DE10107676A1 - Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts durch samenspezifische Expression eines gegen Abscisinsäure gerichteten Antikörpers.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts durch samenspezifische Expression eines gegen Abscisinsäure gerichteten Antikörpers.

Das Phytohormon Abscisinsäure (ABA, abscisic acid, (S)-5-(1-Hydroxy-2,6,6-trimethyl-4- oxo-2-cyclohexenyl)-3-methyl-cis/trans-2,4-pentadiensäure) ist ein allgemein verbreitetes Sesquiterpen mit dem Gerüst der Jonone, das u. a. bei der Regulation der Samenreifung eine wichtige Rolle spielt (Übersicht bei Giraudat et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1557-1577). ABA ist verantwortlich für die Ausprägung der Samendormanz (Koornneef (1986) Genetic aspects of abscisic acid. Plant genetic research, a genetic approach to plant biochemistry. Blonstein AD, King PJ (eds.) Wien, Springer-Verlag, 35-54), kontrolliert die Reserveglobulinsynthese (Finkelstein and Sommerville (1990) Plant Physiol. 94, 1172-­ 1179) und die Austrocknungstoleranz (Kermode and Bewley (1987) Regulatory processes involved in the switch from seed development to germination: Possible roles for dessication and ABA. Drought resistance in plants. Physiological and genetic aspects. Monti L., Porceddu E. (eds.) Brüssel, EEC, 59-76). Im Stand der Technik wurden zum Studium dieser Phänomene bereits neben Mutanten auch transgene Pflanzen eingesetzt, die einen rekombinanten Antikörper gegen ABA im endoplasmatischen Retikulum sich entwickelnder Embryonen zu hohen Konzentrationen akkumulierten. Bei hoher Konzentration des Antikörpers im Embryo zeigten diese Samen vivipare Erscheinungen, die Reserveglobuline waren im Embryo nicht mehr nachweisbar und die Ölkörper kaum vorhanden (Phillips et al. (1997) EMBO J. 16: 4489-4496). Die Expression ABA-spezifischer Antikörper im Samen wurde auch beschrieben von A. Marion-Poll in Trends in Plant Science (1997) 2: 447-448. Ein Zusammenhang zwischen Abscisinsäure und dem Ölgehalt in Pflanzensamen wurde im Stand der Technik bisher nicht erwähnt.

Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, daß der Ölgehalt in Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts erhöht werden kann. Die Erhöhung des Ölgehalts in Pflanzen und insbesondere in Pflanzensamen ist für die klassische wie für die moderne Pflanzenzüchtung und insbesondere die pflanzliche Biotechnologie von großem Interesse.

Dabei ist die Erhöhung des Ölgehalts zum einen aus ernährungstechnischer Sicht vorteilhaft, zum anderen können in Pflanzen bzw. in Pflanzensamen synthetisierte und akkumulierte Fettsäuren für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt werden.

Fettsäuren, die in sämtlichen pflanzlichen und tierischen Fetten und vor allem in pflanzlichen Ölen und Fischölen sowie in Mikroorganismen vorkommen, sind vielseitig einsetzbar. Beispielsweise kann ein Mangel an essentiellen Fettsäuren, also Fettsäuren, die im Organis­ mus nicht synthetisiert werden können und daher mit der Nahrung zugeführt werden müssen, zu Hautveränderungen und Wachstumsstörungen führen, weshalb Fettsäuren u. a. bei Ekzemen, Psoriasis, Verbrennungen und dergleichen, sowie auch in der Kosmetik eingesetzt werden. Weiter finden Fettsäuren und Öle in Wasch- und Reinigungsmitteln, als Deter­ gentien, als Farbzusätze, Schmier- und Gleitstoffe, Verarbeitungshilfen, Emulgationshilfen, Hydrauliköle und als Trägeröle in pharmazeutischen und kosmetischen Erzeugnissen Anwendung. Als nachwachsende Rohstoffe im chemisch-technischen Sektor werden natürliche Fette und Öle tierischen (beispielsweise Talg) und pflanzlichen (beispielsweise Kokosnuß-, Palmkern- oder Rapsöl) Ursprungs eingesetzt. Die Einsatzbereiche pflanzlicher Öle wurden in den letzten zwanzig Jahren deutlich erweitert. Mit steigendem Umwelt­ bewußtsein entwickelte man beispielsweise umweltverträgliche Schmierstoffe und Hydraulik­ öle. Weitere Anwendungen finden Fettsäuren und Fette als Nahrungsmittel bzw. Nahrungs­ mittelzusatz, beispielsweise in der parenteralen Ernährung, bei Backhilfen, in der Baby-, Senioren- und Sportlerkost, in Schokoladenmassen, Kakaopulver und als Backfette, zur Herstellung von Seifen, Salben, Kerzen, Malerfarben und Textilfarben, Firnissen, Heiz- und Beleuchtungsmitteln.

