BRPI0612671A2 - métodos melhorados para a produção de plantas férteis zea mays (milho) estavelmente transformadas - Google Patents

Abstract

MéTODOS MELHORADOS PARA A PRODUçãO DE PLANTAS FéRTEIS ZEA MAYS (MILHO) ESTAVELMENTE TRANS- FORMADAS. A presente invenção refere-se a métodos melhorados para a incorporação de DNA no genoma de uma planta de Zea mays por meio de transformação mediada por Agrobacterium. é preferido o uso das linhagens de Zea may depositadas com a Coleção de Cultivo do Tipo Americano sob aDenominação de Depósito de Patente PTA-61 70 e PTA-61 71.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSMELHORADOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS FÉRTEIS DA ZEAMAYS (MILHO) ESTAVELMENTE TRANSFORMADAS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

Campo da invenção.

A presente invenção refere-se a métodos melhorados para aincorporação de DNA no genoma de uma planta de Zea mays por meio datransformação mediada pelo Agrobacterium.

Descrição da Técnica Referida.

Durante a década passada, tornou-se possível transferir genesem larga escala de organismos para as plantas de colheita pela tecnologiade DNA recombinantee. Este avanço forneceu oportunidades enormes demelhorar a resistência das plantas às pestes, às doenças e aos herbicidas, ede modificar os processos biossintéticos para alterar a qualidade dos produ-tos das plantas. Entretanto, a disponibilidade de um método eficiente detransformação para introduzir um DNA estranho permanece sendo uma bar-reira substancial para a maioria das espécies monocotiledôneas, incluindo omilho.

Houve muitos métodos que foram tentados para a transformaçãode plantas monocotiledôneas, entre os quais o "biobalístico" é o método omais extensamente usado de transformação. No método "biobalístico" (libe-ração de DNA mediada por microprojétil) as partículas do microprojétil sãorevestidas com o DNA e aceleradas por um dispositivo mecânico a uma ve-locidade alta o bastante para penetrar a parede celular e o núcleo da planta(WO 91/02071). O DNA estranho fica incorporado no DNA do hospedeiro eresulta em uma célula transformada. Há muitas variações do método "bioba-lístico" (Sanford 1990; Fromm 1990; Christou 1988; Sautter 1991). O métodofoi usado para produzir plantas monocotiledôneas estavelmente transforma-das incluindo o arroz e o milho (Christou 1991; Gordon-Kamm 1990; Vasil1992, 1993; Wan 1994; Sommers 1992). Entretanto, mesmo com as melho-rias mais recentes ainda há a necessidade de 4 a 6 meses para recuperar asplantas transgênicas (Weeks 1993; Vasil 1992, 1993; Becker 1994, Rasco-Gaunt 2001). A liberação de DNA mediada por microprojétil traz cerca dediversos problemas tais como a fragmentação freqüente de DNA antes desua integração, integração aleatória no transcrito assim como regiões cro-mossômicas não transcritas, inserção predominantemente múltipla da se-qüência a ser transferida, padrões complexos da integração, integração deseqüências da cadeia principal incluindo genes selecionáveis do marcadorno mesmo sítio. Além disso, a transformação da planta mediada por micro-projétil está baseada geralmente nos métodos de cultura celular dependen-tes do genótipo que requerem freqüentemente uma transferência secundáriado transgene para dentro da base do material nobre de propagação atravésde retrocruzamento de longa duração.

Os métodos baseados em protoplastos foram usados na maiorparte das vezes no arroz, onde o DNA é liberado para os protoplastos atra-vés dos lipossomas, PEG, ou da eletroporação (Shimamoto 1989; Datta1990b). Os protoplastos podem ser isolados dos vários tecidos, mas requergeralmente o uso de enzimas de degradação da parede celular. Considera-se provavelmente que o uso de enzimas de degradação da parede celularpossa inibir o processo subseqüente da regeneração. Além disso, a maioriados métodos a base de protoplastos requer o estabelecimento de culturas desuspensão embriogênica de longo prazo. Alguns regênerosntes dos proto-plastos são inférteis e fenotipicamente anormais devido à variação somaclo-nal durante a cultura em suspensão por longo prazo (Davey 1991; Rhodes1988). A transformação por eletroporação envolve a aplicação de camposelétricos curtos de alta-tensão para criar "poros" na membrana celular atra-vés de que o DNA é rerirado. Este método foi usado para produzir plantasmonocotiledoneas estavelmente transformadas (Paszkowski 1984; Shillito1985; Fromm 1986) especialmente plantas do arroz (Shimamoto 1989; Datta1990b; Hayakawa 1992).

Diversos outros de métodos foram relatados para a transforma-ção de plantas monocotiledoneas incluindo, por exemplo, o "método do tubode pólen" (WO 93/18168; Luo 1988), macro-injeção de DNA nos rebentosfloral (Du 1989; De Ia Pena 1987), injeção do Agrobacterium nas cariopsesem deselvolvimento (WO 00/63398), e incubação do tecido das sementesem soluções de DNA (Tópfer 1989). A injeção direta de DNA exógeno noóvulo fertilizado da planta no início da embriogênese foi descrita na WO94/00583.

Embora tenha sido extensamente útil em plantas dicotiledôneas,a transferência de gene mediada por Agrobacterium tem sido há muito tem-po decepcionante quando adaptada para uso nas monocotiledôneas. Hádiversos relatórios na literatura reivindicando a transformação do Agrobacte-rium nas monocotiledôneas (por exemplo, o WO 94/00977 discutido). Estessão especificamente os métodos de Gould 1991; Mooney 1991; e Raineri1990, que reivindicam a transformação pelo Agrobacterium do milho, do ar-roz e do trigo. Há alguma evidência de transferência de gene nestes méto-dos, mas carecem de evidências convincentes sobre a eficiência, a reprodu-tibilidade, e a confirmação da transferência de genes (Potrykus 1990), e afalta de evidência transferência do transgene como herança na progenituraquando as plantas são produzidas. No trabalho de Gould onde a evidênciade plantas transformadas foi apresentada não havia nenhuma herança men-deliana dos genes. As tentativas feitas por Hiei et al., (1994) sugeriram queas plantas de arroz transgênico poderiam ser obtidas depois de transforma-ção mediadas pelo Agrobacterium, mas as cepas bacterianas particularesusadas e a escolha de vetores bacterianos eram críticas para obter os trans-gênicos com sucesso. Uma publicação por Ishida et al., (1996) indicou que atransformação de alta eficiência do milho era possível pela co-cultura deembriões imaturos com A. tumefaciens. Em ambos os relatórios da transfor-mação do arroz e do milho, um vetor super-binário pTOK233 contendo có-pias adicionais dos genes wVB, wTC e w/G foi usado para conseguir umatransformação de alta eficiência. O WO 95/06722 e a EP-A1 672 752 des-crevem um método de transformar monocotiledôneas usando o scutellum deembriões imaturos com A. tumefaciens, cujos embriões imaturos não foramsubmetidos a um tratamento de diferenciação. A EP-A1 0 709 462 descreveum método para transformar plantas monocotiledôneas, em que a melhoria éindicada por incluir um período de recuperação de um dia após a etapa deco-cultivo sem um dispositivo da seleção.

Embora os métodos conhecidos na ténica, especialmente aque-les fornecidos na WO 95/06722, forneçam meios para a produção de plantastransgênicas da Zea mays, todos estes métodos ainda necessitam de tempoe trabalho intensivos. Especialmente quando um grande número plantastransgênicas necessitam ser estabelecidas (como, por exemplo, em umaaproximação de avaliação em base genômica necessitando da construçãode centenas aos milhares de plantas transgênicas diferentes) a eficiência éde elevada importância comercial.

Conseqüentemente, o objetivo da presente invenção é fornecerum método melhorado, eficiente para transformar as plantas de Zea mays,cujo tempo necessário para a obtenção das plantas requeridas desde a épo-ca da transformação é mais curto do que aquele dos métodos convencio-nais. Este objetivo é conseguido pela presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO.

Conseqüentemente, uma primeira modalidade da presente in-venção se refere a um método para gerar uma planta transgênica de Zeamays compreendendo as etapas de:

a. isolamento de um embrião imaturo de uma planta de Zeamays, e

b. co-cultivo do dito embrião imaturo isolado, que não foisubmetido a um tratamento do desdiferenciação, com umabactéria nascida do solo pertence ao gênero Rhizobiaceaecompreendendo pelo menos um T-DNA transgênico, o dito

T-DNA compreendendo pelo menos um gene marcador se-lecionável, com um meio de co-cultivo, e

c. transferência dos embriões imaturos co-cultivados para ummeio de recuperação compreendendo:

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibióti-co que inibe ou suprime o crescimento da bactérianascida do solo, e

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamen-te 1 g/l a aproximadamente 10 g/l, e

iii. nitrato de prata em uma concentração de aproxima-damente 1 uM a aproximadamente 50 pM, e

iv. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, mas não compreendendo uma quantidadeeficaz de um agente de seleção fitotóxica, e

d. indução da formação do calo embriogênica e selecionar ocalo transgênico em um meio compreendendo,

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, e

ii. uma quantidade eficaz de um agente de seleçãopermitindo a seleção das células compreendendo oT-DNA transgênico, e

e. regeneração e seleção das plantas contendo o T-DNA transgênico do ditocalo transgênico.

O embrião imaturo é preferivelmente do grupo dos nascimentosnaturais consistindo, nos híbridos, F1 entre os nascimentos naturais (preferi-velmente diferentes), F1 entre um nascimento natural e um híbrido, F1 entreuma variedade de nascimento natural e uma variedade naturalmente polini-zada, variedades F1 comerciais, qualquer cruzamento F2 ou autopolinizaçãoentre as variedades anteriormente mencionadas e a progenitura de quais-quer dos anteriormente mencionados.

Preferivelmente, o embrião imaturo é isolado de um cruzamentode um híbrido (HilIA x A188) com uma linhagem de nascimento natural dequal as sementes representativas foram depositadas sob o Tratado de Bu-dapest com a Coleção de Cultivo do Tipo Americano (Manasses, VA 20110-2209, EUA) sob a Designação de Depósito de Patente PTA-6170 (para assementes da linhagem BPS553), e PTA-6171 (para sementes da linhagemBPS631).

Em uma modalidade preferida o embrião imaturo é aquele noestágio de não menos do que 2 dias após a polinização. Preferivelmente osembriões imaturos são isolados e preparados diretamente no meio de co-cultivo sem etapas adicionais de lavagem. Preferivelmente, o embrião imatu-ro é submetido à transformação (co-cultivo) sem pré-tratamento de diferen-ciação. O tratamento dos embriões imaturos com uma enzima ou lesão éopcional. Os embriões dissecados das espigas colhidas da estufa e armaze-nadas em um refrigerador a aproximadamente 4°C por até 10 dias permane-cem para serem transformáveis.

Preferivelmente a bactéria nascida do solo é uma bactéria per-tencendo a família do Agrobacterium, mais preferivelmente de um Agrobac-terium tumefaciens desarmado ou cepas rhizogenes. Em uma outra modali-dade preferida a bactéria nascida do solo é uma variante desarmada da ce-pa Agrobacterium rhizogenes, cepa K599 (NCPPB 2659). Tais cepas sãodescritas no Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos, Pedido N960/606789, arquivado em 2 de setembro de 2004, aqui completamente in-corporado pela referência.

Em uma outra modalidade preferida para a etapa da infecção edo co-cultivo uma suspensão da bactéria nascida do solo (por exemplo, A-grobacteria) no meio de co-cultivo ou da infecção é aplicada diretamente acada embrião, e uma quantidade adicional de líquido que cobre o embrião éremovida. A remoção pode ser feita por vários meios, preferivelmente porsecagem ao ar ou por absorção. Em uma modalidade preferida são empre-gados de aproximadamente 1 pi a aproximadamente 10 pi de uma suspen-são da bactéria nascida do solo (por exemplo, Agrobacteria). Preferivelmen-te, o embrião imaturo é infectado com Agrobacterium diretamente no meiode co-cultivo. Preferivelmente, a bactéria é empregada em uma concentra-ção de 106 a 1011 CFU/ml (CFU: unidade de formação de colônia).

Preferivelmente, o meio empregado durante o co-cultivo com-preende de aproximadamente 1 (jM a aproximadamente 10 pM de nitrato deprata e de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 1.000 mg/L de L-cisteína.

Em uma modalidade preferida a etapa da seleção é realizadaem uma única etapa de seleção sem transferência intermediária do tecido.

Em uma outra modalidade preferida, os brotos enraizados resul-tando da etapa de regeneração são transferidos diretamente no meio de solo.

Uma outra modalidade preferida da invenção se refere a umaplanta do milho obtida pelo cruzamento de um híbrido (HilIA x A188) comuma linhagem de nascimento natural selecionada do grupo cuja sementerepresentativa foi depositada sob o Tratado de Budapest com a Coleção deCultivo do Tipo Americano (Manasses, VA 20110-2209, EUA) sob a desig-nação de Depósito de Patente PTA-6170 (para sementes da linhagemBPS553), e de PTA-6171 (para sementes de Nne BPS631).

Preferivelmente, a dita planta do milho é transgênica (por exem-plo, compreende um T-DNA transgênico). Outros objetivos da presente in-venção se referem aos decendentes da dita planta do milho (tal como, porexemplo, de. linhagens de nascimentos naturais), plantas de nascimentosnaturais ou híbridas produzidas dos ditos descendentes e partes das plantasanteriormente mencionadas. Tais partes podem incluir, mas não estão limi-tadas a tecidos, células, pólen, óvulos, raízes, folhas, sementes, microspo-ros, e partes vegetativas.

Uma outra modalidade da presente invenção se refere a um mé-todo para a subseqüente transformação de pelo menos dois constructos deDNA para o interior de uma planta compreendendo as etapas de:

a) uma primeira transformação com um primeiro construtor, odito construtor compreendendo um primeiro gene marcadorde seleção ahas mutado, o dito primeiro gene conferindoresisitência ao imazetapir, mas sendo sensível ao imaza-quin, e selecionando as plantas resistentes ao imazetapir, e

b) uma segunda transformação com um segundo construtuor,o dito construtor compreendendo um segundo gene mar-cador de seleção ahas mutado, o dito segundo gene confe-rindo resisitência a ambos imazetapir e imazaquin, e sele-cionando as plantas resistentes ao imazaquin.

Preferivelmente, o dito primeiro gene é um gene mutante ahasXl 12 e/ou no qual o dito segundo gene é um gene mutante ahas XA17. Maispreferivelmente, a dita planta é uma planta da Zea mays.

Uma outra modalidade da presente invenção se refere a célulada planta ou a planta compreendendo:

a) um primeiro gene marcador de seleção ahas mutado, o ditoprimeiro gene conferindo resisitência ao imazetapir, massendo sensível ao imazaquin, e

b) um segundo gene marcador de seleção ahas mutado, odito segundo gene conferindo resisitência a ambos imaze-tapir e imazaquin.

Preferivelmente, o dito primeiro gene é um gene mutante ahasdo Xl 12 e/ou no qual o dito segundo gene é um gene mutante ahas XA17.Mais preferivelmente, os ditos primeiro e segundo genes são transgenes. Aplanta é preferivelmente uma planta da Zea mays.

DEFINIÇÕES GERAIS.

Deve ser compreendido que a presente invenção não está limi-tada à uma metodologia em particular, protocolos, linhagens celulares, es-pécies ou gêneros de plantas, construtores, e reagentes, descritos comotais. Deve também ser compreendido que a terminologia aqui utilizada tem afinalidade de descrever somente modalidades particulares, e não está desti-nada a limitar o alcance da presente invenção que será limitada somentepelas reivindicações anexadas. Deve-se anotar que tal como aqui utilizado enas reivindicações anexadas, as formas no singular "a", "e" e "o" incluem areferência ao plural a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

Assim, por exemplo, a referência a "um vetor" é uma referência a um oumais vetores e inclui os equivalentes do mesmo que são conhecidos daque-les versados na técnica e assim por diante.

O termo "aproximadamente" é utilizado aqui com o significadode aproximadamente, grosseiramente, por volta de ou nas proximidades de.

Quando o termo "aproximadamente" é usado conjuntamente com uma esca-la numérica, ele modifica a escala estendendo os limites acima e abaixo dosvalores numéricos determinados. Geralmente, o termo "aproximadamente" éaqui utillizado para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor in-dicado por uma variação de 20 por cento para acima ou para baixo (maisalto ou mais baixo).

Tal como aqui utilizada, a palavra "ou" significa qualquer ummembro de uma lista em particular e inclui também qualquer combinaçãodos membros dessa lista.

O termo "ácido nucléico" se refere aos desoxirribonucleotídeosou aos ribonucleotídeos e os polímeros, ou os híbridos dos mesmos, ou co-mo um filamento simples ou como um filamento duplo, no formato sentido ouno formato anti-sentido.

A menos que de outra maneira seja indicado, uma seqüênciaparticular de ácido nucléico também implicitamente abarca as variantes con-servadoramente modificadas da mesma (por exemplo, substituições degene-radas do códon) e as seqüências complementares, assim como a seqüênciaexplicitamente indicada. O termo "ácido nucléico" é usado em alternânciacom os termos "gene", "DNA," "mRNA", "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo".

A frase "seqüência de ácidos nucléicos" tal como aqui utilizadase refere a uma lista consecutiva das abreviaturas, das letras, dos caráteresou das palavras, que representam os nucleotídeos. Em uma modalidade, umácido nucléico pode ser uma "sonda" que é um ácido nucléico relativamentecurto, geralmente menos de 100 nucleotídeos de comprimento. Freqüente-mente uma sonda de ácido nucléico é de aproximadamente 50 nucleotídeosde comprimento a aproximadamente 10 nucleotídeos de comprimento. Uma"região alvo" de um ácido nucléico é uma porção de um ácido nucléico quetenha sido identificada como sendo de interesse. Uma "região de codifica-ção" de um ácido nucléico é a porção do ácido nucléico que é transcrita etraduzida em um modo específico de seqüência para produzir um efeito emum determinado polipeptídeo ou proteína quando colocado sob o controle deseqüências reguladoras adequadas. A região de codificação é dita codifi-cando tal polipeptídeo ou proteína.

O termo "anti-sentido" é compreendido como significando umácido nucléico possuindo uma seqüência complementar a uma seqüênciaalvo, por exemplo, uma seqüência do RNA mensageiro (mRNA) cujo blo-queio da expressão é visto como sendo iniciado pela hibridização com a se-qüência alvo.

O termo "sentido" é compreendido como significando um ácidonucléico possuindo uma seqüência que é homóloga ou é idêntica a uma se-qüência alvo, por exemplo, uma seqüência que se liga a um fator de trans-crição de proteína e que esteja envolvida na expressão de um dado gene.De acordo com uma modalidade preferida, o ácido nucléico compreende umgene de interesse e os elementos que permitem a expressão do dito genede interesse.

O termo "gene" se refere a uma região de codificação operacio-nalmente unida com seqüências reguladoras adequadas capazes de regulara expressão do polipeptídeo de alguma maneira. Um gene inclui regiões re-guladoras não traduzidas de DNA (por exemplo, promotores, melhoradores,repressores, etc), precedendo (a montante) e sucedendo (a jusante) a regiãode codificação (estrutura de leitura aberta, ORF) bem como, onde aplicável,as seqüências de intervenção (isto é, íntrons) entre regiões individuais decodificação (isto é, éxons).

Tal como aqui utilizado o termo "região de codificação" quandousado em referência a um gene estrutural se refere às seqüências de nucle-otídeo que codificam os aminoácidos encontrados no polipeptídeo nascentecomo resultado da tradução de uma molécula do mRNA. A região de codifi-cação está limitada, nos eucariontes, na terminação 5' pelo tripleto de nucle-otídio "ATG" que codifica a metionina do iniciador e na terminação 3' por umdos três tripletoos que especificam os códons de parada (isto é, TAA, TAG,TGA). Além a conter íntrons, as formas genômicas de um gene também po-dem incluir as seqüências situadas em ambas as extremidades 5' e 3' dasseqüências que estão presentes no RNA transcrito. Estas seqüências sãoreferidas como seqüências ou regiões de "flanqueamento" (estas seqüênciasde flanqueamento estão localizadas em 5' ou 3' para as sequencias não tra-duzidas presentes no mRNA transcrito). A região de flanqueamento 5' podeconter seqüências reguladoras tais como promotoras e melhoradoras quecontrolam ou influenciam a transcrição do gene. A região de flanqueamento3' pode conter as seqüências que dirigem a terminação da transcrição, aclivagem pós-transcricional e a poliadenilação.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "oligopeptídeo", "polipeptí-deo", "produto de gene", "produto de expressão" e "proteína" são usadosaqui permutavelmente para se referir a um polímero ou a um oligômero deresíduos consecutivos de aminoácido.

O termo "isolado" tal como aqui utilizado significa que um mate-rial foi removido de seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeoou um polipeptídeo de ocorrência natural, presente em um animal vivo não éisolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de algunsou de todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais po-linucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou po-lipeptídeos poderiam ser parte de uma composição, e seriam isolados a par-tir de tal vetor ou composição se esses não fossem parte de seu ambienteoriginal.

O termo "tipo selvagem", "natural" ou de "origem natural" signifi-cam, em relação a um organismo, a um polipeptídeo, ou a uma seqüênciade ácidos nucléicos, que o dito organismo é de ocorrência ou de disponibili-dade natural em pelo menos um organismo de ocorrência ou disponibilidadenatural que não é alterado, mutado, ou de qualquer outro modo manipuladopelo homem.

O termo "transgênico" ou "recombinante" tal como aqui utilizado(por exemplo, com relação a uma planta ou uma célula da planta Zea mays)pretende se referir às células e/ou às plantas que incorporaram os genes ouas seqüências de DNA exógenos, incluindo, mas não se limitando aos genesou às seqüências de DNA que talvez não estejam normalmente presentes,aos genes que não são transcritos e traduzidos ("expressados") normalmen-te em um dado tipo de célula, ou quaisquer outros genes ou seqüências deDNA que se necessite introduzir na célula e/ou na planta não transformada,tal como os genes que podem normalmente estar presentes na célula e/ouna planta não transformada, mas que se deseje que tenham sua expressãoalterada.

Preferivelmente1 os termos "transgênico" ou "recombinante" emrelação a, por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléicos (ou um orga-nismo, um cassete de expressão ou um vetor compreendendo a dita se-qüência de ácidos nucléicos) se referem a todos aqueles construtores quese originam pelo método recombinante em que cada:

a) dita seqüência ácido nucléico, ou

b) uma seqüência de controle genético ligada operacional-mente à dita seqüência de ácido nucléico (a), por exemplo,um promotor, ou

c) (a)e(b);

Não estão situados em seu ambiente genético natural ou forammodificados por métodos recombinantes, um exemplo de uma modificaçãosendo uma substituição, adição, eliminação, inversão ou inserção de um oumais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural se refere ao sítiocromossômico natural no organismo de origem, ou se refere à presença emuma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambientegenético natural da seqüência de ácidos nucléicos é preferivelmente retido,pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácidos nucléicospelo menos em um lado e tem uma seqüência de pelo menos 50 bp, preferi-velmente de pelo menos 500 bp, especialmente preferivelmente de pelo me-nos 1000 bp, muito especialmente preferivelmente de pelo menos 5000 bp,de comprimento. Um cassete de expressão de ocorrência natural, por exem-pio, uma combinação de ocorrência natural de um promotor com o gene cor-respondente, transforma-se em um cassete de expressão recombinantequando é modificado por métodos sintéticos "artificiais", não naturais, taiscomo, por exemplo, a mutagenização. Tais métodos já foram descritos (US5.565.350; WO 00/15815). Preferivelmente, o termo "recombinante" em rela-ção aos ácidos nucléicos tal como aqui utilizado significa que o ácido nucléi-co está ligado covalentemente e adjacente a um ácido nucléico a que nãoestá adjacente em seu ambiente natural. Os polipeptídeos ou as proteínas"recombinantes" se referem aos polipeptídeos ou às proteínas produzidospelas técnicas recombinantes de DNA1 isto é, produzidas a partir das célulastransformadas por uma construção recombinante exógena de DNA que codi-fica o polipeptídeo ou a proteína desejados. Os ácidos nucléicos e o polipep-tídeos recombinantes também podem compreender as moléculas que dessemodo não existem na Natureza, mas que são modificadas, alteradas, muta-das ou, por outro modo, manipuladas pelo homem.

Um "polipeptídeo recombinante" é um polipeptídeo de ocorrêncianão natural que difere na seqüência de um polipeptídeo natural pelo menospor um resíduo de aminoácido. Os métodos preferidos para produzir o ditopolipeptídeo e/ou o ácido nucléico recombinantes podem compreender amutagênese dirigida ou não dirigida, reordenação de DNA ou os outros mé-todos de recombinação recursiva.

Os termos "seqüência heteróloga de ácido nucléico" ou "DNAheterólogo" são alternadamente usados para se referir a uma seqüência denucleotídeos que está ligada a uma seqüência de ácidos nucléicos a qualnão está ligada na Natureza, ou a qual está ligada em uma posição diferentena Natureza. O DNA heterólogo não é endógeno à célula em que é introdu-zido, mas foi obtido de uma outra célula. Geralmente, embora não necessa-riamente, tal DNA heterólogo codifica o RNA e as proteínas que não sãoproduzidos normalmente pela célula em que é expressado.

A "eficiência de transformação" ou a "freqüência de transforma-ção" tal como aqui utilizada podem ser medidas pelo número de célulastransformadas (ou dos organismos transgênicos crescidos a partir das célu-las transformadas individuais) que são recuperadas sob circunstâncias expe-rimentais padrão (isto é padronizado ou normalizado em relação a umaquantidade de células contactadas com o DNA estranho, a quantidade deDNA liberado, o tipo e as condições da liberação do DNA, condições geraisda cultura, etc). Por exemplo, quando os embriões imaturos isolados sãousados como o material de partida para a transformação, a freqüência detransformação pode ser expressada como o número das linhagens de plan-tas transgênicas obtidas por cada 100 embriões imaturos isolados transfor-mados.

O termo "célula" se refere a uma única célula. O termo "células"se refere a uma população de células. A população pode ser uma populaçãopura compreendendo um tipo celular. Do mesmo modo, a população podecompreender mais de um tipo celular. Na presente invenção, não há nenhumlimite no número de tipos celulares que uma população celular pode com-preender. As células podem ser sincronizadas ou não sincronizadas, preferi-velmente as células são sincronizadas.

O termo "DNA cromossômico" ou "seqüência de DNA cromos-sômico" devem ser compreendidos como o DNA genômico do núcleo celularindependente da situação do ciclo celular. O DNA cromossômico pôde con-seqüentemente ser organizado nos cromossomas ou cromátides, podem sercondensados ou desenrolados. Uma inserção no DNA cromossômico podeser demonstrada e analisada pelos vários métodos conhecidos na ténica talcomo, por exemplo, a análise de PCR, análise de Southern blot, fluorescên-cia in situ da hibridização (FISH), e PCR in situ.

O termo "gene estrutural" tal como aqui utilizado pretende signi-ficar uma seqüência de DNA que é transcrita no mRNA que é depois tradu-zido em uma seqüência de aminoácidos característicos de um polipeptídeoespecífico.

O termo "expressão" se refere à biossíntese de um produto ge-nético. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve atranscrição do gene estrutural no mRNA e, opcionalmente, a tradução sub-seqüente do mRNA em um ou mais polipeptídeos.

O termo "transformação" inclui a introdução do material genéticonas células da planta, preferivelmente tendo por resultado uma integraçãocromossômico e uma hereditariedade estável através da meiose. A trans-formação inclui também a introdução do material genético em células daplanta na forma dos vetores virais da planta envolvendo a replicação epi-cromossômico e a expressão do gene que pode exibir propriedades variá-veis em relação à estabilidade meiótica.

O termo "cassete de expressão" ou "construtor de expressão" talcomo aqui utilizado pretende significar a combinação de qualquer seqüênciade ácidos nucléicos a serem expressados na ligação operável com uma se-qüência promotora e, opcionalmente, alguns elementos adicionais (como porexemplo, a seqüência terminadora e/ou as seqüências de poliadenilação)que facilitem a expressão da dita seqüência de ácidos nucléicos.

O termo "promotor" tal como aqui utilizado pretende significaruma seqüência de DNA que dirige a transcrição de uma seqüência de DNA(por exemplo, um gene estrutural). Tipicamente, um promotor está situadona região 5' de um gene, proximal ao sítio de iniciação transcricional de umgene estrutural. Se um promotor for um promotor indutível, então a taxa datranscrição aumenta em resposta a um agente de indução. Contrariamente,a taxa da transcrição não é regulada por um agente de indução se o promo-tor for um promotor constitutivo. Do mesmo modo, o promotor pode ser regu-lado de um modo específico para um tecido ou preferido para um tecido detal modo que somente é ativo em transcrever a região associada de codifi-cação para um tipo, ou tipos, específico do tecido tal como as folhas, as raí-zes ou o meristema.

O termo "ligação operacional" ou "operacionalmente ligado" deveser compreendido como significando, por exemplo, o arranjo seqüencial deum elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma seqüência deácidos nucléicos a ser expressada e, se adequado, outros elementos regu-ladores (tais como por exemplo, um terminador) de tal maneira que cada umdos elementos reguladores pode cumprir sua função destinada a permitir,modificar, facilitar ou por outro modo influenciar a expressão da dita seqüên-cia de ácidos nucléicos. Pode haver resultado da expressão dependendo doarranjo das seqüências do ácido nucléico em relação ao RNA sentido ouanti-sentido. Para esse fim, a ligação direta no sentido químico não é neces-sariamente exigida. As seqüências de controle genético tais como, por e-xemplo, seqüências melhoradoras, podem também exercer suas funçõessobre a seqüência alvo a partir das posições que estão mais distantes, oucertamente a partir de outras moléculas de DNA. Os arranjos preferidos sãoaqueles em que a seqüência de ácidos nucléicos a ser expressada recombi-nantemente está posicionada atrás da seqüência que age como promotora,de modo que as duas seqüências estejam ligadas covalentemente. A distân-cia entre a seqüência promotora e a seqüência de ácidos nucléicos a serexpressada recombinantemente é preferivelmente menos de 200 pares debases, especialmente preferivelmente menos de 100 pares de bases, muitoespecialmente preferivelmente menos de 50 pares de bases. A ligação ope-racional, e um cassete de expressão, podem ser gerados por meio das téc-nicas habituais de recombinação e de clonagem tal como descrito (por e-xemplo, em Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990). Entre-tanto, seqüências adicionais que, por exemplo, atuam como um Iigante comsítios de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptí-deo de sinalização, também podem ser posicionadas entre as duas seqüên-cias. A inserção de seqüências também pode conduzir à expressão de prote-ínas de fusão. Preferivelmente, o cassete de expressão, consistindo em umaligação do promotor com uma seqüência de ácidos nucléicos a ser expres-sada, pode existir em uma forma de vetor integrado e ser introduzido no ge-noma da planta, por exemplo, por transformação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

Uma primeira modalidade da presente invenção se refere a ummétodo para gerar uma planta transgênica de Zea mays compreendendo asetapas de:

a. isolamento de um embrião imaturo de uma planta de Zeamays, e

b. co-cultivo do dito embrião imaturo isolado, que não foisubmetido a um tratamento do desdiferenciação, com umabactéria nascida do solo pertence ao gênero Rhizobiaceaecompreendendo pelo menos um T-DNA transgênico, o ditoT-DNA compreendendo pelo menos um gene marcador se-lecionável, com um meio de co-cultivo, e

c. transferência dos embriões imaturos co-cultivados para ummeio de recuperação compreendendo:

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibióticoque inibe ou suprime o crescimento da bactéria nas-cida do solo, e

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente1 g/l a aproximadamente 10 g/l, e

iii. nitrato de prata em uma concentração de aproxima-damente 1 |jM a aproximadamente 50 pM, e

iv. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, mas não compreendendo uma quantidadeeficaz de um agente de seleção fitotóxica, e

d. induzir a formação do calo embriogênica e selecionar ocalo transgênico em um meio compreendendo,

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, e

ii. uma quantidade eficaz de um agente de seleção per-mitindo a seleção das células compreendendo o T-DNA transgênico, e

e. regeneração e seleção das plantas contendo o T-DNAtransgênico do dito calo transgênico.

1. Fonte e Preparação do Embrião Imaturo.

O embrião imaturo pode ser isolado de virtualmente qualquervariedade ou planta de Zea mays.

O embrião imaturo é preferivelmente do grupo consistindo emnascimentos naturais, de híbrido, de F1 entre os nascimentos naturais (pre-ferivelmente diferentes), de F1 entre um nascimento natural e um híbrido, deF1 entre uma variedade de nascimento natural e uma variedade naturalmen-te polinizada, de variedades F1 comerciais, de qualquer cruzamento F2 ouautopolinização entre as variedades anteriormente mencionadas e a proge-nitura de quaisquer dos anteriormente mencionados.

São incluídas todas as combinações de pais machos e fêmeaspara as linhagens e cruzamentos anteriormente mencionados. As varieda-des adequadas de Zea mays incluem, mas não são limitadas a P3732,A188, H84, B37Ht, Mo17Ht, W117Ht, Oh43, H99, rhm de W64A Ht, F1(A188 x Preto Mexicano Doce), F1 (A188 x B73Ht), F1 (B73Ht x A188), F1(H84 x A188), F1 (Mo17Ht x A188) e F1 (C103 x A188). Tais variedades es-tão disponíveis como sementes a partir de depósitos tais como a Coleção deCultivo do Tipo Americano (ATCC) e de outros depósitos para o material emsemente conhecido na técnica.

Mais preferivelmente, o embrião imaturo é isolado de um cruza-mento de um F1 ou F2 (HilIA x A188) das plantas com uma linhagem denascimento natural.

As sementes F1 do genótipo HiIIAxAI 88 do milho podem serpreferivelmente produzidas cruzando o HilIA (genitor fêmea) com linhagemde nascimento natural A188 (macho), e plantadas na estufa como doador depólen. As sementes F2 de (HillAxA188) são produzidas por autopolinizaçãodas plantas F1 (HíllAxA188) na estufa ou no campo, e plantadas na estufacomo o doador do pólen.

Bemmaispreferidascomolinhagensdenascimentonaturalparao cruzamento com as plantas F1 ou F2 (HilIA x A188) são linhagens selecio-nadas do grupo das linhagens selecionadas do grupo cuja semente repre-sentativa foi depositada sob o Tratado de Budapest com a Coleção de Culti-vo do Tipo Americano (Manasses, VA 20110-2209, EUA) sob a Patent De-posit Designation PTA-6170 (para sementes da linhagem BPS553), e dePTA-6171 (para sementes da linhagem BPS631).

Os embriões híbridos imaturos da BPS553x(HillAxA188) ou daBPS631x(HillAxA188) são produzidos preferivelmente usando a linhagem denascimento natural BPS553 ou BPS631 como os genitores fêmeas, e ouplantas F1 ou (HillAxA188) as plantas F2 como o genitor macho na estufa.Esses embriões híbridos imaturos demonstraram transformabilidade extraor-dinariamente elevada em comparação com (HilIA x A188) embriões imaturossozinhos, conhecidos na técnica como um dos materiais de Zea mays demelhor transformação (Ishida et al., 1996; Frame et ai., 2002). A transforma-bilidade de um embrião híbrido imaturo de um cruzamento entre o híbrido(HilIA x A188) e as linhagens BPS553 é pelo menos duas vezes maior que aeficiência para o embrião (HilIA x A188) (para uma comparação veja o E-xemplo 7, abaixo). Em conseqüência os cruzamentos acima mencionadassão um material superior para a transformação de Zea mays.

Conseqüentemente, em uma outra modalidade preferida da in-venção se refere a uma planta do milho obtida pelo cruzamento de um híbri-do (HilIA x A188) com uma linhagem de nascimento natural selecionada dogrupo cuja semente representativa foi depositada sob o Tratado de Budapestcom a Coleção de Cultivo do Tipo Americano (Manasses, VA 20110-2209,EUA) sob a Designação de Depósito de Patente PTA-6170 (para sementesda linhagem BPS553), e PTA-6171 (para sementes da linhagem BPS631).

Preferivelmente, a dita planta de milho é transgênica (por exemplo, compre-ende um T-DNA transgênico). Outros objetivos da presente invenção se re-ferem aos descendentes da dita planta do milho (tal como, por exemplo, umalinhagem de nascimento natural), as plantas de nascimento natural ou híbri-das produzidas dos ditos descendentes, e as partes das plantas anterior-mente mencionadas. Tais partes podem incluir, mas não estão limitadas aotecido, às células, ao pólen, o óvulo, às raízes, às folhas, às sementes, aosmicrosporos e às partes vegetativas.

As plantas de Zea mays para o isolamento de embriões imaturossão germinadas e polinizadas tal como conhecido na técnica, preferivelmen-te tal como descrito abaixo, através dos exemplos.

O termo "embrião imaturo" tal como aqui utilizado significa oembrião de uma semente imatura que esteja no estágio do desenvolvimentoinicial e de maturação após polinização. O estágio de desenvolvimento dosembriões imaturos a serem tratados pelo método de acordo com a presenteinvenção não é restrito e os embriões coletados podem estar em qualquerestágio após a polinização. Os embriões preferidos são aqueles coletadosem não menos do que 2 dias após sua fertilização. É preferido também quea scutella dos embriões imaturos sejam capazes de induzir calos germinati-vos diferenciados possuindo uma habilidade de regenerar as plantas nor-mais depois de terem sido transformadas pelo método mencionado abaixo.

Em uma modalidade preferida o embrião imaturo é aquele noestágio de não menos do que 2 dias após a polinização. Mais preferivelmen-te, os embriões imaturos são isolados das espigas das plantas de milho (pre-ferivelmente da primeira espiga que sai) colhidas de 7 a 14 dias (preferivel-mente 8 a 11 dias) após a polinização (DAP). O sincronismo exato da colhei-ta varia dependendo das condições de crescimento e da variedade do milho.

O tamanho de embriões imaturos é uma boa indicação de seu estágio dodesenvolvimento. O comprimento ótimo de embriões imaturos para a trans-formação é de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 1,6 mm, incluin-do o comprimento do scutellum. O embrião deve ser translúcido, não opaco.

Em uma modalidade preferida da invenção, os embriões imatu-ros são isolados e colocados diretamente na superfície um meio solidificadode co-cultivo sem etapa de lavagem adicional. Embora todos os métodosdescritos na técnica incluam diversas etapas de preparação e lavagem todaselas são omitidas na dita melhoria economizando significativa quantidade detempo e custos. Com a presente invenção, a etapa da infecção do Agrobac-terium ocorre no meio de co-cultivo, em vez de dentro de um tubo contendouma suspensão das células do Agrobacterium, tal conhecido na técnica.

Preferivelmente, o embrião imaturo é submetido à transformação(co-cultivo) sem pré-tratamento de diferenciação. O tratamento dos embriõesimaturos com uma enzima de degradação da parede celular ou através delesão da parede celular (por exemplo, corte com bisturi ou perfuração comagulhas) é opcional. Entretanto, esta degradação ou etapa de lesão não sãonecessárias e são omitidas em uma modalidade preferida da invenção.

O termo "desdiferenciação", "tratamento de desdiferenciação" ou"pré-tratamento de desdiferenciação" significa um processo para obter osaglomerados celulares, tais como o calo germinativo, que mostram um cres-cimento não organizado pelo cultivo de células diferenciadas de tecidos daplanta em um meio de desdiferenciação. Mais especificamente, o termo"desdiferenciação" tal como aqui utilizado pretende significar o processo deformação de células que se dividem rapidamente sem uma função em parti-cular no escopo do corpo da planta. Estas células freqüentemente possuemuma potência aumentada com relação a sua habilidade de se desenvolve-rem em vários tecidos da planta. O termo pretende preferivelmente significara reversão de alguns tecidos diferenciados ou especializados (por exemplo,embriônico) a uma forma mais pluripotente ou mais totipotente. A desdife-renciação pode conduzir à reprogramação de um tecido de planta (reverteprimeiramente para um não diferenciado, células não especializadas, e de-pois novas e diferentes vias). O termo "totipotente" tal como aqui utilizadopretende significar uma célula da planta contendo toda a informação genéti-ca e/ou celular necessária para formar uma planta inteira. A desdiferencia-ção pode ser iniciada por determinados reguladores de crescimento da plan-ta (por exemplo, compostos da auxina e/ou da citoquinina), especialmentepor determinadas combinações e/ou concentrações das mesmas.

2. Co-cultivo.

A bactéria nascida do solo empregada para transferência de umT-DNA para o embrião imaturo pode ser de qualquer espécie da família dasRhizobiaceae. A família das Rhizobiaceae compreende os gêneros Agrobae-terium, Rhizobium, Sinorhizobium, e Allorhizobium são os gêneros dentro dafamília bacteriana e foram incluídos na subclasse alfa-2 das Proteobactériascom base nas características ribossômicas. Os membros desta família sãoaeróbicos, Gram negativo. As células normalmente em forma de haste (0,6 a1,0 |a.m por 1,5 a 3,0 (im), ocorrendo sozinha ou em pares, sem endosporose são móveis pela ação de um a seis flagelos. Um mucopolissacarídeo ex-tracelular considerável é produzido geralmente durante o crescimento emmeios contendo carboidrato. É preferido especial Rhizobiaceae tal como oSinorhizobium meliioti, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium fredii, Rhizo-bium sp. NGR234, Rhizobium, sp BR816, Rhizobium, sp. N33, Rhizobiumsp. GRH2, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium terangae, Rhizobium Iegu-minosarum biovar trifolii, Rhizobium Ieguminosarum biovar viciae, RhizobiumIeguminosarum biovar phaseoli, Rhizobium tropici, Rhizobium etli, Rhizobiumgalegae, Rhizobium gálicoum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense,Rhizobium mongoiense, Rhizobium lupini, Rhizobium loti, Mesorhizobiumhuakuii, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium mediterraneium, Mesorhizobi-um tianshanense, Mesorhizobium elkanni, Bradyrhizobium japonicum, Brady-rhizobium liaoningense, Azorhizobium caulinodans, Allobacterium undicola,Phyllobacterium myrsinacearum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacteriumradiobaeter, Agrobaeterium rhizogenes, Agrobacterium vitis e Agrobaeteriumrubi.

A natureza monofilética do Agrobaeterium, Allorhizobium e oRhizobium e sua circunscrição genérica fenotípica comum suportam suaamalgamação em um único gênero, Rhizobium. A classificação e a caracte-rização das cepas do Agrobaeterium incluindo a diferenciação dos Agrobae-terium tumefaciens e Agrobaeterium rhizogenes e suas várias classes dotipo opina são uma prática bem-conhecida na técnica (Ver, por exemplo, La-boratory Guide For Identification Of Plant Pathogenic Bactéria, 3- edição.(2001) Schaad, Jones, e Chun (eds.) ISBN 0890542635; por exemplo, o arti-go de Moore eT ai., publicado no mesmo). As análises recentes demonstramque a classificação por suas propriedades patogênicas da planta não podeser justificada. Métodos conseqüentemente mais avançados baseados naanálise e na comparação do genoma (tal como o sequenciamento do rRNA16S; RFLP, Rep-PCR, etc..) são empregados para elucidar o relacionamentodas várias cepas (veja, por exemplo, Young 2003, Farrand 2003, de Bruijn1996, Vinuesa 1998). Os relacionamentos filogenético dos membros do gê-nero Agrobaeterium por dois métodos demonstram que o relacionamentodas cepas K599 do Agrobaeterium são apresentados em Llob 2003 (figura 2).

Sabe-se na técnica que não somente o Agrobaeterium mas tam-bém outras bactérias nascida do solos são capazes de mediar a transferên-cia de T-DNA fornecendo a eles os elementos funcionais relevantes paratransferência de T-DNA de um Ti-plasmídio ou Ri-Plasmidio (Klein & Klein1953; Hooykaas 1977; van Veen 1988).

Preferivelmente, a bactéria nascida do solo é do gênero Agro-baeterium. O termo "Agrobaeterium" tal como aqui utilizado se refere a umabactéria nascida do solo, Gram negativo, com formato de haste e patogêni-ca. As espécies de Agrobaeterium, Agrobaeterium tumefaciens (sin. Agro-baeterium radiobactei), Agrobaeterium rhizogenes, Agrobaeterium rubi e A-grobacterium vitis, juntamente com Allorhizobium undicola, formam um grupomonofilético com todas as espécie do Rhizobium, baseado em análisescomparativas do rDNA 16S (Sawada 1993, Young 2003). O Agrobacterium éum gênero artificial compreendendo as espécies patogênicas da planta.

O termo Ti-plasmídio tal como aqui utilizado se refere a umplasmídio que seja replicável no Agrobacterium e esteja no seu natural, "ar-mado" para mediar a formação da doença galha-da-coroa em plantas infec-tadas com Agrobacterium. A infecção de uma célula da planta com uma for-ma natural armada de um Ti-plasmídio do Agrobacterium resulta geralmentena produção de opinas (por exemplo, nopalina, agropina, octopina etc..) pelacélula infectada. Assim, as cepas de Agrobacterium que causam a produçãoda nopalina (por exemplo, cepa LBA4301, C58, A208) são referidas comoagrobactérias do tipo nopalina; As cepas de Agrobacterium que causam aprodução do octopina (por exemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) são referidascomo agrobactérias do tipo octopina; e as cepas do Agrobacterium que cau-sam a produção da agropina (por exemplo, cepa EHA105, EHA101, A281)são referidas como agrobactérias do tipo agropina. Um Ti-plasmídio desar-mado é compreendido como um Ti-plasmídio que faltam suas propriedadesmediar a galha-da-coroa, mas fornecendo de outro modo as funções para ainfecção da planta. Preferivelmente, a região de T-DNA do dito plasmídio"desarmado" foi modificada de um modo que ao lado das seqüências dasfronteiras nenhuma seqüência Ti interna funcional pode ser transferida parao genoma da planta. Em uma modalidade preferida, quando usado com umsistema de vetor binário, a região inteira do T-DNA (incluindo as fronteiras doT-DNA) é eliminada.

O termo Ri-plasmídio tal como aqui utilizado se refere a um plas-mídio que é replicável no Agrobacterium e que esteja na sua forma naturalarmada mediando a doença da raiz-em-cabeleira em plantas infectadas comAgrobacterium. A infecção de uma célula da planta com a forma natural ar-mada do Ri-plasmídio do Agrobacterium resulta geralmente na produção deopinas (os derivados específicos do amino-açúcar produzidos nas célulastransformadas da planta tal como, por exemplo, a agropina, a cucumopina, aoctopina, a mikimopina etc.) pela célula infectada. As cepas dos Agrobacte-rium rhizogenes são tradicionalmente separadas em subclasses do mesmomodo que as cepas do Agrobacterium tumefaciens. As cepas mais comunssão cepas do tipo aropina (por exemplo, caracterizado pelo Ri-plasmídio pRi-A4), cepas do tipo manopina (por exemplo, caracterizado pelo Ri-plasmídiopRi8196) e cepas do tipo cucumopina (por exemplo, caracterizado pelo Ri-plasmídio pRi2659). Algumas outras cepas são do tipo mikimopina (por e-xemplo, caracterizado pelo Ri-plasmídio pRi1723). A mikimopina e a cucu-mopina são estereoisômeros mas nenhuma homologia foi encontrada entreos plasmídios pRi no nível do nucleotídeo (Suzuki 2001). Um plasmídio de-sarmado de Ri- é compreendido como um Ri-plasmídio em que faltam suaspropriedades para mediar da doença da raiz-em-cabeleira mas de outra ma-neira fornece as funções para a infecção da planta. Preferivelmente, a regiãode T-DNA do dito plasmídio Ri "desarmado" foi modificada de um modo queao lado das seqüências das fronteiras nenhuma seqüência Ri interna funcio-nal pode ser transferida para o genoma da planta. Em uma modalidade pre-ferida, quando usado com um sistema de vetor binário, a região inteira do T-DNA (incluindo as fronteiras do T-DNA) é eliminada.

Os plasmídios do Ti e do A. tumefaciens e A. rhizogenes, res-pectivamente, carregam os genes responsáveis para a transformação gené-tica da planta (Kado 1991). Os vetores são baseados no Ti-plasmídio ou noRi-plasmídio do Agrobacterium e utilizam um sistema natural de transferên-cia de DNA no genoma da planta. Como a parte deste parasitismo altamentedesenvolvido o Agrobacterium transfere uma parte definida de sua informa-ção genômica (o T-DNA; flanqueado por aproximadamente 25 repetições dobp, nomeados fronteira esquerda e direita) para o DNA cromossômico celu-lar da planta (Zupan 2000). Pela ação combinada dos assim chamados ge-nes vir (parte dos Ti-plasmídios originais) a dita transferência de DNA é me-diada. Para a utilização deste sistema natural, os Ti-plasmídios foram de-senvolvidos faltando os genes originais indutores de tumor ("vetores desar-mados"). Em uma melhoria adicional, os chamados "sistemas de vetoresbinários", o T-DNA foram separados fisicamente dos outros elementos fun-cionais do Ti-plasmídio (por exemplo, os genes vir), sendo incorporado emum vetor de transporte, que permitiu uma manipulação mais fácil (EP-A120.516; US 4.940.838). Estes vetores binários compreendem (ao lado do T-DNA desarmado com suas seqüências de fronteira), seqüências procarióti-cas para a replicação em ambos Agrobacterium e E. coli. É uma vantagemde transformação mediada pelo Agrobacterium em que geralmente somenteo DNA flanqueado pelas fronteiras seja transferido para o genoma e que pre-ferencialmente somente uma cópia seja introduzida. As descrições de siste-mas e de métodos do vetor do Agrobacterium para transferência de genemediadas pelo Agrobaeterium são conhecidas na técnica (Miki 1993; Gruber1993; Moloney 1989).

Desse modo, para a transformação mediada pelo Agrobaeteriuma composição genética (por exemplo, compreendendo um cassete de ex-pressão) é integrada em plasmídios específicos, em um vetor de transporteou em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Se um plasmídio do Tiou do Ri for usado para a transformação, pelo menos a fronteira direita, masna maioria de casos a fronteira direita e esquerda, do plasmídio Ti ou Ri doT-DNA está ligado ao cassete de expressão a ser introduzido na forma deuma região de flanco. Os vetores binários são preferivelmente usados. Osvetores binários são capazes de replicação tanto na E.coii como no Agrobae-terium. Podem compreender um gene marcador ae seleção e um Iigante ouum poliligante (para a inserção, por exemplo, do cassete de expressão a sertransferido) flanqueados pela seqüência das fronteiras direita e esquerda doT-DNA. Podem ser transferidos diretamente para o Agrobaeterium (Holsters1978). O gene marcador de seleção permite a seleção das Agrobaeteriastransformadas e é, por exemplo, o gene nptll, que confere resistência à ca-namicina. O Agrobaeterium que age como organismo hospedeiro neste casojá deve conter um plasmídio com a região de vir. O último é necessário paratransferir o T-DNA para a célula da planta. Um Agrobaeterium transformadodese modo pode ser usado para transformar as células da planta. O uso deT-DNA para transformar células da planta foi estudado e descrito intensiva-mente (EP 120 516; Hoekema 1985; An 1985).

Os vetores binários comuns são baseados em "uma ampla faixade hospedeiros" plasmídios semelhantes ao pRK252 (Bevan 1984) oupTJS75 (Watson 1985) derivados do plasmídio RK2 do tipo P. A maioriadestes veto rs são derivados de pBIN19 (Bevan 1984). Vários vetores biná-rios são conhecidos, alguns dos quais estão comercialmente disponíveiscomo, por exemplo, o pBI101.2 ou o pBIN19 (Clontech Laboratórios, Inc.EUA). Vetores adicionais foram melhorados com relação ao tamanho e àmanipulação (por exemplo, pPZP; Hajdukiewicz 1994). Os sistemas melho-rados de vetor são descritos também no WO 02/00900.

Preferivelmente a bactéria nascida do solo é uma bactéria per-tencendo a família do Agrobacterium, mais preferivelmentè de uma cepadesarmada do Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Emuma modalidade preferida, as cepas do Agrobacterium para o uso na práticada invenção incluem cepas de octopina, por exemplo, cepas de LBA4404 oude agropina, por exemplo, EHA101 ou EHA105. As cepas adequadas de A.tumefaciens para transferência de DNA são, por exemplo, EHA101pEHA101(Hood 1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992), LBA4404[pAL4404] (Hoekema1983), C58C1 [pMP90] (Koncz & Schell 1986), e C58C1[pGV2260] (Deblae-re 1985). Outras cepas adequadas são os Agrobacterium tumefaciens 058,uma cepa da nopalina. Outras cepas adequadas são A. tumefaciens C58C1(Van Larebeke 1974), A136 (Watson 1975) ou LBA4011 (Klapwijk 1980). Emuma outra modalidade preferida a bactéria nascida do solo é uma variantedesarmada da cepa K599 do Agrobacterium rhizogenes (NCPPB 2659). Taiscepas são descritas no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Ng60/606789, arquivada setembro de 2004, aqui incorporado completamentepela referência.

Preferivelmente, estas cepas estão compreendendo uma varian-te desarmada do Ti-plasmídio ou do Ri-plasmídio que fornece as funçõesrequeridas para transferência de T-DNA em células da planta (por exemplo,os genes de vii). Em uma modalidade preferida, a cepa do Agrobacteriumusada para transformar o tecido de planta pré-cultivado com o composto fe-nólico da planta contém um Ti-plasmídio do tipo succinamopina L1L, preferi-velmente desarmado, tal como o pEHA101. Em uma outra modalidade prefe-rida, a cepa do Agrobacterium usada para transformar o tecido de plantapré-cultivado com o composto fenólico da planta contém um Ti-plasmídio dotipo octopina, preferivelmente desarmado, tal como o pAL4404. Geralmente,ao usar o Ti-plasmídio do tipo octopina ou os plasmídios auxiliares, prefere-se que o gene do w/f esteja suprimido ou inativado (Jarschow 1991).

O método de acordo com a invenção também pode ser usadoem combinação com cepas particulares do Agrobacterium, para um aumentoadicional da eficiência de transformação, tal como as cepas do Agrobacteri-um em que a expressão do gene vir e/ou a indução do mesmo é alteradadevido à presença de genes w/A ou w/G mutantes ou quiméricos (por e-xemplo, Hansen 1994; Chen e Winans 1991; Scheeren-Groot, 1994). Sãopreferidas umas combinações adicionais da cepa LBA4404 do Agrobacteri-um tumefaciens (Hiei 1994) com os plasmídios super-virulentos. Estes sãopreferivelmente vetores a base de pTOK246 (Ishida 1996).

Um vetor binário ou todo o outro vetor podem ser modificadospor técnicas comuns do recombinação de DNA, ser multiplicados em E. coli,e ser introduzidos no Agrobacterium por exemplo, pela ração do electropo-ou pelas outras técnicas de transformação (Mozo 1991). O Agrobacterium écrescido e usado em uma maneira similar àquela descrita em Ishida (Ishida1996). O vetor compreendendo a cepa do Agrobacterium pode, por exemplo,ser crescido por 3 dias no meio do YP (ágar do extrato de fermento de 5 g/l,do peptone de 10 g/l, dos 5 g/l NaCI, dos 15 g/l, pH 6.8) suplementado como antibiótico adequado (por exemplo, spectinomicina de 50 mg/l). As bacté-rias são coletadas com um laço do meio contínuo e ressuspensas. Em umamodalidade preferida da invenção, as culturas do Agrobacterium são come-çadas pelo uso das alíquotas congeladas a -80°C.

A transformação dos embriões imaturos pelo Agrobacterium po-de ser realizada meramente contatando os embriões imaturos com o Agro-bacterium. A concentração do Agrobacterium usada para a infecção e o co-cultivo pode necessitar ser variado. Por exemplo, uma suspensão celular doAgrobacterium possuindo uma densidade de população de aproximadamen-te 105 a 1011, preferivelmente de 106 a 1010, mais preferivelmente de apro-ximadamente 108 células ou cfu/ml é preparada e os embriões imaturos sãoimersos nesta suspensão por aproximadamente 3 a 10 minutos. Os embri-ões imaturos resultantes são cultivados então em um meio contínuo por di-versos dias junto com o Agrobacterium.

Em uma outra modalidade preferida para a etapa da infecção edo co-cultivo uma suspensão da bactéria nascida do solo (por exemplo, a-grobacteria) no meio de co-cultivo ou da infecção é aplicada diretamente acada embrião, e uma quantidade adicional de líquido que cobre o embrião éremovida. A remoção pode ser feita por vários meios, preferivelmente porsecagem ao ar ou por absorção. Este é trabalho e tempo poupado e estáreduzindo danos acidentais mediados por Agrobacterium pelo excesso deuso de Agrobacterium. Em uma modalidade preferida de aproximadamente 1a aproximadamente 10 jllI de uma suspensão da bactéria nascida do solo(por exemplo, Agrobacteria) são empregados. Preferivelmente, o embriãoimaturo infectado com Agrobacterium diretamente no meio de co-cultivo.

Preferivelmente, a bactéria é empregada em uma concentração de 106 a1011 cfu/ml.

Para o tratamento do Agrobacterium de embriões imaturos iso-lados, as bactérias ressuspensas em um meio compatível do co-cultivo daplanta. O suplemento do meio da co-cultura com antioxidants (por exemplo,nitrato de prata), compostos fenol-absorvendo (como o polivinilpirrolidona,Perl 1996) ou compostos do tiol (por exemplo, ditiotreitol, L-cisteína, Olhoft2001) que pode diminuir a necrose do tecido devido às respostas de defesada planta (como a oxidação fenólica) pode também melhorar a eficiência detransformação. Em uma outra modalidade preferida, o meio de co-cultivocompreende de pelo menos um composto tiol, selecionado preferivelmentedo grupo consistindo em tiolsulfato de sódio, ditiotreitol (DTT) e L-cisteína.

Preferivelmente a concentração está entre aproximadamente 1 mM e 10 mMde L-cisteína, 0,1 mM 5 ao mM DTT, e/ou tiossulfato de sódio de 0,1 mM de5 mM. Preferivelmente, o meio empregado durante o co-cultivo compreendede aproximadamente 1^iM a aproximadamente 10 (J.M do nitrato de prata ede aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 1, 000 mg/L de L-cisteína.Isto resulta em uma vulnerabilidade altamente reduzida do embrião imaturode encontro aos lesões Agrobacterium-meó\aàos (tais como o necrosis indu-zido) e altamente melhora a eficiência total de transformação. Uma escalade períodos do co-cultivo de algumas horas a 7 dias pode ser empregada. Ocultivação do co- do Agrobacterium com os embriões imaturos isolados ge-ralmente é realizada por aproximadamente 12 horas a aproximadamentecinco dias, preferivelmente aproximadamente 1 dia a aproximadamente 3dias. Em uma modalidade melhorada da invenção os embriões imaturos iso-lados e/ou os Agrobacteria podem ser tratados com um composto fenólicoantes ou durante do co-cultivo do Agrobacterium. da "os compostos fenólicoplanta" ou da "os fenólicos planta" adequados dentro do alcance da inven-ção são aqueles as moléculas fenólico substituídas isoladas que são capa-zes induzir uma resposta Quimiotática positiva, particularmente aquelas quesão capazes induzir a expressão aumentada do gene de vir em um Ti-plasmídio contendo sp. do Agrobacterium, particularmente um Ti-plasmídiocontendo tumefaciens do Agrobacterium. Os métodos para medir respostaschemotactic para compostos fenólico da planta foram como por exemplo, odescrito (Ashby 1988) e os métodos para medir a indução da expressão dogene de vir são também bem-conhecidos (Stachel 1985; Bolton 1986). Opre-treatmento e/ou o tratamento durante o co-cultivo do Agrobacterium têmpelo menos dois efeitos benéficos: Indução dos genes de vir de plasmídiosdo Ti ou de plasmídios auxiliares (Van Wordragen 1992; Jacq 1993; James1993; Guivarc'h 1993), e realce do competence para a modalidade para deDNA do eign no genoma celular da planta.

Os compostos fenólico preferidos da planta são aqueles encon-trados em exudados da ferida de células da planta. Um dos melhores com-postos fenólico conhecidos da planta é o Acetosiringone, que está presenteem diversas células feridas e intactas de várias plantas, albeit em diferentesconcentrações. Entretanto, o Acetosiringone (3,5-demetóxi-4-hidroxiace-tofonona) não é a única planta fenólica que pode induzir a expressão de ge-nes de vir. Outros exemplos são a-hidróxi-Acetosiringone-Acetosiringone,sinapínico (ácido 3,5-demetóxi-4-hidroxicinnamic), ácido siríngico (ácido 4-hidróxi-3,5 benzóico demetóxi), ácido ferulic (ácido 4-hidróxi-3-metoxicinnamic), catechol (1,2-dihidroxibenzeno), ácido p-hidroxibenzóico(ácido 4- benzóico hidróxi), ácido p-resorcylic (ácido 2,4-dihidroxibenzóico),ácido protocatechuic (ácido 3,4-dihidroxibenzóico), ácido pirrogálico (ácido2,3,4-trihidroxibenzóico), ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico) e vani-Iina (3-metóxi-4-hidroxibenzaldehido), e estes compostos fenólico são co-nhecidos ou esperados poder substituir o Acetosiringone nos meios de culti-vasão com os resultados similares. Como usadas aqui, as moléculas men-cionadas são se referidas como aos compostos fenólico da planta.

Os compostos fenólico da planta podem ser adicionados aomeio de cultura da planta sozinho ou em combinação com outros compostosfenólico da planta. Uma combinação particularmente preferida de compostosfenólico da planta compreende pelo menos o Acetosiringone e o ácido p-hidroxibenzóico, mas espera-se que outras combinações de dois, ou mais,compostos fenólico de planta irão também agir sinergisticamente no aumen-to da eficiência de transformação.

Além disso, certos compostos como osmoprotetores (por exem-plo, L-prolina preferivelmente em uma concentração de aproximadamente700 mg/L ou de betaina), Fitoformas (entre outros NAA), opinas, ou os açú-cares, agem sinergisticamente quando adicionados em combinação comcompostos fenólico da planta. Em uma modalidade da presente invenção,prefere-se que o composto fenólico da planta, particularmente Acetosiringo-ne está adicionado ao meio antes de contactar os embriões imaturos isola-dos com agrobacteria (por exemplo, diversas horas a um dia). O períodoexato em que as células cultivadas incubadas no meio contendo o compostofenólico da planta tal como o acetosiringone, é acreditado não ser crítico esomente limitado pelo tempo onde os embriões imaturos começam se dife-renciar.

A concentração do composto fenólico da planta no meio é acre-ditada também para ter um efeito no desenvolvimento da capacidade para atransformação integrada. A escala ótima da concentração de compostos fe-nólico da planta no meio pode variar dependendo da variedade de Zea maysde que os embriões imaturos derivados, mas dele se esperam que aproxi-madamente 100 |j.M 700 |iM é uma concentração apropriada para muitasfinalidades. Entretanto, concentrações tão baixas como aproximadamente 25IiM podem ser usadas para obter um bom efeito na eficiência de transforma-ção. Do mesmo modo, espera-se que concentrações mais elevadas de atéaproximadamente 1000 |iM renderão efeitos similares. As concentraçõescomparáveis aplicam-se a outros compostos fenólico da planta, e as concen-trações ótimas podem ser estabelecidas facilmente pela experimentação deacordo com a presente invenção.

Os agrobacteria serem cultivados com os embriões imaturos iso-lados podem ser também pre-incubados com Acetosiringone ou outro com-posto fenólico da planta, como conhecido pela pessoa versada na técnica,ou usado diretamente após o isolamento de seu meio de cultura. Particular-mente as condições servidas da indução para Agrobacterium tumefaciensforam descritos por Vernade et al. (1988). A eficácia de transformação comAgrobacterium pode ser aumentada por numerosos outros métodos conhe-cidos na ténica como para a infiltração a vácuo do exemplo (WO 00/58484),o choque e/ou a centrifugação do calor, a adição do nitrato de prata, o soni-cation etc.

Observou-se dentro da presente invenção que o eficácia datransformação dos embriões imaturos isolados por Agrobacterium pode sig-nificativamente ser melhorado mantendo o pH do meio de co-cultivo em umaescala de 5,4 a 6,4, preferivelmente 5,6 a 6,2, especialmente preferivelmente5,8 a 6,0, Em uma modalidade melhorada da estabilização pf da invenção opH nesta escala é mediado por uma combinação de MES e de tampão dehidrogenfosfato e potácio.

3. Recuperação e seleção.

Depois que o co-cultivo com as bactérias descritas acima asbactérias restantes podem ser removido (por exemplo, por uma etapa delavagem). O meio empregado após a etapa do co-cultivo contém preferivel-mente, um bacteriocida (antibiótico). Esta etapa é destinada a promover ainiciação da formação embriogênica do calo no embrião do Agrobacteriuminfectado e mata as células restantes do Agrobacterium. Conseqüentemente,o método de acordo com a invenção compreende a etapa de transferir osembriões imaturos co-cultivados a um meio de recuperação compreendendo:

i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico queinibe ou suprime o crescimento das bactérias nascidas dosolos, e

ii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente 1 g/la aproximadamente a 10g/l, e

iii. nitrato de prata em uma concentração de aproximadamen-te 1|iM à aproximadamente 50 |iM, e

iv. um uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, mas não compreendendo uma quantidade eficazde um agente de seleção fitotóxica.

Opcionalmente a dita recuperação do meio pode também com-preender pelo menos um fator do crescimento de planta. Os antibióticos bac-tericidas preferidos a ser empregados são por exemplo, a carbenicilina (500mg/L) ou o Timentin® (GlaxoSmithKline; uma mistura do ticarcillin disodiume do potas- do clavulanate sium; 0,8 g Timentin® contém o ácido clavulânicodo magnésio 50 mg com o ticarcillin do magnésio 750, Quimicamente, o ti-carcillin disodium é sal disodium ácido de N-(2-Carbóxi-3,3-dimetil-7-oxo-4-thia-1- azabiciclo[3.2.0]hept-6-il)-3-thio-fenemalonâmico. Quimicamente, opotássio do vulanate do cia- é o potassium (Z)-(2R, 5R)-3-(2-hidroxiethi-lideno)-7-oxo-4-oxa-1 - azabiciclo[3.2.0 ] heptane-2-carboxilato).

Prefere-se que durante o período da recuperação nenhuma pre-sença de um nível fitotóxico de um agente de seleção (tal como um herbici-da, um antibiótico fitotóxico, um D-amino ácido fitotóxico etc..) seja empre-gado. No caso de a seleção de células transformadas da planta for baseadano uso de um marcador de seleção negativo (veja que abaixo) um agente deseleção negativo (ou fitotóxico) a ser empregado em combinação com o ditomarcador de seleção negativo dito deve ser empregado somente após o pe-ríodo da recuperação. Em agentes do contraste para a seleção positiva e/oua seleção do marcador capaz de ser verificado pode ser empregada mesmodurante o período da recuperação. Os exemplos para meios de recuperaçãopreferidos são dados abaixo (A-4 ou A-5).

O período da recuperação pode durar de aproximadamente 1 diaa aproximadamente 14 dias, preferivelmente aproximadamente de 5 dias aaproximadamente 8 dias. Preferivelmente, o lado do scutellum é proseguidodurante este tempo e não encaixado nos meios.

Depois da etapa de recuperação os embriões imaturos sãotransferidos a e incubados em um meio da seleção compreendendo regula-dores de crescimento adequados da planta para a indução da formação docalo do embruiogênico. O meio da seleção adicional compreende pelo me-nos um composto que termina ou retarda pelo menos o crescimento das cé-lulas não transformadas ou estimula o crescimento de células transformadasalém da taxa de crescimento de células não transformadas.

O termo "regulador de crescimento de planta" (PGR) tal comoaqui utilizado significa os meios que naturalmente ocorrem ou composto sin-téticos (nao ocorrendo naturalmente) que podem regular o crescimento e odesenvolvimento de planta. PGRs podem agir unicamente ou no consortcom um outro ou com outros compostos (por exemplo, açúcares, aminoácidos).

Mais especificamente o meio empregado para a indução e a se-leção embriogênica do calo compreende

i. ma quantidade eficaz de pelo menos um composto auxínico, e

ii. uma quantidade eficaz de um agente de seleção permitin-do a seleção das células compreendendo o transgênico.

Além disso o meio embriogênica da indução do calo pode opcio-nalmente compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um antibióticoque inibe ou suprime o crescimento das bactérias nascida do solos (comodefinido acima).

O termo "auxina" ou "compostos auxina" compreende os com-postos que estimulam a elongasão celular e a divisão, diferenciação do teci-do vascular, desenvolvimento da fruta, formação de raízes imprevistas, pro-dução do etileno, e - em concentrações elevadas - induz a de diferenciação(formação do calo). A auxina mais comum de ocorrer naturalmente é no áci-do doleacético (IAA), que é transportada de forma polar nas raízes e nashastes. As auxinasa sintéticas são usadas extensivamente na agriculturamoderna. Os compostos sintéticos da auxina compreendem ácido indol-3-butirico (IBA), no ácido naftilacético (NAA)1 e no ácido 2,4-diclorofeno-xiacético(2,4-D).

Preferivelmente, quando usado como o único composto da auxi-na, 2,4-D em uma concentração de aproximadamente 0,2 mg/l a aproxima-damente 6 mg/l, mais preferivelmente aproximadamente 0,3 a aproximada-mente 2 mg/l, o mais preferivelmente aproximadamente 1.5 mg/l é emprega-do. Caso que outros compostos da auxina ou combinações disso são em-pregados, suas combinações preferidas estão escolhidas de uma maneiraque o efeito de diferenciação é equivalente ao efeito conseguido com asconcentrações acima especificadas da 2,4-D quando usado como o únicocomposto da auxina.

Além disso, a combinação de auxinas diferentes pode ser em-pregada, por exemplo, uma combinação da 2,4-D e do Picloram. Preferivel-mente, 2,4-D em uma concentração de aproximadamente 0,5 mg/l pode sercombinado com o um ou mais outros tipos de compostos auxina por exem-plo, Picloram em uma concentração de aproximadamente 1 a aproximada-mente 2 mg/l para melhorar qualidade/quantidade da formação embriogênicado calo.

O meio deve ser opcionalmente aindasuplementado com um oumais reguladores de crescimento adicional da planta, como por exemplo, oscompostos do citoquinina (por exemplo, 6-benzilaminopurina) e/ou os outroscompostos da auxina. Tais compostos incluem, mas não são limitados a,IAA, NAA, IBA, citoquininas, auxinas, kinetinas, glifosato, e thiadiazorun. Oscompostos do citoquinina compreendem, por exemplo, a benzilaminopurina6-isopentenyladenine (IPA) e 6-benziladenina/6- (BAP).

O período da seleção e da indução do calo pode fazer exame deaproximadamente 1 a aproximadamente 10 semanas, preferivelmente, 3 a 7semanas, mais preferivelmente 4 a 6 semanas. Entre o período da seleção ocalo pode ser transferido ao meio fresco de seleção uma ou mais vezes. Po-rém alternativa e preferivelmente em um método melhorado, simplificado dainvenção, somente uma etapa média da seleção (sem transferência ao meionovo da seleção) é requerida. Na conseqüentemente, aproximadamente30% do tempo e o trabalho (isto é, 60 minutos para cada 100 embriões ima-turos) é conservado. Quando o protocolo básico (com 2 etapas de transfe-rência) requerer o calo crescente em meios de seleção por geralmente 5 a 6semanas, o método melhorado, simplificado requer 4 semanas. Assim, oprocesso inteiro de transformação é encurtado por 1 a 2 semanas.

As técnicas Agrobacterium-mediadas tipicamente podem resultarna liberação do gene em um número limitado das células no tecido alvejado.

A inserção do componente genético no DNA cromossômico pode ser de-monstrada e analisada pelos vários métodos conhecidos na ténica como porexemplo, a análise de PCR, análise do Southern blot, fluorescência no hibri-dização do situ (FISH), e in situ PCR. Entretanto, a seleção do transformadocom sucesso das células não transformadas é preferida. Isto é feito preferi-velmente aplicando um composto da seleção que em combinação com ge-nes selecionáveis de um marcador no T-DNA permita tal seleção com umavantagem seletiva. Os vários marcadores selecionáveis são conhecidos natécnica apropriada para a transformação de Zea mays. Tais marcadores nãopodem incluir mas são limitados a:

i) Marcadores de seleção negativos.

Os marcadores de seleção negativos conferenciam uma resis-tência a um composto biocidal tal como um inibidor metabolic (por exemplo,2-deoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (por exemplo, canami-cina, G 418, bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (por exemplo, fosfino-tricina ou glifosato). O material de planta transformado (por exemplo, células,tecidos ou brotos), que expressam genes do marcador, é capaz de tornar-sena presença das concentrações de um composto correspondente da seleção(por exemplo, antibiótico ou herbicida) que suprime o crescimento de umnão-transformador tecido do tipo selvagem. Especialmente os marcadoresde seleção negativos preferidos são aqueles que conferenciam resistênciaaos herbicidas. Os exemplos que podem ser mencionados são:

- Acetiltransferases de Fosfinotricina (PAT; ®resistance tambémnomeado de Bialophos; barra; de Obstrução 1987; Vasil 1992, 1993; Sema-nas 1993; Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; Ep O 333 033;US 4,975,374).

- Sintase de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS) conferindoresistência a Glifosato® (N-(fosfonometil)glicina) (Shah 1986; Della-Cioppa 1987)

- Enzimas degradando de Glifosato® (oxidorredutase de Glifosa-to®; gox),

- inativação das dehalogenases de Dalapon® (deh)

- sintases de acetolactato de sulfonilurea- e/ou imidazolinona-inativadas (ahas ou ALS; para variantes mutada ahaslALS com, por exem-plo, o S4, Xl 12, XA17, e/ou mutação de Hra

- Nitrilases degradando de Bromoxynil® (bxn)

- Genes resistente à canamicina ou Genetieina (G418) (NPTII;NPTI) codificando por exemplo, para fosfotransferases do neomicina (Fraley1983; Nehra 1994)

- fosfatase de 2-Desoxiglucose-6-fosfato (produto de D0GR1-Gene; WO 98/45456; EP O 807 836) conferindo a resistência contras 2-desoxiglucose (Randez- Gil 1995).

- fosfotransferase de higromicina (HPT), que media a resistênciaao higromicina (Vanden Elzen 1985).

- redutase do dihidrofolate (Eichholtz 1987).

Os genes selecionáveis negativos adicionais do marcador daorigem bacteriana que conferenciam resistência aos antibióticos incluem ogene do aadA, que conferencia resistência ao antibiótico spectino-micina, aotransferase de acetil gentamicina, à fosfotransferase da streptomicina (SPT),ao transferase da aminoglicosida-3-adenila e à determinante da resistênciado bleomicina (Hayford 1988; Jones 1987; Svab 1990; Hille 1986).São preferidos especialmente os marcadores de seleção negati-vos que conferenciam resistência de encontro aos efeitos tóxicos impostospor D-aminoácidos como por exemplo, a D-alanina e a D-serina (WO03/060133; Erikson 2004). Especialmente preferido no marcador de seleçãonegativo nesta competição é o dao \ gene (EC: 1.4. 3.3: GenBank Acc.-No.:U60066) do fermento de Rhodotorula gracilis (toruloides Rhodosporidium) edo dsdA do gene do E. coli (dehidratase da D-serine (deaminase) da D-serina [EC: 4.3. 1.18; GenBank Acc.-N2.: J01603).

O material de planta transformado (por exemplo, células, embri-ões, tecidos ou brotos) que expressam tais genes do marcador é capaz detornar-se na presença das concentrações de um composto correspondenteda seleção (por exemplo, antibiótico ou herbicida) que suprima o crescimen-to do tecido tipo selvagem não transformado. As plantas resultantes podemser produzidas e hibridizadas na forma habitual. Duas ou o mais geraçõesdevem ser crescidas a fim assegurar-se de que a integração genômica sejaestável e hereditária. Os métodos correspondentes são descritos (Jenes1993; Potrykus 1991).

Além disso, os genes repórter podem ser empregados parapermitir a seleção visual, que pode ou não pode (dependendo do tipo de ge-ne do repórter) requerer o suplemento com um substrato secundário comoum composto da seleção.

Os vários esquemas do tempo podem ser empregados para osvários genes negativos do marcador de seleção. No caso de genes da resis-tência (por exemplo, de encontro aos herbicidas ou aos D-aminoácidos) aseleção é aplicada preferivelmente durante todo a fase da indução do calopor aproximadamente 4 semanas e está através de pelo menos 4 semanasna regeneração. Tal esquema da seleção pode ser aplicado para todos osregimes da seleção. É além disso possível (embora preferido não explicita-mente) permanecer também a seleção durante todo o esquema inteiro daregeneração incluindo enraizar.

Por exemplo, com o gene da resistência da fosfinotricina (barra)como o marcador seletivo, a fosfinotricina em uma concentração de aproxi-madamente 1 a 50 mg/l pode ser incluído no meio. Por exemplo, com o genedaol como o marcador seletivo, a D-serina ou a alanina do d em uma con-centração de aproximadamente 3 a 100 mg/l podem ser incluídos no meio.

As concentrações típicas para a seleção são 20 a 40 mg/l. Por exemplo, comos genes mutado dos ahas como o marcador seletivo, PURSUIT em umaconcentração de aproximadamente 100 a nM aproximadamente 1500 podeser incluído no meio. As concentrações típicas para a seleção são aproxi-madamente 500 a nM aproximadamente 1000.

Em uma modalidade preferida da invenção o marcador de sele-ção negativo é uma resistência conferindo dos genes dos ahas de encontroao nenhum-tipo herbicidas do sulfonilurea- e/ou do imidazoli. Em uma moda-lidade de ahas diferentes da invenção os mutantes podem ser combinadosem uma maneira permita múltiplas a transformações subseqüentes. Por e-xemplo, uma primeira transformação pode ser realizada empregando o genedo mutante ahasQ. do Xl 12. As linhagens do milho do mutante do Xl 12 com ogene ahas2 mutado demonstram para ser altamente resistentes ao imazeta-pir (PURSUIT®), mas sensível ao imazaquin (SCEPTER®) e suscetível aosherbicidas do sulfonilurea. O gene ahas2 do XI12 isolado da linhagem domilho do mutante acoplada com seleção no herbicida da imidazolinona foiusado com sucesso na técnica para a transformação do milho, do arroz e dotrigo (US 6.653.529). No estudo da estufa, as plantas de arroz transgênicocontendo o gene dos ahas Xl 12 exibiram a tolerância aos herbicidas da imi-dazolinona e da sulfonilurea em uma forma similar como a planta não trans-formada do mutante do Xl 12. O fenômeno similar foi observado também emuma experiência de campo conduzida com as plantas de milho transgênico.

A seleção para as construtores compreendendo um marcador de seleçãodos ahas do mutante do Xl 12 pode ser realizada por exemplo, com PURSU-IT®.

A segunda transformação na planta transgênica resultante como marcador de seleção dos ahas do mutante do Xl 12 pode ser realizada u-sando o gene do mutante dos ahas XA17. Os mutantes do milho XA17 de-monstram para ser altamente resistentes ao imazetapir e ao imazaquin(SCEPTER®), e ligeiramente tolerante aos herbicidas da sulfonilurea. En-quanto o gene do milho XA17 conferencia tolerância diferencial aos compos-tos diferentes da imidazolinona e aos herbicidas do Iurea da sulfonilurea,pode ser usado como um marcador selecionável na transformação da plantacom a escolha de usar o imazetapir, o imazaquin ou a sulfonilurea como oreagent seletivo.

O gene mutado dos ahas XA17 e seu promotor podem ser isola-dos da linhagem do mutante XA17. A seqüência foi isolada e o gene foi ca-racterizado (Bemnasconi 1995). A mutação para XA17 está na posição 1625do nucleotídeo do SEQ ID NO: 2. Uma única mudança baixa de G a T ocor-reu nesta posição que conduz a uma mudança do aminoácidos do triptofanao Ieucina na posição 542 do aminoácidos do SEQ ID NO: 3 (se referido pre-viamente como a mutação 542 no sistema nomeando anterior). Este muta-ção é equivalente à posição 574 do aminoácidos em Arabidopsis e se refe-redos agora como a mutação 574 nos ahas novos que nomeiam o sistemapara ser consistente para a mesma mutação na espécie diferente.

O mutante XA17 e seu fenótipo têm de ser descritos (US 4.761,373; US 5.304.732; Anderson & Gregeson 1989; Currie 1995; Newhouse1991). A seleção pode ser realizada com o SCEPTER composto do herbici-da ou da sulfonilurea para a seleção. Conseqüentemente que a combinaçãodos vários mutantes dos ahas permitem em troca o ajuntamento eficiente degenes provendo um mecanismo para a transformação em dobro.

Preferivelmente1 o gene dos ahas do mutante XA17 é descritopor uma seqüência do aminoácidos como o descrito pela SEQ ID NO: 3 ouuma seqüência que têm pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 80%,mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menoshomologia de 95% com a seqüência como descrita por SEQ ID NO: 3 e ten-do um resíduo do Ieucina na posição correspondendo à posição 542 do SEQID NO: 3 que podem conferenciar resistência de encontro aos herbicidas doimazetapir e do imazaquin.

Assim, uma outra modalidade da presente invenção se refere aum método para a transformação subseqüente de pelo menos dois constru-tores de DNA em uma planta compreendendo as etapas de:

a) uma primeira transformação com um primeiro construtor o ditoconstrutor compreendendo um primeiro gene mutado do marcador de sele-ção dos ahas, o dito primeiro gene conferindo resistência ao imazetapir massensível ao imazaquin, e selecionando as plantas resistentes ao imazetapir,e

b) uma segunde transformação com um segundo construtuor, odito construtor compreendendo um segundo gene mutado do marcador deseleção dos ahas, o dito segundo gene conferindo resistência tanto ao ima-zetapir quanto ao imazaquin, e selecionando as plantas resistentes ao ima-zaquin.

Preferivelmente, o dito primeiro gene é um gene mutante ahasdo Xl 12 e/ou em que o dito segundo gene é um gene mutante ahas XA17.

Mais preferivelmente, a dita planta é uma planta de Zea mays.

Uma outra modalidade da presente invenção se refere a da plan-ta de célula ou a planta compreendendo:

a) um primeiro gene mutado do marcador de seleção dos ahas,o dito primeiro gene conferindo resistência ao imazetapir mas sensível aoimazaquin, e

b) um segundo gene mutado do marcador de seleção dos ahas,ao dito segundo gene conferindo resistência tanto ao imazetapir e quantoimazaquin.

Preferivelmente, o dito primeiro gene é um gene mutante ahasdo Xl 12 e/ou em que o dito segundo gene é um gene mutante ahas XA17.

Mais preferivelmente, os primeiro e segundo genes ditos ditos são transge-nes. A planta é preferivelmente uma planta de Zea mays.

ii) Marcador de seleção positivo

Além disso, o marcador de seleção positivo pode ser emprega-do. Os genes semelhantes à isopenteniltransferase Agrobacterium tumefa-ciens (strain:P022; Genbank Acc.-No.: AB025109) pode - como uma enzimachave da biossínteses do citoquinina - facilitar a regeneração de plantastransformadas (por exemplo, pela seleção no meio citoquinina-livre). Os mé-todos correspondentes da seleção são descritos (Ebinuma 2000a, b). Osmarcadores de seleção positivos adicionais, que conferenciam uma vanta-gem do crescimento a uma planta transformada em comparação com nãotransformada, são descritos por exemplo, em EP-A 0 601 092. Os marcado-res de seleção do stimulation do crescimento podem incluir (mas não serálimitado) β-Glucuronidase (em combinação com por exemplo, um glucuroni-de do citoquinina), isomerase de mannose-6-fosfate (em combinação com omannose), UDP-galactose-4-epimerase (em combinação com por exemplo,a galactose), em que a isomerase de mannose-6-fosfate em combinaçãocom o mannose é especialmente preferida.

iii) Marcador de Contador-seleção

Os marcadores de Contador-seleção são especialmente ade-quados selecionar organismos com as seqüências eliminadas definidascompreendendo o dito marcador (Koprek 1999). Os exemplos para o marca-dor de seleção contrário compreendem os quinases do thymidin (TK), dea-minases da citosine (Gleave 1999; Por a era 1993; Stougaard 1993), proteí-nas do citochrom P450 (Koprek 1999), Iogenases de haloalcano deha (Na-ested 1999), produtos do gene do iaaH (Sundaresan 1995), codA do deami-nase do citosine (Schlaman & Hooykaas 1997), ou produtos do gene tms2(Fedoroff& Smith 1993).

4. Regeneração.

Após o período embriogênica da indução e da seleção do calo(como descrito acima) o restante do calo embriogênica amadurecido é trans-ferido para um meio que permite a conversão reservando média de plantastransgênicas. Preferivelmente tal meio não compreende auxinas tais como2,4- D em uma concentração que conduz ao desdiferenciação.

Em uma modalidade preferida tal meio pode compreender um oumais compostos selecionados do grupo que consiste em:

i) citoquininas como por exemplo o zeatin, preferivelmente emuma concentração de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/L,mais preferivelmente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5 mg/L,

ii) um uma quantidade eficaz de pelo menos um antibiótico queinibe ou suprime o crescimento das bactérias nascidas do solos (como defi-nido acima), e

iii) uma quantidade eficaz de um agente de seleção permitindo aseleção das células compreendendo o T-DNA transgênico.

0 calo embriogênica é incubado preferivelmente neste meio atéque os tiros estejam formados e depois transferidos então a um meio enrai-zando. Tal incubação pode fazer exame de 1 a 5, preferivelmente 2 a 3 se-manas.

Os tiros ou os brotos regenerados (isto é, tiros com raízes) sãotransferidos a Phytatray ou às caixas magentas contendo o meio enraizando(tal como o meio descreveu pela receita a 8) e incubate até que os brotosenraizados se tornem (geralmente 1 a 4 semanas, preferivelmente 2 sema-nas). As mudas enraizados são transferidos ao solo de Metromix e desen-volvidos até as plantas se tornarem maduras como descritos na técnica (vejaexemplos).

Em uma modalidade preferida da invenção um procedimentomelhorado é empregado e os brotos regenerados em placas transplantadasdiretamente a MetroMix na estufa, omitindo a etapa na caixa enraizando,desse modo o tempo e o trabalho conservando.

Se necessário, de as plantas transgênicas putativas são pulveri-zadas com o agente adequado da seleção (tal como uma PURSUIT® de 70a 100 g/ha), e crescido na estufa por outras duas semanas. As plantas Nãotransgênico devem desenvolver sintomas herbicidal ou morrer neste tempo.

As plantas que sobrevivens são transplantadas em vasos com solo de Me-troMix.

As plantas resultantes podem ser produzidas e hibridizadas naforma habitual. Duas ou mais gerações devem ser crescidas a fim assegu-rar-se de que a integração genômica seja estável e hereditária. Por exemplo,no estágio de floração, os arranjos de plantas transgênicas são cobertoscom os sacos de papel marrons para impedir o escape do pólen. A poliniza-ção é executada nas plantas transgênicas. É melhor fazer a autopolinizaçãonas plantas transgênicas. Se cobertura e florrescência não forem sincroniza-das, um tipo selvagem doador do pólen ou planta do receptor com mesmofundo genético que a planta T0 transgênica deve estar disponível para exe-cutar o polinização cruzada. As sementes T1 são colhidas, secas e armaze-nadas corretamente com etiqueta adequada no saco da semente. Após tercolhido as sementes Ti transgênico, as plantas TO incluindo o solo e o vasodevem ser cobertos por sacos de autoclave e autoclavados (cobertura dupla).

Outros aspectos importantes da invenção incluem a progenituradas plantas transgênicas preparadas pelos métodos descritos, assim comoas células derivadas de tal progenitura, e as sementes obtidas de tal proge-nitura.

5. Componentes genéticos preferidos e T-DNAs

PreferiveImente1O componente genético (por exemplo, o T-DNA)introduzido no genoma da planta - alvo que compreende pelo menos umcassete de uma expressão, que pode - por exemplo, - facilitar a expressãode marcadores de seleção, de genes do traço, de RNA do anti-sentido ou dofilamento duplo de RNA. Preferivelmente os cassetes da expressão compre-endem uma seqüência promotora funcional nas células da planta ligadasoperacionalmente a uma seqüência de ácidos nucléicos que - em cima daexpressão - conferencie um fenótipo vantajoso à planta transformada. Apessoa versada na técnica está ciente das numerosas seqüências que po-dem ser utilizadas neste contexto, por exemplo, para aumentar a qualidadedo alimento e da alimentação, produzir produtos químicos, produtos quími-cos finos ou farmacêuticos (por exemplo, vitaminas, óleos, carbohidratos;Dunwell 2000), conferindo resistência aos herbicidas, ou conferindo esterili-dade ao macho. Além disso, o desenvolvimento, o rendimento, e a resistên-cia contra os fatores de estresse abiótico e biótico (como por exemplo, fun-gos, vírus ou insetos) podem ser realçados. As propriedades vantajosas po-dem ser conferenciadas sobreexpressando proteínas ou diminuindo a ex-pressão de proteínas endógenas, por exemplo, expressando por um anti-sentido correspondente (Sheehy 1988; US 4.801.340; Mol 1990) ou RNA deduplo filamento (Matzke 2000; Fogo 1998; Waterhouse 1998; WO 99/32619;WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035;WO 00/63364).

Para a expressão nas plantas, os promotores específicos daplanta são preferidos. O termo "promotor específico da planta" é compreen-dido como significando, em princípio, todo o promotor que for capaz de go-vernar a expressão dos genes, em genes estranhos particulares, nas plantasou nas partes da planta, nas células da planta, nos tecidos da planta ou nasculturas da planta. Neste contexto, a expressão pode ser, por exemplo,constitutivo, indutível ou desenvolvimento-dependente. Os seguintes sãopreferidos:

a) Promotores constitutivos

Os promotores "constitutivo" se referem àqueles promotores queasseguram a expressão em um grande número, preferivelmente tudo, teci-dos sobre um período substancial do desenvolvimento da planta, preferivel-mente em todas as vezes durante o desenvolvimento da planta. Um promo-tor da planta ou o promotor que origina-se de um vírus da planta são especi-al e preferivelmente usado. O promotor do transcript 35S de CaMV (vírus domosaico da couve-flor) (Franck 1980; Odell 1985; Shewmaker 1985; Gardner1986) ou o promotor de 19S CaMV (US 5.352.605; WO 84/02913; Benfey1989) é especialmente preferido. Um outro promotor constitutivo adequado éo promotor da actina do arroz (McEIroy 1990), promotor pequeno da subuni-dade de Rubisco (SSU) (US 4.962.028), promotor do Iegumin B (ace deGenBank. N9. X03677), o promotor da sintase do nopalin do Agrobacterium,promotor duplo do TR, promotor do Agrobacterium, promotor de OCS (syn-thase do octopina) do ubiquitin (Holtorf 1995), o ubiquitin 1 promotor (Chris-tensen 1989, 1992; Bruce 1989), promotor de Smas, promotor de dehidro-genase do álcool cinamílico (US 5.683.439), promotores das subundadesvacuolares do aTPase, promotor do pEMU (último 1991); o promotor deMAS (Velten 1984) e promotor da histona do milho H3 (Lepetit 1992; Ata-nassova 1992), promotor do gene nitrilase-1 de Arabidopsis Thaliana (ace deGenBank. Ng.: U38846, nucleotídeos 3862 a 5325 ou mais 5342) ou promo-tor de uma proteína prolina rica do trigo (WO 91/13991), e promotores maisadicionais da expressão constitutiva dos genes nas plantas, especialmenteno monocot ou plantas Gramineae são conhecidas para o trabalhador ver-sado. O promotor doa ubiquitina do milho é preferido particularmente no trigoe na cevada.

b) os promotores Tecido-específicos ou tecido-preferidos.

Além disso preferidos são os promotores com especificados pa-ra sementes, como, por exemplo, o promotor do phaseolin (US 5.504.200;Bustos 1989, Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985), promotor do gene daalbumina 2S (Joseffson 1987), promotor da Iegumina (Shirsat 1989), promo-tor de USP (proteína desconhecida da semente) (Baumlein 1991a), promotordo gene do napin (US 5.608.152; Stalberg 1996), o promotor das proteínasobrigatórias da sacarose (WO 00/26388) ou o promotor do Iegumin B4(LeB4; Baumlein 1991 b, 1992), o promotor do oleosin de Arabidopsis (WO98/45461), e o promotor do brassica Bce4 (WO 91/13980). Os promotoresque além disso são preferidos são aqueles que permitem uma expressãoespecífica da semente nos monocotiledôneas tais como o milho, a cevada, otrigo, o centeio, o arroz e o gosto. O promotor do gene Ipt2 ou Iptl (WO95/15389, WO 95/23230) ou os pormotores descritos em WO 99/16890(promotores do gene de hordeína, do gene de glutelina, do gene de orizina,do gene de prolamina, do gene de gliadina, do gene de glutelina, do gene dezeína, do gene de casirina ou do gene de secalina) podem vantajosamenteser empregados. Mais preferidos ainda é um promotor específico da folha einduzido pela luz tal como aquele do cab ou do rubisco (Simpson 1985; Tim-ko 1985); um promotor específico da antera tal como que de LAT52 (Twell1989b); um promotor pólen-específico tal como isso de Zml3 (Guerrero1993); e um promotor preferido do microsporo tal como isso do apg (Twell 1993).

c) Promotores quimicamente indutíveis.

Os cassetes da expressão também podem conter um promotorquimicamente indutível (artigo de revisão: Gatz 1997), por meio de que aexpressão do gene exógeno na planta pode ser controlada em um pontoparticular a tempo. Tais promotores como, por exemplo, o promotor PRP1(divisão 1993), um promotor indutível do ácido salicílico (WO 95/19443), umpromotor indutível da benzenossulfonamida (EP O 388 186), um promotorindutível da tetraciclina (Gatz 1991, 1992), um promotor induzível de ácidoabscísico EP O 335 528) ou um promotor induzível do etanol-cicloexanona(WO 93/21334) podem ser usados do mesmo modo. Também adequado é opromotor do gene de Il do isoform do transferase da glutationa-S (GST-I I-27), que pode ser ativado por safeners exogenamente aplicados tais como,por exemplo, N, N-diallil-2, 2-dicloroacetamida (WO 93/01294) e que é ope-rável em um grande número tecidos de monocotiledôneas e de dicots. Pro-motores indutíveis exemplares que podem ser utilizados na invenção instan-tânea incluem o sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett 1993); ou opromotor In2 do milho que responde aos safeners do herbicida do benze-nossulfonamida (Hershey 1991; Gatz 1994). Um promotor que responda aum agente de indução a que as plantas não respondem normalmente podeser utilizado. Um promotor indutível exemplar é o promotor indutível de umgene esteróide do hormônio, a atividade do transcriptional de que é induzidapor um hormônio do glucocorticoesteróide (Schena 1991).

São particularmente preferidos os promotores constitutivos. A-lém disso, promotores mais adicionais podem ser ligados operacionalmenteà seqüência de ácidos nucléicos a ser expressada, que os promotores fazempossível a expressão em tecidos de planta mais adicionais ou em outros or-ganismos, tais como, por exemplo, as bactérias de E.coli. Os promotoresadequados da planta são, no princípio, todos os promotores descritos acima.

O componente genético e/ou o cassete de expressão podemcompreender um genético adicional seqüências de controle além a um pro-motor. O termo "seqüências de controle genético" deve ser compreendido nosentido amplo e se refere a todas aquelas seqüências que têm um efeito nomaterialização ou a função do cassete de expressão de acordo com a inven-ção. Por exemplo, as seqüências de controle genético modificam A transcri-ção e translação em organismos procarióticos ou eucarioticos. Preferivel-mente, os cassetes da expressão de acordo com a invenção abrangem umpromotor funcional nas plantas 5'-a montante da seqüência de ácidos nucléi-cos na pergunta a ser expressada recombinantemente, e a jusante de 3'uma seqüência do terminal como a seqüência de controle genético adicionale, se adequado, elementos reguladores habituais mais adicionais, em cadacaso operacionalmente ligado à seqüência de ácidos nucléicos a ser expres-sada recombinantemente.

As seqüências de controle genético além disso abrangem tam-bém as regiões 5' não traduzidas, os íntrons ou o região 3' de não codifica-ção dos genes, como, por exemplo, o íntron actin-1, ou os íntrons 1, 2 e 6 deAdhl-S (referência geral: The maise kandbook, capítulo 116, Freeling eWalbot, Eds., Springer, New York (1994)). Demonstrou-se que podem jogarum papel significativo no regulamento da expressão do gene. Assim, de-monstrou-se que as seqüências 5' não traduzidas podem realçar a expres-são transiente de genes heterólogo. Os exemplos dos melhoradores da tra-dução que podem ser mencionados são a seqüência do líder do vírus 5' domosaico do tabaco (GaIMe 1987) e o gosto. Além disso, podem promover aespecificidade do tecido (Rouster 1998).

O cassete de expressão pode vantajosamente compreenderuma ou mais seqüência do intensificador ligada operacionalmente ao promo-tor, que fazem possível uma expressão recombinante aumentada da se-qüência de ácidos nucléicos. As seqüências vantajosas adicionais, tais comoelementos ou terminais reguladores mais adicionais, também podem ser in-troduzidas no fim 3' das seqüências do ácido nucléico a ser expressadasrecombinantemente. Os sinais que são por mais adequados como seqüên-cias de controle são sinais de poliadenilação da planta, preferivelmente a -queles de poliadenilação correspondendo essencialmente à aos sinais depoliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, em particular o ter-minal de OCS (sinthase de octopina) e o terminal dos no. (sinthase de nopa-lina).

As seqüências de controle devem além disso ser compreendidascomo aquelas que permitem remoção das seqüências introduzidas do ge-noma . Métodos baseados no cre/lox (Sauer 1998; Odell 1990; Dale 1991),FLP/FRT (Lysnik 1993), ou sistema de Ac/Ds (Wader 1987; US 5.225.341;Baker 1987; Lawson 1994) permite uma - se tecido-específico e/ou indutíveladequado - remoção de uma seqüência específica de DNA do genoma doorganismo do hospedeiro. As seqüências de controle podem, neste, signifi-car contexto as seqüências de flanqueamento específicas (por exemplo, se-qüências do lox), que permitem mais tarde a remoção (por exemplo, pormeio do Cre recombinase).

O cassete genético do componente e/ou da expressão da inven-ção pode compreender elementos funcionais mais adicionais. O elementofuncional do termo deve ser compreendido no sentido amplo e se refere atodos aqueles elementos que têm um efeito na geração, amplificação ou fun-ção do componente genético, cassetes da expressão ou organismos recom-binante de acordo com a invenção. Os elementos funcionais podem incluirpor exemplo, (mas não será limitado):

1) marcadores de seleção como descritos acima.

2) genes repórter

Os genes repórter codificam proteínas prontamente quantificá-veis e, através de sua cor ou atividade de enzima, fazem possível uma ava-liação da eficácia de transformação, o local da expressão ou o tempo da ex-pressão. São especialmente preferidas neste contexto as proteínas repórte-res codificando genes (Schenborn 1999) como a proteína fluorescente verde(GFP) (Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; WO 97/41228;Chui 1996; Lefelde Lef- 1997), transferase do chloramphenicol, uma Iucifera-se (Ow 1986; Millar 1992), o gene do aequorin (Prasher 1985)β-galactosidase, gene do sítio de R (que codifica uma proteína que regule aprodução de pigmentos anticianina (coloração vermelha) no tecido de plantae faz assim possível a análise direta da atividade do promotor sem adição desubstâncias auxiliares mais adicionais ou de substratos cromogênicos (Del-Iaporta 1988; Ludwig 1990), com o β-glucuronidase (GUS) que está sendobem-preferido (Jefferson 1987a, b). A expressão do β-glucuronidase (GUS)é detectada por uma cor azul na incubação do tecido com ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-glucurônico, expressão bacteriana da Iuciferase (LUX) édetectada pela emissão clara; a expressão da Iuciferase do vagalume (LUC)é detectada pela emissão clara após a incubação com luciferina; e a expres-são da galactosidase está detectada por uma cor azul brilhante depois que otecido é manchado com o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosida.Os genes repórter também podem ser usados como marcadores capazes depontuar como alternativas aos marcadores antibióticos da resistência. Taismarcadores são usados para detectar a presença ou medir o nível da ex-pressão do gene transferido. O uso de marcadores scorable nas plantas pa-ra identificar ou etiquetar geneticamente modificou bem os trabalhos dascélulas somente quando a eficiência da modificação celular é elevada.

3) Origens da replicação, que asseguram a amplificação doscassetes ou dos vetores da expressão de acordo com a invenção dentro, porexemplo, E. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origemda replicação de DNA), o ori pBR322 ou o ori de P15A (Maniatis 1989).

4) Elementos que são necessários para a transformação daplanta, tal como, por exemplo, a fronteira direita ou esquerda do T-DNA ouda região vir.

Todos as composições e métodos descritos e reivindicados aquipodem ser feitos e executados sem experimentação imprópria na luz da des-crição atual. Quando as composições e os métodos da presente invençãoforem descritos nos termos de modalidades preferidas, será aparente àque-les versados na técnica que as variações podem ser aplicadas à composi-ção, métodos e nas etapas ou na seqüência das etapas do método descritoaqui sem partir do conceito, do espírito e do escopo da invenção. Mais espe-cificamente, será aparente que determinados agentes que são química efisiologicamente relatados podem ser substituído o para agentes descritosnisto quando o mesmo ou similares resultados forem conseguidos. Todostais substitutos e modificações similares aparentes àqueles versados na téc-nica são julgados estar dentro do espírito, do escopo e do conceito da inven-ção como definidos pelas reivindicações anexadas. Todas as publicações,patentes, e pedidos de patente citados aqui são incorporados por este meiopela referência para todas as finalidades.Seqüências.

1. SEQ ID NO: 1 vetor binário pPBS_MM232

2. SEQ ID NO: 2 seqüência de codificação de ácido nucléico pa-ra o mutante XA17 do marcador de seleção dos ahas.

3. SEQ ID NO: 3 coding da seqüência do aminoácidos para omutante XA17 do marcador de seleção dos ahas.

Depósito sob o Tratado de Budapest.

Um depósito foi feito sob o Tratado de Budapest para o seguintematerial:

1. A semente de Zea mays alinha BPS553; Designação de De-pósito de Patente PTA-6170.

2. Semente da linhagem BPS631 de Zea mays\ DesignaçãoPTA-6171 Do Depósito Da Patente.

O depósito foi feito com a Coleção de Cultivo do Tipo Americano(ATCC), Manassas, VA 20110-2209 EUA agosto em 26, 2004.

Exemplos.

Métodos Gerais:

A menos que indicados de outra maneira, os produtos químicose os reagentes nos exemplos foram obtidos de Sigma Produto químicoCompanhia (St. Louis, MO). Os materiais para meios de cultura celular foramobtidos de Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) ou de DIFCO (Detroit, Ml). As eta-pas do clonagem realizadas para as finalidades da presente invenção, como,por exemplo, transformação- de células do E. coli, bactérias crescentes, mul-tiplicando fagos e análise da seqüência de DNA recombinante, são realiza-das como descritas por Sambrook (1989). Os seguintes exemplos são ofere-cidos por a ilustração e não como forma de limitação.

Receitas de Meios.

A solução conservada em estoque de Imazetapir das receitasdos meios (PURSUIT) (1 milímetro) é preparada dissolvendo magnésio 28,9mgda PURSUIT em 100 ml de DMSO (sigma), e armazenada em 4°C noescuro. O estoque de Acetosiringone é preparado como a solução de 200milímetros em DMSO e armazenado em -20°C.A-1. Meios de Milho YP (para crescimento do agrobacterium).

<table>table see original document page 52</column></row><table>

O ajuste do ρH a 6.8 com NaOH de 1 M. Para o meio solido adi-cione o ágar de 3 g (ciência do EM) por frasco de 250 ml. A alíquota de 100ml de meio para cada frasco de 250 ml, autoclave, deixar esfriar e solidificarem frascos. Para a preparação da placa, o meio no frasco é derretido no for-no de microonda, e o frasco é colocado no banho da água e resfriado até55°C. Quando de resfriado, adicione a espectinomicina (sigma S-4014) auma concentração final da cavidade da mistura de 50 mg/l e derrame as placas.

A-2. Meio do Milho LS-inf

<table>table see original document page 52</column></row><table>

O adjuste de pH a 5.2 com 1 M HCI, filtro interligado, dispensaem 100 mL de alíquotas, adicione o ringone do acetosy- (100 μΜ) à direitado meio antes de usar para a infecção do Agrobacterium 50 μΙ_ para 100 mLde meio - estoque de 200 milímetros).

A-3. Meio do Milho 1.5LSAs para o co-cultivo.

<table>table see original document page 52</column></row><table>Ajuste meios do pH a 5.8 com NaOH de 1 M. Pese o ágar Sigmapurificado de 4 g por frasco (8g/L) e dispense meios de 500 ml_ por frasco,autoclave. Quando resfriado adicione o agN03 (estoque em 15 milímetros) auma concentração final de 15 μΜ e de L-cisteína (estoque em 150 mg/ml) auma concentração final 300 mg/l. Derrame em placas de 100 χ 20 milímetrosPetri. O Acetosiringone contendo meio deve ser usado recentemente semarmazenamento a longo prazo.

A-4. Meio de Recuperação do Milho -1: Meio IM

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Mega aproximadamente % do volume total de H2O dd desejado, adicione asacarose e os sais, e dissolva sob agitar. Depois que todos os ingredientessão dissolvidos, ajuste ao volume final com ddH20 e a pH 5.8 KOH usando-se 1 Μ. A alíquota 500 mis em um frasco de 1 litro, adiciona o gelrite 0,9g acada frasco do líquido, autoclave por 20 minutos (ciclo líquido). Depois decolocar frascos de autoclavagem em um banho de água para esfriar para55°C e adicionar o vitaminas MS (a uma concentração final de 1.0 mg/ml),nitrato de prata (a uma concentração final de15 μΜ) e Timentin (à concen-tração final de 150 mg/l)]. Derrame meios em placas de 100 χ 20 milímetrospetri e permita que os meios remanesçam na capa laminar durante a noitepara impedir a condensação adicional.

A-5. Meio de Recuperação do Milho - 2: Meio do MS

<table>table see original document page 53</column></row><table>Ajuste do meios pH a 5.8 com NaOH de 1 M. Adicione o ágarsigma purificado por frasco (8g/L). Dispense meios de 500 mL por o frasco,autoclave. Quando resfriado adicione o nitrato de prata (a uma concentraçãofinal do 15μΜ) e o Timentin (a uma concentração final de 150 mg/l). Estemeio de recuperação é especialmente adequado para BPS553x(HillAxA188)ou BPS631 x(HillAxA188) genótipos.

A-6. Meios de Seleção.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Ajuste do meios pH dos a 5.8 com NaOH de 1 M. Adicione o á-gar sigma purificado (8 g/L), dispense meios de 500 mL por frasco de 1L,autoclave, quando resfriado adicionem:

<table>table see original document page 54</column></row><table>

A-7. Meios da Regeneração do Milho

<table>table see original document page 54</column></row><table>Ajuste meios do pH a 5.8 com NaOH de 1 M. Pese o ágar sigmapurificado de 4 g por frasco (8g/L). Dispense meios de 500 ml_ por frasco,autoclave e deixe-os solidificarem em frascos. Para uso, fundir o meio emmicroondas, quando resfriado, adicionar

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Verter em placas de 100 χ 20 milímetros Petri

A-8. Meios de Enraizamento do milho (enraizar)

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Ajuste meios pH a pH 5.8 com NaOH de 1 M, adicione 1 g Gelrite por frasco(2g/L), dispense meios de 500 mL por frasco, autoclave, derrame-os em Ph-yatrays descartável.

<table>table see original document page 55</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 56</column></row><table>continuação

<table>table see original document page 57</column></row><table>

<table>table see original document page 57</column></row><table>Sumário do protocolo básico

Este protocolo trabalha para todas as linhagens de Zea mays(Incluindo linhagens híbridas, e linhagens de nascimento natural).

<table>table see original document page 58</column></row><table>Exemplo 1:

Preparação de plantas fornecedoras híbridas.

As seguintes linhagens de nascimento natural de Zea mays sãoempregadas para as seguintes etapas:

1. HilIA: genitor A do Hill; depósito No.:T0940A, Maize Geneticsand Genomics Datatabase), disponível da Maize Geneties Cooperation -Stoek Center USDA/ARS & colheita Sci/UIUC, S-123 Turner Hall, S. 1102Goodwin Avenue, Urbana IL EUA 61801- 4798; http://www.milhoqdb.org/stock.php.

2. A188: Agronomy & Plant Genetics, 411 Borlaug Hall, Univ ofMinnesota, de saint Paul 55108.

3. BPS533 (Atcc Patent depont Designation PTA - 6170).

4.BPS631 (Atcc Patent depont Designation PTA - 6171).

As sementes F1 do genótipo HiIIAxAI 88 do milho são produzi-das cruzando HiIIA (pai fêmea) com linha de nascimento natural A188 (ma-cho), e plantadas na estufa como o doador do pólen. As sementes F2 de(HillAxA188) são produzidas pelo autopolinização (HillAxA188) das plantasF1 na estufa ou no campo, e plantadas na estufa como o doador do pólen.

Os embriões híbridos imaturos de BPS553x(HillAxA188) ou deBPS631x(HillAxA188) são produzidos usando a linhagem de nascimentonatural BPS553 (Atcc Patent depont Designation PTA-6170 do ATCC) ouBPS631 (designação PTA-6171 do depósito da patente do ATCC) como osgenitores fêmeas, e F1 ou (HillAxA188) as plantas F2 como o genitor machona estufa.

As sementes são semeadas em uns vasos contendo Metromix.

Uma vez que as sementes se tornam germinadas e enraizadas, uma mu-da/vaso está mantido para a produção de embrião imaturos, e o segundomuda é rejeitada; as alternativamente sementes são iniciadas em vasos de10,2 χ 10,2 cm (4x4 polegada), e as sementes transplantadas aos vasos25,4 cm (10 inch) duas semanas após ter semeado as sementes. Aproxima-damente uma colher de Osmocote 14-14-14 (um tipo de fertilizante de Iibe-raçãoo lento) é adicionada à superfície de cada vaso. A temperatura na estu-fa é mantida durante a noitea 24°C e durante o dia a 28°C. Molhar é feitoautomaticamente, mas suplementado diariamente manualmente como ne-cessitado. Duas vezes uma semana, as plantas são molhadas com uma dilu-ição de 1:15 de fertilizante Peters 20-20-20.

1.1- Preparação de plantas fornecedoras de nascimento natural.

As sementes das linhagens de nascimento natural BPS553 ouBPS631 são semeadas qualquer um diretamente nos vasos de 10,2 cm (4inch), e as mudas transplantados aos vasos de 25,4 cm (10 inch) duas se-manas após ter semeado as sementes. Alternativamente, sementes são se-meados diretamente nos vasos de 25,4 cm (10 inch). A própria polinizaçãoou por família é realizada. As circunstâncias crescentes são as mesmas queacima para a linhagem híbridas.

1.2 - Polinização Manual.

Cada planta de milho é monitorada para tiros da espiga, e quan-do aparecidos, são cobertos com um saco branco pequeno do tiro da espiga(Lawson). Uma vez que os tiros da espiga começaram a produzir sedas, assedas foram cortadas e cobertas novamente com o saco do tiro da espiga. Oarranjo da mesma planta coberta com um saco de papel marrom (que forne-ce que o arranjo incorporou a florescência). A manhã seguinte, o arranjo éagitado para remover o pólen e as anteras no saco. Então o saco é removidoe o pólen é agitado sobre os fios do tiro da espiga. A polinização é feita entre8 e 10 a.m. na manhã. Fixe o saco de papel marrom sobre o tiro da espiga eem torno do caule do milho. Após a polinização, o arranjo é removido daplanta para reduzir o pólen (alergenos a muitos povos) na estufa. Para asse-gurar-se polinizações sincronizadas para os mesmos genótipos, e portantopara evitar a colheita/tranformação no fim-de-semana colheita/transfor-mação, os tiros da espiga daquelas plantas de floração adiantadas são cor-tados para trás outra vez. Um grupo das plantas, por exemplo. 5 a 10 sãoentão plantas polinizada no mesmo dia. Entretanto, esta prática é dependen-te da qualidade/quantidade dos polens em uma planta, o Sib-polinização énecessário para as linhagens de nascimento natural. Por exemplo, tantoBPS553 ou BPS631 podem ser polinizado por si próprios ou pela família en-tre o mesmo genótipo).

1.3 Colheita e Pré-tratamento das Espigas.

As espigas das plantas de milho (a primeira espiga que sai é amelhor) são colhidas 8 a 14 (a média 10) dias após a polinização (DAP). Osincronismo da colheita varia dependendo das condições do crescimento eda variedade do milho. O tamanho de embriões imaturos é uma indicaçãoboa de seu estágio do desenvolvimento. O comprimento ótimo de embriõesimaturos para a transformação é aproximadamente 1 a 1,5 milímetro, inclu-indo o comprimento do scutellum. O embrião deve ser translúcido, nao opa-co. Se a espiga estiver pronta, mas não puder ser usada para tranformaçãoao que dia, a espiga pode ser colhida, posto no saco da polinização, e ar-mazenado em um saco plástico no refrigerador 4°C por 1 a 3 dias.)

2. Preparação do Agrobacterium.

O estoque do glycerol do Agrobacterium é armazenado em -80°C. Os inóculumes do Agrobacterium são listados do estoque do glicerolem conter do meio do ágar do YP (A-1) adequado tetraciclina dos antibióti-cos (por exemplo, spectinomicina de 50 mg/l e/ou 10 mg/l). As culturas bac-terianas são incubadas no escuro em 28°C por 1 a 3 dias, ou até que umacolônias seja visível. A placa obtida pode ser armazenada em 4°C para 1mês e ser usada como uma placa mestra para listar para fora das célulasfrescas. As células frescas devem ser listadas no ágar do YP com o antibió-tico adequado de uma única colônia na placa mestra, pelo menos 2 dias adi-antado de transformação. Estas culturas bacterianas podem ser incubada noescuro em 28°C por 1 a 3 dias.

O estoque alternativamente congelado do Agrobacterium podeser preparado: Liste células do Agrobacterium de estoque frozen a uma pla-ca B-YP-002 (spectinomicina de YP+50 mg/l + tetracycline de 10 mg/l).Cresça em 28°C por 2 a 3 dias. Exceto ele, como a placa e a loja mestrasem 4C por até um mês. Da placa mestra, liste um laço das células agro a umfranco contendo 25 ml o meio líquido I B-YP-OOO suplementadas com ospectinomicina de 50 mg/l + tetraciclina de 10 mg/l. Cresça em um agitadorajustado em 300 RPM e 28°C 2 a 3 dias. Prepare estoque agro congeladomisturando 1 porção da cultura agro acima com a 1 porção do glicerol estérilde 30%. Turbilhonar a misturar bem e dispensar 10 μΙ_ o Agrobacterium/ gli-cerol mistura a um tubo Eppendorf de 50μΙ. Armazene a -80°C.

Um a dois laços (2 milímetros no diâmetro) da cultura bacterianasão suspendidos completamente em 1,0 a 1,8 meio do ml LS-inf suplemen-tada com o Acetosiringone de 100?M. Isto rende uma suspensão bacterianacom densidade ótica aproximada (OD6OO) entre 0,5 a 2,0, Turbilhonada por0,5 a 3 horas. Turbilhonamento é executado fixando (por exemplo, com fila-mento adesivo) o tubo de microfuga horizontalmente (em vez de vertical-mente) na plataforma de um turbilhonador para assegurar células melhoresdo Agrobacterium da dispersão na solução. Mistura 100 μΙ da suspensãocelular do Agrobacterium com o 900 μΙ da solução LS-inf em um curvet, emedida OD6OO. Ajusta o OD da solução original do Agrobacterium a 0,6 a2.0 com (com o Acetosiringone de 100 μΜ) solução LS-Inf-Inf. A suspensãodo Agrobaeterium é turbilhonada preferivelmente no LS-inf + meios do Ace-tosiringone para pelo menos 0,5 a 3 horas antes da infecção. Prepare estasuspensão antes de começar colhendo embriões.

Alternativamente as suspensões do Agrobaeterium para a trans-formação do milho podem ser preparedas como se segue: Dois dias antesque a transformação, do estoque de -80°C, agrobaeteria da raia de um tuboa uma placa contendo B-YP-002 (spectinomicina solidificada de YP+50 mg/l+ tetraciclina de 10 mg/l) e cresça em 28°C no escuro por dois dias. Aproxi-madamente 1 a 4 horas antes de transformação, colocar uma colher de célu-las bacterianas 1,5 ao meio do ml M-LS-002 (LSinf + acetosyrigone de200μΜ) em um tubo de 2ml Eppendorf. Turbilhonar o tubo para dispensar ascélulas bactérias à solução e para agitar o tubo em IOOOrpm por 1 a 4 horas.

O OD6OO deve estar na escala de 0,6 a 1,0 ou sobre 108cfu/ml _.

Para o propósito dos exemplos tumefaeiens do Agrobaeteriumcepa LBA4404 ou a cepa desarmada K599 do Agrobaeterium (NCPPB2659)) transformados com o plasmídio binário pBPSMM232 do vetor foramempregados pBPS_MM232 contêm o gene dos ahas (como o marcador deseleção) e o gene do repórter de gus.Exemplo 3:

isolamento de embriões imaturos.

3.1 Esterilização da Superfície.

As espigas são colhidas da estufa de 8 a 12 dias após a polini-zação. Toda a casca e fios são removidos e as espigas são transportadas nosaco marrom da polinização para trás do laboratório da cultura do tecido. Aespiga de milho é movida na capa estéril. Um par grande do forceps é intro-duzido na extremidade basal da espiga e os forceps são usados como umpunho segurando o espiga de milho. Opcionalmente, quando insec-tos/fungus estão presentes na espiga, a espiga deve primeiramente esterili-zada a 20% com alvejante comercial por 10 minutos (solução de alternati-vamente 30% Clorox por 15 minutos), e então ser enxaguada com água es-terilizada três vezes. Ao prender o espiga de milho pelo forceps, a espiga épulverizada completamente com 70% etanol e enxaguada, então, com d-dH20 estéril.

3.2. Preparação e Inoculação do Agrobacterium de embriões imaturos.

3.2.1 Método 1: O método modificado do "tubo".

O espiga de milho com o punho do forceps é colocado em uma placa grandede Petri. Um escopo dessicado pode ser usado. A porção superior (2/3's)das sementes é cortada fora e removida com um escalpelo #10 (para a con-sideração de segurança, o corte nas sementes é feito cortando afastado desua mão que prende o punho do forceps). Os embriões imaturos são entãoexcisados então das sementes no espiga de milho com um escalpelo (# es-calpelo 11): a lâmina do escalpelo é introduzida em um ângulo em uma ex-tremidade da semente. O endosperm é levantado para cima; o embrião estáencontrando-se debaixo do endosperm. Os embriões excisados são coleta-dos em um tubo do microfuga (ou em uma placa pequena de Petri) contendoaproximadamente 1,5 a 1,8 ml da suspensão do Agrobacterium no acetos-yrigone LS-inf contendo méio líquido (veja acima; meio A-2). Cada tubo podeconter até 100 embriões. O tubo contendo embriões é misturado a mão di-versas vezes, e deixado o tubo/placa estar na temperatura ambiente (20 a25°C) por 30 minutos. Remova a suspensão bacteriana adicional do tu-bo/placa com uma pipeta. Transfira os embriões e as bactérias imaturos noresíduo LS-inf médio a uma placa de Petri contendo o meio do ágar do co-cultivo. Transfira todos os embriões imaturos que permanecerem no tubo domicrofuga por um alça estéril. Remova a suspensão bacteriana adicionalcom uma pipeta. Uma pequena quantidade de líquido é deixada preferivel-mente na placa para evitar de secar para fora dos embriões quando semea-dos em placa. Coloque os embriões imaturos no meio de co-cultivo com olado liso para baixo (scutellum para cima). Não encaixe os embriões no mei-o. Deixe a tampa da placa aberta na capa estéril por aproximadamente 15minutos para evaporar a umidade adicional que cobre embriões imaturos.Sele as placas de petri com o filamento adesivo tipo micorpore da 3M. Apro-ximadamente 100 embriões podem ser colocados em uma placa de Petripara o co-cultivo. Sele a placa e o envoltório com uma folha da folha de alu-mínio. Incube as placas no escuro em 22°C por 2 a 3 dias. Toma-se de 3 a 5embriões imaturos para mancha GUS se um constructo de GUS for usadopara avaliar a expressão transiente de GUS.

3.2.2 Method-2: O método da "gota".

Os embriões imaturos excisados são postos diretamente sobre omeio de co-cultivo (meio A-3) com o lado liso para baixo (scutellum para ci-ma). Gada placa (placa de 20x100 milímetro) pode reter até 100 embriõesimaturos. Ponha μΙ 5 da suspensão celular do Agrobacterium diluída paracada embrião imaturo com uma pipeta de repetição. Remova a umidade adi-cional que cobre embriões imaturos deixando a tampa da placa aberta nacapa por aproximadamente 15 minutos. Sele a placa com o filamento adesi-vo e o envoltório tipo micorpore da 3M com folha de alumínio. Incube a placano escuro em 22°C por 2 a 3 dias. Faça exame de 3-5 embriões imaturospara GUS que mancha se um constructo de GUS for usado avaliar a expres-são transiente de GUS.Comparação da tabela 1 de dois métodos do inoculation: "deixecair" e métodos modificados do "tubo" em dois genótipos do milho.

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Demonstrou-se (veja resultados na tabela 2 abaixo) que a pre-sença de um composto do tiol tal como o L-cisteína no meio de co-cultivoque aumenta significativamente a eficiência de transformação.

O efeito da tabela 2 de L-cisteína em eficiências de transforma-ção no BPS553 de nascimento natural e no híbrido BPS553x(Hil IAxAI 88)alinha. As experiências de transformação foram executadas com a espiga demilho adulta dividada (que divide uma espiga de milho em dois tratamentos:com ou sem adicionar o projeto experimental de L-cisteína), e usar o métododo inoculação da "gota" descrito nisto. Cada um experimenta compreendidode uma média de 50-100 embriões imaturos.

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TE = eficiência de transformação; * Estatisticamente significativo no nívelconfiável de 95% do tratamento sem adicionar o L-cisteína no meio de co-cultivo.

3.2.3 Aplicação do papel de filtro durante o co-cultivo.

Os embriões imaturos são excisados das sementes na espiga demilho com um escalpelo (# escalpelo 11) como descritos acima, e coletadosem um tubo do microfuga (ou em uma placa pequena de Petri) contendoaproximadamente 1,5 a 1,8 ml da suspensão do Agrobacterium no acetos-yrigone LS-inf contendo médio líquido (veja acima; meio A-2). Cada tubopode conter até 100 embriões. O tubo contendo embriões misturado á mãodiversas vezes, e deixado o tubo/placa estar na temperatura de quarto (20 a25°C) por 30 minutos. A suspensão bacteriana adicional é removida do tu-bo/placa com uma pipeta, e os embriões imaturos no meio dos LS-inf do re-síduo são transferidos à superfície de uma camada de papel de filtro que écolocado no meio de co-cultivo do ágar. Os embriões imaturos que perma-necem no tubo do microfuga são transferidos ao papel de filtro no meio deco-cultivo por um alça estéril. A suspensão bacteriana adicional na placa doco-cultivo foi removida com uma pipeta. Uma quantidade pequena de líquidoé deixada preferivelmente na placa para evitar de secar para fora dos embri-ões ao chapear. Coloque os embriões imaturos no meio de co-cultivo com olado liso para baixo (scutellum para cima). Deixe a tampa da placa aberta nacapa estéril por aproximadamente 15 minutos para evaporar a umidade adi-cional que cobre embriões imaturos. Sele os discos de petri com o filamentotipo micorpore da 3M. Aproximadamente 100 embriões podem ser colocadosem uma placa de Petri para o co-cultivo. Sele a placa e o envoltório comuma folha da folha de alumínio. Incube as placas no escuro em 22°C por 2 a3 dias. Toma-se de 3 a 5 embriões imaturos para mancha GUS se um cons-tructo de GUS for usado para avaliar a expressão transiente de GUS.

Efeito da tabela 3 da aplicação do papel de filtro (FP) na trans-formação na linhagem BPS553 de nascimento natural. Uma camada de pa-pel de filtro foi posta sobre a superfície do meio ágar do co-cultivo contendoL-cisteína de 150 mg/l e o AgN03 15 μΜ para o tratamento do papel de fil-tro. O tratamento do papel do não-filtrado do controle foi conduzido exata-mente com o mesmo para o tratamento do papel de filtro, exceto que o papelde filtro foi omitido. Após a inoculação com o método modificado da inocula-ção do "tubo", os embriões imaturos IEs foram colocados no papel de filtro.

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A condição do co-cultivo foi testada também sob a circunstânciamédia ágar-livre adicionando a solução média líquida do co-cultivo às cama-das múltiplas de papel de filtro em uma placa. As vantagens de usar-se á-gar-livres, sustentação do papel de filtro somente incluem, mas não limitam-se (1) ao tempo médio reduzido da preparação, e (2) à flexibilidade aumen-tada de alterar os componentes do meio de co-cultivo.

Exemplo 4:

Recuperação.

Após o co-cultivo, transfira os embriões aos meios de recupera-ção (A-4 ou A-5) e incubate as placas no escuro em 27°C por aproximada-mente 5 a 7 dias. Mantenha o lado do scutellum ascendente e não o encaixenos meios.

Efeito da tabela 3 do comprimento da recuperação (sem adicio-nar o agente de seleção no meio) após o cultivation do co- na eficiência detransformação no genótipo de BPS553x(HillAxA188). O número médio deembriões imaturos para cada tratamento no replicate era aproximadamente 70.

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Exemplo 5:

Seleção.

5.1 Protocolo Básico Da Seleção.

Embriões imaturos de transferência aos 1os meios da seleção(A-6). Aproximadamente 25 a 50 embriões imaturos podem ser colocadosem cada placa. Tenha cuidado para manter a mesma orientação dos embri-ões (scutellum acima). Não encaixe os embriões nos meios. Sele as placasde Petri com filamento adesivo branca. Incube no escuro em 27°C por 10dias a14 dias (primeira seleção). Subculture todos os embriões imaturos queproduzem o calos germinativos variáveis aos meios da seleção (a 6). Tenteevitar de transferir o calos germinativos pegajoso ou mole. Neste estágio,use tesoura para remover quisquer tiros que tenham forma (tentar remover oembrião inteiro do scutellum se possível e o descartar). Coloque firmementeo calo no meio - não embuta no meio. Envolva as placas no filamento adesi-vo tipo micorpore da 3M e ponha-as no escuro em 27°C. Incube por 2 sema-nas sob as mesmas condições para a primeira seleção (segunda seleção).

Usando 2 pares de forceps finos, excise o calos germinativos regenerável doscutellum sob um microscópio estereoscópico. O calo germinativo regenerá-vel é esbranquiçado/amarelado (whitish/yellowish) na cor, no estojo compac-to, nao pegajoso e podem ter algumas estruturas semelhantes a embrião.Transfira o calos germinativos para o fresco os meios da seleção (A-6), en-volva-o no filamento adesivo tipo micropore da 3M e incube no escuro em27°C por 2 semanas. Coloque firmemente o calo nos meios - não encaixenos meios. Tenha cuidado para agrupar e marcar as partes do calos germi-nativos que vieram do mesmo embrião.

5.2 O protocolo melhorado da seleção.

Um esquema melhorado da seleção é aplicado alternativamentee preferivelmente: Todos os métodos (método básico incluindo descrito aci-ma) divulgaram para a transformação do milho na técnica requerem 2 a 3transferências aos meios da seleção com o mesmo ou as concentraçõesdiferentes do reagente da seleção. Um meio de transferência para movermateriais do calo das placas do meio atual para um conjunto de placas demeio novas. O processo de transferência é de trabalho e consumo de tempointensivo, por exemplo, leva 60 minutos para transferir os materiais de calode transferência derivados de 100 embriões imaturos. No método melhora-do, simplificado da invenção, somente uma transferência ao meio da seleçãoé requerida. Em conseqüência, aproximadamente 30% do tempo e trabalho(isto é, 60 minutos para cada 100 materiais embrião-derivados imaturos) éconservado.

Quando o básico requerer o calo crescente em meios da seleçãopor geralmente 5 a 6 semanas, o método melhorado, simplificado requer 4semanas. Assim, o processo inteiro de transformação é encurtado por 1 a 2semanas.

Mostrou que é possível produzir eventos transgênico com o ge-nótipo melhorado, simplificado do método inBPS553x(Hil IAxAI 88) com0,5μΜ ou 0,75 PURSUIT® μΜ e no genótipo de HiIIAxAI 88 com somente0,5 PURSUIT® do μΜ no estágio do calo para a seleção. A eficiência detransformação calculou a média de 20,5% para o genótipo de BPS553x(HilIAxAI 88) e 2.5 para o genótipo de Hil IAxAI 88. Na comparação com o pro-tocolo padrão de transformação (2 semanas no meio com 0,5 PURSUIT doμΜ seguido por outras 3 semanas no meio contendo 0,75 PURSUIT® do μΜpor outras três semanas) o método simplificado teve uma eficiência de trans-formação de 36.7% quando o método anterior teve uma eficiência de 33.3%.

Assim as eficiências de transformação eram comparáveis para ambos osmétodos.

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BPS553x(HxA): BPS553 x(H IAxAI 88) # IE=number dos embriões imaturos usados para atransformação. TE: Eficiência de transformação (%) = número de plantas de PCR+/# IE x100

Mais especificamente o protocolo melhorado da seleção é reali-zado como segue: Olhar através de um microscópio de dissecação e usarum par do forcepspara remover o eixo dos embriões, escolhem e transferemembriões imaturos com células do calo que estão crescendo ativamente aomeio M-LS-401 fresco em placas de 25x100 milímetro, porque algum meiodo genótipo M-LS-301 pode ser usado também. Placa somente 8-10 embri-ões por a placa. Certifique-se que todos os embriões tocam na superfície domeio. Sele as placas com filamento adesivo porosa. Cresça o material em25°C no escuro por 25 a 28 dias. Preferivelmente, não os deixe crescer pormais de 4 semanas no meio da seleção do Ius do calos. Selecione os mate-riais do calo que estão crescendo ativamente sob um microscópio e transfirao meio da regeneração como descrito abaixo.

Exemplo 6:

Regeneração de plantas transformadas

6.1 O protocolo básico da regeneração

Excise os calos germinativos proliferados (whitish com as estru-turas embriônicas que dão forma), na mesma maneira que para a seleção etransferência aos meios da regeneração (A-7) em placas de 25x100 milíme-tro. Coloque firmemente o calo nos meios - não encaixe nos meios. Envolvaas placas no filamento adesivo tipo micorpore da 3M e ponha-as na luz emou em 27°C. Tenha cuidado para agrupar as partes do calos germinativos5 que vieram do mesmo embrião e as numeram pelo embrião.

Incube sob a luz (ca. 2.000 lux; 14/1 Ohr dia/noite) em 25 ou em27°C por 2 a 3 semanas, ou até dispar-como estruturas semelhantes ao tiroserem visíveis. Transferência aos meios frescos da regeneração se neces-sário. As seções do calos germinativos de transferência com tiros regenera-dos ou dispar-como estruturas a um Phytatray ou a umas caixas magentascontendo o meio enraizando (A-8) e incube por 2 semanas sob a mesmacondição para a etapa acima, ou até brotos enraizados tornaram-se. Após 2a 4 semanas nos meios enraizando, calos germinativos de transferência quetêm ainda as regiões verdes (mas que não tenham mudas regeneradas parao Phytatrays de enraizamento fresco. As amostras de semente são feitaspara análise de TaqMan para determinar os números da inserção de T-DNA.

Transfira seedlings enraizadas ao solo de Metromix na estufa ecubra cada um com a abóbada plástica para pelo menos 1 semana, até queas mudas estabeleçam. Mantenha as plantas com água diária, e suplemen-tar o fertilizante líquido duas vezes por semana. Quando as plantas alcança-rem 3 a 4 folha-estágios, elas são fertilizadas com Osmocote. Se necessáriaas plantas transgênicas putativas são pulverizadas com a PURSUIT de 70 a100 g/ha por uma pessoa licenciada, e crescido na estufa por outras duassemanas. As plantas não-transgênicas devem desenvolver sintomas herbici-dal ou morrer neste tempo. As plantas sobrevividas são transplantadas emvasos de 10"com MetroMix e 1 teaspoon Osmocote®.

No estágio floração, os arranjos de plantas transgênicas são co-bertos com os sacos de papel marrons para impedir o escape do pólen. Apolinização é executado nas plantas transgênicas. É melhor fazer o autopo-linização nas plantas transgênicas. Se a cobertura e a florescência não sãosincronizados, um doador do pólen ou planta do receptor tipo selvagem commesmo fundo genético que a planta TO transgênico deve estar disponívelpara executar a polinização reticulada . As sementes T1 são colhidas, secase armazenadas corretamente com etiqueta adequada no saco da semente.Após ter colhido as sementes T1 transgênico, as plantas TO incluindo o soloe o vaso devem ser embalados em sacos da autoclave e autoclavadas (em-balagem em dobro).

6.2 Protocolo Melhorado Da Regeneração.

Em uma modalidade preferida da invenção um procedimentomelhorado é empregado. O protocolo básico e os protocolos de transforma-ção conhecidos nas plantas transgênicas do regenerado da técnica nas pla-cas, transferidas então a uma caixa contendo o meio para estimular enraizar.Enraizado plantado transplanted mais tarde a MetroMix na estufa. Este pro-cedimento é consumo intensivo de tempo e trabalho. No método melhorado,os brotos regenerados em placas são diretamente transplantadasa MetroMixna estufa, omitindo a etapa na caixa enraizando, conservando desse modo otempo e o trabalho.

Assim, os materiais do calo são selecionados mais especifica-mente os quais estão crescendo ativamente sob um microscópio e transfe-rência de dissecação ao meio M-LS-503 ou M-LS-504 em placas de 25x100milímetro. As placas de sustento no jogo do quarto da cultura 14/10 em Ohrluz/noite e 25°C e crescem por 2 a 3 semanas até que o tiro regêneros. Tirostransplantados saudáveis e vigorosa crescentes aos vasos com mistura dometro na estufa. Da aqui siga sobre o protocolo da estufa como descrito a-cima. Pelo menos 50% dos tiros sobrevivem o processo transplantados. Oresultado mostrou que duas experiências separadas tiveram uma taxa dasobrevivência de 62 e de 93%, respectivamente.

Exemplo 7:

Comparação de eficiências de transformação para híbrido do milho.

Os embriões imaturos foram derivados das linhagens híbridas domilho (como especificado na tabela 5 abaixo) e transformado por Agrobacte-rium mediou a transformação como descrita acima. Os eventos de Transgê-nico foram confirmados com análise TaqMan®.Tabela 5: Eficiência de transformação para duas fontes híbridasdiferentes para embriões imaturos

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Para BPS553x(HillAxA188) genótipos, a eficiência de transfor-mação é alta o bastante, que a adição do nitrato de prata e de L-cisteína aomeio de co-cultivo pode ser omitida. Entretanto, a adição destes compostosmais adicionais realça a eficiência de transformação.

Demonstrando o transformabilidade da geração F2 do híbridoBPS553 χ (Hil- IAxAI 88), as plantas F1 de BPS553 χ (HillAxA188) eram po-Iinizada do mesmo, e o F2 que os embriões imaturos foram transformadosbasearam no protocolo sem usar o L-cisteína no meio de co-cultivo, comodescrito neste pedido. As eficiências similares de transformação foram obti-das com os embriões F1 e o F2 imaturos (tabela 6).

Tabela 6: Comparação de transformação das gerações F1 e F2de linhagens híbridas de BPS553 χ (Hil IAxAI88). Os embriões F2 imaturosforam produzidos pelas plantas F1 polinização dos mesmos de BPS553 χ(Hill- AxA188). As experiências de transformação foram conduzidas sem a-plicar o L-cisteína no meio do co-cultivation.

<table>table see original document page 72</column></row><table>REFERÊNCIAS.

As referências listadas abaixo e todas as referências aqui cita-das são aqui incorporadas pela referência até o ponto em que suplementam,explicam e fornecem um embasamento para, ou ensinam a metodologia, astécnicas, e/ou as composições aqui empregadas.

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<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

BASF PLANNT SCIENCE GMBH

MÉTODOS MELHORADOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS FÉRTEIS ZEA MAYS (MILHO)ESTAVELMENTE TRANSFORMADAS

AE20040367

3

PatentIn versão 3.31

15997DNA

vetor pBPSMM232

caracteristica_misc(2305) .. (4305)

codificando para gene (mais intron) de glucuronidade (GUS)

promotor(298) .. (2278)

promotor da ubiquitina do milho

caracteristica_misc(6141) .. (8057)

complemento: seleção do gene marcador de milho mutado AHAS)

caracteristica_misc(148) .. (172)

complemento: limite esquerdo de T-DNA

caracteristica_misc(10103) .. (10126)

complemento: limite direito de T-DNA

<220><221><222>

origem-rep(12490) .. (12770)<223> origem da replicação pBR322<220>

<221> origem-rep

<222> (12489) .. (13170)

<223> origem da replicação colEl

<220>

<221> terminador

<222> (4925) .. (6140)

<223> complemento iteminador de milho AHAS

<400> 1

cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc 60gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg 120ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac 180gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaattg actagtggcg 240cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccatcgaatt cctgcagtgc B00agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa 360aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac 420atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt 480tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga 540caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa 600tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt 660taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa 720

attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga 780

ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga 840

aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa 900

cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc 960

atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc 1020

gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg 1080

cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg 1140

ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac 1200

ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc 1260

acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga 1320

tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag 1380

atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc 1440

agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct 1500

agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg 1560

tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca 1620

tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga 1680

gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc 1740

catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1800

atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt 1860

gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt 1920

ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca 1980

tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg 2040

ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt 2100

gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact 2160

tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta 2220

tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct 2280

gcagcccggg taggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 2340

aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattggtcag 2400

cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 2460

gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 2520

gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 2580

cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 2640

ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg taagtttctg 2700

cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa 2760atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt agtttataag 2820

tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg atgtgcaggt 2880

atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg aatggtgatt 2940

accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa ctatgccgga 3000

atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg 3060

gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat 3120

ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc 3180

actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc 3240

tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc 3300

ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac 3360

tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg 3420

ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg 3480

cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt 3540

gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac 3600

aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta 3660

caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt 3720

attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc gccactggcg 3780

gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc 3840

gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac 3900

ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt 3960

ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg 4020

ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg 4080

ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg 4140

aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg 4200

atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact 4260

ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa caactctcct 4320

ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attgctaccg agctcgaatt tccccgatcg 4380

ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 4440

tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 4500

gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 4560

agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 4620

actagatcgg gaattggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4680

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4740

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4800gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttgtgt 4860

taattaacgg tccgaggcct cctcagcaag ctgttaacgc gatcgcagcg ccttaagggg 4920

ccgctctaga ttagtgtacg gaataaaagt cctaattcat tctttttctt atacgtcacc 4980

gttttctaca tttagaaaaa tgaagtggga atcaattgaa acaattgata gctttaaata 5040

tcaagctgtc ttctccagga ccaggcccca gcacatcggc gtggaaagcg ctaggcccca 5100

gaacaactcg tcaatcgtca tggcaaataa tgacacattg agccgatttg atgcatggaa 5160

cagactaata aggaactcaa atctctttgg agattgaatg attgagatga aaatgaatta 5220

atattttttc tcaatcccct ccaatgctaa gaaagtttga gtttccaaat tagctttaga 5280

gggcgtttag atcccttcgt tttagagaaa ttagaattca ctcaataaaa taacttattt 5340

aatttggaat ttgatattca accacttttc aaagtttaga tataggtcta tctcaaattc 5400

atagggtgga tgatggaaat gattttatgc attaatagaa tttgtttcta ctgtgtaact 5460

tacatgacac tcttcatctc actcctgtat agtaaaaatg tagcatataa atatctccga 5520

catcttgata ataatagtat acaaatatat tttgcataaa accgaattaa cttaattgat 5580

atatgccaaa attactatta ttagaatgga atttaattcc aatgatccaa accacgaaaa 5640

tggatcaggt aactaattca gtcaaatgcc tcattttttt tcactcccct caaaccacga 5700

aaatgccatt ctggtttgta aaatagtttg aaattgcagc cctagcatta ttccatacat 5760

catatgttga gttgaaatta ccaatataat aataactaaa aaaggaaaaa aatagcgaaa 5820

acaaaagcaa ggaccagttg gacacttaaa tttggcaaca gaagccaatt cagaaccact 5880

gcatagcagt gcttattatc ttatttatat gtagcaaaag gcacttaaat gatctcttat 5940

gacacatgcc agaaggaaaa caacagacta cacaattaca aggtcggaag ctacatagga 6000

ttaccataac agatagctga cggcctacaa aaaaagatag aatacaggag aacatcacac 6060

agataaaaac atatcaccct tgtactagca gggaggcggt gcttgctgga ttttagatca 6120

gttgcttgct ggattttaga tcagtacaca gtcctgccat caccatccag gatcatatcc 6180

ttgaaagccc caccattagg gatcataggc aacacatgct cctggtgtgg gacgattata 6240

tccaagaggt acggccctgg agtctcgagc atcttcttta tcgctgcgcg gacttcgttc 6300

ttctttgtca cacggaccgc tggaatgttg aaccctttgg cgatcgtcac gaaatctgga 6360

tatatctcac tttcattctc tgggtttccc aagtatgtgt gcgctctgtt ggccttatag 6420

aacctgtcct cccactgcac caccatcccc aggtgctggt tgtttagcac aaagaccttc 6480

accgggaggt tctcaattcg gatcatagct agctcctgaa cgttcatgag aaagctacca 6540

tctccatcga tgtcaacaac agtaacacct gggttggcca cagaagcacc agcagcagcc 6600

ggcaaaccaa atcccatagc cccaagacca gctgaagaca accactgcct tggccgcttg 6660

taagtgtagt actgtgccgc ccacatctgg tgctgcccaa cacctgtgcc gatgatggcc 6720

tcgcctttcg tcagctcatc aagaacctga atagcatatt gtggctggat ctcctcatta 6780

gatgttttat acccaagggg gaattccctc ttctgctgat ccaactcatc gttccatgag 6840

ccaaagtcaa agctcttctt tgatgtgctt ccttcaagaa gagcattcat gccctgcaaa 6900gcaagcttaa catctgcaca gatggacaca tgtggctgct tgttcttgcc aatctcagcc 6960

ggatcaatat caacgtgcac aatcttagcc ctgcttgcaa aagcctcaat cttccctgtc 7020

acacgatcat caaaccgcac accaagtgca agcaacagat cggccttatc cactgcataa 7080

tttgcataca ccgtgccatg catacctagc atgcgcagag acagtgggtc gtcgctgggg 7140

aagttgccga ggcccataag agtagttgtg accgggattc cagtcagctc cacaaagcgt 7200

cgcaactcct caccagatgc tgcgcagcca ccgccaacat aaagaacagg gcgccgggat 7260

tcaccaacaa gacgcagcac ctgctcaagc aactcagtcg cagggggctt gggaaggcgc 7320

gcaatgtacc caggcagact catgggcttg tcccagacag gcaccgccat ctgctgctgg 7380

atgtccttgg ggatgtcgac aagcaccggc cccggtcgac cagaggaggc gaggaagaaa 7440

gcctcctgca cgacgcgggg gatgtcgtcg acgtcgagga ccaggtagtt gtgcttggtg 7500

atggagcggg tgacctcgac gatgggcgtc tcctggaagg cgtcggtgcc aatcatgcgt 7560

cgcggcacct gtcccgtgat ggcgaccatg gggacggaat cgagcagcgc gtcggcgagc 7620

gcggagacaa ggttggtggc gccggggccg gaggtggcga tgcagacgcc gacgcggccc 7680

gaggagcgcg cgtagccgga ggccgcaaag gcctcccctt gctcgtggcg gaagaggtgg 7740

ttggcgatga cgggggagcg ggtgagtgcc tggtggatct ccatggacgc gccgccgggg 7800

taggcgaaga cgtcgcggac gccgcagcgc tcgagggact cgacgaggat gtcggcgccc 7860

ttgcggggat cggtggggcc ccacggccgg agcggggtgg ccgggggagc catcggcatg 7920

gcgggtgacg ccgctgagca cctgatgggc gcggcgaggg cgcggcgggt ggccaggagg 7980

tgcgcccggc gcctcgcctt gggcgcagcg gtagtggcgc cagtgagcgc ggtagacgcg 8040

gcggcggcgg tggccatggt ttctagaact agtggatccc ccgggctgca gaagtaacac 8100

caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat agcgtatgaa 8160

ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa gtatatcaag 8220

atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca aggttagagc 8280

atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc acatcaacat 8340

gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat gaagatgtat 8400

gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa cagtattcta 8460

ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca accaagcgaa 8520caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata cctatcctag 8580atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg cacacacata 8640cagatccaaa attaataaat ccaccaggta gtttgaaaca gaattctact ccgatctaga 8700acgaccgccc aaccagacca catcatcaca accaagacaa aaaaaagcat gaaaagatga 8760cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac caaaccctat 8820gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta gagccatccc 8880aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg acgtacaggt 8940cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc taacacaaac 9000

atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat ctagagaagg 9060

tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg ccgacgggtg 9120

gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag 9180

agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg 9240

tgggaaagga atcccccgta gctgccggtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt 9300

gccggctcac gtctgccgct ccgccacgca atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc 9360

aacggtggag cggaactctc gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc 9420

tgcttcgctt ggcccgacgc gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc 9480

gacggcgttt aacaggctgg cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt 9540

tttaatttct taaagggtat ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt ctattttata 9600

tctaaattat taaataaaaa aactaaaata gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa 9660

aatagaataa aatagatgta ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc 9720

taaatggatg tactaataaa atggatgaag tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa 9780

aaaggagaac acatgcacac taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc 9840

aattgtcctt tagaccatgt ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa cactgatatt 9900

attgtagtac tatagattat attattcgta gagtaaagtt taaatatatg tataaagata 9960

gataaactgc acttcaaaca agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta 10020

gacatgcaat gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcagga 10080

attcgataaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag 10140

cgtttattag aataatcgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt 10200

tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc tcgggagtgc ttggcattcc gtgcgataat 10260

gacttctgtt caaccaccca aacgtcggaa agcctgacga cggagcagca ttccaaaaag 10320

atcccttggc tcgtctgggt cggctagaag gtcgagtggg ctgctgtggc ttgatccctc 10380

aacgcggtcg cggacgtagc gcagcgccga aaaatcctcg atcgcaaatc cgacgctgtc 10440

gaaaagcgtg atctgcttgt cgctctttcg gccgacgtcc tggccagtca tcacgcgcca 10500

aagttccgtc acaggatgat ctggcgcgag ttgctggatc tcgccttcaa tccgggtctg 10560

tggcgggaac tccacgaaaa tatccgaacg cagcaagatc gtcgaccaat tcttgaagac 10620

gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 10680

agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 10740

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 10800

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 10860

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 10920

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 10980

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 11040gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 11100

