PT1294401E

PT1294401E - Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas

Info

Publication number: PT1294401E
Application number: PT01950766T
Authority: PT
Inventors: Yan Lan; Stephen D Gillies; Sylvia A Holden
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2007-11-09
Also published as: HUP0300868A3; US7517526B2; ZA200300759B; DK1294401T3; PL358582A1; WO2002002143A2; ATE368475T1; CZ2003214A3; RU2272644C2; US20100297060A1; WO2002002143A3; NO20026245L; NO20026245D0; CN1529619A; SK982003A3; DE60129695D1; KR20030064275A; JP2004501981A; BR0112111A; AU2001271729B2

Description

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DESCRIÇÃO "AUMENTO DAS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS MEDIADAS POR PROTEÍNAS DE FUSÃO ANTICORPO-CITOQUINA POR TRATAMENTO COMBINADO COM AGENTES QUE AUMENTAM A CAPTAÇÃO DE IMUNOCITOQUINAS" Área da Invenção A presente invenção refere-se a proteínas de fusão anticorpo-citoquina úteis para imunoterapia dirigida. Em geral, a invenção refere-se à utilização de agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas em terapia de combinação para aumentar a resposta imunológica mediada por uma proteína de fusão anticorpo-citoquina contra um alvo pré-seleccionado, por exemplo, células num tumor. Em particular, a invenção refere-se à administração de proteínas de fusão anticorpo-citoquina em combinação com agentes quimioterapêuticos, como taxanos e/ou agentes de alquilação, para tratar células tumorais e outras células cancerosas ou doentes.

Contexto da Invenção 0 tratamento eficaz de doenças como cancro requer respostas imunológicas robustas por um ou mais tipos de células efectoras, como células assassinas naturais (NK), macrófagos e linfócitos T. Em animais e pacientes com tumores, o sistema imunológico não lidou eficazmente com o tumor em crescimento devido, em grande parte, a mecanismos específicos que o tumor elaborou para suprimir a resposta imunológica. Em muitos casos, células monocíticas que potencialmente destroem tumores, por exemplo, macrófagos, migram para leitos tumorais em crescimento, mas a secreção de factores tais como prostaglandinas, TGF-β e IL-10 pelas células tumorais modulam a sua actividade citotóxica (ver, 2 por exemplo, Sharma et al., 1999, J. Immunol. 163: 5020-5028). Da mesma forma, células linfocíticas que migram para tumores, como células NK e T, podem ser suprimidas por factores segregados por tumores, bem como por interacções com receptores expressos na superfície de células tumorais que activam a apoptose das células imunológicas (ver, por exemplo, Villunger et al., 1997, Blood _90_: 12-20). A exposição destes linfócitos a células monocíticas imunossupressoras no leito tumoral pode reduzir suplementarmente a sua capacidade para montar uma resposta antitumoral eficaz.

Os esforços feitos para ultrapassar os efeitos de supressão imunológica do microambiente tumoral local incluem estimulação imunológica dirigida, como tratamento com proteínas de fusão anticorpo-citoquina específicas para tumores. O tratamento eficaz com esta abordagem foi demonstrado em vários modelos de metástases tumorais em ratinhos; no entanto, o tratamento é muito menos eficaz à medida que a dimensão dos tumores aumenta. Isto deve-se provavelmente ao nível acrescido de factores supressores segregados pela massa tumoral, bem como a outros factores, como o aumento da pressão do fluido intersticial tumoral (Griffon-Etienne et al., 1999, Câncer Res. 5_9: 3776-3782), uma barreira à penetração de tumores sólidos por agentes terapêuticos.

Se bem que a maior parte dos pacientes com cancro ainda seja tratada com uma ou mais sessões de quimioterapia, é bem conhecido que a terapia citotóxica de cancro danifica o sistema imunológico. As células imunológicas estão entre as células que mais rapidamente se dividem no corpo humano, e qualquer tratamento que mate células em divisão também irá matar células imunológicas. Assim, tratamentos que incluem radiação, agentes químicos que danificam DNA, inibidores da 3 síntese de DNA e inibidores da função de microtúbulos danificam o sistema imunológico. São necessários transplantes de medula óssea como adjuvante à terapia de cancro precisamente porque o sistema imunológico fica danificado e necessita de ser reabastecido. 0 metotrexato e outros fármacos anti-cancerígenos são muitas vezes utilizados como imunossupressores. Também há evidências de que tratamentos anti-cancerígenos podem inibir especificamente a função de células T. Por exemplo, pacientes que foram tratados quanto a doença de Hodgkin com irradiação em todo o corpo sofrem uma perda aparentemente permanente de células T não manipuladas (Watanabe et al., 1997, Blood 90: 3662) . A patente W099/52562 descreve que a resposta imunológica citocida iniciada pelas citoquinas de fusão a anticorpos pode ser aumentada se a proteína de fusão for administrada simultaneamente com um inibidor da angiogénese. No entanto, não é conhecido que inibidores da angiogénese tenham uma eficácia citotóxica como a exibida por agentes quimioterapêuticos. Baselga et al. (Câncer Research 1998, 5_8 (13)) ensina que um tratamento combinado de alguns agentes quimioterapêuticos específicos, como paclitaxel ou doxorrubicina, e um anticorpo específico anti-Her2 (HER2; Herceptina®), que se sabe ter citotoxicidade notável mesmo quando utilizado em monoterapia, aumenta a actividade antitumoral citotóxica destes agentes quimioterapêuticos. No entanto, uma citotoxicidade aumentada dessa forma com bases nos agentes quimioterapêuticos como tal não é específica para um alvo e causa muitos efeitos secundários indesejados.

Com base nos conhecimentos actuais pareceria improvável que tratamentos padrão (quimioterapia e radiação) e estimulação imunológica local constituíssem uma abordagem 4 de combinação útil para o tratamento eficaz de cancro. Em consequência, são necessários na área métodos que aumentem as respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina contra tipos de células pré-seleccionados, por exemplo, células tumorais, e composições empregues nesses métodos.

Resumo da Invenção

Foi descoberto que, quando se administra uma proteína de fusão anticorpo-citoquina (imunocitoquina) a um mamífero com um tumor ou metástases tumorais, é possível criar uma resposta antitumoral mais potente se for administrada preferivelmente após tratamento do mamífero com um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas, que aumenta ou intensifica o efeito terapêutico da proteína de fusão anticorpo-citoquina ao intensificar ou aumentar a sua captação pelo tumor. Foi descoberto que agentes úteis que aumentam a captação de imunocitoquinas compreendem agentes quimioterapêuticos de alquilação e taxanos, como paclitaxel. Em particular, foi descoberto que essas combinações são úteis na mediação da destruição imunológica do tipo de célula pré-seleccionado, como células tumorais ou células infectadas com vírus.

Num aspecto, descreve-se um método para induzir uma resposta imunológica citocida contra um tipo de célula pré-seleccionado num mamífero. 0 método compreende administrar ao mamífero (i) uma imunocitoquina que compreende um sítio de ligação de anticorpos capaz de se ligar ao tipo de célula pré-seleccionado e uma citoquina capaz de induzir essa resposta imunológica contra o tipo de célula pré-seleccionado, e (ii) um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas numa quantidade suficiente para aumentar a 5 resposta imunológica relativamente à resposta imunológica estimulada pela imunocitoquina isoladamente.

Numa especificação preferida, o tipo de célula pré-seleccionado pode ser uma célula cancerosa presente, por exemplo, num tumor sólido, mais preferivelmente num tumor sólido maior (isto é, maior do que cerca de 100 mm3) . Alternativamente, o tipo de célula pré-seleccionado pode ser uma célula cancerosa presente na forma de pequenas metástases. O agente que aumenta a captação de imunocitoquinas é preferivelmente administrado antes da administração da imunocitoquina. Suplementarmente, é contemplado que a imunocitoquina possa ser administrada juntamente com uma pluralidade de diferentes agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas. Alternativamente, é contemplado que um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas possa ser administrado juntamente com uma pluralidade de diferentes imunocitoquinas.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma composição na forma de um estojo constituído por partes para induzir uma resposta imunológica citocida contra um tipo de célula pré-seleccionado num mamífero. O estojo constituído por partes compreende: (i) uma primeira embalagem que contém uma composição compreendendo uma imunocitoquina que compreende um sítio de ligação de anticorpos capaz de se ligar ao tipo de célula pré-seleccionado, e uma citoquina capaz de induzir essa resposta imunológica contra o tipo de células pré-seleccionado no mamífero, e (ii) uma segunda embalagem que contém uma composição compreendendo um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas numa quantidade suficiente para aumentar a resposta citocida induzida pela imunocitoquina da combinação relativamente à resposta citocida estimulada pela imunocitoquina isoladamente. 6

Numa especificação preferida, o sitio de ligação de anticorpos da imunocitoquina compreende preferivelmente a cadeia pesada de uma imunoglobulina ou um respectivo fragmento de ligação de antigenes. A cadeia pesada de uma imunoglobulina compreende preferivelmente, na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, o domínio da região variável (VH) de uma imunoglobulina capaz de se ligar a um antigene pré-seleccionado, o domínio pesado constante 1 (CHI) de uma imunoglobulina, o domínio pesado constante 2 (CH2) de uma imunoglobulina e, opcionalmente, também pode incluir o domínio pesado constante 3 (CH3) de uma imunoglobulina. Numa especificação mais preferida, a imunocitoquina é uma proteína de fusão que compreende a cadeia pesada de uma imunoglobulina ou respectivo fragmento de ligação de antigenes fundido, via uma ligação polipeptídica, à citoquina. Em conformidade, uma proteína de fusão anticorpo-citoquina preferida compreende, na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, (i) o sítio de ligação de anticorpos que compreende a região variável de uma imunoglobulina capaz de se ligar a um antigene da superfície celular no tipo de célula pré-seleccionado, o domínio CHI de uma imunoglobulina, o domínio CH2 de uma imunoglobulina (opcionalmente, o domínio CH3) e (ii) a citoquina. Métodos para preparar e utilizar essas proteínas de fusão são descritos em pormenor em Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 1428-1432; Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203, e Patente U.S. N° 5 650 150.

Os domínios de regiões constantes de imunoglobulinas (isto é, os domínios CHI, CH2 e/ou CH3) podem ser os domínios de regiões constantes normalmente associados ao domínio da região variável num anticorpo de ocorrência natural. Alternativamente, um ou mais dos domínios de 7 regiões constantes de imunoglobulinas podem derivar de anticorpos diferentes do anticorpo utilizado como fonte do dominio da região variável. Por outras palavras, os domínios das regiões variável e constante de imunoglobulinas podem derivar de anticorpos diferentes, por exemplo, anticorpos derivados de espécies diferentes. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4 816 567. Suplementarmente, as regiões variáveis de imunoglobulinas podem compreender sequências de regiões de arcabouço (FR) derivadas de uma espécie, por exemplo, um humano, e sequências de regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas entre as FRs, derivadas de uma segunda espécie diferente, por exemplo, um ratinho. Métodos para preparar e utilizar essas regiões variáveis de imunoglobulinas quiméricas são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5 225 539 e 5 585 089.

As imunocitoquinas à base de anticorpos também compreendem preferivelmente a cadeia leve de uma imunoglobulina, que é preferivelmente ligada de forma covalente à cadeia pesada de uma imunoglobulina através, por exemplo, de uma ligação dissulfureto. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas ligadas definem, em conjunto, um sítio de ligação único e completo para a ligação do antigene pré-seleccionado. Noutras especificações, as imunocitoquinas compreendem duas cadeias quiméricas, cada uma das quais compreende pelo menos uma porção da cadeia pesada de uma imunoglobulina fundida a uma citoquina. Preferivelmente, as duas cadeias quiméricas são ligadas em conjunto covalentemente, por exemplo, por uma ou mais ligações dissulfureto inter-cadeias.

Assim, a invenção proporciona proteínas de fusão nas quais a especificidade e actividade de ligação a antigenes 8 de um anticorpo são combinadas com a actividade biológica potente de uma citoquina. Uma proteina de fusão da presente invenção pode ser utilizada para dirigir a citoquina selectivamente para uma célula-alvo in vivo de modo que a citoquina possa exercer um efeito biológico localizado na vizinhança da célula-alvo. Numa especificação preferida, o componente de anticorpo da proteina de fusão liga-se especificamente a um antigene sobre ou numa célula cancerosa e, em resultado, a proteina de fusão exerce actividade anti-cancerigena localizada. Numa especificação preferida alternativa, o componente de anticorpo da proteina de fusão liga-se especificamente a uma célula infectada com vírus, como uma célula infectada com HIV, e, em resultado, a proteína de fusão exerce actividade antiviral localizada.