Pflanzenzüchterische Ziele sind insbesondere die Erhöhung des Gehalts von Fettsäuren in Samenölen. So besteht in Bezug auf Industrieraps und alternative Produktionsbereiche für die Landwirtschaft ein Zuchtziel in der Gewinnung von Rapsöl mit Fettsäuren mittlerer Ketten­ länge, da diese besonders in der Tensidherstellung begehrt sind. Neben dem Gedanken, pflanzliche Öle als Industrierohstoffe zu verwenden, besteht die Möglichkeit, sie als Biotreib­ stoff einzusetzen.

Es besteht daher allgemein ein Bedarf an der Bereitstellung von Fettsäuren, die beispielsweise als Grundstoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Pestizide, Tenside, Kosmetika usw. indus­ triell einsetzbar und/oder nahrungsmitteltechnologisch wertvoll sind. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung von Fettsäuren besteht in der Extraktion der Fettsäuren aus Pflanzen oder Mikroorganismen, die besonders hohe Gehalte an den erwünschten Fettsäuren aufweisen. Die Erhöhung des Gehalts an beispielsweise mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen auf klassischem Wege, also durch Züchtung von Pflanzen, die in erhöhtem Maße diese Fettsäuren produzie­ ren, konnte bisher nur bedingt erreicht werden. Man ist daher besonders an modernen, bio­ technologischen Ansätzen in der Pflanzenzüchtung interessiert.

Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Öl- und Fettsäure­ gehalts in transgenen Pflanzen und insbesondere in transgenen Pflanzensamen bereitzustellen. Insbesondere soll ein zuverlässiges Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welches sowohl die Herstellung als auch die Identifizierung gewünschter transgener Pflanzen bzw. transgener Pflanzensamen mit erhöhtem Ölgehalt ermöglicht.

Diese und weitere Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Patentan­ sprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert.

Jüngste Untersuchungen zeigten, daß die im Stand der Technik von Phillips et al. (1997, vide supra) beobachtete Schädigung der Ölkörper durch Expression eines rekombinanten Antikörpers gegen ABA nur im Hypocotyl deutlich ausgeprägt war, während im Bereich der Cotyledonen die Ölkörper bei mehreren transgenen Linien noch vorhanden waren. Die Bestimmung des Gesamtgehaltes an Fettsäuren, der im Rahmen dieser Patentanmeldung auch als Ölgehalt bezeichnet wird, zeigte keine Unterschiede zwischen den Kontrollpflanzen (die einen rekombinanten Antikörper gegen Oxazolon in vergleichbarer Höhe samenspezifisch unter Kontrolle des USP-Promotors, lokalisiert im Endoplasmatischen Retikulum, exprimierten) und den Wildtyppflanzen, obwohl im Bereich des Hypocotyls sich offensichtlich die Ölkörper auflösten und mit einer Erniedrigung des Ölgehaltes gerechnet werden mußte.

Des weiteren wurden jetzt auch transgene Linien untersucht, die relativ wenig des im Stand der Technik von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen anti-ABA-Antikörpers akkumulierten, nämlich < 1% TSP (total soluble protein) im Samen transgener Pflanzen. Diese Linien zeigten keine viviparen Erscheinungen, dagegen aber einen signifikant erhöhten Ölgehalt, wobei die Erhöhung des Ölgehalts bis zu 80% betrug.

