範囲1
〜Xの数であり、Xはポリペプチドの中に存在するの酸
化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリマーの試
薬とZとの間で形成されたオキシム結合中の炭素原子
は、もとからZ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬では
ない。
=CH−]n−Z; (XXIX) [P−O−CH2CH2−O−CO−
ON=CH−]n−Z; (XXX) [P−O−CH2CH2−NH−CO
−ON=CH−]n−Z; (XXXI) [P−O−CH2CH2−NH−CS
−ON=CH−]n−Z; (XXXII) [P−O−CH2CH2−ON=CH
−]n−Z; (XXXIII) [P−O−CH2CH2−NH−CO
−CH2−ON=CH−]n−Z; (XXXIV) [P−O−CH2CH2−O−CO−
CH2−ON=CH−]n−Z; (XXXV) [P−O−CH2CH2−CH(OH)
−CH2−ON=CH−]n−Z;および (XXXVI) [P−O−CH2CH2−CO−CH2
− ON=CH−]n−Z、 式中、Pは前述したような水溶性ポリマーであり、Zは
前述したようなポリペプチドであり、そしてnは範囲1
〜Xの数であり、Xはポリペプチドの中に存在するの酸
化活性化可能な基の最大数である。水溶性ポリマーの試
薬とZとの間で形成されたオキシム結合中の炭素原子
は、もとからZ上に存在し、水溶性ポリマーの試薬では
ない。
【0043】ポリペプチドはポリペプチド分子当たりx
までの水溶性ポリマーカップリングにより変性すること
ができるが、所定のポリペプチドをxより少ない水溶性
ポリマー分子で変性することが望ましいことがある。ポ
リペプチドを最大数の水溶性ポリマー、すなわち、x水
溶性ポリマー/ポリペプチド分子で誘導化することは望
ましくない。なぜなら、あるポリマーについて、ポリペ
プチドの分子当たりの水溶性ポリマーの数を増加する
と、変性しないポリペプチドに比較して、生物学的活性
が減少することがあるからである。例えば、水溶性ポリ
マー変性EPOで得られたいくつかの結果について、図
2、4、5、9、10および11を参照のこと。
までの水溶性ポリマーカップリングにより変性すること
ができるが、所定のポリペプチドをxより少ない水溶性
ポリマー分子で変性することが望ましいことがある。ポ
リペプチドを最大数の水溶性ポリマー、すなわち、x水
溶性ポリマー/ポリペプチド分子で誘導化することは望
ましくない。なぜなら、あるポリマーについて、ポリペ
プチドの分子当たりの水溶性ポリマーの数を増加する
と、変性しないポリペプチドに比較して、生物学的活性
が減少することがあるからである。例えば、水溶性ポリ
マー変性EPOで得られたいくつかの結果について、図
2、4、5、9、10および11を参照のこと。
【0044】式X、XI、XII、XIII、XIV、
XV、XVI、XVIIおよびXVIIIのヒドラゾン
結合化合物および式XXVIII、XXIX、XXX、
XXXI、XXXII、XXXIII、XXXIV、X
XXVおよびXXXVIのオキシム結合化合物における
ように、糖タンパク質分子に結合した水溶性ポリマー分
子の数を測定する異なる方法は、異なる結果を与えるこ
とがある。この出願の目的のために、ポリペプチドを所
定の数の水溶性ポリマー分子/タンパク質分子により誘
導化したと言うとき、与えた水溶性ポリマーの数はゲル
濾過クロマトグラフィーの保持時間により測定した実験
的に決定した数値である。
XV、XVI、XVIIおよびXVIIIのヒドラゾン
結合化合物および式XXVIII、XXIX、XXX、
XXXI、XXXII、XXXIII、XXXIV、X
XXVおよびXXXVIのオキシム結合化合物における
ように、糖タンパク質分子に結合した水溶性ポリマー分
子の数を測定する異なる方法は、異なる結果を与えるこ
とがある。この出願の目的のために、ポリペプチドを所
定の数の水溶性ポリマー分子/タンパク質分子により誘
導化したと言うとき、与えた水溶性ポリマーの数はゲル
濾過クロマトグラフィーの保持時間により測定した実験
的に決定した数値である。
【0045】式X、XI、XII、XIII、XIV、
XV、XVI、XVIIおよびXVIIIの化合物の合
成は、ヒドラゾン結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのヒドラゾン結
合が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の
混合物を生ずることがある。同様に、式XXVIII、
XXIX、XXX、XXXI、XXXII、XXXII
I、XXXIV、XXXVおよびXXXVIの化合物の
合成は、オキシム結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのオキシム結合
が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の混
合物を生ずることがある。ポリマーPは変化する量の多
数の同一単位からなるので、Pの分子量はかなり変化す
ることがあることが分かるであろう。さらに、Pが所定
の分子量を有すると言うとき、その分子量は近似値のみ
であり、分子の中に存在するサブユニットの数に関し
て、互いに異なる分子Pの集団の平均分子量を反映する
ことがある。一般に、Pは約200〜200,000、
好ましくは700〜30,000、より好ましくは2,
000〜12,000の範囲の分子量を有するであろ
う。Pについて適当な分子量は、式I、II、III、
IV、V、VI、VII、VIIIおよびIXの分子お
よび式XXVIII、XXIX、XXX、XXXI、X
XXII、XXXIII、XXXIV、XXXVおよび
XXXVIの分子をポリペプチドにカップリングすると
き、変性すべき特定のポリペプチドおよび選択した特定
の水溶性ポリマーに従い変化するであろう。個々のポリ
ペプチド分子を、1種または2種以上の異なる水溶性ポ
リマーにより、式I、II、III、IV、V、VI、
VII、VIIIおよびIX(ヒドラゾン)の化合物、
または式XIX、XX、XXI、XXII、XXII
I、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVII(オ
キシム)、またはヒドラゾンおよびオキシムの任意の組
み合わせの異なる態様との反応により誘導化することが
できる。
XV、XVI、XVIIおよびXVIIIの化合物の合
成は、ヒドラゾン結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのヒドラゾン結
合が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の
混合物を生ずることがある。同様に、式XXVIII、
XXIX、XXX、XXXI、XXXII、XXXII
I、XXXIV、XXXVおよびXXXVIの化合物の
合成は、オキシム結合を通してポリペプチドに結合した
水溶性ポリマーの正確な数およびこれらのオキシム結合
が存在する部位に関して、互いに異なる反応生成物の混
合物を生ずることがある。ポリマーPは変化する量の多
数の同一単位からなるので、Pの分子量はかなり変化す
ることがあることが分かるであろう。さらに、Pが所定
の分子量を有すると言うとき、その分子量は近似値のみ
であり、分子の中に存在するサブユニットの数に関し
て、互いに異なる分子Pの集団の平均分子量を反映する
ことがある。一般に、Pは約200〜200,000、
好ましくは700〜30,000、より好ましくは2,
000〜12,000の範囲の分子量を有するであろ
う。Pについて適当な分子量は、式I、II、III、
IV、V、VI、VII、VIIIおよびIXの分子お
よび式XXVIII、XXIX、XXX、XXXI、X
XXII、XXXIII、XXXIV、XXXVおよび
XXXVIの分子をポリペプチドにカップリングすると
き、変性すべき特定のポリペプチドおよび選択した特定
の水溶性ポリマーに従い変化するであろう。個々のポリ
ペプチド分子を、1種または2種以上の異なる水溶性ポ
リマーにより、式I、II、III、IV、V、VI、
VII、VIIIおよびIX(ヒドラゾン)の化合物、
または式XIX、XX、XXI、XXII、XXII
I、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVII(オ
キシム)、またはヒドラゾンおよびオキシムの任意の組
み合わせの異なる態様との反応により誘導化することが
できる。
【0046】本発明の利点は、ポリペプチドの生物学的
活性を実質的に減少しないで、あるいは従来知られてい
る化学的カップリング法および化合物により同様な数の
同一の水溶性ポリマー/ポリペプチド分子の結合により
減少される生物学的活性の減少を低くして、ポリペプチ
ドを水溶性ポリマーの結合により変性することができる
ということである。EPOの生物学的活性の面は、赤血
球の形成の刺激を包含する。EPOの生物学的活性は、
クランツ(Krantz)、S.B.血液(Bloo
d)、77:419−434(1991)に詳細に説明
されている。
活性を実質的に減少しないで、あるいは従来知られてい
る化学的カップリング法および化合物により同様な数の
同一の水溶性ポリマー/ポリペプチド分子の結合により
減少される生物学的活性の減少を低くして、ポリペプチ
ドを水溶性ポリマーの結合により変性することができる
ということである。EPOの生物学的活性の面は、赤血
球の形成の刺激を包含する。EPOの生物学的活性は、
クランツ(Krantz)、S.B.血液(Bloo
d)、77:419−434(1991)に詳細に説明
されている。
【0047】本発明の他の利点は、式I、II、II
I、IV、V、VI、VII、VIIIおよびIXの化
合物または式XIX、XX、XXI、XXII、XXI
II、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVIIの
化合物により変性されたポリペプチドが、リジンの変性
のために頻繁に使用されている(本発明の以前におい
て)mPEGの活性エステルを使用して水溶性ポリマー
をポリペプチドに接合することによって同一ポリペプチ
ドを同一程度に変性するときより、より大きい程度の生
物学的活性を保持することができるということである。
こうして、本発明は、水溶性ポリマーの共有結合の接合
に関連する利点を有すると同時に変性に関連する生物学
的活性の損失を最小にした変性されたポリペプチドを提
供する。結局、水溶性ポリマーによりいっそう高度に誘
導化することができ、こうしてそうでなければより高い
程度の誘導化に関連する利点を有するポリペプチドを製
造することができ、そしてこれらのポリペプチドは従来
の方法を使用して少ない程度に水溶性ポリマーにより誘
導化されたポリペプチドと同一レベルか、あるいはそれ
より高いレベルの生物学的活性を有する。
I、IV、V、VI、VII、VIIIおよびIXの化
合物または式XIX、XX、XXI、XXII、XXI
II、XXIV、XXV、XXVIおよびXXVIIの
化合物により変性されたポリペプチドが、リジンの変性
のために頻繁に使用されている(本発明の以前におい
て)mPEGの活性エステルを使用して水溶性ポリマー
をポリペプチドに接合することによって同一ポリペプチ
ドを同一程度に変性するときより、より大きい程度の生
物学的活性を保持することができるということである。
こうして、本発明は、水溶性ポリマーの共有結合の接合
に関連する利点を有すると同時に変性に関連する生物学
的活性の損失を最小にした変性されたポリペプチドを提
供する。結局、水溶性ポリマーによりいっそう高度に誘
導化することができ、こうしてそうでなければより高い
程度の誘導化に関連する利点を有するポリペプチドを製
造することができ、そしてこれらのポリペプチドは従来
の方法を使用して少ない程度に水溶性ポリマーにより誘
導化されたポリペプチドと同一レベルか、あるいはそれ
より高いレベルの生物学的活性を有する。
【0048】タンパク質へPEGをカップリングするた
めのPEG−アミンの代わりにPEGのヒドラゾン形成
誘導体(および他の水溶性ポリマー)を使用するとき得
られる他の利点は、ヒドラジドまたはオキシルアミン
(または同様な化合物)のアルデヒドへのカップリング
が、それぞれ、ヒドラゾンまたはオキシムを生ずるとい
うことであるが、アミンを介するカップリングはイミン
を生成し、これはヒドラゾンまたはオキシムより安定性
に劣り、そして還元して安定な誘導体を生成することが
必要である。こうして、ヒドラゾン形成化合物の代わり
にアミンを使用するとき、余分の工程を必要とする。
めのPEG−アミンの代わりにPEGのヒドラゾン形成
誘導体(および他の水溶性ポリマー)を使用するとき得
られる他の利点は、ヒドラジドまたはオキシルアミン
(または同様な化合物)のアルデヒドへのカップリング
が、それぞれ、ヒドラゾンまたはオキシムを生ずるとい
うことであるが、アミンを介するカップリングはイミン
を生成し、これはヒドラゾンまたはオキシムより安定性
に劣り、そして還元して安定な誘導体を生成することが
必要である。こうして、ヒドラゾン形成化合物の代わり
にアミンを使用するとき、余分の工程を必要とする。
【0049】本発明の他の利点は、他の水溶性ポリマー
の誘導体を使用するときより高いレベルの水溶性ポリマ
ーを糖タンパク質に結合することができるということで
ある。セミカルバジド(式III)、チオセミカルバジ
ド(式IV)および炭酸ジヒドラジド(式V)誘導体
は、本発明の匹敵するヒドラジド誘導体より高い反応性
をもつので、とくに重要である。ここに記載するセミカ
ルバジド、チオセミカルバジドおよびカルボキシレート
ヒドラジドを使用するEPOの誘導化を包含する反応
は、EPOの各分子について約31〜34までのmPE
G分子の付加を生じたが、EPOの対応するヒドラジド
誘導体を使用する同様な反応はEPOの各分子について
約6〜12分子のEPOの付加を生じた。炭酸ジヒドラ
ジドおよびヒドラジドカルボキシレート誘導体とEPO
との間の反応は、EPOの各分子について22までのm
PEG分子の付加を生じた。EPOの各分子について約
20mPEG分子をmPEGのヒドラジド誘導体が組み
込むようにするために、非常に強い酸化条件、例えば、
50ミリモルの過ヨウ素酸塩、室温において60分のイ
ンキュベーションを必要とした。主題のmPEGセミカ
ルバジドおよびチオセミカルバジド誘導体は、いっそう
温和な酸化条件、例えば、10ミリモルの過ヨウ素酸
塩、0℃において5〜15分間、の下に、同様な程度に
PEGで変性されたEPOを生成するために使用するこ
とができた。強い酸化条件は多数のポリペプチドの構造
および生物学的性質悪影響を及ぼすことがあり、こうし
てPEGセミカルバジド、炭酸ジヒドラジド、ヒドラジ
ドカルボキシレートおよびチオセミカルバジド誘導体
は、ポリペプチドをPEG(または他の水溶性ポリマ
ー)で変性するためにとくに適当な化合物であることが
ある。
の誘導体を使用するときより高いレベルの水溶性ポリマ
ーを糖タンパク質に結合することができるということで
ある。セミカルバジド(式III)、チオセミカルバジ
ド(式IV)および炭酸ジヒドラジド(式V)誘導体
は、本発明の匹敵するヒドラジド誘導体より高い反応性
をもつので、とくに重要である。ここに記載するセミカ
ルバジド、チオセミカルバジドおよびカルボキシレート
ヒドラジドを使用するEPOの誘導化を包含する反応
は、EPOの各分子について約31〜34までのmPE
G分子の付加を生じたが、EPOの対応するヒドラジド
誘導体を使用する同様な反応はEPOの各分子について
約6〜12分子のEPOの付加を生じた。炭酸ジヒドラ
ジドおよびヒドラジドカルボキシレート誘導体とEPO
との間の反応は、EPOの各分子について22までのm
PEG分子の付加を生じた。EPOの各分子について約
20mPEG分子をmPEGのヒドラジド誘導体が組み
込むようにするために、非常に強い酸化条件、例えば、
50ミリモルの過ヨウ素酸塩、室温において60分のイ
ンキュベーションを必要とした。主題のmPEGセミカ
ルバジドおよびチオセミカルバジド誘導体は、いっそう
温和な酸化条件、例えば、10ミリモルの過ヨウ素酸
塩、0℃において5〜15分間、の下に、同様な程度に
PEGで変性されたEPOを生成するために使用するこ
とができた。強い酸化条件は多数のポリペプチドの構造
および生物学的性質悪影響を及ぼすことがあり、こうし
てPEGセミカルバジド、炭酸ジヒドラジド、ヒドラジ
ドカルボキシレートおよびチオセミカルバジド誘導体
は、ポリペプチドをPEG(または他の水溶性ポリマ
ー)で変性するためにとくに適当な化合物であることが
ある。
【0050】mPEGの新規な系列のオキシルアミン誘
導体を合成し、そしてEPOの酸化された炭水化物基と
反応させた。mPEG−オキシルアミンのあるものは、
酸化された炭水化物に対して高い反応性を示した。ま
た、より低い数のmPEGをEPOの中に導入すること
ができ、そしてこれらは、セミカルバジドおよびカルボ
キシレートヒドラジド(ヒドラゾン形成)mPEG誘導
体を使用するとき見られるような、高いin vivo
活性をなおあたえることができた。このより低い数のm
PEGの組み込みは、より短くかつより温和な酸化条件
を使用できるということにおいて有利である。また、よ
り少ない量のmPEG誘導体を変性反応において使用で
きる。
導体を合成し、そしてEPOの酸化された炭水化物基と
反応させた。mPEG−オキシルアミンのあるものは、
酸化された炭水化物に対して高い反応性を示した。ま
た、より低い数のmPEGをEPOの中に導入すること
ができ、そしてこれらは、セミカルバジドおよびカルボ
キシレートヒドラジド(ヒドラゾン形成)mPEG誘導
体を使用するとき見られるような、高いin vivo
活性をなおあたえることができた。このより低い数のm
PEGの組み込みは、より短くかつより温和な酸化条件
を使用できるということにおいて有利である。また、よ
り少ない量のmPEG誘導体を変性反応において使用で
きる。
【0051】同様に、式XXI、式XXIVおよび式X
XIIIの化合物を使用するとき、式XIXオキシルア
ミン誘導体に比較して、とくに高いレベルの水溶性ポリ
マーが糖タンパク質に結合される。ここに記載する式X
XIおよび式XXIVを使用するEPOの誘導化を包含
する反応は、それぞれ、EPOの各分子について18〜
19までのmPEG/EPOおよび31mPEG分子の
付加を生じたが、EPOの対応する式XXIIおよびX
IXオキシルアミン誘導体を使用する同様な反応はEP
Oの各分子について約3〜4分子のmPEGの付加を生
じた。多分より重要なことには、生ずるオキシルアミン
誘導化PEG−EPOの生物学的活性は、EPOへの水
溶性ポリマーのいっそう適度なレベルの結合においてさ
え、驚くべきほどに高い(下の説明および図17を参
照)。これに関して、式XXIIの12のmPEG単離
した分画の生物学的活性はとくに重要である(図16お
よび17を参照)。
XIIIの化合物を使用するとき、式XIXオキシルア
ミン誘導体に比較して、とくに高いレベルの水溶性ポリ
マーが糖タンパク質に結合される。ここに記載する式X
XIおよび式XXIVを使用するEPOの誘導化を包含
する反応は、それぞれ、EPOの各分子について18〜
19までのmPEG/EPOおよび31mPEG分子の
付加を生じたが、EPOの対応する式XXIIおよびX
IXオキシルアミン誘導体を使用する同様な反応はEP
Oの各分子について約3〜4分子のmPEGの付加を生
じた。多分より重要なことには、生ずるオキシルアミン
誘導化PEG−EPOの生物学的活性は、EPOへの水
溶性ポリマーのいっそう適度なレベルの結合においてさ
え、驚くべきほどに高い(下の説明および図17を参
照)。これに関して、式XXIIの12のmPEG単離
した分画の生物学的活性はとくに重要である(図16お
よび17を参照)。
【0052】酸化された炭水化物基へのmPEGのカッ
プリングを経て高い活性をもつ長く作用するmPEG−
EPOを発生する可能性は、選択したmPEG誘導体に
依存する。あるmPEG炭水化物変性誘導体は、最適量
のmPEGをEPO上に結合するために十分な程度に反
応性ではない。あるmPEG誘導体は、生ずる結合の安
定性のために、EPO上への大きい量の組み込みを必要
とする。最適量のmPEGの組み込みは、セミカルバジ
ド誘導体について約17〜25、より好ましくは約22
であり、そしてカルボキシレートヒドラジドについて約
22〜32、より好ましくは約31である。mPEG−
オキシルアミンの反応性は約3〜36mPEG/EPO
である。
プリングを経て高い活性をもつ長く作用するmPEG−
EPOを発生する可能性は、選択したmPEG誘導体に
依存する。あるmPEG炭水化物変性誘導体は、最適量
のmPEGをEPO上に結合するために十分な程度に反
応性ではない。あるmPEG誘導体は、生ずる結合の安
定性のために、EPO上への大きい量の組み込みを必要
とする。最適量のmPEGの組み込みは、セミカルバジ
ド誘導体について約17〜25、より好ましくは約22
であり、そしてカルボキシレートヒドラジドについて約
22〜32、より好ましくは約31である。mPEG−
オキシルアミンの反応性は約3〜36mPEG/EPO
である。
【0053】本発明の水溶性ポリマーの試薬を使用して
種々のポリペプチドまたは同様な分子を変性することが
でき、ここで同様な分子はアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ同様な官能基を含有し、例えば、ケト
ン、ラクトール、活性化カルボン酸または活性化カルボ
ン酸誘導体であり、ヒドロキシル基の酸化、問題のポリ
ペプチド(ポリペプチドが糖タンパク質であるとき炭水
化物部分、および一次配列の中に存在するアミノ酸残
基、例えば、セリン、スレオニン、ヒドロキシルリジン
のN末端を包含する)上に存在する他の酸化活性化可能
な基の酸化、あるいは酸化処理の前後にポリペプチド上
に存在するヒドラジンまたはオキシルアミンの反応性基
と化学的に反応することができる。問題のポリペプチド
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、サイト
カイン、成長因子、ホルモン、酵素、タンパク質または
ペプチドのリガンドなどを包含する。本発明のヒドラゾ
ン結合またはオキシム結合を形成する水溶性ポリマーの
試薬の分子により変性するための問題のポリペプチド
は、それらの天然源、遺伝子操作した細胞、例えば、E
PO生産のために発現ベクターで形質転換されたCHO