As citoquinas que podem ser incorporadas nas imunocitoquinas da invenção incluem, por exemplo, factores de necrose tumoral, interleuquinas, factores estimuladores de colónias e linfoquinas, bem como outras conhecidas na área. Factores de necrose tumoral preferidos incluem, por exemplo, factor de necrose de tecidos α (TNFa).

Interleuquinas preferidas incluem, por exemplo, interleuquina-2 interleuquina-5 interleuquina-12 interleuquina-18 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), (IL—5), interleuquina-7 (IL-7), (IL-12), interleuquina-15 (IL-15) e (IL-18). Factores estimuladores de colónias preferidos incluem, por exemplo, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF). Linfoquinas preferidas incluem, por exemplo, linfotoxina (LT) . Outras citoquinas úteis incluem interferões, incluindo IFN-a, IFN-β e IFN-γ, todas as quais exercem 9 efeitos imunológicos, bem como efeitos antiangiogénicos, que são independentes das suas actividades antivirais.

Foi descoberto que vários tipos de agentes quimioterapêuticos são agentes eficazes que aumentam a captação de imunocitoquinas. Em particular, agentes úteis que aumentam a captação de imunocitoquinas incluem taxanos e agentes quimioterapêuticos de alquilação. São conhecidos na área vários taxanos (ver Bissery e Lavelle, 1997, em "Câncer Therapeutics: Experimental and Clinicai Agents", Capitulo 8, B. Teicher, editor). Numa especificação preferida, o taxano é Taxol, também conhecido como paclitaxel. Outras especificações incluem o taxano semi-sintético docetaxel, o qual, nalguns modelos tumorais e indicações clinicas, é mais eficaz do que o paclitaxel. Outras especificações incluem derivados de taxanos adicionais, como os derivados do material de partida natural 10-desacetil-Bacatina III, extraído das agulhas do teixo. Um desses exemplos é o composto oralmente disponível IDN5109, que também é um substrato fraco para a glicoproteína P e é geralmente mais activo contra tumores resistentes a múltiplos fármacos. Para além de estar oralmente biodisponivel, a dose tolerada também é mais elevada e exibe menos efeitos secundários neurotóxicos (Polizzi et al., 1999, Câncer Res. 59: 1036-1040).

Também são proporcionadas dosagens e regimes de administração preferidos para administrar as imunocitoquinas em combinação com os agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas.

Descrição das Figuras A Figura 1 é uma representação esquemática de uma citoquina. 10 A Figura 2 mostra o efeito do paclitaxel e de uma imunocitoquina no volume do tumor LLC/KSA ao longo do tempo. A Figura 3 mostra o efeito de múltiplas doses de paclitaxel e de uma imunocitoquina no volume tumoral médio ao longo do tempo. A Figura 4 mostra o efeito do paclitaxel e de uma imunocitoquina no peso tumoral num ensaio de metástases no pulmão. A Figura 5 mostra o efeito do paclitaxel e de uma imunocitoquina no volume do tumor CT26/KSA ao longo do tempo. A Figura 6 mostra o efeito do paclitaxel e de uma imunocitoquina no peso tumoral num ensaio de metástases no figado.

As Figuras 7A e 7B mostram o efeito do paclitaxel na captação de imunocitoquinas por um tumor. A Figura 8 mostra o efeito da ciclofosfamida na captação de imunocitoquinas por um tumor. A Figura 9 mostra o efeito da ciclofosfamida e de uma imunocitoquina no peso tumoral num ensaio de metástases no pulmão. A Figura 9B mostra o efeito da ciclofosfamida e de uma imunocitoquina no volume tumoral num ensaio de crescimento tumoral. A Figura 9C mostra o efeito da ciclofosfamida e de uma imunocitoquina no volume tumoral num ensaio de crescimento tumoral. A Figura 10 mostra o efeito da carboplatina e de uma imunocitoquina no volume tumoral num ensaio de crescimento tumoral. 11

Descrição Pormenorizada da Invenção

Estudos mostraram que tumores sólidos grandes são muito mais refractários a intervenção terapêutica mediada por anticorpos e a terapias imunológicas em geral do que focos metastáticos disseminados (Sulitzeanu et al. (1993) Adv. Câncer Res. _60_: 247-267) . Crê-se que a baixa sensibilidade a terapias à base de anticorpos se baseia, em parte, na produção pelos tumores de factores imunossupressores.

Apesar do mecanismo de erradicação tumoral não estar completamente compreendido, é contemplado que respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) podem conduzir à destruição de células cancerosas e proporcionar memória imunológica. Também é contemplado que, em certas circunstâncias, células assassinas naturais (NK) são responsáveis pela erradicação do tumor na ausência de CTLs. As diferentes respostas imunológicas podem resultar do facto de certos tumores produzirem diferentes tipos ou quantidades de substâncias capazes de regular negativamente células T. Isto é especialmente verdade para tumores sólidos, e não para focos micrometastáticos, que atingiram uma massa critica e que são capazes de produzir e segregar factores imunossupressores em niveis suficientes para modular uma resposta imunológica contra os tumores.

Foi agora descoberto que respostas imunológicas citocidas iniciadas por uma imunocitoquina contra um tipo de célula pré-seleccionado podem ser significativamente aumentadas por administração da imunocitoquina juntamente com um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas, em que este agente é preferivelmente administrado antes da imunocitoquina. A terapia combinada é particularmente eficaz na mediação da destruição imunológica de um tecido doente, como um tumor estabelecido. Sem pretender ficar restringido pela teoria, é contemplado que o agente que 12 aumenta a captação de imunocitoquinas aumenta a penetração da imunocitoquina no microambiente tumoral, desse modo tornando-a capaz de ultrapassar o efeito imunossupressor e mais eficaz na activação de respostas imunológicas celulares contra o tumor. De modo semelhante, é contemplado que esse método pode ser útil para o tratamento de certas doenças virais nas quais um mecanismo imunossupressor semelhante evita imunidade celular eficaz, por exemplo, em infecção pelo HIV. É contemplado que o agente que aumenta a captação de imunocitoquinas actua sinergeticamente com a imunocitoquina para mediar a destruição imunológica de um tecido doente, como um tumor estabelecido ou células infectadas por virus. A presente revelação também descreve métodos de preparação e utilização de imunocitoquinas úteis, bem como ensaios úteis para testar as suas propriedades farmacocinéticas em modelos animais in vivo pré-clínicos, quando combinadas com agentes adequados que aumentam a captação de imunocitoquinas.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "agente que aumenta a captação de imunocitoquinas" designa qualquer agente que aumenta uma resposta imunológica citocida induzida por uma imunocitoquina contra um tipo de células pré-seleccionado. Mais especificamente, um agente preferido que aumenta a captação de imunocitoquinas é um agente que aumenta a captação tumoral que aumenta a penetração de uma imunocitoquina num tumor. Exemplos que aumentam a captação de imunocitoquinas incluem, mas não se limitam a estes, agentes quimioterapêuticos, como taxanos, agentes que danificam DNA, incluindo agentes quimioterapêuticos de alquilação, agentes de terapia com radiação e agentes que modulam a pressão sanguínea. Taxanos preferidos são taxol, docetaxel, 10-desacetil-Bacatina III e derivados destes. Agentes de alquilação preferidos são 13 ciclofosfamida, carboplatina, cisplatina e derivados destes. Uma forma de radiação preferida é irradiação gama. Um agente preferido modulador da pressão sanguínea é um agonista da angiotensina II, tal como a própria angiotensina II, preferivelmente administrado periodicamente de acordo com os princípios gerais descritos por Netti et al. (Câncer Research [1995] d5: 5451-8) e Netti et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. [1999] _96: 3137-3142). Pode determinar-se a resposta imunológica por métodos conhecidos do habitualmente experimentado na área e/ou como descritos aqui.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "resposta imunológica citocida" designa qualquer resposta imunológica num mamífero, de natureza humoral ou celular, que é estimulada por uma imunocitoquina e que mata ou então reduz a viabilidade de um tipo de células pré-seleccionado no mamífero. A resposta imunológica pode incluir um ou mais tipos de células, incluindo células T, células NK e macrófagos.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "imunocitoquina" designa uma fusão de (i) um sítio de ligação de anticorpos com especificidade de ligação e capaz de se ligar a um antigene pré-seleccionado, por exemplo, um antigene específico de um tipo de células, e (ii) uma citoquina que é capaz de induzir ou estimular uma resposta imunológica citocida tipicamente contra um cancro ou célula infectada por vírus. Exemplos de antigenes pré-seleccionados incluem antigenes da superfície celular, como em células cancerosas ou células infectadas com vírus, e antigenes intracelulares insolúveis, por exemplo, de células necróticas, que podem permanecer ligados à membrana celular. Antigenes preferidos são antigenes-alvo que são característicos de células tumorais, como antigenes 14 específicos de tumores. Em conformidade, a imunocitoquina é capaz de distribuir selectivamente a citoquina num alvo (que é tipicamente uma célula) in vivo, de modo que a citoquina pode mediar uma resposta imunológica localizada contra uma célula-alvo. Por exemplo, se o componente de anticorpo da imunocitoquina se ligar selectivamente a um antigene numa célula cancerosa, como uma célula cancerosa de um tumor sólido, e em particular um tumor sólido maior de dimensões superiores a cerca de 100 mm3, a imunocitoquina exerce actividade anti-cancerígena localizada. Alternativamente, se o componente de anticorpo da imunocitoquina se ligar selectivamente a um antigene numa célula infectada por vírus, como uma célula infectada com HIV, a imunocitoquina exerce actividade antiviral localizada.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "sítio de ligação de anticorpos" designa pelo menos uma porção da cadeia pesada de uma imunoglobulina, por exemplo, a região variável de uma imunoglobulina, capaz de se ligar a um antigene pré-seleccionado, como um tipo de células. O sítio de ligação de anticorpos também compreende, preferivelmente, pelo menos uma porção da região constante de uma imunoglobulina, incluindo, por exemplo, um domínio CHI, um domínio CH2 e, opcionalmente, um domínio CH3, ou pelo menos um domínio CH2, ou uma ou mais porções destes. Suplementarmente, a cadeia pesada de imunoglobulina pode estar associada, de forma covalente ou não covalente, à cadeia leve de uma imunoglobulina, compreendendo, por exemplo, a região variável da cadeia leve e, opcionalmente, região constante da cadeia leve de uma imunoglobulina. Em conformidade, é contemplado que o sítio de ligação de anticorpos pode compreender um anticorpo intacto ou um 15 respectivo fragmento, ou um anticorpo de cadeia simples, capaz de se ligar ao antigene pré-seleccionado.

No que se refere à imunocitoquina, é contemplado que o fragmento de anticorpo pode estar ligado à citoquina por uma variedade de modos bem conhecidos dos habitualmente experimentados na área. Por exemplo, o sitio de ligação de anticorpos é preferivelmente ligado, via uma ligação polipeptidica ou agente de ligação, a citoquina numa construção de proteína de fusão. Alternativamente, o sítio de ligação de anticorpos pode ser acoplado quimicamente à citoquina via grupos reactivos, por exemplo, grupos sulfidrilo, nas cadeias laterais de aminoácidos presentes no sítio de ligação de anticorpos e na citoquina.

Tal como é aqui utilizado, entende-se que o termo "citoquina" designa qualquer proteína ou péptido, respectivo análogo ou fragmento funcional, que é capaz de estimular ou induzir uma resposta imunológica citocida contra um tipo de célula pré-seleccionado, por exemplo, uma célula cancerosa ou uma célula infectada com vírus, num mamífero. Em conformidade, é contemplado que uma variedade de citoquinas pode ser incorporada nas imunocitoquinas da invenção. Citoquinas úteis incluem, por exemplo, factores de necrose tumoral (TNFs), interleuquinas (ILs), linfoquinas (Ls), factores estimuladores de colónias (CSFs), interferões (IFNs), incluindo respectivas variantes de espécies e análogos truncados que são capazes de estimular ou induzir essas respostas imunológicas citocidas. Factores de necrose tumoral úteis incluem, por exemplo, TNF a. Linfoquinas úteis incluem, por exemplo, LT. Factores estimuladores de colónias úteis incluem, por exemplo, GM-CSF e M-CSF. Interleuquinas úteis incluem, por exemplo, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18. 16

Interferões úteis incluem, por exemplo, IFN-a, IFN-β e IFN-Y· O gene que codifica uma citoquina particular de interesse pode ser clonado de novo, obtido de uma fonte disponível ou sintetizado por síntese comum de DNA a partir de uma sequência de nucleótidos conhecida. Por exemplo, a sequência de DNA da LT é conhecida (ver, por exemplo, Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 6361), bem como as sequências da IL-2 (ver, por exemplo, Taniguchi et al. (1983) Nature 302: 305-318), GM-CSF (ver, por exemplo, Gasson et al. (1984) Science 266: 1339-1342) e TNF α (ver, por exemplo, Nedwin et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 6361) .