Es wurde somit gefunden, daß transgene Pflanzensamen, in denen relativ wenig anti-ABA- Antikörper akkumulierte, eine beträchtliche Steigerung des Ölgehalts gegenüber Wildtypsamen zeigen.

Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, daß es durch die teilweise Immunmodulation der ABA-Wirkung im Samen bei einem bestimmten Grad der Bindung durch ABA durch den Antikörper zu einer Umlagerung der Speicheraktivitäten kommt, die zu einer bevorzugten Speicherung von Öl führt. Bei einem höheren Grad der Immunmodulation wird, so wird gegenwärtig vermutet, der gesamte Prozeß der Bildung von Speichervakuolen gestört und die erhöhte Ölakkumulation wird durch Ölverluste im Hypocotyl (Ölkörperlyse) ausgeglichen.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen, wobei die Erhöhung des Ölgehalts durch Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung und insbesondere des Abscisinsäuregehalts in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzensamen bewirkt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beeinflussung des Gehalts wirksamer Abscisinsäure in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Expression eines rekombinanten anti-ABA-Antikörpers vermittelt. "Wirksame Abscisinsäure bedeutet hier, Abscisinsäure, die nicht vom anti-ABA-Antikörper gebunden ist und die nicht im "falschen" Kompartiment, wo sie nicht die gewünschte Wirkung entfalten kann, festgehalten wird.

Besonders bevorzugt wird der gegen ABA gerichtete Antikörper samenspezifisch exprimiert, d. h. die für den anti-ABA-Antikörper kodierende Nukleinsäure wird unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors im Samengewebe transgener Pflanzen exprimiert.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem samenspezifischen Promotor um den USP- Promotor, unter dessen Kontrolle der anti-ABA-Antikörper exprimiert wird. Dieser Promotor gewährleistet eine relativ frühe und hohe Expression in der Samenentwicklung, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung sehr vorteilhaft ist.

Der USP-Promotor wurde erstmals von Bäumlein et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 459-­ 467) beschrieben und sein Einsatz als samenspezifischer Promotor ist während der letzten Jahre häufig in wissenschaftlichen Publikationen sowie in Patentdokumenten beschrieben worden. Im Zusammenhang mit dem USP-Promotor sowie dem anti-ABA-Antikörper wird hiermit ausdrücklich auf die Offenbarung in dem bereits oben erwähnten Artikel von Phillips et al. (1997, vide supra) Bezug genommen, da dieser Artikel die Synthese und Expression eines im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörpers in transgenen Pflanzensamen im Detail beschreibt und dem Fachmann einen Weg für die praktische Umsetzung der hier beschriebenen Erfindung liefert. Der ausdrückliche Verweis auf den Artikel von Phillips et al. (1997, vide supra) dient der Vermeidung von Wiederholungen.

Auch die Detektion transgener Pflanzenlinien, die den gewünschten Expressions- bzw. Akkumulationslevel an anti-ABA-Antikörpern im Samen aufweisen, ist für den Durchschnittsfachmann mittels einfacher und schneller Routinemethoden durchführbar. Hier bietet sich z. B. ein Western-Blot an, um die Akkumulation des anti-ABA-Antikörpers im Pflanzensamen zu quantifizieren. Darüber hinaus sind dem Fachmann weitere Nachweis­ methoden bekannt, um die Antikörperakkumulation im Samen zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmen zu können.

Wie oben erwähnt zeigen die transgenen Pflanzensamen bevorzugt eine relativ geringe Akkumulation an anti-ABA-Antikörpern im Samen, wobei eine relativ geringe Akkumulation im Rahmen dieser Erfindung eine Akkumulation des Antikörpers von vorzugsweise ≦ 1,0% TSP im Samen und besonders bevorzugt ≦ 0,7% TSP im Samen bedeutet, wobei die Antikörperkonzentration im Samen mindestens 0,01% TSP betragen sollte.

TSP steht für "total soluble protein", also gesamtes lösliches Protein (siehe z. B. Conrad and Fiedler (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 und darin erwähnte Literatur).