細胞から単離することができるか、あるいは種々のin
vitro合成法により生成することができる。本発
明の目的にとくに好ましいポリペプチドは、EPO、お
よびその前駆体、中間体および模倣物(ヒトまたは組み
換え体であるかどうかにかかわらず)。
種々のポリペプチドまたは同様な分子を変性することが
でき、ここで同様な分子はアルデヒド基または同様な化
学的反応性をもつ同様な官能基を含有し、例えば、ケト
ン、ラクトール、活性化カルボン酸または活性化カルボ
ン酸誘導体であり、ヒドロキシル基の酸化、問題のポリ
ペプチド(ポリペプチドが糖タンパク質であるとき炭水
化物部分、および一次配列の中に存在するアミノ酸残
基、例えば、セリン、スレオニン、ヒドロキシルリジン
のN末端を包含する)上に存在する他の酸化活性化可能
な基の酸化、あるいは酸化処理の前後にポリペプチド上
に存在するヒドラジンまたはオキシルアミンの反応性基
と化学的に反応することができる。問題のポリペプチド
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、サイト
カイン、成長因子、ホルモン、酵素、タンパク質または
ペプチドのリガンドなどを包含する。本発明のヒドラゾ
ン結合またはオキシム結合を形成する水溶性ポリマーの
試薬の分子により変性するための問題のポリペプチド
は、それらの天然源、遺伝子操作した細胞、例えば、E
PO生産のために発現ベクターで形質転換されたCHO
細胞から単離することができるか、あるいは種々のin
vitro合成法により生成することができる。本発
明の目的にとくに好ましいポリペプチドは、EPO、お
よびその前駆体、中間体および模倣物(ヒトまたは組み
換え体であるかどうかにかかわらず)。
【0054】本発明の水溶性ポリマーの試薬を使用して
ほとんどのポリペプチドを変性することができるが、
(1)薬物として使用するためにポリペプチド、および
(2)検定において使用するためにポリペプチドを変性
することはとくに重要である。検定において使用するた
めのポリペプチドは、特異的に結合するタンパク質、特
異的に結合するタンパク質、および酵素を包含する。特
異的に結合するタンパク質とは、抗体、ホルモンリセプ
ター、レクチンなどを包含する。
ほとんどのポリペプチドを変性することができるが、
(1)薬物として使用するためにポリペプチド、および
(2)検定において使用するためにポリペプチドを変性
することはとくに重要である。検定において使用するた
めのポリペプチドは、特異的に結合するタンパク質、特
異的に結合するタンパク質、および酵素を包含する。特
異的に結合するタンパク質とは、抗体、ホルモンリセプ
ター、レクチンなどを包含する。
【0055】種々のポリペプチドを、本発明の水溶性ポ
リマーの試薬およびそれらの使用する本発明の方法によ
り、異なる水溶性ポリマーにカップリングするように、
異なる変性度に変性することができる。変化するパラメ
ーター、例えば、(1)個々のポリペプチド分子にカッ
プリングする水溶性ポリマーの数、これはEPOに対す
る誘導化mPEGの活性および生ずるmPEG−EPO
の生物学的活性に依存する;例えば、約3〜36分子の
mPEG/EPOの反応性、(2)水溶性ポリマーの分
子量、例えば、2,000〜12,000ダルトン、
(3)水溶性ポリマーの構造、例えば、モノメトキシポ
リ(エチレングリコール)、(4)水溶性ポリマーの試
薬と問題のポリペプチドとの間の反応を実施する反応条
件、例えば、温度および期間、および(5)変性のため
のポリペプチドを共有結合の接合のために活性化する酸
化条件、例えば、10〜40μmol/mgのタンパク
質の範囲の濃度における過ヨウ素酸塩は、生ずる水溶性
ポリマー変性ポリペプチドの生物学的性質に影響を及ぼ
すことがある。
リマーの試薬およびそれらの使用する本発明の方法によ
り、異なる水溶性ポリマーにカップリングするように、
異なる変性度に変性することができる。変化するパラメ
ーター、例えば、(1)個々のポリペプチド分子にカッ
プリングする水溶性ポリマーの数、これはEPOに対す
る誘導化mPEGの活性および生ずるmPEG−EPO
の生物学的活性に依存する;例えば、約3〜36分子の
mPEG/EPOの反応性、(2)水溶性ポリマーの分
子量、例えば、2,000〜12,000ダルトン、
(3)水溶性ポリマーの構造、例えば、モノメトキシポ
リ(エチレングリコール)、(4)水溶性ポリマーの試
薬と問題のポリペプチドとの間の反応を実施する反応条
件、例えば、温度および期間、および(5)変性のため
のポリペプチドを共有結合の接合のために活性化する酸
化条件、例えば、10〜40μmol/mgのタンパク
質の範囲の濃度における過ヨウ素酸塩は、生ずる水溶性
ポリマー変性ポリペプチドの生物学的性質に影響を及ぼ
すことがある。
【0056】本発明の好ましい態様において、共有結合
の接合のためのポリペプチドの活性化は、変性のための
タンパク質を過ヨウ素酸塩(0.1〜1,000μmo
l/mgタンパク質)と1分〜3日の範囲の期間の間、
より好ましくは0.5〜50μmolの過ヨウ素酸塩/
mgのタンパク質と5分〜180分の範囲の間混合する
ことによって実施する。本発明の好ましい態様におい
て、接合のための活性化は変性のためのタンパク質を過
ヨウ素酸塩と−10〜50℃、好ましくは0〜30℃の
範囲の温度において混合することによって実施する。
の接合のためのポリペプチドの活性化は、変性のための
タンパク質を過ヨウ素酸塩(0.1〜1,000μmo
l/mgタンパク質)と1分〜3日の範囲の期間の間、
より好ましくは0.5〜50μmolの過ヨウ素酸塩/
mgのタンパク質と5分〜180分の範囲の間混合する
ことによって実施する。本発明の好ましい態様におい
て、接合のための活性化は変性のためのタンパク質を過
ヨウ素酸塩と−10〜50℃、好ましくは0〜30℃の
範囲の温度において混合することによって実施する。
【0057】本発明の好ましい態様において、変性のた
めのタンパク質がEPOであるとき、EPOを式II〜
VIIの化合物、好ましくは式II〜Vの化合物で誘導
化し、式IIIの化合物、セミカルバジド、および式I
Iの化合物、カルボキシレートヒドラジドはとくに好ま
しく、ここで水溶性ポリマーPはモノメトキシポリエチ
レングリコール(mPEG)であり、そしてEPOの各
分子は3〜36、より好ましくは17〜25分子のモノ
メトキシポリエチレングリコール(セミカルバジドの場
合において)、およびより好ましくは22〜32分子の
モノメトキシポリエチレングリコール(カルボキシレー
トヒドラジドの場合において)により誘導化し、そして
使用するmPEGは約5000ダルトンの平均分子量を
有する。mPEG5000セミカルバジド変性EPOの
製造のために好ましい反応条件は、0〜30℃において
5〜60分間および0.5〜50μmolの過ヨウ素酸
塩/mgのEPO(酸化剤として過ヨウ素酸塩を使用す
る)である。本発明の水溶性ポリマーの試薬および方法
により変性するためのEPOは、好ましくは遺伝子操作
した細胞から、より好ましくはEPOを生産するように
遺伝学的に変性されたCHO細胞から得られる。EPO
の変性に好ましい水溶性ポリマーの試薬および方法を使
用することによって、EPOの予期せざるほどに延長さ
れた生物学的半減期が得られ、そして増加したヘマトク
リットのレベルを見るすることができる、例えば、図
2、4および5を参照。
めのタンパク質がEPOであるとき、EPOを式II〜
VIIの化合物、好ましくは式II〜Vの化合物で誘導
化し、式IIIの化合物、セミカルバジド、および式I
Iの化合物、カルボキシレートヒドラジドはとくに好ま
しく、ここで水溶性ポリマーPはモノメトキシポリエチ
レングリコール(mPEG)であり、そしてEPOの各
分子は3〜36、より好ましくは17〜25分子のモノ
メトキシポリエチレングリコール(セミカルバジドの場
合において)、およびより好ましくは22〜32分子の
モノメトキシポリエチレングリコール(カルボキシレー
トヒドラジドの場合において)により誘導化し、そして
使用するmPEGは約5000ダルトンの平均分子量を
有する。mPEG5000セミカルバジド変性EPOの
製造のために好ましい反応条件は、0〜30℃において
5〜60分間および0.5〜50μmolの過ヨウ素酸
塩/mgのEPO(酸化剤として過ヨウ素酸塩を使用す
る)である。本発明の水溶性ポリマーの試薬および方法
により変性するためのEPOは、好ましくは遺伝子操作
した細胞から、より好ましくはEPOを生産するように
遺伝学的に変性されたCHO細胞から得られる。EPO
の変性に好ましい水溶性ポリマーの試薬および方法を使
用することによって、EPOの予期せざるほどに延長さ
れた生物学的半減期が得られ、そして増加したヘマトク
リットのレベルを見るすることができる、例えば、図
2、4および5を参照。
【0058】他の好ましい態様において、EPOを式X
X〜XXVIIの化合物、より好ましくは式XXI〜X
XIVの化合物で誘導化し、ここで水溶性ポリマーPは
mPEGであり、そしてEPOの各分子を、式XXI、
XXIVおよびXXIIIについて、それぞれ、約18
〜19mPEG、31mPEGおよび17mPEGで誘
導化する。これらの結果は使用するmPEGが約500
0ダルトンの平均分子量を有するとき得られた。式XX
IIIの化合物は12mPEGの分画を有し、この分画
は22mPEGセミカルバジドおよび31mPEGカル
ボキシレートヒドラジドに匹敵するin vivo生物
学的活性を有した。式XXI、XXIVおよびXXII
Iについての反応性(mPEGの分子数/EPO)は、
同一反応条件下に、PEGヒドラジドについてのそれを
越えた。mPEG5000オキシムの製造のための好ま
しい反応条件は、より高いin vivo生物学的活性
を生成するために、対応するヒドラジドの場合より、い
っそう温和な酸化条件、例えば、より短い酸化時間また
はより低い酸化剤の濃度であることができる。
X〜XXVIIの化合物、より好ましくは式XXI〜X
XIVの化合物で誘導化し、ここで水溶性ポリマーPは
mPEGであり、そしてEPOの各分子を、式XXI、
XXIVおよびXXIIIについて、それぞれ、約18
〜19mPEG、31mPEGおよび17mPEGで誘
導化する。これらの結果は使用するmPEGが約500
0ダルトンの平均分子量を有するとき得られた。式XX
IIIの化合物は12mPEGの分画を有し、この分画
は22mPEGセミカルバジドおよび31mPEGカル
ボキシレートヒドラジドに匹敵するin vivo生物
学的活性を有した。式XXI、XXIVおよびXXII
Iについての反応性(mPEGの分子数/EPO)は、
同一反応条件下に、PEGヒドラジドについてのそれを
越えた。mPEG5000オキシムの製造のための好ま
しい反応条件は、より高いin vivo生物学的活性
を生成するために、対応するヒドラジドの場合より、い
っそう温和な酸化条件、例えば、より短い酸化時間また
はより低い酸化剤の濃度であることができる。
【0059】本発明は、また、本発明の水溶性ポリマー
の試薬との接合、すなわち、共有結合の接合のためにポ
リペプチドを活性化する方法を提供する。接合のために
ポリペプチドを活性化するこれらの方法は、問題のピペ
ロニルを部分的に酸化に酸化する工程からなる。部分的
酸化は、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸塩および当業者に
知られている他の酸化剤を添加するか、あるいは問題の
ポリペプチドの部分上で酸化反応を触媒することができ
る酵素、例えば、ガラクトースオキシダーゼを添加する
ことによって達成できる。接合のための活性化のために
ポリペプチドを部分的に酸化する好ましい方法は、0.
1〜1,000μmol/mgのタンパク質の範囲の濃
度で過ヨウ素酸塩を1分〜3日の範囲の期間の間、より
好ましくは0.5〜50μmol/mgのタンパク質の
範囲の濃度で過ヨウ素酸塩を5分〜180分の範囲の期
間の間添加することによる。活性化を実施する温度は好
ましくは−10〜50℃の範囲、より好ましくは0〜3
0℃の範囲である。
の試薬との接合、すなわち、共有結合の接合のためにポ
リペプチドを活性化する方法を提供する。接合のために
ポリペプチドを活性化するこれらの方法は、問題のピペ
ロニルを部分的に酸化に酸化する工程からなる。部分的
酸化は、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸塩および当業者に
知られている他の酸化剤を添加するか、あるいは問題の
ポリペプチドの部分上で酸化反応を触媒することができ
る酵素、例えば、ガラクトースオキシダーゼを添加する
ことによって達成できる。接合のための活性化のために
ポリペプチドを部分的に酸化する好ましい方法は、0.
1〜1,000μmol/mgのタンパク質の範囲の濃
度で過ヨウ素酸塩を1分〜3日の範囲の期間の間、より
好ましくは0.5〜50μmol/mgのタンパク質の
範囲の濃度で過ヨウ素酸塩を5分〜180分の範囲の期
間の間添加することによる。活性化を実施する温度は好
ましくは−10〜50℃の範囲、より好ましくは0〜3
0℃の範囲である。
【0060】ここに記載する高分子、例えば、ポリペプ
チド、水溶性ポリマーおよびそれらの誘導体の任意のも
のの塩類は、このような分子が種々のpHの水溶液の中
に存在する(またはそれから単離された)とき、天然に
存在するであろう。示した生物学的活性を有するポリペ
プチドおよび他の高分子のすべての塩類は、本発明の範
囲内に入ると考えられる。このような塩類の例は、カル
ボン酸残基のアルカリ金属、アルカリ土類金属および他
の金属の塩類、アミノ残基の酸付加塩(例えば、HC
l)、および同一分子内のカルボン酸およびアミノ残基
の間の反応により形成した両性イオンを包含する。本発
明の化合物は単独で投与することができるが、一般に、
意図する投与のルートおよび標準的製剤学的実施に関し
て選択された製剤学的担体または希釈剤と混合して投与
されるであろう。調製物は非経口的に、例えば、動脈内
または静脈内に注射することができる。この調製物は、
また、経口的、皮下または筋肉内のルートで供給するこ
とができる。非経口的投与のために、それらは、例え
ば、無菌の水溶液の形態で使用することができ、この水
溶液は他の溶質、例えば、この溶液を等張とするために
十分な塩類またはグルコースを含有することができる。
チド、水溶性ポリマーおよびそれらの誘導体の任意のも
のの塩類は、このような分子が種々のpHの水溶液の中
に存在する(またはそれから単離された)とき、天然に
存在するであろう。示した生物学的活性を有するポリペ
プチドおよび他の高分子のすべての塩類は、本発明の範
囲内に入ると考えられる。このような塩類の例は、カル
ボン酸残基のアルカリ金属、アルカリ土類金属および他
の金属の塩類、アミノ残基の酸付加塩(例えば、HC
l)、および同一分子内のカルボン酸およびアミノ残基
の間の反応により形成した両性イオンを包含する。本発
明の化合物は単独で投与することができるが、一般に、
意図する投与のルートおよび標準的製剤学的実施に関し
て選択された製剤学的担体または希釈剤と混合して投与
されるであろう。調製物は非経口的に、例えば、動脈内
または静脈内に注射することができる。この調製物は、
また、経口的、皮下または筋肉内のルートで供給するこ
とができる。非経口的投与のために、それらは、例え
ば、無菌の水溶液の形態で使用することができ、この水
溶液は他の溶質、例えば、この溶液を等張とするために
十分な塩類またはグルコースを含有することができる。
【0061】経口的モードの投与のために、的のEPO
組成物は錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、散剤、シロップ
剤、エリキシル、水溶液および水性懸濁液などの形態で
使用することができる。錠剤の場合において、使用でき
る担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリ
ン酸の塩類を包含する。種々の崩壊剤、例えば、澱粉、
および滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを錠剤
において普通に使用する。カプセル剤の形態で投与する
ために、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポ
リエチレングリコールである。水溶液を経口的使用のた
めに必要とするとき、ある種の甘味剤および/または香
味剤を添加できる。
組成物は錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、散剤、シロップ
剤、エリキシル、水溶液および水性懸濁液などの形態で
使用することができる。錠剤の場合において、使用でき
る担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリ
ン酸の塩類を包含する。種々の崩壊剤、例えば、澱粉、
および滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを錠剤
において普通に使用する。カプセル剤の形態で投与する
ために、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポ
リエチレングリコールである。水溶液を経口的使用のた
めに必要とするとき、ある種の甘味剤および/または香
味剤を添加できる。
【0062】EPOの治療に対して応答する疾患の状態
の処置においてヒトに投与するために、処方する医師は
所定のヒトの被検体のために適当な投与量を究極的に決
定し、そしてこれは体重、年令および個体の応答ならび
に患者の疾患の性質およびひどさに従い変化することが
期待される。ペギレイテッド(pegylated)形
態の薬物の投与量は、一般に、天然の薬物のために使用
される量であることができるが、ある場合において、こ
れらの限界外の投与量を投与することが好ましいか、あ
るいは必要であることがある。
の処置においてヒトに投与するために、処方する医師は
所定のヒトの被検体のために適当な投与量を究極的に決
定し、そしてこれは体重、年令および個体の応答ならび
に患者の疾患の性質およびひどさに従い変化することが
期待される。ペギレイテッド(pegylated)形
態の薬物の投与量は、一般に、天然の薬物のために使用
される量であることができるが、ある場合において、こ
れらの限界外の投与量を投与することが好ましいか、あ
るいは必要であることがある。
【0063】また、式I、II、III、IV、V、V
I、VII、VIIIおよびIX、および式XIX、X
X、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XX
V、XXVIおよびXXVIIの水溶性ポリマーの試薬
を別々にまたは種々の組み合わせで、キットの形態で供
給して、問題のポリペプチドの便利なかつ再現性ある誘
導化を提供することが重要である。問題のキットは式
I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII
またはIXの水溶性ポリマーの試薬、あるいは式XI
X、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、
XXV、XXVIまたはXXVIIの水溶性ポリマーの
試薬、緩衝剤、酸化剤、反応インディケーター化合物、
タンパク質濃度媒質試薬、例えば、フラッドフォード
(Bradford)アッセイのために、などからなる
溶液を含有することができる。キットの中に含まれる化
合物は、再現性を提供しかつ誤差を最小とするために、
好ましくは前以て媒質した部分および前以て混合した溶
液で提供される。キットは、また、好ましくは取扱説明
書を含有する。取扱説明書は主題の方法を実施するとき
の種々の工程に関するものである。
I、VII、VIIIおよびIX、および式XIX、X
X、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XX
V、XXVIおよびXXVIIの水溶性ポリマーの試薬
を別々にまたは種々の組み合わせで、キットの形態で供
給して、問題のポリペプチドの便利なかつ再現性ある誘
導化を提供することが重要である。問題のキットは式
I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII
またはIXの水溶性ポリマーの試薬、あるいは式XI
X、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、
XXV、XXVIまたはXXVIIの水溶性ポリマーの
試薬、緩衝剤、酸化剤、反応インディケーター化合物、
タンパク質濃度媒質試薬、例えば、フラッドフォード
(Bradford)アッセイのために、などからなる
溶液を含有することができる。キットの中に含まれる化
合物は、再現性を提供しかつ誤差を最小とするために、
好ましくは前以て媒質した部分および前以て混合した溶
液で提供される。キットは、また、好ましくは取扱説明
書を含有する。取扱説明書は主題の方法を実施するとき
の種々の工程に関するものである。
【0064】水溶性ポリマーの誘導体の合成 次の本発明の化合物の合成は例示であり、そして本発明
を限定することを意図しない。有機化学における当業者
は例示した合成についての種々の変化を案出することが
できるであろう。
を限定することを意図しない。有機化学における当業者
は例示した合成についての種々の変化を案出することが
できるであろう。
【0065】ヒドラゾン形成m−PEGの合成 mPEG−ヒドラジドの合成 mPEG−ヒドラジドを合成するいくつかの方法が存在
する。2つの方法を示す。
する。2つの方法を示す。
【0066】mPEG5000酸(20.8g、4mm
ol)を30mlのジクロロメタン中に溶解し、そして
15mlのジクロロメタン中のt−ブチルカルバゼート
(2.64g、8mmol)を添加し、次いで10ml
のジメチルホルムアミド中に溶解した1.68g(8m
mol)のジシクロヘキシルカーボジイミドを添加し
た。室温において反応を一夜進行させた後、反応混合物
を濾過した。濾液を濃縮し、そして生ずる残留物をジク
ロロメタン中に取った。エーテルを添加してmPEG−
t−ブチル−カルバゼートを沈澱させ、これを濾過し、
そして乾燥した。生成物をジクロロメタン/トリフルオ
ロ酢酸(1:1)混合物の中に入れた。40分後、溶液
を濃縮し、ジクロロメタンの中に再溶解し、そしてエー
テルを添加した。生成物を濾過により回収した。収量1
7.7g。IR:(C=O)1730、1700。分
析、Nについての計算値:0.55。実測値:N、0.
44。下に示す別法はmPEG−アルコールをエステル
に転化した。次いで、mPEG−エステルをヒドラジン
で加水分解してmPEG−ヒドラジドを生成する。mP
EG−エステルの合成は、ロイアー(Royer)、
G.P.およびアナンサーマイア(Anantherm
aiah)、G.M.(1979)ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティー(J.Am.C
hem.Soc.)、101、3394−3395の手
順に類似する。
ol)を30mlのジクロロメタン中に溶解し、そして
15mlのジクロロメタン中のt−ブチルカルバゼート
(2.64g、8mmol)を添加し、次いで10ml
のジメチルホルムアミド中に溶解した1.68g(8m
mol)のジシクロヘキシルカーボジイミドを添加し
た。室温において反応を一夜進行させた後、反応混合物
を濾過した。濾液を濃縮し、そして生ずる残留物をジク
ロロメタン中に取った。エーテルを添加してmPEG−
t−ブチル−カルバゼートを沈澱させ、これを濾過し、
そして乾燥した。生成物をジクロロメタン/トリフルオ
ロ酢酸(1:1)混合物の中に入れた。40分後、溶液
を濃縮し、ジクロロメタンの中に再溶解し、そしてエー
テルを添加した。生成物を濾過により回収した。収量1
7.7g。IR:(C=O)1730、1700。分
析、Nについての計算値:0.55。実測値:N、0.
44。下に示す別法はmPEG−アルコールをエステル
に転化した。次いで、mPEG−エステルをヒドラジン
で加水分解してmPEG−ヒドラジドを生成する。mP
EG−エステルの合成は、ロイアー(Royer)、
G.P.およびアナンサーマイア(Anantherm
aiah)、G.M.(1979)ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアティー(J.Am.C
hem.Soc.)、101、3394−3395の手
順に類似する。
【0067】
【化26】
【0068】典型的な合成において、mPEG−OHを
高真空炉中で約5時間85℃において乾燥した。冷却
後、5gのmPEG−OH(分子量=5000、1mm
ol)を5mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し
た。26.4mg(1.1mmol)の水素化ナトリウ
ムに、1mlの乾燥テトラヒドロフランを添加した。m
PEG5000溶液をNaHに滴々添加した。この混合
物をアルゴン雰囲気中で室温において1時間撹拌した。
この時間の間、溶液はオレンジ色になった。ブロモアセ
チル酸ベンジルエステル(2.29g、10mmol)
を1mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、そして
この溶液をmPEG5000混合物に滴々添加した。反
応混合物を室温においてアルゴン雰囲気下に一夜撹拌
し、次いで濾過した。冷エーテルを濾液に添加してmP
EG5000−ベンジルエステルを沈澱させ、そして固
体を集め、そして乾燥した。収量4.5g。IR:(C
=O)1752。この化合物をLH−20カラムのゲル
濾過により精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。
高真空炉中で約5時間85℃において乾燥した。冷却
後、5gのmPEG−OH(分子量=5000、1mm
ol)を5mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し
た。26.4mg(1.1mmol)の水素化ナトリウ
ムに、1mlの乾燥テトラヒドロフランを添加した。m
PEG5000溶液をNaHに滴々添加した。この混合
物をアルゴン雰囲気中で室温において1時間撹拌した。
この時間の間、溶液はオレンジ色になった。ブロモアセ
チル酸ベンジルエステル(2.29g、10mmol)
を1mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、そして
この溶液をmPEG5000混合物に滴々添加した。反
応混合物を室温においてアルゴン雰囲気下に一夜撹拌
し、次いで濾過した。冷エーテルを濾液に添加してmP
EG5000−ベンジルエステルを沈澱させ、そして固
体を集め、そして乾燥した。収量4.5g。IR:(C
=O)1752。この化合物をLH−20カラムのゲル
濾過により精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。
【0069】mPEG5000−ベンジルエステルをヒ
ドラジンで処理してヒドラジドに転化した。典型的な実
験において、1.0gのmPEG5000−ベンジルエ
ステルをアルゴン雰囲気下に3mlのメタノール/塩化
メチレン(5:1)中に溶解した。ヒドラジン(0.0
91ml、2.91mmol)を添加し、そしてこの溶
液を室温において約70時間撹拌した。この混合物をL
H−20カラム上でおき、メタノール/塩化メチレン
(5:1)で溶離した。mPEG−ヒドラジドをヒドラ
ジドから分離し、そしてエーテルで沈澱させた。固体を
濾過により集めた。収量0.78g。IR(H2N−C
=O):1669。分析、Nについての計算値、0.5
5。実測値:N、0.34。
ドラジンで処理してヒドラジドに転化した。典型的な実
験において、1.0gのmPEG5000−ベンジルエ
ステルをアルゴン雰囲気下に3mlのメタノール/塩化
メチレン(5:1)中に溶解した。ヒドラジン(0.0
91ml、2.91mmol)を添加し、そしてこの溶
液を室温において約70時間撹拌した。この混合物をL
H−20カラム上でおき、メタノール/塩化メチレン
(5:1)で溶離した。mPEG−ヒドラジドをヒドラ
ジドから分離し、そしてエーテルで沈澱させた。固体を
濾過により集めた。収量0.78g。IR(H2N−C
=O):1669。分析、Nについての計算値、0.5
5。実測値:N、0.34。
【0070】また、mPEG2000−ヒドラジド、m
PEG6000−ヒドラジド、mPEG8500−ヒド
ラジド,およびmPEG12000−ヒドラジドを前述
の手順により合成した。
PEG6000−ヒドラジド、mPEG8500−ヒド
ラジド,およびmPEG12000−ヒドラジドを前述
の手順により合成した。
【0071】mPEG−ヒドラジンカルボキシレートの
合成
合成
【0072】
【化27】
【0073】上のmPEG5000−ヒドラジンカルボ
キシレートは次のようにして合成した。メトキシポリオ
キシエチレンイミダゾリルカルボニル(シグマ・ケミカ
ル(Sigma Chemical)から、2.5g、
0.49mmol)を、10mlの塩化メチレン中でヒ
ドラジン(0.077ml、2.45mmol)で処理
した。室温において4時間後、反応混合物を濾過し、そ
して濾液を冷エーテルで処理した。収量2.22g。I
R(C=O):1718。分析、Nについての計算値、
0.55。実測値:N、0.595。
キシレートは次のようにして合成した。メトキシポリオ
キシエチレンイミダゾリルカルボニル(シグマ・ケミカ
ル(Sigma Chemical)から、2.5g、
0.49mmol)を、10mlの塩化メチレン中でヒ
ドラジン(0.077ml、2.45mmol)で処理
した。室温において4時間後、反応混合物を濾過し、そ
して濾液を冷エーテルで処理した。収量2.22g。I
R(C=O):1718。分析、Nについての計算値、
0.55。実測値:N、0.595。
【0074】mPEG−セミカルバジドの合成
【0075】
【化28】
【0076】上のmPEG5000−セミカルバジドを
次のようにして合成した。mPEG5000−アミン
を、ラジャセクハラン・ピライ(Rajasekhar
anPillai)、V.N.およびムッター(Mut
ter)、M.(1980)ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)、4
5、5364−5370に記載されているようにして合
成した。mPEG5000−アミン(2g、0.4mm
ol)を9mlのジクロロメタン中に溶解し、そして
0.28mlのトリエチルアミンを添加した。この混合
物にアルゴン雰囲気下にホスゲン(トルエン中、0.4
2ml、0.8mmol)を添加した。反応を一夜通気
し、次いでアルゴンで泡立てて過剰のホスゲンを除去し
た。この溶液を濃縮し、そして残留物をジクロロメタン
中に溶解し、そして0.063mlのヒドラジン(2m
mol)を添加し、次いで2mlのメタノールを添加し
た。反応を4時間通気し、次いで冷エーテルを添加し、
そして沈澱を濾過により取り出し、そして乾燥した。収
量1.51g。IR(C=O):1683。分析、Nに
ついての計算値、0.83。実測値:N、0.56。
次のようにして合成した。mPEG5000−アミン
を、ラジャセクハラン・ピライ(Rajasekhar
anPillai)、V.N.およびムッター(Mut
ter)、M.(1980)ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)、4
5、5364−5370に記載されているようにして合
成した。mPEG5000−アミン(2g、0.4mm
ol)を9mlのジクロロメタン中に溶解し、そして
0.28mlのトリエチルアミンを添加した。この混合
物にアルゴン雰囲気下にホスゲン(トルエン中、0.4
2ml、0.8mmol)を添加した。反応を一夜通気
し、次いでアルゴンで泡立てて過剰のホスゲンを除去し
た。この溶液を濃縮し、そして残留物をジクロロメタン
中に溶解し、そして0.063mlのヒドラジン(2m
mol)を添加し、次いで2mlのメタノールを添加し
た。反応を4時間通気し、次いで冷エーテルを添加し、
そして沈澱を濾過により取り出し、そして乾燥した。収
量1.51g。IR(C=O):1683。分析、Nに
ついての計算値、0.83。実測値:N、0.56。
【0077】また、前述の手順を使用して、mPEG2
000、mPEG8500、およびmPEG12000
のセミカルバジドを合成した。
000、mPEG8500、およびmPEG12000
のセミカルバジドを合成した。
【0078】mPEG−チオセミカルバジドの合成 5mlのジクロロメタン中の1.5gのmPEG500
0−アミンに、0.1mlのトリエチルアミン(0.7
5mmol)および0.071g(0.3mmol)の
ジ−2−ピリジルチオノカーボネートを添加した。反応
を一夜通気し、次いで0.047ml(0.3mmo
l)のヒドラジンを添加した。4時間後、この混合物を
濾過し、そして濾液を冷エーテルで処理した。生成物を
濾過により集めた。収量1.34g。IR(N=Hスト
レッチ):3332。分析、Nについての計算値、0.
83。実測値:N、0.255。
0−アミンに、0.1mlのトリエチルアミン(0.7
5mmol)および0.071g(0.3mmol)の
ジ−2−ピリジルチオノカーボネートを添加した。反応
を一夜通気し、次いで0.047ml(0.3mmo
l)のヒドラジンを添加した。4時間後、この混合物を
濾過し、そして濾液を冷エーテルで処理した。生成物を
濾過により集めた。収量1.34g。IR(N=Hスト
レッチ):3332。分析、Nについての計算値、0.
83。実測値:N、0.255。
【0079】mPEG−炭酸ジヒドラジドの合成 アルゴンでパージした反応フラスコに、2mlのジクロ
ロメタン、0.084mlのトリエチルアミン(0.6
mmol)および0.03gのトリホスゲン(0.1m
mol)中のt−ブチルカルバゼート(0.04g、
0.3mmol)を添加した。5分後、4mlのジクロ
ロメタン中の1.5gのmPEG5000−アミン
(0.3mmol)を添加した。反応を一夜通気し、次
いで冷エーテルを添加して生成物を沈澱させた。生成物
を濾過により単離した。収量1.44g。保護したジヒ
ドラジド(0.61g)を室温において10分間2ml
のトリフルオロ酢酸で処理した。トリフルオロ酢酸を除
去し、そして生ずる油を塩化メチレン中に溶解し、そし
て濃縮した。この工程を反復した。この油を塩化メチレ
ン中に溶解し、そして生成物を冷エーテルで沈澱させ
た。生成物を濾過により単離した。収量0.41g。I
R(C=O):1695。分析、Nについての計算値、
1.37。実測値:N、0.41。
ロメタン、0.084mlのトリエチルアミン(0.6
mmol)および0.03gのトリホスゲン(0.1m
mol)中のt−ブチルカルバゼート(0.04g、
0.3mmol)を添加した。5分後、4mlのジクロ
ロメタン中の1.5gのmPEG5000−アミン
(0.3mmol)を添加した。反応を一夜通気し、次
いで冷エーテルを添加して生成物を沈澱させた。生成物
を濾過により単離した。収量1.44g。保護したジヒ
ドラジド(0.61g)を室温において10分間2ml
のトリフルオロ酢酸で処理した。トリフルオロ酢酸を除
去し、そして生ずる油を塩化メチレン中に溶解し、そし
て濃縮した。この工程を反復した。この油を塩化メチレ
ン中に溶解し、そして生成物を冷エーテルで沈澱させ
た。生成物を濾過により単離した。収量0.41g。I
R(C=O):1695。分析、Nについての計算値、
1.37。実測値:N、0.41。
【0080】mPEG−アリールヒドラジドの合成
【0081】
【化29】
【0082】上のmPEG5000−アリールヒドラジ
ドを次のようにして合成した。4−ヒドラジノ安息香酸
をジ−t−ブチルピロカーボネートとジオキサン中で塩
基の存在下に0℃において反応させることによって、B
oc−NHNH−C6H4−COOHを調製した。保護し
たアリール酸ヒドラジン(0.378g、1.5mmo
l)をmPEG−アミン(1.5g、0.3mmol)
とジクロロメタン/ジメチルホルムアミド溶液(4m
l、1:1)中で反応させた。また、ジシクロヘキシル
カーボジイミド(0.31g、1.5mmol)、1−
ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.2g、1.5mm
ol)およびトリエチルアミン(0.21ml、1.5
mmol)を添加した。反応を一夜通気し、次いで内容
物を濾過した。濾液をエーテルで処理し、そして沈澱を
集めた。沈澱をトリフルオロ酢酸で処理し、そして30
分後、トリフルオロ酢酸を除去した。エーテルを油状残
留物に添加して、mPEG−アリールヒドラジン生成物
を沈澱させた。生成物を濾過により単離した。収量1.
19g。IR(N−H):3267;(C=O):16
55;(C=O):1606。分析、Nについての計算
値、0.82。実測値:N、0.50。
ドを次のようにして合成した。4−ヒドラジノ安息香酸
をジ−t−ブチルピロカーボネートとジオキサン中で塩
基の存在下に0℃において反応させることによって、B
oc−NHNH−C6H4−COOHを調製した。保護し
たアリール酸ヒドラジン(0.378g、1.5mmo
l)をmPEG−アミン(1.5g、0.3mmol)
とジクロロメタン/ジメチルホルムアミド溶液(4m
l、1:1)中で反応させた。また、ジシクロヘキシル
カーボジイミド(0.31g、1.5mmol)、1−
ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.2g、1.5mm
ol)およびトリエチルアミン(0.21ml、1.5
mmol)を添加した。反応を一夜通気し、次いで内容
物を濾過した。濾液をエーテルで処理し、そして沈澱を
集めた。沈澱をトリフルオロ酢酸で処理し、そして30
分後、トリフルオロ酢酸を除去した。エーテルを油状残
留物に添加して、mPEG−アリールヒドラジン生成物
を沈澱させた。生成物を濾過により単離した。収量1.
19g。IR(N−H):3267;(C=O):16
55;(C=O):1606。分析、Nについての計算
値、0.82。実測値:N、0.50。
【0083】オキシム形成mPEGの合成 CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−CO−ONH
2の合成
2の合成
【0084】
【化30】
【0085】mPEG−5000スクシンイミドエステ
ル(NHS)(2.0g、0.4mmol)を10ml
のジクロロメタン中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロ
キシカルバメート(0.53g、4mmol)を添加
し、次いで0.7mlのトリエチルアミン(5mmo
l)を添加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテル
を添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄
し、そして乾燥した。生成物(1.5g)をジクロロメ
タン/トリフルオロ酢酸(1:1)混合物の中に入れ
た。60分後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH
−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量1.2
g。IR(C=O):1741。分析、Nについての計
算値、0.28。実測値:N、0.13。
ル(NHS)(2.0g、0.4mmol)を10ml
のジクロロメタン中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロ
キシカルバメート(0.53g、4mmol)を添加
し、次いで0.7mlのトリエチルアミン(5mmo
l)を添加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテル
を添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄
し、そして乾燥した。生成物(1.5g)をジクロロメ
タン/トリフルオロ酢酸(1:1)混合物の中に入れ
た。60分後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH
−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量1.2
g。IR(C=O):1741。分析、Nについての計
算値、0.28。実測値:N、0.13。
【0086】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
O−CO−ONH2の合成
O−CO−ONH2の合成
【0087】
【化31】
【0088】mPEG5000−オキシカルボニルイミ
ダゾール(2.0g、0.4mmol)を10mlのジ
クロロメタン中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロキシ
カルバメート(0.53g、4mmol)を添加し、次
いで0.7mlのトリエチルアミン(5mmol)を添
加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。生成物(1.5g)をジクロロメタン/ト
リフルオロ酢酸(1:2)混合物の中に入れた。60分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH−20カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール/塩化メ
チレン(5:1)で溶離した。収量1.2g。IR(C
=O):1741。分析、Nについての計算値、0.2
8。実測値:N、0.15。
ダゾール(2.0g、0.4mmol)を10mlのジ
クロロメタン中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロキシ
カルバメート(0.53g、4mmol)を添加し、次
いで0.7mlのトリエチルアミン(5mmol)を添
加した。反応を一夜進行させた後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。生成物(1.5g)をジクロロメタン/ト
リフルオロ酢酸(1:2)混合物の中に入れた。60分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH−20カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール/塩化メ
チレン(5:1)で溶離した。収量1.2g。IR(C
=O):1741。分析、Nについての計算値、0.2
8。実測値:N、0.15。
【0089】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
NH−CO−ONH2の合成
NH−CO−ONH2の合成
【0090】
【化32】
【0091】mPEG5000−アミン(2.0g、
0.4mmol)をカルボニルイミダゾール(0.23
g、1.45mmol)と一緒に10mlのクロロホル
ム中に溶解した。この反応は、ラヌチ(Ranucc
i)、E.およびフェルチ(Feruti)、P.(1
991)マクロモレキュールス(Macromolec
ules)24、3747−3752に記載されている
mPEG−アルコールのカルボニルイミダゾールによる
活性化の手順に従った。反応混合物を室温において2時
間撹拌し、次いで7mlの水を添加し、そして有機層を
抽出した。水による抽出を5回反復した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、そしてこの塩を濾過した。濾液に
t−ブチルN−ヒドロキシカルバメート(0.53g、
4mmol)を添加し、次いで0.7mlのトリエチル
アミン(5mmol)を添加した。反応混合物を一夜撹
拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物(1.
5g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(1:2)
混合物の中に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。
この化合物をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに
精製し、メタノール/塩化メチレン(5:1)で溶離し
た。収量1.3g。IR(C=O):1726。分析、
Nについての計算値、0.55。実測値:N、0.4
3。
0.4mmol)をカルボニルイミダゾール(0.23
g、1.45mmol)と一緒に10mlのクロロホル
ム中に溶解した。この反応は、ラヌチ(Ranucc
i)、E.およびフェルチ(Feruti)、P.(1
991)マクロモレキュールス(Macromolec
ules)24、3747−3752に記載されている
mPEG−アルコールのカルボニルイミダゾールによる
活性化の手順に従った。反応混合物を室温において2時
間撹拌し、次いで7mlの水を添加し、そして有機層を
抽出した。水による抽出を5回反復した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、そしてこの塩を濾過した。濾液に
t−ブチルN−ヒドロキシカルバメート(0.53g、
4mmol)を添加し、次いで0.7mlのトリエチル
アミン(5mmol)を添加した。反応混合物を一夜撹
拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物(1.