Numa especificação preferida, as imunocitoquinas são proteínas de fusão recombinantes produzidas por metodologias convencionais de DNA recombinante, isto é, por formação de uma construção de ácido nucleico que codifica a imunocitoquina quimérica. A construção de proteínas de fusão recombinantes anticorpo-citoquina foi descrita na técnica anterior. Ver, por exemplo, Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8_9: 1428-1432/ Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203, e Patente U.S. N° 5 650 150. Preferivelmente, uma construção genética que codifica a imunocitoquina da invenção inclui, na orientação 5' para 3', um segmento de DNA que codifica o domínio da região variável da cadeia pesada de uma imunoglobulina, um segmento de DNA que codifica a região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina e um DNA que codifica a citoquina. O gene fundido é montado ou inserido num vector de expressão para transfecção numa célula receptora apropriada, onde o gene fundido é expresso. A cadeia polipeptídica híbrida é preferivelmente combinada com a 17 cadeia leve de uma imunoglobulina de modo que a região variável da cadeia pesada (VH) de uma imunoglobulina e a região variável da cadeia leve (VL) de uma imunoglobulina se combinam para produzir um sitio único e completo para a ligação de um antigene pré-seleccionado. Numa especificação preferida, as cadeias pesada e leve de imunoglobulinas são acopladas de forma covalente, por exemplo, através de uma ligação dissulfureto inter-cadeias. Suplementarmente, duas cadeias pesadas de imunoglobulinas, em que uma ou ambas estão fundidas a uma citoquina, podem ser covalentemente acopladas, por exemplo, através de uma ou mais ligações dissulfureto inter-cadeias.

Em conformidade, os métodos descritos aqui são úteis para aumentar a actividade antitumoral de uma imunocitoquina utilizada num método terapêutico para tratar um tumor, incluindo composições e métodos de imunocitoquinas revelados em W099/29732, W099/43713, W099/52562, W099/53958 e W001/10912, e proteínas de fusão à base de anticorpos com uma sequência de aminoácidos alterada na região de junção. Numa especificação, os métodos descritos aqui são úteis em combinação com proteínas de fusão de Fc, como Fc-interferão-α. A Figura 1 mostra uma representação esquemática de uma imunocitoquina exemplificativa 1. Nesta especificação, as moléculas de citoquina 2 e 4 estão ligadas por ligações peptídicas aos terminais carboxi 6 e 8 das regiões CH3 10 e 12 das cadeias pesadas de anticorpos 14 e 16. As regiões VL 26 e 28 estão apresentadas emparelhadas com as regiões VH 18 e 20 numa configuração típica de IgG, desse modo proporcionando dois sítios de ligação de antigenes 30 e 32 nas extremidades amino-terminais da imunocitoquina 1 e dois sítios de ligação de receptores de citoquinas 40 e 42 nas extremidades carboxi da imunocitoquina 1. Obviamente, nos 18 seus aspectos mais amplos, não é necessário que as imunocitoquinas estejam emparelhadas como ilustrado, ou é apenas necessário que uma das duas cadeias pesadas de imunoglobulinas esteja fundida a uma molécula de citoquina.

As imunocitoquinas descritas aqui podem ser consideradas quiméricas em virtude de dois aspectos da sua estrutura. Em primeiro lugar, a imunocitoquina é quimérica por incluir a cadeia pesada de uma imunoglobulina com especificidade de ligação de antigenes ligada a uma dada citoquina. Em segundo lugar, uma imunocitoquina pode ser quimérica no sentido de incluir a região variável (V) de uma imunoglobulina e a região constante (C) de uma imunoglobulina, ambas as quais derivam de anticorpos diferentes, de modo que a proteina resultante é uma quimera V/C. Por exemplo, as regiões variável e constante podem derivar de moléculas de anticorpos de ocorrência natural que podem ser isolados de espécies diferentes. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 4 816 567. Também estão abrangidas construções nas quais qualquer uma ou ambas as regiões variáveis de imunoglobulinas compreendem sequências da região de arcabouço (FR) e sequências da região determinante de complementaridade (CDR) derivadas de espécies diferentes. Essas construções são reveladas, por exemplo, em Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535, e Patentes U.S. N°s 5 225 539 e 5 585 089. Suplementarmente, é contemplado que as sequências da região variável podem ser derivadas por rastreio de bibliotecas, por exemplo, bibliotecas de expressão em fagos, quanto a sequências da região variável que se ligam a um antigene pré-seleccionado com uma afinidade desejada. Métodos para preparar e rastrear bibliotecas de expressão em fagos são revelados, por exemplo, em Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281, 19 e Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 11120-11123.

Os domínios da região constante da cadeia pesada de imunoglobulinas das imunocitoquinas podem ser seleccionados de qualquer uma das cinco classes de imunoglobulinas referidas como IgA (Iga), IgD (Igô), IgE (Igs), IgG (Igy) e IgM (Igp). No entanto, são preferidas regiões constantes da cadeia pesada de uma imunoglobulina da classe IgG. Suplementarmente, é contemplado que as cadeias pesadas de imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer uma das subclasses de anticorpos IgG referidas na área como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Como é conhecido, cada região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina compreende quatro ou cinco domínios. Os domínios são denominados sequencialmente do modo seguinte: CHl-região conectora-CH2-CH3-(-CH4). O CH4 está presente em IgM, que não tem nenhuma região conectora. As sequências de DNA dos domínios da cadeia pesada têm homologia cruzada entre as classes de imunoglobulinas, por exemplo, o domínio CH2 de IgG é homólogo ao domínio CH2 de IgA e IgD e ao domínio CH3 de IgM e IgE. As cadeias leves de imunoglobulinas podem ter uma cadeia constante kapa (k) ou lambda (λ) . Sequências e alinhamentos de sequências destas regiões de imunoglobulinas são bem conhecidos na área (ver, por exemplo, Kabat et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, terceira edição 1983, quarta edição 1987, e Huck et al. (1986) Nuc. Acids Res. 14: 1779-1789).

Em especificações preferidas, a região variável é derivada de um anticorpo especifico para um antigene da superfície celular pré-seleccionado (um antigene associado a uma célula doente, como uma célula cancerosa ou célula 20 infectada com vírus) e a região constante inclui os domínios CHI e CH2 (e opcionalmente CH3) de um anticorpo que é igual ou diferente do anticorpo que é a fonte da região variável. Na prática desta invenção, a porção de anticorpo da imunocitoquina é preferivelmente não imunogénica ou é fracamente imunogénica no receptor pretendido. Em conformidade, a porção de anticorpo, tanto quanto possível, é preferivelmente derivada da mesma espécie do receptor pretendido. Por exemplo, se a imunocitoquina se destinar a ser administrada a humanos, os domínios da região constante têm preferivelmente origem humana. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4 816 567. Suplementarmente, quando a região variável de uma imunoglobulina derivar de uma espécie diferente do receptor pretendido, por exemplo, quando as sequências da região variável têm origem murina e o receptor pretendido é humano, então a região variável compreende, preferivelmente, sequências de FR humanas com sequências de CDR murinas intercaladas entre as sequências de FR, para produzir uma região variável quimérica que tem especificidade de ligação para um antigene pré-seleccionado mas simultaneamente minimizando a reactividade imunológica no hospedeiro pretendido. A concepção e síntese dessas regiões variáveis quiméricas são reveladas em Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen et al. (1988) Science 239: 1534-1535, e Patentes U.S. N°s 5 225 539 e 5 585 089. A clonagem e expressão de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina humanizada, proteína de fusão anticorpo anti-EpCAM KS-1/4-IL-12, bem como a sua capacidade para erradicar metástases de carcinoma do cólon estabelecido, foram descritas em Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203. 21 0 gene que codifica a citoquina é reunido, directamente ou através de um agente de ligação, por exemplo, através de DNA que codifica um agente de ligação (Gly4-Ser)3, na estrutura, à extremidade 3' do gene que codifica a região constante de uma imunoglobulina (por exemplo, um exão CH2 ou CH3). Em certas especificações, o agente de ligação pode compreender uma sequência de nucleótidos que codifica um sitio de clivagem proteolitica. Este sitio, quando intercalado entre a região constante de uma imunoglobulina e a citoquina, pode ser concebido para proporcionar libertação proteolitica da citoquina no sitio-alvo. Por exemplo, é bem conhecido que plasmina e tripsina procedem à clivagem após resíduos lisina e arginina em sítios que estão acessíveis às proteases. Muitas outras proteases específicas para sítios e as sequências de aminoácidos que clivam são bem conhecidas na área. Sítios de clivagem proteolitica e enzimas proteolíticas preferidas que são reactivas com esses sítios de clivagem são revelados nas Patentes U.S. N°s 5 541 087 e 5 726 044. A construção de ácido nucleico pode incluir, opcionalmente, o promotor e intensificador endógenos para o gene que codifica a região variável, para regular a expressão da cadeia de imunoglobulina quimérica. Por exemplo, os genes que codificam regiões variáveis podem ser obtidos como fragmentos de DNA compreendendo o péptido líder, o gene VJ (regiões variáveis (V) funcionalmente rearranjadas com segmento de reunião (J) ) para a cadeia leve, ou gene VDJ para a cadeia pesada, e o promotor e intensificador endógenos para estes genes. Alternativamente, o gene que codifica a região variável pode ser obtido separadamente de elementos reguladores endógenos e utilizado num vector de expressão que proporciona estes elementos. 22

Genes de regiões variáveis podem ser obtidos por procedimentos comuns de clonagem de DNA a partir de células que produzem o anticorpo desejado. 0 rastreio da biblioteca genómica quanto a uma região variável especifica funcionalmente rearranjada pode ser feito utilizando sondas de DNA apropriadas, tais como segmentos de DNA que contêm a sequência de DNA da região J e sequências a jusante. Procede-se à identificação e confirmação de clones correctos por sequenciação dos genes clonados e comparação da sequência com a sequência correspondente do mRNA completo apropriadamente processado. 0 antigene alvo pode ser um antigene da superfície celular de uma célula tumoral ou cancerosa, uma célula infectada com vírus ou outra célula doente. 0 antigene alvo também pode ser um antigene intracelular insolúvel de uma célula necrótica (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5 019 368). Genes que codificam regiões variáveis apropriadas podem ser geralmente obtidos de linhas de células linfóides que produzem imunoglobulinas. Por exemplo, linhas de células de hibridoma que produzem imunoglobulinas específicas para antigenes associados a tumores ou antigenes virais podem ser produzidas por técnicas comuns de hibridização de células somáticas bem conhecidas na área (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4 196 265) . Estas linhas de células produtoras de imunoglobulinas proporcionam a fonte de genes de regiões variáveis em forma funcionalmente rearranjada. Os genes de regiões variáveis terão tipicamente origem murina porque este sistema murino é propenso à produção de uma grande variedade de imunoglobulinas de especificidade desejada. Suplementarmente, podem derivar-se sequências de regiões variáveis rastreando bibliotecas, por exemplo, bibliotecas de expressão em fagos, quanto a sequências de regiões 23 variáveis que se ligam a um antigene pré-seleccionado com uma afinidade desejada. Métodos para preparar e rastrear bibliotecas de expressão em fagos são revelados, por exemplo, em Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281, e Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 11120-11123. O fragmento de DNA que codifica o gene da região variável funcionalmente activo é ligado a um fragmento de DNA que contém o gene que codifica a região constante desejada (ou uma porção desta). Regiões constantes de imunoglobulinas (cadeia pesada e leve) podem ser obtidas de células produtoras de anticorpos por técnicas comuns de clonagem de genes. Foram clonados genes para as duas classes de cadeias leves humanas (k e λ) e para as cinco classes de cadeias pesadas humanas (α, δ, ε, γ e μ) e, assim, regiões constantes de origem humana estão facilmente disponíveis a partir destes clones. O gene fundido que codifica a cadeia pesada de imunoglobulina híbrida é reunido ou inserido num vector de expressão para incorporação numa célula receptora. Pode proceder- se à incorporação da construção do gene em vectores plasmídicos por procedimentos comuns de processamento de genes. A cadeia pesada de imunoglobulina quimérica pode ser co-expressa na mesma célula com a cadeia leve de imunoglobulina correspondente de modo que uma imunoglobulina completa possa ser expressa e reunida simultaneamente. Para esta finalidade, as construções das cadeias pesada e leve podem ser colocadas no mesmo vector ou em vectores separados.

Linhas de células receptoras são geralmente células linfóides. A célula receptora preferida é um mieloma (ou hibridoma). Mielomas podem sintetizar, reunir e segregar imunoglobulinas codificadas por genes transfectados e podem 24 glicosilar proteínas. Células receptoras ou hospedeiro particularmente preferidas incluem células de mieloma Sp2/0, que normalmente não produz imunoglobulina endógena, e células NS/0 de mieloma de ratinho. Quando transfectada, a célula produz apenas imunoglobulina codificada pelas construções de genes transfectados. Mielomas transfectados podem crescer em cultura ou no peritoneu de ratinhos, onde imunocitoquinas segregadas podem ser recuperadas de fluido de ascites. Podem utilizar-se como células receptoras outras células linfóides, como linfócitos B. Há vários métodos para transfectar células linfóides com vectores que contêm as construções de ácidos nucleicos que codificam a cadeia de imunoglobulina quimérica. Por exemplo, podem introduzir-se vectores em células linfóides por fusão de esferoblastos (ver, por exemplo, Gillies et al. (1989) Biotechnol. 7: 798-804). Outros métodos úteis incluem electroporação ou precipitação com fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Sambrook et al. editores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press).

Outros métodos úteis para produzir as imunocitoquinas incluem a preparação de uma sequência de RNA que codifica a construção e a sua tradução num sistema de expressão in vivo ou in vitro apropriado. É contemplado que as metodologias de DNA recombinante para sintetizar genes que codificam proteínas de fusão anticorpo-citoquina, para introduzir os genes em células-hospedeiro, para expressar os genes no hospedeiro e para recolher a proteína de fusão resultante são bem conhecidas e estão extensamente documentadas na área. Protocolos específicos estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al. editores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor

Press. 25

Deve entender-se que as imunocitoquinas quimicamente acopladas podem ser produzidas utilizando uma variedade de métodos bem conhecidos dos experimentados na área. Por exemplo, o anticorpo ou um fragmento de anticorpo pode ser quimicamente acoplado à citoquina utilizando cadeias laterais de aminoácidos quimicamente reactivas no anticorpo ou fragmento de anticorpo e na citoquina. As cadeias laterais de aminoácidos podem ser covalentemente ligadas, por exemplo, via ligações dissulfureto, ou por intermédio de reagentes de formação de ligações cruzadas homo- ou hetero-bifuncionais, incluindo, por exemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinato, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissulfossuccinimida e 1,4-di-[31 - (2'-piridiltio)propionamido]butano, todos os quais são comercialmente disponibilizados pela Pierce, Rockford, IL. A combinação de imunocitoquinas com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas é útil para intensificar a estimulação do sistema imunológico, desse modo resultando numa resposta citotóxica no sitio do tipo da célula abordada selectivamente, por exemplo, células tumorais ou outras células doentes. É de esperar que uma combinação de uma imunocitoquina e de um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas não exerça nenhum efeito antitumoral combinado ou sinergético in vitro, pois a imunocitoquina isoladamente não é citotóxica.

Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, crê-se que os efeitos da terapia combinada in vivo podem incluir captação aumentada de um dos agentes pela acção do outro, dando origem a qualquer um ou ambos os seguintes: (1) citotoxicidade quimioterapêutica aumentada (se a imunocitoquina tiver aumentado a captação do agente quimioterapêutico que aumenta a captação de imunocitoquinas 26 para células tumorais), e/ou (2) estimulação imunológica aumentada (se o agente que aumenta a captação de imunocitoquinas tiver, de algum modo, aumentado a captação da imunocitoquina para o tumor). Relativamente ao mecanismo (1), estudos anteriores mostraram que é possível aumentar a captação de anticorpos etiquetados de forma radioactiva (e, presumivelmente, de fármacos que consistem em moléculas pequenas) para tumores por tratamento prévio com doses elevadas de um imunoconjugado anticorpo-IL2 que induz fugas vasculares locais (ver, por exemplo, Hornick et al., 1999, Clin. Câncer Res. 5: 51-60). Se este mecanismo particular operar na terapia de combinação de imunocitoquinas e agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, será necessário tratar primeiramente o animal com tumor com a imunocitoquina. No entanto, se uma única dose de um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas, administrada antes do tratamento com uma imunocitoquina, der origem a um efeito sinergético na actividade antitumoral, então esse mecanismo não pode estar a funcionar. Ao invés, uma explicação mais provável será a de que o tratamento com um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas aumentou a captação da imunocitoquina pelo mecanismo (2) . Esta hipótese pode ser suplementarmente corroborada demonstrando que a co-administração com um agente que aumenta a captação de imunocitoquinas aumenta a captação de uma imunocitoquina etiquetada de forma radioactiva para um tumor sólido.

Uma vantagem da terapia de combinação é o facto da administração de uma imunocitoquina aumentar o efeito citotóxico de um agente quimioterapêutico que actua como agente que aumenta a captação de imunocitoquinas. Em consequência, pode ser administrada a um paciente uma dosagem mais baixa do agente quimioterapêutico. Em conformidade, a supressão de alguns aspectos do sistema 27 imunológico de um paciente, muitas vezes associada a tratamento utilizando um agente quimioterapêutico, é reduzida. Numa especificação da invenção, uma única dose de um agente quimioterapêutico que aumenta a captação de imunocitoquinas é administrada a um paciente preferivelmente antes da administração de uma imunocitoquina. 0 agente quimioterapêutico que aumenta a captação de imunocitoquinas é administrado preferivelmente entre cerca de 4 dias e cerca de 4 horas, muito preferivelmente cerca de 24-48 horas, antes da imunocitoquina. Noutra especificação da invenção, várias doses do agente quimioterapêutico que aumenta a captação de imunocitoquinas são administradas a um paciente antes da administração da imunocitoquina. 0 paclitaxel é um exemplo de um agente quimioterapêutico que aumenta a captação de imunocitoquinas que pode suprimir ou comprometer aspectos do sistema imunológico de um paciente. Não obstante a maior parte dos efeitos de potenciação imunológica do paclitaxel ser mediada por células macrófagos/monócitos, muitos estudos sobre a função de linfócitos indicam um efeito prejudicial do paclitaxel neste subconjunto. Por exemplo, verificou-se que o tratamento com paclitaxel compromete gravemente a capacidade proliferativa de linfócitos em ratinhos normais e com tumores (Mullins et al., 1998, Immunopharmacol. Immunotoxicol. 20: 473-492) e enfraquece a citotoxicidade de células NK e a geração de citotoxicidade activada por linfoquinas em culturas de células que contêm IL-2 (Chuang et al., 1993, Gynecol. Oncol. 4_9: 291-298). De facto, as evidências disponíveis apontam para o subconjunto de células que consiste em linfócitos como sendo a população efectora essencial na actividade antitumoral de imunocitoquinas (Lode et al., 1998, Pharmacol. Ther. 80: 28 277-292) . Evidências experimentais contidas na presente divulgação revelaram várias descobertas novas que não teriam sido previstas pela técnica anterior, especialmente no que se refere à ordem de administração dos fármacos.

Os taxanos podem ser administrados com a imunocitoquina por vias de administração diferentes. As composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer via que seja compatível com as moléculas particulares. Assim, consoante o apropriado, a administração pode ser oral ou parentérica, incluindo as vias de administração intravenosa e intraperitoneal.

As composições da presente invenção podem ser administradas a um animal por qualquer meio adequado, directamente (por exemplo, localmente, tal como por injecção, implantação ou administração tópica no locus de um tecido) ou sistemicamente (por exemplo, parentérica ou oralmente). Quando a composição se destinar a ser administrada parentericamente, tal como por administração intravenosa, subcutânea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intra-orbital, intracerebral, intracraniana, intra-espinal, intraventricular, intratecal, intra-cisterna, intra-capsular, intranasal ou por aerossol, a composição compreende preferivelmente parte de uma suspensão ou solução aquosa ou de fluido fisiologicamente compatível. Assim, o transportador ou veículo será fisiologicamente aceitável de modo que, para além de distribuir a composição desejada no paciente, não afecte adversamente o equilíbrio electrolítico e/ou de volume do paciente. Assim, o meio fluido para o agente pode compreender soro fisiológico normal (por exemplo, NaCl aquoso 9,85%, 0,15 M, pH 7-7,4). Para muitos taxanos, as formulações são geralmente mais complexas devido às suas propriedades de solubilidade 29 geralmente desfavoráveis. Por exemplo, a formulação padrão para o paclitaxel é Cremophor 10%, etanol 10% e solução salina 80% (NaCl 0,9%), ao passo que a formulação para o docetaxel é uma solução 1:1 de etanol:polissorbato 80, que é diluída 1:10 em solução de glucose 5% antes da administração (Bissery e Lavelle, 1999). No entanto, outras formulações incluindo taxanos e análogos sintetizados de novo serão reconhecidas e/ou rotineiramente desenvolvidas pelos experimentados na área.

Dosagens preferidas da imunocitoquina por administração situam-se na gama de 0,1 mg/m2 - 100 mg/m2, mais preferivelmente 1 mg/m2 - 20 mg/m2 e muito preferivelmente 2 mg/m2 - 6 mg/m2. Dosagens preferidas do agente que aumenta a captação de imunocitoquinas dependerão geralmente do tipo de agente utilizado que aumenta a captação de imunocitoquinas; todavia, podem determinar-se dosagens óptimas utilizando experimentação de rotina. A administração da imunocitoquina e/ou do agente que aumenta a captação de imunocitoquinas pode ser feita por injecções periódicas de bolus, ou por administração intravenosa ou intraperitoneal contínua a partir de um reservatório externo (por exemplo, a partir de um saco intravenoso) ou interno (por exemplo, a partir de um implante bioerodível). Suplementarmente, é contemplado que a imunocitoquina também pode ser administrada no receptor pretendido juntamente com uma pluralidade de diferentes agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas. No entanto, é contemplado que a combinação óptima de imunocitoquinas e agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, modos de administração e dosagens podem ser determinados por experimentação de rotina no âmbito da área.

Pode empregar-se uma variedade de métodos para avaliar a eficácia da terapia combinada, utilizando proteínas de 30 fusão anticorpo-citoquina e agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, em respostas imunológicas. Por exemplo, o modelo animal descrito nos exemplos abaixo ou outros modelos animais adequados podem ser utilizados pelo técnico experimentado para testar quais os agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, ou combinações de agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, são mais eficazes para actuarem sinergeticamente com uma imunocitoquina (por exemplo, uma proteína de fusão anticorpo-IL2), com a finalidade de intensificar a destruição imunológica de tumores estabelecidos. O agente que aumenta a captação de imunocitoquinas, ou combinação de agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, pode ser administrado antes ou simultaneamente com a terapia de imunocitoquinas, e o efeito no tumor pode ser convenientemente monitorizado por medição volumétrica. Além disso, à medida que forem identificados novos agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas, o técnico experimentado será capaz de utilizar os métodos descritos aqui para avaliar o potencial destes novos compostos para intensificar ou modificar de qualquer outra forma a actividade anti-cancerígena de proteínas de fusão anticorpo-citoquina.

Alternativamente, após a terapia, os tumores podem ser excisados, seccionados e corados via métodos histológicos comuns, ou via reagentes imuno-histológicos específicos, para avaliar o efeito da terapia combinada na resposta imunológica. Por exemplo, coloração simples com hematoxilina-eosina pode revelar diferenças na infiltração de linfócitos nos tumores sólidos, o que é indicativo de uma resposta imunológica celular. Suplementarmente, a imunocoloração de secções com anticorpos para classes específicas de células imunológicas pode revelar a natureza de uma resposta induzida. Por exemplo, podem utilizar-se 31 anticorpos que se ligam a CD4 5 (um marcador de leucócitos gerais), CD4 e CD8 (para identificar subclasses de células T) e NK1.1 (um marcador de células NK) para avaliar o tipo de resposta imunológica que foi mediada pelas imunocitoquinas da invenção.