In einer weiteren Ausführungsform wird die Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts durch direkte Modulation der ABA-Biosynthese bewirkt, wobei auch hier eine samenspezifische Modulation bevorzugt ist.

So kann z. B. durch Erzeugung geeigneter Mutanten, in denen die natürliche ABA- Biosynthese gestört ist und die aufgrund dieser Störung erniedrigte ABA-Gehalte aufweisen, die oben im Zusammenhang mit der Expression von ABA-spezifischen Antikörpern beschriebene Erhöhung des Ölgehalts erreicht werden. Beispiele für ABA-defiziente Mutanten sind bereits bekannt und betreffen vor allem pflanzliche Gene für Aldehydoxidase, die die Oxidation von Abscisinaldehyd zu ABA katalysiert und deren Inaktivierung in einem reduzierten ABA-Gehalt resultiert (siehe z. B. Seo et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12908-12913). Neben Aldehydoxidase können andere Enzyme durch Mutation inaktiviert bzw. in ihrer Aktivität gehemmt werden, die an der ABA-Synthese beteiligt sind und deren Beeinflussung in einer Erniedrigung des ABA-Gehalts in Pfanzenzellen resultiert.

Ein weiteres im Rahmen der Erfindung einsetzbares Gen bzw. Genprodukt, das an der ABA- Biosynthese beteiligt ist, ist die Zeaxanthin-Epoxidase (Audran et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 1267-1274; Audran et al. (1998) Plant Physiol. 118: 1021-1028; Mann et al. (1996) EMBO J. 15: 2331-2342).

In einer weiteren Ausführungsform wird die Modulation der ABA-Biosynthese nicht durch Mutation der in die Biosynthese involvierten Gene bewirkt, sondern durch Cosuppressions- bzw. Antisense-Ansätze, bei denen geeignete sense- bzw. antisense-Konstrukte in transgenen Pflanzen und vorzugsweise im Samengewebe exprimiert werden.

Sowohl die Erzeugung von Pflanzen, in denen die ABA-Biosynthese durch Mutationen in den ABA-Biosynthesegenen gehemmt ist, als auch die Erzeugung von Pflanzen, in denen die ABA-Biosynthese durch Übertragung und Expression von sense- bzw. antisense-Konstrukten für ABA-Biosynthesegene verringert ist, ist dem Fachmann mittels molekularbiologischer Routinemethoden und herkömmlicher Transformationstechniken ohne Probleme möglich.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Modulation der ABA-Wirkung durch Inhibition von Enzymen, die an der ABA-Biosynthese beteiligt sind, mittels spezifischer Antikörper bewerkstelligt werden. In diesem Fall wäre der Antikörper also nicht gegen ABA gerichtet, sondern z. B. gegen die oben erwähnte Aldehydoxidase, was ebenfalls zu der gewünschten Erniedrigung der ABA-Konzentration in der Pflanzenzelle führen würde. Auch die Möglichkeit der Immunmodulation ist für den Fachmann problemlos umsetzbar, da die Expression spezifischer Antikörper in Pflanzen bereits seit vielen Jahren gut etabliert ist; siehe z. B. Fiedler et al. (1997) Immunotechnology 3: 205-216; Conrad and Fiedler (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (Review); De Jaeger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 43: 419-428.

In einer weiteren Ausführungsform wird die ABA-Biosynthese durch Applikation eines Inhibitors gehemmt und dadurch die gewünschte Steigerung des Ölgehalts bewirkt. Als Hemmstoff eignet sich z. B. Fluridon, der sich bereits bei Embryonen von Luzerne und Senf als ABA-Biosynthesehemmer bewährt hat (Xu et al. (1995) J. Exp. Botany 46: 687-694; Fischer et al. (1983) In. Krueger and La Bege (eds.) II: Int. Symp. On pre-harvested sprouting in cereals, Boulder, Col. Westview Press, Seiten 188-196).

In jedem Fall muß der Fachmann im Anschluß an die Erzeugung der Pflanzen, diejenigen Pflanzen selektieren, die neben einem verringerten ABA-Gehalt auch einen erhöhten Ölgehalt aufweisen. Wie bereits erwähnt, stehen auch hier dem Fachmann diverse Standardmethoden zur Verfügung.