5g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(1:2)
混合物の中に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。
この化合物をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに
精製し、メタノール/塩化メチレン(5:1)で溶離し
た。収量1.3g。IR(C=O):1726。分析、
Nについての計算値、0.55。実測値:N、0.4
3。
【0092】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
NH−CS−ONH2の合成
NH−CS−ONH2の合成
【0093】
【化33】
【0094】mPEG5000−アミン(1.5g、
0.3mmol)を30mlのジクロロメタン中に溶解
した。トリエチルアミン(0.1ml、0.75mmo
l)を添加し、次いでジ−2−ピリジルチオノカーボネ
ート(0.028g、0.35mmol)を添加した。
反応混合物を室温において2時間撹拌し、次いで7ml
の水を添加し、そして有機層を抽出した。水による抽出
を5回反復した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そ
してこの塩を濾過した。濾液にt−ブチルN−ヒドロキ
シカルバメート(0.53g、4mmol)を添加し、
次いでt−ブチルN−ヒドロキシカルバメート(0.5
3g、4mmol)を0.5mlのトリエチルアミン
(3.75mmol)と一緒に添加した。反応混合物を
一夜撹拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
(1.6g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸
(1:1)混合物の中に入れた。30分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をLH−20カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。収量0.72g。IR(C=S):1
684。分析、Nについての計算値、0.55。実測
値:N、0.30。
0.3mmol)を30mlのジクロロメタン中に溶解
した。トリエチルアミン(0.1ml、0.75mmo
l)を添加し、次いでジ−2−ピリジルチオノカーボネ
ート(0.028g、0.35mmol)を添加した。
反応混合物を室温において2時間撹拌し、次いで7ml
の水を添加し、そして有機層を抽出した。水による抽出
を5回反復した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そ
してこの塩を濾過した。濾液にt−ブチルN−ヒドロキ
シカルバメート(0.53g、4mmol)を添加し、
次いでt−ブチルN−ヒドロキシカルバメート(0.5
3g、4mmol)を0.5mlのトリエチルアミン
(3.75mmol)と一緒に添加した。反応混合物を
一夜撹拌した後、冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
(1.6g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸
(1:1)混合物の中に入れた。30分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をLH−20カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。収量0.72g。IR(C=S):1
684。分析、Nについての計算値、0.55。実測
値:N、0.30。
【0095】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
ONH2の合成
ONH2の合成
【0096】
【化34】
【0097】mPEG5000−トレシレート(2.0
g、0.4mmol)を10mlのジクロロメタン中に
溶解し、これにt−ブチルN−ヒドロキシカルバメート
(0.53g、4mmol)および0.7mlのトリエ
チルアミン(5mmol)を添加した。この混合物を4
5℃(還流)に加熱し、そして反応を一夜進行させた。
冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集
め、洗浄し、そして乾燥した。生成物(1.5g)をジ
クロロメタン/トリフルオロ酢酸(3:7)混合物の中
に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。この化合物
をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メ
タノール/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量
1.6g。分析、Nについての計算値、0.28。実測
値:N、0.19。
g、0.4mmol)を10mlのジクロロメタン中に
溶解し、これにt−ブチルN−ヒドロキシカルバメート
(0.53g、4mmol)および0.7mlのトリエ
チルアミン(5mmol)を添加した。この混合物を4
5℃(還流)に加熱し、そして反応を一夜進行させた。
冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾過により集
め、洗浄し、そして乾燥した。生成物(1.5g)をジ
クロロメタン/トリフルオロ酢酸(3:7)混合物の中
に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。この化合物
をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メ
タノール/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量
1.6g。分析、Nについての計算値、0.28。実測
値:N、0.19。
【0098】別の合成はの通りである。t−ブチルN−
ヒドロキシカルバメート(0.53g、4mmol)を
1mlのテトラヒドロフランの中に入れ、次いでNaH
(78mg、3.25mmol)を添加した。数分後、
この溶液を5mlのテトラヒドロフラン中のmPEG5
000−トレシレート(1.0g、0.2mmol)に
添加した。この混合物を40℃に加熱し、そして反応を
一夜進行させた。冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
(1.5g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸
(3:7)混合物の中に入れた。60分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をLH−20カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。収量0.75g。分析、Nについての
計算値、0.28。実測値:N、0.10。
ヒドロキシカルバメート(0.53g、4mmol)を
1mlのテトラヒドロフランの中に入れ、次いでNaH
(78mg、3.25mmol)を添加した。数分後、
この溶液を5mlのテトラヒドロフラン中のmPEG5
000−トレシレート(1.0g、0.2mmol)に
添加した。この混合物を40℃に加熱し、そして反応を
一夜進行させた。冷エーテルを添加し、そして生ずる沈
澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生成物
(1.5g)をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸
(3:7)混合物の中に入れた。60分後、この溶液を
濃縮した。この化合物をLH−20カラムのゲル濾過に
よりさらに精製し、メタノール/塩化メチレン(5:
1)で溶離した。収量0.75g。分析、Nについての
計算値、0.28。実測値:N、0.10。
【0099】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ONH2の合成
NH−CO−CH2−ONH2の合成
【0100】
【化35】
【0101】mPEG5000−アミン(2.0g、
0.4mmol)およびBoc−アミノオキシ酢酸
(0.2g、1.05mmol)を20mlのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−1−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート(1.1g、2mmol)を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン(0.7ml、3.9mmol)
を添加した。反応混合物を室温において約72時間撹拌
し、次いで冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。集めた沈澱の
半分をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(3:7)混
合物の中に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに精
製し、メタノール/塩化メチレン(5:1)で溶離し
た。生ずる黄色沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理
した。約24時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾
液を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテル
で処理した。白色生成物が得られた。収量0.5g。I
R(C=O):1676。分析、Nについての計算値、
0.55。実測値:N、0.50。
0.4mmol)およびBoc−アミノオキシ酢酸
(0.2g、1.05mmol)を20mlのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−1−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート(1.1g、2mmol)を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン(0.7ml、3.9mmol)
を添加した。反応混合物を室温において約72時間撹拌
し、次いで冷エーテルを添加し、そして生ずる沈澱を濾
過により集め、洗浄し、そして乾燥した。集めた沈澱の
半分をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(3:7)混
合物の中に入れた。60分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をLH−20カラムのゲル濾過によりさらに精
製し、メタノール/塩化メチレン(5:1)で溶離し
た。生ずる黄色沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理
した。約24時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾
液を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテル
で処理した。白色生成物が得られた。収量0.5g。I
R(C=O):1676。分析、Nについての計算値、
0.55。実測値:N、0.50。
【0102】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
O−CO−CH2−ONH2の合成
O−CO−CH2−ONH2の合成
【0103】
【化36】
【0104】mPEG5000−アルコール(2.0
g、0.4mmol)およびBoc−アミノオキシ酢酸
(0.2g、1.05mmol)を20mlのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−1−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート(1.1g、2mmol)を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン(0.7ml、3.09mmo
l)を添加した。反応混合物を室温において約2時間撹
拌し、次いでジメチルアミノピリジン(0.244g、
2mmol)を添加した。約4日後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理し
た。約24時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾液
を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテルで
処理した。分析、Nについての計算値、0.28。実測
値:N、0.14。
g、0.4mmol)およびBoc−アミノオキシ酢酸
(0.2g、1.05mmol)を20mlのジクロロ
メタン中に溶解した。ベンゾトリアゾル−1−イル−オ
キシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスヘ
ート(1.1g、2mmol)を添加し、次いでジイソ
プロピルエチルアミン(0.7ml、3.09mmo
l)を添加した。反応混合物を室温において約2時間撹
拌し、次いでジメチルアミノピリジン(0.244g、
2mmol)を添加した。約4日後、冷エーテルを添加
し、そして生ずる沈澱を濾過により集め、洗浄し、そし
て乾燥した。沈澱を水中に取り、そして脱色炭で処理し
た。約24時間後、脱色炭を濾過し、そして透明な濾液
を集めた。残留物をジクロロメタン中に溶解し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、そして濾液を冷エーテルで
処理した。分析、Nについての計算値、0.28。実測
値:N、0.14。
【0105】集めた沈澱の半分をジクロロメタン/トリ
フルオロ酢酸(2:1)混合物の中に入れた。30分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH−20カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール/塩化メ
チレン(5:1)で溶離した。収量0.3g。IR(C
=O):1734。
フルオロ酢酸(2:1)混合物の中に入れた。30分
後、この溶液を濃縮した。この化合物をLH−20カラ
ムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノール/塩化メ
チレン(5:1)で溶離した。収量0.3g。IR(C
=O):1734。
【0106】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
CH(OH)−CH2−ONH2の合成
CH(OH)−CH2−ONH2の合成
【0107】
【化37】
【0108】mPEG−5000−エポキシド(1.0
g、0.2mmol)を10mlの0.1M NaOH
中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロキシカルバメート
(0.53g、4mmol)を添加した。反応を一夜進
行させ、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。硫酸
ナトリウムを添加し、そして濾過した。冷エーテルをジ
クロロメタンの溶液に添加し、そして生ずる沈澱を濾過
により集め、洗浄し、そして乾燥した。この化合物をL
H−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノ
ール/塩化メチレン(5:1)で溶離した。保護したm
PEG−誘導体(0.25g)をジクロロメタン/トリ
フルオロ酢酸(1:1)混合物の中に入れた。30分
後、この溶液を濃縮し、そしてジクロロメタン中に取っ
た。この化合物をエーテルから沈澱により単離した。収
量0.2g。IR(O−H):3447。分析、Nにつ
いての計算値、0.28。実測値:N、0.21。
g、0.2mmol)を10mlの0.1M NaOH
中に溶解した。t−ブチルN−ヒドロキシカルバメート
(0.53g、4mmol)を添加した。反応を一夜進
行させ、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。硫酸
ナトリウムを添加し、そして濾過した。冷エーテルをジ
クロロメタンの溶液に添加し、そして生ずる沈澱を濾過
により集め、洗浄し、そして乾燥した。この化合物をL
H−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノ
ール/塩化メチレン(5:1)で溶離した。保護したm
PEG−誘導体(0.25g)をジクロロメタン/トリ
フルオロ酢酸(1:1)混合物の中に入れた。30分
後、この溶液を濃縮し、そしてジクロロメタン中に取っ
た。この化合物をエーテルから沈澱により単離した。収
量0.2g。IR(O−H):3447。分析、Nにつ
いての計算値、0.28。実測値:N、0.21。
【0109】CH3O−(CH2CH2)n−CH2CH2−
CO−CH2−ONH2の合成
CO−CH2−ONH2の合成
【0110】
【化38】
【0111】mPEG−O−CH2CH2−CH(OH)
−CH2−ONH−Boc(0.3g、0.6mmo
l)を3mlの乾燥ジメチルスルホキシドの中に入れ、
2mlの酢酸無水物を添加した。反応を室温において約
24時間進行させ、次いで冷エーテルを添加した。生ず
る沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生
成物をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(1:1)混
合物の中に入れた。30分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をエーテルから沈澱により単離した。収量0.
18g。IR(C=O):1698。分析、Nについて
の計算値、0.28。実測値:N、0.20。
−CH2−ONH−Boc(0.3g、0.6mmo
l)を3mlの乾燥ジメチルスルホキシドの中に入れ、
2mlの酢酸無水物を添加した。反応を室温において約
24時間進行させ、次いで冷エーテルを添加した。生ず
る沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。生
成物をジクロロメタン/トリフルオロ酢酸(1:1)混
合物の中に入れた。30分後、この溶液を濃縮した。こ
の化合物をエーテルから沈澱により単離した。収量0.
18g。IR(C=O):1698。分析、Nについて
の計算値、0.28。実測値:N、0.20。
【0112】mPEG−オルニチンセミカルバジドの合
成 mPEG−000−アミン(5.0g、1mmol)を
5mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして10ml
の乾燥ジメチルホルムアミドを添加した。Fmoc−O
rn(Boc)−OPfp(3.1g、5mmol)を
添加した。室温において1時間後、この溶液を濃縮し
た。水を残留物に添加し、そしてこの溶液を濾過し、遠
心し、そして濾液して水溶液中の分散した固体を除去し
た。濾過した水溶液を濃縮し、そして残留物を塩化メチ
レン中に取り、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この
溶液を濾過した。濾液を冷エーテルで処理した。生ずる
沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。収量
3.3g。IR(C=O):1713、1680。この
化合物を25%のピペラジン(塩化メチレン中)で30
分間処理することによって、Fmoc基を除去した。冷
エーテルをこの溶液に添加して、mPEG−誘導体を沈
澱させた。沈澱を集め、洗浄し、そして乾燥した。1.
4gのmPEG−誘導体を3mlのジクロロメタンで溶
解させ、そして1mlの酢酸無水物を添加することによ
って、遊離アルファアミノ基をアセチル化した。室温に
おいて1.7時間後、この溶液を濃縮した。生ずる固体
を塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(5:3)で処理
した。溶媒を除去し、そして生ずる油を塩化メチレン中
に取り、そして冷エーテルを添加した。形成した沈澱を
集め、洗浄し、そして乾燥した。収量1.1g。IR
(C=O):1685。mPEG−誘導体を3mlの乾
燥塩化メチレン中に溶解し、そしてトリエチルアミン
(0.54ml、3.84mmol)を添加し、次いで
トルエン中の1mlのホスゲン(1.92mmol)お
よび追加の2mlの乾燥塩化メチレンを添加した。反応
を室温において一夜進行させ、次いで溶媒を除去した。
残留物を3mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして
0.2mlのヒドラゾン(5.76mmol)を添加し
た。溶液が透明になるまで、乾燥メタノールを添加した
(3.4ml)。室温において4時間後、この溶液を遠
心により透明にし、そして濃縮した。この化合物をLH
−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量0.7
g。IR(C=O):1675。
成 mPEG−000−アミン(5.0g、1mmol)を
5mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして10ml
の乾燥ジメチルホルムアミドを添加した。Fmoc−O
rn(Boc)−OPfp(3.1g、5mmol)を
添加した。室温において1時間後、この溶液を濃縮し
た。水を残留物に添加し、そしてこの溶液を濾過し、遠
心し、そして濾液して水溶液中の分散した固体を除去し
た。濾過した水溶液を濃縮し、そして残留物を塩化メチ
レン中に取り、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この
溶液を濾過した。濾液を冷エーテルで処理した。生ずる
沈澱を濾過により集め、洗浄し、そして乾燥した。収量
3.3g。IR(C=O):1713、1680。この
化合物を25%のピペラジン(塩化メチレン中)で30
分間処理することによって、Fmoc基を除去した。冷
エーテルをこの溶液に添加して、mPEG−誘導体を沈
澱させた。沈澱を集め、洗浄し、そして乾燥した。1.
4gのmPEG−誘導体を3mlのジクロロメタンで溶
解させ、そして1mlの酢酸無水物を添加することによ
って、遊離アルファアミノ基をアセチル化した。室温に
おいて1.7時間後、この溶液を濃縮した。生ずる固体
を塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(5:3)で処理
した。溶媒を除去し、そして生ずる油を塩化メチレン中
に取り、そして冷エーテルを添加した。形成した沈澱を
集め、洗浄し、そして乾燥した。収量1.1g。IR
(C=O):1685。mPEG−誘導体を3mlの乾
燥塩化メチレン中に溶解し、そしてトリエチルアミン
(0.54ml、3.84mmol)を添加し、次いで
トルエン中の1mlのホスゲン(1.92mmol)お
よび追加の2mlの乾燥塩化メチレンを添加した。反応
を室温において一夜進行させ、次いで溶媒を除去した。
残留物を3mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして
0.2mlのヒドラゾン(5.76mmol)を添加し
た。溶液が透明になるまで、乾燥メタノールを添加した
(3.4ml)。室温において4時間後、この溶液を遠
心により透明にし、そして濃縮した。この化合物をLH
−20カラムのゲル濾過によりさらに精製し、メタノー
ル/塩化メチレン(5:1)で溶離した。収量0.7
g。IR(C=O):1675。
【0113】本発明を説明したが、次の実施例により本
発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しな
い。
発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しな
い。
【0114】
【実施例】EPOの変性(ヒドラジド法) 典型的な実験において、EPO(0.5〜1.0mg)
(オーソ・バイオテク(Ortho Biotech)
を合計のvlm0.786mlの100mMの酢酸ナト
リウムpH5.6の中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム
の十分な10mg/mlの溶液を添加して、過ヨウ素酸
ナトリウムの最終濃度を10mMにした。酸化を暗所で
0℃において30分間進行させ、次いで0.33mlの
80mMのNa2CO3を添加した。5分後、この溶液を
濃縮し、そしてマイクロコンセントレイター中で100
mMの酢酸ナトリウムで3回洗浄した。最後の濃縮後、
酸化したEPO溶液を100mMの酢酸ナトリウムで
1.0mlにした。mPEG5000−ヒドラジド(5
0mg)を酸化したEPOに添加した。この混合物を室
温において一夜撹拌した。mPEG5000−EPOを
セファクリル(Sephacryl)S−200−HR
カラム(1mm×45mm)のゲル濾過により精製し、
0.05%のアジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝
液で溶離した。mPEG変性EPOの量をソルバックス
(ZorbaxR)GF−250またはGF−450カ
ラムのHPLCゲル濾過により決定し、0.1Mのリン
酸塩緩衝液pH7を使用した。6〜12分子のmPEG
がEPOの各分子に結合していることが分かった。
(オーソ・バイオテク(Ortho Biotech)
を合計のvlm0.786mlの100mMの酢酸ナト
リウムpH5.6の中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム
の十分な10mg/mlの溶液を添加して、過ヨウ素酸
ナトリウムの最終濃度を10mMにした。酸化を暗所で
0℃において30分間進行させ、次いで0.33mlの
80mMのNa2CO3を添加した。5分後、この溶液を
濃縮し、そしてマイクロコンセントレイター中で100
mMの酢酸ナトリウムで3回洗浄した。最後の濃縮後、
酸化したEPO溶液を100mMの酢酸ナトリウムで
1.0mlにした。mPEG5000−ヒドラジド(5
0mg)を酸化したEPOに添加した。この混合物を室
温において一夜撹拌した。mPEG5000−EPOを
セファクリル(Sephacryl)S−200−HR
カラム(1mm×45mm)のゲル濾過により精製し、
0.05%のアジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝
液で溶離した。mPEG変性EPOの量をソルバックス
(ZorbaxR)GF−250またはGF−450カ
ラムのHPLCゲル濾過により決定し、0.1Mのリン
酸塩緩衝液pH7を使用した。6〜12分子のmPEG
がEPOの各分子に結合していることが分かった。
【0115】EPOの変性(セミカルバジド法) 上のヒドラジド法と同一の手順を実施したが、ただし酸
化の反応時間を5分に減少し、そしてmPEG−ヒドラ
ジドの量(50mg)と比較して少ない量のmPEG−
セミカルバジド(10mg)を使用した。酸化時間を短
縮しかつより少ない量のmPEGを添加したにもかかわ
らず、より多くの(約18)mPEG分子がEPOに結
合した。より長い酸化時間(15分)を使用しそしてよ
り多いmPEG−セミカルバジドを添加する場合、使用
するmPEGの分子量に依存して約30mPEG分子を
EPOに結合することができる。こうしてmPEG−セ
ミカルバジドはmPEG−ヒドラジドより反応性である
ように思われ、そして同様な反応条件下にmPEG−ヒ
ドラジドで可能であるより多数のより多くのmPEG分
子をEPOに結合することができる。
化の反応時間を5分に減少し、そしてmPEG−ヒドラ
ジドの量(50mg)と比較して少ない量のmPEG−
セミカルバジド(10mg)を使用した。酸化時間を短
縮しかつより少ない量のmPEGを添加したにもかかわ
らず、より多くの(約18)mPEG分子がEPOに結
合した。より長い酸化時間(15分)を使用しそしてよ
り多いmPEG−セミカルバジドを添加する場合、使用
するmPEGの分子量に依存して約30mPEG分子を
EPOに結合することができる。こうしてmPEG−セ
ミカルバジドはmPEG−ヒドラジドより反応性である
ように思われ、そして同様な反応条件下にmPEG−ヒ
ドラジドで可能であるより多数のより多くのmPEG分
子をEPOに結合することができる。
【0116】炭水化物基上またはアミノ酸側鎖上におい
てmPEGでEPOを変性する効果の比較は図1に示さ
れている。分析用HPLCゲル濾過の条件を前述と同一
である。未変性のEPOのクロマトグラムは図1aに表
されている。10.5分の保持時間をもつピークが見い
だされる。EPOをその炭水化物基上においてmPEG
5000で変性するとき(図1b)、9.4分の保持時
間をもつ単一の大きいピークが未精製の反応生成物につ
いて見られる。リジンの側鎖と反応するmPEG500
0のスクシンイミドエステルとEPOを反応させると
き、反応生成物の不均質塩化メチレンが得られる(7.
5〜10.5分のピーク)。CSF−1、インターロイ
キン−2およびβ−インターフェロンへのスクシンイミ
ドのカップリングを使用するmPEGの変性について同
様な不均質パターンが見いだされた(米国特許第4,8
47,325号および米国特許第4,917,888
号)。また、スクシンイミドのカップリングでより低い
分子量の不純物が存在する(図1c)。mPEGのスク
シンイミド誘導体を使用する活性エステルのカップリン
グは、タンパク質にmPEGを結合する好ましい方法で
あった[ヌチ(Nucci)、M.L.、ショル(Sh
orr)、R.およびアブチョウスキ(Abuchow
ski)、A.(1991)アドバンスド・ドラッグ・
デリバリー・リビューズ(Adv.Drug Deli
very Rev.)、6、133−151]。また、
EPOを前述のセミカルバジド法を使用してmPEG5
000で誘導化した、生物学的実験の結果について図4
を参照。また、前述のセミカルバジド法を使用して、m
PEG12000で変性したEPO(図3参照)および
mPEG2000で変性したEPO(図10参照)を得
た。
てmPEGでEPOを変性する効果の比較は図1に示さ
れている。分析用HPLCゲル濾過の条件を前述と同一
である。未変性のEPOのクロマトグラムは図1aに表
されている。10.5分の保持時間をもつピークが見い
だされる。EPOをその炭水化物基上においてmPEG
5000で変性するとき(図1b)、9.4分の保持時
間をもつ単一の大きいピークが未精製の反応生成物につ
いて見られる。リジンの側鎖と反応するmPEG500
0のスクシンイミドエステルとEPOを反応させると
き、反応生成物の不均質塩化メチレンが得られる(7.
5〜10.5分のピーク)。CSF−1、インターロイ
キン−2およびβ−インターフェロンへのスクシンイミ
ドのカップリングを使用するmPEGの変性について同
様な不均質パターンが見いだされた(米国特許第4,8
47,325号および米国特許第4,917,888
号)。また、スクシンイミドのカップリングでより低い
分子量の不純物が存在する(図1c)。mPEGのスク
シンイミド誘導体を使用する活性エステルのカップリン
グは、タンパク質にmPEGを結合する好ましい方法で
あった[ヌチ(Nucci)、M.L.、ショル(Sh
orr)、R.およびアブチョウスキ(Abuchow
ski)、A.(1991)アドバンスド・ドラッグ・
デリバリー・リビューズ(Adv.Drug Deli
very Rev.)、6、133−151]。また、
EPOを前述のセミカルバジド法を使用してmPEG5
000で誘導化した、生物学的実験の結果について図4
を参照。また、前述のセミカルバジド法を使用して、m
PEG12000で変性したEPO(図3参照)および
mPEG2000で変性したEPO(図10参照)を得
た。
【0117】EPOを、また、mPEGのチオセミカル
バジド、ヒドラジドカルボキシレートおよび炭酸ジヒド
ラジドの誘導体で変性した。mPEGのこれらの誘導体
はmPEGのセミカルバジド誘導体に似た性能を示し、
mPEGのヒドラジドと比較したとき、これらの誘導体
を使用して高いレベルのEPOへのmPEGのカップリ
ングを得ることができた。EPOの酸化の他の条件、例
えば、温度の増加、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度の増
加、および反応時間の増加または減少は、これらの酸化
条件がEPOの生物学的活性を損なわないかい、使用す
ることができる。EPOの大規模の変性(セミカルバジドまたはカルボキ
シレートヒドラジド法) EPO(12.0mg)(オーソ・バイオテク(Ort
ho Biotech)から入手した)を合計の体積
1.8mlの100mMの酢酸ナトリウムpH5.5の
中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム(0.215ml)
を40mg/mlの濃度で添加した。酸化を暗所で0℃
において20分間進行させ、次いで0.02mlのエチ
レングリコールを添加し、そしてこの混合物を0℃にお
いて10分間撹拌した。酸化したEPOをセファデック
ス(SephadexR) G−25カラム(2.5cm
×9cm)のゲル濾過により精製し、そして100mM
の酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3で溶離した。溶離さ
れた酸化EPO(10〜11ml)をプールした。mP
EG5000セミカルバジド(100mg)を精製した
酸化EPOに添加した。この混合物を室温において一夜
撹拌した。mPEG5000−EPOをセファクリル
(Sephacryl)S−200−HRカラムのゲル
濾過により精製し、0.2MのNaCl、0.02Mの
クエン酸ナトリウム、0.025%のアジ化ナトリウム
を含有する緩衝液pH7.0で溶離した。200mgの
mPEG5000セミカルバジドを使用して、上の変性
を反復した。反応性は約22mPEG分子/EPO分子
であった。
バジド、ヒドラジドカルボキシレートおよび炭酸ジヒド
ラジドの誘導体で変性した。mPEGのこれらの誘導体
はmPEGのセミカルバジド誘導体に似た性能を示し、
mPEGのヒドラジドと比較したとき、これらの誘導体
を使用して高いレベルのEPOへのmPEGのカップリ
ングを得ることができた。EPOの酸化の他の条件、例
えば、温度の増加、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度の増
加、および反応時間の増加または減少は、これらの酸化
条件がEPOの生物学的活性を損なわないかい、使用す
ることができる。EPOの大規模の変性(セミカルバジドまたはカルボキ
シレートヒドラジド法) EPO(12.0mg)(オーソ・バイオテク(Ort
ho Biotech)から入手した)を合計の体積
1.8mlの100mMの酢酸ナトリウムpH5.5の
中に入れた。過ヨウ素酸ナトリウム(0.215ml)
を40mg/mlの濃度で添加した。酸化を暗所で0℃
において20分間進行させ、次いで0.02mlのエチ
レングリコールを添加し、そしてこの混合物を0℃にお
いて10分間撹拌した。酸化したEPOをセファデック
ス(SephadexR) G−25カラム(2.5cm
×9cm)のゲル濾過により精製し、そして100mM
の酢酸ナトリウム緩衝液pH4.3で溶離した。溶離さ
れた酸化EPO(10〜11ml)をプールした。mP
EG5000セミカルバジド(100mg)を精製した
酸化EPOに添加した。この混合物を室温において一夜
撹拌した。mPEG5000−EPOをセファクリル
(Sephacryl)S−200−HRカラムのゲル
濾過により精製し、0.2MのNaCl、0.02Mの
クエン酸ナトリウム、0.025%のアジ化ナトリウム
を含有する緩衝液pH7.0で溶離した。200mgの
mPEG5000セミカルバジドを使用して、上の変性
を反復した。反応性は約22mPEG分子/EPO分子
であった。
【0118】上で特定した反応成分の半分の量を使用
し、200mgのカルボキシレートヒドラジドを使用し
て、上の変性を反復した。反応性は約30mPEG分子
/EPO分子であった。
し、200mgのカルボキシレートヒドラジドを使用し
て、上の変性を反復した。反応性は約30mPEG分子
/EPO分子であった。
【0119】EPOの変性(オキシム法) A.mPEG−CH2CH2−NH−CO−CH2−ON
H2 上の大規模のセミカルバジド法について同一の手順を実
施した。しかしながら、mPEG5000セミカルバジ
ドの添加の代わりに、mPEG5000−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ONH2(50mg)を、2.15
mlの酸化EPOと室温において一夜混合した。mPE
G5000−EPOをセファクリル(Sephacry
l)S−200−HRカラムのゲル濾過により精製し、
0.2MのNaCl、0.02Mのクエン酸ナトリウ
ム、0.025%のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液
pH7で溶離した。フェノメネックス・バイオセプ(P
henomenex Biosep)−Sec−S40
00カラム(30cm×0.017cm)を使用するH
PLCゲル濾過により決定して、約31分子のmPEG
5000がEPOの各分子に結合していることが分かっ
た。25分子のmPEG−EPOから成る少量の分画が
また単離され、そして生物学的試験のために使用した。
図16、18および19を参照。
H2 上の大規模のセミカルバジド法について同一の手順を実
施した。しかしながら、mPEG5000セミカルバジ
ドの添加の代わりに、mPEG5000−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ONH2(50mg)を、2.15
mlの酸化EPOと室温において一夜混合した。mPE
G5000−EPOをセファクリル(Sephacry
l)S−200−HRカラムのゲル濾過により精製し、
0.2MのNaCl、0.02Mのクエン酸ナトリウ
ム、0.025%のアジ化ナトリウムを含有する緩衝液
pH7で溶離した。フェノメネックス・バイオセプ(P
henomenex Biosep)−Sec−S40
00カラム(30cm×0.017cm)を使用するH
PLCゲル濾過により決定して、約31分子のmPEG
5000がEPOの各分子に結合していることが分かっ
た。25分子のmPEG−EPOから成る少量の分画が
また単離され、そして生物学的試験のために使用した。
図16、18および19を参照。
【0120】B.mPEG−O−CH2CH2−NH−C
O−ONH2 mPEG−O−CH2CH2−NH−CO−ONH2を使
用して、上のEPOの変性を反復した。上の変性Aにお
ける方法を使用して決定して、約18〜19分子のmP
EG5000がEPOの各分子に結合していることが分
かった。生物学的データを図16、18および19に示
す。
O−ONH2 mPEG−O−CH2CH2−NH−CO−ONH2を使
用して、上のEPOの変性を反復した。上の変性Aにお
ける方法を使用して決定して、約18〜19分子のmP
EG5000がEPOの各分子に結合していることが分
かった。生物学的データを図16、18および19に示
す。
【0121】C.mPEG−O−CH2CH2−ONH2 mPEG−O−CH2CH2−ONH2を使用して、上の
EPOの変性を反復した。上の変性Aにおける方法を使
用して決定して、約17分子のmPEG5000がEP
Oの各分子に結合していることが分かった。22mPE
G、12mPEGの2つの少量の分画がまた単離された
(を図16、18および19)。
EPOの変性を反復した。上の変性Aにおける方法を使
用して決定して、約17分子のmPEG5000がEP
Oの各分子に結合していることが分かった。22mPE
G、12mPEGの2つの少量の分画がまた単離された
(を図16、18および19)。
【0122】D.mPEG−O−CH2CH2−CO−O
NH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−C
O−ONH2を使用して、上のEPOの変性を反復し
た。上の変性Aにおける方法を使用して決定して、約3
分子のmPEG5000がEPOの各分子に結合してい
ることが分かった。
NH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−C
O−ONH2を使用して、上のEPOの変性を反復し
た。上の変性Aにおける方法を使用して決定して、約3
分子のmPEG5000がEPOの各分子に結合してい
ることが分かった。
【0123】E.mPEG−O−CH2CH2−CH(O
H)−CH2−ONH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−C
H(OOH)−CH2−ONH2を使用して、上のEPO
の変性を反復した。上の変性Aにおける方法を使用して
決定して、約31分子のmPEG5000がEPOの各
分子に結合していることが分かった。
H)−CH2−ONH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−C
H(OOH)−CH2−ONH2を使用して、上のEPO
の変性を反復した。上の変性Aにおける方法を使用して
決定して、約31分子のmPEG5000がEPOの各
分子に結合していることが分かった。
【0124】F.mPEG−O−CH2CH2−NH−C
S−ONH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−N
H−CS−ONH2を使用して、上のEPOの変性を反
復した。上の変性Aにおける方法を使用して決定して、
約4分子のmPEG5000がEPOの各分子に結合し
ていることが分かった。
S−ONH2 PEG−オキシム誘導体mPEG−O−CH2CH2−N
H−CS−ONH2を使用して、上のEPOの変性を反
復した。上の変性Aにおける方法を使用して決定して、
約4分子のmPEG5000がEPOの各分子に結合し
ていることが分かった。
【0125】mPEG−EPOの生物学的活性 変性したタンパク質の注射後に発生した赤血球の増加を
測定することによって、mPEG−EPO誘導体をin
vivoの生物学的活性について検定した(エグリエ
(Egrie)、J.C.、ストリックランド(Str
ickland)、T.W.、レイン(Lane)、
J.、アオキ、K.、コウヘン(Cohen)、A.
M.、スモーリング(Smalling)、R.、トレ
イル(Trail)、G.、リン(Lin)、F.
K.、ブロウネ(Browne)、J.K.およびハイ
ネス(Hines)、D.K.(1986)イムノバイ
オロジー(Immunobiol.)172:213−
224)。簡単に述べると、マウス(雌のCD−1、週
齢8)に0.4μgのタンパク質を連続する2日間に1
日1回腹腔内または皮下に注射した。血液をヘマトクリ
ットの読みのために抜き出した。
測定することによって、mPEG−EPO誘導体をin
vivoの生物学的活性について検定した(エグリエ
(Egrie)、J.C.、ストリックランド(Str
ickland)、T.W.、レイン(Lane)、
J.、アオキ、K.、コウヘン(Cohen)、A.
M.、スモーリング(Smalling)、R.、トレ
イル(Trail)、G.、リン(Lin)、F.
K.、ブロウネ(Browne)、J.K.およびハイ
ネス(Hines)、D.K.(1986)イムノバイ
オロジー(Immunobiol.)172:213−
224)。簡単に述べると、マウス(雌のCD−1、週
齢8)に0.4μgのタンパク質を連続する2日間に1
日1回腹腔内または皮下に注射した。血液をヘマトクリ
ットの読みのために抜き出した。
【0126】mPEGのヒドラジド誘導体を介して結合
したmPEG−EPOのin vivoの生物学的活性
(ヘマトクリットのレベル)を図2、4および5および
表IおよびIIに示す。発見を要約すると、図2および
5が示すように、mPEGのカップリングの最適な数は
明らかでなく、そして最良のmPEG−EPOを得るた
めに合成および生物学的試験により決定しなくてはなら
ない。図4はヒドラジドおよびセミカルバジドのリンカ
ーを使用するmPEGのカップリングを比較する。mP
EG−EPOについてのより高くかつより長いヘマトク
リットのレベルは、セミカルバジドのリンカーを使用し
て得ることができた。観察された結果は、一部分、セミ
カルバジドのリンカーを使用して得ることができるmP
EGの組み込みのより高いレベルのためである。表I
は、組み込まれたmPEGの数および使用したmPEG
の分子量の関数として、mPEG−EPOの生物学的活
性を示す。
したmPEG−EPOのin vivoの生物学的活性
(ヘマトクリットのレベル)を図2、4および5および
表IおよびIIに示す。発見を要約すると、図2および
5が示すように、mPEGのカップリングの最適な数は
明らかでなく、そして最良のmPEG−EPOを得るた
めに合成および生物学的試験により決定しなくてはなら
ない。図4はヒドラジドおよびセミカルバジドのリンカ
ーを使用するmPEGのカップリングを比較する。mP
EG−EPOについてのより高くかつより長いヘマトク
リットのレベルは、セミカルバジドのリンカーを使用し
て得ることができた。観察された結果は、一部分、セミ
カルバジドのリンカーを使用して得ることができるmP
EGの組み込みのより高いレベルのためである。表I
は、組み込まれたmPEGの数および使用したmPEG
の分子量の関数として、mPEG−EPOの生物学的活
性を示す。
【0127】使用したmPEGの分子量およびカップリ
ングしたmPEGの量を比較する、異なるヒドラジドm
PEG−EPOの生物学的活性を表Iに要約する。
ングしたmPEGの量を比較する、異なるヒドラジドm
PEG−EPOの生物学的活性を表Iに要約する。
【0128】使用した異なるmPEGヒドラジドのリン
カーが表IIにおいて比較されている。最適な量のmP
EGが組み込まれた異なるmPEG5000−ヒドラジ
ド誘導体で変性されたEPOの生物学的活性を、表II
に要約する。最適な量のmPEGまたは他の因子と十分
にカップリングすることができないために、すべての炭
水化物mPEG誘導体が、EPOにカップリングしたと
き、同一の生物学的活性を示すわけではない。生物学的
活性は各リンカーについて得られた最良の値である。
カーが表IIにおいて比較されている。最適な量のmP
EGが組み込まれた異なるmPEG5000−ヒドラジ
ド誘導体で変性されたEPOの生物学的活性を、表II
に要約する。最適な量のmPEGまたは他の因子と十分
にカップリングすることができないために、すべての炭
水化物mPEG誘導体が、EPOにカップリングしたと
き、同一の生物学的活性を示すわけではない。生物学的
活性は各リンカーについて得られた最良の値である。
【0129】
【表1】
【0130】
【表2】
【0131】マウスにおけるEPOおよびmPEG50
00−EPOのヘマトクリットのレベルを図2に示す。
12PEG−EPOをmPEG5000−ヒドラジドの
カップリングより作り、そしてこれは前述の実験の条件
下にこのmPEG誘導体により達成できる最大の組み込
みを反映する。18PEGおよび28PEGのEPO
を、mPEG5000−セミカルバジドとのカップリン
グにより作った。mPEGのセミカルバジド誘導体は、
このmPEG誘導体を使用して組み込むことができるm
PEGの量が大きいために、mPEGのヒドラジド誘導
体より非常にいっそうすぐれた生物学的活性を生ずる。
すべての3つのmPEG−EPOは、天然のEPOと比
較したとき、増加した最大の活性および延長した活性を
示す。こうして、タンパク質の炭水化物基をPEGで変
性すると、非常にいっそう効力のある治療用タンパク質
を生成することができる。
00−EPOのヘマトクリットのレベルを図2に示す。
12PEG−EPOをmPEG5000−ヒドラジドの
カップリングより作り、そしてこれは前述の実験の条件
下にこのmPEG誘導体により達成できる最大の組み込
みを反映する。18PEGおよび28PEGのEPO
を、mPEG5000−セミカルバジドとのカップリン
グにより作った。mPEGのセミカルバジド誘導体は、
このmPEG誘導体を使用して組み込むことができるm
PEGの量が大きいために、mPEGのヒドラジド誘導
体より非常にいっそうすぐれた生物学的活性を生ずる。
すべての3つのmPEG−EPOは、天然のEPOと比
較したとき、増加した最大の活性および延長した活性を
示す。こうして、タンパク質の炭水化物基をPEGで変
性すると、非常にいっそう効力のある治療用タンパク質
を生成することができる。
【0132】実験において使用した種々のmPEGヒド
ラジド変性EPOのヘマトクリットのレベルへの作用に
ついての追加のデータについて、図8〜15を参照のこ
と。図8〜15に示された実験において使用したmPE
G変性EPOは、図2〜5に示す実験において使用した
他のmPEG変性EPO分子について本質的に記載し
た、適当な水溶性ポリマーの試薬を使用して調製した。
ラジド変性EPOのヘマトクリットのレベルへの作用に
ついての追加のデータについて、図8〜15を参照のこ
と。図8〜15に示された実験において使用したmPE
G変性EPOは、図2〜5に示す実験において使用した
他のmPEG変性EPO分子について本質的に記載し
た、適当な水溶性ポリマーの試薬を使用して調製した。
【0133】mPEGのオキシム形成誘導体を介して結
合したmPEG−EPOのin vivo生物学的活性
(ヘマトクリットのレベル)を、図16および17に示
す。要約すると、図16においてmPEG−O−CH2
CH2−NH−CO−ONH2(「A」)およびmPEG
−O−CH2CH2−NH−CO−CH2−ONH
2(「C」)リンカーを使用するmPEGのカップリン
グが比較されている。mPEG−EPOのより高いヘマ
トクリットのレベルは、31mPEG分子/EPO分子
を有する「C」リンカー(ここにおいて式XXXIII
に相当する)に比較して、18mPEG分子/EPO分
子を有する「A」リンカー(ここにおいて式XXXに相
当する)を使用して得ることができる。また、31mP
EG分子/EPO分子を有する同一のリンカーに比較し
て、25mPEG分子/EPO分子を有する「C」リン
カー(ここにおいて式XXXIII)のより高いヘマト
クリット活性は注目に値する。
合したmPEG−EPOのin vivo生物学的活性
(ヘマトクリットのレベル)を、図16および17に示
す。要約すると、図16においてmPEG−O−CH2
CH2−NH−CO−ONH2(「A」)およびmPEG
−O−CH2CH2−NH−CO−CH2−ONH
2(「C」)リンカーを使用するmPEGのカップリン
グが比較されている。mPEG−EPOのより高いヘマ
トクリットのレベルは、31mPEG分子/EPO分子
を有する「C」リンカー(ここにおいて式XXXIII
に相当する)に比較して、18mPEG分子/EPO分
子を有する「A」リンカー(ここにおいて式XXXに相
当する)を使用して得ることができる。また、31mP
EG分子/EPO分子を有する同一のリンカーに比較し
て、25mPEG分子/EPO分子を有する「C」リン
カー(ここにおいて式XXXIII)のより高いヘマト
クリット活性は注目に値する。
【0134】図17において、22、17および12m
PEG分子/EPO分子のmPEG−O−CH2CH2−
ONH2(式XXIII)を使用するmPEGのカップ
リングが比較されている。最高のヘマトクリットのレベ
ルは最低のペギレイション(pegylation)の
程度において得られ、そしてヘマトクリットはペギレイ
ションの程度に逆比例して減少した。しかしながら、m
PEG−O−CH2CH2−ONH2を使用するすべての
mPEGリンカーにおいて、天然のEPOに比較してよ
り高くかつ期間が増加した。
PEG分子/EPO分子のmPEG−O−CH2CH2−
ONH2(式XXIII)を使用するmPEGのカップ
リングが比較されている。最高のヘマトクリットのレベ
ルは最低のペギレイション(pegylation)の
程度において得られ、そしてヘマトクリットはペギレイ
ションの程度に逆比例して減少した。しかしながら、m
PEG−O−CH2CH2−ONH2を使用するすべての
mPEGリンカーにおいて、天然のEPOに比較してよ
り高くかつ期間が増加した。
【0135】式XXIIIの12mPEG−EPOの生
物学的活性はことに注目に値する。ヒドラジド誘導体1
2mPEG−EPOは、オキシルアミン誘導化EPOの
それのようなヘマトクリットの増加の程度および期間を
生成しない。
物学的活性はことに注目に値する。ヒドラジド誘導体1
2mPEG−EPOは、オキシルアミン誘導化EPOの
それのようなヘマトクリットの増加の程度および期間を
生成しない。
【0136】mPEG−EPOへの抗体の結合 クリニゲン(ClinigenR)エリトロポイエチン
(EPO)EIA試験キットを使用して、mPEG−E
POの抗原性を決定した。簡単に述べると、このアッセ
イはEPOに対してモノクローナル抗体で被覆したマイ
クロタイタープレートから成る。EPOまたはmPEG
−EPOを被覆したプレートと相互作用させた。プレー
トを洗浄後、標識化したEPOに対するポリクローナル
抗体をプレート上でインキュベーションした。基質の展
開後、プレートを読む。
(EPO)EIA試験キットを使用して、mPEG−E
POの抗原性を決定した。簡単に述べると、このアッセ
イはEPOに対してモノクローナル抗体で被覆したマイ
クロタイタープレートから成る。EPOまたはmPEG
−EPOを被覆したプレートと相互作用させた。プレー
トを洗浄後、標識化したEPOに対するポリクローナル
抗体をプレート上でインキュベーションした。基質の展
開後、プレートを読む。
【0137】ヒドラジド誘導化EPOについてのELI
SAアッセイの結果を図3に示す。mPEG−EPO
は、所定の分子量のmPEGについて結合した概算の数
として、表されている。例えば、12PEG−5Kは、
約12分子の約5000の分子量のmPEGがEPOの
各分子にカップリングしたことを意味する。データが示
すように、EPOにカップリングするmPEGの数が増
加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。同様
にEPOにカップリングするmPEGの数が増加するに
つれて、変性したEPOの抗原性、すなわち、抗体の結
合は減少する。酸化したEPOをmPEGのヒドラジド
誘導体と反応させることは、セミカルバジド、チオセミ
カルバジドおよび炭酸ジヒドラジドのPEG誘導体で見
られる高いカップリングレベルに到達しなかった。タン
パク質の抗原性の減少は、タンパク質の免疫原性の減少
と同様によく相関関係をもつ。こうして、EPOの炭水
化物基にカップリングしたmPEG−EPOはタンパク
質に関係する潜在的な免疫原性を減少することがあり、
高いレベルでカップリングすることができるmPEGの
誘導体は最も有効である。
SAアッセイの結果を図3に示す。mPEG−EPO
は、所定の分子量のmPEGについて結合した概算の数
として、表されている。例えば、12PEG−5Kは、
約12分子の約5000の分子量のmPEGがEPOの
各分子にカップリングしたことを意味する。データが示
すように、EPOにカップリングするmPEGの数が増
加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。同様
にEPOにカップリングするmPEGの数が増加するに
つれて、変性したEPOの抗原性、すなわち、抗体の結
合は減少する。酸化したEPOをmPEGのヒドラジド
誘導体と反応させることは、セミカルバジド、チオセミ
カルバジドおよび炭酸ジヒドラジドのPEG誘導体で見
られる高いカップリングレベルに到達しなかった。タン
パク質の抗原性の減少は、タンパク質の免疫原性の減少
と同様によく相関関係をもつ。こうして、EPOの炭水
化物基にカップリングしたmPEG−EPOはタンパク
質に関係する潜在的な免疫原性を減少することがあり、
高いレベルでカップリングすることができるmPEGの
誘導体は最も有効である。
【0138】mPEGヒドラジド誘導体を使用する追加
のデータについては、図6を参照のこと。
のデータについては、図6を参照のこと。
【0139】オキシム誘導化EPOについてのELIS
Aアッセイの結果は、図18に示されている。データが
示すように、EPOにカップリングするmPEGの数が
増加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。比
較的低いカップリングレベルを生じたリンカー(18P
EG−A、17PEG−B、12PEG−B)と酸化し
たEPOと反応させることは、比較的高いカップリング
レベルの配合物(22PEG−B、25PEG−Cおよ
び31PEG−C)で見られるような、免疫原性の大き
い減少を与えなかった。免疫原性を減少するタンパク質
の能力のこれらの差は、カップリングレベルに大きく基
づいて決定されるように思われることに注意すべきであ
る。(例えば、12PEG−Bおよび22PEG−Bの
比較)。こうして、オキシム結合を通してEPOの炭水
化物基にカップリングしたmPEGはタンパク質に関係
する潜在的な免疫原性を減少することがあり、高いレベ
ルでカップリングすることができるmPEGの誘導体は
最も有効である。
Aアッセイの結果は、図18に示されている。データが
示すように、EPOにカップリングするmPEGの数が
増加するにつれて、タンパク質の抗原性は減少する。比
較的低いカップリングレベルを生じたリンカー(18P
EG−A、17PEG−B、12PEG−B)と酸化し
たEPOと反応させることは、比較的高いカップリング
レベルの配合物(22PEG−B、25PEG−Cおよ
び31PEG−C)で見られるような、免疫原性の大き
い減少を与えなかった。免疫原性を減少するタンパク質
の能力のこれらの差は、カップリングレベルに大きく基
づいて決定されるように思われることに注意すべきであ
る。(例えば、12PEG−Bおよび22PEG−Bの
比較)。こうして、オキシム結合を通してEPOの炭水
化物基にカップリングしたmPEGはタンパク質に関係
する潜在的な免疫原性を減少することがあり、高いレベ
ルでカップリングすることができるmPEGの誘導体は
最も有効である。
【0140】セイヨウワサビペルオキシダーゼの変性:
ヒドラジド/セミカルバジドのカップリングの比較 セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)は糖タンパ
ク質の酵素(オキシド−リダクターゼ)である。HRP
をmPEG5000−ヒドラジドまたはmPEG500
0−セミカルバジドで変性して、EPO以外の他の糖タ
ンパク質が2つの異なる炭水化物の変性試薬の間で変性
の差を示すかどうかを明らかにした。典型的な実験にお
いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(2mg)を合
計の体積0.8mlの100mMの酢酸ナトリウムpH
5.6の中に入れた。十分な10mg/mlの過ヨウ素
酸ナトリウムの溶液を添加して、過ヨウ素酸ナトリウム
の最終濃度を10mMにした。0℃において酸化を15
分間進行させ、次いで0.33mlの80mMのNa2
CO3を添加した。5分後、この溶液を濃縮し、そして
マイクロコンセントレーターの中で100mMの酢酸ナ
トリウムpH4.2で3回洗浄した。次いで酸化したセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を半分に分割し、一
方の半分に30mgのmPEG5000−ヒドラジドを
添加し、そして他方の半分に30mgのmPEG500
0−セミカルバジドを添加した。次いで、2つの酸化し
たセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を室温において
一夜撹拌した。ゾルバックス(ZorbaxR)GF−
250カラムのHPLCゲル濾過により0.1Mのリン
酸塩緩衝液pH7を使用して、PEGの変性の程度を決
定した。mPEG5000−ヒドラジドで変性したセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ7PEG分子/HR
Pを有した;mPEG5000−セミカルバジドで変性
したセイヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ19PEG
分子/HRPを有した。こうして、その炭水化物基に結
合したPEGをもつセイヨウワサビペルオキシダーゼの
変性は、同一の実験条件下に、ヒドラジドよりPEGの
セミカルバジド誘導体を使用したとき、いっそう有効で
ある。
ヒドラジド/セミカルバジドのカップリングの比較 セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)は糖タンパ
ク質の酵素(オキシド−リダクターゼ)である。HRP
をmPEG5000−ヒドラジドまたはmPEG500
0−セミカルバジドで変性して、EPO以外の他の糖タ
ンパク質が2つの異なる炭水化物の変性試薬の間で変性
の差を示すかどうかを明らかにした。典型的な実験にお
いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(2mg)を合
計の体積0.8mlの100mMの酢酸ナトリウムpH
5.6の中に入れた。十分な10mg/mlの過ヨウ素
酸ナトリウムの溶液を添加して、過ヨウ素酸ナトリウム
の最終濃度を10mMにした。0℃において酸化を15
分間進行させ、次いで0.33mlの80mMのNa2
CO3を添加した。5分後、この溶液を濃縮し、そして
マイクロコンセントレーターの中で100mMの酢酸ナ
トリウムpH4.2で3回洗浄した。次いで酸化したセ
イヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を半分に分割し、一
方の半分に30mgのmPEG5000−ヒドラジドを
添加し、そして他方の半分に30mgのmPEG500
0−セミカルバジドを添加した。次いで、2つの酸化し
たセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液を室温において
一夜撹拌した。ゾルバックス(ZorbaxR)GF−
250カラムのHPLCゲル濾過により0.1Mのリン
酸塩緩衝液pH7を使用して、PEGの変性の程度を決
定した。mPEG5000−ヒドラジドで変性したセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ7PEG分子/HR
Pを有した;mPEG5000−セミカルバジドで変性
したセイヨウワサビペルオキシダーゼはほぼ19PEG
分子/HRPを有した。こうして、その炭水化物基に結
合したPEGをもつセイヨウワサビペルオキシダーゼの
変性は、同一の実験条件下に、ヒドラジドよりPEGの
セミカルバジド誘導体を使用したとき、いっそう有効で
ある。
【0141】半減期の決定 半減期の実験は、体重約0.3kgの雄のスプレイクー
ダウレイ(Spraque−Dawley)ラットを使
用して実施した。3匹のラットを各化合物について使用
した。実験の詳細は次の通りである。各ラットに1μg
のEPOまたはmPEG−EPOをIV(静脈内)注射
した。ヒドラジド誘導化mPEG−EPOについて、使
用したmPEG−EPOはmPEG5000−セミカル
バジド−18であり、セミカルバジドを使用するEPO
の変性について上の節に本質的に記載するようにして調
製した。血液を各ラットから2、5、15、90分およ
び3、6、24、48、54時間の時点において抜き出
した。血液をヘパリン添加した管の中に集め、そして血
漿を単離した。単離した血漿を、EPO依存性細胞増殖
アッセイにおけるEPOの生物学的活性について試験し
た。in vitroアッセイはFDC−P1/ER細
胞系を使用した。このネズミの細胞系はEPOリセプタ
ーを組み込み、そして増殖についてEPOに依存する。
このアッセイは次のように実施した。細胞をEPOの不
存在下に24時間増殖させ(106/ml)、次いで異
なる濃度でEPOまたはmPEG−EPOを細胞に添加
した。細胞を42時間インキュベーションし、次いでト
リチウム化チミジンを細胞に添加した。6時間後、細胞
を収獲し、そして計数した。細胞の増殖はチミジンの吸
収の増加により決定した。結果を図7に示す。
ダウレイ(Spraque−Dawley)ラットを使
用して実施した。3匹のラットを各化合物について使用
した。実験の詳細は次の通りである。各ラットに1μg
のEPOまたはmPEG−EPOをIV(静脈内)注射
した。ヒドラジド誘導化mPEG−EPOについて、使
用したmPEG−EPOはmPEG5000−セミカル
バジド−18であり、セミカルバジドを使用するEPO
の変性について上の節に本質的に記載するようにして調
製した。血液を各ラットから2、5、15、90分およ
び3、6、24、48、54時間の時点において抜き出
した。血液をヘパリン添加した管の中に集め、そして血
漿を単離した。単離した血漿を、EPO依存性細胞増殖
アッセイにおけるEPOの生物学的活性について試験し
た。in vitroアッセイはFDC−P1/ER細
胞系を使用した。このネズミの細胞系はEPOリセプタ
ーを組み込み、そして増殖についてEPOに依存する。
このアッセイは次のように実施した。細胞をEPOの不
存在下に24時間増殖させ(106/ml)、次いで異
なる濃度でEPOまたはmPEG−EPOを細胞に添加
した。細胞を42時間インキュベーションし、次いでト
リチウム化チミジンを細胞に添加した。6時間後、細胞
を収獲し、そして計数した。細胞の増殖はチミジンの吸
収の増加により決定した。結果を図7に示す。
【0142】EPO依存性細胞増殖アッセイを、オキシ
ム誘導化mPEG−EPOを使用して、前述したように
実施した。結果を図19に示す。
ム誘導化mPEG−EPOを使用して、前述したように
実施した。結果を図19に示す。
【0143】in vivoアッセイ:貧血マウスのモ
デル このアッセイにおいて、マウスを連続する5日間TNF
−アルファで注射することによって貧血とする。この貧
血を克服するために、EPOまたはmPEG−EPO
(0.03μg/投与)で同一の5日にわたってSC
(皮下)注射するか、あるいはマウスにTNF−アルフ
ァを与える5日のうちのちょうど2日にSC注射した。
結果を図15に示す。
デル このアッセイにおいて、マウスを連続する5日間TNF
−アルファで注射することによって貧血とする。この貧
血を克服するために、EPOまたはmPEG−EPO
(0.03μg/投与)で同一の5日にわたってSC
(皮下)注射するか、あるいはマウスにTNF−アルフ
ァを与える5日のうちのちょうど2日にSC注射した。
結果を図15に示す。
【0144】同等の態様 上の詳細な説明中に述べたすべての刊行物および特許を
ここにおいて引用によって加える。前述の詳細な説明は
当業者が本発明を実施するために十分であると考えられ
る。事実、分子生物学または関係する分野における当業
者にとって明らかな、本発明を実施するための前述の方
法の種々の変更は、特許請求の範囲の中に含まることを
意図する。
ここにおいて引用によって加える。前述の詳細な説明は
当業者が本発明を実施するために十分であると考えられ
る。事実、分子生物学または関係する分野における当業
者にとって明らかな、本発明を実施するための前述の方
法の種々の変更は、特許請求の範囲の中に含まることを
意図する。
【0145】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【0146】1.式:
【0147】
【化39】 式中、XはOまたはSであり、Qは−NHNH2および
−C6H4−NHNH2から成る群より選択され、そして
Yは−O−、−OCH2−、−NH−、−NHNH−、
−O−CO−CH2CH2−および−NHCO−N−NH
NH−から成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。
−C6H4−NHNH2から成る群より選択され、そして
Yは−O−、−OCH2−、−NH−、−NHNH−、
−O−CO−CH2CH2−および−NHCO−N−NH
NH−から成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。
【0148】2.前記化合物が、 式:
【0149】
【化40】 (I) P−O−CH2−CO−NHNH2 を有する化合物、 式:
【0150】
【化41】(II) P−O−CO−NHNH2 を有する化合物、 式:
【0151】
【化42】 (III) P−NH−CO−NHNH2 を有する化合物、 式:
【0152】
【化43】 (IV) P−NH−CS−NHNH2 を有する化合物、 式:
【0153】
【化44】(V) P−NHCO−N−NHN
HCO−NHNH2 を有する化合物、 式:
HCO−NHNH2 を有する化合物、 式:
【0154】
【化45】 (VI) P−NHNHCONHNH2 を有する化合物、 式:
【0155】
【化46】 (VII) P−NHNHCSNHNH2 を有する化合物、 式:
【0156】
【化47】 (VIII) P−NH−CO−C6H4−NHNH2 を有する化合物、および 式:
【0157】
【化48】(IX) P−O−CO−CH2CH2
−CO−NHNH2 を有する化合物、 から成る群に属する上記第1項記載の化合物。
−CO−NHNH2 を有する化合物、 から成る群に属する上記第1項記載の化合物。
【0158】3.前記化合物が、式:
【0159】
【化49】(II) P−O−CO−NHNH2 を有する上記第2項記載の化合物。
【0160】4.前記化合物が、式:
【0161】
【化50】 (III) P−NH−CO−NHNH2 を有する上記第2項記載の化合物。
【0162】5.前記化合物が、式:
【0163】
【化51】 (IV) P−NH−CS−NHNH2 を有する上記第2項記載の化合物。
【0164】6.前記化合物が、式:
【0165】
【化52】(V) P−NHCO−N−NHN
HCO−NHNH2 を有する上記第2項記載の化合物。
HCO−NHNH2 を有する上記第2項記載の化合物。
【0166】7.前記ポリマーが、ポリエチレングリコ
ールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホモ
ポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコール
とのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコポリ
マーは置換されていないか、あるいは1端においてアル
キル基で置換されている)、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチ
ルエーテル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)
−DL−アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでR
はアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイル、
アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテ
ル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールであるこ
とができる)、および前記ポリマーの誘導体から成る群
より選択される上記第2項記載の化合物。
ールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホモ
ポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコール
とのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコポリ
マーは置換されていないか、あるいは1端においてアル
キル基で置換されている)、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチ
ルエーテル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)
−DL−アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでR
はアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイル、
アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテ
ル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールであるこ
とができる)、および前記ポリマーの誘導体から成る群
より選択される上記第2項記載の化合物。
【0167】8.前記水溶性ポリマーがポリエチレング
リコールまたはその誘導体である上記第7項記載の化合
物。
リコールまたはその誘導体である上記第7項記載の化合
物。
【0168】9.前記水溶性ポリマーがモノメトキシポ
リ(エチレングリコール)である上記第8項記載の化合
物。
リ(エチレングリコール)である上記第8項記載の化合
物。
【0169】10.工程:ポリペプチドを変性のため上
記第1項記載の化合物と混合すること、からなる方法に
よって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
記第1項記載の化合物と混合すること、からなる方法に
よって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
【0170】11.変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第10項記載の変性ポリペプチド。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第10項記載の変性ポリペプチド。
【0171】12.変性のための前記ポリペプチドが抗
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第11項
記載の変性ポリペプチド。
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第11項
記載の変性ポリペプチド。
【0172】13.変性のための前記ポリペプチドが酵
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第11項記載の変性ポリペプチド。
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第11項記載の変性ポリペプチド。
【0173】14.変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第11項記載の変性ポリペプチ
ド。
タンパク質である上記第11項記載の変性ポリペプチ
ド。
【0174】15.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第14項記載の変性ポリペプチド。
チンである上記第14項記載の変性ポリペプチド。
【0175】16.前記方法が前記混合工程前に酸化剤
を添加する工程をさらに含む上記第9項記載の変性ポリ
ペプチド。
を添加する工程をさらに含む上記第9項記載の変性ポリ
ペプチド。
【0176】17.上記第10項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【0177】18.上記第15項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【0178】19.式:
【0179】
【化53】(X) [P−O−CH2−CO−NH
N=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
N=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0180】
【化54】(XI) [P−O−CO−NHN=C
H−]n−Z を有する化合物、 式:
H−]n−Z を有する化合物、 式:
【0181】
【化55】(XII) [P−NH−CO−NHN=
CH−]n−Z を有する化合物、 式:
CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0182】
【化56】(XIII) [P−NH−CS−NHN=
CH−]n−Z を有する化合物、 式:
CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0183】
【化57】(XIV) [P−NHCO−NH−NH
NHCO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
NHCO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0184】
【化58】 (XV) [P−HNNHCON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0185】
【化59】 (XVI) [P−HNNHCSN=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0186】
【化60】(XVII)[P−NH−CO−C6H4−N
HN=CH−]n−Z を有する化合物、および 式:
HN=CH−]n−Z を有する化合物、および 式:
【0187】
【化61】(XVIII) [P−O−CO−CH2CH
2−CO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、式中、Zはポリペプチドであり、nは
1〜xであり、xはZ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてPは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。
2−CO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、式中、Zはポリペプチドであり、nは
1〜xであり、xはZ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてPは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。
【0188】20.式:
【0189】
【化62】 (X) [P−O−CO−NHN=CH−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0190】21.nが22〜32である上記第20項
記載の化合物。
記載の化合物。
【0191】22.式:
【0192】
【化63】(XI) [P−NH−CO−NHN=C
H−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
H−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0193】23.nが17〜25である上記第22項
記載の化合物。
記載の化合物。
【0194】24.式:
【0195】
【化64】(XII) [P−NH−CS−NHN=C
H−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
H−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0196】25.式:
【0197】
【化65】(XIII) [P−NHCO−NH−NH
NHCO−NHN=CH−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
NHCO−NHN=CH−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0198】26.式:
【0199】
【化66】 (XIV) [P−HNNHCON=CH−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0200】27.式:
【0201】
【化67】 (XV) [P−HNNCSN=CH−]n−Z を有する上記第19項記載の化合物。
【0202】28.Pがポリエチレングリコールのホモ
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー(ここで前記ホモポリマーおよびコポリマーは置換
されていないか、あるいは1端においてアルキル基で置
換されている)、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリ
ビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−DL−
アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでRはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る)および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第19項記載の化合物。
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー(ここで前記ホモポリマーおよびコポリマーは置換
されていないか、あるいは1端においてアルキル基で置
換されている)、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリ
ビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−DL−
アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでRはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る)および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第19項記載の化合物。
【0203】29.Zがホルモン、リンホカイン、サイ
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第19項記載の化合
物。
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第19項記載の化合
物。
【0204】30.Zが糖タンパク質である上記第29
項記載の化合物。
項記載の化合物。
【0205】31.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第30項記載の化合物。
チンである上記第30項記載の化合物。
【0206】32.Zがエリトロポイエチンである上記
第22項記載の化合物。
第22項記載の化合物。
【0207】33.前記Pがモノメトキシポリ(エチレ
ングリコール)である上記第32項記載の化合物。
ングリコール)である上記第32項記載の化合物。
【0208】34.モノメトキシポリ(エチレングリコ
ール)の平均分子量が2000〜12000の範囲であ
る上記第33項記載の化合物。
ール)の平均分子量が2000〜12000の範囲であ
る上記第33項記載の化合物。
【0209】35.nが10〜36である上記第34項
記載の化合物。
記載の化合物。
【0210】36.nは20〜32である上記第35項
記載の化合物。
記載の化合物。
【0211】37.モノメトキシポリ(エチレングリコ
ール)の平均分子量が5000である上記第36項記載
の化合物。
ール)の平均分子量が5000である上記第36項記載
の化合物。
【0212】38.工程、ポリペプチドを活性化のため
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物II、II
I、IVおよびVから成る群より選択される化合物との
接合のためにポリペプチドを活性化する方法。
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物II、II
I、IVおよびVから成る群より選択される化合物との
接合のためにポリペプチドを活性化する方法。
【0213】39.前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム
である上記第38項記載の方法。
である上記第38項記載の方法。
【0214】40.前記過ヨウ素酸塩がタンパク質1m
g当たり10〜40μmolの濃度で存在する上記第3
9項記載の方法。
g当たり10〜40μmolの濃度で存在する上記第3
9項記載の方法。
【0215】41.前記混合工程を−10〜50℃の範
囲の温度において実施する上記第40項記載の方法。
囲の温度において実施する上記第40項記載の方法。
【0216】42.前記混合工程を0〜30℃の範囲の
温度において実施する上記第41項記載の方法。
温度において実施する上記第41項記載の方法。
【0217】43.前記混合工程が1分〜3日の期間の
間を必要とする上記第42項記載の方法。
間を必要とする上記第42項記載の方法。
【0218】44.前記混合工程を1分〜60分の期間
の間実施する上記第43項記載の方法。
の間実施する上記第43項記載の方法。
【0219】45.工程、変性のためにポリペプチドを
上記第1項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合す
ること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチドを
製造する方法。
上記第1項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合す
ること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチドを
製造する方法。
【0220】46.変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第44項記載の方法。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第44項記載の方法。
【0221】47.変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第46項記載の方法。
タンパク質である上記第46項記載の方法。
【0222】48.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第47項記載の方法。
チンである上記第47項記載の方法。
【0223】49.混合工程前に、酸化剤をポリペプチ
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第44
項記載の方法。
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第44
項記載の方法。
【0224】50.前記酸化剤が10〜40μmolの
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Pが400
0〜12000の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポリ
マーが式
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Pが400
0〜12000の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポリ
マーが式
【0225】
【化68】 (III) P−NH−CO−NHNH2 の化合物である上記第49項記載の方法。
【0226】51.上記第1項記載の水溶性ポリマーか
らなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するため
のキット。
らなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するため
のキット。
【0227】52.酸化剤をさらに含む上記第51項記
載のキット。
載のキット。
【0228】53.変性のためのポリペプチドをさらに
含む上記第51項記載のキット。
含む上記第51項記載のキット。
【0229】54.式:
【0230】
【化69】P−Y−X−Q 式中、XはC=O、C=S、CH2またはCHOHであ
り、Qは−ONH2−および−CH2−ONH2−から成
る群より選択され、そしてYは−O−CH2CH2−、−
O−CH2CH2−O−、−O−CH2CH2−N−、−O
−CH2CH2−S−および−O−CH2CH2CH−から
成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。
り、Qは−ONH2−および−CH2−ONH2−から成
る群より選択され、そしてYは−O−CH2CH2−、−
O−CH2CH2−O−、−O−CH2CH2−N−、−O
−CH2CH2−S−および−O−CH2CH2CH−から
成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。
【0231】55.前記化合物が、式:
【0232】
【化70】 (XIX) P−O−CH2CH2−CO−ONH2 を有する化合物、式:
【0233】
【化71】(XX) P−O−CH2CH2−O−
CO−ONH2 を有する化合物、 式:
CO−ONH2 を有する化合物、 式:
【0234】
【化72】(XXI) P−O−CH2CH2−NH
−CO−ONH2 を有する化合物、 式:
−CO−ONH2 を有する化合物、 式:
【0235】
【化73】(XXII) P−O−CH2CH2−O−
CS−ONH2 を有する化合物、 式:
CS−ONH2 を有する化合物、 式:
【0236】
【化74】 (XXIII) P−O−CH2CH2−ONH2 を有する化合物、 式:
【0237】
【化75】(XXIV) P−O−CH2CH2−NH
−O−CH2ONH2 を有する化合物、 式:
−O−CH2ONH2 を有する化合物、 式:
【0238】
【化76】(XXV) P−O−CH2CH2−O−
CO−CH2−ONH2 を有する化合物、 式:
CO−CH2−ONH2 を有する化合物、 式:
【0239】
【化77】(XXVI) P−O−CH2CH2−CH
(OH)−CH2−ONH2 を有する化合物、および 式:
(OH)−CH2−ONH2 を有する化合物、および 式:
【0240】
【化78】(XXVII) P−O−CH2CH2−CO
−CH2−ONH2 を有する化合物、から成る群に属する上記第54項記載
の化合物。
−CH2−ONH2 を有する化合物、から成る群に属する上記第54項記載
の化合物。
【0241】56.前記化合物が式:
【0242】
【化79】(XXI) P−O−CH2CH2−NH
−CO−ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
−CO−ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
【0243】57.前記化合物が式:
【0244】
【化80】 (XXIII) P−O−CH2CH2−ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
【0245】58.前記化合物が式:
【0246】
【化81】(XXIV) P−O−CH2CH2−NH
−CO−CH2ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
−CO−CH2ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
【0247】59.前記化合物が式:
【0248】
【化82】 (XIX) P−O−CH2CH2−CO−ONH2 を有する上記第55項記載の化合物。
【0249】60.前記ポリマーが、ポリエチレングリ
コールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホ
モポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコー
ルとのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコポ
リマーは置換されていないか、あるいは1端においてア
ルキル基で置換されている)、ポリオキシエチル化ポリ
オール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエ
チルエーテル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチ
ル)−DL−アスパルトアミド]、RO−PEG(ここ
でRはアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイ
ル、アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエー
テル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールである
ことができる)、および前記ポリマーの誘導体から成る
群より選択される上記第55項記載の化合物。
コールのホモポリマー、ポリプロピレングリコールのホ
モポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコー
ルとのコポリマー(ここで前記ホモポリマーおよびコポ
リマーは置換されていないか、あるいは1端においてア
ルキル基で置換されている)、ポリオキシエチル化ポリ
オール、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエ
チルエーテル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチ
ル)−DL−アスパルトアミド]、RO−PEG(ここ
でRはアルキル、アリール、アルキルアリール、アロイ
ル、アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルキルエー
テル、シクロアルキル、シクロアルキルアリールである
ことができる)、および前記ポリマーの誘導体から成る
群より選択される上記第55項記載の化合物。
【0250】61.前記水溶性ポリマーがポリエチレン
グリコールまたはその誘導体である上記第60項記載の
化合物。
グリコールまたはその誘導体である上記第60項記載の
化合物。
【0251】62.前記水溶性ポリマーがモノメトキシ
ポリ(エチレングリコール)である上記第8項記載の化
合物。
ポリ(エチレングリコール)である上記第8項記載の化
合物。
【0252】63.工程:ポリペプチドを変性のため上
記第61項記載の化合物と混合すること、からなる方法
によって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
記第61項記載の化合物と混合すること、からなる方法
によって製造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。
【0253】64.変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第63項記載の変性ポリペプチド。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第63項記載の変性ポリペプチド。
【0254】65.変性のための前記ポリペプチドが抗
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第64項
記載の変性ポリペプチド。
体であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記抗体上
の結合部位に特異的に結合することができる化合物と前
記抗体を組み合わせる工程をさらに含む、上記第64項
記載の変性ポリペプチド。
【0255】66.変性のための前記ポリペプチドが酵
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第64項記載の変性ポリペプチド。
素であり、前記方法が、前記混合工程前に、前記酵素の
ための基質と前記酵素を組み合わせる工程をさらに含
む、上記第64項記載の変性ポリペプチド。
【0256】67.変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第64項記載の変性ポリペプチ
ド。
タンパク質である上記第64項記載の変性ポリペプチ
ド。
【0257】68.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第67項記載の変性ポリペプチド。
チンである上記第67項記載の変性ポリペプチド。
【0258】69.前記方法が前記混合工程前に酸化剤
を添加する工程をさらに含む上記第62項記載の変性ポ
リペプチド。
を添加する工程をさらに含む上記第62項記載の変性ポ
リペプチド。
【0259】70.上記第63項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【0260】71.上記第68項記載のポリペプチドお
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
よび製剤学的に許容されうる担体からなる組成物。
【0261】72.式:
【0262】
【化83】(XXVIII) [P−O−CH2CH2−
CO−ON =CH−]n−Z を有する化合物、 式:
CO−ON =CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0263】
【化84】(XXIX) [P−O−CH2CH2−O
−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0264】
【化85】(XXX) [P−O−CH2CH2−N
H−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
H−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0265】
【化86】(XXXI) [P−O−CH2CH2−N
H−CS−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
H−CS−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0266】
【化87】(XXXII) [P−O−CH2CH2−
ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0267】
【化88】(XXXIII) [P−O−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
NH−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0268】
【化89】(XXXIV) [P−O−CH2CH2−
O−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
O−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式:
【0269】
【化90】(XXXV) [P−O−CH2CH2−
CH(OH)−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、および 式:
CH(OH)−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、および 式:
【0270】
【化91】(XXXVI) [P−O−CH2CH2−C
O−CH2− ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式中、Zはポリペプチドであり、nは1〜xであり、x
はZ上の酸化活性化可能な基の数であり、そしてPは水
溶性ポリマーである、から成る群に属する化合物。
O−CH2− ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式中、Zはポリペプチドであり、nは1〜xであり、x
はZ上の酸化活性化可能な基の数であり、そしてPは水
溶性ポリマーである、から成る群に属する化合物。
【0271】73.式:
【0272】
【化92】(XXX) [P−O−CH2CH2−N
H−CO−ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
H−CO−ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
【0273】74.式:
【0274】
【化93】(XXXII) [P−O−CH2CH2−
ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
【0275】75.式:
【0276】
【化94】(XXXIII) [P−O−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
NH−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
【0277】76.式:
【0278】
【化95】(XXVIII) [P−O−CH2CH2−
CO−ON =CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
CO−ON =CH−]n−Z を有する上記第72項記載の化合物。
【0279】77.Pがポリエチレングリコールのホモ
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー(ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは置
換されていないか、あるいは1端においてアルキル基で
置換されている)、ポリオキシエチル化ポリオール、ポ
リビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−DL−
アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでRはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る)および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第72項記載の化合物。
ポリマー、ポリプロピレングリコールのホモポリマー、
エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリ
マー(ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは置
換されていないか、あるいは1端においてアルキル基で
置換されている)、ポリオキシエチル化ポリオール、ポ
リビニルアルコール、多糖類、ポリビニルエチルエーテ
ル、α,β−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−DL−
アスパルトアミド]、RO−PEG(ここでRはアルキ
ル、アリール、アルキルアリール、アロイル、アルカノ
イル、ベンゾイル、アリールアルキルエーテル、シクロ
アルキル、シクロアルキルアリールであることができ
る)および前記ポリマーの誘導体から成る群より選択さ
れる上記第72項記載の化合物。
【0280】78.Zがホルモン、リンホカイン、サイ
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第72項記載の化合
物。
トカイン、成長因子、酵素、ワクチンの抗原、および抗
体から成る群より選択される上記第72項記載の化合
物。
【0281】79.Zが糖タンパク質である上記第74
項記載の化合物。
項記載の化合物。
【0282】80.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第79項記載の化合物。
チンである上記第79項記載の化合物。
【0283】81.Zがエリトロポイエチンである上記
第76項記載の化合物。
第76項記載の化合物。
【0284】82.前記Pがモノメトキシポリ(エチレ
ングリコール)である上記第77項記載の化合物。
ングリコール)である上記第77項記載の化合物。
【0285】83.モノメトキシポリ(エチレングリコ
ール)の平均分子量が2000〜12000の範囲であ
る上記第78項記載の化合物。
ール)の平均分子量が2000〜12000の範囲であ
る上記第78項記載の化合物。
【0286】84.nが3〜36である上記第83項記
載の化合物。
載の化合物。
【0287】85.nは8〜31である上記第84項記
載の化合物。
載の化合物。
【0288】86.モノメトキシポリ(エチレングリコ
ール)の平均分子量が5000である上記第85項記載
の化合物。
ール)の平均分子量が5000である上記第85項記載
の化合物。
【0289】87.工程、ポリペプチドを活性化のため
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物XIX、X
XI、XXIIIおよびXXIVから成る群より選択さ
れる化合物との接合のためにポリペプチドを活性化する
方法。
に酸化剤と混合すること、からなる、化合物XIX、X
XI、XXIIIおよびXXIVから成る群より選択さ
れる化合物との接合のためにポリペプチドを活性化する
方法。
【0290】88.前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム
である上記第87項記載の方法。
である上記第87項記載の方法。
【0291】89.前記過ヨウ素酸塩がタンパク質1m
g当たり10〜40μmolの濃度で存在する上記第8
8項記載の方法。
g当たり10〜40μmolの濃度で存在する上記第8
8項記載の方法。
【0292】90.前記混合工程を−10〜50℃の範
囲の温度において実施する上記第89項記載の方法。
囲の温度において実施する上記第89項記載の方法。
【0293】91.前記混合工程を0〜30℃の範囲の
温度において実施する上記第90項記載の方法。
温度において実施する上記第90項記載の方法。
【0294】92.前記混合工程が1分〜3日の期間の
間を必要とする上記第91項記載の方法。
間を必要とする上記第91項記載の方法。
【0295】93.前記混合工程を1分〜60分の期間
の間実施する上記第92項記載の方法。
の間実施する上記第92項記載の方法。
【0296】94.工程、変性のためにポリペプチドを
上記第54項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合
すること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチド
を製造する方法。
上記第54項記載の水溶性ポリマーの試薬化合物と混合
すること、からなる、水溶性ポリマー変性ポリペプチド
を製造する方法。
【0297】95.変性のための前記ポリペプチドが、
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第94項記載の方法。
ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、成長因子、酵
素、ワクチンの抗原、および抗体から成る群より選択さ
れる上記第94項記載の方法。
【0298】96.変性のための前記ポリペプチドが糖
タンパク質である上記第94項記載の方法。
タンパク質である上記第94項記載の方法。
【0299】97.前記糖タンパク質がエリトロポイエ
チンである上記第96項記載の方法。
チンである上記第96項記載の方法。
【0300】98.混合工程前に、酸化剤をポリペプチ
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第94
項記載の方法。
ドに変性のために添加する工程をさらに含む上記第94
項記載の方法。
【0301】99.前記酸化剤が10〜40μmolの
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Pが400
0〜12,000の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポ
リマーが式
範囲の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムであり、Pが400
0〜12,000の範囲の分子量を有し、前記水溶性ポ
リマーが式
【0302】
【化96】(XXI) P−O−CH2CH2−NH
−CO−ONH2 の化合物である上記第98項記載の方法。
−CO−ONH2 の化合物である上記第98項記載の方法。
【0303】100.上記第54項記載の水溶性ポリマ
ーからなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性する
ためのキット。
ーからなる、ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性する
ためのキット。
【0304】101.酸化剤をさらに含む上記第100
項記載のキット。
項記載のキット。
【0305】102.変性のためのポリペプチドをさら
に含む上記第101項記載のキット。
に含む上記第101項記載のキット。
【図1】図1aは、EPOのHPLCクロマトグラムを
示す。図1bは、mPEG5000のヒドラジン誘導体
のHPLCクロマトグラムを示す。図1cは、mPEG
5000のスクシンイミドエステルで変性したEPOの
HPLCクロマトグラムを示す。
示す。図1bは、mPEG5000のヒドラジン誘導体
のHPLCクロマトグラムを示す。図1cは、mPEG
5000のスクシンイミドエステルで変性したEPOの
HPLCクロマトグラムを示す。
【図2】異なる量の結合したmPEG(28、18およ
び12のmPEG/EPO分子)を含有するmPEG5
000−EPOで処置したマウスのヘマトクリットのレ
ベルのグラフである。18または28mPEG5000
/分子で誘導化したEPOを、本発明のセミカルバジド
化合物を使用して誘導化する。12mPEG5000/
分子で誘導化したEPOを、本発明のヒドラジド化合物
を使用して誘導化する。
び12のmPEG/EPO分子)を含有するmPEG5
000−EPOで処置したマウスのヘマトクリットのレ
ベルのグラフである。18または28mPEG5000
/分子で誘導化したEPOを、本発明のセミカルバジド
化合物を使用して誘導化する。12mPEG5000/
分子で誘導化したEPOを、本発明のヒドラジド化合物
を使用して誘導化する。
【図3】ELISAアッセイにおいてEPOに対して特
異的なモノクローナル抗体と結合するEPO、ヒドラジ
ドmPEG5000−EPO(12PEG/EPO)、
ヒドラジドmPEG12000−EPO(6PEG/E
PO)、チオセミカルバジドmPEG5000−EPO
(25PEG/EPO)、セミカルバジドmPEG12
000−EPO(14PEG/EPO)、およびmPE
G12000−EPO(29PEG/EPO)の能力を
示すグラフである。
異的なモノクローナル抗体と結合するEPO、ヒドラジ
ドmPEG5000−EPO(12PEG/EPO)、
ヒドラジドmPEG12000−EPO(6PEG/E
PO)、チオセミカルバジドmPEG5000−EPO
(25PEG/EPO)、セミカルバジドmPEG12
000−EPO(14PEG/EPO)、およびmPE
G12000−EPO(29PEG/EPO)の能力を
示すグラフである。
【図4】mPEG−ヒドラジド(HY)またはmPEG
−セミカルバジド(SC)で変性したときのEPOの生
物学的活性の比較を示すグラフである。mPEGの2つ
の異なる分子量(8500および5000)を比較にお
いて使用した。マウスのアルブミンを対照として使用し
た。
−セミカルバジド(SC)で変性したときのEPOの生
物学的活性の比較を示すグラフである。mPEGの2つ
の異なる分子量(8500および5000)を比較にお
いて使用した。マウスのアルブミンを対照として使用し
た。
【図5】異なる量の結合したmPEG(34、20およ
び12のmPEG)を含有するmPEG8500−EP
Oで処置したマウスのヘマトクリットのレベルを示すプ
ロットである。34または20のmPEG8500/分
子で誘導化したEPOを、本発明のセミカルバジド化合
物を使用して誘導化する。12mPEG8500/分子
で誘導化したEPOを、本発明のヒドラジド化合物で誘
導化する。マウスのアルブミンを対照として使用する。
び12のmPEG)を含有するmPEG8500−EP
Oで処置したマウスのヘマトクリットのレベルを示すプ
ロットである。34または20のmPEG8500/分
子で誘導化したEPOを、本発明のセミカルバジド化合
物を使用して誘導化する。12mPEG8500/分子
で誘導化したEPOを、本発明のヒドラジド化合物で誘
導化する。マウスのアルブミンを対照として使用する。
【図6】クリニゲン(ClinigenR)EPO E
IA試験キットを使用するmPEG変性EPOについて
のELISAアッセイの結果を示すグラフである。凡例
において、SC5−24はEPOの1分子当たり24分
子のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変
性EPOを意味し、SC5−18はEPOの1分子当た
り18分子のmPEGセミカルバジドをもつセミカルバ
ジドmPEG5000変性EPOを意味する。
IA試験キットを使用するmPEG変性EPOについて
のELISAアッセイの結果を示すグラフである。凡例
において、SC5−24はEPOの1分子当たり24分
子のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変
性EPOを意味し、SC5−18はEPOの1分子当た
り18分子のmPEGセミカルバジドをもつセミカルバ
ジドmPEG5000変性EPOを意味する。
【図7】血漿中のEPOの循環半減期を示すグラフであ
る。凡例において、SC5−18−ivは静脈内注射し
たEPOの1分子当たり18分子のmPEGをもつセミ
カルバジドmPEG5000変性EPOを意味し、EP
O−ivは静脈内注射を意味する。
る。凡例において、SC5−18−ivは静脈内注射し
たEPOの1分子当たり18分子のmPEGをもつセミ
カルバジドmPEG5000変性EPOを意味し、EP
O−ivは静脈内注射を意味する。
【図8】EPOの注射に対する応答におけるヘマトクリ
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC5−18はEPOの1分子当たり18分子
のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変性
EPOを意味し、用語SC5−22はEPOの1分子当
たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、用語HY5−8
はEPOの1分子当たり8分子のmPEG5000をも
つヒドラジドmPEG5000変性EPOを意味する。
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC5−18はEPOの1分子当たり18分子
のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変性
EPOを意味し、用語SC5−22はEPOの1分子当
たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、用語HY5−8
はEPOの1分子当たり8分子のmPEG5000をも
つヒドラジドmPEG5000変性EPOを意味する。
【図9】EPOの注射に対する応答におけるヘマトクリ
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC5−24はEPOの1分子当たり24分子
のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変性
EPOを意味し、用語TS5−25はEPOの1分子当
たり25分子のmPEG5000をもつチオセミカルバ
ジドmPEG5000変性EPOを意味し、用語DH5
−22はEPOの1分子当たり22分子のmPEG50
00をもつジヒドラジドmPEG5000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
ットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC5−24はEPOの1分子当たり24分子
のmPEGをもつセミカルバジドmPEG5000変性
EPOを意味し、用語TS5−25はEPOの1分子当
たり25分子のmPEG5000をもつチオセミカルバ
ジドmPEG5000変性EPOを意味し、用語DH5
−22はEPOの1分子当たり22分子のmPEG50
00をもつジヒドラジドmPEG5000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図10】EPOの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語TS5−17はEPOの1分子当たり17分子
のmPEG5000をもつチオセミカルバジドmPEG
5000変性EPOを意味し、用語SC8.5−12は
EPOの1分子当たり12分子のmPEG8500をも
つチオセミカルバジドmPEG8500変性EPOを意
味し、用語SC2−15はEPOの1分子当たり15分
子のmPEG2000をもつセミカルバジドmPEG2
000変性EPOを意味し、M.A.はマウスのアルブ
ミンの対照を意味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語TS5−17はEPOの1分子当たり17分子
のmPEG5000をもつチオセミカルバジドmPEG
5000変性EPOを意味し、用語SC8.5−12は
EPOの1分子当たり12分子のmPEG8500をも
つチオセミカルバジドmPEG8500変性EPOを意
味し、用語SC2−15はEPOの1分子当たり15分
子のmPEG2000をもつセミカルバジドmPEG2
000変性EPOを意味し、M.A.はマウスのアルブ
ミンの対照を意味する。
【図11】EPOの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例は次の
通りである:用語SC5−18はEPOの1分子当たり
18分子のmPEG5000をもつmPEG5000セ
ミカルバジド変性EPOを意味し、用語SC12−14
はEPOの1分子当たり14分子のmPEG12,00
0をもつチオセミカルバジドmPEG12,000変性
EPOを意味し、用語SC5−28はEPOの1分子当
たり28分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、用語HY12−
6はEPOの1分子当たり6分子のmPEG12,00
0をもつヒドラジドmPEG12,000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例は次の
通りである:用語SC5−18はEPOの1分子当たり
18分子のmPEG5000をもつmPEG5000セ
ミカルバジド変性EPOを意味し、用語SC12−14
はEPOの1分子当たり14分子のmPEG12,00
0をもつチオセミカルバジドmPEG12,000変性
EPOを意味し、用語SC5−28はEPOの1分子当
たり28分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、用語HY12−
6はEPOの1分子当たり6分子のmPEG12,00
0をもつヒドラジドmPEG12,000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図12】EPOの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC8.5−34はEPOの1分子当たり34
分子のmPEG8500をもつセミカルバジドmPEG
8500変性EPOを意味し、用語SC12−29はE
POの1分子当たり29分子のmPEG12,000を
もつセミカルバジドmPEG12,000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、用語SC8.5−34はEPOの1分子当たり34
分子のmPEG8500をもつセミカルバジドmPEG
8500変性EPOを意味し、用語SC12−29はE
POの1分子当たり29分子のmPEG12,000を
もつセミカルバジドmPEG12,000変性EPOを
意味し、M.A.はマウスのアルブミンの対照を意味す
る。
【図13】EPOまたはEPO誘導体を皮下または静脈
内に注射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを
示すグラフである。凡例は次の通りである:EPO−S
Cは皮下注射したEPOを意味し、EPO−ivは静脈
内注射したEPOを意味し、SC5−28−SCは皮下
注射したEPOの1分子当たり28分子のmPEG50
00をもつセミカルバジドmPEG5000変性EPO
を意味し、SC5−28−ivは静脈内注射したEPO
の1分子当たり28分子のmPEG5000をもつセミ
カルバジドmPEG5000変性EPOを意味し、HY
12−6−SCは皮下注射したEPOの1分子当たり6
分子のmPEG12,000をもつヒドラジドジmPE
G12,000変性EPOを意味し、HY12−6−i
vは静脈内注射したEPOの1分子当たり6分子のmP
EG12,000をもつヒドラジドmPEG12,00
0変性EPOを意味し、M.A.−scは皮下注射した
マウスのアルブミンの対照を意味し、M.A.−ivは
静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を意味する。
内に注射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを
示すグラフである。凡例は次の通りである:EPO−S
Cは皮下注射したEPOを意味し、EPO−ivは静脈
内注射したEPOを意味し、SC5−28−SCは皮下
注射したEPOの1分子当たり28分子のmPEG50
00をもつセミカルバジドmPEG5000変性EPO
を意味し、SC5−28−ivは静脈内注射したEPO
の1分子当たり28分子のmPEG5000をもつセミ
カルバジドmPEG5000変性EPOを意味し、HY
12−6−SCは皮下注射したEPOの1分子当たり6
分子のmPEG12,000をもつヒドラジドジmPE
G12,000変性EPOを意味し、HY12−6−i
vは静脈内注射したEPOの1分子当たり6分子のmP
EG12,000をもつヒドラジドmPEG12,00
0変性EPOを意味し、M.A.−scは皮下注射した
マウスのアルブミンの対照を意味し、M.A.−ivは
静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を意味する。
【図14】0.1μgのEPOの多数/単一の投与で注
射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを示すグ
ラフである。凡例は次の通りである:EPO×3scは
3回/週で皮下注射したEPOを意味し、EPO×iv
は3回/週で静脈内注射したEPOを意味し、SC5−
22×1scは1回/週で皮下注射したEPOの1分子
当たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジ
ドmPEG5000変性EPOを意味し、SC5−22
×1ivは1回/週で静脈内注射したEPOの1分子当
たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、M.A.×3は
3回/週で静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を
意味する。
射したマウスにおけるヘマトクリットのレベルを示すグ
ラフである。凡例は次の通りである:EPO×3scは
3回/週で皮下注射したEPOを意味し、EPO×iv
は3回/週で静脈内注射したEPOを意味し、SC5−
22×1scは1回/週で皮下注射したEPOの1分子
当たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジ
ドmPEG5000変性EPOを意味し、SC5−22
×1ivは1回/週で静脈内注射したEPOの1分子当
たり22分子のmPEG5000をもつセミカルバジド
mPEG5000変性EPOを意味し、M.A.×3は
3回/週で静脈内注射したマウスのアルブミンの対照を
意味する。
【図15】EPOまたはEPO誘導体を注射した腫瘍壊
死因子α(TNFα)誘発貧血のマウスにおけるヘマト
クリットのレベルを示すグラフである。凡例は次の通り
である:TNF(5)は5日間にわたって注射したTN
Fを意味し、T+EPO(5)は5日間にわたって同時
に注射したTNFおよびEPOを意味し、T+EPO
(2)は5日間にわたって注射したTNFおよび第1お
よび第4日に注射したEPOを意味し、T+SC5−1
8(5)は第1および第4日に注射したEPOの1分子
当たり18分子のmPEG5000をもつセミカルバジ
ドmPEG5000変性EPOと同時に5日間にわたっ
て注射TNFを意味し、M−Aはマウスのアルブミンの
対照を意味する。
死因子α(TNFα)誘発貧血のマウスにおけるヘマト
クリットのレベルを示すグラフである。凡例は次の通り
である:TNF(5)は5日間にわたって注射したTN
Fを意味し、T+EPO(5)は5日間にわたって同時
に注射したTNFおよびEPOを意味し、T+EPO
(2)は5日間にわたって注射したTNFおよび第1お
よび第4日に注射したEPOを意味し、T+SC5−1
8(5)は第1および第4日に注射したEPOの1分子
当たり18分子のmPEG5000をもつセミカルバジ
ドmPEG5000変性EPOと同時に5日間にわたっ
て注射TNFを意味し、M−Aはマウスのアルブミンの
対照を意味する。
【図16】EPOの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、18PEG−AはEPOの1分子当たり18分子の
mPEGをもつmPEG−O−CH2CH2−NH−CO
−ONH2(本発明の式XXI)で変性したEPOを意
味し、31PEG−Cは31PEG/EPOをもつmP
EG−O−CH2CH2−NH−CO−CH2−ONH
2(本発明の式XXIV)で変性したEPOを意味し、
25PEG−Cは25分子のmPEG/EPO分子をも
つmPEG−O−CH2−CH2−NH−CO−CH2−
ONH2(本発明の式XXIV)で変性したEPOを意
味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、18PEG−AはEPOの1分子当たり18分子の
mPEGをもつmPEG−O−CH2CH2−NH−CO
−ONH2(本発明の式XXI)で変性したEPOを意
味し、31PEG−Cは31PEG/EPOをもつmP
EG−O−CH2CH2−NH−CO−CH2−ONH
2(本発明の式XXIV)で変性したEPOを意味し、
25PEG−Cは25分子のmPEG/EPO分子をも
つmPEG−O−CH2−CH2−NH−CO−CH2−
ONH2(本発明の式XXIV)で変性したEPOを意
味する。
【図17】EPOの注射に対する応答におけるヘマトク
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、22PEG−Bは22mPEG分子/EPO分子を
もつオキシム誘導化mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(本発明の式XXIII)で変性したEPOを意味
し、17PEG−Bは17mPEG分子/EPO分子を
有する同一オキシムリンカーで変性したEPOを意味
し、そして12PEG−Bは12mPEG分子/EPO
分子を有する同一オキシムリンカーで変性したEPOを
意味する。
リットのレベルの変化を示すグラフである。凡例におい
て、22PEG−Bは22mPEG分子/EPO分子を
もつオキシム誘導化mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(本発明の式XXIII)で変性したEPOを意味
し、17PEG−Bは17mPEG分子/EPO分子を
有する同一オキシムリンカーで変性したEPOを意味
し、そして12PEG−Bは12mPEG分子/EPO
分子を有する同一オキシムリンカーで変性したEPOを
意味する。
【図18】ELISAアッセイにおいてEPOに対して
特異的なモノクローナル抗体と結合するEPO、mPE
G−O−CH2CH2−NH−CO−ONH
2(「A」)、mPEG5000 EPO(18PEG
/EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(22PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(17PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(12PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−NH−CO−C
H2−ONH2(「C」)mPEG5000 EPO(3
1PEG/EPO)、およびmPEG−O−CH2CH2
−NH−CO−CH2−ONH2(「C」)mPEG50
00 EPO(25PEG/EPO)の能力を示すグラ
フである。
特異的なモノクローナル抗体と結合するEPO、mPE
G−O−CH2CH2−NH−CO−ONH
2(「A」)、mPEG5000 EPO(18PEG
/EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(22PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(17PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−ONH
2(「B」)mPEG5000 EPO(12PEG/
EPO)、mPEG−O−CH2CH2−NH−CO−C
H2−ONH2(「C」)mPEG5000 EPO(3
1PEG/EPO)、およびmPEG−O−CH2CH2
−NH−CO−CH2−ONH2(「C」)mPEG50
00 EPO(25PEG/EPO)の能力を示すグラ
フである。
【図19】mPEG−EPOを使用するEPO依存性細
胞増殖を示すグラフである。凡例において、18PEG
−Aは18PEG/EPOをもつmPEG−O−CH2
CH2−NH−CO−ONH2(式XXI)で変性したE
POを意味し、22PEG−Bは22mPEG分子/E
PO分子をもつmPEG−O−CH2CH2−ONH
2(式XXIII)で変性したEPOを意味し、17P
EG−Bは17mPEG/EPOにおける式XXIII
を意味し、12PEG−Bは12mPEG/EPOにお
ける式XXIIIを意味し、31PEG−Cは31PE
G/EPOにおけるmPEG−O−CH2CH2−NH−
CO−CH2−ONH2(式XXIV)で変性したEPO
を意味し、そして25PEG−Cは25mPEG/EP
Oにおける式XXIVを意味する。
胞増殖を示すグラフである。凡例において、18PEG
−Aは18PEG/EPOをもつmPEG−O−CH2
CH2−NH−CO−ONH2(式XXI)で変性したE
POを意味し、22PEG−Bは22mPEG分子/E
PO分子をもつmPEG−O−CH2CH2−ONH
2(式XXIII)で変性したEPOを意味し、17P
EG−Bは17mPEG/EPOにおける式XXIII
を意味し、12PEG−Bは12mPEG/EPOにお
ける式XXIIIを意味し、31PEG−Cは31PE
G/EPOにおけるmPEG−O−CH2CH2−NH−
CO−CH2−ONH2(式XXIV)で変性したEPO
を意味し、そして25PEG−Cは25mPEG/EP
Oにおける式XXIVを意味する。
【図20】mPEG−EPOを使用するEPO依存性細
胞増殖を示すグラフである。凡例において、31mPE
Gは31mPEG分子/EPO分子を有するオキシム誘
導化mPEG−O−CO−NHNH2(本発明の式I
I)で変性したEPOを意味する。
胞増殖を示すグラフである。凡例において、31mPE
Gは31mPEG分子/EPO分子を有するオキシム誘
導化mPEG−O−CO−NHNH2(本発明の式I
I)で変性したEPOを意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 38/00 38/22
Claims (14)
- 【請求項1】 式: 【化1】 式中、XはOまたはSであり、Qは−NHNH2および
−C6H4−NHNH2から成る群より選択され、そして
Yは−O−、−OCH2−、−NH−、−NHNH−、
−O−CO−CH2CH2−および−NHCO−N−NH
NH−から成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリ
マーである、を有する化合物。 - 【請求項2】 工程:ポリペプチドを変性のために請求
項1の化合物と混合すること、からなる方法によって製
造された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。 - 【請求項3】 請求項2のポリペプチドおよび製剤学的
に許容されうる担体からなる組成物。 - 【請求項4】 式: 【化2】(X) [P−O−CH2−CO−NHN
=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化3】(XI) [P−O−CO−NHN=CH
−]n−Z を有する化合物、 式: 【化4】(XII) [P−NH−CO−NHN=C
H−]n−Z を有する化合物、 式: 【化5】(XIII) [P−NH−CS−NHN=C
H−]n−Z を有する化合物、 式: 【化6】(XIV) [P−NHCO−NH−NHN
HCO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化7】 (XV) [P−HNNHCON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化8】 (XVI) [P−HNNHCSN=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化9】(XVII)[P−NH−CO−C6H4−NH
N=CH−]n−Z を有する化合物、および 式: 【化10】(XVIII) [P−O−CO−CH2CH
2−CO−NHN=CH−]n−Z を有する化合物、式中、Zはポリペプチドであり、nは
1〜xであり、xはZ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてPは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。 - 【請求項5】 工程、 ポリペプチドを活性化のために酸化剤と混合すること、
からなる、請求項1の化合物との接合のためにポリペプ
チドを活性化する方法。 - 【請求項6】 工程、 変性のためにポリペプチドを請求項1の水溶性ポリマー
の試薬化合物と混合すること、からなる、水溶性ポリマ
ー変性ポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項7】 請求項1の水溶性ポリマーからなる、ポ
リペプチドを水溶性ポリマーで変性するためのキット。 - 【請求項8】 式: 【化11】P−Y−X−Q 式中、XはC=O、C=S、CH2またはCHOHであ
り、Qは−ONH2−および−CH2−ONH2−から成
る群より選択され、そしてYは−O−CH2CH2−、−
O−CH2CH2−O−、−O−CH2CH2−N−、−O
−CH2CH2−S−および−O−CH2CH2CH−から
成る群より選択され、そしてPは水溶性ポリマーであ
る、を有する化合物。 - 【請求項9】 工程:ポリペプチドを変性のため請求項
8の化合物と混合すること、からなる方法によって製造
された水溶性ポリマー変性ポリペプチド。 - 【請求項10】 請求項9のポリペプチドおよび製剤学
的に許容されうる担体からなる組成物。 - 【請求項11】 式: 【化12】(XXVIII) [P−O−CH2CH2−
CO−ON =CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化13】(XXIX) [P−O−CH2CH2−O
−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化14】(XXX) [P−O−CH2CH2−N
H−CO−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化15】(XXXI) [P−O−CH2CH2−N
H−CS−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化16】(XXXII) [P−O−CH2CH2−
ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化17】(XXXIII) [P−O−CH2CH2−
NH−CO−CH2−ON=CH−]n−Z を有する化合物、 式: 【化18】(XXXIV) [P-O-CH2CH2-O-C
O-CH2-ON=CH-]n−Z を有する化合物、 式: 【化19】(XXXV) [P-O-CH2CH2-CH(O
H)-CH2-ON=CH-]n−Z を有する化合物、および 式: 【化20】(XXXVI) [P−O−CH2CH2−C
O−CH2− ON=CH−]n−Z を有する化合物、式中、Zはポリペプチドであり、nは
1〜xであり、xはZ上の酸化活性化可能な基の数であ
り、そしてPは水溶性ポリマーである、から成る群に属
する化合物。 - 【請求項12】 工程、 ポリペプチドを活性化のために酸化剤と混合すること、
からなる、請求項8の化合物との接合のためにポリペプ
チドを活性化する方法。 - 【請求項13】 工程、 変性のためにポリペプチドを請求項8の水溶性ポリマー
の試薬化合物と混合すること、からなる、水溶性ポリマ
ー変性ポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項14】 請求項8の水溶性ポリマーからなる、
ポリペプチドを水溶性ポリマーで変性するためのキッ
ト。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US98773992A | 1992-12-09 | 1992-12-09 | |
US987739 | 1992-12-09 | ||
US4505293A | 1993-04-07 | 1993-04-07 | |
US045052 | 1993-04-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07196925A true JPH07196925A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=26722325
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5340709A Pending JPH07196925A (ja) | 1992-12-09 | 1993-12-09 | Pegヒドラゾンおよびpegオキシム結合形成試薬およびそれらのタンパク質誘導体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07196925A (ja) |
KR (1) | KR100254650B1 (ja) |
AU (1) | AU5238393A (ja) |
FI (1) | FI935485A (ja) |
NO (1) | NO934477L (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JP2006505635A (ja) * | 2002-09-11 | 2006-02-16 | フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法 |
JP2006522738A (ja) * | 2002-10-09 | 2006-10-05 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | エリスロポエチン:エリスロポエチンの改造および複合糖質化 |
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JP2008525473A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト成長ホルモン |
WO2009113578A1 (ja) | 2008-03-13 | 2009-09-17 | 味の素株式会社 | カルボニル化合物除去材 |
JP2010501638A (ja) * | 2006-09-01 | 2010-01-21 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 修飾タンパク質 |
JP2010248528A (ja) * | 2002-09-11 | 2010-11-04 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法 |
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US8226942B2 (en) | 2007-12-28 | 2012-07-24 | Kuros Biosurgery Ag | PDGF fusion proteins incorporated into fibrin foams |
JP2013500375A (ja) * | 2009-07-27 | 2013-01-07 | リポクセン テクノロジーズ リミテッド | 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化 |
JP5170931B2 (ja) * | 2000-10-16 | 2013-03-27 | 中外製薬株式会社 | Peg修飾エリスロポエチン |
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US8841439B2 (en) | 2005-11-03 | 2014-09-23 | Novo Nordisk A/S | Nucleotide sugar purification using membranes |
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