JP2003502009A - 植物種子において遺伝子を発現させるための新規発現カセット - Google Patents
植物種子において遺伝子を発現させるための新規発現カセットInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、植物種子中の遺伝子を発現させるための発現カセットと、該発現カセットを含有するプラスミドとに関する。本発明は、該発現カセットを含有するトランスジェニック植物細胞の産生と、トランスジェニック植物を産生するための該発現カセットにおけるプラスミドの使用とに関する。本発明は、バイオテクノロジー、薬剤学および植物生産の分野で応用することができる。本発明の目的は、所望の物質の生産に適した様式でのトランスジェニック植物における種子特異的発現のための手段を提供することである。本発明の別の目的は、植物種子中で産生される物質の遺伝子を高い発現率で安定に発現させ得る発現カセットを構築することである。本発明の発現カセットは、以下の必須の成分を含有する：ショ糖結合タンパク質（SBP）と類似の種子タンパク質の遺伝子のプロモーター、発現すべき遺伝子、3'停止配列、ならびに必要な場合にはシグナルペプチド、好ましくはSBPシグナルペプチドのDNA配列。
Description
【０００１】
本発明は、植物種子において任意の遺伝子を発現させるための発現カセットと
、該発現カセットを含有するプラスミドとに関する。本発明はまた、この発現カ
セットを含有するトランスジェニック植物細胞の生産、ならびにトランスジェニ
ック植物の生産のためのこの発現カセットを利用したプラスミドの使用を包含す
る。本発明の適用分野は、バイオテクノロジー、薬剤学および植物生産である。
、該発現カセットを含有するプラスミドとに関する。本発明はまた、この発現カ
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る。本発明の適用分野は、バイオテクノロジー、薬剤学および植物生産である。
【０００２】
もう長い間、高等植物のゲノム内に関連遺伝子を組み込むことを可能にする方
法が存在している。本研究の目的は、新しい性質（例えば農業生産性の向上、食
品製造の最適化、および特定の薬剤や他の目的となる成分の生産のための）を有
する植物の生産である。ここで移入された遺伝子の発現の１つの要件は、これら
が植物特異的プロモーター配列を有することである。この目的のために、例えば
ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（1）、TR二重プロモーター（2）、ま
たはカリフラワーモザイクウイルスの35S転写物のプロモーター（3）が使用され
る。これらのプロモーターの１つの欠点は、これらは、操作された植物のほとん
どすべての組織中で活性があることである。従って、植物中の外来遺伝子の制御
されたかつ目的に沿った発現は不可能である。組織特異的にかつ成長に依存せず
に機能するプロモーターを使用することが好ましい。該当するプロモーター（葯
、子房、花、葉、落葉、茎、根、または種子でのみ活性がある）を有する遺伝子
が単離されている（4）。しかしこれらは、発現の強度と特異性が大きく異なり
、用途が限定される。栄養源として種子の使用およびおよび成分の生産のために
興味が集まるのは、特に種子特異的プロモーターである。種子貯蔵タンパク質の
遺伝子についての長年の研究により、強度の異なるある程度特異的ないくつかの
プロモーター（例えば、ファセオリン（5）またはレグミンおよびUSP（6）のプ
ロモーター）が利用可能になっている。これらの貯蔵タンパク質は遺伝子ファミ
リーにより合成されるため、これらのプロモーターと外来遺伝子の融合体は、対
応する遺伝子ファミリーの内因性の多数の遺伝子と競合している。このため、ユ
ニークな、強力かつ特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターを使用すること
が、より好ましい。同時形質転換および多段階形質転換については、種子の経時
的成長をより有効に利用するために、同一のまたは異なる遺伝子産物を平行して
合成し、同時抑制を避けるようにするためには、異なる制御配列の使用が適して
いる。
法が存在している。本研究の目的は、新しい性質（例えば農業生産性の向上、食
品製造の最適化、および特定の薬剤や他の目的となる成分の生産のための）を有
する植物の生産である。ここで移入された遺伝子の発現の１つの要件は、これら
が植物特異的プロモーター配列を有することである。この目的のために、例えば
ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（1）、TR二重プロモーター（2）、ま
たはカリフラワーモザイクウイルスの35S転写物のプロモーター（3）が使用され
る。これらのプロモーターの１つの欠点は、これらは、操作された植物のほとん
どすべての組織中で活性があることである。従って、植物中の外来遺伝子の制御
されたかつ目的に沿った発現は不可能である。組織特異的にかつ成長に依存せず
に機能するプロモーターを使用することが好ましい。該当するプロモーター（葯
、子房、花、葉、落葉、茎、根、または種子でのみ活性がある）を有する遺伝子
が単離されている（4）。しかしこれらは、発現の強度と特異性が大きく異なり