Wie bereits erwähnt, ist die auf den Samen beschränkte Modulation der ABA-Wirkung im Unterschied zur systemischen Beeinflussung des ABA-Gehalts in der gesamten Pflanze bevorzugt. Ein wesentlicher Grund hierfür liegt darin, daß die Modulation von ABA- Wirkungen in allen Zellen die Pflanze physiologisch so verändern würde, daß praktisch nur noch ein Wachstum bei 95% Luftfeuchtigkeit möglich wäre.

Die Herstellung erfindungsgemäßer Nukleinsäurekonstrukte ist dem Fachmann mittels Standardmethoden möglich, wie sie beispielsweise von Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Coldspring Harbour, Laboratory Press, Coldspring Harbour, New York, beschrieben sind. Gleiches gilt für die Einführung von Mutationen, die Herstellung von sense- und antisense-Konstrukten, die Herstellung von Antikörperkonstrukten etc. Wie oben erwähnt sind dem Fachmann auch geeignete samenspezifische Promotorregionen bekannt, neben dem bereits erwähnten USP-Promotor sind hier beispielsweise zu nennen der LeB4-Promotor (Nagj I. (1990) Untersuchung zu Expression und Regulation samenspezifischer Gene von Vicia faba, Dissertation, Universität Halle) und der DC3- Promotor (Steffens et al. (1990) Dev. Genet. 11: 65-76). Geeignet sind auch der Napin- Promotor (Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1019-1027) und der FatB4-Promotor. Diese samenspezifischen Promotoren können sowohl für anti-sense- als auch sense- Konstrukte eingesetzt werden, um Veränderungen des Abscisinsäure-Biosynthesewegs mit dem Ziel einer Verminderung des Abscisinsäuregehalts in den Samen zu erreichen.

Da auch eine Erhöhung des Ölgehalts in z. B. Ölpalmenfrüchten und Oliven von großem pflanzenzüchterischen Interesse ist, stellt die fruchtspezifische Expression von anti-ABA- Antikörpern ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Gleiches gilt selbstverständlich für die anderen oben genannte Wege zur Erniedrigung des ABA-Gehalts.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün­ schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen­ det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und an­ schließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmetho­ de zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions­ analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden ein­ gesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Tech­ niken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierig­ keiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe­ ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Zellen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken­ bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer­ den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme­ diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region.

Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas­ mids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon­ jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro­ bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor­ mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen­ dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans­ formation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan­ zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengel­ segmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen­ zellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Genta­ mycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestat­ ten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek­ tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.

Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli­ chen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure bzw. des von der Nukleinsäure kodierten Proteins untersucht werden.

Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, für die eine Erhöhung des Ölgehalts im Samengewebe erwünscht ist. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Ölsaaten und am meisten bevorzugt um Lein, Raps, Rübsen, Sonnenblume und Sojabohne.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschau­ lichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.

Beispiele Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Tabaksamen durch Expression eines rekombinanten anti-ABA-Antikörpers in den Samen

Die Erzeugung transgener Pflanzen, das verwendete Nukleinsäurekonstrukt, das für den anti- ABA-Antikörper unter Kontrolle des USP-Promotors kodiert, die Bestimmung des ABA- Gehalts durch ELISA, die Durchführung von Western-Blots zur Quantifizierung des anti- ABA-Antikörpers, die gelektrophoretische Analyse der Reserveglobuline im Tabaksamen bzw. Tabakembryo wurden gemäß Phillips et al. (1997, vide supra) durchgeführt. Auf die gesamte Offenbarung dieses Artikels aus dem Jahr 1997 wird hiermit zwecks Vermeidung von Wiederholungen Bezug genommen.