Alternativamente, pode avaliar-se o tipo de resposta imunológica mediada pelas imunocitoquinas por estudos convencionais de depleção de subconjuntos de células, descritos, por exemplo, em Lode et al. (1998) Blood 91: 1706-1715. Exemplos de anticorpos de depleção incluem aqueles que reagem com os marcadores de células T CD4 e CD8, bem como aqueles que se ligam aos marcadores de NK NK1.1 e asialo GM. Em resumo, estes anticorpos são injectados no mamífero antes da iniciação do tratamento com anticorpo-citoquina em doses bastante elevadas (por exemplo, numa dose de cerca de 0,5 mg/ratinho) e seguidamente são administrados em intervalos semanais até a experiência estar completa. Esta técnica pode identificar os tipos de células necessários para induzir a resposta imunológica observada no mamífero.

Noutra abordagem, a actividade citotóxica de esplenócitos isolados de animais que foram tratados com a terapia de combinação pode ser comparada com a dos outros grupos de tratamento. Preparam-se culturas de esplenócitos picando mecanicamente baços recuperados e esterilizados por técnicas comuns descritas na maior parte dos manuais laboratoriais de imunologia. Ver, por exemplo, Coligan et al. (editores) (1988) "Current Protocols in Immunology" John Wiley & Sons, Inc. As células resultantes são então cultivadas num meio adequado de cultura de células (por exemplo, DMEM da GIBCO) que contém soro, antibióticos e uma concentração baixa de IL-2 (~ 10 U/ml). Por exemplo, para comparar a actividade de NK, 3 dias de cultura é 32 normalmente óptimo, ao passo que, para comparar a actividade citotóxica de células T, 5 dias de cultura é normalmente óptimo. Pode medir-se a actividade citotóxica por etiquetagem radioactiva de células tumorais alvo (por exemplo, células LLC) com 51Cr durante 30 minutos. Após remoção do excesso da etiqueta radioactiva, as células etiquetadas são misturadas com concentrações variáveis de células de baço cultivadas durante 4 horas. No final da incubação, o 51Cr libertado das células é medido com um contador gama, que é seguidamente utilizado para quantificar a extensão da lise celular induzida pelas células imunológicas. Tradicionalmente, a actividade de linfócitos T citotóxicos (ou CTL) é medida deste modo. A invenção é suplementarmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1. Modelos Animais

Desenvolveram-se modelos de cancro murino para estudar o efeito da combinação de imunocitoquinas e taxanos na mediação de respostas citotóxicas eficazes contra um tumor. As imunocitoquinas utilizadas nos exemplos seguintes ligam-se à EpCAM, um antigene tumoral humano presente na maior parte dos tumores derivados do epitélio (ver Perez e Walker (1989) J. Immunol. 142: 3662-3667). Para testar a eficácia num modelo murino imunocompetente, foi necessário expressar o antigene humano na superfície de uma célula tumoral de ratinho singeneica com o hospedeiro de ratinho. Células de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC), uma linha de células de cancro do pulmão de ratinho bem conhecida, foram a primeira linha de células seleccionada para esta finalidade. Sabe-se que esta linha de células produz níveis elevados de inibidores do sistema imunológico e que induz a produção de IL-10 a partir de células imunológicas no microambiente 33 tumoral, conduzindo a supressão imunológica localizada (Sharma et al., 1999, J. Immunol. 163: 5020-5028). O antigene tumoral humano EpCAM (também referido como KSA) foi expresso na superfície de células LLC, de modo que foi possível abordá-lo selectivamente in vivo com imunocitoquinas derivadas do anticorpo de ratinho anti-EpCAM, KS-1/4. Isto foi feito por transdução da sequência de cDNA de EpCAM com um vector retroviral recombinante, como descrito (Gillies, candidatura de patente U.S. 09/293 042), dando origem a uma linha de células denominada LLC/KSA. Estas células foram mantidas em DMEM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e Geneticina (GIBCO) a 37°C e C02 7, 0%.

Linhas de células adicionais que representam carcinomas originários de tecidos diferentes foram manipuladas de modo semelhante. A linha de células de carcinoma mamário murino não imunogénico 4T1 foi fornecida pelo Dr. Paul Sondei (Universidade de Wisconsin). Esta linha cresce de forma lenta e progressiva após implantação subcutânea e dá origem à formação espontânea de metástases em muitos órgãos mesmo antes da remoção cirúrgica do tumor primário. Também é possível induzir metástases experimentais no pulmão por injecção intravenosa. A linha de células de carcinoma do cólon murino CT26, derivada por injecção intra-rectal de N-nitroso-N-metiluretano em ratinhos BALB/C, foi fornecida por Dr. I. J. Fidler (MD Anderson Câncer Center, Houston, TX). As células 4T1 e CT26 foram transfectadas com Ep-CAM, como descrito (Gillies et al., 1998, J. Immunol. 160: 6195-6203). As células 4T1/KSA foram mantidas em RPMI suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e Geneticina (GIBCO) a 37 °C e C02 7,0%. As células CT26/KSA foram 34 mantidas em DMEM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%, L-glutamina, vitaminas, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais, penicilina/ estreptomicina e Geneticina (GIBCO, Gaithersberg, MD) a 37°C e CO2 7,0%. Adicionou-se Geneticina às células transfectadas para manter a expressão de KSA. Todas as linhas de células transfectadas crescem progressivamente na forma de tumores da pele (após injecção subcutânea) ou na forma de metástases (após injecção intravenosa) e matam os ratinhos, apesar da sua expressão da molécula EpCAM humana (um antigene estranho potencial) na sua superfície celular.

Para estudos de crescimento tumoral, tumores LLC/KSA ou CT26/KSA foram implantados subcutaneamente no dorso de ratinhos. Para estudos de LLC/KSA, transplantaram-se tumores de vários tumores armazenados que haviam sido injectados com uma única suspensão de células de 1 x 106 células em 100 μΐ de PBS. Passadas cerca de duas semanas, os tumores foram recolhidos de forma asséptica e peneirados num crivo equipado com uma malha de 150 μπι. Em seguida, as células foram passadas duas ou três vezes numa seringa com agulha de calibre 23, foram lavadas duas vezes e novamente suspensas em PBS. Uma única suspensão de células de 1 x 106 células LLC/KSA em 100 μΐ de PBS foi injectada subcutaneamente no dorso de ratinhos utilizando uma agulha de calibre 30½. Para estudos de CT26/KSA, células com crescimento exponencial em cultura foram injectadas na forma de uma única suspensão de células de 1 x 106 células em 100 μΐ de PBS. Depois de estabelecidos os tumores, cerca de 2 semanas após a implantação, iniciou-se a dosagem no Dia 0. Mediram-se os tumores com compassos nas três dimensões duas vezes por semana. Calcularam-se os volumes tumorais utilizando a equação: 35

Volume = Η x 4/3 π (L/2 χ W/2 χ Η), em que L = comprimento, W = largura e H = altura do tumor. Os animais foram pesados e monitorizou-se o estado geral de saúde durante o estudo. Quando os tumores se tornaram necróticos ou quando os animais ficaram moribundos, os animais foram submetidos a eutanásia por asfixia com C02.

Os dados estão apresentados graficamente. Os gráficos representam volumes tumorais individuais ou médios (+/-EPM) durante e após a dosagem. Os dados também estão expressos como percentagem do controlo de volumes tumorais médios de ratinhos tratados relativamente a ratinhos tratados com veiculo. Utilizou-se o teste t de Student nos volumes tumorais individuais para determinar diferenças significativas.

Para estudos de metástases hepáticas experimentais, os ratinhos foram anestesiados utilizando 80 mg/kg de cetamina HC1 (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) e 5 mg/kg de xilazina (Bayer, Shawnee Mission, KS). Uma única suspensão de células de 1 χ 105 células CT26/KSA em 100 μΐ de DMEM que continha HEPES 25 mM (GIBCO) foi injectada por baixo da cápsula esplénica, utilizando uma agulha de calibre 27^, durante um período de 60 segundos no Dia 0. Passados mais 2 minutos, os vasos esplénicos foram cauterizados com uma unidade de cautério (Roboz, Rockville, MD) e removeram-se os baços. Os animais foram suturados utilizando Autoclips. Três semanas após a inoculação sacrificaram-se os animais; os seus fígados foram removidos e pesados. Em seguida, os fígados foram fixados e corados em solução de Bouin (Sigma, St. Louis, MO).

Os dados estão apresentados graficamente. Os gráficos representam cargas tumorais médias (+/- EPM) na altura do sacrifício. Determinaram-se as cargas tumorais subtraindo o peso de um fígado normal do peso dos fígados experimentais. 36

Os dados também estão expressos como percentagem do controlo da carga tumoral média de ratinhos tratados relativamente a ratinhos tratados com veículo. Utilizou-se o teste t de Student nas cargas tumorais individuais para determinar diferenças significativas.

Para estudos de metástases experimentais no pulmão, uma única suspensão celular de 2,5 x 105 células 4T1/KSA em 100 μΐ de PBS foi lentamente injectada na veia lateral da cauda no Dia 0, utilizando uma agulha de calibre 27½. Cerca de 3 semanas após a inoculação sacrificaram-se os animais; os seus pulmões foram removidos e pesados. Depois os pulmões foram fixados e corados em solução de Bouin (Sigma). Os dados estão apresentados graficamente. Os gráficos representam cargas tumorais médias (+/- EPM) na altura do sacrifício. Determinaram-se as cargas tumorais subtraindo o peso de um pulmão normal do peso dos pulmões experimentais. Os dados também estão expressos como percentagem do controlo da carga tumoral média de ratinhos tratados relativamente a ratinhos tratados com veículo. Utilizou-se o teste t de Student nas cargas tumorais individuais para determinar diferenças significativas.

Exemplo 2. Preparação de Proteínas de Fusão de Anticorpo (Imunocitoquinas)

Nos exemplos seguintes discutem-se várias proteínas de fusão anticorpo-citoquina. huKS-huyl-huIL2 (abreviado, KS-IL2)

Um gene que codifica a proteína de fusão huKS-huyl-huIL2 foi preparado e expresso essencialmente como descrito em Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203, e

Patente U.S. N° 5 650 150. Em resumo, regiões variáveis 37 humanizadas do anticorpo de ratinho KS1/4 (Varki et ai. (1984) Câncer Res. 4_4: 681-687) foram modeladas utilizando os métodos revelados em Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, que envolveram a inserção das CDRs de cada região variável de KS1/4 nas sequências de arcabouço de consenso das regiões variáveis humanas com o grau de homologia mais elevado. A modelagem molecular com uma estação de trabalho Silicon Graphics índigo implementando o "software" BioSym confirmou que as formas das CDRs se mantiveram. Em seguida, as sequências proteicas foram traduzidas de forma reversa e os genes foram construídos por ligação dos oligonucleótidos com sobreposição.

As regiões variáveis resultantes foram inseridas num vector de expressão que continha as regiões constantes da cadeia leve κ humana e a cadeia pesada Cyl humana essencialmente como descrito em Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8_9: 1428-1432, com a excepção dos promotores da metalotioneína e intensificadores da cadeia pesada de imunoglobulina terem sido substituídos pelo promotor/ intensificador do CMV para a expressão de ambas as cadeias. As fusões das sequências maduras da IL-2 ao terminal carboxi das cadeias pesadas humanas foram preparadas como descrito em Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 1428-1432, com a excepção das regiões 3' não traduzidas do gene da IL-2 terem sido derivadas da região poli(A) do SV40. A proteína de fusão de IL-2 foi expressa por transfecção do plasmídeo resultante na linha de células de mieloma NS/0 com meio de selecção que continha metotrexato (MTX) 0,1 μΜ. Em resumo, para obter clones transfectados de forma estável, introduziu-se DNA plasmídico nas células NS/0 de mieloma de ratinho por electroporação. As células NS/0 cresceram em meio de Eagle modificado de Dulbecco 38 suplementado como soro fetal de bovino 10%. Cerca de 5 x 106 células foram lavadas uma vez com PBS e novamente suspensas em 0,5 ml de PBS. Seguidamente incubaram-se com as células 10 μς de DNA plasmidico linearizado numa Cuveta Gene Pulser (hiato entre eléctrodos 0,4 cm, BioRad) em gelo durante 10 minutos. Realizou-se a electroporação utilizando um Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) com parâmetros de 0,25 V e 500 μΡ. Deixaram-se as células recuperar durante 10 minutos em gelo, após o que foram novamente suspensas em meio de crescimento e depois plaqueadas em duas placas de 96 cavidades. Os clones transfectados de forma estável foram seleccionados por crescimento na presença de metotrexato 100 nM, que foi introduzido dois dias pós-transfecção. As células foram nutridas mais três vezes de 3 em 3 dias, e os clones resistentes ao MTX apareceram em 2 até 3 semanas.

Identificaram-se clones com expressão por ELISA de Fc ou citoquina utilizando os anticorpos apropriados (ver, por exemplo, Gillies et al. (1989) Biotechnol. T_: 798-804). A proteína de fusão resultante foi purificada por ligação e eluição a partir de proteína A Sefarose (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. huKS-huy4-huIL2

Um gene que codifica a proteína de fusão huKS-huy4-huIL2 foi construído e expresso essencialmente como descrito em U.S.S.N. 09/256 156, registado em 24 de Fevereiro de 1999, que reivindica prioridade para U.S.S.N. 60/075 887, registado em 25 de Fevereiro de 1998.

Em resumo, preparou-se uma versão de Igy4 da proteína de fusão huKS-huyl-huIL2, descrita acima, removendo o fragmento do gene Cyl da região constante de imunoglobulina 39 do vector de expressão de huKS-huyl-huIL2 e substituindo-o pela sequência correspondente do gene Cy4 humano. As sequências e alinhamentos de sequências das regiões constantes de cadeias pesadas humanas Cyl, Cy2, Cy3 e Cy4 são revelados em Huck et al. (1986) Nuc. Acids Res. 14: 1779-1789.

Efectuou-se a troca dos fragmentos Cyl e Cy4 digerindo o DNA plasmidico que continha Cyl original com Hind III e Xho I e purificando um fragmento grande de 7,8 kb por electroforese em gel de agarose. Um segundo DNA plasmidico que continha o gene Cy4 foi digerido com Hind III e Nsi I e purificou-se um fragmento de 1,75 kb. Um terceiro plasmideo que continha o cDNA da IL-2 humana e sitio poliA do SV40, fundido ao terminal carboxilo do gene Cyl humano, foi digerido com Xho I e Nsi I e purificou-se o pequeno fragmento de 470 pares de bases. Os três fragmentos foram ligados em quantidades aproximadamente equimolares. Utilizou-se o produto da ligação para transformar E. coli competentes e seleccionaram-se colónias por crescimento em placas que continham ampicilina. Identificaram-se plasmideos recombinantes reunidos correctamente por análises de restrição de preparações de DNA plasmidico de transformantes isolados, e utilizou-se digestão com Fsp I para distinguir as inserções dos genes Cyl (sem Fsp I) e Cy4 (um sitio). O vector final, que continha a substituição da cadeia pesada Cy4-IL2, foi introduzido em células de mieloma de ratinho NS/0 por electroporação (0,25 V e 500 μΡ) e seleccionaram-se transfectantes por crescimento em meio que continha metotrexato (0,1 μΜ). os clones de células que expressaram niveis elevados da proteina de fusão huKS-huy4- 40 huIL2 foram identificados e expandidos e a proteína de fusão foi purificada dos sobrenadantes da cultura utilizando cromatografia com proteína A Sefarose.

Determinou-se a pureza e integridade da proteína de fusão de Cy4 por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Mediu-se a actividade de IL-2 num ensaio de proliferação de células T (Gillis et al. (1978) J. Immunol. 120: 2027-2032), tendo-se verificado que era idêntica à da construção com γΐ. huKS-muy2a-muIL2

Construiu-se um gene que codifica a proteína de fusão huKS-muy2a-muIL2 substituindo as regiões constantes do anticorpo humano e IL-2 humana da proteína de fusão huKS-huyl-huIL2, como descrito acima, pelas sequências murinas correspondentes. Especificamente, o DNA de Cyl-IL2 humano foi substituído por um fragmento de cDNA Cy2a murino fundido a um DNA que codifica a IL-2 murina. Em resumo, a região VH de huKS foi reunida na estrutura ao cDNA de y2a murino por PCR com sobreposição utilizando os "primers" oligonucleotídicos com sobreposição:

(sentido) 5'CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC (ID SEQ NO: 3);

(anti-sentido) 5'GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (ID SEQ NO: 4) ; (sentido) 5'C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG (ID SEQ NO: 5) , e (anti-sentido) 5'CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (ID SEQ NO: 6).

Os oligonucleótidos das ID SEQ NOs: 3 e 4 foram concebidos para hibridizarem para a junção do domínio VH de huKS à região constante do cDNA de y2a murino (em itálico). 41

Na primeira ronda de PCR realizaram-se duas reacções separadas. Numa reacção utilizou-se a VH do DNA de huKS como modelo com os oligonucleótidos das ID SEQ NOs: 4 e 5. 0 "primer" da ID SEQ NO: 5 introduziu um sitio de restrição AflII (CTTAAG) a montante da sequência que codifica o terminal amino maduro da VH de huKS (a cheio). Noutra reacção utilizou-se cDNA de y2a murino como modelo com os oligonucleótidos das ID SEQ NOs: 3 e 6. 0 "primer" da ID SEQ NO: 6 hibridizou para o cDNA que codifica a região em redor do terminal C de y2a e introduziu um sitio de restrição Xmal (CCCGGG) para ligação subsequente ao cDNA de muIL2. Os produtos de PCR das duas reacções foram misturados e submetidos a uma segunda ronda de PCR utilizando os oligonucleótidos das ID SEQ NOs: 5 e 6. 0 produto de PCR resultante foi clonado e, por verificação da sequência, utilizou-se o fragmento AflII-Xmal que codifica a VH de huKS e a região constante de y2a murino para a ligação ao DNA que codifica o péptido de sinal no sítio AflII e cDNA de muIL2 no sítio Xmal. 0 cDNA de IL2 murina foi clonado a partir de mRNA de células mononucleares do sangue periférico murinas utilizando os oligonucleótidos apresentados nas ID SEQ NOs: 7 e 8, nomeadamente: (sentido) 5'GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC (ID SEQ NO: 7), e (anti-sentido) 5'CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (ID SEQ NO: 8). O "primer" da ID SEQ NO: 7 adaptou a muIL2 (sequência a cheio) para ser reunida a mu y2a no sítio de restrição Xmal (CCCGGG). O "primer" da ID SEQ NO: 8 introduziu um sítio de restrição Xhol (CTCGAG) imediatamente após o codão de terminação da tradução (anti-sentido a cheio). 42

De modo semelhante, o domínio leve variável (VL) de huKS foi reunido à sequência de cDNA mu κ por PCR com sobreposição. Os oligonucleótidos com sobreposição utilizados incluíram: (sentido) 5'G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G (ID SEQ NO: 9); (anti-sentido) 5'GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (ID SEQ NO: 10); (sentido) 5'C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (ID SEQ NO: 11), e (anti-sentido) 5'CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC (ID SEQ NO: 12).

Os oligonucleótidos foram concebidos para hibridizarem para a junção da VL de huKS à região constante de cDNA de κ murina (em itálico). Na primeira ronda de PCR realizaram-se duas reacções separadas. Numa reacção, a VL de DNA de huKS foi utilizada como modelo com os oligonucleótidos apresentados nas ID SEQ NOs: 10 e 11, que introduziram um sítio de restrição AflII (CTTAAG) a montante da sequência que codifica o terminal amino maduro da VL de huKS (a cheio). Na outra reacção utilizou-se cDNA de κ murina como modelo com os oligonucleótidos apresentados nas ID SEQ NOs: 9 e 12, que introduziram um sítio de restrição Xhol após o codão de terminação da tradução (anti-sentido a cheio).

Os produtos de PCR das duas reacções foram misturados e submetidos a uma segunda ronda de PCR utilizando os "primers" oligonucleotídicos apresentados nas ID SEQ NOs: 11 e 12. O produto de PCR resultante foi clonado e, por verificação da sequência, utilizou-se o fragmento AflII-Xhol que codifica a VL de huKS e a região constante κ murina foi ligada ao DNA que codifica o péptido de sinal no sítio AflII. 43

Ambas as sequências das cadeias pesada e leve murinas foram utilizadas para substituir as sequências humanas em pdHL7. O vector de expressão de anticorpo resultante, que continha um gene de marcador seleccionável dhfr, foi submetido a electroporação (6,25 V, 500 μΕ) em células de mieloma NS/0 murino e seleccionaram-se clones por cultura em meio que continha metotrexato 0,1 μΜ. Os clones transfectados resistentes ao metotrexato foram testados quanto à secreção de determinantes de anticorpo por métodos padrão de ELISA. Purificaram-se as proteínas de fusão via cromatografia com proteína A Sefarose de acordo com as instruções dos fabricantes. huKS-miry2a-muIL12

Um gene que codifica a proteína de fusão huKS-muy2a-muIL12 foi construído e expresso essencialmente como descrito em U.S.S.N. 08/986 997, registado em 8 de Dezembro de 1997, e Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195- 6203. Em resumo, isto foi feito fundindo o cDNA da subunidade da IL-12 p35 murina à região codificadora da cadeia pesada de huKS-muy2a preparada previamente. Em seguida, o vector resultante foi transfectado para uma linha de células de mieloma NS/0 pré-transfectada com a subunidade da IL-12 p40 e capaz expressá-la. Por outras palavras, uma linha de células foi transfectada com p40 isoladamente e seleccionou-se uma célula com expressão estável e elevada, que depois foi utilizada como receptor para transfecção pela proteína de fusão que continha p35 (isto é, transfecção sequencial).

As subunidades p35 e p40 da IL-12 murina foram isoladas por PCR a partir de mRNA preparado de células de baço activadas com Concanavalina A (5 μρ/ιηΐ em meio de cultura 44 durante 3 dias). Os "primers" de PCR utilizados para isolar a sequência de ácido nucleico que codifica p35, que também adaptaram o cDNA de p35 como fragmento de restrição Xmal-Xhol, incluíram: 5'CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (ID SEQ NO: 13), e 5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (ID SEQ NO: 14).

Os "primers" de PCR utilizados para isolar a sequência de ácido nucleico que codifica p40 incluíram: 5'TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (ID SEQ NO: 15), e 5'CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (ID SEQ NO: 16).

Construiu-se um vector plasmídico (pdHL7-huKS-muy2a-p35), como descrito (Gillies et al. J. Immunol. Methods 125: 191), que continha um gene de marcador seleccionável dhfr, uma unidade de transcrição que codifica a cadeia leve do anticorpo KS humanizado e uma unidade de transcrição que codifica uma cadeia pesada murina fundida à subunidade p35 da IL-12 de ratinho. Efectuou-se a fusão por ligação do fragmento Xmal até Xhol do cDNA da subunidade p35 adaptada a um sitio Xmal único na extremidade do exão de CH3 do gene de y2a murino preparado previamente. Ambas as unidades de transcrição das cadeias H e L incluíam um promotor de citomegalovírus (CMV) (em vez do promotor da metalotioneína na referência original) na extremidade 5' e um sítio de poliadenilação na extremidade 3'.

Construiu-se um vector semelhante (pNC-p40) para expressão da subunidade p40 livre, que incluiu um gene de marcador seleccionável (gene resistente à neomicina) mas que ainda usou o promotor de CMV para a transcrição. Neste caso, a região codificadora incluiu a sequência líder natural da subunidade p40 para o tráfego apropriado para o retículo endoplasmático e reunião com a proteína de fusão. 0 plasmídeo pNC-p40 foi submetido a electroporação para células e as células foram plaqueadas e seleccionadas em 45 meio que continha G418. Neste caso, os sobrenadantes da cultura de clones resistentes a fármacos foram testados, por ELISA, quanto à produção da subunidade p40. 0 vector de expressão pdHL7-huKS-muy2a-p35 foi submetido a electroporação para a linha de células NS/0 que já expressa a p40 murina, como descrito em Gillies et al. (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203. Os clones transfectados resistentes ao metotrexato foram testados quanto à secreção de determinantes de anticorpo e IL-12 de ratinho por métodos padrão de ELISA. A proteina resultante foi purificada por ligação e eluição de uma coluna de proteina A Sefarose de acordo com as instruções dos fabricantes.

Exemplo 3. Actividade citotóxica in vitro da terapia de combinação

Testaram-se as linhas de células manipuladas para utilização em modelos animais (exemplo 1) quanto à sua sensibilidade à citotoxicidade induzida por taxanos em culturas de células na presença ou ausência de uma imunocitoquina à base de IL-2, que consistiu na forma humanizada do anticorpo KS-1/4 fundido, no terminal carboxilo da cadeia H, à IL-2 humana (huKS-huyl-huIL2, daqui em diante abreviada para KS-IL2) . As células foram semeadas a 1000 células/cavidade em placas de fundo plano de 96 cavidades e foram incubadas durante 24 horas a 37°C, CO2 7%. Adicionaram-se paclitaxel, em diluições de duas vezes desde 200 ng/ml até 3,125 ng/ml, KS-IL2 a 200 ng/ml e IL-2 a 33,3 ng/ml (a quantidade equivalente de IL-2 em KS- IL2), em duplicado, às placas de cultura de células, e os sistemas foram incubados durante 6 dias a 37°C, C02 7%. Realizou- se directamente nas placas de 96 cavidades 0 ensaio colorimétrico de MTS (Promega), uma medida da viabilidade celular baseada na conversão celular de um sal 46 de tetrazólio. Depois das placas terem sido lidas e registadas, células aderentes viáveis foram coradas com Violeta de cristal (Sigma, St. Louis, MO). Utilizaram-se as placas coradas com violeta de cristal para verificar os resultados do ensaio de MTS. Os resultados estão expressos em tabelas. 0 valor IC50 é a concentração do fármaco que produziu citotoxicidade num nivel de 50% do controlo.

Realizou-se um ensaio de citotoxicidade com paclitaxel (3 até 200 ng/ml) isoladamente ou combinado com KS-IL2 (200 ng/ml) ou IL-2 (33,3 ng/ml, a quantidade equivalente de IL-2 em KS-IL2) contra células CT26/KSA, LLC/KSA e 4T1/KSA. Observou-se pouca ou nenhuma citotoxicidade de KS-IL2 ou IL-2 isoladamente nas três linhas de células testadas (81% até 101% do controlo, Tabela 1). A adição de KS-IL2 ou IL-2 não afectou a citotoxicidade do Paclitaxel. Em consequência, uma vez que nem KS-IL2 nem IL-2 afectam a citotoxicidade do paclitaxel, qualquer aumento da actividade antitumoral em ratinhos pelos tratamentos combinados será devido a outros mecanismos que ocorrem apenas no animal com tumor.

Tabela 1. Citotoxicidade do Paclitaxel em combinação com IL-2 ou KS-IL2

Paclitaxel IC50 (ng/ml) CT26/KSAa CT26/KSAb CT26/KSA1 Taxol 27 6 16 Taxol + IL-2 (33 ng/ml) 30 8 20 Taxol + KS-IL2 (200 ng/ml) 26 5 19 % do Controlo CT26/KSAa CT26/KSAb CT26/KSA1 IL-2 (33 ng/ml) 97 100 95 KS-IL2 (200 ng/ml) 90 101 81 47 a. Média de três experiências b. Média de duas experiências

Exemplo 4. Terapia de combinação de tumores da pele LLC com KS-IL2 e um taxano

Realizou-se um ensaio de regressão do crescimento tumoral utilizando o tumor que cresce de forma agressiva LLC/KSA, no qual a uma única dose de paclitaxel (80 mg/kg) se seguiu, uma semana depois, KS-IL2 (20 pg) , administrado por injecção intravenosa na veia da cauda durante 5 dias (Figura 2). Não se observou nenhum efeito do paclitaxel nem de KS-IL2 administrados isoladamente (nos Dias 0 - 4) . No entanto, quando KS-IL2 foi administrado uma semana após o paclitaxel, observou-se uma grande redução do volume tumoral médio (41% do controlo) e um retardamento do crescimento tumoral (TGD) de cerca de 8 dias, que foi significativamente diferente do observado para o paclitaxel isoladamente (p = 0,023). Não se observou toxicidade de monta relacionada com o fármaco, exceptuando uma perda de peso < 5% nos grupos tratados com paclitaxel.

Em seguida comparou-se o efeito de múltiplas doses de paclitaxel, geralmente considerado um calendário de quimioterapia mais eficaz, com uma única dose de paclitaxel em combinação com KS-IL2, para determinar o modo como a calendarização afecta o aumento. Mais uma vez, KS-IL2 (20 pg, Dias 0-4) isoladamente não exerceu nenhum efeito no crescimento do tumor LLC/KSA, mas o paclitaxel isoladamente, quando administrado em múltiplas doses (50 mg/kg, dias alternados) reduziu o volume tumoral médio para 63% do controlo e causou um retardamento do crescimento tumoral (TGD) de 4 dias (Figura 3). Quando a imunocitoquina KS-IL2 foi administrada uma semana após o tratamento com paclitaxel, observou-se uma redução do volume tumoral para 48 27% do controlo e um TGD de 10 dias, que foi significativamente diferente do paclitaxel isoladamente (p = 0,016). Não se observou toxicidade de monta relacionada com o fármaco, exceptuando uma perda de peso <5% nos grupos tratados com paclitaxel. O grupo de terapia combinada exibiu ainda menos perda de peso. Estes resultados positivos da terapia de combinação são surpreendentes, considerando o intervalo de tempo relativamente curto entre o tratamento quimioterapêutico (e potencialmente danificador do sistema imunológico) e o início de um tratamento que se baseia na capacidade para estimular a proliferação e citotoxicidade de linfócitos.

Uma explicação para o efeito combinado é o facto da apoptose induzida por taxanos de uma porção da massa tumoral em crescimento ter reduzido a pressão intersticial, o que, por sua vez, aumentou a captação efectiva de KS-IL2 para o tumor. Estudos recentes (Griffon-Etienne et al., 1999, Câncer Res. .59: 3776-3782) indicam que o efeito de uma única dose de paclitaxel diminuiu eficazmente pressões de fluido intersticial, com um efeito máximo observado entre as 24 e 48 horas (Grif fon-Etienne et al., 1999, Câncer Res. .59: 3776-3782). Apesar desta poder ser a melhor altura para a captação da imunocitoquina para o tumor, também é um intervalo de tempo muito curto após a quimioterapia. Ainda assim, tratámos ratinhos com tumores LLC/KSA com KS-IL2 durante 5 dias consecutivos começando logo às 24 horas após receberem uma única dose de paclitaxel. Os resultados indicam que há uma resposta combinada ainda melhor quando o tratamento com imunocitoquina foi iniciado mais cedo do que uma semana após uma única dose de paclitaxel com esta linha tumoral, bem como com carcinoma do cólon CT26 (ver abaixo). 49

Exemplo 5. Terapia de combinação de metástases de 4T1 com KS-IL2 e um taxano

Uma vez que descobrimos que os intervalos de tratamento entre a administração de um taxano e de uma imunocitoquina podiam ser mais curtos do que o esperado, testámos regimes de combinação nos quais o taxano e a imunocitoquina são administrados no mesmo dia, e comparámos uma única dose (75 mg/kg) de paclitaxel com uma dose fraccionada (25 mg/kg x 3 dias) administrada concorrentemente com o tratamento com KS-IL2 (15 pg/dose x 3 dias administrado 4 horas após o paclitaxel). Para esta experiência utilizámos um modelo experimental de metástases no pulmão induzidas com células de carcinoma da mama 4T1/KSA. Seleccionaram-se as doses dos fármacos de modo a serem sub-óptimas por si próprias, para que se pudesse observar qualquer potencial actividade aditiva ou sinergética.

Cada agente administrado isoladamente reduziu significativamente (p <0,02) os pesos pulmonares médios numa extensão semelhante: redução de 43% para a dose única de paclitaxel, uma redução de 49% para múltiplas doses de paclitaxel isoladamente e uma redução de 39% com KS-IL2 isoladamente (Figura 4). A combinação de paclitaxel e KS-IL2 reduziu ainda mais, de forma ligeira, as metástases no pulmão, mas o efeito não chegou a ser aditivo: redução de 58% para a dose única de paclitaxel em combinação com KS-IL2 e uma redução de 68% para múltiplas doses de paclitaxel em combinação com KS-IL2. Apesar de não se ter observado sinergia, a dose única de paclitaxel em combinação com KS-IL2 resultou numa diferença significativa em comparação com o paclitaxel administrado isoladamente (p = 0,047) .

Observou-se perda de peso inferior a 10% em todos os grupos; no entanto, a maior perda de peso foi observada com 50 25 mg/kg de paclitaxel administrado 3 vezes em dias alternados. Com base nestes dados, o melhor regime neste ensaio de metástases no pulmão de 4T1 no que se refere ao maior efeito da terapia de combinação consistiu numa única dose de paclitaxel seguida de KS-IL2, como no caso do modelo de regressão do crescimento do tumor LLC/KSA. Uma vez que, neste caso, o intervalo de dosagem foi apenas 4 horas, os resultados poderão não ter sido óptimos para uma captação eficiente para o tumor.

Exemplo 6. Terapia de combinação de tumores da pele CT26 com KS-IL2 e um taxano

Os resultados descritos no exemplo 5 sugeriram que o intervalo de tempo de 4 horas entre a dosagem dos dois agentes poderá ser demasiado curto. Talvez os níveis de paclitaxel ainda presentes no animal na altura da dosagem de KS-IL2 pudessem ter interferido directamente na activação de linfócitos, reduzindo assim a sua potencial actividade antitumoral no cenário de combinação. Também não se atingiu, no instante das 4 horas, o efeito máximo na pressão intersticial tumoral. Assim, concebemos outra experiência, desta vez utilizando tumores da pele estabelecidos do carcinoma do cólon CT26/KSA, na qual combinámos uma única dose de paclitaxel (75 mg/kg) com uma duração de 5 dias de KS-IL2, começando às 24 horas após a administração do taxano. O paclitaxel isoladamente não exerceu nenhum efeito no crescimento tumoral (Figura 5) . O tratamento com doses sub-óptimas de KS-IL2 (10 pg, Dias 1-5) resultou em volumes tumorais de 71% do controlo. Observou-se uma redução dramática e sinergética do volume tumoral para 8% do controlo com a combinação de paclitaxel e KS-IL2, que foi significativamente diferente do tratamento com paclitaxel isoladamente (p <0,001). 51

Observou-se uma perda de peso mínima de ~5% para ambos os grupos tratados com paclitaxel.

Realizou-se uma segunda experiência utilizando o modelo CT26/KSA, desta vez testando o efeito da terapia combinada em metástases no fígado estabelecidas e novamente utilizando o intervalo de 24 horas entre a administração de paclitaxel e o tratamento com KS-IL2. Também comparámos a resposta à dose do paclitaxel na terapia de combinação. Injectaram-se ratinhos com 25, 50 ou 75 mg/kg de paclitaxel no Dia 5 após a indução de metástases, isoladamente ou seguido, um dia depois, de KS-IL2 (7 μρ) durante 5 dias. Observou-se um efeito de resposta à dose para o paclitaxel isoladamente, em que 25, 50, 75 mg/kg resultaram em cargas tumorais de 49%, 23%, 10% do controlo, respectivamente (Figura 6) . A combinação de paclitaxel com KS-IL2 reduziu ainda mais as metástases no pulmão para 12%, 9% e 6% do controlo, para as mesmas doses respectivas de paclitaxel. A dose mais baixa de paclitaxel (25 mg/kg) em combinação com KS-IL2 deu origem à redução maior e mais significativa (p <0,001) da carga tumoral em comparação com as doses mais elevadas de paclitaxel com KS-IL2. Em consequência, a combinação de KS-IL2 precedido pelo paclitaxel resultou num efeito antitumoral mais elevado do que com qualquer um dos agentes isoladamente. Além disso, a dose mais baixa de paclitaxel em combinação com KS-IL2 teve uma eficácia antitumoral semelhante à da dose mais elevada de paclitaxel isoladamente. Assim, a utilização de uma dose mais baixa de paclitaxel em combinação com KS-IL2 reduz a toxicidade mantendo boa eficácia.

Exemplo 7. Medição da captação de KS-IL2 para tumores

Se o efeito de doses isoladas de tratamento com fármaco citotóxico, antes da terapia com imunocitoquina, consiste 52 em diminuir a pressão intersticial tumoral e aumentar a penetração de tumores, este deve ser mensurável utilizando uma imunocitoquina etiquetada de forma radioactiva, por exemplo, KS-IL2. Etiquetou-se KS-IL2 purificada com I por procedimentos comuns (referência) por contrato com um vendedor comercial (New England Nuclear, Billerica, MA) . Tumores da pele de CT26/KSA foram implantados subcutaneamente como descrito no Exemplo 1 e deixados crescer até atingirem 100 - 200 mm3. Dois grupos de 4 ratinhos foram injectados com paclitaxel (50 mg/kg) em veiculo ou com veiculo isoladamente, seguido, após 1 hora (Experiência 1) ou 24 horas (Experiência 2), de 10 pg de 125I-KS-IL2 (95 pCi) . Seis horas após a injecção da imunocitoquina etiquetada de forma radioactiva, os ratinhos foram sacrificados e os seus tumores foram removidos cirurgicamente. Como controlo, também se recolheram fígados dos animais, e todos os tecidos foram pesados e depois contados num contador gama. Os resultados foram expressos em contagens por minuto (CPM) por grama de tecido, dividindo a CPM total no tecido pelo peso.

Quando se injectou KS-IL2 etiquetada 1 hora após o tratamento com paclitaxel (Figura 7A), observou-se apenas um pequeno aumento da quantidade de radioactividade nos tumores excisados de animais que receberam o fármaco. Em contraste, quando se injectou KS-IL2 etiquetada 24 horas após o tratamento com paclitaxel, observou-se um aumento dramático da captação (>200 por cento) relativamente ao controlo de veículo (Figura 7B) . Esta grande diferença da captação tumoral entre os instantes 1 hora e 24 horas está de acordo com os dados de alterações induzidas por taxanos na pressão intersticial (Griffon-Etienne et al., 1999, Câncer Res. 59: 3776-3782) e é consistente com os dados dos nossos modelos tumorais que mostraram que o tratamento 53 começando às 24 horas após o paclitaxel é mais eficiente do que o tratamento numa altura anterior (4 horas).

Também testámos se outras classes de fármacos poderiam aumentar a captação de imunocitoquina etiquetada para tumores sólidos. Neste caso, injectaram-se ratinhos com uma única dose de ciclofosfamida (40 mg/kg) 24 horas ou 3 dias antes da experiência. Injectou-se KS-IL2 etiquetada com 125I em todos os ratinhos, incluindo ratinhos de controlo pré-tratados com PBS, e determinou-se a quantidade de radioactividade em tumores excisados 16 horas mais tarde. Os resultados (Figura 8) mostram que o pré-tratamento com ciclofosfamida aumentou a captação de KS-IL2 em 48% em ratinhos pré-tratados 24 horas antes, e em 70% em ratinhos pré-tratados há 3 dias.

Exemplo 8. Terapia de combinação com huKS-huy4-IL2 e um taxano

Foram recentemente descritas novas formas de imunocitoquinas com maiores tempos de semi-vida em circulação e eficácia melhorada devido a uma afinidade reduzida para receptores Fc (ver Gillies et al., 1999, Câncer Res. 5_9: 2159-2166). Testou-se um exemplo representativo destas imunocitoquinas de IL-2 melhoradas, huKS-huy4-lL2, em terapia de combinação com uma única dose de paclitaxel. Mais uma vez, observou-se eficácia melhorada quando os dois fármacos foram administrados sequencialmente em ratinhos com tumores da pele CT26/KSA.

Exemplo 9. Terapia de combinação com huKS-muy2a-muIL12 e um taxano

Para testar se o efeito terapêutico sinergético é especifico apenas de imunocitoquinas à base de IL-2, 54 tratámos tumores volumosos CT26/KSA estabelecidos primeiramente com paclitaxel (uma única dose de 75 mg/kg) seguido, 24 horas depois, de um periodo de 5 dias de huKS-muy2a-muILl2 (5 μρ por dia) . Esta imunocitoquina é uma fusão entre a forma murina do anticorpo HuKS (isto é, as regiões constantes foram revertidas em C kapa e C gama 2a murinas) e IL-12 murina. Foi necessário utilizar sequências murinas da IL-12 porque, ao contrário da IL-2, esta citoquina é altamente especifica para espécies e a forma humana não é muito activa no ratinho. Os resultados mostram que o tratamento com paclitaxel isoladamente teve muito pouco efeito no crescimento tumoral. 0 tratamento com doses sub-óptimas de huKS-muy2a-muIL12 exerceu um efeito antitumoral, e este foi maior em ratinhos que foram tratados primeiramente com uma única dose de paclitaxel.

Exemplo 10. Terapia de combinação com huKS-IL2 e um agente de alquilação i. Também se demonstrou o efeito terapêutico melhorado da combinação de huKS-IL2 com ciclofosfamida, um fármaco quimioterapêutico da classe de agentes de alquilação. Células de carcinoma da mama 4T1 foram injectadas intravenosamente em ratinhos imunocompetentes para estabelecer metástases pulmonares 3 dias antes do tratamento. Os ratinhos foram tratados com uma única dose de ciclofosfamida (15, 40 ou 80 mg/kg) seguida, três dias mais tarde, de um periodo de 5 dias de huKS-IL2 (15 μρ^ί3) . Não obstante as duas doses mais baixas isoladamente terem reduzido apenas de forma modesta a carga tumoral de metástases no pulmão, a combinação com huKS-IL2 resultou num decréscimo significativamente grande da carga tumoral em comparação com a ciclofosfamida isoladamente (p 55 < 0,05, Figura 9). No entanto, não ocorreu sinergia à dose mais elevada (80 mg/kg). ii. Também se demonstrou o efeito terapêutico melhorado da combinação de huKS-lL2 com ciclofosfamida num ensaio de crescimento tumoral em ratinhos imunocompetentes com tumores subcutâneos estabelecidos de carcinoma da mama. Os ratinhos foram tratados com uma única dose de 80 mg/kg de ciclofosfamida, isoladamente ou em combinação com 5 doses diárias de huKS-IL2 (30 μς) 3 dias após o tratamento com ciclofosfamida. Os volumes tumorais médios para huKS-IL2 e 80 mg/kg de ciclofosfamida isoladamente foram reduzidos em 31% e 69%, respectivamente (Figura 9B) . O tratamento de combinação reduziu os volumes tumorais médios em 100% no Dia 25, o que foi significativamente diferente de huKS-IL2 isoladamente ou ciclofosfamida isoladamente (p <0,05) e eliminou completamente os tumores em seis de oito ratinhos até às doze semanas após o tratamento inicial. Os animais toleraram bem estes tratamentos, tendo-se observado uma perda de peso inferior a 10% em todos os grupos. iii. Também se demonstrou o efeito terapêutico melhorado da combinação de huKS-IL2 com ciclofosfamida num ensaio de crescimento tumoral em ratinhos imunocompetentes com tumores subcutâneos estabelecidos de carcinoma do pulmão. Os ratinhos foram tratados com uma única dose de 80 mg/kg de ciclofosfamida, isoladamente ou em combinação com 5 doses diárias de huKS-IL2 (20 pg) 3 dias após o tratamento com ciclofosfamida. Os volumes tumorais médios para huKS-IL2 e 80 mg/kg de ciclofosfamida isoladamente foram reduzidos em 2% e 27%, respectivamente (Figura 9C). O tratamento de combinação reduziu os volumes tumorais médios em 48% no Dia 20, o que foi significativamente diferente de huKS-IL2 isoladamente ou ciclofosfamida isoladamente (p <0,05). Os animais toleraram bem estes tratamentos, 56 tendo-se observado uma perda de peso inferior a 10% em todos os grupos.

Exemplo 11. Terapia de combinação com huKS-IL2 e um agente de alguilação

Demonstrou-se o efeito terapêutico melhorado da combinação de huKS-IL2 com Carboplatina, outro agente de quimioterapia da classe de agentes de alquilação. Ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos de carcinoma do pulmão de células não pequenas (LLC/KSA) foram tratados com Carboplatina (75 mg/kg) no Dia 0 seguida, três dias mais tarde, de um periodo de 5 dias de KS-IL2 (20 pg por dia). O tratamento com carboplatina e KS-IL2, cada um isoladamente, diminuiu de forma modesta o crescimento tumoral, e só o tratamento de combinação reduziu significativamente o volume tumoral médio no Dia 20 (p <0,05, Figura 10). Além disso, o crescimento de tumores em que os ratinhos foram tratados com a combinação, em comparação com o tratamento com Carboplatina isoladamente, foi significativamente diferente (p <0,05). A invenção pode ser especificada noutras formas particulares sem sair do seu espirito ou caracteristicas essenciais. Em consequência, as especificações anteriores devem ser consideradas, em todos os aspectos, ilustrativas e não limitativas da invenção aqui descrita. Assim, o âmbito da invenção é indicado pelas reivindicações adjuntas e não pela descrição anterior, pretendendo-se que estejam ai abrangidas todas as alterações dentro do significado e gama de equivalência das reivindicações. 57 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Gillies, Stephen Lan, Yan Holden, Sylvia

Lexigen Pharmaceuticals Corp.

<120> Aumento das Respostas Imunológicas Mediadas por Proteínas de Fusão Anticorpo-Citoquina por Tratamento Combinado com Agentes que Aumentam a Captação de Imunocitoquinas <130> LEX-014PC <140> PCT/US01/20958 <141> 2001-06-29 <150> U.S. 60/215,038 <151> 2000-06-29 <16 0 > 16 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 0 <212> <213> <220> <223> nenhum <400> 1 "000" <210> 2 <211> 0 <212> <213> 58 <220> <223> nenhum <4 0 0 > 2 "000" <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> seguência artificial <220> <223> "primer" sentido para a junção de cDNA huKS ratinho <400> 3 ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" anti-sentido para cDNA huKS-gama 2 <4 0 0 > 4 ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> sequência artificial 35 <2 2 Ο >

<223> "primer" sentido incluindo um sitio AflII 37 59 <4 Ο Ο> 5 cttaagccag atccagttgg tgcag 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" anti-sentido incluindo um sitio Xmal <4 0 0 > 6 cccggggtcc gggagaagct cttagtc 27 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> sense primer <400> 7 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" anti-sentido <400> 8 25 ccctcgagtt attgagggct tgttg 60

<210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" sentido <400> 9 ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg 32 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> "primer" anti-sentido <4 0 0 > 10 gcagcatcag cccgttttat ttccagcttg gtcc 34 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> "primer" sentido <4 0 0 > 11 cttaagcgag atcgtgctga cccag 25 <210> 12 <211> 29 61 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> "primer" anti-sentido <4 0 0 > 12 ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc 29 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" de PCR para p35 <4 0 0 > 13 ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 28 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" de PCR para p35 <4 0 0 > 14 ctcgagtcag gcggagctca gatagc 26 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> sequência artificial 62 <2 2 Ο > <223> "primer" de PCR para p40 <4 0 0 > 15 tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 28

<210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> "primer" de PCR para p40 <400> 16 ctcgagctag gatcggaccc tgcag 25

Lisboa, 25 de Outubro de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Estojo constituído por partes adequado para mediar a destruição imunológica de um tumor num mamífero, que compreende: (i) uma primeira embalagem que contém uma composição compreendendo uma proteína de fusão anticorpo-citoquina, e (ii) uma segunda embalagem que contém uma composição compreendendo um agente que aumenta a penetração da referida proteína de fusão com anticorpo no tumor; em que o referido agente é seleccionado do grupo que consiste num agente quimioterapêutico e um agente que danifica DNA; em que a composição da referida segunda embalagem se destina a ser administrada no referido mamífero antes da composição da referida primeira embalagem.

2. Estojo constituído por partes de acordo com a Reivindicação 1, em que a proteína de fusão anticorpo-citoquina compreende, na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, (a) o sítio de ligação de anticorpos compreendendo a região variável de uma imunoglobulina capaz de se ligar a um antigene da superfície celular, o domínio CHI de uma imunoglobulina, o domínio CH2 de uma imunoglobulina, e (b) a citoquina.

3. Estojo constituído por partes de acordo com a Reivindicação 2, em que a proteína de fusão anticorpo-citoquina também compreende um domínio CH3 intercalado entre o domínio CH2 e a citoquina. 2

4. Estojo constituído por partes de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 - 3, em que a citoquina presente na referida proteína de fusão anticorpo-citoquina é seleccionada do grupo que consiste num factor de necrose tumoral, uma interleuquina, um factor estimulador de colónias e uma linfoquina.

5. Estojo constituído por partes de acordo com a Reivindicação 4, em que a referida proteína de fusão anticorpo-citoquina é KS-IL2, em que KS é o anticorpo anti-EpCAM humanizado KS-1/4.

6. Estojo constituído por partes de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-5, em que o referido agente quimioterapêutico é um taxano.

7. Estojo constituído por partes de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 - 6, em que a composição da referida segunda embalagem se destina a ser administrada ao referido mamífero entre 4 horas e 4 dias antes do tratamento com a composição da referida primeira embalagem.

8. Estojo constituído por partes de acordo com a Reivindicação 7, em que a composição da referida segunda embalagem se destina a ser administrada ao referido mamífero entre 24 horas e 48 horas antes do tratamento com a composição da referida primeira embalagem.

9. Estojo constituído por partes de acordo com a Reivindicação 8, em que a composição da referida segunda embalagem se destina a ser administrada ao referido mamífero 24 horas antes do tratamento com a composição da referida primeira embalagem. 3

10. Utilização de um estojo constituído por partes como definido em qualquer uma das Reivindicações 1-9 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de tumores ou metástases tumorais.

11. Utilização da Reivindicação 10, em que o tumor é um tumor sólido. Lisboa, 25 de Outubro de 2007