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 11160

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 11220

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 11280

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 11340

agcgtgacac cacgatgcct gcaggggggg gggggggggg acatgaggtt gccccgtatt 11400

cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt 11460

aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt 11520

gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt 11S80

acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt 11640

ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa 11700

acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc 11760

gtggaatgaa caatggaacc cccccccccc cccccctgca gcaatggcaa caacgttgcg 11820

caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 11880

ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat 11940

tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 12000

agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 12060

tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 12120

agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 12180

gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 12240

gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 12300

tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt 12360

gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 12420

accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 12480

accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 12540

gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 12600

ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 12660

atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 12720

gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 12780

cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 12840

gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 12900

gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc 12960

tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac 13020cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct 13080tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 13140

tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg 13200

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 13260

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 13320

tcaccgaaac gcgcgaggca gcagatcccc cgatcaagta gatacactac atatatctac 13380

aatagacatc gagccggaag gtgatgttta ctttcctgaa atccccagca attttaggcc 13440

agtttttacc caagacttcg cctctaacat aaattatagt taccaaatct ggcaaaaggg 13500

ttaacaagtg gcagcaacgg attcgcaaac ctgtcacgcc ttttgtgcca aaagccgcgc 13560

caggtttgcg atccgctgtg ccaggtgtta ggcgtcatat gaagatttcg gtgatccctg 13620

agcaggtggc ggaaacattg gatgctgaga accatttcat tgttcgtgaa gtgttcgatg 13680

tgcacctatc cgaccaaggc tttgaactat ctaccagaag tgtgagcccc taccggaagg 13740

attacatctc ggatgatgac tctgatgaag actctgcttg ctatggcgca ttcatcgacc 13800

aagagcttgt cgggaagatt gaactcaact caacatggaa cgatctagcc tctatcgaac 13860

acattgttgt gtcgcacacg caccgaggca aaggagtcgc gcacagtctc atcgaatttg 13920

cgaaaaagtg ggcactaagc agacagctcc ttggcatacg attagagaca caaacgaaca 13980

atgtacctgc ctgcaatttg tacgcaaaat gtggctttac tctcggcggc attgacctgt 14040

tcacgtataa aactagacct caagtctcga acgaaacagc gatgtactgg tactggttct 14100

cgggagcaca ggatgacgcc taacaattca ttcaagccga caccgcttcg cggcgcggct 14160

taattcagga gttaaacatc atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat 14220

cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt 14280

acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg 14340

tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt 14400

cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg 14460

acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc 14520

gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct 14580

tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct 14640

ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga 14700

actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt 14760

ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg 14820agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc taggcaggct tatcttggac 14880aagaagatcg cttggcetcg cgcgcagatc agttggaaga atttgttcac tacgtgaaag 14940gcgagatcac caaggtagtc ggcaaataat gtctaacaat tcgttcaagc cgacgccgct 15000tcgcggcgcg gcttaactca agcgttagag agctggggaa gactatgcgc gatctgttga 15060aggtggttct aagcctcgta cttgcgatgg catcggggca ggcacttgct gacctgccaa 15120ttgttttagt ggatgaagct cgtcttccct atgactactc cccatccaac tacgacattt 15180ctccaagcaa ctacgacaac tccataagca attacgacaa tagtccatca aattacgaca 15240

actctgagag caactacgat aatagttcat ccaattacga caatagtcgc aacggaaatc 15300

gtaggcttat atatagcgca aatgggtctc gcactttcgc cggctactac gtcattgcca 15360

acaatgggac aacgaacttc ttttccacat ctggcaaaag gatgttctac accccaaaag 15420

gggggcgcgg cgtctatggc ggcaaagatg ggagcttctg cggggcattg gtcgtcataa 15480

atggccaatt ttcgcttgcc ctgacagata acggcctgaa gatcatgtat ctaagcaact 15540

agcctgctct ctaataaaat gttaggcctc aacatctagt cgcaagctga ggggaaccac 15600

tagtgtcata cgaacctcca agagacggtt acacaaacgg gtacattgtt gatgtcatgt 15660

atgacaatcg cccaagtaag tatccagctg tgttcagaac gtacgtccga attaattcat 15720

cggggtacgg tcgacgatcg tcaacgttca cttctaaaga aatagcgcca ctcagcttcc 15780

tcagcggctt tatccagcga tttcctatta tgtcggcata gttctcaaga tcgacagcct 15840

gtcacggtta agcgagaaat gaataagaag gctgataatt cggatctctg cgagggagat 15900

gatatttgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc 15960

gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgc 15997

<210> 2

<211> 1917

<212> DNA

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1914)

<223> Codificando para mutante ΧΑ17 ahas

<220>

<221> mutation

<222> (1625) (1625)

<223> Mutação G/T conferindo fenotipo XA17 resultando em

mudança de triptofano para leucina na posição 542 daseqüência de aminoácido traduzido

<400> 2

atg gcc acc gcc gcc gcc gcg tct acc gcg ctc act ggc gçc açt açc 48

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr

1 5 10 15

gct gcg ccc aag gcg agg cgc cgg gcg cac ctc ctg gcc acc cgc cgc 96

Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg20 25 30

gcc ctc gcc gcg ccc ate agg tgc tca gcg gcg tca ccc gcc atg ccg 144

Ala Leu Ala Ala Pro lie Arg Cys Ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro35 40 45

atg gct ccc ccg gcc acc ccg ctc cgg ccg tgg ggc ccc acc gat ccc 192Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Asp Pro50 55 60

cgc aag ggc gcc gac ate ctc gtc gag tcc ctc gag cgc tgc ggc gtc 240Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu Glu Arg Cys Gly vai65 70 75 80

cgc gac gtc ttc gcc tac ccc ggc ggc gcg tcc atg gag ate cac cag 288

Arg Asp vai Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala ser Met Glu lie His Gln85 90 95

gea ctc acc cgc tcc ccc gtc ate gcc aac cac ctc ttc cgc cac gag 336Ala Leu Thr Arg Ser Pro vai lie Ala Asn His Leu Phe Arg His Glu100 105 110

caa ggg gag gec ttt gcg gcc tcc ggc tac gcg cgc tcc tcg ggc cgc 384

Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg ser ser Gly Arg115 120 125

gtc ggc gtc tgc ate gcc acc tcc ggc ccc ggc gcc acc aac ctt gtc 432Val Gly vai Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu vai130 135 140

tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gat tcc gtc ccc atg gtc gcc ate 480Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp ser Val Pro Met Val Ala Ile145 150 155 160

acg gga cag gtg ccg cga cgc atg att ggc acc gac gcc ttc cag gag 528Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu165 170 175

acg ccc ate gtc gag gtc acc cgc tcc ate acc aag cac aac tac ctg 576

Thr Pro lie Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu180 185 190

gtc ctc gac gtc gac gac ate ccc cgc gtc gtg cag gag gct ttc ttc 624Val Leu Asp vai Asp Asp lie Pro Arg vai vai Gln Glu Ala Phe Phe195 200 205

ctc gcc tcc tet ggt cga ccg ggg ccg gtg ctt gtc gac ate ccc aag 672Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys210 215 220

gac ate cag cag cag atg gcg gtg cct gtc tgg gac aag ccc atg agt 720Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala vai Pro vai Trp Asp Lys Pro Met Ser225 230 235 240

ctg cct ggg tac att gcg cgc ctt ccc aag ccc cct gcg act gag ttg 768Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu245 250 255

ctt gag cag gtg ctg cgt ctt gtt ggt gaa tcc cgg cgc cct gtt ctt 816Leu Glu Gln vai Leu Arg Leu vai Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu260 265 270

tat gtt ggc ggt ggc tgc gea gea tet ggt gag gag ttg cga cgc ttt 864Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe275 280 285

gtg gag ctg act gga ate ccg gtc aca act act ctt atg ggc ctc ggc 912

vai Glu Leu Thr Gly lie Pro vai Thr Thr Ttir Leu Met Gly Leu Gly290 295 300aac ttc ccc age gac gac cca ctg tet ctg cgc atg cta ggt atg cat 960

Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His305 310 315 320

ggc acg gtg tat gea aat tat gea gtg gat aag gcc gat ctg ttg ctt 1008Gly Thr vai Tyr Ala Asn Tyr Ala vai as ρ Lys Ala Asp Leu Leu Leu325 330 335

gea ctt ggt gtg cgg ttt gat gat cgt gtg aca ggg aag att gag gct 1056Ala Leu Gly vai Arg Phe Asp Asp Arg VaT Thr Gly Lys Ile Glu Ala340 345 350

ttt gea age agg gct aag att gtg cac gtt gat att gat ccg gct gag 1104Phe Ala Ser Arg Ala Lys lie vai His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu355 360 365

att ggc aag aac aag cag cca cat gtg tcc ate tgt gea gat gtt aag 1152Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp vai Lys370 375 380

ctt gct ttg cag ggc atg aat gct ctt ctt gaa gga age aca tca aag 1200Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly Ser Thr Ser Lys385 390 395 400

aag age ttt gac ttt ggc tca tgg aac gat gag ttg gat cag cag aag 1248Lys ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gln Gln Lys405 410 415

agg gaa ttc ccc ctt ggg tat aaa aca tet aat gag gag ate cag cca 1296Arq Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gln Pro420 425 430

caa tat gct att cag gtt ctt gat gag ctg acg aaa ggc gag gcc ate 1344Gln Tyr Ala lie Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala lie435 440 445

ate ggc aca ggt gtt ggg cag cac cag atg tgg gcg gea cag tac tac 1392lie Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr450 455 460

act tac aag cgg cca agg cag tgg ttg tet tca gct ggt ctt ggg gct 1440Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser ser Ala Gly Leu Gly Ala465 470 475 480

atg gga ttt ggt ttg ccg gct gct gct ggt gct tet gtg gcc aac cca 1488Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala ser Val Ala Asn Pro485 490 495

ggt gtt act gtt gtt gac ate gat gga gat ggt age ttt ctc atg aac 1536Gly vai Thr vai vai Asp Ile Asp Gly Asp Gly ser Phe Leu Met Asn500 505 510

gtt cag gag cta gct atg ate cga att gag aac ctc ccg gtg aag gtc 1584Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val515 520 525

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agg ttc tat aag gcc aac aga gcg cac aca tac ttg gga aac cca gag 1680Arq Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu545 550 555 560

aat gaa agt gag ata tat cca gat ttc gtg acg ate gcc aaa ggg ttc 1728Asn Glu Ser Glu lie Tyr Pro Asp Phe Val Thr lie Ala Lys Gly Phe565 570 575aac att cca gcg gtc cgt gtg aca aag aag aac gaa gtc cgc gca gcg 1776Asn Ile Pro Ala vai Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu vai Arg Ala Ala580 585 590

ata aag aag atg ctc gag act cca ggg ccg tac ctc ttg gat ata ate 1824Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile595 600 605

gtc cca cac cag gag cat gtg ttg cct atg ate cct agt ggt ggg gctvai Pro His Gln Glu His vai Leu Pro Met lie Pro Ser Gly Gly Ala610 615 620

1872

ttc aag gat atg ate ctg gat ggt gat ggc agg act gtg tac tga 1917

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Giy Arg Thr Val Tyr625 630 635

<210> 3

<211> 638

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 3

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr1 5 10 15

Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg20 25 30

Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg cys ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro35 40 45

Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Asp Pro50 55 60

Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu ser Leu Glu Arg Cys Gly vai65 70 75 80

Arg Asp vai Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala ser Met Glu lie His Gln85 90 95

Ala Leu Thr Arg Ser Pro vai Ile Ala Asn His Leu Phe Arg His Glu100 105 110

Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg ser ser Gly Arg115 120 125

vai Gly vai cys lie Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu vai130 135 140

Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile145 150 155 160Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu165 170 175

Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu180 185 190

Val Leu Asp vai Asp Asp lie Pro Arg vai vai Gln Glu Ala Phe Phe195 200 205

Leu Ala Ser ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Vafl Asp Ile Pro Lys210 215 220

Asd Ile Gln Gln Gln Met Ala vai Pro vai Trp Asp Lys Pro Met Ser225 230 235 240

Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu

"50

245

255

Leu Glu Gln vai Leu Arg Leu vai Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu260 265 270

Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe275 280 285

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Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His305 310 315 320

Gly Thr vai Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu325 330 335

Ala Leu Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala340 345 350

Phe Ala ser Arg Ala Lys Ile vai His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu355 360 365

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His vai ser lie Cys Ala Asp Val Lys370 375 380

Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly Ser Thr Ser Lys385 390 395 400

Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gln Gln Lys405 410 415

Arq Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gln Pro420 425 430

Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile435

440

445

Ile Gly Thr Gly vai Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr450 455 460

Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser ser Ala Gly Leu Gly Ala465 470 475 480

Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro485 490 495

Gly vai Thr vai vai Asp lie Asp Gly Asp Gly ser Phe Leu Met Asn500 505 510

Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val515 520 525

Phe vai Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met vai vai Gln Leu Glu Asp530 535 540

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu545 550 555 560

Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr lie Ala Lys Gly Phe565 570 575

Asn lie Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu Val Arg Ala Ala580 585 590

Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile595 600 605

vai Pro His Gln Glu His vai Leu Pro Met lie Pro Ser Gly Gly Ala610 615 620

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr vai Tyr625 630 635

Claims (32)

1. Método para gerar uma planta transgênica de Zea mays com-preendendo as etapas de:a. isolamento de um embrião imaturo de uma planta de Zeamays, eb. co-cultivo do dito embrião imaturo isolado, que não foisubmetido a um tratamento do de-diferenciação, com umabactéria nascida do colo pertence ao gênero Rhizobiaceaecompreendendo pelo menos um T-DNA transgênico, o ditoT-DNA compreendendo pelo menos um gene marcador se-lecionável, com um meio de co-cultivo, ec. transferência dos embriões imaturos co-cultivados para ummeio de recuperação compreendendo:i. uma quantidade eficaz de pelo menos um antibióticoque inibe ou suprime o crescimento da bactéria nas-cida do solo, eii. L-prolina em uma concentração de aproximadamente-1 g/l a aproximadamente 10 g/l, eiii. nitrato de prata em uma concentração de aproxima-damente 1 μΜ a aproximadamente 50 μΜ, eiv. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, mas não compreendendo uma quantidadeeficaz de um agente de seleção fitotóxica, ed. induzir a formação do calo embriogênica e selecionar ocalo transgênico em um meio compreendendo,i. uma quantidade eficaz de pelo menos um compostoauxínico, eii. uma quantidade eficaz de um agente de seleçãopermitindo a seleção das células compreendendo o T-DNA transgênico, ee. regeneração e seleção das plantas contendo o T-DNA transgênico do ditocalo transgênico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito em-brião imaturo está no grupo consistindo em nascimentos naturais, híbridos,F1 entre os nascimentos naturais, F1 entre um nascimento natural e um hí-brido, F1 entre uma variedade de nascimento natural e naturalmente polini-zada, variedades F1 comerciais, qualquer cruzamento F2 ou auto-polini-zação entre as variedades anteriormente mencionadas e a progenitura dequalquer dos anteriormente mencionados.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o embriãoimaturo é isolado de um cruzamento do híbrido (HilIA χ A188) com uma Ii-nhagem de nascimento natural selecionada do grupo cuja semente repre-sentativa foi depositada com a Coleção de Cultivo do Tipo Americano sob aDesignação do Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-6171.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 3, em que o dito embrião imaturo é aquele no estágio de não menos doque 2 dias após a polinização.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que os embriões imaturos são isolados e inoculados diretamentecom a suspensão do Agrobacterium sem etapas adicionais de lavagem pré-vias.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 5, em que os embriões imaturos são isolados, colocados sobre a superfíciede um meio de cultivo sólido com lado do scutellum para cima e inoculadocom uma gota da suspensão celular do Agrobacterium.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que os embriões imaturos são colocados em uma ou mais camadasde papel de filtro na superfície do meio de co-cultivo da ágar ou em um oumais camada de papel de filtro contendo a solução do meio líquido de co-cultivo em uma placa sem o meio ágar.

8. Método de acordo a reivindicação 5 ou 6, em que para a eta-pa de co-cultivo sobre uma suspensão de Agrobacteria no meio de infecçãoé aplicada diretamente sobre cada embrião e a quantidade em excesso dolíquido é removida após a inoculação do Agrobacterium.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 8, em que a quantidade eficaz o composto auxínico é equivalente a umaconcentração de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 6 mg/l de-2,4-D.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 9, em que o dito embrião imaturo é submetido à transformação sem pré-tratamento de diferenciação em que o dito embrião imaturo, opcionalmente,é tratado com uma enzima ou ferido.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 10, em que a bactéria nascida do solo é de uma Agrobacterium tumefa-ciens desarmada ou uma cepa Agrobacterium rhizogenes.

12. Método de quaisquer reivindicações 1 a 11, em que a ditabactéria pertencendo ao gênero Agrobacterium usada para a transformaçãotem uma população celular de 106 CFU/ml a 1011 CFU/ml.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 12, em que o meio empregado durante o co-cultivo compreende de a-proximadamente 1 μΜ a aproximadamente 10 μΜ de nitrato de prata e deaproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 1.000 mg/L de L-cisteína.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 13, em que a seleção é realizada em uma única etapa de seleção semtransferência intermediária de tecido.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 14, em que os brotos enraizados resultando da etapa de regeneraçãosão transferidos diretamente para dentro do meio de solo.

16. Planta do milho obtida pelo cruzamento de um híbrido (HilIAχ A188) com uma linhagem de nascimento natural selecionada do grupo cujasemente representativa foi depositada com a Coleção de Cultivo do TipoAmericano sob a Designação do Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-6171.

17. Planta do milho de acordo com a reivindicação 16, compre-endendo um T-DNA transgênico.

18. Planta transgênica do milho gerada a partir da transformaçãocom um gene construtor heterólogo de uma planta, uma célula ou um tecidodo milho originado de uma planta selecionada do grupo cuja semente repre-sentativa foi depositada com a Coleção de Cultivo do Tipo Americano sob aDesignação do Depósito de Patente PTA-6170 e PTA-617.

19.Planta descendente de uma planta do milho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 18.

20. Planta híbrida produzida a partir da planta descendente deacordo com a reivindicação 19.

21. Planta de nascimento natural produzida a partir da plantadescendente de acordo com a reivindicação 19.

22. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 21, em que a dita planta está compreendendo o dito T-DNA transgênicoou o dito constructo de genes heterólogos.

23. Parte de uma planta do milho como definida em qualqueruma das reivindicações de 16 a 22.

24. Parte da planta de acordo com a reivindicação 23, em que aparte é selecionada a partir do grupo consistindo no tecido, das células, dopólen, da oosfera (óvulo), das raízes, das folhas, das sementes, dos micros-poros e das partes vegetativas.

25. Método para a transformação subseqüente de pelo menosdois constructos de DNA em uma planta compreendendo as etapas de:

26. Planta descendente de uma planta do milho de acordo coma) uma primeira transformação com um primeiro cosntructo, odito constructo compreendendo um primeiro gene ahasmutado marcador de seleção, o dito primeiro gene confe-rindo resistência ao imazetapir, mas sendo sensível ao i-mazaquin, e selecionando as plantas resistentes ao imaze-tapir, eb) uma segunda transformação com um segundo cosntructo,o dito constructo compreendendo um segundo gene ahasmutado marcador de seleção, o dito segundo gene confe-rindo resistência tanto ao imazetapir quanto ao imazaquin,e selecionando as plantas resistentes ao imazaquin.26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o ditoprimeiro gene é um gene ahas mutante Xl 12 e/ou em que o dito segundogene é um gene ahas mutante XA17.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, em que ogene ahas mutante XA17 é descrito por:i) uma seqüência de aminoácidos tal como descrito pela SEQID NQ: 3 ouii) uma seqüência tendo pelo menos 60% de homologia coma seqüência tal como descrita pela SEQ ID NO.: 3 e tendoum resíduo da Ieucina na posição correspondendo à posi-ção 542 da SEQ ID NO.: 3 sendo capaz de conferir resis-tência contra os herbicidas imazetapir e do imazaquin.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-25 a 27, em que a dita planta é uma planta Zea mays.

29. Célula da planta ou a planta compreendendo um:a) um primeiro gene ahas mutado marcador de seleção, o ditoprimeiro gene conferindo resistência ao imazetapir, massendo sensível ao imazaquin, e selecionando as plantasresistentes ao imazetapir, eb) um segundo gene ahas mutado marcador de seleção, odito segundo gene conferindo resistência tanto ao imazeta-pir quanto ao imazaquin.

30. Célula da planta ou a planta de acordo com a reivindicação-29, em que o dito primeiro gene é um gene ahas mutante Xl 12 e/ou em queo dito segundo gene é um gene ahas mutante XA17.

31. Célula da planta ou a planta de acordo com a reivindicação-29 ou 30, em que o dito primeiro e o dito segundo genes são transgenes.

32. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações de-29 a 31, em que a dita planta é uma planta Zea mays.