Die Lipidanalyse wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Für die Analyse des Gesamtfettsäuregehalts von transgenen Tabaksamen wurden 1 mg der Samen durch Zugabe von 405 µl eines Gemischs von Toluol und Methanol (1 : 1 v/v) und von 105 µl von 0,5 mM Natriummethoxid-Lösung in Methanol im Mörser homogenisiert. Als internen Standard wurden 100 µg Triheptadecanoat hinzugegeben. Nach Inkubation der Proben für 20 Min. wurden 0,5 ml von 1 mM Natriumchlorid hinzugegeben und die Fettsäuremethylester wurden zweimal mit 0,5 ml Heptan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit verdampft und die entsprechenden Fettsäuremethylester wurden in 10 µl Acetonitril wieder aufgenommen. Anschließend wurde 1 µl einer jeden Probe mittels Gaschromatographie (GC) analysiert. Die GC-Analyse wurde mit einem Agilent GC 6890-System, gekoppelt mit einem FID-Detektor, ausgestattet mit einer HP INNOVAX-Kapillarsäule (30 m × 0,32 mm; 0,5 µm Beschichtungsdicke; Agilent, Deutschland) durchgeführt.

Helium wurde als Trägergas verwendet (30 cm × s^-1). Die Proben wurden mit einem Splitverhältnis von 60 : 1 und mit einer Injektortemperatur von 220°C gemessen. Der Temperaturgradient war 150°C für 1 Min., 150°C-200°C bei 15°C/Min., 200°C-250°C bei 2°C/Min. und 250°C für 10 Min. Sämtliche Fettsäuren wurden durch Coinjektion mit authentischen Standards identifiziert und der Ölgehalt durch Addition der Mengen der einzelnen Fettsäuren bestimmt.

Wie oben erwähnt basiert die vorliegende Erfindung auf den von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen transgenen Pflanzen, die vivipare Erscheinungen in den sich entwickelnden Samen zeigen. Allerdings wurden im Stand der Technik nur hochexprimierende Pflanzen untersucht, die in den Cotelydonen weder "protein bodies" noch Ölkörper enthalten. Jüngste elektronenmikroskopische Untersuchungen von Embryonen anhand von Schnitten aus verschiedenen Bereichen des Embryos zeigten, daß zwar überall die "protein bodies" fehlten, aber die Ölkörper nur im mittleren Bereich des Embryos, nämlich im Hypocotyl, nicht mehr vorhanden waren. Aus dieser Beobachtung ergab sich die Vermutung, daß die Ölkörperbildung und die "protein body"-Bildung während der Samenentwicklung zwar beide durch Abscisinsäure reguliert werden, aber nicht streng aneinander gekoppelt sind. Es wurde daher eine Serie von 60 unabhängigen transgenen Pflanzen (TG0-Pflanzen, also TG1-Samen, Bezeichnung: BU1 bis BU60) untersucht und hier eine hohe Variabilität im Ölgehalt von 400-800 µg/mg (µg Fettsäuren/mg Samengewebe) festgestellt. Nicht­ transgene Pflanzen wiesen einen Gehalt von 400 µg/mg auf.

Da TG1-Samen genetisch nicht einheitlich sind, wurden die Samen von TG2-Pflanzen, also TG3-Samen verschiedener Primärlinien untersucht. Alle in diesen Versuch eingeschlossenen Samen wurden parallel im Gewächshaus zum selben Zeitpunkt angezogen und geerntet, wobei sowohl hochexprimierende Linien als auch geringere Antikörpermengen akkumulierende Linien in das Experiment eingeschlossen wurden. Als Kontrollen dienten parallel zum selben Zeitpunkt angezogene Wildtyppflanzen und anti-Oxazolon scFv transgene Linien (20U-18, Phillips et al. (1997, vide supra), Fiedler et al. (1997, vide supra)). Von diesen Linien wurden zunächst die Antikörperkonzentration durch Western-Blot und die ABA-Konzentration durch ELISA bestimmt (siehe unten stehende Tabelle 1).

Darüber hinaus wurde beobachtet, daß in den hoch exprimierenden Linien (BU18, BU22 und BU24 in Tabelle 1 bzw. Bezeichnung ohne BU in Fig. 1) die von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen morphologischen Veränderungen auftraten, nämlich Ergrünung, Embryowachstum und teilweise Viviparie. Die Linien BU31 und BU61 hingegen waren nur teilweise etwas ergrünt. Um diese Befunde durch einen weiteren Parameter zu unterstützen, wurde auf Transkriptebene die Expression der kleinen Hitzeschockproteine (hsp17) untersucht (ebenfalls in Tabelle 1). Kleine Hitzeschockproteine werden ebenfalls im Samenreifungsprozeß synthetisiert.