、用途が限定される。栄養源として種子の使用およびおよび成分の生産のために
興味が集まるのは、特に種子特異的プロモーターである。種子貯蔵タンパク質の
遺伝子についての長年の研究により、強度の異なるある程度特異的ないくつかの
プロモーター（例えば、ファセオリン（5）またはレグミンおよびUSP（6）のプ
ロモーター）が利用可能になっている。これらの貯蔵タンパク質は遺伝子ファミ
リーにより合成されるため、これらのプロモーターと外来遺伝子の融合体は、対
応する遺伝子ファミリーの内因性の多数の遺伝子と競合している。このため、ユ
ニークな、強力かつ特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターを使用すること
が、より好ましい。同時形質転換および多段階形質転換については、種子の経時
的成長をより有効に利用するために、同一のまたは異なる遺伝子産物を平行して
合成し、同時抑制を避けるようにするためには、異なる制御配列の使用が適して
いる。
【０００３】
植物種子中の任意の遺伝子の発現のための多くの発現カセットがすでに知られ
ているが、植物種子中で達成された発現速度は、所望する物質の植物バイオテク
ノロジーによる生産を具体化する上で、現在のところ最適ではない。
ているが、植物種子中で達成された発現速度は、所望する物質の植物バイオテク
ノロジーによる生産を具体化する上で、現在のところ最適ではない。
【０００４】
従って本発明は、トランスジェニック植物中の種子特異的発現を、物質の生産
に適した基盤に基づくものとするという目的を有する。これは、生産される物質
の遺伝子の高い発現速度での安定な発現を、植物細胞中で達成できる発現カセッ
トを構築する作業に基づく。
に適した基盤に基づくものとするという目的を有する。これは、生産される物質
の遺伝子の高い発現速度での安定な発現を、植物細胞中で達成できる発現カセッ
トを構築する作業に基づく。
【０００５】
本発明の目的は、請求項１に記載の発現カセットにより達成され、従属請求項
２〜７が好適な変更態様である。
２〜７が好適な変更態様である。
【０００６】
本発明の発現カセットは、以下の本質的な成分を有する：
ショ糖結合タンパク質（SBP）様タンパク質の遺伝子のプロモーターと、
必要な場合には、シグナルペプチド（好ましくはSBPシグナルペプチド）のD
NA配列と、 発現させるべき遺伝子と、 3'終止配列。
NA配列と、 発現させるべき遺伝子と、 3'終止配列。
【０００７】
本発明は特に、ゲノム中にユニークに存在し、主に種子の成長に依存した子葉
中および内胚乳中の任意の異種遺伝子の強い発現を媒介する、制御DNA配列に関
する。
中および内胚乳中の任意の異種遺伝子の強い発現を媒介する、制御DNA配列に関
する。
【０００８】
前記カセットの最も重要な成分は、SBPプロモーターであり、その配列を図１
に示す。この分野の類似のプロモーターと比較して、このプロモーターは、強度
が強く種子特異的であるという利点を有する。外来遺伝子の発現のためのその使
用は、シグナルペプチドのDNA配列が無くても、本発明の範囲の一部である。
に示す。この分野の類似のプロモーターと比較して、このプロモーターは、強度
が強く種子特異的であるという利点を有する。外来遺伝子の発現のためのその使
用は、シグナルペプチドのDNA配列が無くても、本発明の範囲の一部である。
【０００９】
転写制御配列とともに、本発明の発現カセットはまた、必要であればシグナル
ペプチドを含有する。このシグナルペプチドは、タンパク粒への所望の遺伝子産
物の輸送を可能にし、こうして遺伝子産物が大幅に分解することを防ぐ。信頼性
のあるシグナルペプチドを任意に使用することにより、タンパク粒への合成外来
タンパク質の輸送と貯蔵が可能になる。
ペプチドを含有する。このシグナルペプチドは、タンパク粒への所望の遺伝子産
物の輸送を可能にし、こうして遺伝子産物が大幅に分解することを防ぐ。信頼性
のあるシグナルペプチドを任意に使用することにより、タンパク粒への合成外来
タンパク質の輸送と貯蔵が可能になる。
【００１０】
発現させるべき遺伝子は、転写または翻訳融合体として組み込むことができ、
これらは、大幅に改変することができる。例えば、酵素（例えば、アミラーゼ、
キシラナーゼ）、医薬品の生産、または必須アミノ酸を高含有率で有するタンパ
ク質の過剰発現（例えば、メチオニンに富むブラジルナッツの2Sグロブリン）も
しくは種子の性質に影響を与える他のタンパク質の過剰発現のために、遺伝子を
使用することができる。アンチセンス方向に遺伝子を組み込むことにより、遺伝
子産物の減少または除去を引き起こすさらなる可能性が示される。この種子特異
的プロモーターの制御下に制御遺伝子を挿入することにより、種子中の代謝プロ
セスに影響を与えることもできる。前記カセットはまた、ソラマメ由来のプロモ
ーターに特異的なSBP遺伝子を他の種において発現させるために使用することも
できる。他のターミネーター（例えば、発現すべき遺伝子の終止配列）を使用す
ることにより、カセットの最適な使用のさらなる可能性が示される。具体例とし
て、β−グルクロニダーゼ（GUS）の遺伝子を、プロモーターの特異性を示すた
めに使用した（図2b、c）。
これらは、大幅に改変することができる。例えば、酵素（例えば、アミラーゼ、
キシラナーゼ）、医薬品の生産、または必須アミノ酸を高含有率で有するタンパ
ク質の過剰発現（例えば、メチオニンに富むブラジルナッツの2Sグロブリン）も
しくは種子の性質に影響を与える他のタンパク質の過剰発現のために、遺伝子を
使用することができる。アンチセンス方向に遺伝子を組み込むことにより、遺伝
子産物の減少または除去を引き起こすさらなる可能性が示される。この種子特異
的プロモーターの制御下に制御遺伝子を挿入することにより、種子中の代謝プロ
セスに影響を与えることもできる。前記カセットはまた、ソラマメ由来のプロモ
ーターに特異的なSBP遺伝子を他の種において発現させるために使用することも
できる。他のターミネーター（例えば、発現すべき遺伝子の終止配列）を使用す
ることにより、カセットの最適な使用のさらなる可能性が示される。具体例とし
て、β−グルクロニダーゼ（GUS）の遺伝子を、プロモーターの特異性を示すた
めに使用した（図2b、c）。
【００１１】
発現カセットのヌクレオチド配列は、転写制御領域を含有し、これが植物の種
子中の任意の遺伝子の強い特異的発現を保証する。ノーザン（図2a）は、ソラマ
メ（Vicia faba）の種々の組織中での、高い種子特異的発現を示す。図2bと2c中
のGUSデータは、一方で成熟したタバコの種子の切片のβ−グルクロニダーゼの
分布を示し、他方で成長の関数としてトランスジェニックタバコ種子中のβ−グ
ルクロニダーゼの蓄積を示す。
子中の任意の遺伝子の強い特異的発現を保証する。ノーザン（図2a）は、ソラマ
メ（Vicia faba）の種々の組織中での、高い種子特異的発現を示す。図2bと2c中
のGUSデータは、一方で成熟したタバコの種子の切片のβ−グルクロニダーゼの
分布を示し、他方で成長の関数としてトランスジェニックタバコ種子中のβ−グ
ルクロニダーゼの蓄積を示す。
【００１２】
発現カセットを含有するプラスミド（好ましくはプラスミドpSBPROCSおよびpP
TVSBPRGUS）はまた、保護下に置かれる。
TVSBPRGUS）はまた、保護下に置かれる。
【００１３】
本発明の範囲はまた、請求項12〜16に記載の発現カセットの使用を含み、これ
は、細菌株への形質転換、およびその後の、得られた組換えクローンの好適な双
子葉植物への移入により行われる。種子中で所望の遺伝子産物を発現する植物を
選択し、遺伝的に安定な系統として繁殖させる。採取後、所望の遺伝子産物を、
基本的に公知の方法でトランスジェニック種子から抽出する。
は、細菌株への形質転換、およびその後の、得られた組換えクローンの好適な双
子葉植物への移入により行われる。種子中で所望の遺伝子産物を発現する植物を
選択し、遺伝的に安定な系統として繁殖させる。採取後、所望の遺伝子産物を、
基本的に公知の方法でトランスジェニック種子から抽出する。
【００１４】
本発明はまた、全体での発現速度を増大させることを目的とし、種子の成長時
期をより有効に利用し、かつ同時抑制による影響を避けるために、種々のプロモ
ーターの制御下で所望の遺伝子産物を発現させるような適用としても、興味深い
。この発現カセットはまた、種々の遺伝子産物を発現する目的で、同時形質転換
および多段階形質転換にも適している。正しい発現カセットを選択するために、
これらの方策には、種々の新規の発現カセットが必要である。
期をより有効に利用し、かつ同時抑制による影響を避けるために、種々のプロモ
ーターの制御下で所望の遺伝子産物を発現させるような適用としても、興味深い
。この発現カセットはまた、種々の遺伝子産物を発現する目的で、同時形質転換
および多段階形質転換にも適している。正しい発現カセットを選択するために、
これらの方策には、種々の新規の発現カセットが必要である。
【００１５】
植物細胞の改変のための全方法は、実施例に示す（pSBPOCS）。
【００１６】
本発明を、実施例を用いてより詳細に以下に説明する。
【００１７】方法
1.クローニング法
クローニングのために、ベクターpUC18（7）、pBK-CMV（Stratagene）およびp
OCS1（Plant Genetic Systems, Gent, ベルギー）を、そして植物形質転換のた
めにベクターBIN19（8）を、およびGUS遺伝子の削除後にpGPTV-BAR（9）を、使
用した。
OCS1（Plant Genetic Systems, Gent, ベルギー）を、そして植物形質転換のた
めにベクターBIN19（8）を、およびGUS遺伝子の削除後にpGPTV-BAR（9）を、使
用した。
【００１８】
2.細菌株
大腸菌（E. coli ）の形質転換のために、株DH5α（10）を使用した。バイナ
リープラスミドを、接合によりアグロバクテリア株EHA105（11）中に挿入した。
リープラスミドを、接合によりアグロバクテリア株EHA105（11）中に挿入した。
【００１９】
3.植物形質転換
タバコ（Nicotiana tabacum）の形質転換はリーフディスク法（12）により行
い、ビシア・ナルボネンシス（Vicia narbonensis）の形質転換は、Pickardtに
より1991年に記載されたアグロバクテリウム（agrobacterium）介在遺伝子転移
による方法（13）を使用して行った。
い、ビシア・ナルボネンシス（Vicia narbonensis）の形質転換は、Pickardtに
より1991年に記載されたアグロバクテリウム（agrobacterium）介在遺伝子転移
による方法（13）を使用して行った。
【００２０】
4.トランスジェニック植物由来のゲノムDNAの解析
トランスジェニックタバコおよびビシア・ナルボネンシス（V. narbonensis）
植物のゲノムDNAを、Macherey & Nagel社のDNA単離キットを用いて単離した。第
１の工程で、トランスジェニック系統を、遺伝子特異的プライマーを用いるPCR
により同定した。外来DNAの組み込みは、適当な制限消化後のDNA20μgを「サザ
ンブロット」解析により調べた。
植物のゲノムDNAを、Macherey & Nagel社のDNA単離キットを用いて単離した。第
１の工程で、トランスジェニック系統を、遺伝子特異的プライマーを用いるPCR
により同定した。外来DNAの組み込みは、適当な制限消化後のDNA20μgを「サザ
ンブロット」解析により調べた。
【００２１】
5.β−グルクロニダーゼ活性試験（GUSアッセイ）
レポーター遺伝子β−グルクロニダーゼは、定量アッセイ（14）と組織化学的
活性アッセイが可能な細菌酵素である。組織サンプルを、１mM X-Gluc、50mM リ
ン酸ナトリウム（pH 7.0）、および0.1%Tween20中で、37℃で一晩インキュベー
トした。切片調製のために、組織を固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトーム
で15〜30μm厚の切片として切断した。
活性アッセイが可能な細菌酵素である。組織サンプルを、１mM X-Gluc、50mM リ
ン酸ナトリウム（pH 7.0）、および0.1%Tween20中で、37℃で一晩インキュベー
トした。切片調製のために、組織を固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトーム
で15〜30μm厚の切片として切断した。
【００２２】実施例
新しい種子特異的発現カセットならびにプラスミドとそれから得られるトラン
スジェニック植物の作製を包含する本発明を、以下に一部は図を使用して、実施
例を使用して説明する。
スジェニック植物の作製を包含する本発明を、以下に一部は図を使用して、実施
例を使用して説明する。
【００２３】1.) ソラマメ（Vicia faba）由来のSBP種子タンパク質遺伝子のクローニングと
構造解析 プライマー（5'-GAAGACCCTGAGCTCGTAACTTGCAA-ACAC-3'および5'-AGTACTCATAGA
TCTCTGGGTGATGTTGGT-3'）を、大豆のショ糖結合タンパク質をコードするcDNAク
ローンの配列から得た（15）。次に、ソラマメ（V. faba）の未成熟子葉から単
離したmRNAに対するRT-PCRにより、その遺伝子特異的プローブを増幅し、クロー
ン化し、配列決定した。このPCR産物を、ショ糖結合タンパク質に相同な遺伝子
断片として同定し、ソラマメ（V. faba）L. var. minorの子葉特異的λ Zap発現
cDNAバンクからの完全長cDNAの単離のためのプローブとして使用した。単離した
クローンの１つ（VfSBP20）（これは、ヌクレオチドレベルで68%の相同性を有す
る）は、ソラマメ由来の完全長SBP相同遺伝子をコードする。しかしこれは、発
現（図2a）と機能（ショ糖結合せず）の両方で、大豆から単離した遺伝子とは異
なる。
構造解析 プライマー（5'-GAAGACCCTGAGCTCGTAACTTGCAA-ACAC-3'および5'-AGTACTCATAGA
TCTCTGGGTGATGTTGGT-3'）を、大豆のショ糖結合タンパク質をコードするcDNAク
ローンの配列から得た（15）。次に、ソラマメ（V. faba）の未成熟子葉から単
離したmRNAに対するRT-PCRにより、その遺伝子特異的プローブを増幅し、クロー
ン化し、配列決定した。このPCR産物を、ショ糖結合タンパク質に相同な遺伝子
断片として同定し、ソラマメ（V. faba）L. var. minorの子葉特異的λ Zap発現
cDNAバンクからの完全長cDNAの単離のためのプローブとして使用した。単離した
クローンの１つ（VfSBP20）（これは、ヌクレオチドレベルで68%の相同性を有す
る）は、ソラマメ由来の完全長SBP相同遺伝子をコードする。しかしこれは、発
現（図2a）と機能（ショ糖結合せず）の両方で、大豆から単離した遺伝子とは異
なる。
【００２４】2)PCRによる制御配列の単離
制御配列は、CLONTECH社の「Universal GenomeWalkerTM Kit」、ならびに遺伝
子特異的プライマーであるPSBP1(159位)（5'-AATCCTCA-CACTTCTCCATGCATATCCGTT
TGTCC-3'）、PSBP2(118位)（5'-GCCCTGCAGAT-CGCATTTGTCTTTGCA-3'）、およびPS
BP3(85位)（5'-CTGGGTCCTTTTCTTTTCTGG- C-3'）を使用して単離した。ソラマメ
（V. faba）のゲノムDNAをScaI(a)とStuI(b)であらかじめ消化し、アダプターを
連結した後、キットの説明に従って以下のパラメータを使用して二段階PCRを行
った：94℃で２秒、72℃で３分を７サイクルと、94℃で２秒、67℃で３分、67℃
で４分を32サイクル。PCR調製物を1:50希釈し、各１μlを第２のPCR（94℃で２
秒、72℃で３分を５サイクルと、94℃で２秒、67℃、67℃で４分を20サイクル）
で増幅した。アガロースゲルでは、(a)からの1.7kbのバンドと(b)からの1.9kbの
バンドを、サザンブロットにより確認した。次にこれらのバンドをpUC18中にク
ローン化し、配列決定した。次に、クローンSBPR7とSBPR15を配列比較により、
遺伝子VfSBP20と適合するプロモーターとして同定した。これらは遺伝子VfSBP20
の対立遺伝子変異体であり、いずれのクローンも対応する領域でクローンVfSBP2
0と100%の配列同一性を有する。SBP遺伝子のATGの5'側の、クローンSBPR7の有す
る1539 bpとクローンSBPR15の有する1750 bpが単離された。これらは、23塩基対
の置換と２つの挿入により異なる。クローンpSBPR7とpSBPR15の制限地図を図３
に示し、クローンpSBPR15の配列を図１に示す。
子特異的プライマーであるPSBP1(159位)（5'-AATCCTCA-CACTTCTCCATGCATATCCGTT
TGTCC-3'）、PSBP2(118位)（5'-GCCCTGCAGAT-CGCATTTGTCTTTGCA-3'）、およびPS
BP3(85位)（5'-CTGGGTCCTTTTCTTTTCTGG- C-3'）を使用して単離した。ソラマメ
（V. faba）のゲノムDNAをScaI(a)とStuI(b)であらかじめ消化し、アダプターを
連結した後、キットの説明に従って以下のパラメータを使用して二段階PCRを行
った：94℃で２秒、72℃で３分を７サイクルと、94℃で２秒、67℃で３分、67℃
で４分を32サイクル。PCR調製物を1:50希釈し、各１μlを第２のPCR（94℃で２
秒、72℃で３分を５サイクルと、94℃で２秒、67℃、67℃で４分を20サイクル）
で増幅した。アガロースゲルでは、(a)からの1.7kbのバンドと(b)からの1.9kbの
バンドを、サザンブロットにより確認した。次にこれらのバンドをpUC18中にク
ローン化し、配列決定した。次に、クローンSBPR7とSBPR15を配列比較により、
遺伝子VfSBP20と適合するプロモーターとして同定した。これらは遺伝子VfSBP20
の対立遺伝子変異体であり、いずれのクローンも対応する領域でクローンVfSBP2
0と100%の配列同一性を有する。SBP遺伝子のATGの5'側の、クローンSBPR7の有す
る1539 bpとクローンSBPR15の有する1750 bpが単離された。これらは、23塩基対
の置換と２つの挿入により異なる。クローンpSBPR7とpSBPR15の制限地図を図３
に示し、クローンpSBPR15の配列を図１に示す。
【００２５】3a)タバコにおける種子特異的発現の証明
β−グルクロニダーゼのレポーター遺伝子を用いて、単離した制御配列SBPR7
とSBPR15の種子特異的発現を試験した。このために、バイナリープラスミドpBI1
01（14）（これは、ポリリンカーの後にプロモーター不含グルクロニダーゼ遺伝
子を含有する）をSmaIで切断し、脱リン酸化した。SalI/NcoI消化によりプラス
ミドpSBPR7とpSBPR15からそれぞれプロモーターを単離し、末端を平滑化した。
次にその断片を、バイナリープラスミドpBI101のレポーター遺伝子の前のSmaI部
位にクローン化してプラスミドpBISBPR7GUSとpBISBPR15GUSを得た。次にこれら
のプラスミドを、アグロバクテリア（Agrobacteria）株EHA105に移入させ、タバ
コの形質転換のために用いられるSBPプロモーター/グルクロニダーゼ遺伝子を含
有するキメラアグロバクテリアを使用した。結果を図2bと2cに示す。トランスジ
ェニックタバコ種子の分析は、濃い青色呈色、すなわち、これも種子の成長に従
うタバコ種子の内胚乳と子葉中のグルクロニダーゼの強い活性を、示す。他の組
織ではグルクロニダーゼ活性は検出されなかった。２つのわずかに異なるヌクレ
オチド配列SBPR7とSBPR15も、その発現挙動は異なっていない。これらのデータ
は、β−グルクロニダーゼ遺伝子と融合された単離した制御配列は、タバコ中で
強くかつ厳密に種子特異的な発現を引き起こすことを示している。
とSBPR15の種子特異的発現を試験した。このために、バイナリープラスミドpBI1
01（14）（これは、ポリリンカーの後にプロモーター不含グルクロニダーゼ遺伝
子を含有する）をSmaIで切断し、脱リン酸化した。SalI/NcoI消化によりプラス
ミドpSBPR7とpSBPR15からそれぞれプロモーターを単離し、末端を平滑化した。
次にその断片を、バイナリープラスミドpBI101のレポーター遺伝子の前のSmaI部
位にクローン化してプラスミドpBISBPR7GUSとpBISBPR15GUSを得た。次にこれら
のプラスミドを、アグロバクテリア（Agrobacteria）株EHA105に移入させ、タバ
コの形質転換のために用いられるSBPプロモーター/グルクロニダーゼ遺伝子を含
有するキメラアグロバクテリアを使用した。結果を図2bと2cに示す。トランスジ
ェニックタバコ種子の分析は、濃い青色呈色、すなわち、これも種子の成長に従
うタバコ種子の内胚乳と子葉中のグルクロニダーゼの強い活性を、示す。他の組
織ではグルクロニダーゼ活性は検出されなかった。２つのわずかに異なるヌクレ
オチド配列SBPR7とSBPR15も、その発現挙動は異なっていない。これらのデータ
は、β−グルクロニダーゼ遺伝子と融合された単離した制御配列は、タバコ中で
強くかつ厳密に種子特異的な発現を引き起こすことを示している。
【００２６】3b)エンドウにおける種子特異的発現の証明
種子特異的発現がマメ科植物中でも期待できることを証明するために、プラス
ミドpSBPR15のSalI/NcoI断片を、SalI/NcoIで切断したプラスミドpGUS1（Plant
Genetic Systems, Gent）中にクローン化した。得られたプラスミドpSBPGUSから
、SBPR15プロモーター/GUS/ocs-ターミネーターの融合体をSalI/SmaIで切り出し
、平滑化し、EcoRI/SmaIで切断したバイナリープラスミドpGPTV-Bar中に連結し
た（図４）。pGPTV-Bar（9）は、エンドウの形質転換に首尾よく使用されるホス
フィノトリシン耐性を媒介するバイナリープラスミドである。このプラスミドは
pPTVSBPRGUS（図４）と呼ばれている。このプラスミドを用いて作製したトラン
スジェニックエンドウ系統の胚は、組織化学分析で濃い青色呈色を示す。
ミドpSBPR15のSalI/NcoI断片を、SalI/NcoIで切断したプラスミドpGUS1（Plant
Genetic Systems, Gent）中にクローン化した。得られたプラスミドpSBPGUSから
、SBPR15プロモーター/GUS/ocs-ターミネーターの融合体をSalI/SmaIで切り出し
、平滑化し、EcoRI/SmaIで切断したバイナリープラスミドpGPTV-Bar中に連結し
た（図４）。pGPTV-Bar（9）は、エンドウの形質転換に首尾よく使用されるホス
フィノトリシン耐性を媒介するバイナリープラスミドである。このプラスミドは
pPTVSBPRGUS（図４）と呼ばれている。このプラスミドを用いて作製したトラン
スジェニックエンドウ系統の胚は、組織化学分析で濃い青色呈色を示す。
【００２７】3c)ソラマメ（Vicia faba）、ビシア・ナルボネンシス（Vicia narbonensis）、 エンドウ（Pisum sativum）およびブラシカ・ナプス（Brassica napus）の胚に
おける一過性発現の証明 プラスミドpSBPGUSを用いて、ソラマメ（Vicia faba）、ビシア・ナルボネン
シス（Vicia narbonensis）、エンドウ（Pisum sativum）およびブラシカ・ナプ
ス（Brassica napus）の単離した胚に、Biolistics PDS-1000/He粒子送達システ
ムを使用して以下の条件で噴射した。コーティング調製物は、50μlの金（Herea
us、0.6-3μm、50■/ml）、10μlのQiagen非汚染プラスミドDNA（１μg/μl）、
50μlの2.5M CaCl2および10μlの0.1Mスペルミジンを含有した。1800 Psiおよび
27インチHgの減圧下で、寒天パネル上に置いた胚に噴射し、次にMS-2%ショ糖液
体培地中で２日間培養した。次に50mM リン酸ナトリウム（pH7.0）と0.1%Tween2
0中、X-Gluc（１mM）を添加して37℃で一晩反応させた。陰性対照（プロモータ
ー不含pGUS1）と異なり、上記胚中に多くの青い点が示され、前記SBPプロモータ
ーが種子中で機能することを示していた。
おける一過性発現の証明 プラスミドpSBPGUSを用いて、ソラマメ（Vicia faba）、ビシア・ナルボネン
シス（Vicia narbonensis）、エンドウ（Pisum sativum）およびブラシカ・ナプ
ス（Brassica napus）の単離した胚に、Biolistics PDS-1000/He粒子送達システ
ムを使用して以下の条件で噴射した。コーティング調製物は、50μlの金（Herea
us、0.6-3μm、50■/ml）、10μlのQiagen非汚染プラスミドDNA（１μg/μl）、
50μlの2.5M CaCl2および10μlの0.1Mスペルミジンを含有した。1800 Psiおよび
27インチHgの減圧下で、寒天パネル上に置いた胚に噴射し、次にMS-2%ショ糖液
体培地中で２日間培養した。次に50mM リン酸ナトリウム（pH7.0）と0.1%Tween2
0中、X-Gluc（１mM）を添加して37℃で一晩反応させた。陰性対照（プロモータ
ー不含pGUS1）と異なり、上記胚中に多くの青い点が示され、前記SBPプロモータ
ーが種子中で機能することを示していた。
【００２８】4.)種子中の異種遺伝子の過剰発現のための発現カセットの作製
外来遺伝子の過剰発現に制御配列が利用できるようにするために、より長いク
ローンSBPR15のSalI断片を単離し、平滑化し、プラスミドpOCS1（Plant Genetic
Systems, Gent、ベルギー）のSmaI部位にクローン化した。これにより、このカ
セットは、プロモーター領域、完全な5'非翻訳領域、完全長シグナルペプチド、
成熟タンパク質の最初の５つのトリプレット（図１）、および3'非翻訳領域を、
オクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルとともに含有する（図５
）。NcoI部位は、外来遺伝子との転写融合のために使用することができ、BamHI
部位は翻訳融合のために使用することができる。外来遺伝子の挿入後、プロモー
ター、制御配列、外来遺伝子および3'終止配列を含有する配列を、制限酵素で切
り出し、植物形質転換に適した除草剤耐性を有するバイナリーベクター中にクロ
ーン化した。
ローンSBPR15のSalI断片を単離し、平滑化し、プラスミドpOCS1（Plant Genetic
Systems, Gent、ベルギー）のSmaI部位にクローン化した。これにより、このカ
セットは、プロモーター領域、完全な5'非翻訳領域、完全長シグナルペプチド、
成熟タンパク質の最初の５つのトリプレット（図１）、および3'非翻訳領域を、
オクトピンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルとともに含有する（図５
）。NcoI部位は、外来遺伝子との転写融合のために使用することができ、BamHI
部位は翻訳融合のために使用することができる。外来遺伝子の挿入後、プロモー
ター、制御配列、外来遺伝子および3'終止配列を含有する配列を、制限酵素で切
り出し、植物形質転換に適した除草剤耐性を有するバイナリーベクター中にクロ
ーン化した。
【００２９】
この１例として、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocell
um）のキシラナーゼＺの遺伝子のBamHI断片を、プラスミドpSBPOCSのBamHI部位
にクローン化して、翻訳融合体とした。得られたプラスミドpSBPRXYNZ（図６）
由来の平滑化したAsp718/SphI断片を、酵素EcoRI/SmaIで切断し平滑化したバイ
ナリーベクターpGPTV-Barと連結した。アグロバクテリア（Agrobactera）株EHA1
05中に形質転換した後、タバコ（N. Tabacum）を形質転換した。キシラナーゼＺ
の強い発現が、ウェスタンブロットにより成熟トランスジェニック種子中で示さ
れた（図７）。
um）のキシラナーゼＺの遺伝子のBamHI断片を、プラスミドpSBPOCSのBamHI部位
にクローン化して、翻訳融合体とした。得られたプラスミドpSBPRXYNZ（図６）
由来の平滑化したAsp718/SphI断片を、酵素EcoRI/SmaIで切断し平滑化したバイ
ナリーベクターpGPTV-Barと連結した。アグロバクテリア（Agrobactera）株EHA1
05中に形質転換した後、タバコ（N. Tabacum）を形質転換した。キシラナーゼＺ
の強い発現が、ウェスタンブロットにより成熟トランスジェニック種子中で示さ
れた（図７）。
【００３０】
文献：
【図１】
図１は、発現カセットに含まれる、プロモーターのヌクレオチド配列およびそ
れに続くアミノ酸配列を示す。
れに続くアミノ酸配列を示す。
【図２】
図2aはVfSBP20をプローブとして得られたソラマメRNAに対するノーザンハイブ
リダイゼーションの結果を示す。図2bは遺伝子(SBPRGUS)を導入した成熟タバコ
の切片のβ-グルクロニダーゼの発現分布である。図2cは遺伝子pSBPRGUSを導入
したタバコ系統中のGUS含有量を示す。
リダイゼーションの結果を示す。図2bは遺伝子(SBPRGUS)を導入した成熟タバコ
の切片のβ-グルクロニダーゼの発現分布である。図2cは遺伝子pSBPRGUSを導入
したタバコ系統中のGUS含有量を示す。
【図３】
図３は、プラスミドpSBPR7とpSBPR15の模式図である。
【図４】
図４は、プラスミドPTVSBPRGUSの模式図である。
【図５】
図５は、プラスミドpSBPOCSの模式図である。
【図６】
図６は、プラスミドPTVSBPXYNの模式図である。
【図７】
図７は、キシラナーゼＸに対する抗体を用いた、成熟種子由来のタンパク質抽
出物のウェスタンブロットの結果を示す。
出物のウェスタンブロットの結果を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月７日（２００１．６．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，
ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，Ｃ
Ｚ，ＤＭ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，
ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ
Ａ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17
CA19 CB03 CD03 CD07 CD10
4B024 AA08 AA20 CA02 DA01 EA04
FA02 FA07 FA10 FA18
4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14
BA02 CA24 CA53
Claims (20)
- 【請求項１】 植物種子において任意の遺伝子を発現させるための発現カセ
ットであって、 ショ糖結合タンパク質（SBP）と類似の種子タンパク質の遺伝子のプロモータ
ーと、 必要な場合には、シグナルペプチド、好ましくはSBPシグナルペプチドのDNA配
列と、 発現すべき遺伝子と、 3'終止配列と、 を含有する上記発現カセット。 - 【請求項２】 シグナルペプチドのDNA配列を除く図１に記載の配列を有す
るSBPRプロモーターを含有する、請求項１に記載の発現カセット。 - 【請求項３】 強い種子特異的遺伝子発現のための転写制御配列を有するDN
A領域の下流にさらなるDNA配列が存在してなり、該DNA配列は、作物における内
因性産物の生成と定量的分布についての情報、または作物における異種産物の発
現についての情報を有するものである、請求項１または２に記載の発現カセット
。 - 【請求項４】 転写融合体または翻訳融合体として任意の外来遺伝子が組み
込まれている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現カセット。 - 【請求項５】 SBP種子タンパク質遺伝子のシグナルペプチドがシグナルペ
プチドとして使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセット。 - 【請求項６】 ショ糖結合タンパク質の遺伝子が、発現すべき遺伝子として
使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセット。 - 【請求項７】 同時形質転換および多段階形質転換にも使用される、請求項
１〜６のいずれか１項に記載の発現カセット。 - 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットを含有す
るプラスミド。 - 【請求項９】 ソラマメ（Vicia-faba）のSBP相同遺伝子のシグナルペプチ
ドと５つのトリプレットとを含む約1.9 kbの制御開始領域のSalIプロモーター断
片、外来遺伝子におけるクローニングのための制限部位、およびオクトピンシン
ターゼ遺伝子の転写ターミネーターを含有する、約5.3kbのDNA配列を含んでなる
プラスミドpSBPROCS。 - 【請求項１０】 約1kbのホスフィノトリシン耐性遺伝子、約1.8 kbのソラ
マメ（Vicia faba）のSBP様遺伝子の制御開始領域のSalI/NcoIプロモーター断片
、約１kbのβ−グルクロニダーゼのコード領域、およびオクトピンシンターゼ遺
伝子の転写ターミネーターを含有する、約14.9 kbのDNA配列を含んでなるプラス
ミドpPTVSBPRGUS。 - 【請求項１１】 以下の工程を含んでなる、強い種子特異的遺伝子発現のた
めのDNA配列を有する発現カセットの植物細胞中への挿入方法。 ａ）クローンVfSBP20を単離する工程、ここで、植物の種子中に存在するSBP種
子タンパク質をコードする遺伝子は、ソラマメ（Vicia faba）の子葉のcDNAバン
クから選択される、 ｂ）クローンpSBPR15を単離する工程、ここで、pSBPR15に含有されるDNA配列
は、ソラマメ（Vicia faba）のSBP種子タンパク質遺伝子の制御開始領域と、SBP
PR15のDNA配列とハイブリダイズする関連マメ科植物由来の配列とを含む、 ｃ）1.9 kbのプラスミドpSBPR15のSalI断片を使用してプラスミドpSBPOCSを生
産する工程、 ｄ）pSBPOCS発現カセットに外来遺伝子を組み込む工程、 ｅ）植物種子において外来遺伝子を過剰発現させるためのDNA配列を含有する
発現カセットを、バイナリーベクターにクローニングする工程、 ｆ）SBPRプロモーターの制御下に外来遺伝子を含有する発現カセットを、植物
細胞に導入する工程。 - 【請求項１２】 形質転換植物の種子において同種遺伝子および異種遺伝子
を発現させるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセットの使用
。 - 【請求項１３】 種子の貯蔵能力または発芽能力を変化させる遺伝子を発現
させるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセットの使用。 - 【請求項１４】 作物の形質転換のための、プラスミドpBISBPR7、pBISBPR1
5、pSBPGUS、pPTVSBPRGUSおよびpSBPOCSまたはそれらの誘導体の使用。 - 【請求項１５】 作物における内因性プロセスの制御のための、または作物
における異種産物の産生のための、プラスミドpBISBPR7、pBISBPR15、pSBPGUS、
pPTVSBPRGUSおよびpSBPOCSまたはそれらの誘導体の使用。 - 【請求項１６】 種子中で新規遺伝子産物または改変された遺伝子産物を発
現している形質転換植物を選択し、遺伝的に安定な系統を育成し、そして遺伝子
産物をトランスジェニック植物の種子から抽出する、請求項１〜７のいずれか１
項に記載の発現カセットの使用。 - 【請求項１７】 請求項８〜１０のいずれか１項に記載のプラスミドを含有
する植物細胞。 - 【請求項１８】 請求項１１に記載の方法により産生された植物細胞。
- 【請求項１９】 請求項１２または１３に記載の植物細胞から再生された植
物または植物組織。 - 【請求項２０】 作物である請求項１４に記載の植物。
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- 2001-05-03 ZA ZA200103557A patent/ZA200103557B/en unknown
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