EP2078087A1 - Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen - Google Patents

Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen

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Publication number
EP2078087A1
EP2078087A1 EP07821224A EP07821224A EP2078087A1 EP 2078087 A1 EP2078087 A1 EP 2078087A1 EP 07821224 A EP07821224 A EP 07821224A EP 07821224 A EP07821224 A EP 07821224A EP 2078087 A1 EP2078087 A1 EP 2078087A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
plant
acid molecule
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07821224A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Frank
Patrick Schweizer
Dimitar Douchkov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to EP07821224A priority Critical patent/EP2078087A1/de
Priority to EP12166996A priority patent/EP2487245A3/de
Publication of EP2078087A1 publication Critical patent/EP2078087A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the pathogen resistance in transgenic plants and / or plant cells, wherein a DNA sequence coding for a Hordeum vulgar Armadillo Repeat (HvARM) polynucleotide or a functional equivalent thereof, in the plant or plant cell introduced and expressed there.
  • HvARM Hordeum vulgar Armadillo Repeat
  • the present invention also relates to the use of nucleic acids encoding such a protein for the production of transgenic plants or plant cells having an increased pathogen resistance.
  • the present invention relates to nucleic acid sequences which code for such a protein, which mediates an increased pathogen resistance in plants.
  • the invention relates to homologous sequences (ARM1) thereof, as well as their use in methods for achieving a pathogen resistance in plants, as well as nucleic acid constructs, expression casts and vectors comprising these sequences and which are suitable for mediating a fungal resistance in plants.
  • the invention further relates to these expression cassettes or vectors transformed transgenic organisms, in particular plants, derived cultures, parts or transgenic propagation material.
  • Plant diseases caused by various pathogens e.g. Viruses, bacteria and fungi caused by crop cultivation can lead to significant crop failures, which has economic consequences, but also threatens the safety of the human diet.
  • chemical fungicides have been used to control fungal diseases. Although the use of these substances has reduced the extent of plant diseases, it is still possible today that these compounds have a harmful effect on humans, animals and the environment.
  • genetic engineering manipulation e.g. by the introduction of external resistance genes or by the manipulation of endogenous gene expression in the plants to make targeted for the production of pathogen-resistant plants.
  • the invention relates to a method for increasing the resistance to one or more penetrating pathogen (s) in a monocot or dicotyledonous plant, or a part of a plant, eg in an organ, tissue, cell or part of a plant cell, eg an organelle, characterized in that a DNA sequence which codes for an armadillo repeat ARM1 protein and an increased pathogen resistance, preferably an increased fungal pathogen resistance, is introduced into the plant or plant cell and expressed there.
  • a DNA sequence which codes for an armadillo repeat ARM1 protein and an increased pathogen resistance, preferably an increased fungal pathogen resistance is introduced into the plant or plant cell and expressed there.
  • the invention relates to a method for increasing the resistance to one or more penetrating pathogen (s) in a monocot or dicotyledonous plant, or a part of a plant, eg in an organ, tissue, cell or part of a plant cell , eg in an organelle, characterized in that an endogenous DNA sequence which codes for an Armadillo Repeat ARM1 protein and an increased pathogen resistance, preferably an increased fungal pathogen resistance, in the plant, plant part or plant cell relative to the starting point or wild-type plant, or the part of which is increased, or that the endogenous gene sequence or preferably the 5'-untranslated region (5'UTR) is changed relative to the starting sequence.
  • an endogenous DNA sequence which codes for an Armadillo Repeat ARM1 protein and an increased pathogen resistance, preferably an increased fungal pathogen resistance, in the plant, plant part or plant cell relative to the starting point or wild-type plant, or the part of which is increased, or that the endogenous gene sequence or preferably
  • TIGS Transient Induced Gene Silencing
  • race-specific resistance is achieved in the method according to the invention.
  • a broad spectrum resistance against obligate biotrophic and / or hemibiotrohpe and / or necrotrophic fungi of plants, in particular against mesophyll and / or epidermis-penetrating pathogens can be achieved.
  • Armadillo Repeat motif was originally discovered in the segment polarity gene Armadillo from Drosophila melanogaster. It codes for a beta-catenin, which plays an important role in cell cell adhesion and cell differentiation.
  • Armadillo (Arm) Repeat proteins contain tandem copies of a degenerate sequence of approximately 42 amino acids, which encodes a three-dimensional structure for mediating protein-protein interactions (Azevedo et al., Trends Plant Sci. 6, 354 (2001) ). Most of these proteins are involved in intracellular signal transduction or in the regulation of gene expression in cellular development processes.
  • ARC1 belongs to the U-box subclass of Armadillo repeat proteins, which includes 18 genes in Arabidopsis (Azevedo et al., Trends Plant Sci. 6, 354 (2001)).
  • the U-Box is a mo- del consisting of approx. 70 amino acid residues.
  • Proteins are believed to form a third class of ubiquitin E3 ligases whose primary function is to establish the substrate specificity of the ubiquitination machinery (Hatakeyama et al., J. Biol. Chem. 76, 331 11 (2001)).
  • genes with a high homology to HvArm probably mediate similar functions.
  • the genes or the nucleic acids or proteins used have an identity of 40% or more, preferably 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%. or more compared to the respective sequence of HvARM (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 63 [cDNA sequence with UTR] and protein sequence SEQ ID NO: 2, respectively).
  • the highest homology genes to HvArm from rice Acc #: XM_479734.1, XM_463544, AP003561, or XM_506432), tobacco (AY219234), and Arabidopsis (Acc.-No.
  • AK1 18613, AL138650, AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 and AK1 18730) thus presumably perform functions similar to HvARM in the plant.
  • the homologous sequences are named "Armadillo Repeat ARM1" or "ARM1".
  • HvARM or HvARMI refer to such a sequence of barley, etc.
  • sequence (s) according to the invention is used for reasons of simplification, which, depending on the context, relates to the nucleic acid and / or amino acid sequences disclosed herein.
  • the polypeptide according to the invention which is encoded by a sequence according to the invention, has no U box in the 5'-UTR.
  • the invention consequently relates to a method for producing a plant with increased resistance to one or more plant pathogens, preferably with a broad spectrum resistance, in particular against fungal pathogens, for example from the class Ascomycetes, Basidiomycetes, Chytridiomycetes or Oomycetes of powdery mildew fungi of the family Erysiphaceae, and more preferably of the genus Blumeria, by introducing and expressing a sequence according to the invention which is characterized in that it encodes a protein containing at least one armadillo repeat.
  • the protein contains two, more preferably more than two Armadillo repeats.
  • the cDNA encoding the protein comprises substantially no U box, i. either no U-box or no functional U-box.
  • the nucleic acid sequence of the invention i. that which codes for an Armadillo Repeat ARM1 protein which mediates an increased pathogen resistance, preferably an increased fungal pathogen resistance, and which is introduced and expressed in the process according to the invention into the plant or plant cell or a part thereof, or the same endogenous DNA sequence which is increased in the plant or plant cell relative to the starting or wild-type plant or its part, or wherein the endogenous gene sequence or preferably the 5'-untranslated region (5'UTR) relative to the starting sequence is changed is selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 or 63;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of at least 50%, preferably at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% has the sequences SEQ ID No: 2;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide recognized by a monoclonal antibody directed against a polypeptide encoded by the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • nucleic acid molecule which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions;
  • the resistance to mesophyll- and / or epidermal cell-penetrating pathogens is preferably increased in particular.
  • the resistance is achieved by using a nucleic acid sequence according to the invention, for example that of an ARM1 from rice (Acc. No .: XM_479734.1, XM_463544, AP003561, or XM_506432), tobacco (AY219234) and Arabidopsis (Acc. No NM_127878, AC004401, BT020206, AB007645, NM_115336, AK118613, AL138650,
  • methods known to those skilled in the art can also increase the endogenous expression or activity of one of these sequences, e.g. by mutation of a UTR region, preferably the 5 'UTR, a promoter region, a genomic coding region for the active site, for binding sites, for localization signals, for domains, clusters, etc. such as e.g. coding regions for coiled coil, HEAT, FBOX, LRR, IBIB, C2, WD40, Beach, U-box, or AND domains.
  • the activity can be increased according to the invention by mutations which influence the secondary, tertiary, or quaternary structure of the protein.
  • Mutations can be introduced, for example, by EMS mutagenesis. Domains can be identified by appropriate computer programs, such as SMART, or InterPRO, eg as described in Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279 (38) 40053 (2004) or Mudgil Y., Plant Physiology, 134, 59 (2004 ), and writings mentioned therein. The suitable mutants can then be identified eg by Tilling (eg according to Henikoff et al., Plant Physiol. 135 (2), 630 (2004)).
  • the introduction and expression of a sequence of the invention into a plant, or the enhancement or modification of an endogenous sequence of the invention, optionally one or both of the untranslated regions, in a plant is combined with an increase in polypeptide amount, activity or function other resistance factors, preferably a Bax inhibitor 1 protein (BI-1), preferably the Bax inhibitor 1 protein from Hordeum vulgare (GenBank Acc. No .: AJ290421), from Nicotiana tabacum (GenBank Acc. No .: AF390556) , Rice (GenBank Acc. No .: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc. No .: AB025927) and Tobacco and Rape (GenBank Acc. No .: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)) or ROR2 (eg from barley (GenBank Acc. No .: AY246906),
  • BI-1 Bax inhibitor 1 protein
  • SnAP34 eg from barley (GenBank Acc.-No .: AY247208) and / or the lumenal binding protein BiP eg from rice (GenBank Acc.No. AF006825)
  • An increase can be achieved eg by mutagenesis or overexpression of a transgene ,
  • a reduction in the protein amount or activity or function of the proteins RacB eg from barley (GenBank Acc. No .: AJ344223)
  • CSL1 eg from Arabidopsis (GenBank Acc. No .: NM116593)
  • HvNaOX For example, from barley (GenBank Acc.- No .: AJ251717)
  • MLO eg from barley (GenBank Acc.-No. Z83834) combined with the inventive method.
  • MLO activity or function of MLO, BI-1 and / or NaOX
  • WO 98/04586 WO 00/01722
  • WO 99/47552 the other writings mentioned below are reduced or inhibited, the content of which is hereby expressly and expressis verbis with recorded, in particular to describe the activity and inhibition of MLO.
  • the description of the cited documents describes methods, methods and particularly preferred embodiments for reducing or inhibiting the activity or function of MLO, the examples specifically state how this can be carried out.
  • BI-1 The reduction of the activity or function and optionally the expression of BI-1 is described in detail in WO 2003/020939, which is hereby expressly and expressly incorporated herein by reference.
  • the specification of the cited document describes methods and methods for reducing or inhibiting the activity or function of BI-1, the examples specifically indicating how this can be carried out.
  • the reduction or inhibition of the activity or function of BI-1 is particularly preferably carried out according to the embodiments particularly preferred in WO 2003/020939 and the examples and in the organisms shown there as particularly preferred, in particular in a plant, eg constitutively, or in a part thereof, eg in a tissue, but especially at least in the epidermis or a substantial part of the epidermal cells.
  • the increase in the amount of polypeptide, activity or function of Bax inhibitor 1 protein from Hordeum vulgare (GenBank Acc. No .: AJ290421), from Nicotiana tabacum (GenBank Acc. No .: AF390556), rice (GenBank Acc. No .: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc. No .: AB025927) or tobacco and oilseed rape (GenBank Acc. No .: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)) or of ROR2 (eg from barley (GenBank Acc.
  • an increase in expression can be achieved as described herein.
  • increasing expression or function herein is meant both activation or enhancement of expression or function of the endogenous protein, including de novo expression, as well as an increase or increase by the expression of a transgenic protein or factor.
  • Order in the context of the invention means “non-human organisms” as long as the term refers to a viable multicellular organism, preferably plants.
  • Plants in the context of the invention means all dicotyledonous or monocyledonous plants Preferred plants are those which can be subsumed under the class of the Liliatae (monocotyledoneae or monocotyledonous plants) The term includes the mature plants, seeds, shoots and seedlings, as well as derived parts, reproductive material, plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures, as well as all other types of groupings of plant cells into functional or structural units.Red plants means plants at any stage of development beyond the seedling young, immature plant at an early stage of development.
  • dicotyledonous plants include the mature plants, seeds, shoots and seedlings, as well as derived parts, propagates, plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures, as well as all other types of groupings of plant cells into functional or structural units .
  • Mature plants means plants at any stage of development beyond the seedling. Keimling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant also includes annual and perennial dicotyledonous or monocotyledonous plants and includes, by way of example but not limitation, those of the genera, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum and Sac - charum.
  • the method is applied to monocotyledonous plants, for example from the family Poaceae, more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and saccharum, most preferably to plants of agricultural importance , such as Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), Sorghum bicolor (millet), Zea mays (maize), saccharum officinarum (sugarcane) or Oryza sative (rice).
  • the family Poaceae more preferably to the genera Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, and saccharum, most preferably to plants of agricultural importance , such as Hordeum vulgare (barley), Triticum aesti
  • Epidermis tissue or epidermis means the outer layers of tissues of the plants, it may be monolayer to multi-layered, there is epidermis "enriched” gene expression, e.g. Cer3, which can serve as a marker (Hannoufa A. Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
  • epidermis the skilled artisan preferably understands the predominant terminating tissue of primary aerial plant parts, such as the shoot, leaves, flowers, fruits and seeds, externally, the epidermal cells separate a water-repellent layer, the cuticle, and the roots are surrounded by the rhizodermis
  • the epidermis is similar in many respects, but also markedly different from it
  • the epidermis is formed from the outermost layer of the apicaemeristem, but the derivation of the rhizodermis is less clear Depending on the species, it can evolutionarily either the root cap or the primary bark be attributed.
  • the epidermis can be attributed numerous functions: It provides the plant protection against dehydration and regulates the transpiration rate It protects the plant from various chemical and physical external influences as well as animal and infestation by parasites. It is involved in gas exchange, the secretion of certain metabolites and the absorption of water. It contains receptors for light and mechanical stimuli. It acts as a signal transducer between environment and plant. According to the various functions, the epidermis contains a number of differently differentiated cells. There are also species-specific variants and different organization of the epidermes in the individual parts of a plant.
  • the "actual" epidermis cells the cells of the stomata (stomata) and the trichomes (Greek: trichoma, hair), epidermal appendages of various shapes, structures and functions.
  • epidermal cells constitute the major mass of the cells of the terminal tissue. They are either polygonal (of plate or tabular shape) or stretched in plan. The trained between them walls are often wavy or booked. What induces this form during development is unknown; the present hypotheses explain the situation only unsatisfactorily. Elongated epidermal cells are found on organs or organ parts which are self-stretched, e.g. on stems, petioles and leaf ribs as well as on the leaves of most monocotyledones.
  • the top and bottom of leaf blades may be covered by differently structured epidermis, whereby both the shape of the cells, the thickness of the walls, and the distribution and number of specialized cells (stomata and / or trichomes) per unit area may vary.
  • epidermis Most of the epidermis is single-layered, but have been detected in species from several families (Moraceae: here most Ficus species, Piperaceae: Peperonia [Peperonia], Begoniaceae, Malvaceae, etc.) multi-layered water-storing epidermis.
  • Cuticle which covers all epidermal surfaces as a continuous film. It can be either smooth or structured by protrusions, ridges, folds and furrows. However, a folding of the cuticle that is visible by viewing the surface is not always based on the formation of cuticular strips. There are certainly cases where a kutikulafaltung is only the expression of the underlying protuberances of the cell wall.
  • trichomes Epidermal appendages of various shapes, structures and functions are known as trichomes, also referred to herein as "epidermis” and appear as protective, supporting and glandular hairs in the form of dandruff, various papillae and roots as absorbing hair
  • Epithelial cells are involved in the formation of cells, often a trichome is formed from just one of these cells, sometimes several are involved in the formation.
  • papillae are protuberances of the epidermis surface
  • the textbook example of this is the papillae on flower surfaces of the pansy (viola tricolor) and the leaf surfaces of many species in the tropical rainforest. Forest. They give the surface a velvety consistency.
  • Some cells of epidermis can be designed as a water reservoir. A typical example is the bladder cells on the surfaces of many midday flowers and other succulents. In some plants, such as the campanula (Campanula persicifolia), the outer walls of the epidermis are thickened like a lens.
  • parenchymatous tissues The bulk of all tissues forms the ground tissue or parenchyma.
  • the parenchymatous tissues is the mesophyll, which may be differentiated in leaves in the parsed parenchyma and spongy parenchyma.
  • mesophyll the mesophyll
  • Parenchymatous cells are all living, mostly isodiametric, rarely elongated.
  • the pith of the shoots, the storage tissues of the fruits, seeds, the root and other subterranean organs are to be regarded as parenchyma as well as the mesophyll.
  • “Mesophyllic tissue” means the leaf tissue lying between the epidermis layers, consisting of the palisade tissue, the sponge tissue and the leaf veins.
  • the mesophyll is subdivided into palisade and sponge parenchyma in the leaves of most ferns and phanerogams, especially in the dicotyledons and many monocotyledons.
  • a "typical" leaf is dorsiventral built.
  • the palisade parenchyma is usually located on the upper side of the leaf just below the epidermis.
  • the sponge parenchyma fills the underlying space. It is interspersed with a voluminous intercellular system whose gas space is in direct contact with the outside world via the stomata.
  • the palisade parenchyma consists of elongated, cylindrical cells. In some species, the cells are irregular, sometimes they are forked (Y-shaped: armpalisadenparenchym). Such variants occur in ferns, conifers and a few angiosperms (for example in some ranunculaceae and caprifoliaceen species [example: elderberry]). In addition to the most widely used form of organization just described, the following variants have been demonstrated: Palisade parenchyma on the underside of the leaf. Especially noticeable in scale leaves. Example: Tree of Life (Thuja), as well as the leaves of wild garlic (Allium ursinum)
  • Palisade parenchyma on both sides of the leaf (top and bottom) is often found in plants of dry locations (xerophytes), e.g. in the compass plant (Lactuca serriola).
  • Ring-shaped closed palisade parenchyma is found, for example, in cylindrically organized leaves and in needles of the conifers.
  • the variability of the sponge parenchyma cells and the formation of the sponge parenchyma itself are even more diverse than those of the palisade parenchyma. It is usually referred to as a ventilation tissue, because it contains a large number of interconnected intercellular spaces.
  • the mesophyll may comprise the so-called assimilation tissue, but the terms mesophyll and assimilation tissue are not to be used as synonyms.
  • chloroplast-free leaves that differ only insignificantly in their structure from comparable, green leaves. Consequently, they contain mesophyll, but there is no assimilation; conversely, assimilation takes place, for example, in sprouts.
  • epidermis or epidermis cells can be characterized histologically or biochemically, including molecular biology.
  • the epidermis is characterized biochemically.
  • the epidermis may in one embodiment be characterized by the activity of one or more of the following promoters:
  • GLP4 acc. AJ310534; Wei.Y., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).
  • GLP2a acc. AJ237942, Swiss P., Plant J. 20, 541 (1999).
  • Prx7 acc. AJ003141, Kristensen B.K., Molecular Plant Pathology 2 (6), 311 (2001).
  • GerA acc. AF250933; Wu S., Plant Phys. Biochem. 38, 685 (2000).
  • RTBV acc. AAV62708, AAV62707; Klöti A., PMB 40, 249 (1999). Cer3; Hannoufa A., Plant J. 10 (3), 459 (1996).
  • the epidermis is characterized in that only a part of the promoters is active, e.g. 2, 3, 5 or 7 or more, but at least one of the above enumerated is active. In one embodiment, the epidermis is characterized in that all said promoters are active in the tissue or cell.
  • mesophyll or mesophyll cells can be biochemically characterized, including molecular biology or histology.
  • the mesophyll is biochemically characterized.
  • the mesophyll may in one embodiment be characterized by the activity of one or more of the following promoters:
  • PPCZmI PEPC
  • Kausch AP Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001).
  • OsrbcS Kyozuka J. et al., Plant Phys. 102 (3), 991 (1993).
  • OsPPDK acc. AC099041.
  • TaGF-2.8 acc. M63223; Swiss P., Plant J. 20, 541 (1999).
  • TaFBPase acc. X53957.
  • TaWISI acc. AF467542
  • HvBISI acc. AF467539; US 2002201 15849.
  • ZmMISI acc. AF467514; US 2002201 15849.
  • HvPRIA acc. X74939; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7 (2), 267 (1994).
  • HvPRI b acc. X74940; Bryngelsson et al. Mol. Plant Microbe Interact. 7 (2), 267 (1994).
  • HvPrx ⁇ acc. AJ276227; Kristensen B.K., Molecular Plant Pathology 2 (6), 311 (2001).
  • HvPAL acc. X97313; Wei, Y. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).
  • the mesophyll is characterized in that only a part of the promoters is active, e.g. 2, 3, 5 or 7 or more, but at least one of those enumerated above. In one embodiment, the mesophyll is characterized in that all of the promoters mentioned are active in the tissue or cell.
  • all of the promoters mentioned are active in the epidermis of a plant used or produced according to the invention or a plant according to the invention in the epidermis and mesophyll. In one embodiment, only a portion of the promoters mentioned are active, e.g. 2, 5, 7 or more, but at least one of the promoters enumerated above is active in each case.
  • Nucleic acids means biopolymers of nucleotides linked by phosphodiester bonds (polynucleotides, polynucleic acids) Depending on the type of sugar in the nucleotides (ribose or deoxyribose), a distinction is made between the two classes of ribonucleic acids (RNA) and deoxyribonucleic acids (DNA). ,
  • slaughter means all parts of plants obtained by agricultural cultivation of plants and collected during the harvesting process.
  • “Resistance” means preventing, repressing, reducing or attenuating disease symptoms of a plant that occur as a result of infestation by a pathogen.
  • the symptoms can be of a variety of types, but preferably include those which directly or indirectly lead to impairment of the quality of the plant, the quantity of the crop, the suitability for use as feed or food or even sowing, cultivation, harvesting or processing of the Harvest difficult.
  • the following disease symptoms are attenuated, reduced or prevented: formation of pustules and spore beds on the surfaces of the affected tissues, maceration of the tissues, spreading necrosis of the tissue, accumulation of mycotoxins e.g. from Fusarium graminearum or F. culmorum, penetration of the epidermis and / or mesophyll, etc.
  • an "increased pathogen resistance” means that the defense mechanisms of a particular plant or in a part of a plant, for example in an organ, a tissue, a cell or an organelle, by application of the method according to the invention in comparison to a suitable control, eg the wild type of the plant ("control plant", “starting plant”), to which the inventive method was not applied, under otherwise identical conditions (such as climatic or growing conditions , Pathogen species, etc.) has increased resistance to one or more pathogens.
  • control plant the wild type of the plant
  • starting plant to which the inventive method was not applied, under otherwise identical conditions (such as climatic or growing conditions , Pathogen species, etc.) has increased resistance to one or more pathogens.
  • a suitable control eg the wild type of the plant
  • starting plant e.g the wild type of the plant
  • the inventive method has increased resistance to one or more pathogens.
  • resistance is increased in the lemma, palea, and / or glume.
  • the increased resistance preferably manifests itself in a reduced expression of the disease symptoms, the disease symptoms also including, for example, the penetration efficiency of a pathogen into the plant or plant cell or the proliferation efficiency of the pathogen in or on the same, in addition to the above-mentioned impairments.
  • the disease symptoms are preferably reduced by at least 10% or at least 20%, more preferably by at least 40% or 60%, especially preferably by at least 70% or 80%, most preferably by at least 90% or 95% compared to the control plant.
  • the increased resistance expresses preference in a reduced expression of the disease symptoms, wherein disease symptoms - in addition to the above-mentioned impairments - also includes, for example, the penetration efficiency of a pathogen into the plant or plant cell or the proliferation in or on the same.
  • diseases in the cell wall structure can be a fundamental mechanism of pathogen resistance, such as e.g. shown in Jacobs A.K. et al., Plant Cell 15 (11), 2503 (2003).
  • Pathogen in the context of the invention means organisms whose interactions with a plant lead to the symptoms of the ailment described above, in particular pathogens refers to organisms from the kingdom of fungi. Pathogens are preferably understood to mean an epidermis or mesophyll cell-penetrating pathogen, particularly preferably pathogens which penetrate via stomata in plants and subsequently penetrate mesophyll cells. Organisms of the strains Ascomycota and Basidomycota are preferred. Particularly preferred are the families Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae and Hypocreaceae.
  • Ascomycota such as e.g. Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Septoria nodorum and Septoria tritici (tuber fimbriae on wheat), Basidiomycetes such as e.g. Puccinia graminis (black rust on wheat, barley, rye, oats), Puccinia recondita (brown rust on wheat), Puccinia dispersa (brown rust on rye), Puccinia hordei (brown rust on barley), Puccinia coronata (crown rust on oats).
  • Fusarium oxysporum Fusarium wilt on tomato
  • Septoria nodorum and Septoria tritici such as e.g. Fusarium oxysporum (Fusarium wilt on tomato), Septoria nodorum and Septoria tritici (tuber fimbriae on wheat
  • the method according to the invention contributes to resistance
  • Puccinia graminis f.sp. hordei barley stem rust
  • Blumeria graminis f.sp. hordei barley powdery mildew
  • Blumeria graminis f.sp. tritici (wheat mildew), Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae or Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust), and / or
  • Puccinia purpurea Fusarium monilifonne, Fusarium graminearum or Fusarium oxysporum, and / or
  • nucleic acid (molecule) in a preferred embodiment also comprises the untranslated sequence located at the 3 'and at the 5' end of the coding gene region: at least 500, preferably 200, particularly preferably 100 nucleotides of Sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least 100, preferably 50, more preferably 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region. Also particularly preferred in the present invention are isolated nucleic acid sequences. An “isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably does not have sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (eg, sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid; however, the above-mentioned embodiments including the 5 'and 3' UTR regions remain unaffected.
  • the isolated molecule may contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of nucleotide sequences that naturally contain the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell, from which the nucleic acid is derived flank. All of the nucleic acid molecules mentioned here may be, for example, RNA, DNA or cDNA.
  • nucleic acid molecules of the invention can be isolated using standard molecular biology techniques and the sequence information provided herein. Also, with the aid of comparison algorithms, such as e.g. on the NCBI homepage at http://www.ncbi.nlm.nih.gov, for example, a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions at the DNA or amino acid level can be identified. Significant portions of this sequence or the entire homologous sequence can be used as a hybridization probe using standard hybridization techniques (such as described in Sambrook et al., Supra) to isolate further useful nucleic acid sequences from other organisms by screening cDNA and cDNA / or genomic banks are used.
  • standard hybridization techniques such as described in Sambrook et al., Supra
  • nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers based on the sequences given here or parts thereof (eg, a nucleic acid molecule comprising the complete sequence or a part thereof, by polymerase chain reaction using isolated from oligonucleotide primers prepared on the basis of this same sequence).
  • mRNA can be isolated from cells (eg, by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)) and therefrom by reverse transcriptase (eg, Moloney MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL , Bethesda, MD or AMV Reverse Transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL).
  • reverse transcriptase eg, Moloney MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL , Bethesda, MD or AMV Reverse Transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification can be prepared based on the sequences disclosed herein.
  • a nucleic acid of the invention may be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers by standard PCR amplification techniques.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to a nucleotide sequence which codes for a protein according to the invention can be prepared by standard synthesis methods, for example with an automatic DNA synthesizer.
  • fragment of DNA refers to portions of the DNA that encode a protein of the invention whose biological activity is to mediate an increase in pathogen resistance (preferably fungal pathogen resistance).
  • fragments of the protein refers to portions of the protein whose biological activity is to mediate an increase in pathogen resistance (preferably fungal pathogen resistance) in plants.
  • Armadillo Repeat Arm1 polypeptide or “Armadillo Repeat ARM1 protein” or “arm” or “A ⁇ m1” and their modifications means in the context of the invention a protein with one or more Armadillo repeats.
  • an Armadillo Repeat ARM1 protein is understood as meaning a protein with a homology to one of the amino acids shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 or amino acid sequences shown in the figures, eg an armadillo repeat ARM1 polypeptide from barley (HvARM) according to SEQ ID NO: 2 and / or Rice (Oryza sative) according to SEQ ID NO: 4, 6, 8, and / or 10, and / or from tobacco (Nicotiana tabacum) according to SEQ ID NO .: 12 and / or from A.
  • HvARM barley
  • Rice Oryza sative
  • the invention relates to functional equivalents of the aforementioned polypeptide sequences.
  • polypeptide amount is meant, for example, the number of molecules or moles of armadillo repeat ARM1 polypeptide molecules in an organism, tissue, cell or cell compartment.
  • Increasing the amount of polypeptide means increasing the number of respective polypeptides in an organism, tissue, cell or cell compartment by a molar amount - for example, by any of the methods described below - as compared to a suitable control, e.g. the wild type (control plant) of the same genus and species to which this method was not applied, under otherwise identical conditions (such as culture conditions, age of the plants, etc.).
  • the increase is at least 5%, preferably at least 10% or at least 20%, particularly preferably at least 40% or 60%, very particularly preferably at least 70% or 80%, most preferably at least 90%, 95% or 99%, in particular 100%, more preferably more than 100%, preferably more than 150%, 200% or 300%.
  • Homology between two nucleic acid sequences means the identity of the nucleic acid sequence over the respective entire sequence length, which can be determined by comparison with the aid of the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Gene. tics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)) using the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • sequence which has a homology of at least 80% polypeptide-based with the sequence SEQ ID NO: 2 a sequence understood that in a comparison with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above-mentioned parameter a homology of at least 80%.
  • Amiadillo repeat is meant a sequence containing tandem copies of a degenerate sequence of about 42 amino acids which encodes a three-dimensional structure for mediating protein-protein interactions (Azevedo et al., Trends Plant Sci., 6, 354 (2001)).
  • the polypeptide used in the method of the present invention or the polypeptide of the present invention has an activity involved in intracellular signal transduction or regulation of gene expression in cellular development processes.
  • the Armadillo repeat ARM1 protein is encoded, for example, by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide having the sequence shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 , 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62;
  • nucleic acid molecule which comprises at least one polynucleotide of the sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 or 63;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or more to the sequences SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 having;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide recognized by a monoclonal antibody directed against a polypeptide encoded by the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • nucleic acid molecule which under stringent conditions with a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments consisting of at least 15 nucleotides (nt), preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt hybridized;
  • nucleic acid molecule which consists of a DNA library using a nucleic acid molecule according to (a) to (c) or its partial fragments of at least 15 nt, preferably 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt or 500 nt can be isolated as a probe under stringent hybridization conditions;
  • polypeptide coding sequence of the invention has no U box in the 5'-UTR.
  • the activity of ARM1 in lemma, palea, and / or glume is increased.
  • “Introduction” or “introduction” in the context of the invention includes all methods which are suitable for introducing a nucleic acid sequence according to the invention, directly or indirectly, into a plant or a cell, compartment, tissue, organ or semen thereof or there to generate.
  • the introduction can lead to a temporary (transient) or to a permanent (stable) presence of a nucleic acid sequence according to the invention.
  • Introduction includes, for example, methods such as transfection, transduction or transformation.
  • an expression cassette according to the invention into an organism or cells, tissues, organs, parts or seeds thereof (preferably in plants or plant cells, tissues, organs, parts or seeds) can advantageously be realized using vectors in which the Expression cassettes are included.
  • the expression cassette can be introduced into the vector (for example a plasmid) via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli cells. Correctly transformed E. coli cells are selected, grown and recovered the recombinant plasmid by methods familiar to those skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can serve to verify the cloning step.
  • the vectors may be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or agrobacteria.
  • the introduction of the expression cassette is realized by means of plasmid vectors. Preference is given to those vectors which enable a stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • epitope is meant the specificity of antibody-determining regions of an antigen (the antigenic determinant). An epitope is therefore the part of an antigen that actually comes into contact with the antibody.
  • Such antigenic determinants are the regions of an antigen to which the T-cell receptors respond and subsequently produce antibodies that specifically bind the antigenic determinant / epitope of an antigen.
  • Antigens or their epitopes are thus able to induce the immune response of an organism with the consequence of the formation of specific - directed against the epitope - antibody.
  • Epitopes consist of e.g. from linear sequences of amino acids in the primary structure of proteins, or from complex secondary or tertiary protein structures.
  • a hapten is an epitope extracted from the context of the antigenic environment. Although haptens have by definition directed an antibody to themselves, haptens may not be able to recover after e.g. Injecting into an organism to induce an immune response.
  • haptens are coupled to carrier molecules.
  • DNP dinitrophenol
  • BSA bovine serum albumine
  • Haptens are therefore particularly (often low molecular weight or small) substances that do not trigger an immune response themselves, but very well when coupled to a large molecular weight carrier.
  • the antibodies thus produced are also those which can bind the hapten alone.
  • the present invention relates to an antibody to a polypeptide characterized herein, more particularly to a monoclonal antibody that binds a polypeptide comprising or consisting of an AA sequence according to the sequences set forth in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 are shown.
  • Antibodies in the context of the present invention can be used for the identification and isolation of polypeptides disclosed according to the invention from organisms, preferably plants, particularly preferably monocotyledonous plants, or furthermore preferably dicotyledonous plants.
  • the antibodies may be monoclonal, polyclonal, or synthetic in nature, or may consist of antibody fragments such as Fab, Fv, or scFv fragments resulting from proteolytic degradation.
  • Single chain Fv (scFv) fragments are single-chain fragments which, linked by a flexible linker sequence, contain only the variable regions of the heavy and light antibody chains. Such scFv fragments can also be produced as recombinant antibody derivatives. A presentation of such antibody fragments on the surface of filamentous phage allows the direct selection of highly affine scFv molecules from combinatorial phage libraries.
  • Monoclonal antibodies can be obtained according to the method described by Kohler and Milstein (Nature 256, 495 (1975)).
  • “Functional equivalents" of an Armadillo-Repeat ARM1 protein preferably means such polypeptides as those represented by the sequences SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 have homology of at least 40% and have substantially the same properties or functions. Preferably, the homology is 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, most preferably 95%, 97%, 98%, 99% or more.
  • Functional equivalence can be determined, for example, by comparing the phenotypes of test organisms after expression of the respective polypeptides under as identical conditions as possible.
  • Substantially equivalent properties of a functional equivalent means primarily conferring a pathogen resistant phenotype or conferring or increasing pathogen resistance to at least one pathogen in increasing the polypeptide level, activity or function of said functional armadillo repeat ARM1 protein equivalent in a plant, organ , Tissue, part or cells, in particular in epidermis and / or Mesophyllzel- len thereof, preferably as measured by the penetration efficiency of a pathogen as shown in the examples.
  • Aligninous conditions means that all framework conditions such as culture or breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates, pathogen concentration, etc.) are kept substantially identical between the experiments to be compared and the approaches are determined solely by the sequence of the armadillo repeat ARM1 polypeptides, their source organism and optionally the pathogen to be compared.
  • “Functional equivalents” also means natural or artificial mutation variants of the Armadillo-Repeat ARM1 polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 , 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 as well as homologous polypeptides from other monocotyledons and dicotyledonous plants, which furthermore have essentially the same properties. Preferred are homologous polypeptides from preferred plants described herein.
  • the sequences of other plants homologous to the Armadillo-Repeat ARM1 protein sequences disclosed in this invention may be e.g. by database searching or screening of gene banks - using the Armadillo-Repeat ARM1 protein sequences as a search sequence or probe - can be easily found.
  • Functional equivalents may e.g. also of one of the polypeptides according to the invention according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42 , 44, 60, 61 or 62 are derived by substitution, insertion or deletion and to these polypeptides homology of at least 40%, 50, 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95%, especially preferably have at least 98% and are characterized by substantially the same functional properties as the polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
  • Functional equivalents are also those of the nucleic acid sequences according to the invention according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 nucleic acid molecules derived by substitution, insertion or deletion, and have a homology of at least 40%, 50, 60%, preferably 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, most preferably at least 98% to one of the polynucleotides according to the invention according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 and encode polypeptides having substantially identical functional properties as polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
  • Examples of the functional equivalents of the Armadillo repeat ARM 1 proteins to be increased in the method according to the invention as shown in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 may be derived, for example, from organ- men, whose genomic sequence is known to find by homology comparisons from databases.
  • Nucleic acid sequences described as 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, or parts thereof as a probe is a method familiar to those skilled in the art for identifying homologs in other species.
  • those of the nucleic acid sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 , 41, or 43 derived probes have a length of at least 20 bp, preferably at least 50 bp, more preferably at least 100 bp, most preferably at least 200 bp, most preferably at least 400 bp.
  • the probe may also be one or more kilobases long, e.g. 1 Kb, 1, 5 Kb or 3 Kb.
  • For the screening of the libraries can also be one of the under SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 sequences complementary DNA strand, or a fragment thereof of a length between 20 bp and several kilobases.
  • Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions depending on the application. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T. et al., In “Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57). or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions may be selected during the washing step from low-stringency conditions (approximately 2X SSC at 50 0 C) and high-stringency conditions (approximately 0.2X SSC at 50 0 C., preferably at 65 ° C) (2 O x SSC: 0 , 3M sodium citrate, 3M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature may range from low stringency conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions. be raised at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously or individually, keeping the other parameter constant.
  • denaturing agents such as formamide or SDS may also be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Hybridization conditions may be selected, for example, from the following conditions:
  • Washing steps may be selected, for example, from the following conditions:
  • the hybridization conditions are chosen as follows:
  • a hybridization buffer containing formamide, NaCl and PEG 6000 is chosen.
  • the presence of formamide in the hybridization buffer destabilizes double-stranded nucleic acid molecules, allowing the hybridization temperature to be lowered to 42 ° C without lowering the stringency.
  • the use of salt in the hybridization buffer increases the renaturation rate of a duplex DNA, or the hybridization efficiency.
  • PEG increases the viscosity of the solution, which has a negative influence on renaturation rates, the presence of the polymer in the solution increases the concentration of the probe in the remaining medium, which increases the rate of hybridization.
  • the composition of the buffer is:
  • the hybridizations are carried out at 42 ° C for about 12 hours, for example overnight.
  • the filters are then 3x with 2x SSC + 0.1% SDS for about 10 min. gewa- see.
  • Gene expression and “expression” are to be used synonymously and mean the realization of the information stored in a nucleic acid molecule.
  • the "modification" of nucleotide or amino acid sequences according to the invention preferably comprises their mutations or mutations.
  • “Mutations” in the sense of the present invention means the modification of the nucleic acid sequence of a gene variant in a plasmid or in the genome of an organism. For example, mutations may arise as a result of errors in replication or may be caused by mutagens. The rate of spontaneous mutations in the cell genome of organisms is very low, but a variety of biological, chemical or physical mutagens and methods for random or targeted mutation of nucleotide sequences, and thus potentially also for altering the amino acid sequences encoded by them, are known to those skilled in the art ,
  • Mutations include substitutions, additions, deletions of one or more nucleic acid residues. Substitutions are understood as meaning the exchange of individual nucleic acid bases, a distinction being made between transitions (substitution of a purine for a purine base or a pyrimidine for a pyrimidine base) and transversions (substitution of a pancy gene for a pyrimidine base (or vice versa).
  • Addition or insertion means the incorporation of additional nucleic acid residues into the DNA, which may lead to shifts in the reading frame.
  • Such frame shifts distinguish between “in frame” insertions / additions and “out of frame” insertions.
  • In “in-frame” insertions / additions the reading frame is preserved and a polypeptide increased by the number of amino acids encoded by the inserted nucleic acids is produced.
  • In “out of frame” insertions / additions the original reading frame is lost and the formation of a complete and functional polypeptide is no longer possible in many cases, depending of course on the location of the mutation.
  • Deletions describe the loss of one or more base pairs, which also result in "in frame” or “out of frame” shifts of the reading frame and the consequent consequences on the formation of an intact protein.
  • mutagenic agents useful for generating random or targeted mutations and the applicable methods and techniques are known to those skilled in the art.
  • Such methods and mutagens are e.g. described by van Harten A.M. ("Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998)), Friedberg E., Walker G., Siede W. ("DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing (1995)).
  • Sankaranarayanan K. Gentile JM, Ferguson LR ("Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences (2000)).
  • Chemical mutagens can be subdivided according to their mechanism of action.
  • base analogues eg 5-bromouracil, 2-aminopurine
  • monofunctional and bifunctional alkylating agents eg monofunctional such as ethyl methyl sulfonate, dimethyl sulfate or bifunctional such as dichloroethyl sulfite, mitomycin, nitrosoguanidine dialkylnitrosamine, N-nitrosoguanidine derivatives
  • intercalating Substances eg acridine, ethidium bromide.
  • Ionizing radiations are electromagnetic waves or particle radiations that are able to ionize molecules, ie to remove them from these electrons. The remaining ions are usually very reactive, so that if they arise in living tissue, they can cause great damage, for example to the DNA and (at low intensity) thereby induce mutations.
  • Ionizing radiations are, for example, gamma radiation (photon energy of about one megaelectron volt MeV), x-radiation (photon energy of several or many kiloelectron volts keV) or ultraviolet light (UV light, photon energy of more than 3.1 eV). UV light causes the formation of dimers between bases, most commonly thymidine dimers, which give rise to mutations.
  • EMS Ethylmethylsulfonate
  • Borchler JA Schwartz D., Biochem Genet 17 (1 1-12), 1173 (1979); Hoffmann GR, Mutat. Res. 75 (1), 63 (1980)
  • ionizing radiation by the use of biological mutagens eg Transposons (eg Tn5, Tn903, Tn916, TnIO00, Balcells et al., 1991, May BP et al., Proc Natl Acad., USA 100 (20), 11541 (2003)) or molecular biology methods such as mutagenesis Biol. 20 (5), 963 (1992)) by T-DNA insertion (Feldman KA, Plant J. 1, 71 (1991), Koncz et al., Plant Mol.
  • polypeptides for the process according to the invention which are obtained as a result of a mutation of a nucleotide sequence coding for a polypeptide according to the invention, e.g. according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 receives.
  • transgene is meant, for example, a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing said nucleic acid sequence or an organism transformed with said nucleic acid sequence, expression cassette or vector, all such genetically engineered constructions or organisms in which either
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the lineage or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • non-natural, synthetic methods such as For example, a mutagenization is changed.
  • Corresponding methods are described (US 5,565,350, WO 00/15815).
  • the enhancement of pathogen resistance according to the invention can also be achieved by limiting the expression of the plant's own, i. endogenous protein which corresponds to the protein according to the invention or an endogenous nucleotide sequence which represents a sequence according to the invention and which may also comprise the 5 'and / or 3' UTR region. It is therefore a plant-specific nucleotide or peptide sequence which mediates an increase in the pathogen resistance and which preferably has one or more arm dilillope repeat sequences, or an amino acid sequence according to the invention which codes for such a protein.
  • This manipulation can be achieved by any alteration of the sequence, preferably a mutation, but can also be achieved, for example, by a change in the promoter DNA sequence of the protein-encoding gene.
  • Such a change which results in an altered, preferably increased expression rate of the endogenous gene according to the invention, can be effected by deletion or insertion of DNA sequences.
  • a change in the 5'-UTR region as a whole and / or the promoter sequence of endogenous genes according to the invention generally leads to a change in the expressed amount of the gene and / or the function of the expressed gene or gene product, and thus preferably also to a change in the detectable in the cell or plants activity.
  • the alteration of the 5 'UTR region as a whole and / or the promoter sequence of the endogenous gene according to the invention can also lead to a change in the amount and / or function of a protein according to the invention in the cell.
  • Another way to increase the activity and content of the endogenous protein of the invention is to use transcription factors involved in the transcription of the corresponding endogenous gene, e.g. upregulate by overexpression.
  • transcription factors involved in the transcription of the corresponding endogenous gene e.g. upregulate by overexpression.
  • the measures for the overexpression of transcription factors are known to the person skilled in the art and are likewise disclosed in the context of the present invention for proteins according to the invention.
  • an increased expression of an endogenous gene according to the invention can be achieved in that a regulatory protein which does not occur in the non-transformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • a regulatory protein which does not occur in the non-transformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • a regulator may be a chimeric protein consisting of a DNA binding domain and a transcriptional activator domain, as described, for example, in WO 96/06166.
  • transformation a variety of methods are available (Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527 (1990)).
  • the DNA or RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can be permeabilized chemically, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can enter the cell by diffusion.
  • the DNA can also be introduced into the cell by protoplast fusion with other DNA-containing moieties such as minicells, cells, lysosomes or liposomes. Electroporation is another suitable method for introducing DNA, in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse.
  • transformation can also be carried out by bacterial infection by means of Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. The methods are described, for example, in Horsch et al. Science 225, 1229 (1985).
  • the expression cassette should be integrated into special plasmids, which may either be an intermediate vector (English: Shuttle or Intermediate Vector) or a binary vector. If a Ti or Ri plasmid is used for transformation, at least the right border, but in most cases both the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA is connected as flanking region with the introduced expression cassette.
  • binary vectors are used. Binary vectors can replicate in both E. coli and Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequences. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet.
  • the selection marker gene for example, the nptll gene, which confers resistance to kanamycin, allows selection of transformed agrobacteria.
  • the Agrobacterium acting as host organism in this case should already contain a helper Ti plasmid with the vir region, which is required for the transfer of the T-DNA to the plant cell.
  • Such transformed Agrobacterium can be used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA to transform plant cells has been extensively studied and described (EP 120 516, Hoekema, The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V. An et al., EMBO J. 4 , 277 (1985)).
  • Various binary vectors are known and are partially commercially available such as, for example, pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • plasmid In the case of injection or electroporation of DNA or RNA into plant cells, no special requirements are placed on the plasmid used. Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that an additional selectable marker gene be present on the plasmid.
  • Stably transformed cells i. those which incorporate the introduced DNA integrally into the DNA of the host cell can be distinguished from untransformed if a selectable marker is part of the introduced DNA (McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81 (1986)).
  • a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • any gene capable of conferring resistance to antibiotics or herbicides can function as a marker.
  • Transformed cells expressing such a marker gene are capable of surviving in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild-type.
  • Examples include the bar gene conferring resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore et al., Plant Mol. Biol. 21 (5), 871 (1993)), the nptll gene conferring resistance to kanamycin, the hpt- Gene conferring resistance to hygromycin, or the EPSP gene conferring resistance to the herbicide glyphosate.
  • the resulting plants can be grown and crossed in the usual way. Two or more generations should be cultured to ensure that genomic integration is stable and hereditary.
  • the construct to be expressed is cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example into pBini 9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)).
  • a complete plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is an example of callus cultures. From these still undifferentiated cell masses, the image of shoot and root can be induced in a known manner. The obtained sprouts can be planted out and bred.
  • a further subject of the present invention is a recombinant nucleic acid molecule comprising the following elements in the 5'-3 'orientation:
  • regulatory sequences of a promoter active in plant cells operatively linked thereto a DNA sequence according to the invention, optionally operatively linked thereto regulatory sequences which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in the plant cell.
  • said expression constructs / expression cassettes is a nucleic acid molecule whose expression (transcription and optionally translation) generates an "Armadillo-Repeat ARM1 protein compound", preferably in functional linkage with at least one genetic control element (for example a promoter), which ensures expression in plants - tet.
  • at least one genetic control element for example a promoter
  • plant-specific genetic control elements for example promoters
  • the "Armadillo Repeat ARM1 Protein Compound” can also be produced in other organisms or in vitro and then introduced into the plant. All prokaryotic or eukaryotic genetic control elements (for example promoters) which permit expression in the particular plant selected for the production are preferred in this.
  • operatively linked or “functionally linked” is meant, for example, the sequential arrangement of a promoter with the nucleic acid sequence to be expressed (for example an “armadillo repeat ARM1 protein compound") and, if appropriate, further regulative Elements such as a terminator such that each of the regulatory (or regulatory) elements can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, may also exert their function on the target sequence from more distant locations or even from other DNA molecules.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, more preferably less than 100 base pairs, most preferably less than 50 base pairs.
  • sequences can also be positioned between the two sequences, which, for example, have the function of a linker with specific restriction enzyme cleavage sites or a signal peptide.
  • insertion of sequences may result in the expression of fusion proteins.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can be present integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • the method according to the invention can advantageously be combined with further methods which bring about a pathogen resistance (for example against insects, fungi, bacteria, nematodes etc.), stress resistance or another improvement of the plant properties.
  • a pathogen resistance for example against insects, fungi, bacteria, nematodes etc.
  • stress resistance or another improvement of the plant properties. Examples are u.a. referred to as Dunwell J.M., J. Exp. Bot. 51, (Spec No.) 487 (2000).
  • the production or enhancement of the function of an Armadillo-Repeat ARM1 protein in a plant is combined with an increase in the activity of a Bax inhibitor 1 protein.
  • This can be accomplished, for example, by expression of a nucleic acid sequence encoding a Bax inhibitor-1 protein, e.g. in mesophyll tissue and / or root tissue.
  • Nicotiana tabacum particularly preferred.
  • Another object of the invention relates to nucleic acid molecules encoding nucleic acid molecules for armadillo repeat ARM1 proteins from barley according to the polynucleotides SEQ.
  • Another object of the invention relates to the armadillo repeat ARM1 protein from barley according to SEQ. ID No .: 2 or one comprising these sequences, as well as functional equivalents thereof which are not one of the sequences of SEQ ID Nos. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, or 44, respectively.
  • transgenic expression cassettes comprising one of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the nucleic acid sequence encoding the Armadillo-Repeat ARM1 proteins from barley, wheat and maize is linked to at least one genetic control element as defined above in such a way that expression (transcription and optionally translation) in any organism - preferably in monocotyledonous plants - can be realized. Suitable genetic control elements are described above.
  • the transgenic expression cassettes may also contain other functional elements as defined above.
  • Such expression cassettes contain, for example, a nucleic acid sequence according to the invention, e.g. one which is essentially identical to a nucleic acid molecule according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 , 37, 39, 41, or 43 or a fragment according to the invention thereof, wherein said nucleic acid sequence is preferably in sense orientation or in antisense orientation to a promoter and thus can lead to the expression of sense or antisense RNA, wherein said promoter is an active in plants promoter, preferably a pathogen-inducible promoter.
  • transgenic vectors which include said transgenic expression cassettes.
  • Plant-specific promoters basically means any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues, cultures.
  • the expression may be, for example, constitutive, inducible or developmentally dependent.
  • Constant promoter means those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a longer period of plant development, preferably at all times of plant development.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of CaMV (cauliflower mosaic virus) (Franck et al., Cell 21, 285 (1980); Odell et al., Nature
  • the ubiquitin 1 promoter (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18, 675 (1992); Bruce et al., Acac., USA, 86, 9692 (1989)), the Smas promoter, the cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter (US 5,683,439), the promoters of the vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91 / 13991), as well as other promoters of genes whose constitutive expression in plants is known to the person skilled in the art.
  • constitutive promoter particularly preferred is the
  • A. thaliana nitrilase-1 (nit1) gene (GenBank Acc. No .: Y07648.2, nucleotides 2456-4340, Hillebrand et al., Gene 170, 1997 (1996)).
  • promoters having specificities for the anthers, ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds are used.
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseolin (US 5,504,200, Bustos et al., Plant Cell 1 (9), 839 (1989)), 2S-albumining (Joseffson et al., J. Biol. Chem. 262, 12196 (1987)), the legume (Shirsat et al., Mol. Gen. Genet., 215 (2), 326 (1989)), the USP (unknown seed protein, Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 3), 459 (1991)), the napin gene (US 5,608,152, Stalberg et al., L.
  • phaseolin US 5,504,200, Bustos et al., Plant Cell 1 (9), 839 (1989)
  • 2S-albumining Jaseffson et al., J. Biol. Chem. 262, 12196 (1987)
  • the legume Shirsat et al., Mol. Gen. Genet.,
  • seed-specific promoters are those of the genes coding for the High Molecular Weight Glutenin (HMWG), gliadin, branching enzyme, ADP-glucose pyrophosphatase (AGPase) or the starch synthase. Further preferred are
  • Promoters that allow seed-specific expression in monocotyledons such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • the promoters of the lpt2 or lpt1 gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene , the prolamine gene, the gliadin gene, the zein gene, the kasirin gene or the
  • Tuber, storage-root or root-specific promoters are, for example, the platinum promoter class I (B33) and the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato.
  • Leaf-specific promoters are, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of Rubisco (ribulose). 1, 5-bisphosphate carboxylase) or potato ST-LSI promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)).
  • Epidermis-specific promoters are, for example, the promoter of the OXLP gene ("oxalate oxidase-like protein"; Wei et al., Plant Mol. Biol.
  • tissue specific promoters are e.g. Flower specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the Prr gene (WO 98/22593) and anther specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the global Promoter and the ⁇ -zein promoter.
  • Flower specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the Prr gene (WO 98/22593)
  • anther specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the global Promoter and the ⁇ -zein promoter.
  • the expression cassettes may also contain a chemically inducible promoter (reviewed in Gatz et al., Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 48, 89 (1997)), which expresses the expression of the exogenous gene in the plant Timing can be controlled.
  • a chemically inducible promoter as e.g. Biol. 22: 361 (1993)
  • a salicylic acid inducible promoter WO 95/19443
  • a benzenesulfonamide inducible promoter EP 0 388 186
  • a tetracycline inducible promoter Promoter (Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992))
  • an abscisic inducible promoter EP 0 335 528) or an inducible by ethanol or cyclohexanone promoter (WO 93/21334)
  • WO 93/21334 can also be used .
  • active promoters which are pathogen-inducible promoters are used in plants.
  • Pathogen-inducible promoters include the promoters of genes induced as a result of pathogen attack, such as genes of PR proteins, SAR proteins, ⁇ -1,3-glucanase, chitinase, etc. (for example, Redolfi et al., Neth Plant Pathol 89, 245 (1983), Uknes et al., Plant Cell 4, 645 (1992); Van Loon Plant Mol. Viral.
  • wound inducible promoters such as the pinll gene (Ryan, Ann., Rev. Phytopath, 28, 425 (1990), Duan et al., Nat. Biotech., 14, 494 (1996)), the Woo1 and wun2 gene (US 5,428,148), the win1 and win2 genes (Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215, 200 (1989)), the systemin gene (McGurl et al., Science 225, 1570 (1990); 1992)), the WIP1 gene (Rohmeier et al., Plant Mol. Biol. 22, 783 (1993), Eckelkamp et al., FEBS Letters 323, 73 (1993)), the MPI gene (Corderok et al. , Plant J. 6 (2), 141 (1994)) and the like.
  • a source of further pathogen-inducible promoters is the PR gene family.
  • a number of elements in these promoters have proven to be advantageous.
  • the nucleotide region of nucleotide -364 to nucleotide -288 in the promoter of PR-2d mediates salicylate specificity (Buchel et al., Plant Mol. Biol. 30, 493 (1996)).
  • the sequence 5'-TCATCTTCTT-3 'appears repeatedly in the promoter of the barley ß-1, 3-glucanase and in more than 30 other stress-induced genes. This region binds a nuclear protein in tobacco, the amount of which is increased by salicylate.
  • the PR-1 promoters from tobacco and Arabidopsis are likewise suitable as pathogen-inducible promoters.
  • the "acidic PR-5" (aPR5) promoters are from barley (Schweizer et al., Plant Physiol. 114, 79 (1997)) and wheat (Rebmann et al., Plant Mol. Biol. 16, 329 (1991)).
  • aPR5 proteins accumulate in about 4 to 6 hours after pathogen attack and show very little
  • pathogen-inducible promoters include the flax Fis1 promoter (WO 96/34949), the Vst1 promoter (Schubert et al., Plant Mol. Biol. 34, 417 (1997)) and the tobacco EAS4 sesquiterpene cyclase promoter (US 6,100,451).
  • promoters induced by biotic or abiotic stress such as the pathogen-inducible promoter of the PRP1 gene (or gst1 promoter, for example). Biol. 22, 361 (1993)), the heat-inducible hsp70 or hsp ⁇ O promoter from tomato (US 5,187,267), the cold-inducible alpha-amylase promoter from the Potato (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter (EP-A 0 375 091).
  • the pathogen-inducible promoter of the PRP1 gene or gst1 promoter, for example.
  • Mesophyllic tissue means the leaf tissue lying between the epidermis layers, consisting of the palisade tissue, the sponge tissue and the leaf veins.
  • mesophyll tissue-specific promoters such as, for example, the promoter of the wheat germin 9f-3.8 gene
  • GenBank Acc. No .: M63224 or the barley GerA promoter (WO 02/057412). Said promoters are particularly advantageous because they are both mesophyll tissue-specific and pathogen-inducible. Also suitable is the mesophyll tissue specific Arabidopsis CAB-2 promoter (GenBank Acc. No .: X15222), as well as the Zea mays PPCZmI promoter (GenBank Acc. No .: X63869) or homologs thereof.
  • Mesophyll tissue-specific means a restriction of transcription of a gene to as few mesophyll tissue-containing plant tissue as possible due to the specific interaction of cis elements present in the promoter sequence and transcription factors binding to it, preferably a transcription restricted to the mesophyll tissue.
  • PPCZmI PEPC; Kausch, Plant Mol.
  • Epidermis tissue or epidermis means the outer tissue layers of the plants
  • Epidermis can be one to several layers; there is epidermis-enriched gene expression, such as Cer3, which can serve as a marker (Hannoufa, Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
  • the skilled artisan preferably understands the predominant terminal tissue of primary aerial plant parts, such as the shoot, leaves, flowers, fruits and seeds.
  • suitable promoters are, for example, fertility-specific promoters, such as, for example, the fruit maturation-specific promoter from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • Developmentally-dependent promoters include, in part, the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is naturally development-dependent.
  • constitutive, as well as leaf and / or stem-specific, pathogen-inducible, root-specific, mesophyll-tissue-specific promoters wherein constitutive, pathogen-inducible, mesophyll-tissue-specific and root-specific promoters are most preferred.
  • promoters may also be operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which allow expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • all promoters described above are suitable as plant promoters.
  • a second step by means of cDNA clones based on poly (A) + RNA molecules from another tissue, from the first bank by hybridization those clones are identified whose corresponding poly (A) + RNA molecules accumulate only in the desired tissue. Subsequently, with the aid of these cDNAs thus identified promoters are isolated, which have tissue-specific regulatory elements.
  • tissue-specific regulatory elements The skilled person is also available further PCR-based methods for the isolation of suitable tissue-specific promoters.
  • nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be used with further genetic control sequences in addition to a promoter. tively linked.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the production or the function of the recombinant nucleic acid molecule according to the invention. Genetic control sequences, for example, modify transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention 5'-upstream of the respective transgenic nucleic acid sequence comprise a promoter with a specificity as described above and 3'-downstream terminator sequence as additional genetic control sequence, and optionally further conventional regulatory elements, in each case functionally linked to the transgenic to be expressed nucleic acid sequence.
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • the tissue-specific expression can additionally take place as a function of specific stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, water stress, abscisic acid (Lam E. and Chua NH, J. Biol. Chem. 266 (26), 17131 (1991)) and heat stress (Schoffl F. et al., Mol. Gen. Genet. 217 (2-3), 246 (1989)).
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions (5'-UTR), introns or the non-coding 3' region of genes such as the actin-1 intron, or the Adh1-S introns 1, 2 and 6 ( generally, "The Maize Handbook," Chapter 16, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). These have been shown to play a significant role in the regulation of gene expression.
  • 5'-untranslated sequences may enhance the transient expression of heterologous genes, for example the translational enhancer 5'-leader sequence from the tobacco mosaic virus may be mentioned (GaIMe et al., Nucl. Acids Res., 15, 8693 (1987 They may further promote tissue specificity (Rouster J. et al., Plant J.
  • the recombinant nucleic acid molecule may advantageously contain one or more so-called enhancer sequences functionally linked to the promoter, which allow increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the transgenic nucleic acid sequences to be expressed additional advantageous sequences can be inserted, such as other regulatory elements or terminators. To express the transgene- The nucleic acid sequences may be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals which are suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al., EMBO J 3, 835 (1984)) or functional equivalents thereof.
  • particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopaline synthase) terminator.
  • Control sequences are furthermore to be understood as meaning those which permit homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or permit removal from the genome.
  • the natural promoter of a particular gene may be replaced with a promoter having specificity for the embryonic epidermis and / or the flower.
  • a recombinant nucleic acid molecule and a vector derived therefrom may contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the nucleic acid molecules, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the nucleic acid molecules, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • Deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin. Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides.
  • NPTII gene conferring resistance to kanamycin or geneticinidine
  • HPT hyperglycine phosphotransferase
  • ALS acetolactate synthase gene
  • ALS acetolactate synthase gene conferring resistance to sulfonylurea herbicides (eg mutant ALS variants with, for example, the S4 and / or Hra mutation), as well as the acetolactate synthase gene (ALS), which confers resistance to imidazolinone herbicides.
  • Reporter genes which code for easily quantifiable proteins and ensure an evaluation of the transformation efficiency or of the expression site or time point via intrinsic color or enzyme activity. Very particular preference is given to reporter proteins (Schenborn and Groskreutz, Mol. Biotechnol. 13 (1), 29 (1999)), such as the "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al., Plant Journal 8 (5 777 (1995); Haseloff et al., Proc. Natl.
  • a selectable marker which confers on the successfully transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as
  • the present invention furthermore relates to transgenic plant cells and transgenic plants which comprise a nucleic acid sequence or a recombinant nucleic acid molecule according to the invention, and also parts of the plants, transgenic harvest products and transgenic propagation material of these plants, such as protoplasts, plant cells, callosis, seeds, tubers, cuttings, as well as the transgenic offspring of this plant.
  • Another object of the invention relates to plants which contain by natural processes or artificially induced one or more mutations in a nucleic acid molecule, the the nucleic acid sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, wherein said mutation is an increase in the activity, function or polypeptide amount of one of the nucleic acid molecules according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 1, 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43 causes coded polypeptide. For example, one made by Tilling and identified mutation.
  • the invention relates to a plant, in particular a monocotyledonous plant, containing a nucleic acid sequence according to the invention which contains a mutation which causes an increase in the activity of one of the proteins encoded by the nucleic acid molecules according to the invention in the plant or parts thereof.
  • the mutation relates to one or more amino acid residues which is marked as conserved or highly conserved in the consensus sequence shown in the figures.
  • a further subject of the invention therefore relates to transgenic plants transformed with at least
  • nucleic acid sequence comprising nucleic acid molecules according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, or 43, or the complementary nucleic acid sequences for functional equivalents of the polypeptides according to SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 or 62 encoding nucleic acid molecules;
  • transgenic expression cassette comprising one of the nucleic acid sequences of the invention, or a vector of the invention, and cells, cell cultures, tissues, parts - such as in plant organisms leaves, roots, etc. - or propagating material derived from such organisms.
  • the plant according to the invention or the plant used according to the invention is not Arabidopsis thaliana.
  • transgenic organisms are preferred as “transgenic organisms.”
  • the transgenic organism is a mature plant, seed, shoot, and seedling, as well as derived parts, propagation material, and cultures, for example Cell culture.
  • “Mature plant” means plants any stage of development beyond the seedling.
  • “Seedling” means a young, immature plant at an early stage of development
  • Especially preferred plants as host organisms are plants to which the method according to the invention can be applied for the achievement of a pathogen resistance according to the abovementioned criteria monocotyledonous plant such as wheat, oats, millet, barley, rye, maize, rice, buckwheat, sorghum, triticale, spelled or sugarcane, in particular selected from the species Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp .spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), Sorghum bicolor (millet), Zea mays (corn), Saccharum officinarum (sugar cane) or Oryza sativa (rice).
  • the production of the transgenic organisms can be accomplished by the above-described methods of transforming or transfecting organisms.
  • transgenic plants are preferred which have increased Bax inhibitor 1 activity in mesophyll cells or root cells, particularly preferred are transgenic plants to the family belong to the Poaceae and have increased Bax inhibitor 1 activity in mesophyll cells or root cells, most preferred are transgenic plants selected from the plant genera Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum and Oryza, most preferably the plant species Hordeum vulgare (barley), Triticum aestivum (wheat), Triticum aestivum subsp.spelta (spelled), triticale, Avena sative (oats), Seeale cereale (rye), sorghum bicolor (millet), Zea mays (maize), Saccharum officinarum ( Sugarcane) and Oryza sative (rice).
  • transgenic plants selected from the plant genera Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum and Oryza
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms of the invention and the cells derived from them, cell cultures, parts - such as in transgenic plant organisms roots, leaves, etc.-, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food - or animal feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the invention further relates to a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms wherein a host organism or a part thereof is transformed with one of the above-described expression nucleic acid molecules and said expression cassette contains one or more structural genes corresponding to the desired fine chemical or catalyze the biosynthesis of the desired fine chemical, the transformed host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the culture medium.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavorings, flavorings and dyes. Particularly preferred is the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids.
  • the expression of a structural gene can also be effected or influenced independently of the execution of the method according to the invention or the use of the articles according to the invention.
  • SEQ ID NO: 60, 61, 62 consensus sequences of the polynucleotide SEQ ID NO. from 1st to 22nd
  • SEQ ID NO: 64 5'UTR from HvArm The figures show:
  • FIG. 1 Nucleic acid sequences of ARM1 from barley, rice, and Arabidopsis thali- ana.
  • Figure 2 Polypeptide sequences of ARM1 from barley, rice, and Arabidopsis thaliana.
  • Figure 3 Sequence comparison of ARM1 protein sequences polypeptides from barley, rice, and Arabidopsis thaliana.
  • FIG. 4 Increase of the mildew resistance of wheat by introducing and expressing ARM repeat sequences
  • FIG. 5 Consensus sequences of the sequence comparison of ARM1 protein sequences
  • FIG. 6 Nucleic acid sequence of barley ARM1 including the 5 'UTR
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of E. coli cells, culture of bacteria, propagation of phage and sequence analysis of recombinant DNA are performed as described in Sambrook et al. Coed Spring Harbor Laboratory Press (1989); ISBN 0-87969-309-6 described.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules is carried out using a laser fluorescence DNA sequencer from MWG-Licor according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc Natl Acad. See U. S.A. 74, 5463 (1977)).
  • the golden variety Golden Promise comes from Patrick Schweizer, Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research Gatersleben.
  • the variety Pallas and the backcrossed line BCIngrid-mlo5 were provided by Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark. Their preparation is described (Koller et al., Crop. Sci. 26, 903 (1986)).
  • the wheat variety Chancellor also comes from Patrick Schweizer, Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research Gatersleben.
  • the plants are limiting in air conditioning or chambers at a daytime temperature of 24 ° C, at night cultured 20 0 C, 50 to 60% relative humidity and a 16 / ⁇ sthyroiden dark cycle with 30000 lux.
  • the wheat powdery mildew Blumeria graminis (DC) spear f. sp. used tritici. This mildew was isolated from field crops. Offspring of the inoculum are grown in climatic chambers under the same conditions as described above for barley and wheat plants by transferring the conidia of infested plant material to regularly grown, 7 day old plants at a density of 100 conidia / mm 2 .
  • RNA Extraction Buffer AGS, Heidelberg, Germany
  • central primary leaf segments of 5 cm in length are harvested and homogenized in liquid nitrogen in mortars.
  • the homogenate is stored at -70 0 C until RNA extraction.
  • RNA extraction kit (AGS, Heidelberg). This is done by adding 200 mg of the frozen leaf material in one Overlay microcentrifuge tubes (2 ml) with 1.7 ml RNA extraction buffer (AGS) and mix well immediately. After addition of 200 .mu.l chloroform is mixed well again and shaken at room temperature for 45 min on a horizontal shaker at 200 U / min. The mixture is then centrifuged for 15 minutes at 20000 g and 4 ° C for phase separation, the upper (aqueous) phase transferred to a new microcentrifuge tube and the lower discarded.
  • AGS RNA extraction kit
  • the aqueous phase is again purified with 900 ⁇ l of chloroform by homogenizing 3 times for 10 seconds and centrifuging again (see above) and lifting off.
  • 850 ⁇ l of 2-propanol are then added, homogenized and placed on ice for 30 to 60 minutes. Following that is centrifuged for 20 minutes (see above), the supernatant was carefully decanted, 2 ml of 70% ethanol (-20 0 C) were pipetted, mixed and centrifuged again for 10 min. The supernatant is then decanted again and the pelet carefully freed with a pipette of liquid residues before it is dried at a clean air workplace in the clean air stream.
  • RNA is dissolved in 50 ⁇ L DEPC water on ice, mixed and centrifuged for 5 min (see above). 40 .mu.l of the supernatant are transferred as RNA solution to a new microcentrifuge tube ported and stored at -70 0 C.
  • the concentration of RNA is determined photometrically.
  • the concentrations of the RNA solutions are subsequently adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ L with DEPC water and checked in the agarose gel.
  • RNA concentrations in the horizontal agarose gel 1% agarose in 1 ⁇ MOPS buffer with 0.2 ⁇ g / mL ethidium bromide
  • 1 ⁇ l RNA solution with 1 ⁇ L 10 ⁇ MOPS, 1 ⁇ L color marker and 7 ⁇ L DEPC water offset according to their size at 120 V voltage in the gel in 1x MOPS running buffer over 1, 5 h separated and photographed under UV light. Any concentration differences of the RNA extracts are compensated with DEPC water and the adjustment is checked again in the gel.
  • RNA from barley epidermis was used as a template.
  • the RNA was isolated from epidermal cells of barley Ingrid + Bgt at 12 h and 24 h after infection.
  • the cDNA sequence of HvArm was extended by RACE technology using the GeneRacer Kit (INVITROGENE Life Technologies). For this purpose, 4000 ng total mRNA, 1 ⁇ L 10xCIP buffer, 10 units RNAse inhibitor, 10 units CIP ("calf intestinal phosphatase") and DEPC-treated water were up to a total volume of 10 ⁇ L for 1 h at 50 0 C treated. To precipitate the RNA, an additional 90 ⁇ L DEPC water and 100 ⁇ L phenokloroform were added and thoroughly mixed for about 30 seconds.
  • the upper phase was mixed with 2 ⁇ l of 10 mg / ml Mussei glycogen, 10 ⁇ l of 3 M sodium acetate (pH 5.2) in a new microreaction vessel. 220 ⁇ l of 95% ethanol was added and the mixture was incubated on ice. Subsequently, the RNA was precipitated by centrifugation for 20 min at 20,000 g and 4 ° C. The supernatant was discarded, 500 .mu.l 75% ethanol added, vortexed briefly and again centrifuged for 2 min (20,000 g).
  • RNA CAP structures were removed by adding 1 ⁇ l 1 OxTAP buffer, 10 units RNAsin and 1 unit TAP ("tobacco acid pyrophosphatase"). The mixture was incubated for 1 h at 37 ° C and then cooled on ice. The RNA was again - as described above - precipitated and transferred into a reaction vessel with 0.25 ug GeneRacer oligonucleotide primer. The oligonucleotide primer was resuspended in the RNA solution, the mixture incubated for 5 min at 70 0 C and then cooled on ice.
  • RNA was again precipitated as described above and resuspended in 7 ⁇ l of DEPC water.
  • Ten pmoles of GeneRacer oligo-dT primer and two ⁇ L of each dNTP solution (25 mM) were added to the RNA, heated to 70 ° C. for 10 min, and cooled again on ice.
  • the reaction was incubated at 50 ° C for 50 minutes.
  • GR 5 ' primer (Invitrogen): 5 ' cgactggagcacgaggacactga 3 ' (Seq ID No .: 47)
  • GR 3 ' primer (Invitrogen): 5 ' GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3 ' (Seq ID No .: 51)
  • the batch (total volume 50 ⁇ l) had the following composition:
  • the PCR gave a product of about 850bp.
  • the resulting PCR product was isolated on a 1% A garose gel, extracted from the gel and cloned into pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) by means of T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is thus identical to the armadillo sequence of barley.
  • the batch (total volume 50 ⁇ l) had the following composition:
  • PCR revealed a product of 1326bp.
  • the resulting PCR product was isolated on a 1% agarose gel, extracted from the gel and cloned into pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) by T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is thus identical to the armadillo sequence of barley.
  • BAC clones carrying the sequence of the invention were identified by PCR using primers 5 'TAA TGA TAA TCT TCC TAA TAC CCG TCA G and 5' CCT TTG AGG GGC AGA AGA GAT AG. Two overlapping BAC clones # 705A01 and # 581D24 were identified, which contained the identity HvARM gene.
  • BAC DNA of a single clone was isolated by Qiagen column (Maxi kit, Qiagen, isolation according to manufacturer's protocol).
  • Qiagen column Maxi kit, Qiagen, isolation according to manufacturer's protocol.
  • shear Hadroshear: Genomic Solutions
  • 5 - 10 kbp fragments were generated from this BAC DNA and filled the resulting ends with Klenow to blunt ends (reaction according to the manufacturer's protocol).
  • the selection of the fragment lengths took place via a 0.8% agarose gel in 0.5% TBE.
  • the corresponding fragment length region was excised from the gel and the DNA was eluted from the agarose gel using Qiagen Gel Extraction Kit (elution according to the manufacturer's protocol).
  • the eluted 5-10 kbp fragments are ligated into an EcoRV linearized pBluescript II SK (-) vector with smooth dephosphorylated ends (restriction and dephosphorylation according to the manufacturer's instructions) and transformed into highly competent E. coli cells by chemical-thermal transformation. Subsequently, the transformants are randomized using a picking robot (Qpick, Genetix) and transferred to microtiter plates with LB medium.
  • a picking robot Qpick, Genetix
  • the PCR was chosen because of its high sensitivity for the detection of the desired DNA sequence.
  • the analysis was carried out in 20 ⁇ l reaction volume.
  • the reaction consisted of 10 mM Tris-HCl, pH 9.0; 50 mM KCl; 0.1% Triton X-100, 0.2 mM dNTP; 2 mM MgCl 2, 0.6 ⁇ M each of oligonucleotides and Taq polymerase (concentration in the reaction mixture: ⁇ 1 U ⁇ h 1 ). Either 10ng of BAC pool DNA or 2 ⁇ l of bacterial culture (for colony PCR) was used per reaction.
  • the BAC DNA to be amplified and the primers were initially charged and then mixed with the PCR reaction mixture.
  • the template was heated to 95 ° C for 5 minutes prior to the addition of the PCR reaction mixture.
  • an initial 5 min step at 95 ° C was used.
  • the touch-down PCR reaction was carried out in the sections 30 sec 95 ° C; 30 sec temperature T and 60 sec 72 ° C for the first 10 cycles where T in the first cycle is 60 0 C and is lowered by 0.5 0 C for each cycle. Another 30 cycles were carried out in the sections 30 sec 95 ° C; 30 sec 55 ° C and 60 sec 72 ° C.
  • primer pairs 5 'ACC GAC TAG TCA CCA CCA CC ACC ACCA (containing a Spei site) and 5' GCA GGG CCC AGC GCC AGT CAA CAA CAA TAA C (contains an Apal interface) and BAC 705A01 as a template isolated by PCR a 3.0 Kbp fragment containing the full-length sequence of HvARM.
  • the PCR reaction was carried out under the following conditions: Reaction Buffer - 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM KCl, 1% (v / v)
  • Triton X-10 0.1 mg / ml BSA, 1 mM MgSO4, each dNTPs 0.2 mM, each 1 ⁇ M primer, 2.5 U
  • the Temerpatur program was: 94 ° for 2 min; then 5 cycles of 94 °, 30 sec 50 0 C, where the temperature at each cycle by 2 ° C (touchup) was raised to 60 0 C; thereafter 30 cycles of 94 ° C for 30 sec, 60 0 C for 30 seconds, 72 ° C for 6 min; Finally, an extension reaction was added at 72 ° C for 7 min.
  • the 3.0 Kbp PCR amplicon was digested with Apal and Spei, the DNA eluted from an agarose gel and cloned into Apal / Spel-digested plPKTA9 vector for transient overexpression.
  • MWG 32b 5 'gactcacactactctaatacc 3' (SEQ ID No .: 58)
  • the batch (total volume 50 ⁇ l_) had the following composition (the gene was divided into two parts for the PCR because of its size of 2775 bp):
  • the PCR gives a product of 1 143bp and 1705bp, respectively.
  • the resulting PCR product is isolated on a 1% agarose gel, extracted from the gel and cloned into pCR4-Topo (Invitrogen Life Technologies) by T-overhang ligation and sequenced.
  • the sequence reproduced under SEQ ID NO: is therefore identical to the Arabidopsis thaliana armadillo sequence.
  • the 1705bp PCR product is cloned into pUC18. This is followed by the cloning of AtArm 1 143bp into pUC18 AtArm 1705bp.
  • Example 6 Transient expression in barley and wheat by particle bombardment
  • pUbiGUS - GUS overexpression reporter gene construct (Schweizer et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (8), 647 (1999)).
  • plPKTA9 - Blank vector control (Zimmermann et al., Plant Physiology 142, 181 (2006)), plPKTA9_ARM40F - plPKTA9-based.
  • HvARM overexpressing construct BAC 581 D24 - HvARM containing BAC clone
  • the particles were introduced in a vacuum (3.6 ⁇ 10 3 Pa) by a helium pressure wave of 7.6 ⁇ 10 6 Pa onto 7 leaf segments of 7-day-old barley or wheat plants (barley: Golden Promise variety, wheat: Kanzler variety).
  • the leaf segments were placed in a Petri dish to 0.5% (w / v) Phytoagar, which was mixed with 20 ug mh 1 benzimidazole.
  • the leaves were then incubated C. and indirect daylight for 4 h at +20 0th
  • the bombarded leaves were transferred to 1% (w / v) phytoagar with 20 ⁇ g mh 1 benzimidazole in 20 x 20 cm polycarbonate dishes.
  • the barley leaves were infested with barley mildew spores and wheat leaves with wheat mildew spores by shaking spores of heavily infected barley or wheat leaves into the tower.
  • the inoculum density was around 200 spores / mm 2 . After 5 min, the dishes were removed, sealed and incubated at 20 0 C and indirect daylight for 40 to 48 hours.
  • TaPERO (WO 2005/035766) serves as a positive control for a successful melamine resistance in the transient assay.
  • Example 7 Expression in wheat by particle bombardment
  • Transgenic wheat Triticum aestivum was generated by particle bombardment according to methods known to the person skilled in the art.
  • the Armadillo-Repeat genes were fused with the wheat RbcS promoter (ribose-1, 5-bisphosphate carboxylase small unit).
  • seedlings of the T1 generation were obtained therefrom which were resistant to Blumeria graminis f.sp. tritici were tested.
  • the seedlings were planted in soil and after seven days as previously described with spores of Blumeria graminis f.sp. tritici inoculated.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren penetrierenden Pathogen(en) in einer monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, und eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt eine erhöhte Pilzpathogenresistenz, vermittelt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird; oder dass eine endogene DNA-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, und eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt eine erhöhte Pilzpathogenresistenz, vermittelt, in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle gegenüber der Ausgangs- bzw. Wildtyppflanze bzw. deren Teil erhöht wird, oder dass die endogene Gensequenz oder bevorzugt die 5'-untranslatierte Region (5'UTR) gegenüber der Ausgangssequenz verändert wird. Ebenfalls betrifft die Erfindung Pfanzen, Teile einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, die nach den voranstehenden verfahren erhalten werden, sowie entsprechendendes Vermehrungsgut.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen, wobei eine DNA-Sequenz, die für ein Hordeum vulgäre Armadillo-Repeat (HvARM)-Polynukleotid oder ein funktionelles Äquivalent desselben kodiert, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für ein solches Protein kodie- ren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für ein solches Protein kodieren, das eine erhöhte Pathogenresistenz in Pflanzen vermittelt. Ferner betrifft die Erfindung homologe Sequenzen (ARM1 ) davon, sowie deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen, sowie Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskas- setten und Vektoren, die diese Sequenzen umfassen, und die geeigntet sind, eine Pilzresistenz in Pflanzen zu vermitteln. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Organismen, insbesondere Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut.
Pflanzenkrankheiten, die durch verschiedene Pathogene wie z.B. Viren, Bakterien und Pilze verursacht werden, können beim Anbau von Kulturpflanzen zu erheblichen Ernteausfällen führen, was zum einen wirtschaftliche Folgen hat, aber auch die Sicherheit der menschlichen Ernährung bedroht. Seit dem letzten Jahrhundert werden zur Kontrolle von Pilzerkrankungen chemische Fungizide eingesetzt. Durch den Einsatz dieser Stoffe konnte zwar das Ausmaß von Pflanzenerkrankungen reduziert werden, es ist allerdings bis heute nicht auszuschließen, dass diese Verbindungen eine schädliche Wirkung auf Mensch, Tier und Umwelt ausüben. Um langfristig den Verbrauch von herkömmlichen Pflanzenschutzmitteln auf ein Minimum zu reduzieren, ist es daher von Bedeutung, die natürliche Pathogenabwehr von verschiedenen Pflanzen gegenüber unterschiedlichen Erregern zu untersuchen und sie sich durch gentechnologische Ma- nipulation, z.B. durch das Einführen externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen Genexpression in den Pflanzen, zur Herstellung von pathogenresistenten Pflanzen gezielt nutzbar zu machen.
Es gibt nur wenige Ansätze, die Pflanzen eine Resistenz gegenüber Pathogenen, vor allem Pilzpathogenen, verleihen. Dieser Mangel ist zum Teil in der Komplexität der betrachteten biologischen Systeme begründet. Dem Erreichen von Resistenzen gegenüber Pathogenen steht auch entgegen, dass über die Wechselwirkungen zwischen Pathogen und Pflanze wenig bekannt ist. Die große Anzahl unterschiedlicher Pathogene, die von ihnen entwickelten Infektionsmechanismen und die von den Pflanzen-familien, -gattungen und -arten entwickelten Abwehrmechanismen stehen in vielfältigen Wechselwirkungen miteinander. Pilzpathogene haben im Wesentlichen zwei Infektionsstrategien entwickelt. Manche Pilze dringen über die Spaltöffnungen in das Wirtsgewebe ein (z.B. Rostpilze, Septoria-, Fusarium-Arten) und penetrieren das Mesophyllgewebe, während andere über die Cuticula die darunterliegenden Epidermiszellen penetrieren (z.B. Blumeria Arten).
Die durch die Pilzpathogene verursachten Infektionen führen in den befallen Pflanzen zur Aktivierung der pflanzlichen Abwehrmechanismen. So konnte gezeigt werden, dass Abwehrreaktionen gegen Epidermis penetrierende Pilze häufig mit der Ausbildung einer Penetrationsresistenz (Papillenbildung, Zellwandverdickungen mit Kallose als Hauptbestandteil) unterhalb der pilzli- chen Penetrationshyphe beginnen (Elliott et al., Mol. Plant Microbe Interact. 15, 1069 (2002)).
Die pflanzlichen Abwehrmechanismen vermitteln jedoch in vielen Fällen nur einen unzureichen- den Schutzmechnismus gegen Pathogenbefall.
Die Ausbildung einer Penetrationsresistenz gegenüber Pathogenen, deren Infektionsmechanismus eine Penetration der Epidermis- oder Mesophyllzellen beinhaltet, ist sowohl für monoko- tyledone als auch dikotyledone Pflanzen von grosser Bedeutung. Sie kann vermutlich im Ge- gensatz zur beschriebenen mlo-vermittelten Resistenz die Ausbildung einer Breitspektrum- Resistenz gegen obligat-biotrophe, hemibiotrophe und nekrotrophe Pilze ermöglichen.
Bisher wurden zur Erzeugung pilzresistenter Pflanzen häufig quantitative Resistenzmerkmale (Resistenz-QTLs) eingekreuzt. Dieses Verfahren hat aber den Nachteil, dass oft unerwünschte Merkmale mit eingekreuzt werden. Darüber hinaus sind die dazu benötigten Züchtungsmethoden sehr kompliziert und zeitaufwendig.
Daher lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erzeugung einer Resistenz von Pflanzen gegen penetrierende Pathogene bereitzustellen.
Die Lösung der Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren penetrierenden Pathogen(en) in einer monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, und eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt eine erhöhte Pilzpathogenresistenz, vermittelt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle ein- geführt und dort exprimiert wird. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren penetrierenden Pathogen(en) in einer monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, dadurch gekennzeichnet, dass eine endogene DNA-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, und eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt eine erhöhte Pilzpathogenresistenz, vermittelt, in der Pflanze, Pflanzenteil bzw. Pflanzenzelle gegenüber der Ausgangs- bzw. Wildtyppflanze, bzw. deren Teil erhöht wird, oder dass die endogene Gensequenz oder bevorzugt die 5'- untranslatierte Region (5'UTR) gegenüber der Ausgangssequenz verändert wird.
Ursprünglich wurde im Rahmen einer TIGS (=Transient Induced Gene Silencing)-Analyse in Gerste nach der Methode von Schweizer et al. (2001 ) gefunden, dass durch ein dsRNAi- vermitteltes Silencing eines Gens codierend für ein Armadillo-Repeat die Empfänglichkeit der Pflanze für das Pilzpathogen Blumeria graminis herabgesetzt ist und daher das Gen eine Rolle bei der Vermittlung der Pathogenresistenz von Pflanzen spielen könnte.
In diesem Zusammenhang muss jedoch angemerkt werden, dass es aufgrund der hohen Zahl konservierter Reste und der Homologie zwischen den einzelnen Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptiden und ihren funktionellen Äquivalenten möglich ist, mit einer einzigen dsRNA-Sequenz, die ausgehend von einer bestimmten Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenz eines Organismus generiert wurde, die Expression weiterer homologer Polypeptide und/oder deren funktioneller Äquivalente des gleichen Organismus zu unterdrücken.
Überraschenderweise wurde jedoch nun festgestellt, dass das Einführen des Gens aus Gerste bzw. dessen Expression oder Überexpression in von Gerste verschiedenen Pflanzen, bevorzugt monokotyle Pflanzen, insbesondere Weizen ebenfalls eine Erhöhung der Resistenz hervorrufen kann.
Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine rasseunspezifische Resistenz erreicht. So kann z.B. durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Breitspektrumresistenz gegen obligat biotrophe und/oder hemibiotrohpe und/oder nekrotrophe Pilze von Pflanzen, insbesondere gegen Mesophyll und/ oder Epidermis-penetrierende Pathogene erreicht werden.
Das Armadillo Repeat-Motiv war ursprünglich in dem Segment-Polaritäts-Gen Armadillo aus Drosophila melanogaster entdeckt worden. Es kodiert für ein beta-Catenin, welches in der ZeII- Zell-Adhäsion sowie für die Zelldifferenzierung eine wichtige Rolle spielt. Armadillo (Arm) Repeat Proteine enthalten tandemartig angeordnete Kopien einer degenerierten Sequenz von ca. 42 Aminosäuren, welche eine drei-dimensionale Struktur zur Vermittlung von Protein-Protein- Interaktionen kodiert (Azevedo et al., Trends Plant Sei. 6, 354 (2001)). Die meisten dieser Pro- teine sind in die intrazelluläre Signaltransduktion oder in die Regulation der Genexpression im Rahmen zellulärer Entwicklungsprozesse involviert. Im Gegensatz zu Tieren sind erst zwei pflanzliche Armadillo-Repeat-Proteine funktionell charakterisiert worden: Bei einem Gen handelt es sich um PH0R1 (photoperiod-responsive 1 ) aus Kartoffel, für welches eine Rolle in der Gib- berellinsäure-Signaltransduktion demonstriert werden konnte (Amador V., Cell 106 (3), 343 (2001 )) Bei dem zweiten Armadillo-Repeat Protein handelt es sich um ARC1 (Armadillo-Repeat Containing Protein 1 ) aus Raps, das mit der Rezeptor-Kinase SRK1 interagiert (Gu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 382 (1998)). Damit spielt es bei der Regulation der Selbstinkompatibili- tät von Raps eine große Rolle. Transgene Pflanzen, in denen die Expression von ARC1 durch Silencing herabgesetzt ist, zeigen eine reduzierte Selbstinkomptibilität. Interessanterweise zählt ARC1 zu der U-Box enthaltenden Subklasse der Armadillo-Repeat Proteine, zu der in Arabi- dopsis 18 Gene zählen (Azevedo et al., Trends Plant Sei. 6, 354 (2001)). Die U-Box ist ein Mo- tiv bestehend aus ca. 70 Aminosäure-Resten. Neben den HECT- und den RING-Finger-
Proteinen bilden sie vermutlich eine dritte Klasse an Ubiquitin E3-Ligasen, deren primäre Funktion darin besteht, die Substratspezifität der Ubiquitinierungsmaschinerie festzulegen (Hatakey- ama et al., J. Biol. Chem. 76, 331 11 (2001)).
Gene mit einer hohen Homologie zu HvArm vermitteln vermutlich ähnliche Funktionen. Vorzugsweise haben die Gene oder die verwendeten Nukleinsäuren oder die exprimierten Proteine eine Identität von 40% oder mehr, vorzugweise 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,98%, 99% oder mehr verglichen mit der jeweiligen Sequenz von HvARM (SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 63 [cDNA-Sequenz mit UTR] bzw. der Proteinsequenz SEQ ID NO: 2). Die Gene mit den höchsten Homolgien zu HvArm aus Reis (Acc. Nr.: XM_479734.1 , XM_463544, AP003561 , oder XM_506432), Tabak (AY219234) und Arabidopsis (Acc.-No. NM_127878, AC004401 , BT020206 , AB007645, NM_115336 , AK1 18613, AL138650, AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 und AK1 18730) nehmen somit vermutlich ähnliche Funktionen wie HvARM in der Pflanze wahr. Im folgenden werden die homologen Sequenzen mit dem Begriff „Armadillo Repeat ARM1" oder „ARM1 " benannt. HvARM bzw. HvARMI beziehen sich hingegen auf eine solche Sequenz aus Gerste usw.
In der Beschreibung wird aus Gründen der Vereinfachung der Begriff der „erfindungsgemäßen Sequenz(en)" verwendet, was sich je nach Zusammenhang auf die hierin offenbarten Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen bezieht. Dem Fachmann wird aus dem Zusammenhang der Bezug ersichtlich sein.
Kürzlich wurde in Mais mit SpH 1 ein weiteres pflanzliches Armadillo-Repeat Protein beschrie- ben, für das eine Regulation der pflanzlichen Zelltodantwort im Rahmen der abiotischen Stressantwort nachgewiesen wurde. Der Funktionsverlust des entsprechenden Gens führt zu einem sog. Lesion Mimic-Phänotyp, der die agronomische Leistungsfähigkeit der Pflanze beeinträchtigt (Zeng L. R., Plant Cell. 16 (10), 2795 (2004)). Interessanterweise beträgt die Sequenzhomologie von SpH 1 zu HvARM lediglich 23,4% auf Aminosäure-Ebene. Ohne durch Theorie eine Festlegung oder Einschränkung herbeizuführen deutet neben den unterschiedlichen Funktionen auch die geringe Sequenzhomologie auf die Zugehörigkeit von HvARM und SpH 1 zu verschiedenen Subklassen von Armadillo-Repeat Proteinen hin. Es war folglich überraschend, dass das Einführen und Exprimieren von erfindungsgemäßen HvArm-Sequenzen zu einer Erhöhung der Resistenz von Weizen gegen Weizenmehltau führt. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid, das von einer erfindungsgemäßen Sequenz kodiert wird, keine U box im 5'-UTR.
In einer weitere Ausführungsform betrifft die Erfindung folglich ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhter Resistenz gegen ein oder mehrere pflanzliche Pathogen(e), vorzugsweise mit einer Breitspektrumresistenz, insbesondere gegen Pilzpathogene, beispielsweise aus der Klasse der Ascomycetes, Basidiomycetes, Chytridiomycetes oder Oomycetes, bevorzugt von Mehltaupilzen der Familie Erysiphaceae, und besonders bevorzugt der Gattung Blumeria, und zwar durch Einführen und Expression einer erfindungsgemäßen Sequenz, die dadurch charakterisiert ist, dass sie für ein Protein kodiert, das mindestens ein Armadillo-Repeat enthält. Vorzugsweise enthält das Protein zwei, besonders bevorzugt mehr als zwei Armadillo- Repeats.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die das Protein codierende cDNA (bzw. die mRNA einschließlich der UTR-Sequenz(en)) im Wesentlichen keine U-Box, d.h. entweder keine U-Box oder keine funktionelle U-Box.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, d.h. jene die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, die eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt eine erhöhte Pilzpathogenre- sistenz, vermittelt, und die in den erfindungsgemäßen Verfahren in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle bzw. einen Teil von dieser eingeführt und dort exprimiert wird, oder die ebensolche endo- gene DNA-Sequenz, die in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle gegenüber der Ausgangs- oder Wildtyppflanze bzw. deren Teil erhöht wird, oder wobei die endogene Gensequenz oder bevorzugt die 5'-untranslatierte Region (5'UTR) gegenüber der Ausgangssequenz verändert wird, ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert, umfassend die in
SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43 oder 63 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50%, vorzugweise mindestens 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,98%, oder 99%, zu den Sequenzen SEQ ID No: 2 aufweist; (d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;
(f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und
(g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremo- leküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungs- bedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst.
Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere die Resistenz gegen Mesophyll- und/ oder Epidermiszellen penetrierende Pathogene erhöht.
In einer Ausführungsform wird die Resistenz dadurch erreicht, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel die eines ARM1 aus Reis (Acc. Nr.: XM_479734.1 , XM_463544, AP003561 , oder XM_506432), Tabak (AY219234) und Arabidopsis (Acc.-No. NM_127878, AC004401 , BT020206 , AB007645, NM_115336 , AK118613, AL138650,
AL133314, AC010870, AY125543, AY087360, AB016888, AK175585, AL049655, AY096530 und AK118730) eingeführt und exprimiert wird.
Anderseits kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren auch die endogene Expression o- der Aktivität einer dieser Sequenzen erhöht werden, z.B. durch Mutation einer UTR-Region, bevorzugt der 5'-UTR, einer Promotorregion, einer genomischen codierenden Region für das aktive Zentrum, für Bindungsstellen, für Lokalisationssignalen, für Domainen, Cluster, etc. wie z.B. von codierenden Regionen für coiled coil, HEAT, FBOX, LRR, IBIB, C2, WD40, Beach, U- Box, oder UND-Domänen. Die Aktivität kann erfindungsgemäß erhöht werden durch Mutatio- nen, die die Sekundär-, Tertiär-, oder Quartärstruktur des Proteins beinflussen.
Mutationen können z.B. durch eine EMS-Mutagenese eingeführt werden. Domänen können durch geeignete Computerprogramme identifiziert werden, wie z.B. SMART, oder InterPRO, z.B. wie in Andersen P., The Journal of Biol. Chemistry, 279 (38) 40053 (2004) oder Mudgil Y., Plant Physiology, 134, 59 (2004), und darin genannten Schriften beschrieben. Die geeigneten Mutanten können dann z.B. durch Tilling (bspw. nach Henikoff et al., Plant Physiol. 135 (2), 630 (2004)) identifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Einführung und Expression einer erfindungsgemäßen Sequenz in eine Pflanze bzw. das Erhöhen oder Verändern bzw. Mutieren einer erfindungsgemäßen endogenen Sequenz, ggf. eines oder beider untranslatierten Bereiche, in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion anderer Resistenzfaktoren, bevorzugt eines Bax Inhibitor 1-Proteins (BI-1 ), bevorzugt des Bax Inhibitor 1-Proteins aus Hordeum vulgäre (GenBank Acc.-No.: AJ290421), aus Nicotiana tabacum (GenBank Acc.-No.: AF390556), Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927) bzw. Tabak und Raps (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)) oder von ROR2 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY246906),
SnAP34 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY247208) und/oder des Lumenal Binding Protein BiP z.B. aus Reis (GenBank Acc.-No. AF006825). Eine Erhöhung kann z.B. u.a. durch Muta- genese oder Überexpression eines Transgens erreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Verminderung der Proteinmenge oder Aktivität oder Funktion der Proteine RacB (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ344223)), CSL1 (z.B. aus Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: NM116593), HvNaOX (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.- No.: AJ251717), MLO (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No. Z83834) mit den erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert.
Die Aktivität oder Funktion von MLO, BI-1 und/oder NaOX kann analog wie für MLO in WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552 und den weiteren unten genannten Schriften beschrieben reduziert oder inhibiert werden, deren Inhalt hiermit ausdrücklich und expressis verbis mit aufgenommen gilt, insbesondere um die Aktivität und Inhibierung von MLO zu beschreiben. Die Beschreibung der genannten Schriften beschreibt Verfahren, Methoden und besonders bevorzugte Ausführungsformen zur Verminderung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von MLO, die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann.
Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von BI-1 ist in der WO 2003/020939 ausführlich beschrieben, die hiermit ausdrücklich und expressis verbis mit als in die vorliegenden Beschreibung aufgenommen gilt. Die Beschreibung der genannten Schrift beschreibt Verfahren und Methoden zur Verminderung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von BI-1 , die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt wird die Reduktion oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von BI-1 gemäß der in der WO 2003/020939 besonders bevorzugten Ausführungsformen und der Beispiele und in den dort als besonders bevorzugt dargestellten Organismen durchgeführt, insbesondere in einer Pflanze, z.B. konstitutiv, oder in einem Teil davon, z.B. in einem Gewebe, besonders jedoch mindestens in der Epidermis oder einem wesentlichen Teil der Epidermiszellen. Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von BI-1 ist in der WO 2003/020939 ausführlich beschrieben. Der Fachmann findet in der WO 2003/020939 die Sequenzen, die für BI-1 Proteine codieren, und kann mit dem in der WO 2003/020939 zur Verfügung gestellten Verfahren auch BI-1 identifizieren. Die Reduzierung der Aktivität oder Funktion und ggf. der Expression von NaOX ist in der WO 2004/09820 (PCT/E P/03/07589) ausführlich beschrieben, die hiermit ausdrücklich und expres- sis verbis als in die vorliegenden Beschreibung mit aufgenommen gilt. Die Beschreibung der genannten Schrift beschreibt Verfahren und Methoden zur Erniedrigung oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von NaOX, die Beispiele geben konkret an, wie dies ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt wird die Reduktion oder Inhibierung der Aktivität oder Funktion von NaOX gemäß der in der WO 2004/09820 (PCT/E P/03/07589) besonders bevorzugten Ausführungsformen und der Beispiele und in den dort als besonders bevorzugt dargestellten Organis- men durchgeführt insbesondere in einer Pflanze, z.B. konstitutiv, oder einem Teil davon, z.B. in einem Gewebe, besonders vorteilhaft jedoch mindestens in der Epidermis oder einem wesentlichen Teil der Epidermiszellen. Der Fachmann findet in der WO 2004/09820 (PCT/E P/03/07589) die Sequenzen, die für NaOX Proteine codieren und kann mit dem in der WO 2004/09820 (PCT/EP/03/07589) zur Verfügung gestellten Verfahren auch NaOX identifizieren.
Die Begriffe „vermindern", „reduzieren" oder „repremieren" oder deren Substantive werden hierein synonym verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion des Bax Inhibitor 1 -Proteins aus Hordeum vulgäre (GenBank Acc.-No.: AJ290421), aus Nicotiana tabacum (GenBank Acc.-No.: AF390556), Reis (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927) bzw. Tabak und Raps (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)) oder von ROR2 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY246906), SnAP34 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AY247208) und/oder des Lumenal Binding Protein BiP z.B. aus Reis (GenBank Acc.-No. AF006825) kombiniert mit der Verminderung der Proteinmenge oder Aktivität oder Funktion der Proteine RacB (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ344223), CSL1 (z.B. aus Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: NM1 16593), HvNaOx (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No.: AJ251717), und/oder MLO (z.B. aus Gerste (GenBank Acc.-No. Z83834). Folglich wird in einer Ausführungsform mindestens eins der oben genannten zur Überexpression oder erhöhten Aktivität geeigneten Gene aktiviert oder überexprimiert und/oder mindestens eins der oben genannten zur Verminderung geeigneten Gene vermindert.
Eine Erhöhung der Expression kann wie hierin beschrieben erreicht werden. Unter Erhöhung der Expression oder Funktion wird hierein sowohl die Aktivierung oder Steigerung der Expression oder Funktion des endogenen Proteins einschließlich einer de novo Expression als auch eine Erhöhung oder Steigerung durch die Expression eines transgenen Proteins oder Faktors verstanden.
„Organismus" im Rahmen der Erfindung meint „nicht humane Organismen" solange sich der Begriff auf einen lebensfähigen vielzelligen Organismus bezieht, vorzugsweise Pflanzen. „Pflanzen" im Rahmen der Erfindung meint alle dicotyledonen oder monokyledonen Pflanzen. Bevorzugt sind Pflanzen die unter der Klasse der Liliatae (Monocotyledoneae bzw. einkeimblättrige Pflanzen) subsumiert werden können. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Ebenfalls bevorzugt sind zweikeimblättrige Pflanzen. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst auch einjährige und mehrjährige dicotyledone oder monokotyledone Pflanzen und schließt, beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, solche der Gattungen, Bromus, Aspara- gus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum und Sac- charum ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, beispiels- weise aus der Familie der Poaceae, besonders bevorzugt auf die Gattungen Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, und Saccharum, ganz besonders bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeutung, wie z.B. Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aesti- vum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zucker- röhr) oder Oryza sative (Reis) angewendet.
„Epidermisgewebe" oder Epidermis meint die äußeren Gewebeschichten der Pflanzen. Sie kann ein- bis mehrschichtig sein; es gibt Epidermis-„angereicherte" Genexpression, wie z.B. Cer3, die als Marker dienen kann (Hannoufa A. Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
Unter „Epidermis" versteht der Fachmann vorzugsweise das vorherrschende Abschlussgewebe primärer oberirdischer Pflanzenteile, so des Sprosses, der Blätter, Blüten, Früchte und Samen. Nach außen scheiden die Epidermiszellen eine wasserabstoßende Schicht, die Kutikula ab. Die Wurzeln sind von der Rhizodermis umgeben, welche der Epidermis in vieler Hinsicht ähnelt, jedoch auch markante Unterschiede zu ihr aufweist. Die Epidermis entsteht aus der äußersten Schicht des Apikaimeristems. Die Ableitung der Rhizodermis hingegen ist weniger klar. Je nach Art kann sie entwicklungsgeschichtlich entweder der Wurzelhaube oder der primären Rinde zugerechnet werden. Der Epidermis können zahlreiche Funktionen zugeschrieben werden: Sie bietet der Pflanze Schutz vor Austrocknung und regelt die Transpirationsrate Sie schützt die Pflanze vor den verschiedensten chemischen und physikalischen Fremdeinflüssen sowie vor Tierfraß und Befall durch Parasiten. Sie ist am Gasaustausch, an der Sekretion bestimmter Stoffwechselprodukte und an der Absorption von Wasser beteiligt. In ihr sind Rezeptoren für Licht und mechanische Reize enthalten. Sie wirkt damit als ein Signalwandler zwischen Umwelt und Pflanze. Entsprechend den verschiedenen Funktionen enthält die Epidermis eine Anzahl unterschiedlich differenzierter Zellen. Hinzu kommen artspezifische Varianten und unterschiedliche Organisation der Epidermen in den einzelnen Teilen einer Pflanze. Im Wesentlichen be- steht sie aus drei Kategorien von Zellen: den "eigentlichen" Epidermiszellen, den Zellen der Stomata (Spaltöffnungen) und den Trichomen (griech.: Trichoma, Haar), epidermalen Anhangsgebilden verschiedener Form, Struktur und Funktion.
Die "eigentlichen", d.h., die am wenigsten spezialisierten Epidermiszellen machen die Haupt- masse der Zellen des Abschlußgewebes aus. Sie sind in der Aufsicht entweder polygonal (von platten- oder tafelförmiger Gestalt) oder gestreckt. Die zwischen ihnen ausgebildeten Wände sind vielfach gewellt oder gebuchtet. Wodurch diese Form während der Entwicklung induziert wird, ist unbekannt, die vorliegenden Hypothesen erklären den Sachverhalt nur unbefriedigend. Gestreckte Epidermiszellen findet man an Organen oder Organteilen, die selbst gestreckt sind, so z.B. an Stengeln, Blattstielen und Blattrippen sowie an den Blättern der meisten Monokotyle- donen. Ober- und Unterseite von Blattspreiten können von unterschiedlich strukturierten Epidermen bedeckt sein wobei sowohl die Form der Zellen, die Dicke der Wände als auch die Verteilung und Zahl spezialisierter Zellen (Stomata und/oder Trichome) pro Flächeneinheit variieren kann. Große Variationen findet man auch innerhalb einzelner Familien, z. B. bei den Crassulaceen. Meist ist die Epidermis einschichtig, jedoch sind bei Arten aus mehreren Familien (Moraceae: hier die meisten Ficus-Arten, Piperaceae: Peperonia [Peperonie], Begoniaceae, Malvaceae u.a.) mehrschichtige wasserspeichernde Epidermen nachgewiesen worden. Epidermiszellen sondern nach außen eine Cutinschicht (Kutikula) ab, die als ein ununterbrochener Film alle epidermalen Oberflächen überzieht. Sie kann entweder glatt oder durch Vorwölbun- gen, Leisten, Falten und Furchen strukturiert sein. Doch nicht immer beruht eine durch Betrachtung der Oberfläche sichtbare Faltung der Kutikula auf der Ausbildung von Kutikularleisten. Es gibt durchaus Fälle, wo eine Kutikulafaltung nur der Ausdruck der darunterliegenden Ausstülpungen der Zellwand ist. Epidermale Anhangsgebilde verschiedener Form, Struktur und Funktion werden als Trichome bezeichnet und hierin ebenfalls unter dem Begriff „Epidermis" verstanden. Sie treten als Schutz-, Stütz- und Drüsenhaare in Form von Schuppen, verschiedenen Papillen und bei Wurzeln als absorbierende Haare auf. An ihrer Bildung sind allein Epidermiszellen beteiligt. Oft entsteht ein Trichom aus nur einer solchen Zelle, manchmal sind an der Entstehung mehrere beteiligt.
Ebenfalls umfasst unter dem Begriff „Epidermis" sind Papillen. Papillen sind Ausstülpungen der Epidermisoberfläche. Das Lehrbuchbeispiel hierfür sind die Papillen auf Blütenoberflächen des Stiefmütterchens (Viola tricolor) sowie die Blattoberflächen vieler Arten im tropischen Regen- wald. Sie verleihen der Oberfläche eine samtartige Konsistenz. Einige Zellen von Epidermen können als Wasserspeicher ausgebildet sein. Ein typisches Beispiel stellen die Blasenzellen an Oberflächen vieler Mittagsblumenarten und anderer Sukkulenten dar. Bei manchen Pflanzen, z.B. bei der Glockenblume (Campanula persicifolia) sind die Außenwände der Epidermis linsen- förmig verdickt.
Die Hauptmasse aller Gewebe bildet das Grundgewebe oder Parenchym. Zu den parenchyma- tischen Geweben gehört das Mesophyll, das in Blättern in Palisadenparenchym und Schwamm- parenchym differenziert sein kann. Folglich versteht der Fachmann unter Mesophyll ein paren- chymatisches Gewebe. Parenchymatische Zellen sind durchweg lebend, meist isodiametrisch, seltener gestreckt. Das Mark der Sprosse, die Speichergewebe der Früchte, Samen, der Wurzel und anderer unterirdischer Organe sind ebenso als Parenchyme zu betrachten wie das Mesophyll. „Mesophyllgewebe" meint das zwischen den Epidermisschichten liegende Blattgewebe, bestehend aus dem Palisadengewebe, dem Schwammgewebe und den Blattadern.
Das Mesophyll ist in den Blättern der meisten Farne und Phanerogamen, besonders ausgeprägt bei den Dikotyledonen und vielen Monokotyledonen, in Palisaden- und Schwammparen- chym untergliedert. Ein "typisches" Blatt ist dorsiventral gebaut. Das Palisadenparenchym liegt dabei meist an der Blattoberseite unmittelbar unter der Epidermis. Das Schwammparenchym füllt den darunterliegenden Raum aus. Es ist von einem voluminösen Interzellularsystem durchsetzt, dessen Gasraum über die Spaltöffnungen in direktem Kontakt zur Außenwelt steht.
Das Palisadenparenchym besteht aus langgestreckten, zylindrischen Zellen. Bei einigen Arten sind die Zellen irregulär, gelegentlich sind sie gegabelt (Y-förmig: Armpalisadenparenchym). Solche Varianten kommen bei Farnen, Coniferen und einigen wenigen Angiospermen (z.B. bei einigen Ranunculaceen- und Caprifoliaceenarten [Beispiel: Holunder]) vor. Neben der eben beschriebenen, am weitesten verbreiteten Organisationsform sind die folgenden Varianten nachgewiesen worden: Palisadenparenchym an der Blattunterseite. Besonders auffällig bei Schuppenblättern. Beispiel: Lebensbaum (Thuja), sowie bei den Blättern des Bärlauchs (Allium ursinum)
Palisadenparenchym an beiden Blattseiten (Ober- und Unterseite) wird häufig bei Pflanzen trockener Standorte (Xerophyten) angetroffen, z.B. bei der Kompaßpflanze (Lactuca serriola).
Ringförmig geschlossenes Palisadenparenchym findet sich beispielsweise in zylindrisch organisierten Blättern und in Nadeln der Koniferen.
Die Variabilität der Schwammparenchymzellen und die Ausbildung des Schwammparenchyms selbst sind noch vielgestaltiger als die des Palisadenparenchyms. Es wird meist als Durchlüf- tungsgewebe bezeichnet, denn es enthält eine Vielzahl untereinander verbundener Interzellularen. Das Mesophyll kann das so genannte Assimilationsgewebe umfassen, jedoch sind die Begriffe Mesophyll und Assimilationsgewebe nicht als Synonyme zu verwenden. Es gibt chloroplasten- freie Blätter, die sich in ihrem Aufbau nur unwesentlich von vergleichbaren, grünen Blättern unterscheiden. Folglich enthalten sie Mesophyll, doch eine Assimilation unterbleibt; umgekehrt findet eine Assimilation z.B. auch in Sproßabschnitten statt. Weitere Hilfsmittel zur Charakterisierung von Epidermis und Mesophyll findet der Fachmann z.B. in v. Guttenberg H. „Lehrbuch der Allgemeinen Botanik", Berlin, Akademie-Verlag 1955 (5. Aufl.); Haberlandt G., „Physiologische Pflanzenanatomie", Leipzig, W. Engelmann 1924 (6. Aufl.); Troll W. „Morphologie der Pflanzen", Band 1 : Vegetationsorgane, Berlin, Gebr. Borntraeger, 1937; Troll W., „Praktische Einführung in die Pflanzenmorphologie", Jena, VEB G. Thieme Verlag 1954/1957; Troll W., Höhn K., „Allgemeine Botanik", Stuttgart, F. Enke Verlag, 1973 (4. Aufl.).
Folglich können Epidermis oder Epidmermiszellen histologisch oder biochemisch, einschließlich molekularbiologisch, charakterisiert werden. In einer Ausführungsform wird die Epidermis bio- chemisch charakterisiert. Die Epidermis kann in einer Ausführungsform durch die Aktivität eines oder mehrer der folgenden Promotoren gekennzeichnet werden:
Wl R5 (=GstA1 ), acc. X56012, Dudler & Schweizer, unveröff.
GLP4, acc. AJ310534; Wei.Y., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998). GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Plant J. 20, 541 (1999).
Prx7, acc. AJ003141 , Kristensen B.K., Molecular Plant Pathology 2 (6), 311 (2001 ).
GerA, acc. AF250933 ; Wu S., Plant Phys. Biochem. 38, 685 (2000).
OsROCI , acc. AP004656
RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 ; Klöti A., PMB 40, 249 (1999). Cer3; Hannoufa A., Plant J. 10 (3), 459 (1996).
In einer anderen Ausführungsform wird die Epidermis dadurch gekennzeichnet, dass nur ein Teil der Promotoren aktiv ist, z.B. 2, 3, 5 oder 7 oder mehr, mindestens jedoch ist einer der o- ben aufgezählten aktiv. In einer Ausführungsform wird die Epidermis dadurch gekennzeichnet, dass alle genannten Promoter in dem Gewebe oder der Zelle aktiv sind.
Folglich können Mesophyll oder Mesophyllzellen biochemisch einschließlich molekularbiologisch oder histologisch charakterisiert werden. In einer Ausführungsform wird das Mesophyll biochemisch charakterisiert. Das Mesophyll kann in einer Ausführungsform durch die Aktivität eines oder mehrer der folgenden Promotoren gekennzeichnet werden:
PPCZmI (=PEPC); Kausch A.P., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001 ). OsrbcS, Kyozuka J. et al., Plant Phys. 102 (3), 991 (1993). OsPPDK, acc. AC099041. TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Plant J. 20, 541 (1999). TaFBPase, acc. X53957. TaWISI , acc. AF467542; US 2002201 15849. HvBISI , acc. AF467539; US 2002201 15849. ZmMISI , acc. AF467514; US 2002201 15849.
HvPRIa, acc. X74939 ; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7 (2), 267 (1994). HvPRI b, acc. X74940; Bryngelsson et al. Mol. Plant Microbe Interact. 7 (2),267 (1994). HvB1 ,3gluc; acc. AF479647.
HvPrxδ, acc. AJ276227; Kristensen B.K., Molecular Plant Pathology 2 (6), 311 (2001 ). HvPAL, acc. X97313 ; Wei,Y. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).
In einer anderen Ausführungsform wird das Mesophyll dadurch gekennzeichnet, dass nur ein Teil der Promotoren aktiv ist, z.B. 2, 3, 5 oder 7 oder mehr, mindestens jedoch einer der oben aufgezählten. In einer Ausführungsform wird das Mesophyll dadurch gekennzeichnet, dass alle genannten Promotoren in dem Gewebe oder der Zelle aktiv sind.
In einer Ausführungsform sind in der Epidermis einer erfindungsgemäß verwendeten oder her- gestellten Pflanze oder einer erfindungsgemäßen Pflanze in der Epidermis und im Mesophyll alle genannten Promotoren aktiv. In einer Ausführungsform sind nur ein Teil der genannten Promotoren aktiv, z.B. 2, 5, 7 oder mehr, mindestens ist jedoch einer der oben aufgezählten Promotoren jeweils aktiv.
„Nukleinsäuren" meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).
Der Begriff „Ernte" meint alle durch landwirtschaftlichen Anbau von Pflanzen gewonnenen und im Rahmen des Erntevorgangs gesammelten Pflanzenteile.
"Resistenz" bedeutet das Verhindern, das Reprimieren, das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze, die infolge eines Befalls durch ein Pathogen auftreten. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrages, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Erntegutes erschweren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die folgenden Krankheitssymptome abgeschwächt, vermindert oder verhindert: Bildung von Pusteln und Sporienlagern auf den Oberflächen der befallenen Gewebe, Mazeration der Gewebe, spreitende Nekrosen des Gewebes, Akkumulation von Mykotoxinen z.B. aus Fusarium graminearum oder F. culmorum, Penetration der Epidermis und/oder des Mesophylls, usw.
Eine "erhöhte Pathogenresistenz" bedeutet, dass die Abwehrmechanismen einer bestimmten Pflanze oder in einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Organell, durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, z.B. dem Wildtyp der Pflanze („Kontrollpflanze", „Ausgangspflanze"), auf den das erfindungsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Bedingungen (wie beispielsweise Klima- oder Anbaubedingungen, Pathogenart etc.) eine erhöhte Resistenz gegen ein oder mehr Pathogene aufweist. Vorzugsweise weisen in einer Pflanze mindestens die Epidermis und/oder Mesophyll-Gewebe oder die Organe, die ein Epidermis und/oder Mesophyll-Gewebe besitzen, eine erhöhte Resistenz gegen die Pathogene auf. Beispielsweise ist die Resistenz in den Blättern erhöht.
In einer Ausführungsform wird die Resistenz in Lemma (Deckspelze), Palea (Vorspelze), und/oder Glume (Antherenanlage) erhöht.
Die erhöhte Resistenz äußert sich bevorzugt in einer verminderten Ausprägung der Krankheitssymptome, wobei die Krankheitssymptome - neben den oben erwähnten Beeinträchti- gungen - auch beispielsweise die Penetrationseffizienz eines Pathogens in die Pflanze oder pflanzliche Zelle oder die Proliferationseffizienz des Pathogens in oder auf denselben umfassen. Dabei sind die Krankheitssymptome bevorzugt um mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, insbesondere bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 % oder 95 % gegenüber der Kontrollpflanze vermindert.
Dabei äußert sich die erhöhte Resistenz bevorzugt in einer verminderten Ausprägung der Krankheitssymptome, wobei Krankheitssymptome - neben den oben erwähnten Beeinträchtigungen - auch beispielsweise die Penetrationseffizienz eines Pathogens in die Pflanze oder pflanzliche Zelle oder die Proliferationseffizienz in oder auf denselben umfasst. Veränderungen in der Zellwandstruktur können beispielsweise einen grundlegenden Mechanismus der Patho- genresistenz darstellen, wie z.B. gezeigt in Jacobs A.K. et al., Plant Cell 15 (1 1 ), 2503 (2003).
"Pathogen" meint im Rahmen der Erfindung Organismen, deren Interaktionen mit einer Pflanze zu den oben beschriebenen Kranheitssymptomen führen, insbesondere meint Pathogene Organismen aus dem Reich der Pilze. Vorzugsweise wird unter Pathogen ein Epidermis- bzw. Mesophyllzellen- penetrierendes Pathogen verstanden, besonders bevorzugt Pathogene, die über Spaltöffnungen in Pflanzen eindringen und anschließend Mesophyllzellen penetrieren. Bevorzugt sind dabei Organismen der Stämme Ascomycota und Basidomycota genannt. Be- sonders bevorzugt sind dabei die Familien Blumeriaceae, Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocreaceae.
Besonders bevorzugt sind Organismen dieser Familien, die zu den Gattungen Blumeria, Pucci- nia, Fusarium oder Mycosphaerella zählen. Ganz besonders bevorzugt sind die Arten Blumeria graminis, Puccinia triticina, Puccinia strii- formis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae und Microdochium nivale.
Es ist jedoch anzunehmen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auch eine Resistenz gegen weitere Pathogene bewirken.
Besonders bevorzugt sind Ascomycota wie z.B. Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen), Basidiomyceten wie z.B. Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia coronata (Kronenrost an Hafer).
In bevorzugten Ausführungsformen führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer Resistenz bei
Gerste gegen die Pathogene:
Puccinia graminis f.sp. hordei (barley stem rust), Blumeria graminis f.sp. hordei (Gerstenmehltau), und/oder
- bei Weizen gegen die Pathogene:
Blumeria graminis f.sp. tritici (Weizenmehltau), Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae oder Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust), und/oder
bei Mais gegen die Pathogene:
Fusarium moniliforme var. subglutinans, Puccinia sorghi oder Puccinia polysora, und/oder
bei Sorghum gegen die Pathogene: Puccinia purpurea, Fusarium monilifonne, Fusarium graminearum oder Fusarium oxysporum, und/oder
bei Soja gegen die Pathogene: Phakopsora pachyrrhizi und Phakopsora meibomiae.
Der Begriff "Nukleinsäure(molekül)", wie hier verwendet, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untransla- tierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs. Besonders bevorzugt sind in der vorliegenden Erfindung zudem isolierte Nukleinsäuresequen- zen. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organis- mus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden; hiervon bleiben jedoch die oben genannten Ausführungsformen umfassend 5'- und 3'-UTR-Bereiche unberührt). Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte Molekül z.B. weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, flankieren. Bei allen hier erwähnten Nukleinsäuremolekülen kann es sich z.B. um RNA, DNA oder cDNA handeln.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereit gestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch können mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen, wie sie z.B. auf der NCBI-Homepage unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov zu finden sind, beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Wesentliche Teile dieser Sequenz oder die gesamte homologe Sequenz können als Hybridisie- rungssonde unter Verwendung von Standardhybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al., vide supra) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsäurese- quenzen aus anderen Organismen durch das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken verwendet werden.
Überdies lässt sich ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül bzw. ein Teil von dieser durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer auf der Basis der hier angegebenen Sequenzen oder von Teilen davon verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)) und daraus mittels reverser Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse Transkrip- tase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku Amerika, Inc., St. Petersburg, FL) cDNA herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis der hierin offenbarten Sequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern mittels Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizier- te Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Nukleotidsequenz entspre- chen, welche für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, können durch Standardsyntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden. Unter dem Begriff "Fragmente der DNA", wie er hier verwendet wird, versteht man Teilstücke der DNA, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodieren, dessen biologische Aktivität darin besteht, dass es eine Erhöhung der Pathogenresistenz (bevorzugt der Pilzpathogenresistenz) vermittelt.
Der Begriff "Fragmente des Proteins", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Teilstücke des Proteins, dessen biologische Aktivität darin besteht, dass es eine Erhöhung der Pathogenresistenz (bevorzugt der Pilzpathogenresistenz) in Pflanzen vermittelt.
"Armadillo Repeat Arm1 Polypeptid" oder "Armadillo Repeat ARM1 Protein" oder „Arm" oder „Aιm1 " und deren Abwandlungen meint im Rahmen der Erfindung ein Protein mit einem oder mehreren Armadillo repeats.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptid, das die in den Beispielen gezeigte Aktivität hat. In einer Ausführungsform wird unter einem Armadillo Repeat ARM1 Protein ein Protein verstanden mit einer Homologie zu einer der in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 oder in den Figuren gezeigten Aminosäuresequenzen, z.B ein Armadillo- Repeat ARM1 Polypeptid aus Gerste (HvARM) gemäß SEQ ID NO: 2 und/oder aus Reis (Oryza sative) gemäß SEQ ID NO: 4, 6, 8, und/oder 10, und/oder aus Tabak (Nicotiana tabacum) gemäß SEQ ID NO.: 12 und/oder aus A.thaliana gemäß SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, und/oder 44, oder gemäß einer der Consensussequenzen gemäß SEQ ID NO.: 60, 61 oder 62 oder ein funktionelles Fragment davon. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung funktionelle Äquivalente der vorgenannten Polypeptidsequenzen.
"Polypeptidmenge" meint beispielsweise Molekülzahl oder Mol an Armadillo-Repeat ARM1 Po- lypeptidmolekülen in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkomparti- ment. "Erhöhung" der Polypeptidmenge meint die molare Erhöhung der Anzahl an jeweiligen Polypeptiden in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment - beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, z.B. dem Wildtyp (Kontrollpflanze) derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.). Die Erhöhung beträgt dabei mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 %, 95 % oder 99 %, insbesondere 100 %, insbersondere bevorzugt mehr als 100%, vorzugsweise mehr als 150 %, 200 % oder 300 %.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nukleinsäurese- quenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Gene- tics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nuklein- säurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmal- gorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Polypep- tidbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parame- tersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Unter „Amiadillo repeat" wird eine Sequenz verstanden die tandemartig angeordnete Kopien einer degenerierten Sequenz von ca. 42 Aminosäuren enthält, welche eine drei-dimensionale Struktur zur Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen kodiert (Azevedo et al. Trends Plant Sei. 6, 354 (2001)). Beispielsweise hat das Polypeptid, das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, oder das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aktivität, die in die intrazelluläre Signaltransduktion oder in die Regulation der Genexpression im Rahmen zellulärer Entwicklungsprozesse involviert ist.
Das Armadillo-Repeat ARM1 Protein wird beispielsweise kodiert von einem Nukleinsäuremole- kül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz umfasst; (b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43 oder 63 umfaßt;
(c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 oder 62 aufweist;
(d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein funktionelle Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Anti- körper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; und
(f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente bestehend aus mindestens 15 Nukleotiden (nt), vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt hybridisiert;
(g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremo- leküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungs- bedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst, oder ein funktionelles Äquivalent davon darstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Sequenz keine U box im 5'-UTR.
Erfindungsgemäß wird die Aktivität der genannten Polypeptide in eine Pflanze oder einen Teil einer Pflanze, vorzugsweise in den Epidermis- und/oder Mesophyllzellen einer Pflanze, wie o- ben erläutert, eingeführt und exprimiert, bzw. entsprechend die Expression des endogenen Polypeptids erhöht.
In einer Ausführungsform wird die Aktivität von ARM1 in Lemma, Palea und/oder Glume erhöht.
"Einführung" bzw. „Einbringen" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet sind, eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, direkt oder indirekt, in eine Pflanze oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen derselben einzuführen oder dort zu generieren. Die Einführung kann zu einer vorübergehenden (transienten) oder zu einer dauerhaften (stabilen) Präsenz einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz führen.
„Einführung" bzw. „Einbringen" umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transdukti- on oder Transformation.
Die Einbringung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Gewebe, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die Expressionskassetten enthalten sind. Die Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli-Zellen eingeführt. Korrekt transformierte E.coli-Zellen werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung kön- nen dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Bei den Vektoren kann es sich beispielsweise um Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien handeln. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabi- Ie Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Unter "Epitop" versteht man die die Spezifität der Antikörper bestimmenden Bereiche eines Antigens (die antigene Determinante). Ein Epitop ist demnach der Teil eines Antigens, der tatsächlich mit dem Antikörper in Kontakt tritt.
Solche antigenischen Determinaten sind die Bereiche eines Anitgens, auf welches die T-ZeII Rezeptoren reagieren und in der Folge Antikörper produzieren, die spezifisch die Antigene- Determinante/ das Epitop eines Antigens binden. Antigene bzw. deren Epitope sind demnach in der Lage, die Immunantwort eines Organismus mit der Folge der Bildung spezifischer - gegen das Epitop gerichteter - Antikörper zu induzieren. Epitope bestehen z.B. aus linearen Abfolgen von Aminosäuren in der Primärstruktur von Proteinen, oder aus komplexen sekundären oder tertiären Proteinstrukturen. Unter einem Hapten versteht man ein aus dem Kontext der Antigen- umgebung herausgelöstes Epitop. Obwohl Haptene per Definition einen Antikörper gegen sich gerichtet haben, sind Haptene unter Umständen nicht in der Lage nach z.B. Injektion in einen Organismus eine Immunantwort zu induzieren. Zu diesem Zweck werden Haptene an Trägermoleküle gekoppelt. Als Beispiel sei Dinitrophenol (DNP) genannt, welches nach Kopplung an BSA (bovine serum albumine) zur Herstellung von Antikörpern gerichtet gegen DNP verwendet wurde (Bohn A., König W., Immunology 47 (2), 297 (1982)).
Haptene sind daher insbesondere (oft niedermolekulare bzw. kleine) Substanzen, die selbst keine Immunreaktion auslösen, aber sehr wohl, wenn sie an einen großmolekularen Träger gekoppelt wurden. Unter den so erzeugten Antikörpern finden sich auch solche, die das Hapten alleine binden können.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper gegen ein hierin charakterisiertes Polypeptid, insbesondere einen monoklonalen Antikörper der ein Polypeptid bindet, das eine AA-Sequenz umfasst oder daraus besteht gemäß den Sequenzen, die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigt sind.
Antikörper im Rahmen der vorliegenden Erfindung können zur Identifikation und Isolierung von erfindungsgemäß offenbarten Polypeptiden aus Organismen, bevorzugt Pflanzen, besonders bevorzugt monokotyledonen Pflanzen, oder weiterhin bevorzugt dikotyledonen Pflanzen, verwendet werden. Die Antikörper können sowohl monoklonal, polyklonal, als auch synthetischer Natur sein, oder aus Antikörperfragmenten wie Fab, Fv oder scFv Fragmenten bestehen, die durch proteolytischen Abbau entstehen. "Single chain" Fv (scFv) Fragmente sind einkettige Fragmente, die verbunden über eine flexible Linkersequenz nur die variablen Bereiche der schweren und leichten Antikörperketten enthalten. Solche scFv Fragmente können auch als rekombinante Antikörperderivate produziert werden. Eine Präsentation solcher Antikörperfrag- mente auf der Oberfläche filamentöser Phagen ermöglicht die direkte Selektion hochaffin bindender scFv-Moleküle aus kombinatorischen Phagenbibliotheken.
Monoklonale Antikörper können gemäß der von Köhler und Milstein beschriebenen Methode gewonnen werden (Nature 256, 495 (1975)).
"Funktionelle Äquivalente" eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins meint bevorzugt solche Polypeptide, die zu den durch die Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 beschriebenen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 40% aufweisen und im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweisen oder Funktionen besitzen. Vorzugsweise beträgt die Homologie 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, besonders bevorzugt 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr.
Funktionelle Äquivalenz kann zum Beispiel durch Vergleich der Phänotypen von Testorganismen nach Expression der jeweiligen Polypeptide unter möglichst identischen Bedingungen be- stimmt werden.
"Im Wesentlichen gleiche Eigenschaften" eines funktionellen Äquivalentes meint vor allem die Verleihung eines pathogenresistenten Phänotypes oder die Verleihung oder Steigerung der Pathogenresistenz gegen zumindest ein Pathogen bei Erhöhen der Polypeptidmenge, Aktivität oder Funktion des besagten funktionellen Armadillo-Repeat ARM1 Protein Äquivalentes in einer Pflanze, Organ, Gewebe, Teil oder Zellen, insbesondere in Epidermis- und/oder Mesophyllzel- len derselben, vorzugsweise gemessen an der Penetrationseffizienz eines Pathogens wie in den Beispielen gezeigt.
"Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- oder Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Pathogenkon- zentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen im Wesentlichen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Sequenz der zu vergleichenden Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptide, ihrem Ursprungs-Organismus und gegebenenfalls dem Pathogen unterscheiden.
"Funktionelle Äquivalente" meint auch natürliche oder künstliche Mutationsvarianten der Armadillo-Repeat ARM1 Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 sowie homologe Polypeptide aus anderen monokoty- ledonen und dikotyledonen Pflanzen, welche weiterhin im Wesentlichen gleiche Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus hierin beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Armadillo-Repeat ARM1 Proteinsequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen können z.B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken - unter Verwendung der Armadillo-Repeat ARM1 Protein- Sequenzen als Suchsequenz bzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Funktionelle Äquivalente können z.B. auch von einem der erfindungsgemäßen Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet sein und zu diesen Polypeptiden eine Homologie von mindestens 40 %, 50 , 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % aufweisen und zeichnen sich durch im Wesentlichen gleiche funktionelle Eigenschaften wie die Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 oder 62 aus.
Funktionelle Äquivalente sind auch jene von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitete Nukleinsäuremoleküle, und haben eine Homologie von mindestens 40 %, 50 , 60 %, bevorzugt 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 98 % zu einem der erfindungsgemäßen Polynukleotide gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 und kodieren für Polypeptide mit im Wesentlichen identischen funktionellen Eigenschaften wie Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62.
Beispiele für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhenden funktionellen Äquivalente der Armadillo-Repeat ARM 1 Proteine gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 lassen sich beispielsweise aus Organis- men, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden.
Auch die Durchmusterung von cDNA- oder genomischen Bibliotheken anderer Organismen, bevorzugt von den weiter unten genannten als Wirt zur Transformation geeigneten Pflanzenarten, unter Verwendung der unter SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29,
31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 beschriebene Nukleinsäuresequenzen oder Teilen derselben als Sonde, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren, um Homologe in anderen Arten zu identifizieren. Dabei haben die von der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Die Sonde kann auch ein oder mehrere Kilobasen lang sein, z.b. 1 Kb, 1 ,5 Kb oder 3 Kb. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang, oder ein Fragment desselben mit einer Länge zwischen 20 bp und mehreren Kilobasen eingesetzt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch solche DNA Moleküle verwendet werden, die unter Standardbedingungen mit den durch SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43 oder 63 beschriebenen und für Armadillo-Repeat ARM1 Proteine kodierenden Nukleinsäuremoleküle, der zu diesen komplementären Nukleinsäuremo- lekülen oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen über die gleichen Eigenschaften, bevorzugt funktionellen Eigenschaften, wie die unter SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,
32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 beschriebenen Polypeptide verfügen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint je nach Anwendung stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbe- dingungen sind unter anderem bei Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. et al., in „Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Der Fachmann wird aus seinem Fachwissen heraus Hybridisierungsbedingungen auswählen, die es ihm ermöglichen, spezifische von unspezifischen Hybridisierungen zu unterscheiden.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus Bedingungen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 500C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 500C bevorzugt bei 65°C) (2OX SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M NaCI, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Be- dingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig oder auch einzeln variiert werden, wobei der jeweils andere Parameter konstant gehalten wird. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige bevorzugte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind nachstehend angegeben:
(1 ) Hybridisierungbedingungen können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, Lachssperma-DNA bei 68°C, e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 %
Formamid bei 42°C, f) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, g) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyr- rolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCI, 75 mM Natriumeitrat bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 500C (schwach stringente Bedingung), i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung), oder j) 500 mN Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 7% SDS (g/V), 1 mM EDTA, 10μg/ml Single stranded DNA, 0,5% BSA (g/V) (Church und Gilbert, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 81 ,
1991 (1984))
(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 0,015 M NaCI/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % SDS bei 500C, b) 0.1X SSC bei 65°C, c) 0,1 X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C, d) 0,1 X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C, oder f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung),
In einer Ausführungsform werden die Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt:
Es wird ein Hybridisierungspuffer gewählt, der Formamid, NaCI und PEG 6000 enthält. Die An- Wesenheit von Formamid im Hybridisierungspuffer destabilisiert Doppelstrang-Nukleinsäure- moleküle, wodurch die Hybridisierungstemperatur auf 42°C gesenkt werden kann, ohne dadurch die Stringenz zu erniedrigen. Die Verwendung von Salz im Hybridisierungspuffer erhöht die Renaturierungsrate einer Duplex-DNA, bzw. die Hybridisierungseffizienz. Obwohl PEG die Viskosität der Lösung erhöht, was einen negativen Einfluß auf Renaturierungsraten besitzt, wird durch die Anwesenheit des Polymers in der Lösung die Konzentration der Sonde im verbleibenden Medium erhöht, was die Hybridisierungsrate steigert. Die Zusammensetzung des Puf- fers ist:
Die Hybridisierungen werden bei 42°C etwa 12 Stunden, beispielsweise über Nacht, durchgeführt. Die Filter werden anschliessend 3x mit 2x SSC + 0,1 % SDS für jeweils ca. 10 min. gewa- sehen.
„Genexpression" und „Expression" sind synomym zu verwenden und meinen das Realisieren der Information, die in einem Nukleinsäuremolekül gespeichert ist.
Das erfindungsgemäße „Verändern" von Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen umfasst bevorzugt deren Mutieren bzw. Mutationen. „Mutationen" im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Veränderung der Nukleinsäureabfolge einer Genvariante in einem Plasmid oder im Genom eines Organismus. Mutationen können z.B als Folge von Fehlern bei der Replikation entstehen oder durch Mutagene hervorgerufen werden. Die Rate der Spontanmutationen im Zellgenom von Organismen ist sehr gering, allerdings sind dem kundigen Fachmann eine Vielzahl von biologischen, chemischen oder physikalischen Mutagenen und Verfahren zum zufälligen oder gezielten Mutieren von Nukleotidsequenzen, und damit letzlich potentiell auch zum Verändern der von diesen kodierten Aminosäuresequenzen, bekannt.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen eines oder mehrerer Nukleinsäu- rereste. Unter Substitutionen versteht man den Austausch von einzelnen Nukleinsäurebasen, dabei unterscheidet man zwischen Transitionen (Substitution einer Purin- gegen eine Purinbase bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und Transversionen (Substitution einer Puringegen eine Pyrimidinbase (oder umgekehrt).
Unter Addition bzw. Insertion versteht man den Einbau von zusätzlichen Nukleinsäureresten in die DNA, wobei es zu Verschiebungen des Leserahmens kommen kann. Bei derartigen Leserahmenverschiebungen unterscheidet man zwischen „in frame" Insertionen/Additionen und „out of frame" Insertionen. Bei den „in-frame" Insertionen/Additionen bleibt der Leserahmen erhalten und ein um die Anzahl der von den insertierten Nukleinsäuren kodierten Aminosäuren vergrößertes Polypeptid entsteht. Bei „out of frame" Insertionen/Additionen geht der ursprüngliche Leserahmen verloren und die Bildung eines vollständigen und funktionstüchtigen Polypeptids ist in vielen Fällen, natürlich abhängig vom Ort der Mutation, nicht mehr möglich.
Deletionen beschreiben den Verlust von einem oder mehreren Basenpaaren, die ebenfalls zu „in frame" oder „out of frame" Verschiebungen des Leserahmens und den damit verbundenen Folgen bezüglich der Bildung eines intakten Proteins führen.
Die zur Erzeugung von zufälligen oder gezielten Mutationen verwendbaren mutagenen Agenzien (Mutagene) und die anwendbaren Methoden und Techniken sind dem Fachmann bekannt. Deratige Methoden und Mutagene sind z.B. beschrieben bei van Harten A.M. ("Mutation breed- ing: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998)), Friedberg E., Walker G., Siede W. („DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing (1995)), oder Sankaranarayanan K., Gentile J. M., Ferguson L. R. („Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences(2000)).
Für die Einführung von gezielten Mutationen können geläufige molekulabiologische Methoden und Verfahren wie z.B der vitro Mutagenese Kits, „LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto), oder PCR Mutagenesen unter Verwendung geeigenter Primer verwendet werden.
Wie bereits oben aufgeführt, gibt es eine Vielzahl von chemischen physikalischen und biologischen Mutagenen.
Die im folgenden aufgeführten seien beispielhaft aber nicht einschränkend genannt.
Chemische Mutagene können gemäß ihres Wirkmechanismus unterteilt werden. So gibt es Basenanaloga (z.B.5-Bromuracil, 2-Aminopurin), mono- und bifunktionale alkylierende Agenzien (z.B. monfunktionale wie Ethylmethylsulfonat, Dimethylsulfat, oder bifunktionale wie Dichlor- ethylsulfit, Mitomycin, Nitrosoguanidin - dialkylnitrosamin, N-Nitrosoguanidin-Derivate) oder interkalierende Substanzen (z.B. Acridin, Ethidiumbromid).
Physikalische Mutagene sind zum Beispiel ionisierende Strahlungen. Ionisierende Strahlungen sind elektromagnetische Wellen oder Teilchenstrahlungen die in der Lage sind, Moleküle zu ionisieren, d.h. aus diesen Elektronen zu entfernen. Die zurückbleibenden Ionen sind meist sehr reaktiv, so dass sie, falls sie in lebendem Gewebe entstehen, großen Schaden z.B an der DNA anrichten können und (bei geringer Intensität) dadurch Mutationen induzieren. Ionisierende Strahlungen sind z.B. Gammastrahlung (Photonenenergie von etwa einem Megaelektronenvolt MeV), Röntgenstrahlung (Photonenenergie von mehreren oder vielen Kiloelektronenvolt keV) oder auch Ultraviolettes Licht (UV-Licht, Photonenenergie von über 3,1 eV). UV Licht bewirkt die Bildung von Dimeren zwischen Basen, am häufigsten sind Thymidindimere, durch die Mutationen entstehen.
Die klassische Erzeugung von Mutanten durch Behandlung der Samen mit mutagenisierenden Agentien wie z.B. Ethylmethylsulfonat (EMS) (Birchler J.A., Schwartz D., Biochem. Genet. 17 (1 1-12), 1173 (1979); Hoffmann G. R., Mutat. Res. 75 (1 ), 63 (1980)) oder ionosierender Strahlung ist durch die Verwendung biologischer Mutagene z.B. Transposons (z.B. Tn5, Tn903, Tn916, TnIOOO, Balcells et al.,1991 , May B.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei U S A. 100 (20), 11541 (2003)) oder molekularbiologischer Methoden wie der Mutagense durch T-DNA Insertion (Feldman K.A., Plant J. 1 , 71 (1991 ), Koncz et al., Plant Mol. Biol. 20 (5), 963 (1992)) erweitert worden.
Bevorzugt ist die Verwendung von chemischen oder biologischen Mutagenen zur Erzeugung von mutierten Genvarianten. Bei den chemischen Agenzien ist besonders bevorzugt die Erzeu- gung von Mutanten durch Verwendung der EMS (Ethylmethylsulfonat) Mutagenese genannt. Bei der Erzeugung von Mutanten unter Verwendung biologischer Mutagene sei bevorzugt die T- DNA-Mutagenese oder Transposonmutagenese genannt.
Somit können beispielsweise auch solche Polypeptide für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, welche man in Folge einer Mutation einer Nukleotidsequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Polypeptid z.B. gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 44, 60, 61 or 62 erhält.
"Transgen" meint zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskasset- te oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor, alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen oder Organismen, in denen sich entweder
(a) die Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz, oder
(b) eine mit der Armadillo-Repeat ARM1 Protein Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
(c) (a) und (b)
nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste(s) sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, geneti- sehe Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Promotors mit dem entsprechenden Armadillo-Repeat ARM1 Protein-Gen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815).
Die erfindungsgemäße Erhöhung der Pathogenresistenz kann auch dadurch erreicht werden, dass die Expression des Pflanzen-eigenen, d.h. endogenen Proteins, welches dem erfindungs- gemäßen Protein entspricht, bzw. einer endogenen Nukleotidsequenz, welche eine erfindungsgemäße Sequenz darstellt, und welche auch den 5'- und/oder 3'-UTR-Bereich umfassen kann, manipuliert wird. Es handelt sich also um eine pflanzeneigene Nukleotid- oder Peptidsequenz, die eine Erhöhung der Pathogenresistenz vermittelt und die bevorzugt ein oder mehrere Arma- dillo-Repeat-Sequenzen aufweist, oder um eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, die für ein solches Protein kodiert. Diese Manipulation kann durch irgendeine Veränderung der Sequenz, bevorzugt eine Mutation, erreicht werden, aber auch beispielsweise durch eine Veränderung der Promotor-DNA-Sequenz des Protein-kodierenden Gens erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte, vorzugsweise erhöhte Expressionsrate des endogenen erfindungsgemäßen Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA-Sequenzen erfolgen. Eine Veränderung der 5'-UTR-Region insgesamt und/oder der Promotor-Sequenz von endogenen erfindungsgemäßen Genen führt in der Regel zu einer Veränderung der exprimier- ten Menge des Gens und/ oder der Funktion des exprimierten Gens bzw. Genprodukts, und damit vorzugsweise auch zu einer Veränderung der in der Zelle bzw. den Pflanzen nachweisbaren Aktivität. Die Veränderung der 5'-UTR-Region insgesamt und/oder der Promotor-Sequenz des erfindungsgemäßen endogenen Gens kann auch zu einer Veränderung der Menge an und/ oder Funktion eines erfindungsgemäßen Proteins in der Zelle führen.
Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Aktivität und des Gehalts des erfindungsgemäßen endogenen Proteins besteht darin, Transkriptionsfaktoren, die in die Transkription des entspre- chenden endogenen Genes involviert sind, z.B. durch Überexpression hochzuregulieren. Die Maßnahmen zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung für erfindungsgemäße Proteine offenbart.
Des Weiteren kann eine erhöhte Expression eines endogenen erfindungsgemäßen Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht-transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt. Bei einem solchen Regulator kann es sich um ein chimäres Protein handeln, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrie- ben. Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle) erfordert, dass das entsprechende DNA-Moleküle in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird und anschließend durch die Genexpression die entsprechenden RNAs und Proteine gebildet werden.
Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527(1990)). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglykol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen in die Zelle eingeführt werden. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entspre- chende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al., Gene 100, 247 (1991); Scheid et al., Mol. Gen. Genet. 228, 104 (1991 ); Guerche et al., Plant Science 52, 11 1 (1987); Neuhause et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987); Klein et al., Nature 327, 70(1987); Howell et al., Science 208, 1265 (1980); Horsch et al., Science 227, 1229 (1985); DeBlock et al., Plant Physiology 91 , 694 (1989); "Methods for Plant Molecular Biology" (Weissbach and Weiss- bach, eds.) Academic Press Inc. (1988); und „Methods in Plant Molecular Biology" (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Trans- formation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch
Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch et al. Science 225, 1229 (1985).
Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, bei denen es sich entweder um einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or interme- diate vector) oder um einen binären Vektor handeln kann. Wird ein Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation verwendet, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch sowohl die rechte als auch die linke Begrenzung der Ti- oder Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA-Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). Das Selektionsmarkergen, zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht, erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakterien. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Helfer-Ti-Plasmid mit der vir- Region enthalten, die für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich ist. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, in „The Binary Plant Vector System", Off- setdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. EMBO J. 4, 277 (1985)). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Im Falle der Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen werden keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen aus den transformierten Zellen vollständige Pflanzen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen, d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten unterschieden werden, wenn ein selektio- nierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist (McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81 (1986)). Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin) zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiele umfassen das bar- Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore et al., Plant Mol. Biol. 21 (5), 871 (1993)), das nptll-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt-Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Es sollten zwei oder mehr Generationen kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes et al. („Techniques for Gene Transfer", in „Transgenic Plants", Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung S.D. und Wu R., Academic Press, S. 128-143 (1993), sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991)). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Kon- strukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise in pBini 9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die BiI- düng von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind auch Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al., Plant Cell Rep. 11 , 567 (1992); Stoeger et al., Plant Cell Rep. 14, 273 (1995); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89, 525 (1994), verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäure- molekül, umfassend die folgenden Elemente in 5'-3'-Orientierung:
regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, operativ daran gebunden eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die in der Pflanzenzelle als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale dienen können.
In besagten Expressionskonstrukten/Expressionskassetten steht ein Nukleinsäuremolekül, dessen Expression (Transkription und ggf. Translation) eine "Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" generiert, bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine Expression in Pflanzen gewährleis- tet. Soll das Expressionskonstrukt direkt in die Pflanze eingeführt und die " Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" dort in planta erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt. Die " Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung" kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze eingebracht werden. In diesem sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen gene- tischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in der jeweils für die Herstellung gewählte Pflanze erlauben.
Unter Operativ (daran) gebunden" bzw. „funktionell (damit) verknüpft" versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäurese- quenz (zum Beispiel einer " Armadillo-Repeat ARM1 Protein Verbindung") und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen (bzw. regulatorischen) Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäu- resequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforder- lieh. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevor- zugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T., Fritsch E. F. und Sambrook J., „Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual", CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY) (1989), in Silhavy TJ. , Berman M. L. und Enquist L.W. „Experiments with Gene Fusions", CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY) (1984), in Ausubel F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) und bei Gelvin et al., in "Plant Molecular Biology Manual" (1990) beschrieben sind. Zwischen beiden Sequenzen kön- nen aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimieren- der Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Trans- formation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft mit weiteren Verfahren, die eine Pathogenre- sistenz (beispielsweise gegen Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden etc.), Stressresistenz oder eine andere Verbesserung der pflanzlichen Eigenschaften bewirken, kombiniert werden. Bei- spiele sind u.a. genannt bei Dunwell J. M., J. Exp. Bot. 51 , (Spec No) 487 (2000).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erzeugung oder Erhöhung der Funktion eines Armadillo-Repeat ARM1 Proteins in einer Pflanze kombiniert mit einer Erhöhung der Aktivität eines Bax Inhibitor 1-Proteins. Dies kann beispielsweise durch Expression einer für ein Bax- lnhibitor-1 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, z.B. im Mesophyllgewebe und/oder Wurzelgewebe erfolgen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind die Bax-lnhibitor-1 Proteine aus Hordeum vulgäre oder
Nicotiana tabacum besonders bevorzugt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuremoleküle kodierend für Armadillo-Repeat ARM1 Proteine aus Gerste gemäß den Polynukleotiden SEQ.
ID No: 1 umfassen, sowie die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, und die durch
Entartung (Degeneration) des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen und die für funktio- nelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ. ID No.: 1 kodierenden Nukleinsäuremoleküle, wobei die Nukleinsäuremoleküle nicht aus der SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23,
25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 bestehen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft das Armadillo-Repeat ARM1 Protein aus Gerste gemäß SEQ. ID No.: 2 oder eines, das diese Sequenzen umfasst, sowie funktionelle Äquivalente davon, die nicht einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 42, oder 44, entsprechen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfassen. In den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Armadillo-Repeat ARM1 Proteine aus Gerste, Weizen und Mais mit mindestens einem genetischen Kontrollelement nach obiger Definition derart verknüpft, dass die Expression (Transkription und ggf. Translation) in einem beliebigen Organismus - bevorzugt in monokotyledonen Pflanzen - realisiert werden kann. Dazu geeignete genetische Kontrollelemente sind oben beschrieben. Die transgenen Expressionskassetten können auch weitere Funktionselemente gemäß obiger Definition enthalten.
Derartige Expressionskassetten enthalten beispielsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z.B. eine die im Wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül nach SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 oder einem erfindungsgemäßen Fragment davon, wobei besagte Nukleinsäuresequenz bevor- zugt in Sense-Orientierung oder in Antisense-Orientrierung zu einem Promotor vorliegt und damit zur Expression von sense- oder antisense-RNA führen kann, wobei es sich bei dem besagten Promotor um einen in Pflanzen aktiven, bevorzugt um einen durch Pathogenbefall induzierbaren Promotor handelt. Erfindungsgemäß sind auch transgene Vektoren umfaßt, die die besagten transgenen Expressionskassetten beinhalten.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, - kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkript.es des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21 , 285 (1980); Odell et al., Nature
313, 810 (1985); Shewmaker et al., Virology 140, 281 (1985); Gardner et al., Plant Mol. Bi- ol. 6, 221 (1986)) oder der 19S CaMV-Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al., EMBO J. 8, 2195-2202 (1989)). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der Promotor der Nopalinsyntha- se aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase)-Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin-Promotor (Holtorf S. et al., Plant Mol. Biol. 29, 637 (1995)), der Ubiquitin 1 -Promotor (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18, 675 (1992); Bruce et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 9692 (1989)), der Smas-Promotor, der Cinnamylal- koholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991 ), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflan- zen dem Fachmann bekannt ist. Als konstitutiver Promotor insbesondere bevorzugt ist der
Promotor des Nitrilase-1 (nit1) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al., Gene 170,197 (1996)).
Gewebespezifische Promotoren
In einer Ausführungsform werden Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen verwendet.
Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos et al., Plant Cell 1 (9), 839 (1989)), des 2S-Albumingens (Joseffson et al., J. Biol. Chem. 262, 12196 (1987)), des Legumins (Shirsat et al., Mol. Gen. Genet. 215 (2), 326 (1989)), des USP (unknown seed protein; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (3), 459 (1991)), des Napin-Gens (US 5,608,152; Stalberg et al., L. Planta 199, 515 (1996)), des Gens kodierend für das Saccharosebindeprotein (WO 00/26388) oder der Le- gumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225, 121 (1991); Bäumlein et al, Plant Journal 2 (2), 233 (1992); Fiedler et al., Biotechnology (NY) 13 (10), 1090 (1995)), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP-Glucose-Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner
Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promotor des lpt2- oder des lpt1 -Gens (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen Promotoren (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin- Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des
Secalin-Gens).
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Pa- tatin-Promotor Klasse I (B33) und der Promotor des Cathepsin D-Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose- 1 ,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)). Epidermis-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor des OXLP-Gens ("Oxalat-Oxidase like protein"; Wei et al., Plant Mol. Biol. 36, 101 (1998)), ein Promotor bestehend aus dem GSTA1 -Promotor und dem WIR1 a-lntron (WO 2005/035766) und der GLP4-Promotor (WO2006/128882 = PCT/EP 2006/062747).
Andere gewebespezifische Promotoren sind z.B. blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen-Synthase-Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des Prr- Gens (WO 98/22593) und Antheren-spezifische Promotoren wie der 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051 ), der globl-Promotor und der γ-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89 (1997)), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22, 361 (1993)), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)), ein durch Abscisin- säure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ganz besonders vorteilhaft ist die Verwendung von pathogen-induzierbaren Promotoren, da diese eine Expression nur im Bedarfsfall (d.h. Pathogenbefall) ermöglichen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden daher in einer Ausführungsform in Pflanzen ak- tive Promotoren verwendet, bei denen es sich Pathogen-induzierbare Promotor handelt.
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR- Proteinen, ß-1 ,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al., Neth. J. Plant Pathol. 89, 245 (1983); Uknes et al., Plant Cell 4, 645 (1992); Van Loon Plant Mol. Viral. 4,
11 1 (1985); Marineau et al., Plant Mol. Biol. 9, 335 (1987); Matton et al. Molecular Plant- Microbe Interactions 2, 325 (1987); Somssich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2427 (1986); Somssich et al., Mol. Gen. Genetics 2, 93 (1988); Chen et al., Plant J. 10, 955 (1996); Zhang and Sing, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 , 2507 (1994); Warner et al., Plant J. 3, 191 (1993); Siebertz et al., Plant Cell 1 , 961 -968 (1989)). Umfasst sind auch durch Verwundung induzierbare Promotoren wie der des pinll-Gens (Ryan, Ann. Rev. Phytopath. 28, 425 (1990); Duan et al., Nat. Biotech. 14, 494 (1996)), des wun1- und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215, 200 (1989)), des Systemin-Gens (McGurl et al., Science 225, 1570 (1992)), des WIP1-Gens (Rohmeier et al., Plant Mol. Biol. 22, 783 (1993); Eckelkamp et al., FEBS Letters 323, 73 (1993)), des MPI-Gens (Corderok et al., Plant J. 6 (2), 141 (1994)) und dergleichen.
Eine Quelle für weitere pathogen-induzierbare Promotoren stellt die PR-Genfamilie dar. Eine Reihe von Elementen in diesen Promotoren haben sich als vorteilhaft erwiesen. So vermittelt der Nukleotidbereich von Nukleotid -364 bis Nukleotid -288 im Promotor von PR-2d Salicylat-Spezifität (Buchel et al., Plant Mol. Biol. 30, 493 (1996)). Die Sequenz 5'- TCATCTTCTT-3' taucht im Promotor der Gersten ß-1 ,3-Glucanase und in mehr als 30 weiteren Stress-induzierten Genen wiederholt auf. Diese Region bindet in Tabak ein nukleä- res Protein, dessen Menge durch Salicylat erhöht wird. Die PR-1 -Promotoren aus Tabak und Arabidopsis (EP-A 0 332 104, WO 98/03536) eignen sich ebenfalls als pathogen- induzierbare Promotoren. Bevorzugt, da besonders spezifisch durch Pathogen induziert, sind die "acidic PR-5"-(aPR5)-Promotoren aus Gerste (Schweizer et al., Plant Physiol. 114, 79 (1997)) und Weizen (Rebmann et al., Plant Mol. Biol. 16, 329 (1991)). aPR5-Proteine akkumulieren in ca. 4 bis 6 Stunden nach Pathogenbefall und zeigen nur eine sehr geringe
Hintergrundexpression (WO 99/66057). Ein Ansatz, um eine erhöhte pathogen-induzierte Spezifität zu erreichen, bildet die Herstellung synthetischer Promotoren aus Kombinationen von bekannten pathogen-responsiven Elementen (Rushton et al., Plant Cell 14, 749 (2002); WO 00/01830; WO 99/66057). Weitere pathogen-induzierbare Promotoren aus verschiedenen Arten sind dem Fachmann bekannt (EP-A 1 165 794; EP-A 1 062 356; EP-
A 1 041 148; EP-A 1 032 684).
Weitere pathogen-induzierbare Promotoren umfassen den Flachs Fis1 -Promotor (WO 96/34949), den Vst1 -Promotor (Schubert et al., Plant Mol. Biol. 34, 417 (1997)) sowie den EAS4 Sesquiterpen-Cyclase-Promotor aus Tabak (US 6,100,451 ).
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden, wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (bzw. gst1 Promotor) z.B. aus Kartoffel (WO 96/28561 ; Ward et al., Plant Mol. Biol. 22, 361 (1993)), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hspδO-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare alpha-Amylase-Promotor aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht- induzierbare PPDK-Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promotor (EP-A 0 375 091 ).
e) Mesophyllgewebe-spezifische Promotoren „Mesophyllgewebe" meint das zwischen den Epidermisschichten liegende Blattgewebe, bestehend aus dem Palisadengewebe, dem Schwammgewebe und den Blattadern.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in einer Ausführungsform Mesophyllgewebe- spezifische Promotoren wie beispielsweise der Promotor des Weizen Germin 9f-3.8 Gens
(GenBank Acc.-No.: M63224) oder der Gerste GerA-Promotor (WO 02/057412) verwendet. Besagte Promotoren sind besonders vorteilhaft, da sie sowohl Mesophyllgewebespezifisch als auch pathogen-induzierbar sind. Ferner geeignet ist der Mesophyllgewebespezifische Arabidopsis CAB-2 Promotor (GenBank Acc.-No.: X15222), sowie der Zea mays PPCZmI -Promotor (GenBank Acc.-No.: X63869) oder Homologe davon. Mesophyllgewebe-spezifisch meint eine durch die spezifische Wechselwirkung von in der Promotorsequenz vorhandenen Cis-Elementen und an diese bindende Transkriptionsfaktoren hervorgerufene Beschränkung der Transkription eines Gens auf möglichst wenige, das Mesophyllgewebe enthaltende Pflanzengewebe, vorzugsweise ist eine auf das Mesophyllge- webe beschränkte Transkription gemeint.
Weitere Mesophyll-spezifische Promotoren sind PPCZmI (= PEPC; Kausch, Plant Mol.
Biol. 45, 1 (2001)); OsrbcS (Kyozuka et al., Plant Phys. 102, 991- (1993)); OsPPDK, acc.
AC099041 ; TaGF-2.8, acc. M63223 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999)); TaFBPase, acc. X53957;.TaWIS1 , acc. AF467542 (US 2002/1 15849); HvBISI , acc. AF467539 (US
2002/115849); ZmMISI , acc. AF467514 (US 2002/115849); HvPRIa, acc. X74939 (Bryn- gelsson et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 7 (2), 267 (1994); HvPRI b, acc.
X74940 (Bryngelsson et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 7 (2), 267 (1994));
HvB1 ,3gluc; acc. AF479647; HvPrxδ, acc. AJ276227 (Kristensen et al., Molecular Plant Pathology 2 (6), 31 1 (2001)); und HvPAL, acc. X97313 (Wei, Plant Molecular Biology 36,
101 (1998)).
Epidermis-spezifische Promotoren
„Epidermisgewebe" oder Epidermis meint die äußeren Gewebeschichten der Pflanzen. Die
Epidermis kann ein- bis mehrschichtig sein; es gibt epidermis-„angereicherte" Genexpression, wie z.B. von Cer3 , die als Marker dienen kann (Hannoufa, Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
Unter „Epidermis" versteht der Fachmann vorzugsweise das vorherrschende Abschlussgewebe primärer oberirdischer Pflanzenteile, z.B. des Sprosses, der Blätter, Blüten, Früchte und Samen.
Epidermisspezifische Promotoren sind beispielsweise WIR5 (=GstA1), acc. X56012 (Dud- ler & Schweizer, unveröff.); GLP4, acc. AJ310534 (Wei, Plant Molecular Biology 36, 101
(1998)); GLP2a, acc. AJ237942 (Schweizer, Plant J. 20, 541 (1999).); Prx7, acc. AJ003141 (Kristensen, Molecular Plant Pathology 2 (6), 31 1 (2001 )); GerA, acc. AF250933 (Wu, Plant Phys. Biochem. 38, 685 (2000)); OsROCI , acc. AP004656; RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 (Klöti, PMB 40, 249 (1999)) und Cer3 (Hannoufa, Plant J. 10 (3), 459 (1996)).
g) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifungs-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungs-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Besonders bevorzugt sind konstitutive, sowie Blatt- und/oder Stengel-spezifische, pathogen- induzierbare, Wurzel-spezifische, Mesophyllgewebe-spezifische Promotoren, wobei konstituti- ve, pathogen-induzierbare, Mesophyllgewebe-spezifische und Wurzel-spezifische Promotoren am meisten bevorzugt sind.
Es können ferner weitere Promotoren operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli-Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind beschrieben (Rogers et al., Meth. in Enzymol. 153, 253 (1987); Schardl et al., Gene 61 , 1 (1987); Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 8402 (1989)).
Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA-Protein-Bindungsstudien z. B. weitere epidermis-spezifische regulatorische Nukleinsäureelemente identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt das gewünschte Gewebe aus dem gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, isoliert und daraus die gesamte poly(A)+-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem anderen Gewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich im gewünschten Gewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Gewebe-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Gewebe-spezifischer Promotoren zur Verfügung.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäure- sequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promotor opera- tiv verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder euka- ryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor mit einer vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nuk- leinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zu- sätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E. und Chua N. H., J. Biol. Chem. 266 (26), 17131 (1991)) und Hitzestress (Schoffl F. et al., Mol. Gen. Genet. 217 (2-3), 246 (1989)) beschrieben.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierten Regionen (5'-UTR), Introns oder die nicht-kodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1 , 2 und 6 (allgemein: „The Maize Handbook", Chapter 1 16, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'- untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Bei- spielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (GaIMe et al., Nucl. Acids Res. 15, 8693 (1987)) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebespezifität fördern (Rouster J. et al., Plant J. 15, 435 (1998)). Besonders bevorzugt ist die natürliche 5'-UTR des HvArm-Gens, und insbesondere die mit der Sequenz entsprechend SEQ ID No: 64 oder einer dazu zu mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, oder insbesondere 99% oder mehr identischen Sequenz.
Das rekombinante Nukleinsäuremolekül kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer"-Sequenzen funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimieren- den Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylie- rungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignalen aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti- Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octo- pin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte ausgetauscht werden.
Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül und ein von ihr abgeleiteter Vektor können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungs- gemäßen Nukleinsäuremoleküle, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-
Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA-Sequenzen, die für Phosphinothricinace- tyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP-Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(Phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox-Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh-Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), sowie bxn-Gene, die für Bro- moxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleiht, das Streptomycinphosphotransferase (SPT)- Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin vermittelt, das Neomycinphosphotransferase
(NPTII)-Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygro- mycinphosphotransferase (HPT)-Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthase-Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation), sowie das Acetolactatsynthase-Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide verleiht. b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn und Groskreutz, Mol. Biotechnol. 13 (1), 29 (1999)) wie das "green fluorescen- ce protein" (GFP) (Sheen et al., Plant Journal 8 (5), 777 (1995); Haseloff et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 94 (6), 2122 (1997); Reichel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (12), 5888 (1996); Tian et al., Plant Cell Rep. 16, 267 (1997); WO 97/41228; Chui et al., Curr Biol 6, 325 (1996); Leffel et al.,Biotechniques 23(5): 912-8(1997)), die Chlorampheni- coltransferase, eine Luziferase (Ow et al., Science 234, 856 (1986); Miliar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 10, 324 (1992)), das Aequoringen (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 126 (3), 1259 (1985)), die ß-Galaktosidase, das R-Locus Gen (kodiert ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., in „Chromosome Struc- ture and Function: Impact of New Concepts", 18th Stadler Genetics Symposium, 1 1 , 263
(1988), ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glukuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901 (1987)).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressions- kassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt
ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook Sambrook J. et al., in „Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", 2. Auflage, CoId Spring Harbor Labo- ratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium-vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
Zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektio- nierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich transformierten Zellen eine Resis- tenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-
Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht, und damit die Selektion der transformierten Zellen gegenüber untransformierten erlaubt (McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81 (1986)).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin transgene Pflanzenzellen und transgene Pflanzen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassen, sowie Teile der Pflanzen, transgene Ernteprodukte und trans- genes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, KaIIi, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanze.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft Pflanzen, die durch natürliche Vorgänge oder künstlich induziert eine oder mehrere Mutationen in einem Nukleinsäuremolekül enthalten, das die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfaßt, wobei besagte Mutation eine Erhöhung der Aktivität, Funktion oder Polypeptidmenge eines der durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 kodierten Po- lypeptids bewirkt. Beispielsweise eine durch Tilling hergestellte und identifizierte Mutation.
Bevorzugt sind dabei monokotyledone Pflanzen, insbesondere solche die zu der Familie der Poaceae gehören, besonders bevorzugt sind Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, ganz besonders be- vorzugt Pflanzen ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
Folglich betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform eine Pflanze, insbesondere eine monokotyledone Pflanze, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welche eine Mutation enthält, die eine Erhöhung der Aktivität eines der durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine in der Pflanze oder Teilen davon bewirkt. Beispielsweise betrifft die Mutation einen oder mehr Aminosäurereste, die in der in den Figuren gezeigten Con- sensussequenz als konserviert oder hochkonserviert markiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft folglich transgene Pflanzen, transformiert mit wenigstens
a) einer Nukleinsäuresequenz, die Nukleinsäuremoleküle gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 umfasst, enthalten, die dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, oder die für funktionelle Äquivalente der Polypeptide gemäß SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodierenden Nukleinsäuremoleküle;
b) einer transgenen Expressionskassette, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfaßt, oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Pflanze oder die erfindungsgemäß verwendete Pflanze keine Arabidopsis thaliana.
Als „transgene Organismen" bevorzugte Wirts- oder Ausgangs-organismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. In einer Ausführungsform ist der transgene Organismus eine reife Pflanze, Saatgut, Spross und Keimling, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. „Reife Pflanze" meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. „Keimling" meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. Insbesondere als Wirtsorganismen bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, auf die der erfindungsgemäße Verfahren zum Erzielen einer Pa- thogenresistenz gemäß oben genannten Kriterien angewendet werden kann. In einer Ausfüh- rungsform ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze wie z.B. Weizen, Hafer, Hirse, Gerste, Roggen, Mais, Reis, Buchweizen, Sorghum, Triticale, Dinkel oder Zuckerrohr, insbesondere ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aesti- vum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sativa (Reis).
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die erfindungsgemäß beschriebenen transgenen Pflanzen, die zusätzlich über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität verfügen, bevorzugt sind dabei Pflanzen, die eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, besonders bevorzugt sind transgene Pflanzen die zu der Familie der Poaceae gehören und eine erhöhte Bax Inhibitor 1 Aktivität in Mesophyllzellen oder Wurzelzellen aufweisen, am meisten bevorzugt sind transgene Pflanzen ausgewählt aus den Pflanzengattungen Hor- deum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza, am allermeisten bevorzugt sind die Pflanzenarten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus oder ein Teil davon mit einer der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle Expressionskas- setten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Fein- chemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Ge- schmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedi- um erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood E. E., Jilka J. M., Curr Opin Biotechnol. 10 (4), 382 (1999).; Ma J. K., Vine N. D., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 236, 275 (1999).
Erfindungsgemäß kann die Expression eines Strukturgens natürlich auch unabhängig von der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände erfolgen oder beeinflusst werden.
Die folgenden Beispiele dienen stellen Ausführungsformen der Erfindung dar und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Umfang der Erfindung, wie er im Rest der Beschreibung, der Figuren und Ansprüche enthalten ist, einschränken sollen.
Sequenzen:
1. SEQ ID NO:1 und 2: HvArm
2. SEQ ID NO: 3 und 4: OS_1_XM_479734.1
3. SEQ ID NO: 5 und 6 Os_2_XM_463544
4. SEQ ID NO: 7 und 8 Os_3_AP003561 5. SEQ ID NO:9 und 10 Os_4_XM_506432
6. SEQ ID NO:11 und 12 NT_1_AY219234
7. SEQ ID NO: 13 und 14 At_1_NM_127878
8. SEQ ID NO: 15 und 16 At_2_AC004401
9. SEQ ID NO: 17 und 18 At_3_BT020206 10. SEQ ID NO:19 und 20 At_4_AB007645
1 1. SEQ ID NO: 21 und 22 At_5_NM_1 15336 (At3g54790)
12. SEQ ID NO:23 und 24 At_6_AK118613
13. SEQ ID NO: 25 und 26 At_7_AL138650
14. SEQ ID NO: 27 und 28 At_8_AL133314 15. SEQ ID NO: 29 und 30 At_9_AC010870
16. SEQ ID NO: 31 und 32 At_10_AY125543 (At3g01400)
17. SEQ ID NO:33 und 34 At_11_AY087360
18. SEQ ID NO: 35 und 36 At_12_AB016888
19. SEQ ID NO: 37 und 38 At_13_AK175585 20. SEQ ID NO: 39 und 40 At_14_AL049655
21. SEQ ID NO: 41 und 42 At_15_AY096530 (At3g54850)
22. SEQ ID N 0:43 und 44 At_16_AK1 18730 (At4g 16490)
23. SEQ ID NO: 45 bis 59: Primer
24. SEQ ID NO: 60, 61 , 62: Consensussequenzen der Polynukleotid SEQ ID NO. aus 1. bis 22.
25. SEQ ID NO: 63: 5'UTR in Kombination mit der Sequenz von HvArm
26. SEQ ID NO: 64: 5'UTR von HvArm Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Nukleinsäuresequenzen von ARM1 aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thali- ana.
Figur 2: Polypeptidsequenzen von ARM1 aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thaliana.
Figur 3: Sequenzvergleich von ARM1 Proteinsequenzen Polypeptiden aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thaliana.
Figur 4: Erhöhung der Mehltauresistenz von Weizen durch Einbringen und Exprimie- ren von ARM-Repeat-Sequenzen
Figur 5: Consensussequenzen des Sequenzvergleich von ARM1 Proteinsequenzen
Polypeptiden aus Gerste, Reis, und Arabidopsis thaliana.
Figur 6: Nukleinsäuresequenz von ARM1 aus Gerste einschließlich der 5'-UTR-
Region
Beispiele
Allgemeine Methoden:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al., CoId Spring Harbor Labora- tory Press (1989); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma MWG- Licor nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc Natl Acad Sei U. S.A. 74, 5463 (1977)).
Beispiel 1 : Pflanzen, Pathogene und Inokulation
Die Gerstensorte Golden Promise stammt von Patrick Schweizer, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben. Die Sorte Pallas und die rückgekreuzte Linie BCIngrid-mlo5 wurden von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agriculturai University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Ihre Herstellung ist beschrieben (KΘlster P. et al., Crop Sei. 26, 903 (1986)). Die Weizensorte Kanzler stammt ebenfalls von Patrick Schweizer, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben.
Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Gerste- oder Weizensaatgut wird, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8x8cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen werden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht / 8-stündigen Dunkel- heitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 μmols-1nτ2 Photonenflussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt werden, sind diese vollständig entwickelt.
Vor Durchführung der transienten Transfektionsexperimente werden die Pflanzen in Klima- schränken oder -kammern bei tagsüber 24°C, nachts 200C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16stündigen Licht / δstündigen Dunkelheitszyklus mit 30000 lux kultiviert.
Für die Inokulation von Gerstenpflanzen wird Echte Gerstenmehltau Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchai der Rasse A6 (Wiberg A. Hereditas 77, 89 (1974)) (BghA6) verwendet. Dieser wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgt in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.
Für die Inokulation von Weizenpflanzen wird der Echte Weizenmehltau Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. tritici verwendet. Dieser Mehltau wurde von Feldpflanzen isoliert. Die Nachzucht des Inokulums erfolgt in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Gerste- und Weizenpflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Pflanzen bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.
Beispiel 2: RNA-Extraktion
Gesamt RNA wird aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert.
Dazu werden zentrale Primärblattsegmente von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wird bis zur RNA-Extraktion bei -700C gelagert.
Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wird 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml_) mit 1 ,7 ml_ RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 μl_ Chloroform wird erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur 45 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wird zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere (wässrige) Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wässrige Phase wird erneut mit 900 μl_ Chloroform gereinigt, indem 3-mal für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s.o.) und abgehoben wird. Zur Fällung der RNA wird dann 850 μl_ 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wird für 20 min zentrifugiert (s.o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 ml_ 70 %iges Ethanol (-200C) hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird dann wiederum dekantiert und das Pelet vorsichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wird. Danach wird die RNA in 50 μL DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s.o.). 40 μl des Überstandes werden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -700C gela- gert.
Die Konzentration der RNA wird photometrisch bestimmt. Dazu wird die RNA-Lösung 1 :99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm gemessen (E260 nm = 1 bei 40 μg RNA/mL). Gemäß der errechneten RNA-Gehalte wer- den die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 μg/μL angeglichen und im Agarosegel überprüft.
Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1 % Agarose in 1 x MOPS-Puffer mit 0,2 μg/mL Ethidiumbromid) wird 1 μl_ RNA-Lösung mit 1 μL 10 x MOPS, 1 μL Farbmarker und 7 μL DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1x MOPS-Laufpuffer über 1 ,5 h aufgetrennt und unter UV-Licht fotographiert. Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA-Extrakte werden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.
Beispiel 3: Klonierung der HvARM-cDNA-Sequenz aus Gerste
Die zur Isolation der Armadillo cDNA, ihrer Klonierung, Sequenzierung benötigten cDNA Fragmente wurden mittles RT-PCR unter Verwendung des GeneRacer Kit (Fa. Invitrogen Life Technologies) erhalten. Dazu wurde Gesamt-RNA aus Gerstenepidermis als Matrize verwendet. Die RNA wurde aus Epidermiszellen von Gerste Ingrid + Bgt 12h und 24h nach Infektion isoliert.
Die cDNA-Sequenz von HvArm wurde mittels der RACE-Technologie unter Verwendung des "GeneRacer Kit" (INVITROGENE Life Technologies) verlängert. Dazu wurden 4000 ng Gesamt- mRNA, 1 μL 10xCIP-Puffer, 10 Units RNAse-lnhibitor, 10 Units CIP ("calf intestinal phosphata- se") und DEPC-behandeltes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 μL für 1 h bei 500C behandelt. Zur Präzipitation der RNA wurden weitere 90 μL DEPC-Wasser und 100 μL Phe- nokChloroform hinzugegeben und intensiv für ca. 30 sek durchmischt. Nach 5 min Zentrifugati- on bei 20.000 g wurde die obere Phase mit 2 μl 10 mg/ml Mussei Glycogen, 10 μl 3 M Natrium- acetat (pH 5,2) in einem neuen Mikroreaktionsgefäß versetzt. 220 μl 95 % Ethanol wurden hinzugegeben und die Mischung auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die RNA durch Zentrifuga- tion für 20 min bei 20.000 g und 4°C präzipitiert. Der Überstand wurde verworfen, 500 μl 75 % Ethanol hinzugegeben, kurz gevortext und wieder für 2 min zentrifugiert (20000 g). Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Präzipitat für 2 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und anschließend in 6 μl DEPC-Wasser suspendiert. mRNA CAP-Strukturen wurden durch Zugage von 1 μl 1 OxTAP Puffer, 10 Units RNAsin und 1 Unit TAP ("tobacco acid py- rophosphatase") entfernt. Die Mischung wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend auf Eis gekühlt. Die RNA wurde wiederum - wie oben beschrieben - präzipitiert und in ein Reaktionsgefäß mit 0,25 μg GeneRacer Oligonukleotid-Primer überführt. Der Oligonukleotid-Primer wurde in der RNA-Lösung resuspendiert, die Mischung für 5 min bei 700C inkubiert und dann auf Eis gekühlt. 1 μl 10xLigasepuffer, 10 mM ATP, 1 Unit RNAsin und 5 Units T4 RNA-Ligase wurden hinzugegeben und der Reaktionsansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde wie- derum - wie oben beschrieben - präzipitiert und in 7 μl DEPC-Wasser resuspendiert. 10 pMol GeneRacer Oligo-dT Primer und 2 μL jeder dNTP-Lösung (25 mM) wurden zu der RNA gegeben, für 10 min auf 700C erhitzt und wieder auf Eis gekühlt. Anschließend wurde ein Mix aus 2 μL 1OxRT buffer, 4μl 25mM MgCI2, 2μl 0,1 M DTT, 5U (1 μl) Superscriptlll Transkriptase (200 U/μl) und 1 μl RNAse Out (40 U/μl) hinzugegeben, die Reaktionslösung für 50 min bei 500C in- kubiert und anschließend für 5 min bei 85°C inaktiviert. Nach einer Inkubation von 20 min bei 37°C mit 1 μl RNAse H (2 U/μl) wurde die so hergestellte Erststrang-cDNA bei -200C gelagert.
Für die RT-PCR wurden folgende Primer verwendet:
GeneRacer Oligo-dT-Primer (Fa. Invitrogen Life Technologies):
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 (Seq ID No.: 45)
Für die Reaktion (20 μL-Ansatz) wurden je 4000 ng Gesamt-RNA, 10 mM dNTPs, 50μM GeneRacer Oligo-dT-Primer (Fa. Invitrogen Life Technologies), 1 μl RNase-lnhibitor und 1 μl En- zymmix in 1x RT-Puffer (GeneRacer Kit Invitrogen) eingesetzt.
Die Reaktion wurde für 50 Minuten bei 50°C inkubiert.
Zur Amplifikation der 5'-cDNA-Enden wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 1 :
5'GCAGACATGACCCAATCTTGGCAGG 3' (Seq ID No.: 46)
GR 5'Primer (Invitrogen): 5'cgactggagcacgaggacactga 3' (Seq ID No.: 47)
MWG 2: 5'CCACGGTCAGCAACCTCTCCAGACG 3' (Seq ID No.: 48)
GeneRacer 5'nested Primer (Invitrogen): 5'ggacactgacatggactgaaggagta 3' (Seq ID No.: 49)
MWG 3:
5' cagatgatagttattgttgttgactgg 3' (Seq ID No.: 50)
GR 3'Primer (Invitrogen): 5' GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3' (Seq ID No.: 51)
MWG 4:
5'ctcatcttctcaagctactggtgg 3' (Seq ID No.: 52)
GeneRacer 3'nested Primer (Invitrogen):
5'CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3' (Seq ID No.: 53)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50 μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung:
4 μl MWG1 (10 pmol/μL)
4,5 μl 5'Gene Racer (10 pmol/μL)
5 μl 1 Ox Puffer Roche
1 ,5 μl 1 O mM dNTPs
1 μl cDNA 1 μl Taq (Roche)
33 μl H2O
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems): 94°C 2 min Denaturierung
5 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung)
72°C 2 min (Extension) 5 Zyklen mit 940C 30 sek (Denaturierung)
700C 2 min (Extension) 30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung)
65°C 30 sek (Annealing)
68°C 2 min (Extension)
68°C 7 min abschließende Extension
4°C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung Die PCR ergab kein Produkt. Davon ausgehend wurde eine „nested"-RACE mit MWG2, dem Armadillo-spezifischen Oligonukleotidprimer und dem „GeneRacer Nested 5'Primer" durchgeführt: 94°C 2 min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung) 65°C 30 sek (Annealing) 68°C 2 min (Extension) 68°C 7 min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung
Die PCR ergab ein Produkt von ca. 850bp. Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein 1 % A- garosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Gerste.
Zur Amplifikation der Volllängensequenz von HvArm wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 29: 5'atatgcaaatggctctgctag 3' (Seq ID No.: 54)
MWG 30:
5 TATCATCTCCTTCCCGAGTTC 3' (Seq ID No.: 55)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung:
4 μl MWG29 (10 pmol/μL)
4 μl MWG30 (10 pmol/μL)
5 μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene) 1 ,5 μl 1 OmM dNTPs
1 μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33 μl H2O
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems):
94°C 2 min Denaturierung
30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung) 55°C 30 sek (Annealing)
72°C 1 ,5 min (Extension) 72°C 7min abschließende Extension 4°C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung
Die PCR ergab ein Produkt von 1326bp. Das erhaltene PCR-Produkt wurde über ein 1 % Aga- rosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiedergegebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Gerste.
Beispiel 4: Klonierung der genomischen Volllängensequenz von HvARM:
1 ) BAC-Screening zur Identifizierung des Klones, der die erfindungsmässige Sequenz enthält.
Für die Identifizierung des Genes kodierend für die erfindungsmässige Sequenz in Gerste wurden DNA-pools aus einer Gersten-BAC-Bibliothek (Yu et al., TAG 101 ,1093 (2000)) verwendet. BAC Klone, welche die erfindungsmässige Sequenz tragen, wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer 5' TAA TGA TAA TCT TCC TAA TAC CCG TCA G und 5' CCT TTG AGG GGC AGA AGA GAT AG identifiziert. Dabei wurden zwei überlappende BAC-Klone Nr. 705A01 sowie Nr. 581 D24 identifiziert, welche das identitische HvARM-Gen enthielten.
Identifizierte Einzelklone wurden für die Gen- und Promotoridentifizierung in zwei Stufen subkloniert. Zunächst wurde die BAC-DNA eines Einzelklones mittels Qiagen-Säule isoliert (Maxi-Kit; Qiagen; Isolierung nach Herstellerprotokoll). Durch Scherung (Hydroshear: Genomic Solutions) wurden von dieser BAC-DNA 5 - 10 kbp Fragmente erzeugt und die entstandenen Enden mit Klenow zu glatten Enden aufgefüllt (Reaktion nach Protokoll des Herstellers). Die Selektion der Fragmentlängen erfolgte über ein 0,8%iges Agarosegel in 0,5 % TBE. Aus dem Gel wurde der entsprechende Fragmentlängenbereich herausgeschnitten und die DNA aus dem Agarosegel mit Hilfe von Qiagen Gel Extraction Kit eluiert (Elution nach Protokoll des Herstellers). Die eluierten 5-10 kbp Fragmente werden in einen mit EcoRV linearisierten pBluescript Il SK(-) Vektor mit glatten dephosphorylierten Enden ligiert (Restriktion und Dephosphorylierung entsprechend den Herstellerangaben) und in hochkompetente E. coli Zellen chemisch-thermisch transformiert. Anschließend werden die Transformanten mit Hilfe eines Picking-Roboters (Qpick, Genetix) willkürlich geordnet und in Mikrotiterplatten mit LB-Medium überführt.
Mittels PCR wurde dasjenige Subfragment ausgewählt, welche das interessierende Gen trägt und die Länge des potenziellen 5'-upstream Bereichs maximiert. Das gewählte Subfragment wurde erneut in 1-2 kbp Fragmente geschert, ligiert, transformiert und die Klone in Microtiterplatten gelagert (s.o.). Von den gepickten Klonen wurden 96 Kolonien willkürlich ausgewählt und mit dem TempliPhi Protokoll nach Herstellerprotokoll sequenziert. Die Sequenzen wurden assembliert. Die erhaltene Sequenzinformation wurde für die Annotation der kodierenden Exons im Vergleich zu bereits bekannten Sequenzen anderer Organismen genutzt, um die erfindungsmässige Sequenz und ihre potenziellen Promotoren zu bestimmen. PCR:
Die PCR wurde aufgrund ihrer hohen Sensitivität zum Nachweis der gesuchten DNA-Sequenz gewählt. Die Analyse wurde in 20 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Der Reaktionsansatz bestand aus 10 mM Tris-HCI, pH 9,0; 50 mM KCl; 0,1 % Triton X-100, 0,2 mM dNTP; 2 mM MgCI2, je 0,6 μM Oligonukleotide und Taq-Polymerase (Konzentration im Reaktionsansatz: ~ 1 U μh1). Pro Reaktionsansatz wurden entweder 10 ng BAC-Pool-DNA oder 2 μl Bakterienkultur (für Kolonie-PCR) verwendet. Vorhandene cDNA-Sequenzen dienten als Grundlage zur Ableitung der Oligonukleotide 5' CAG CCA CCA CCA ACC CAA AC und 5' GCC CAC GGT CAG CAA CCT CTC C.
Die zu amplifizierende BAC-DNA und die Primer wurden vorgelegt und anschließend mit dem PCR-Reaktionsansatz vermischt. Zum Abtöten und Aufschließen der Bakterien in einer Kolonie- PCR wurde die Vorlage vor der Zugabe des PCR-Reaktionsgemisches für 5 min auf 95°C erhitzt. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA wurde ein initialer Schritt von 5 min bei 95°C benutzt. Die Touch-Down PCR-Reaktion erfolgte in den Abschnitten 30 sek 95°C; 30 sek Temperatur T und 60 sek 72°C für die ersten 10 Zyklen wobei T im ersten Zyklus 600C beträgt und bei jedem Zyklus um 0,5 0C gesenkt wird. Weitere 30 Zyklen erfolgten in den Abschnitten 30 sek 95°C; 30 sek 55°C und 60 sek 72°C. Zur abschließenden Kettenverlängerung wurde 5 min bei 72°C inkubiert, bevor die Reaktion auf eine Temperatur von 200C abgekühlt und konstant gehalten wurde. Die Analyse der PCR-Experimente erfolgte aufgrund des erwartet kurzen Reaktionsproduktes von 1831 bp mit 2,5 %igen Agarosegelen in 0,5x TBE-Puffer.
2) Klonierung der genomischen Volllängensequenz
Über die Verwendung der Primerpaare 5' ACC GAC TAG TCA CCA CCA ACC CAA ACC (ent- haltend eine Spei Site) und 5' GCA GGG CCC AGC GCC AGT CAA CAA CAA TAA C (enthält eine Apal Schnittstelle) sowie BAC 705A01 als Template wurde via PCR ein 3,0 Kbp-Fragment isoliert, welches die Volllängensequenz von HvARM enthielt.
Die PCR-Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Reaktionspuffer - 20 mM Tris-HCI (pH 8,8 at 25°C), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 1 % (v/v)
Triton X-10, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM MgSO4, jeweils dNTPs ä 0.2 mM, jeweils 1 μM Primer, 2,5 U
Pfu proofreading DNA Polymerase (Fermentas, Burlington, Canada).
Das Temerpaturprogramm lautete: 94° für 2 min; dann 5 Zyklen bei 94°, 30 sek 500C, von wo die Temperatur mit jedem Zyklus um 2°C (touchup) auf 600C erhöht wurde; darauf 30 Zyklen bei 94°C für 30 sek, 600C für 30 sek, 72°C für 6 min; schließlich wurde eine Extensionsreaktion bei 72°C für 7 min hinzugefügt. Das 3,0 Kbp PCR-Amplicon wurde mit Apal and Spei verdaut, die DNA aus einem Agarosegel eluiert und in mit Apal/Spel-verdauten plPKTA9-Vektor für die transiente Überexpression kloniert.
Beispiel 5: Klonierung der Volllängen-cDNA-Sequenz von AtARM (At2g23140) aus Arabidopsis thaliana. Zur Amplifikation der Volllängensequenz von AtArm wurden nachfolgende Primer verwendet:
MWG 31 :
5' cccgggatgattttgcggttttggcgg 3' (Seq ID No.: 56)
MWG 32:
5' CCCGGGTCACAAGACAAAACATAAAAATAGG 3' (Seq ID No.: 57)
MWG 32b: 5'gactcacactactctaatacc 3' (Seq ID No.: 58)
MWG 33:
5'GACATCGTTTGTCTCACACC 3' (Seq ID No.: 59)
Der Ansatz (Gesamtvolumen 50 μl_) hatte nachfolgende Zusammensetzung (das Gen wurde aufgrund seiner Größe von 2775 bp für die PCR in zwei Teile geteilt):
4 μl MWG31 (10 pmol/μL)
4 μl MWG34 (10 pmol/μL) 5 μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene)
1 ,5 μl 1 OmM dNTPs
1 μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33 μl H2O
bzw.
4 μl MWG32 (10 pmol/μL)
4 μl MWG33 (10 pmol/μL) 5 μl 1 Ox Pfu Ultra Puffer (Stratagene)
1 ,5 μl 1 OmM dNTPs
1 μl cDNA
1 μl Pfu Ultra (Stratagene)
33 μl H2O
Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems):
94°C 2 min Denaturierung 30 Zyklen mit 94°C 30sek (Denaturierung)
59°C 30 sek (Annealing)
72°C 1 ,5 min (Extension)
72°C 7 min abschließende Extension
40C Kühlung bis zu Weiterverarbeitung
Die PCR ergibt ein Produkt von 1 143bp bzw. 1705bp. Das erhaltene PCR-Produkt wird über ein 1 % Agarosegel isoliert, aus dem Gel extrahiert und in pCR4-Topo (Fa. Invitrogen Life Technologies) mittels T-Überhang-Ligation kloniert und sequenziert. Die unter SEQ ID NO: wiederge- gebene Sequenz ist also identisch mit der Armadillo-Sequenz aus Arabidopsis thaliana.
Um das Gen zusammenzufügen, wird das PCR-Produkt von 1705bp in pUC18 kloniert. Hiernach erfolgt die Klonierung von AtArm 1 143bp in pUC18-AtArm 1705bp.
Beispiel 6: Transiente Expression in Gerste und Weizen durch Partikelbeschuß
1 ) Folgendes Gemisch von Konstrukten wurde mit einer "Genkanone" (Bio-Rad, Modell PDS- 1000/He, Hepta-Adapter) mittels biolistischer Transformation in Weizenblätter eingebracht, gemäss Douchkov et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 18, 755 (2005):
Verwendete Vektoren und Kontrollen: pUbiGUS - GUS-Überepxressions-Reportergen-Konstrukt (Schweizer et al., Molecular Plant- Microbe Interactions 12 (8), 647 (1999)). plPKTA9 - Leere Vektorkontrolle (Zimmermann et al., Plant Physiology 142, 181 (2006)), plPKTA9_ARM40F - plPKTA9-basiert.es HvARM-Überexpresssionskonstrukt, BAC 581 D24 - HvARM enthaltender BAC-Klon,
BAC 632F23 - „leere" BAC-Kontrolle (BAC hybridisiert nicht mit irgendeinem bekannten EST).
Für die Beschichtung mit DNA wurden pro Schuß 2.18 mg Goldpartikel (1.0 μm Durchmesser, Partikeldichte 25 mg mh1 in 50% (v/v) Glyzerin) mit 14-21 μg "supercoiled" DNA gemischt und mit 1 M Ca(NÜ3)2 pH 10 versetzt, sodass die finale Konzentration von Ca(NÜ3)2 0.5 M war. Nach Zentrifugieren und Waschen mit 70 % (v/v) Ethanol wurden die Partikel in 96 % (v/v) E- thanol resuspendiert und auf den 7 Makrocarriern verteilt. Die Partikel wurden in einem Vakuum (3.6x103 Pa) durch eine Heliumdruckwelle von 7.6x106 Pa auf jeweils 7 Blattsegmente von 7 Tage alten Gersten- oder Weizenpflanzen (Gerste: Sorte Golden Promise; Weizen: Sorte Kanzler) eingebracht. Zum Beschüß wurden die Blattsegmente in eine Petrischale auf 0.5% (w/v) Phytoagar gelegt, der mit 20 μg mh1 Benzimidazol versetzt war. Die Blätter wurden anschließend bei +200C und indirektem Tageslicht für 4 h inkubiert.
2) Inokulation der Blattsegmente
Die bombardierten Blätter wurden auf 1 % (w/v) Phytoagar mit 20 μg mh1 Benzimidazol in 20 x 20 cm großen Polycarbonat-Schalen umgelegt. In einem Inokulationsturm erfolgte die Infektion der Gerstenblätter mit Gerstenmehltau-Sporen und der Weizenblätter mit Weizenmehltau- Sporen, indem Sporen von stark infizierten Gersten- oder Weizenblättern in den Turm geschüt- telt wurden. Die Inokulumdichte lag bei rund 200 Sporen/mm2. Nach 5 min wurden die Schalen entfernt, geschlossen und bei +200C und indirektem Tageslicht für 40-48 h inkubiert.
3) Histochemischer GUS-Nachweis
Die Blätter wurden unter Vakuum mit der GUS-Nachweislösung (10 mM EDTA, 1.4 mM K3[Fe(CN)6], 1.4 mM K4[Fe(CN)6], 0.1 % (v/v) Triton X-100, 20 % (v/v) Methanol, 1 mg/ml 5-
Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronsäure, 100 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7.0) infiltriert und über Nacht bei +37°C inkubiert. Nach Entfernen der Nachweislösung wurden die Blätter mit einer Lösung aus 7.5 % (w/v) Trichloressigsäure und 50 % (v/v) Methanol für 15 min bei +200C entfärbt.
4) Bestimmung der Suszeptibilität bombardierter Epidermiszellen
Die Lichtmikroskopie erfolgte mit einem Zeiss Axiolab bei 200-facher Vergrösserung. Zellen mit GUS-Expression besitzen einen blau gefärbten Zellinhalt. Mittels quantitativer Mikroskopie wurden pro Schuss die Anzahl GUS-gefärbter Zellen und die Anzahl der GUS-gefärbten Zellen, die mindestens 1 Haustorium des Weizenmehltaupilzes tragen, gezählt. Der Suszeptibilitätsindex berechnete sich aus der Anzahl der haustoriuntragenden GUS-pos. Zellen/alle GUS-positiven Zellen.
Ergebnisse: Erhöhung der Mehltauresistenz von Weizen durch Expression von HvARM-Repeat Protein
Tabelle 1 : Komplementationsdaten HvARM (= 'Rnr5')
Die Expression der TaPERO (WO 2005/035766) dient als positive Kontrolle für eine erfolgreiche Melhtauresistenz im transienten Assay.
Abbildung 4 fasst die Daten aus Tabelle 1 zusammen.
Beispiel 7: Expression in Weizen durch Partikelbeschuß
Nach dem Fachmann bekannten Verfahren wurden transgener Weizen (Triticum aestivum) mittels Partikelbeschuß generiert. Zur Expression wurden die Armadillo-Repeat Gene mit dem Weizen RbcS-Promtor (ribose-1 ,5-bisphosphate carboxylase small unit) fusioniert. Nach den üblichen Methoden erhielt man hieraus Setzlinge der T1 Generation, welche bzgl. ihrer Resistent gegen Blumeria graminis f.sp. tritici getestet wurden. Hierzu wurden die Setzlinge in Erde gepflanzt und nach sieben Tagen wie voranstehend bereits beschrieben mit Sporen von Blumeria graminis f.sp. tritici inoculiert. Die so infizierten Pfanzen wurden dann nach weiteren sieben bis zehn Tagen in Hinblick auf ihren Befall mit Blumeria graminis f.sp. tritici untersucht. Drei der so erhaltenenen transgenen Weizenlinien zeigten nahezu keinen Pilzbefall (5 % Pilzbefall im Vergleich zu der Wildtypkontrolle).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren Pathogen(en) in einer Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, bei dem eine Nukleotid-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein oder einen Teil von diesem kodiert, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle oder deren Teil eingeführt und dort expri- miert wird; oder bei dem eine endogene Nukleotid-Sequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein oder einen Teil von diesem kodiert, in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle oder deren Teil gegenüber der Ausgangs- bzw. Wildtyppflanze bzw. deren Teil erhöht wird.
2. Verfahren zur Erzeugung oder Erhöhung der Resistenz gegenüber einem oder mehreren Pathogen(en) in einer Pflanze, oder einem Teil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, Gewebe, einer Zelle oder einem Teil einer pflanzlichen Zelle, z.B. in einem Organell, bei dem eine endogene Nukleotidsequenz, die für ein ein Armadillo Repeat ARM1 Protein kodiert, und/oder die 5'-untranslatierte Region (5'UTR), gegenüber der Ausgangssequenz verändert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Nukleotidsequenz mindestens ein Nukleinsäuremolekül umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,
44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 63 oder 64 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, oder 44, aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremo- lekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäu- remoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmenten von mindestens 15 nt, vor- zugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst, wobei die Nukleotidsequenz so gestaltet ist, dass dadurch eine Pathogenresistenz erzeugt oder erhöht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem eine Pilzpathogenresistenz erzeugt oder erhöht wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem es sich um ein penetrierendes Pilzpathogen handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüchel bis 5, bei dem der Teil einer Pflanze Mesophyll- und/ oder Epidermiszellen sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Teil einer Pflanze Lemma (Deckspelze), Palea (Vorspelze) und/ oder Glume (Antherenanlage) ist.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Armadillo Repeat ARM1 Protein zwei oder mehr Armadillo Repeats umfasst.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das/ die Pathogen(e) ausgewählt ist/ sind aus den Familien der Pucciniaceae, Mycosphaerellaceae und Hypocrea- ceae.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend
a) die Einbringung einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine Nukleinsäuresequenz wie charakterisiert in Anspruch 3 (a-g) in eine pflanzliche Zelle; b) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und c) Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Menge und für eine Zeit, hinreichend um eine Pathogenresistenz in besagter Pflanze zu erzeugen oder zu erhöhen.
1 1. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Pflanzen aktiven Promotor um einen Pathogen-induzierbaren Promotor oder einen Epidermis- oder Mesophyll-spezifischen Promotor handelt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in der
Pflanze, dem pflanzlichen Organ, pflanzlichen Gewebe oder der pflanzlichen Zelle zusätzlich die Aktivität eines Polypeptids codierend für Bax Inhibitor 1 , ROR2, SnAP34, und/oder Lumenal Binding Protein BiP erhöht ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in der
Pflanze, dem pflanzlichen Organ, pflanzlichen Gewebe oder der pflanzlichen Zelle die Aktivität eine Polypeptides codierend für RacB, CSL1 , HvNaOX und/oder MLO vermindert wird.
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Bax-Inhibitor 1 unter Kontrolle eines Mesophyll und/oder Wurzel spezifischen Promotors exprimiert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt ist aus den Arten Blumeria graminis, Puccinia triticina, Puccinia striiformis, Mycosphaerella graminicola, Stagonospora nodorum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae oder Microdochium nivale.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Pathogen Blumeria graminis ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Pathogen Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei oder Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. tritici ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus den Pflanzengattungen Hordeum, Avena, Seeale, Triticum, Sorghum, Zea, Saccharum und Oryza ausgewählt ist.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Pathogen Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei ist und die Pflanze aus der Gattung Hordeum ausgewählt ist.
20. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Pathogen Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. tritici ist und die Pflanze aus der Gattung Triticum, bevorzugt Triticum aestivum, ausgewählt ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Armadillo Repeat ARM1 Nukleotidsequenz aus der Gerste stammt.
22. Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Armadillo-repeat ARM1 Protein, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekül, das mindestens ein Polypeptid kodiert umfassend die in SEQ ID No: 2 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID No: 1 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 50% zu den Sequenzen SEQ ID No: 2 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäu- remoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder eine komplementäre Sequenz davon umfasst;
oder ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz kodiert von dem Nukleinsäure- molekül; wobei das Nukleinsäuremolekül nicht aus der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO.: 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , oder 43 besteht.
23. Nukleinsäure-Konstrukt enthaltend ein Nukleinsäuremolekül enthaltend mindestens ein Fragment eines Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Armadillo repeat ARM1 Polypeptid funktionell verknüpft mit einem pathogen-induzierbaren Promoter oder einem Epidermis- und/oder Mesophyll-spezifischen Promoter.
24. Konstrukt nach Anspruch 23, wobei das Armadillo repeat ARM1 Polypeptid kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz nach der SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43 oder 63 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40 % zu den Sequenzen SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, oder 44, aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment oder ein Epitop der Sequenzen gemäß SEQ. ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 61 oder 62 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen
Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird; f) Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; oder g) Nukleinsäuremolekül, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäu- remoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann;
oder komplementär dazu ist.
25. DNA Expressionskassette umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen identisch ist zu einem Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert.
26. DNA Expressionskassette nach Anspruch 25, wobei besagte Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft ist.
27. DNA Expressionskassette nach Anspruch 26, wobei der Promotor ein in Pflanzen funktioneller Promotor ist.
28. DNA Expressionskassette nach Anspruch 26, wobei der in Pflanzen funktionelle Promotor ein pathogen-induzierbarer oder einem Epidermis- und/oder Mesophyll-spezifischer Promotor ist.
29. Vektor umfassend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28.
30. Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, eine DNA- Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, ein Nukleinsäuremolekül o- der ein Polypeptid nach Anspruch 22, oder einen Vektor gemäß Anspruch 29, oder bei der eine Resistenz durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 erzeugt oder erhöht wurde.
31. Transgener nicht-humaner Organismus, bevorzugt Pflanze, umfassend ein Nukleinsäure- molekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, eine DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach Anspruch 22, oder einen Vektor gemäß Anspruch 29, oder bei dem eine Resistenz durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 erzeugt oder erhöht wurde, oder umfassend eine Zelle nach Anspruch 30.
32. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 29, der ein monokotyledoner Organismus ist.
33. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 31 oder 32, der zudem über eine erhöhte Bax Inhibitor 1 -Protein-, ein ROR2-, und/oder SnAP34- Aktivität verfügt und/oder eine verminderte RacB-, CSL1-, und/oder HvRBOH F-Aktivität aufweist.
34. Transgener nicht-humaner Organismus nach einem der Ansprüche 31 , 32 oder 33, der eine erhöhte Bax Inhibitor 1-, ein ROR2-, und/oder SnAP34- Aktivität und/oder eine verminderte RacB-, CSL1-, und/oder HvRBOH F-Aktivität in Mesophyllzellen und/oder Wurzelzellen besitzt.
35. Organismus gemäß einem der Ansprüche 31 bis 34, ausgewählt aus den Arten Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Tri- ticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccharum officinarum (Zuckerrohr) und Oryza sative (Reis).
36. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls wie in Anspruch 3 charakterisiert, einer DNA- Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, eines Nukleinsäuremoleküls oder ein Polypeptids nach Anspruch 22, oder eines Vektors gemäß Anspruch 29, oder einer Zelle nach Anspruch 30 zur Herstellung einer Pflanze, die resistent gegen Mesophyllzellen penetrierende Pathogene ist.
37. Ernte, Vermehrungsmaterial oder Zusammensetzung umfassend ein Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 3 charakterisiert, eine DNA-Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, ein Nukleinsäuremolekül oder ein Polypeptid nach Anspruch 22, oder einen Vektor gemäß Anspruch 29, oder bei dem/ der eine Resistenz durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 erzeugt oder erhöht wurde, oder umfassend eine Zelle nach Anspruch 30.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9051581B2 (en) 2010-04-30 2015-06-09 The Curators Of The University Of Missouri Defense peptides against fungal infection and method of their use
WO2014076614A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing casar
US9957522B2 (en) * 2012-11-13 2018-05-01 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing CASAR
CN111580517B (zh) * 2020-05-12 2021-02-19 国家海洋技术中心 一种基于无人水面艇的多海湾区域路径遍历方法及***
CN114134155B (zh) * 2021-06-29 2023-09-12 中国农业科学院油料作物研究所 一种mlo基因突变体及其制备方法与应用

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
WO1984002913A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Chimeric genes suitable for expression in plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
EP0332104A3 (de) 1988-03-08 1991-03-20 Ciba-Geigy Ag Chemisch regulierte Sequenzen und Gene, und ihre Verwendungen
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
DE3843628A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
HU218717B (hu) 1989-03-17 2000-11-28 E. I. Du Pont De Nemours And Co. Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra
WO1991001373A1 (en) 1989-07-19 1991-02-07 Calgene, Inc. Fruit-specific transcriptional factors
GB9005772D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
CA2058756A1 (en) 1990-03-16 1991-09-17 Vic. C. Knauf Sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
GB9105420D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Ici Plc Expression of genes in transgenic plants
AU3901993A (en) 1992-04-13 1993-11-18 Zeneca Limited Dna constructs and plants incorporating them
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
EP0689594A1 (de) 1993-03-22 1996-01-03 Zeneca Limited Dna, dna-konstruktionen, zellen und die davon abgeleitete pflanzen
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
WO1995015972A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
ATE407205T1 (de) 1994-08-20 2008-09-15 Gendaq Ltd Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
US5750868A (en) 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
WO1996028561A1 (en) 1995-03-09 1996-09-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Chimeric genes comprising a fungus-responsive element
AUPN283495A0 (en) 1995-05-05 1995-06-01 Australian National University, The Plant promoter activated by fungal infection
US6100451A (en) 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
US20030198642A1 (en) 1995-08-03 2003-10-23 Johannes J. Geuze Cell derived antigen presenting vesicles
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
AU708850B2 (en) 1996-07-23 1999-08-12 Novartis Ag Chemically-inducible arabidopsis PR-1 promoter
ES2317652T3 (es) 1996-07-29 2009-04-16 Keygene N.V. Polinucleotido y su utilizacion para modular una respuesta de defensa en las plantas.
US5955361A (en) 1996-11-20 1999-09-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. P gene promoter constructs for floral-tissue preferred gene expression
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
EP0870836A1 (de) 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
EP1019517B2 (de) 1997-09-30 2014-05-21 The Regents of The University of California Herstellung von proteinen in pflanzensamen
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
IL138341A0 (en) 1998-03-17 2001-10-31 Novartis Ag Genes encoding mlo proteins and conferring fungal resistance upon plants
PL343636A1 (en) 1998-04-01 2001-08-27 Mogen Internat Nv Pathogen-inducible promoter
GB9813345D0 (en) 1998-06-19 1998-08-19 Nickerson Biocem Ltd Promoters
WO2000001830A1 (de) 1998-07-01 2000-01-13 Kws Kleinwanzlebener Saatzucht Ag Vorm. Rabbethge Und Giesecke Promotoren und promotorelemente zur erhöhung der pathogen-induzierbarkeit von genen in pflanzen
US6211433B1 (en) 1998-07-07 2001-04-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Manipulation of Mlo genes to enhance disease resistance in plants
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
DE19852195C2 (de) 1998-11-04 2000-11-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen
EP1041148A1 (de) 1999-04-02 2000-10-04 Mogen International N.V. Pathogen-induzierbarer Promotor
EP1264887A4 (de) 2000-02-25 2004-05-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Neues armadillo-wiederholungen enthaltendes protein, alex1
WO2002057412A2 (en) 2000-11-09 2002-07-25 Washington State University Research Foundation Plant promoters, and methods of use
US7456335B2 (en) 2001-09-03 2008-11-25 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants
JP2005185101A (ja) 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
DE10233327A1 (de) 2002-07-22 2004-02-05 Basf Ag Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
DE10346611B4 (de) 2003-10-07 2006-04-27 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Promotor zur epidermisspezifischen Transgenexpression in Pflanzen
DE102005025656A1 (de) 2005-06-03 2006-12-07 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Promotor zur epidermisspezifischen, pathogeninduzierbaren Transgenexpression in Pflanzen
US8362323B2 (en) 2005-11-08 2013-01-29 Basf Plant Science Gmbh Use of armadillo repeat (ARM1) polynucleotides for obtaining pathogen resistance in plants

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2008043826A1 *

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EP2487245A3 (de) 2012-10-24
US8329988B2 (en) 2012-12-11
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