Tabelle 1

Antikörpergehalt, ABA-Gehalt und Transkriptmenge der kleinen Hitzeschockproteine von transgenen BU-Samen und Kontrollsamen

Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der ABA-Gehalt in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration steigt, daß die Linien BU31 und BU61 relativ wenig ABA- Antikörper produzieren und BU31 im reifen Samen einen leicht erhöhten ABA-Gehalt aufweist, während BU61 dies nicht zeigt. Weiter zeigen die Ergebnisse, daß bei hohem Antikörpergehalt die Hitzeschockprotein (hsp)-Transkripte fast völlig wegfallen, und die hsp- Transkripte bei niedrigem Antikörpergehalt ebenfalls deutlich verringert sind.

Untersuchungen der Reserveproteine zeigten, daß diese nur bei hoch exprimierenden Linien, wie BU18, BU22 und BU24, sehr stark verringert auftreten. Daraus folgt, daß in Folge der samenspezifischen Immunmodulation der ABA-Funktion einzelne Parameter unterschiedlich reguliert werden. Überraschende Einflüsse zeigten sich bei der Analyse des Ölgehaltes (siehe Fig. 1). Nur wenig Antikörper produzierende Linien zeigen einen deutlich erhöhten Ölgehalt. Durch differentielle samenspezifische Immunmodulation der ABA-Funktion wurde eine Situation erzeugt, die erhöhte Ölakkumulation und nicht signifikant verminderte Reserveglobulinsynthese ermöglicht. Diese Situation ist ABA-immunmodulationsspezifisch, wie normale Ölgehalte in SNN- und 20U/18-Samen (anti-Oxazolon-Antikörper, ist spezifisch für ein anderes Antigen und bindet nicht an ABA) beweisen.

Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Samen durch Expression eines sense- oder antisense- Konstrukts, in dem die für ABA-Aldehydoxidase, vorzugsweise für ABA-Aldehydoxidase 3 (siehe Seo et al. (2000), vide supra), kodierende Nukleinsäuresequenz in sense- bzw. antisense-Orientierung unter Kontrolle eines Samen-spezifischen Promotors, vorzugsweise unter Kontrolle des USP-Promotors steht.

Konstrukte

Durch Analyse des Ölgehaltes können transgene Pflanzen mit durch ABA-Reduktion erhöhtem Ölgehalt selektiert werden.

Figuren

Fig. 1 zeigt den Ölgehalt transgener Tabaksamen verschiedener transgener Linien.

Claims (12)

1. Verfahren zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzen und/oder Pflanzensamen, wobei die Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts durch Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung in der Pflanze und/oder den Pflanzensamen bewirkt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung eine Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts eine Erniedrigung des Abscisinsäuregehalts ist.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung durch Expression eines rekombinanten anti-Abscisinsäure-Antikörpers vermittelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der anti-Abscisinsäure-Antikörper unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Promotor der USP-Promotor ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Akkumulation des anti- Abscisinsäure-Antikörpers im Samen ≦ 1,0%, vorzugsweise ≦ 0,7%, des gesamten löslichen Proteins ausmacht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung durch Übertragung und Expression eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in transgenen Pflanzen und/oder Pflanzensamen vermittelt wird, wobei in dem Nukleinsäuremolekül eine für ein an der Abscisinsäure-Biosynthese beteiligtes Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz in sense- oder antisense-Orientierung unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Enzym um Aldehyd-Oxidase, vorzugsweise Aldehyd-Oxidase 3 handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der samenspezifische Promotor der USP-Promotor ist.

11. Transgene Pflanze und/oder Pflanzensamen, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.

12. Verwendung von Antikörpern, die gegen Abscisinsäure oder gegen an der Abscisinsäure-Biosynthese beteiligte Enzyme gerichtet sind, zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzensamen.