JP2003164238A - レギュカルチン過剰発現モデル動物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 元来高等動物の肝臓等に発現しているレギュ
カルチンを過剰に発現する、骨粗鬆症に代表される骨病
態等のレギュカルチン過剰発現モデル動物を提供するこ
と。 【解決手段】 ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレ
ギュカルチンｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチ
ン蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡを単離し、このラ
ットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦを切り出
し、発現ベクター（pCXN2）に導入し、この遺伝子発現
ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェク
ションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔
ラットを発生させ、その産仔からホモ体のラットを作出
する。かかるトランスジェニックラットは、形態学的に
も生化学的にも顕著な骨病態を呈し、また、体重の増加
が有意に抑制される。
カルチンを過剰に発現する、骨粗鬆症に代表される骨病
態等のレギュカルチン過剰発現モデル動物を提供するこ
と。 【解決手段】 ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレ
ギュカルチンｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチ
ン蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡを単離し、このラ
ットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦを切り出
し、発現ベクター（pCXN2）に導入し、この遺伝子発現
ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェク
ションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔
ラットを発生させ、その産仔からホモ体のラットを作出
する。かかるトランスジェニックラットは、形態学的に
も生化学的にも顕著な骨病態を呈し、また、体重の増加
が有意に抑制される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レギュカルチン遺
伝子導入トランスジェニック非ヒト動物、詳しくは、レ
ギュカルチン遺伝子が導入され体重増加抑制能を有する
トランスジェニック非ヒト動物や、かかるトランスジェ
ニック非ヒト動物を用いるレギュカルチンの製造方法
や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治
療薬のスクリーニング方法や、レギュカルチン発現低下
に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法等に関
する。また本発明は、骨粗鬆症に代表される骨病態のモ
デル動物、より詳しくは、レギュカルチンを過剰発現す
る非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価や骨成分の生
化学的測定評価により選抜・確認され、骨組織の脆弱
化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨病態を呈する骨病態
モデル動物や、該骨病態のモデル動物を用いた骨粗鬆症
に代表される骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方
法に関する。
伝子導入トランスジェニック非ヒト動物、詳しくは、レ
ギュカルチン遺伝子が導入され体重増加抑制能を有する
トランスジェニック非ヒト動物や、かかるトランスジェ
ニック非ヒト動物を用いるレギュカルチンの製造方法
や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治
療薬のスクリーニング方法や、レギュカルチン発現低下
に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法等に関
する。また本発明は、骨粗鬆症に代表される骨病態のモ
デル動物、より詳しくは、レギュカルチンを過剰発現す
る非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価や骨成分の生
化学的測定評価により選抜・確認され、骨組織の脆弱
化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨病態を呈する骨病態
モデル動物や、該骨病態のモデル動物を用いた骨粗鬆症
に代表される骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドホルモンが細胞膜の受容体に結
合し、細胞内にその情報を伝達する仕組みの中で、Ｃａ
2+は主役を演じている。細胞内にはＣａ2+を結合する多
くのタンパク質が存在するが、その作用を増幅するタン
パク質として、カルモジュリンは重要な役割を果たして
おり、Ｃａ2+はこのカルモジュリンに結合し、細胞機能
の調節に関与する各種の酵素を活性化することが解明さ
れている（Science, 202, 19-27, 1984）。また、Ｃａ
2+がプロテインキナーゼＣやその他のＣａ2+結合タンパ
ク質（酵素も含む）に作用することも知られている（Sc
ience, 233, 305-312, 1986）。レギュカルチンも、本
発明者らによりラット肝細胞質から単離されたＣａ2+結
合蛋白質である。
合し、細胞内にその情報を伝達する仕組みの中で、Ｃａ
2+は主役を演じている。細胞内にはＣａ2+を結合する多
くのタンパク質が存在するが、その作用を増幅するタン
パク質として、カルモジュリンは重要な役割を果たして
おり、Ｃａ2+はこのカルモジュリンに結合し、細胞機能
の調節に関与する各種の酵素を活性化することが解明さ
れている（Science, 202, 19-27, 1984）。また、Ｃａ
2+がプロテインキナーゼＣやその他のＣａ2+結合タンパ
ク質（酵素も含む）に作用することも知られている（Sc
ience, 233, 305-312, 1986）。レギュカルチンも、本
発明者らによりラット肝細胞質から単離されたＣａ2+結
合蛋白質である。
【０００３】レギュカルチンは、分子量が３３３８８の
Ｃａ2+結合タンパク質で、そのＣａ 2+結合定数が４．１
９×１０5Ｍ-1を示し、６〜７個の高親和性Ｃａ2+結合
部位を持ち、α−ヘリックス構造を３４％含む、肝臓に
顕著に存在する等電点ｐＩ５．２０の酸性蛋白質であ
る。レギュカルチンは、カルモジュリンや他の多くのＣ
ａ2+結合タンパク質にみられる部位ＥＦハンド構造（領
域）を含まない特異なタンパク質で、例えば、Ｃａ2+を
結合することにより、カルモジュリンはα−ヘリックス
含量が増加し、その構造が堅固になるが、レギュカルチ
ンはα−ヘリックス含量が減少する。また一方、細胞機
能調節において、レギュカルチンは、カルモジュリンに
よる酵素活性化を阻害し、プロティンキナーゼＣの活性
化をも阻害することが明らかになっている。このよう
に、レギュカルチンは、シグナリングの制御タンパク質
として機能するなど多くの知見が蓄積されている（FEBS
Lett,327, 251-255, 1993）。
Ｃａ2+結合タンパク質で、そのＣａ 2+結合定数が４．１
９×１０5Ｍ-1を示し、６〜７個の高親和性Ｃａ2+結合
部位を持ち、α−ヘリックス構造を３４％含む、肝臓に
顕著に存在する等電点ｐＩ５．２０の酸性蛋白質であ
る。レギュカルチンは、カルモジュリンや他の多くのＣ
ａ2+結合タンパク質にみられる部位ＥＦハンド構造（領
域）を含まない特異なタンパク質で、例えば、Ｃａ2+を
結合することにより、カルモジュリンはα−ヘリックス
含量が増加し、その構造が堅固になるが、レギュカルチ
ンはα−ヘリックス含量が減少する。また一方、細胞機
能調節において、レギュカルチンは、カルモジュリンに
よる酵素活性化を阻害し、プロティンキナーゼＣの活性
化をも阻害することが明らかになっている。このよう
に、レギュカルチンは、シグナリングの制御タンパク質
として機能するなど多くの知見が蓄積されている（FEBS
Lett,327, 251-255, 1993）。
【０００４】レギュカルチン遺伝子は、ラットにおいて
Ｘ染色体（Xq 11.1-12）に存在し、ヒトにおいてもＸ染
色体に位置する。レギュカルチン遺伝子は、ラットやヒ
トの他、サル，マウス，イヌ，ウシ，ウサギ，ニワトリ
等の高等動物に見い出されているが酵母にはなく、高度
に分化されたタンパク質をコードするものと考えられて
いる。レギュカルチンｃＤＮＡはクローニングされてお
り、その全構造も決定されている（特開平７−１２３９
８５号公報）。ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡは、
全アミノ酸をコードする塩基対が０．８９７ｋｂであ
り、２９９のアミノ酸を翻訳する。また、マウス肝やヒ
ト肝のレギュカルチンｃＤＮＡの塩基配列も決定されて
おり、ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡと比較して、
それぞれ９４％と約８９％のホモロジーを有している。
レギュカルチンｍＲＮＡの発現は、ヒト，ラット，マウ
ス，ウシ，ニワトリ等の肝臓においてみられ、これらの
肝臓にはレギュカルチンタンパク質の存在も確認されて
いる。
Ｘ染色体（Xq 11.1-12）に存在し、ヒトにおいてもＸ染
色体に位置する。レギュカルチン遺伝子は、ラットやヒ
トの他、サル，マウス，イヌ，ウシ，ウサギ，ニワトリ
等の高等動物に見い出されているが酵母にはなく、高度
に分化されたタンパク質をコードするものと考えられて
いる。レギュカルチンｃＤＮＡはクローニングされてお
り、その全構造も決定されている（特開平７−１２３９
８５号公報）。ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡは、
全アミノ酸をコードする塩基対が０．８９７ｋｂであ
り、２９９のアミノ酸を翻訳する。また、マウス肝やヒ
ト肝のレギュカルチンｃＤＮＡの塩基配列も決定されて
おり、ラット肝のレギュカルチンｃＤＮＡと比較して、
それぞれ９４％と約８９％のホモロジーを有している。
レギュカルチンｍＲＮＡの発現は、ヒト，ラット，マウ
ス，ウシ，ニワトリ等の肝臓においてみられ、これらの
肝臓にはレギュカルチンタンパク質の存在も確認されて
いる。
【０００５】レギュカルチンは、多機能性を有する細胞
内Ｃａ2+シグナリングの制御蛋白質として特徴を有する
蛋白質であり、細胞機能調節に関与する重要な蛋白質で
あることが知られている（Life Sciences 66, 1769-178
0, 2000、Biochemical and Biophysical Research Comm
unications 276, 1-6, 2000）。また、生体内における
肝臓や腎臓におけるレギュカルチンの発現が肝障害（Mo
lecular and CellularBiochemisty 131, 173-179, 199
4）や腎障害（Molecular and Cellular Biochemisty 15
1, 55-60, 1995）時に低下することが動物実験的に明ら
かにされており、レギュカルチンと病態成因との関連が
示唆されている。そして、ＧＯＴ、ＧＰＴ等の既存の肝
機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するレギュ
カルチンの血清中の濃度を測定することにより、肝疾患
患者血清を鑑別する方法、すなわち、肝疾患患者の血清
ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健常人
の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、その
測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用であること
も知られている（特開平１０−２６６２３号公報）。
内Ｃａ2+シグナリングの制御蛋白質として特徴を有する
蛋白質であり、細胞機能調節に関与する重要な蛋白質で
あることが知られている（Life Sciences 66, 1769-178
0, 2000、Biochemical and Biophysical Research Comm
unications 276, 1-6, 2000）。また、生体内における
肝臓や腎臓におけるレギュカルチンの発現が肝障害（Mo
lecular and CellularBiochemisty 131, 173-179, 199
4）や腎障害（Molecular and Cellular Biochemisty 15
1, 55-60, 1995）時に低下することが動物実験的に明ら
かにされており、レギュカルチンと病態成因との関連が
示唆されている。そして、ＧＯＴ、ＧＰＴ等の既存の肝
機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するレギュ
カルチンの血清中の濃度を測定することにより、肝疾患
患者血清を鑑別する方法、すなわち、肝疾患患者の血清
ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健常人
の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、その
測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用であること
も知られている（特開平１０−２６６２３号公報）。
【０００６】他方、骨組織は、骨細胞と基質からなり、
１／３はコラーゲンを主成分とする有機質、２／３はカ
ルシウム−リンの骨塩である無機質からできており、構
造上は緻密質と海綿質と皮質に分けられ、例えば長骨の
骨幹は緻密質、骨端は皮質で囲まれた海綿質から構成さ
れている。骨は一旦形成された後は全く変化しない構築
物ではなく、骨形成と骨吸収のバランスの上にその構造
および量は維持されている。従って、加齢あるいはその
他の原因によりそのバランスが崩れると、種々の骨疾患
を発症する。骨疾患のうち、カルシウム塩が骨から血液
中に溶出してゆく骨吸収の異常亢進によって起きるもの
としては、骨髄腫やリンパ腫などが原因で起こる悪性高
カルシウム血症、局所性骨吸収によりもたらされる骨ぺ
ージェット病、骨の絶対量が減少しているが骨の質的な
変化を伴わない骨粗鬆症等が挙げられる。これらの疾患
は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因とな
ることが知られており、現在、これらの疾患は高齢人口
の増加に伴い社会問題化している。
１／３はコラーゲンを主成分とする有機質、２／３はカ
ルシウム−リンの骨塩である無機質からできており、構
造上は緻密質と海綿質と皮質に分けられ、例えば長骨の
骨幹は緻密質、骨端は皮質で囲まれた海綿質から構成さ
れている。骨は一旦形成された後は全く変化しない構築
物ではなく、骨形成と骨吸収のバランスの上にその構造
および量は維持されている。従って、加齢あるいはその
他の原因によりそのバランスが崩れると、種々の骨疾患
を発症する。骨疾患のうち、カルシウム塩が骨から血液
中に溶出してゆく骨吸収の異常亢進によって起きるもの
としては、骨髄腫やリンパ腫などが原因で起こる悪性高
カルシウム血症、局所性骨吸収によりもたらされる骨ぺ
ージェット病、骨の絶対量が減少しているが骨の質的な
変化を伴わない骨粗鬆症等が挙げられる。これらの疾患
は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因とな
ることが知られており、現在、これらの疾患は高齢人口
の増加に伴い社会問題化している。
【０００７】その他、高カルシウム血症、低カルシウム
血症、副甲状腺機能亢進症、くる病、骨軟化症、骨粗鬆
症、骨減少症などの骨疾患、糸球体腎炎、糸球体硬化
症、慢性腎炎、腎不全などの腎臓疾患、悪性腫瘍、乾癬
症あるいはそれらの合併症などの病態モデル動物として
利用することができ、これらの病態機序の解明および疾
患の治療方法の検討、ならびに治療薬のスクリーニング
を行うことが可能な、外来性２５−水酸化ビタミンＤ３
２４−水酸化酵素遺伝子またはその変異遺伝子を組み込
んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が知られている（特
開平１１−９１４０号公報）。
血症、副甲状腺機能亢進症、くる病、骨軟化症、骨粗鬆
症、骨減少症などの骨疾患、糸球体腎炎、糸球体硬化
症、慢性腎炎、腎不全などの腎臓疾患、悪性腫瘍、乾癬
症あるいはそれらの合併症などの病態モデル動物として
利用することができ、これらの病態機序の解明および疾
患の治療方法の検討、ならびに治療薬のスクリーニング
を行うことが可能な、外来性２５−水酸化ビタミンＤ３
２４−水酸化酵素遺伝子またはその変異遺伝子を組み込
んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が知られている（特
開平１１−９１４０号公報）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】レギュカルチンタンパ
ク質は、肝臓に特異発現される他、腎臓，心臓，大脳
（神経細胞）にも低レベルで発現し、細胞内のＣａ2+シ
グナリング関連細胞機能の調節に関与し、その発現が低
下すると生理的異常を来たす特異な多機能性蛋白質であ
り、これまでラットの肝臓から単離した蛋白質や抗レギ
ュカルチンモノクローナル抗体を用いて、その機能解析
が行われ、上記のカルシウムシグナルの制御因子として
の役割の他、細胞内カルシウム輸送酵素の調節や、プロ
テアーゼの活性化因子としての役割や、細胞核のカルシ
ウム輸送の調節、細胞核ＤＮＡ分解における役割、肝再
生時の細胞核機能における役割等の細胞核機能の調節
や、腎尿細管カルシウム再吸収における役割など、多く
の生体調節におけるレギュカルチンの機能的役割が本発
明者により明らかにされている。
ク質は、肝臓に特異発現される他、腎臓，心臓，大脳
（神経細胞）にも低レベルで発現し、細胞内のＣａ2+シ
グナリング関連細胞機能の調節に関与し、その発現が低
下すると生理的異常を来たす特異な多機能性蛋白質であ
り、これまでラットの肝臓から単離した蛋白質や抗レギ
ュカルチンモノクローナル抗体を用いて、その機能解析
が行われ、上記のカルシウムシグナルの制御因子として
の役割の他、細胞内カルシウム輸送酵素の調節や、プロ
テアーゼの活性化因子としての役割や、細胞核のカルシ
ウム輸送の調節、細胞核ＤＮＡ分解における役割、肝再
生時の細胞核機能における役割等の細胞核機能の調節
や、腎尿細管カルシウム再吸収における役割など、多く
の生体調節におけるレギュカルチンの機能的役割が本発
明者により明らかにされている。
【０００９】本発明者は、レギュカルチンの種々の機能
的役割の解明についての研究過程で、レギュカルチンが
他の数多くのＣａ2+結合タンパク質とは異なる特異的作
用を有する点に着目し、カルシウムが関与する各種細胞
の機能調節は、生体内におけるレギュカルチンの発現量
とカルモジュリンをはじめとする他の数多くのＣａ2+結
合タンパク質の発現量とのバランスの上に成立している
と考え、レギュカルチンの発現量と他の数多くのＣａ2+
結合タンパク質の発現量とのバランスが崩れた場合に、
生体に生じる変化・影響を調べることにした。本発明の
課題は、元来高等動物の肝臓等に発現しているレギュカ
ルチンを過剰に発現させ、他の数多くのＣａ2+結合タン
パク質とのバランスを崩した場合に、生体にどのような
変化・影響が生じるかを調べるためのツールであるレギ
ュカルチン過剰発現モデル動物を提供することにある。
的役割の解明についての研究過程で、レギュカルチンが
他の数多くのＣａ2+結合タンパク質とは異なる特異的作
用を有する点に着目し、カルシウムが関与する各種細胞
の機能調節は、生体内におけるレギュカルチンの発現量
とカルモジュリンをはじめとする他の数多くのＣａ2+結
合タンパク質の発現量とのバランスの上に成立している
と考え、レギュカルチンの発現量と他の数多くのＣａ2+
結合タンパク質の発現量とのバランスが崩れた場合に、
生体に生じる変化・影響を調べることにした。本発明の
課題は、元来高等動物の肝臓等に発現しているレギュカ
ルチンを過剰に発現させ、他の数多くのＣａ2+結合タン
パク質とのバランスを崩した場合に、生体にどのような
変化・影響が生じるかを調べるためのツールであるレギ
ュカルチン過剰発現モデル動物を提供することにある。
【００１０】また従来、骨粗鬆症に代表されるカルシウ
ム骨代謝に係り、高齢化や特に女性において多発する骨
病態の予防、治療薬剤開発には、卵巣摘出ラットが用い
られるが、卵巣摘出動物は外科的摘出手術を要し、さら
に骨量減少を起こさせるまでに３ヶ月以上の飼育が必要
で、研究経費が高額になるばかりでなく技術的、時間的
な制約も多かった。また臨床面において見られる他の骨
病態モデル動物として炎症性（リュウマチ）関節炎骨病
態モデル動物があるが、これは薬物投与により発症させ
るため、他の副作用を伴い生理的に問題があった。本発
明の課題は、また、上記問題を解決することができる、
卵巣摘出等の外科的摘出手術を要することなく、さらに
骨量減少を起させるまでの飼育期間が不要であり、副作
用を伴うなどの生理的な問題がない、骨粗鬆症に代表さ
れる骨病態のモデル動物を提供することにある。
ム骨代謝に係り、高齢化や特に女性において多発する骨
病態の予防、治療薬剤開発には、卵巣摘出ラットが用い
られるが、卵巣摘出動物は外科的摘出手術を要し、さら
に骨量減少を起こさせるまでに３ヶ月以上の飼育が必要
で、研究経費が高額になるばかりでなく技術的、時間的
な制約も多かった。また臨床面において見られる他の骨
病態モデル動物として炎症性（リュウマチ）関節炎骨病
態モデル動物があるが、これは薬物投与により発症させ
るため、他の副作用を伴い生理的に問題があった。本発
明の課題は、また、上記問題を解決することができる、
卵巣摘出等の外科的摘出手術を要することなく、さらに
骨量減少を起させるまでの飼育期間が不要であり、副作
用を伴うなどの生理的な問題がない、骨粗鬆症に代表さ
れる骨病態のモデル動物を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレ
ギュカルチンｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチ
ン蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡを単離し、このラ
ットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦを切り出
し、発現ベクター（pCXN2）に導入し、この遺伝子発現
ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェク
ションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔
ラットを発生させ、その産仔の組織からＤＮＡを抽出
し、ＰＣＲ法によってレギュカルチンｃＤＮＡが組み込
まれているラットを確認したところ、２９匹の産仔から
レギュカルチンｃＤＮＡを発現するホモ体のラット５匹
（雄４匹、雌１匹）が作出され、かかるトランスジェニ
ックラットの体重の増加が有意に抑制されることを見い
出し、本発明を完成するに至った。
解決するため、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレ
ギュカルチンｃＤＮＡをクローニングし、レギュカルチ
ン蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡを単離し、このラ
ットレギュカルチン全長ｃＤＮＡよりＯＲＦを切り出
し、発現ベクター（pCXN2）に導入し、この遺伝子発現
ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェク
ションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔
ラットを発生させ、その産仔の組織からＤＮＡを抽出
し、ＰＣＲ法によってレギュカルチンｃＤＮＡが組み込
まれているラットを確認したところ、２９匹の産仔から
レギュカルチンｃＤＮＡを発現するホモ体のラット５匹
（雄４匹、雌１匹）が作出され、かかるトランスジェニ
ックラットの体重の増加が有意に抑制されることを見い
出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】また、本発明者は、外見上何ら骨病態を呈
していない上記レギュカルチン遺伝子導入によりレギュ
カルチン過剰発現能を獲得した形質転換ラットについ
て、偶々、動物研究用ｐＱＴＣ（Peripheral Quantitat
ive Computed Tomography）骨密度測定装置による骨の
形態学的（骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨
周囲長さ）測定評価、及び骨成分の生化学的（カルシウ
ム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカ
リホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるＤ
ＮＡ量）測定評価を実施したところ、特に大腿骨におい
て形態学的にも生化学的にも、骨量、骨密度の減少によ
る骨吸収（骨塩溶解）による骨組織の脆弱化、骨形態変
化、および尾骨成長遅延などの顕著な骨病態を呈するこ
とを見い出し、このレギュカルチン過剰発現病態モデル
ラットの形質が継代的に安定しており、商業的生産に耐
えるものであることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
していない上記レギュカルチン遺伝子導入によりレギュ
カルチン過剰発現能を獲得した形質転換ラットについ
て、偶々、動物研究用ｐＱＴＣ（Peripheral Quantitat
ive Computed Tomography）骨密度測定装置による骨の
形態学的（骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨
周囲長さ）測定評価、及び骨成分の生化学的（カルシウ
ム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカ
リホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるＤ
ＮＡ量）測定評価を実施したところ、特に大腿骨におい
て形態学的にも生化学的にも、骨量、骨密度の減少によ
る骨吸収（骨塩溶解）による骨組織の脆弱化、骨形態変
化、および尾骨成長遅延などの顕著な骨病態を呈するこ
とを見い出し、このレギュカルチン過剰発現病態モデル
ラットの形質が継代的に安定しており、商業的生産に耐
えるものであることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００１３】すなわち本発明は、レギュカルチン遺伝
子が導入され、レギュカルチンを過剰発現することを特
徴とするトランスジェニック非ヒト動物（請求項１）
や、サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，チキン
β−アクチンプロモーター，レギュカルチン遺伝子，ラ
ビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列された直
鎖ＤＮＡが導入されたことを特徴とする請求項１記載の
トランスジェニック非ヒト動物（請求項２）や、レギュ
カルチン遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であること
を特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニック
非ヒト動物（請求項３）や、配列表の配列番号２記載の
アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラッ
トレギュカルチン遺伝子であることを特徴とする請求項
３記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項４）
や、ホモ体であることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項５）
や、体重増加抑制能を有することを特徴とする請求項１
〜５のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物
（請求項６）や、大脳機能障害発症性であることを特徴
とする請求項１〜６のいずれか記載のトランスジェニッ
ク非ヒト動物（請求項７）や、インスリン非依存性糖尿
病発症性であることを特徴とする請求項１〜７のいずれ
か記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項８）
や、腎性高血圧発症性であることを特徴とする請求項１
〜８のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物
（請求項９）や、尿細管再吸収障害発症性であることを
特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のトランスジェ
ニック非ヒト動物（請求項１０）や、非ヒト動物がラッ
トであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記
載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項１１）に関
する。
子が導入され、レギュカルチンを過剰発現することを特
徴とするトランスジェニック非ヒト動物（請求項１）
や、サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，チキン
β−アクチンプロモーター，レギュカルチン遺伝子，ラ
ビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配列された直
鎖ＤＮＡが導入されたことを特徴とする請求項１記載の
トランスジェニック非ヒト動物（請求項２）や、レギュ
カルチン遺伝子が、配列表の配列番号２記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であること
を特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニック
非ヒト動物（請求項３）や、配列表の配列番号２記載の
アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラッ
トレギュカルチン遺伝子であることを特徴とする請求項
３記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項４）
や、ホモ体であることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項５）
や、体重増加抑制能を有することを特徴とする請求項１
〜５のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物
（請求項６）や、大脳機能障害発症性であることを特徴
とする請求項１〜６のいずれか記載のトランスジェニッ
ク非ヒト動物（請求項７）や、インスリン非依存性糖尿
病発症性であることを特徴とする請求項１〜７のいずれ
か記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項８）
や、腎性高血圧発症性であることを特徴とする請求項１
〜８のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物
（請求項９）や、尿細管再吸収障害発症性であることを
特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のトランスジェ
ニック非ヒト動物（請求項１０）や、非ヒト動物がラッ
トであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記
載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項１１）に関
する。
【００１４】また本発明は、請求項１〜１１のいずれか
記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特
徴とするレギュカルチンの製造方法（請求項１２）や、
請求項１〜１１のいずれか記載のトランスジェニック非
ヒト動物又は該トランスジェニック非ヒト動物由来の組
織，器官もしくは細胞と被検物質とを用いることを特徴
とするレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・
治療薬のスクリーニング方法（請求項１３）や、トラン
スジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、該トラン
スジェニック非ヒト動物における体重増加の程度を測定
・評価することを特徴とする請求項１３記載のレギュカ
ルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項１４）や、レギュカルチン過剰発
現に起因する疾病が、大脳機能障害であることを特徴と
する請求項１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
（請求項１５）や、レギュカルチン過剰発現に起因する
疾病が、インスリン非依存性糖尿病であることを特徴と
する請求項１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
（請求項１６）や、レギュカルチン過剰発現に起因する
疾病が、腎性高血圧であることを特徴とする請求項１３
又は１４記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病
の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１７）
や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病が、尿細管
再吸収障害であることを特徴とする請求項１３又は１４
記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・
治療薬のスクリーニング方法（請求項１８）や、請求項
１３〜１８のいずれか記載のスクリーニング方法により
得られるレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防
・治療薬（請求項１９）に関する。
記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特
徴とするレギュカルチンの製造方法（請求項１２）や、
請求項１〜１１のいずれか記載のトランスジェニック非
ヒト動物又は該トランスジェニック非ヒト動物由来の組
織，器官もしくは細胞と被検物質とを用いることを特徴
とするレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・
治療薬のスクリーニング方法（請求項１３）や、トラン
スジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、該トラン
スジェニック非ヒト動物における体重増加の程度を測定
・評価することを特徴とする請求項１３記載のレギュカ
ルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリ
ーニング方法（請求項１４）や、レギュカルチン過剰発
現に起因する疾病が、大脳機能障害であることを特徴と
する請求項１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
（請求項１５）や、レギュカルチン過剰発現に起因する
疾病が、インスリン非依存性糖尿病であることを特徴と
する請求項１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
（請求項１６）や、レギュカルチン過剰発現に起因する
疾病が、腎性高血圧であることを特徴とする請求項１３
又は１４記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病
の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１７）
や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病が、尿細管
再吸収障害であることを特徴とする請求項１３又は１４
記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・
治療薬のスクリーニング方法（請求項１８）や、請求項
１３〜１８のいずれか記載のスクリーニング方法により
得られるレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防
・治療薬（請求項１９）に関する。
【００１５】さらに本発明は、請求項１〜１１のいずれ
か記載のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と
被検物質とを用いることを特徴とするレギュカルチン発
現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法
（請求項２０）や、トランスジェニック非ヒト動物に被
検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物にお
ける体重減少の程度を測定・評価することを特徴とする
請求項２０記載のレギュカルチン発現低下に起因する疾
病の原因物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、
レギュカルチン発現低下に起因する疾病が、動脈硬化心
筋梗塞であることを特徴とする請求項２０又は２１記載
のレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質の
スクリーニング方法（請求項２２）や、レギュカルチン
発現低下に起因する疾病が、心筋梗塞であることを特徴
とする請求項２０又は２１記載のレギュカルチン発現低
下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法（請
求項２３）や、請求項２０〜２３のいずれか記載のスク
リーニング方法により得られるレギュカルチン発現低下
に起因する疾病の原因物質（請求項２４）に関する。
か記載のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と
被検物質とを用いることを特徴とするレギュカルチン発
現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法
（請求項２０）や、トランスジェニック非ヒト動物に被
検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物にお
ける体重減少の程度を測定・評価することを特徴とする
請求項２０記載のレギュカルチン発現低下に起因する疾
病の原因物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、
レギュカルチン発現低下に起因する疾病が、動脈硬化心
筋梗塞であることを特徴とする請求項２０又は２１記載
のレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質の
スクリーニング方法（請求項２２）や、レギュカルチン
発現低下に起因する疾病が、心筋梗塞であることを特徴
とする請求項２０又は２１記載のレギュカルチン発現低
下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法（請
求項２３）や、請求項２０〜２３のいずれか記載のスク
リーニング方法により得られるレギュカルチン発現低下
に起因する疾病の原因物質（請求項２４）に関する。
【００１６】そしてまた本発明は、レギュカルチンを過
剰発現する非ヒト動物であって、骨病態を呈することを
特徴とする骨病態モデル動物（請求項２５）や、骨組織
の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか１以上の
骨病態を呈することを特徴とする請求項２５記載の骨病
態モデル動物（請求項２６）や、レギュカルチンを過剰
発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び／
又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認された
ことを特徴とする請求項２５又は２６記載の骨病態モデ
ル動物（請求項２７）や、骨の形態学的測定評価が、骨
密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのい
ずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項
２７記載の骨病態モデル動物（請求項２８）や、骨成分
の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスフ
ァターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の
測定評価であることを特徴とする請求項２７記載の骨病
態モデル動物（請求項２９）や、骨病態の表現形質が継
代的に安定していることを特徴とする請求項２５〜２９
のいずれか記載の骨病態モデル動物（請求項３０）や、
レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物が、レギュカ
ルチン遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動
物であることを特徴とする請求項２５〜３０のいずれか
記載の骨病態モデル動物（請求項３１）や、レギュカル
チンを過剰発現する非ヒト動物が、ホモ体であることを
特徴とする２６〜３２のいずれか記載の骨病態モデル動
物（請求項３２）や、レギュカルチンを過剰発現する非
ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請
求項２５〜３２のいずれか記載の骨病態モデル動物（請
求項３３）や、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動
物が、ラットであることを特徴とする請求項２５〜３３
のいずれか記載の骨病態モデル動物（請求項３４）に関
する。
剰発現する非ヒト動物であって、骨病態を呈することを
特徴とする骨病態モデル動物（請求項２５）や、骨組織
の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか１以上の
骨病態を呈することを特徴とする請求項２５記載の骨病
態モデル動物（請求項２６）や、レギュカルチンを過剰
発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び／
又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認された
ことを特徴とする請求項２５又は２６記載の骨病態モデ
ル動物（請求項２７）や、骨の形態学的測定評価が、骨
密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのい
ずれか１以上の測定評価であることを特徴とする請求項
２７記載の骨病態モデル動物（請求項２８）や、骨成分
の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスフ
ァターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以上の
測定評価であることを特徴とする請求項２７記載の骨病
態モデル動物（請求項２９）や、骨病態の表現形質が継
代的に安定していることを特徴とする請求項２５〜２９
のいずれか記載の骨病態モデル動物（請求項３０）や、
レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物が、レギュカ
ルチン遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動
物であることを特徴とする請求項２５〜３０のいずれか
記載の骨病態モデル動物（請求項３１）や、レギュカル
チンを過剰発現する非ヒト動物が、ホモ体であることを
特徴とする２６〜３２のいずれか記載の骨病態モデル動
物（請求項３２）や、レギュカルチンを過剰発現する非
ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請
求項２５〜３２のいずれか記載の骨病態モデル動物（請
求項３３）や、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動
物が、ラットであることを特徴とする請求項２５〜３３
のいずれか記載の骨病態モデル動物（請求項３４）に関
する。
【００１７】本発明はまた、請求項２５〜３４のいずれ
か記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病
態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び／又は
骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病
態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３５）
や、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部
皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評
価であることを特徴とする請求項３５記載の骨病態の予
防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３６）や、骨
成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホ
スファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以
上の測定評価であることを特徴とする請求項３５記載の
骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３
７）や、骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求
項３５〜３７のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬の
スクリーニング方法（請求項３８）や、請求項３５〜３
８のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる
骨病態の予防・治療薬（請求項３９）に関する。
か記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病
態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び／又は
骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病
態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３５）
や、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部
皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評
価であることを特徴とする請求項３５記載の骨病態の予
防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３６）や、骨
成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホ
スファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ量のいずれか１以
上の測定評価であることを特徴とする請求項３５記載の
骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項３
７）や、骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求
項３５〜３７のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬の
スクリーニング方法（請求項３８）や、請求項３５〜３
８のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる
骨病態の予防・治療薬（請求項３９）に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明のトランスジェニック非ヒ
ト動物としては、レギュカルチン遺伝子が導入され、レ
ギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制
限されるものではなく、ここで、レギュカルチンを過剰
発現するとは、野生型の非ヒト動物のレギュカルチン発
現量に比べて有意に多量のレギュカルチンを発現するこ
とをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マ
ウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウ
サギ等を挙げることができるが、中でもラットが好まし
い。モデル動物としてよく用いられているマウスでは臓
器が小さく病態の解析には限界があることもあるが、例
えば血圧測定などラットにおいてはこれが可能になり、
病態解明や遺伝子治療のための動物実験的手段としてき
わめて有用となる。
ト動物としては、レギュカルチン遺伝子が導入され、レ
ギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制
限されるものではなく、ここで、レギュカルチンを過剰
発現するとは、野生型の非ヒト動物のレギュカルチン発
現量に比べて有意に多量のレギュカルチンを発現するこ
とをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マ
ウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウ
サギ等を挙げることができるが、中でもラットが好まし
い。モデル動物としてよく用いられているマウスでは臓
器が小さく病態の解析には限界があることもあるが、例
えば血圧測定などラットにおいてはこれが可能になり、
病態解明や遺伝子治療のための動物実験的手段としてき
わめて有用となる。
【００１９】本発明のトランスジェニック非ヒト動物の
好ましい態様として、サイトメガロウイルス−ＩＥエン
ハンサー，チキンβ−アクチンプロモーター，レギュカ
ルチン遺伝子，ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの
順に配列された直鎖ＤＮＡが導入されたトランスジェニ
ック非ヒト動物を挙げることができる。例えば、マーカ
ー遺伝子，サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，
チキンβ−アクチンプロモーター，ｃＤＮＡ挿入サイ
ト，ラビットβ−グロビンポリＡシグナル等を有する発
現ベクター（pCXN2）にレギュカルチン全長ｃＤＮＡを
導入したものを用いると、効率よくトランスジェニック
非ヒト動物を得ることができる。
好ましい態様として、サイトメガロウイルス−ＩＥエン
ハンサー，チキンβ−アクチンプロモーター，レギュカ
ルチン遺伝子，ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの
順に配列された直鎖ＤＮＡが導入されたトランスジェニ
ック非ヒト動物を挙げることができる。例えば、マーカ
ー遺伝子，サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサー，
チキンβ−アクチンプロモーター，ｃＤＮＡ挿入サイ
ト，ラビットβ−グロビンポリＡシグナル等を有する発
現ベクター（pCXN2）にレギュカルチン全長ｃＤＮＡを
導入したものを用いると、効率よくトランスジェニック
非ヒト動物を得ることができる。
【００２０】また、本発明のトランスジェニック非ヒト
動物の好ましい態様として、レギュカルチン遺伝子が、
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質をコードする遺伝子であるトランスジェニック非ヒ
ト動物、特に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配
列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラットレギュカルチ
ン遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げる
ことができるが、レギュカルチン遺伝子の由来として
は、ラットの他、マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエ
ル，ヒト，イヌ，ウサギ等特に制限されるものではな
い。
動物の好ましい態様として、レギュカルチン遺伝子が、
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質をコードする遺伝子であるトランスジェニック非ヒ
ト動物、特に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配
列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラットレギュカルチ
ン遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げる
ことができるが、レギュカルチン遺伝子の由来として
は、ラットの他、マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエ
ル，ヒト，イヌ，ウサギ等特に制限されるものではな
い。
【００２１】また、本発明のトランスジェニック非ヒト
動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェ
ニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染
色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有する
ラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得るこ
とができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多い
ことから、実験モデル動物として特に好ましい。また、
本発明のトランスジェニック非ヒト動物として、体重の
増加が野生型の非ヒト動物に比べて有意に抑制された、
すなわち体重増加抑制能を有するトランスジェニック非
ヒト動物を好適に挙げることができる。レギュカルチン
遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトラ
ンスジェニック非ヒト動物が、かかる体重増加抑制能を
有することは全く予想できなかったことであり、この新
たな知見はレギュカルチンが肥満防止剤としての有用性
をもつ可能性があることを示唆している。かかる新たな
知見からして、本発明のトランスジェニック非ヒト動物
は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチン
を過剰発現することを特徴とする体重増加抑制能を有す
るトランスジェニック非ヒト動物ということもできる。
動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェ
ニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染
色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有する
ラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得るこ
とができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多い
ことから、実験モデル動物として特に好ましい。また、
本発明のトランスジェニック非ヒト動物として、体重の
増加が野生型の非ヒト動物に比べて有意に抑制された、
すなわち体重増加抑制能を有するトランスジェニック非
ヒト動物を好適に挙げることができる。レギュカルチン
遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトラ
ンスジェニック非ヒト動物が、かかる体重増加抑制能を
有することは全く予想できなかったことであり、この新
たな知見はレギュカルチンが肥満防止剤としての有用性
をもつ可能性があることを示唆している。かかる新たな
知見からして、本発明のトランスジェニック非ヒト動物
は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチン
を過剰発現することを特徴とする体重増加抑制能を有す
るトランスジェニック非ヒト動物ということもできる。
【００２２】また、本発明のトランスジェニック非ヒト
動物の好ましい態様として、大脳機能障害発症性，イン
スリン非依存性糖尿病発症性，腎性高血圧発症性，尿細
管再吸収障害発症性等のレギュカルチン過剰発現に起因
する症状や疾病のうち少なくとも１以上の症状や疾病を
発現するトランスジェニック非ヒト動物を挙げることが
できる。大脳機能障害は、大脳の記憶維持メカニズム上
必要とされるＣａ−カルモジュリン依存性タンパク質リ
ン酸化酵素の活性化を、過剰発現したレギュカルチンが
抑制して、神経細胞内の神経伝達を制御することにより
発症するものと考えられ、本発明のトランスジェニック
非ヒト動物は、記憶などの大脳機能の障害（アルツハイ
マー等の痴呆症）の実験モデル動物として有用である。
また、レギュカルチンは、肝臓や腎臓において発現し、
ホルモンの細胞内情報伝達の制御を行っており、レギュ
カルチンの過剰発現により、肝臓と腎臓の機能を調節す
るホルモンの作用発現が障害され、肝臓においては、イ
ンスリンの働きを抑制することからインスリン非依存性
糖尿病を誘発し、腎臓においては、レニン−アンジオテ
ンシン系に関係した腎性高血圧、さらに電解質代謝に関
連した尿細管再吸収障害を誘発するものと考えられ、本
発明のトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン非
依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害等の実験
モデル動物として有用である。
動物の好ましい態様として、大脳機能障害発症性，イン
スリン非依存性糖尿病発症性，腎性高血圧発症性，尿細
管再吸収障害発症性等のレギュカルチン過剰発現に起因
する症状や疾病のうち少なくとも１以上の症状や疾病を
発現するトランスジェニック非ヒト動物を挙げることが
できる。大脳機能障害は、大脳の記憶維持メカニズム上
必要とされるＣａ−カルモジュリン依存性タンパク質リ
ン酸化酵素の活性化を、過剰発現したレギュカルチンが
抑制して、神経細胞内の神経伝達を制御することにより
発症するものと考えられ、本発明のトランスジェニック
非ヒト動物は、記憶などの大脳機能の障害（アルツハイ
マー等の痴呆症）の実験モデル動物として有用である。
また、レギュカルチンは、肝臓や腎臓において発現し、
ホルモンの細胞内情報伝達の制御を行っており、レギュ
カルチンの過剰発現により、肝臓と腎臓の機能を調節す
るホルモンの作用発現が障害され、肝臓においては、イ
ンスリンの働きを抑制することからインスリン非依存性
糖尿病を誘発し、腎臓においては、レニン−アンジオテ
ンシン系に関係した腎性高血圧、さらに電解質代謝に関
連した尿細管再吸収障害を誘発するものと考えられ、本
発明のトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン非
依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害等の実験
モデル動物として有用である。
【００２３】本発明の体重増加抑制能を有するモデルラ
ット等のモデル動物の樹立方法としては、公知のトラン
スジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いた方法を挙げ
ることができる。例えば、レギュカルチン（ＲＣ）トラ
ンスジェニックラットを創製する方法としては、ラット
肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレギュカルチンのｃＤＮ
Ａをクローニングし、レギュカルチンタンパク質の全長
をコードするｃＤＮＡを単離後、オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を切り出し、発現ベクターに導入
し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺
伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをラット受精卵雄性
前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるい
は２細胞期胚を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを
発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いて
ＰＣＲ法等により、レギュカルチンｃＤＮＡが組み込ま
れていることを確認する方法等を挙げることができる。
ット等のモデル動物の樹立方法としては、公知のトラン
スジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いた方法を挙げ
ることができる。例えば、レギュカルチン（ＲＣ）トラ
ンスジェニックラットを創製する方法としては、ラット
肝臓ｃＤＮＡライブラリーからレギュカルチンのｃＤＮ
Ａをクローニングし、レギュカルチンタンパク質の全長
をコードするｃＤＮＡを単離後、オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を切り出し、発現ベクターに導入
し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺
伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをラット受精卵雄性
前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるい
は２細胞期胚を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを
発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いて
ＰＣＲ法等により、レギュカルチンｃＤＮＡが組み込ま
れていることを確認する方法等を挙げることができる。
【００２４】本発明のレギュカルチンの製造方法として
は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、好ましく
はホモ体のトランスジェニック非ヒト動物を用いる方法
であれば特に制限されるものではなく、例えば、ホモ体
のレギュカルチントランスジェニックラットから肝臓を
取り出し、そのホモジネートから文献（Chem. Pharm.Bu
ll. 26, 1915-1918, 1978）記載の方法に準じて、レギ
ュカルチンを単離・精製することができる。また、レギ
ュカルチンの増収を目的として、トランスジェニック非
ヒト動物にカルシウム、カルチトニン、インスリン、エ
ストロゲン等を投与することもできる。
は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、好ましく
はホモ体のトランスジェニック非ヒト動物を用いる方法
であれば特に制限されるものではなく、例えば、ホモ体
のレギュカルチントランスジェニックラットから肝臓を
取り出し、そのホモジネートから文献（Chem. Pharm.Bu
ll. 26, 1915-1918, 1978）記載の方法に準じて、レギ
ュカルチンを単離・精製することができる。また、レギ
ュカルチンの増収を目的として、トランスジェニック非
ヒト動物にカルシウム、カルチトニン、インスリン、エ
ストロゲン等を投与することもできる。
【００２５】本発明のレギュカルチン過剰発現に起因す
る疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、
本発明のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と
被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、上記レギュカルチン過剰発現に起因する疾病と
しては、大脳機能障害，インスリン非依存性糖尿病，腎
性高血圧，尿細管再吸収障害等を例示することができ
る。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを
用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に
被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動
物における体重増加の程度や、レギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物
質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる
組織，器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現抑制
量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における
形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子
顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織、器官
又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検
物質の存在下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュ
カルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、
組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体によ
る免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙
げることができる。
る疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、
本発明のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と
被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、上記レギュカルチン過剰発現に起因する疾病と
しては、大脳機能障害，インスリン非依存性糖尿病，腎
性高血圧，尿細管再吸収障害等を例示することができ
る。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを
用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に
被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動
物における体重増加の程度や、レギュカルチン過剰発現
に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物
質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる
組織，器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現抑制
量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における
形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子
顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織、器官
又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランス
ジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検
物質の存在下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュ
カルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、
組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体によ
る免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙
げることができる。
【００２６】上記組織や器官としては、肝臓，腎臓尿細
管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を
構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることがで
きる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型
非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合
と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験
をすることができることから好ましい。このように、上
記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチ
ン過剰発現に起因する疾病、例えば大脳機能障害，イン
スリン非依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害
等の予防・治療薬をスクリーニングすることができ、か
かるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン
過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬も本発明の範疇
に含まれる。
管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を
構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることがで
きる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型
非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合
と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験
をすることができることから好ましい。このように、上
記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチ
ン過剰発現に起因する疾病、例えば大脳機能障害，イン
スリン非依存性糖尿病，腎性高血圧，尿細管再吸収障害
等の予防・治療薬をスクリーニングすることができ、か
かるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン
過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬も本発明の範疇
に含まれる。
【００２７】本発明のレギュカルチン発現低下に起因す
る疾病の原因物質のスクリーニング方法としては、本発
明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニ
ック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物
質とを用いる方法であれば特に制限されるものではな
く、レギュカルチン発現低下に起因する疾病としては、
動脈硬化，心筋梗塞等を例示することができる。上記ト
ランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法
としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を
直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における
体重減少の程度や、レギュカルチン発現低下に起因する
疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後の
トランスジェニック非ヒト動物から得られる組織，器官
又は細胞におけるレギュカルチンの発現増加量の程度を
測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化を
モノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡によ
り評価する方法などを挙げることができる。また、トラ
ンスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞と
被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック
非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検物質の存在
下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュカルチンの
発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官
における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色
法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることが
できる。
る疾病の原因物質のスクリーニング方法としては、本発
明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニ
ック非ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物
質とを用いる方法であれば特に制限されるものではな
く、レギュカルチン発現低下に起因する疾病としては、
動脈硬化，心筋梗塞等を例示することができる。上記ト
ランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法
としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を
直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における
体重減少の程度や、レギュカルチン発現低下に起因する
疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後の
トランスジェニック非ヒト動物から得られる組織，器官
又は細胞におけるレギュカルチンの発現増加量の程度を
測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化を
モノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡によ
り評価する方法などを挙げることができる。また、トラ
ンスジェニック非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞と
被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック
非ヒト動物由来の組織，器官又は細胞を被検物質の存在
下で培養し、該組織，器官又は細胞のレギュカルチンの
発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官
における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色
法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることが
できる。
【００２８】上記組織や器官としては、肝臓，腎臓尿細
管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を
構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることがで
きる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型
非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合
と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験
をすることができることから好ましい。このように、上
記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチ
ン発現低下に起因する疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞
等の原因物質をスクリーニングすることができ、かかる
スクリーニング方法により得られるレギュカルチン発現
低下に起因する疾病の原因物質は、レギュカルチンの生
体内における作用・役割をより一層明らかにする上で有
用であり、また、これら原因物質に結合する物質等その
作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、
レギュカルチン発現低下に起因する疾病の予防・治療薬
を開発することができる可能性があることからしても有
用であり、かかる原因物質も本発明の範疇に含まれる。
管，心臓，大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を
構成する肝細胞，神経細胞等を具体的に挙げることがで
きる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型
非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合
と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験
をすることができることから好ましい。このように、上
記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチ
ン発現低下に起因する疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞
等の原因物質をスクリーニングすることができ、かかる
スクリーニング方法により得られるレギュカルチン発現
低下に起因する疾病の原因物質は、レギュカルチンの生
体内における作用・役割をより一層明らかにする上で有
用であり、また、これら原因物質に結合する物質等その
作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、
レギュカルチン発現低下に起因する疾病の予防・治療薬
を開発することができる可能性があることからしても有
用であり、かかる原因物質も本発明の範疇に含まれる。
【００２９】次に、本発明の骨病態モデル動物として
は、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であっ
て、骨病態を呈するモデル動物であれば特に制限される
ものではなく、かかる骨病態モデル動物として、レギュ
カルチン遺伝子が導入された上述の本発明のトランスジ
ェニック非ヒト動物を好適に例示することができる。し
たがって、以下本発明の骨病態モデル動物や骨病態の予
防・治療薬のスクリーニング方法について説明するが、
より詳細には、上述の本発明のトランスジェニック非ヒ
ト動物に関する記載や、本発明のレギュカルチン過剰発
現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
等に関する記載を参照することができる。なお、本発明
において、骨病態とは、骨粗鬆症に代表されるカルシウ
ム骨代謝異常等により、骨量の減少、骨組織の脆弱化、
骨形態変化、骨成長遅延等の骨やその成長が正常でない
状態をいう。
は、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であっ
て、骨病態を呈するモデル動物であれば特に制限される
ものではなく、かかる骨病態モデル動物として、レギュ
カルチン遺伝子が導入された上述の本発明のトランスジ
ェニック非ヒト動物を好適に例示することができる。し
たがって、以下本発明の骨病態モデル動物や骨病態の予
防・治療薬のスクリーニング方法について説明するが、
より詳細には、上述の本発明のトランスジェニック非ヒ
ト動物に関する記載や、本発明のレギュカルチン過剰発
現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法
等に関する記載を参照することができる。なお、本発明
において、骨病態とは、骨粗鬆症に代表されるカルシウ
ム骨代謝異常等により、骨量の減少、骨組織の脆弱化、
骨形態変化、骨成長遅延等の骨やその成長が正常でない
状態をいう。
【００３０】上記本発明の骨病態モデル動物としては、
レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形
態学的測定評価、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨
厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価、及
び／又は、骨成分の生化学的測定評価、例えばカルシウ
ム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ
量のいずれか１以上の測定評価により選抜・確認され
た、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれ
か１以上の骨病態を呈する骨病態モデル動物が好まし
く、上記骨の形態学的測定評価には、動物研究用ｐＱＴ
Ｃ（Peripheral Quantitative Computed Tomography）
骨密度測定装置（Bone Vol.29, No.2, August 2001; 10
1-104）を特に有利に用いることができる。また、骨成
分の生化学的測定評価は、後述する実施例に記載されて
いるような、この分野における常法により実施すること
ができる。なお、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化
学的測定評価には、大腿骨等の骨自体が必要な、供試動
物をそのまま骨病態モデル動物として使用できないこと
から、上記選抜・確認された骨病態モデル動物とは、骨
の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価に供し
た動物と同腹の動物又はその子孫をいう。
レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形
態学的測定評価、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨
厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１以上の測定評価、及
び／又は、骨成分の生化学的測定評価、例えばカルシウ
ム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮＡ
量のいずれか１以上の測定評価により選抜・確認され
た、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれ
か１以上の骨病態を呈する骨病態モデル動物が好まし
く、上記骨の形態学的測定評価には、動物研究用ｐＱＴ
Ｃ（Peripheral Quantitative Computed Tomography）
骨密度測定装置（Bone Vol.29, No.2, August 2001; 10
1-104）を特に有利に用いることができる。また、骨成
分の生化学的測定評価は、後述する実施例に記載されて
いるような、この分野における常法により実施すること
ができる。なお、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化
学的測定評価には、大腿骨等の骨自体が必要な、供試動
物をそのまま骨病態モデル動物として使用できないこと
から、上記選抜・確認された骨病態モデル動物とは、骨
の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価に供し
た動物と同腹の動物又はその子孫をいう。
【００３１】本発明の骨病態モデル動物は、例えば前記
のように、本発明者が作製したラットレギュカルチン発
現ベクターから切り出され、リニアライズされたＤＮＡ
フラグメントを別途調整した受精卵卵胞細胞にマイクロ
インジェクション法で注入し、卵細胞を培養後、発生が
進み異常が認められない胚を仮親の卵管内に移植し、生
まれた産仔について、特に動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測
定装置による骨の形態学的測定評価、及び骨成分の生化
学的測定評価の結果を行うことにより、選抜・確認する
ことができ、これらの中でも、骨病態の表現形質が継代
的に安定し、商業的生産に適したものが好ましい。ま
た、本発明の骨病態モデル動物としては、ホモ体である
レギュカルチントランスジェニック骨病態モデル動物を
好ましく例示することができる。かかる変異染色体をホ
モに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等
の非ヒト動物同士を交配することにより得ることがで
き、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことか
ら、骨変化等の骨病態の表現形質がより強く現れること
から好ましい。さらに、本発明の骨病態モデル動物とし
ては、レギュカルチン遺伝子がＸ染色体上にあり、雄よ
りも雌において骨変化等の骨病態の表現形質がより顕著
に現れることから、雌ラット等の雌の骨病態モデル動物
を好ましく例示することができる。
のように、本発明者が作製したラットレギュカルチン発
現ベクターから切り出され、リニアライズされたＤＮＡ
フラグメントを別途調整した受精卵卵胞細胞にマイクロ
インジェクション法で注入し、卵細胞を培養後、発生が
進み異常が認められない胚を仮親の卵管内に移植し、生
まれた産仔について、特に動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測
定装置による骨の形態学的測定評価、及び骨成分の生化
学的測定評価の結果を行うことにより、選抜・確認する
ことができ、これらの中でも、骨病態の表現形質が継代
的に安定し、商業的生産に適したものが好ましい。ま
た、本発明の骨病態モデル動物としては、ホモ体である
レギュカルチントランスジェニック骨病態モデル動物を
好ましく例示することができる。かかる変異染色体をホ
モに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等
の非ヒト動物同士を交配することにより得ることがで
き、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことか
ら、骨変化等の骨病態の表現形質がより強く現れること
から好ましい。さらに、本発明の骨病態モデル動物とし
ては、レギュカルチン遺伝子がＸ染色体上にあり、雄よ
りも雌において骨変化等の骨病態の表現形質がより顕著
に現れることから、雌ラット等の雌の骨病態モデル動物
を好ましく例示することができる。
【００３２】本発明の骨病態の予防・治療薬のスクリー
ニング方法としては、上記本発明の骨病態モデル動物に
被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形
態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価を
行うことを特徴とするスクリーニング方法であれば特に
制限されるものではなく、被検物質としては、公知の合
成化合物、ペプチド、蛋白質などの他に、例えば哺乳動
物の組織抽出物、細胞培養上清などや、各種植物の抽出
成分等が用いられる。例えば、被検化合物を本発明の骨
病態モデル動物に経口的又は非経口的に投与し、該骨病
態モデル動物における、例えば骨密度、骨強度、骨幹部
皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ等の骨の形態学的測定評価
や、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活
性、骨組織中のＤＮＡ量等の骨成分の生化学的測定評価
を実施することにより、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治
療薬をスクリーニングすることができる。また、これら
のスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同
腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価するこ
とが、個体レベルで正確な比較実験をすることができる
ことから好ましい。
ニング方法としては、上記本発明の骨病態モデル動物に
被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形
態学的測定評価及び／又は骨成分の生化学的測定評価を
行うことを特徴とするスクリーニング方法であれば特に
制限されるものではなく、被検物質としては、公知の合
成化合物、ペプチド、蛋白質などの他に、例えば哺乳動
物の組織抽出物、細胞培養上清などや、各種植物の抽出
成分等が用いられる。例えば、被検化合物を本発明の骨
病態モデル動物に経口的又は非経口的に投与し、該骨病
態モデル動物における、例えば骨密度、骨強度、骨幹部
皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ等の骨の形態学的測定評価
や、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活
性、骨組織中のＤＮＡ量等の骨成分の生化学的測定評価
を実施することにより、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治
療薬をスクリーニングすることができる。また、これら
のスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同
腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価するこ
とが、個体レベルで正確な比較実験をすることができる
ことから好ましい。
【００３３】また、本発明の骨病態の予防・治療薬とし
ては、上記本発明のスクリーニング方法により得られる
骨病態の予防・治療薬であれば特に制限されるものでは
なく、これら予防・治療薬を医薬品として用いる場合
は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化
剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、
溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加す
ることができる。これら予防・治療薬を用いる、骨粗鬆
症等の骨病態の予防・治療方法においては、患者の性別
・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療
薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。す
なわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カ
プセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与
することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液
等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することが
できる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもでき
る。
ては、上記本発明のスクリーニング方法により得られる
骨病態の予防・治療薬であれば特に制限されるものでは
なく、これら予防・治療薬を医薬品として用いる場合
は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化
剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、
溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加す
ることができる。これら予防・治療薬を用いる、骨粗鬆
症等の骨病態の予防・治療方法においては、患者の性別
・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療
薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。す
なわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カ
プセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与
することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液
等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することが
できる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもでき
る。
【００３４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１［ラットＲＣｃＤＮＡ調製］ （ＲＮＡの調製）ウイスター系雄性ラット（３週齢）か
ら肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液
（４Ｍグアニジニウムチオシアネート，２５mMクエン酸
ナトリウム（pH７．０），０．５％サルコシル，０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール，２Ｍ酢酸ナトリウム）で
ホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール混液で抽出し、４℃、１０，００
０×ｇで２０分遠心した。水層にイソプロパノールを加
え、−２０℃で放置し、ＲＮＡを沈澱させた。回収した
沈澱はジエチルピロカーボネート処理した０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムに通し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し
た。
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１［ラットＲＣｃＤＮＡ調製］ （ＲＮＡの調製）ウイスター系雄性ラット（３週齢）か
ら肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液
（４Ｍグアニジニウムチオシアネート，２５mMクエン酸
ナトリウム（pH７．０），０．５％サルコシル，０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール，２Ｍ酢酸ナトリウム）で
ホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール混液で抽出し、４℃、１０，００
０×ｇで２０分遠心した。水層にイソプロパノールを加
え、−２０℃で放置し、ＲＮＡを沈澱させた。回収した
沈澱はジエチルピロカーボネート処理した０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムに通し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し
た。
【００３５】（ｃＤＮＡライブラリーの作製）精製した
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）に５０ｕｎｉｔのMolone
y-Murine Leukemiaウイルス逆転写酵素とオリゴ（ｄ
Ｔ）18プライマーリンカーを添加し、１本鎖ｃＤＮＡを
合成した。さらに合成した１本鎖ｃＤＮＡに大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨとＤＮＡポリメラーゼＩを添加し、２本
鎖ｃＤＮＡを合成した。これにEcoRIアダプターを付加
し、XhoI，EcoRIで消化したファージ発現ベクター（λZ
APII）と連結した。さらにパッケージングエキストラク
トを用いてファージにパッケージングしｃＤＮＡライブ
ラリーのファージを作製した。
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）に５０ｕｎｉｔのMolone
y-Murine Leukemiaウイルス逆転写酵素とオリゴ（ｄ
Ｔ）18プライマーリンカーを添加し、１本鎖ｃＤＮＡを
合成した。さらに合成した１本鎖ｃＤＮＡに大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨとＤＮＡポリメラーゼＩを添加し、２本
鎖ｃＤＮＡを合成した。これにEcoRIアダプターを付加
し、XhoI，EcoRIで消化したファージ発現ベクター（λZ
APII）と連結した。さらにパッケージングエキストラク
トを用いてファージにパッケージングしｃＤＮＡライブ
ラリーのファージを作製した。
【００３６】（ＲＣｃＤＮＡクローンの選抜）ラット肝
のｃＤＮＡライブラリーのファージ約１×１０6個を大
腸菌と混合し２０個の寒天プレートに植菌した。４２℃
で３時間半インキュベートした後、プレートに１０mMイ
ソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシドで処理したニトロ
セルロース膜をのせ、３７℃で３時間半インキュベート
した。ニトロセルロース膜はブロッキングした後、抗Ｒ
Ｃウサギ血清（×２００）と室温で２時間インキュベー
トした。膜は洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合
抗ウサギＩｇＧ抗体を加えインキュベートした。これを
発色液（０．３５mMニトロブルーテトラゾリウム，０．
４mM５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート）に浸し発色させ、ＲＣｃＤＮＡ陽性プラークを同
定した。
のｃＤＮＡライブラリーのファージ約１×１０6個を大
腸菌と混合し２０個の寒天プレートに植菌した。４２℃
で３時間半インキュベートした後、プレートに１０mMイ
ソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシドで処理したニトロ
セルロース膜をのせ、３７℃で３時間半インキュベート
した。ニトロセルロース膜はブロッキングした後、抗Ｒ
Ｃウサギ血清（×２００）と室温で２時間インキュベー
トした。膜は洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合
抗ウサギＩｇＧ抗体を加えインキュベートした。これを
発色液（０．３５mMニトロブルーテトラゾリウム，０．
４mM５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート）に浸し発色させ、ＲＣｃＤＮＡ陽性プラークを同
定した。
【００３７】（プラスミドベクターへのサブクローニン
グ）ファージベクターλZAPIIは、その配列中にプラス
ミドベクターであるpBluescriptの塩基配列を含み、λZ
APIIにクローニングされたＲＣのｃＤＮＡ断片はこのpB
luescriptに挿入されている。また、pBluescriptの両端
にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在して
いる。そこで同定したプラークよりファージを単離し、
Ｒ４０８ヘルパーファージとともに大腸菌ＳＵＲＥに感
染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を含むpBluescriptを大腸
菌内で合成させ、ヘルパーファージの形で大腸菌体外に
放出させた。このファージ液をさらに大腸菌ＳＵＲＥに
感染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を有するプラスミドとし
て菌内で複製させた。この大腸菌を５０μｇ／mlアンピ
シリン含有のＬＢプレートに植菌し、アンピシリン耐性
コロニーを選択した。
グ）ファージベクターλZAPIIは、その配列中にプラス
ミドベクターであるpBluescriptの塩基配列を含み、λZ
APIIにクローニングされたＲＣのｃＤＮＡ断片はこのpB
luescriptに挿入されている。また、pBluescriptの両端
にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在して
いる。そこで同定したプラークよりファージを単離し、
Ｒ４０８ヘルパーファージとともに大腸菌ＳＵＲＥに感
染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を含むpBluescriptを大腸
菌内で合成させ、ヘルパーファージの形で大腸菌体外に
放出させた。このファージ液をさらに大腸菌ＳＵＲＥに
感染させ、ＲＣのｃＤＮＡ断片を有するプラスミドとし
て菌内で複製させた。この大腸菌を５０μｇ／mlアンピ
シリン含有のＬＢプレートに植菌し、アンピシリン耐性
コロニーを選択した。
【００３８】（ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定）
Sequenaseシステム（US Biochemical社製）を用いてｃ
ＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した。すなわちプ
ラスミドＤＮＡをEcoRIで切断し、断片はアルカリ変性
処理した後、プライマーを加えアニーリングした。これ
に３５Ｓ ｄＣＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、Sequense用酵素
液を添加した後４等分し、各々にｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを加え、３７℃５分間イン
キュベートした。これらはアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、塩基配列
を読み取った。配列番号１にレギュカルチンｃＤＮＡの
全塩基配列を示す。また、得られたアミノ酸配列も配列
番号２に示す。これから計算されるレギュカルチンの分
子量は３３，３８８であった。この値は精製したレギュ
カルチンをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により
算出した分子量と一致した。
Sequenaseシステム（US Biochemical社製）を用いてｃ
ＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した。すなわちプ
ラスミドＤＮＡをEcoRIで切断し、断片はアルカリ変性
処理した後、プライマーを加えアニーリングした。これ
に３５Ｓ ｄＣＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、Sequense用酵素
液を添加した後４等分し、各々にｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰを加え、３７℃５分間イン
キュベートした。これらはアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、塩基配列
を読み取った。配列番号１にレギュカルチンｃＤＮＡの
全塩基配列を示す。また、得られたアミノ酸配列も配列
番号２に示す。これから計算されるレギュカルチンの分
子量は３３，３８８であった。この値は精製したレギュ
カルチンをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により
算出した分子量と一致した。
【００３９】実施例２［トランスジェニックラットの創
製］ （導入遺伝子の構築）実施例１で得られたラットレギュ
カルチン全長ｃＤＮＡを含むプラスミド、ＲＣ−９００
（glycerol stock；ＲＣ−Ｆ）、ベクターpBluescript
SK（−）より、ＯＲＦ全てを含むＤＮＡ断片をPstIを用
いて切り出した（図１Ａ）。この切り出したPstIフラグ
メントをpBluescript II KS(+)のPstIサイトに組み込ん
だ（図１Ｂ）。次にEcoRIで切り出し、得られたEcoRIフ
ラグメント（図２Ａ）を、発現ベクターpCXN2（クロン
テック社）（Gene 108, 193-199, 1991）のEcoRIサイト
に導入し（図２Ｂ）、ラットレギュカルチン発現ベクタ
ーRC/ pCXN2を調製した。このRC/pCXN2をSalIとSfiIとM
luIで切断し、リニアライズされた３．６ｋｂｐのフラ
グメントを得た（図３）。
製］ （導入遺伝子の構築）実施例１で得られたラットレギュ
カルチン全長ｃＤＮＡを含むプラスミド、ＲＣ−９００
（glycerol stock；ＲＣ−Ｆ）、ベクターpBluescript
SK（−）より、ＯＲＦ全てを含むＤＮＡ断片をPstIを用
いて切り出した（図１Ａ）。この切り出したPstIフラグ
メントをpBluescript II KS(+)のPstIサイトに組み込ん
だ（図１Ｂ）。次にEcoRIで切り出し、得られたEcoRIフ
ラグメント（図２Ａ）を、発現ベクターpCXN2（クロン
テック社）（Gene 108, 193-199, 1991）のEcoRIサイト
に導入し（図２Ｂ）、ラットレギュカルチン発現ベクタ
ーRC/ pCXN2を調製した。このRC/pCXN2をSalIとSfiIとM
luIで切断し、リニアライズされた３．６ｋｂｐのフラ
グメントを得た（図３）。
【００４０】（トランスジェニックラットの作製）ラッ
トの前核期受精卵への上記リニアライズされた３．６ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメント溶液のマイクロインジェクシ
ョンは下記の要領で実施した。４週齢のスプラーグ−ド
ーリー(SD, Sprague-Dawley)系雌ラットを明暗サイクル
１２時間（明時間 ４：００〜１６：００)、温度約２３
℃、湿度約５５％で飼育し、膣スメア法により雌の性周
期を観察してホルモン処理日を選択した。雌ラットに１
５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本全
薬社製「ＰＭＳゼンヤク」）を腹腔内投与して過剰***
処理を行い、その４８時間後に１５０ＩＵ／ｋｇのヒト
胎盤性性腺刺激ホルモン（三共エール薬品（株）社製
「プべローゲン」）を腹腔内投与した後、雄との同居に
より交配を行わせ、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン投与３
２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
トの前核期受精卵への上記リニアライズされた３．６ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメント溶液のマイクロインジェクシ
ョンは下記の要領で実施した。４週齢のスプラーグ−ド
ーリー(SD, Sprague-Dawley)系雌ラットを明暗サイクル
１２時間（明時間 ４：００〜１６：００)、温度約２３
℃、湿度約５５％で飼育し、膣スメア法により雌の性周
期を観察してホルモン処理日を選択した。雌ラットに１
５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本全
薬社製「ＰＭＳゼンヤク」）を腹腔内投与して過剰***
処理を行い、その４８時間後に１５０ＩＵ／ｋｇのヒト
胎盤性性腺刺激ホルモン（三共エール薬品（株）社製
「プべローゲン」）を腹腔内投与した後、雄との同居に
より交配を行わせ、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン投与３
２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
【００４１】この様にして調製したウイスターラットの
受精卵の雄性前核に、前記３．６ｋｂｐのＤＮＡフラグ
メント溶液（５ｎｇ／μｌ濃度）を顕微注入した。ＤＮ
Ａフラグメントが注入された卵を、ＣＯ2インキュベー
ター内でｍ−ＫＲＢ（ｍ−クレブスリンガー緩衝液）培
地を用いて１晩培養した。翌日２細胞へと発生が進み、
異常の認められない２細胞期胚を９匹の仮親（精管結紮
雄と交配させた偽妊娠雌ラット）の卵管内に１匹あたり
２０〜３０個程度を移植し、２９匹の産仔を得た。４週
齢まで生存した２７匹の産仔の尾よりＤＮＡを採取し、
採取したＤＮＡをプライマーhuRC-1；GGAGGCTATGTTGCCA
CCATTGGA（配列番号３）、プライマーhuRC-2；CCCTCCAA
AGCAGCATGAAGTTG（配列番号４）を用いてＰＣＲ法によ
り検定した（図４）。その結果、合計５匹（雄４匹、雌
１匹）のラットに導入遺伝子の存在を確認した。そのう
ち５匹が次世代に導入遺伝子を伝えた。
受精卵の雄性前核に、前記３．６ｋｂｐのＤＮＡフラグ
メント溶液（５ｎｇ／μｌ濃度）を顕微注入した。ＤＮ
Ａフラグメントが注入された卵を、ＣＯ2インキュベー
ター内でｍ−ＫＲＢ（ｍ−クレブスリンガー緩衝液）培
地を用いて１晩培養した。翌日２細胞へと発生が進み、
異常の認められない２細胞期胚を９匹の仮親（精管結紮
雄と交配させた偽妊娠雌ラット）の卵管内に１匹あたり
２０〜３０個程度を移植し、２９匹の産仔を得た。４週
齢まで生存した２７匹の産仔の尾よりＤＮＡを採取し、
採取したＤＮＡをプライマーhuRC-1；GGAGGCTATGTTGCCA
CCATTGGA（配列番号３）、プライマーhuRC-2；CCCTCCAA
AGCAGCATGAAGTTG（配列番号４）を用いてＰＣＲ法によ
り検定した（図４）。その結果、合計５匹（雄４匹、雌
１匹）のラットに導入遺伝子の存在を確認した。そのう
ち５匹が次世代に導入遺伝子を伝えた。
【００４２】実施例３［体重増加抑制能］
実施例２で得られたトランスジェニックラット（ヘテロ
体）の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量
が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジ
ェニックラット（ホモ体）を得た。また、ホモ体である
ことは、ラット尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導
入遺伝子の組み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体の
ｃＤＮＡ量の２倍以上の組み込み量を検出することによ
り確認した。かかるホモ体のトランスジェニックラット
を用いて体重増加抑制能について調べた。３〜４週齢の
野生型ＳＤラットとトランスジェニックラット（ホモ
体）それぞれ８匹ずつの体重の平均値を表１に示す。St
udent's t test, Ｐ＜０．０１、平均値±標準誤差で表
し有意差が認められ、レギュカルチン遺伝子の過剰発現
により、体重増加が抑制されることを確認することがで
きた。
体）の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量
が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジ
ェニックラット（ホモ体）を得た。また、ホモ体である
ことは、ラット尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導
入遺伝子の組み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体の
ｃＤＮＡ量の２倍以上の組み込み量を検出することによ
り確認した。かかるホモ体のトランスジェニックラット
を用いて体重増加抑制能について調べた。３〜４週齢の
野生型ＳＤラットとトランスジェニックラット（ホモ
体）それぞれ８匹ずつの体重の平均値を表１に示す。St
udent's t test, Ｐ＜０．０１、平均値±標準誤差で表
し有意差が認められ、レギュカルチン遺伝子の過剰発現
により、体重増加が抑制されることを確認することがで
きた。
【００４３】
【表１】
【００４４】実施例４［骨病態モデル動物］
（ＳＤ系ホモタイプ骨病態モデルラット）実施例２で得
られたトランスジェニックラット（ヘテロ体）の系統の
内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系
統同士を交配することにより、トランスジェニックラッ
ト（ホモ体）を得た。また、ホモ体であることは、ラッ
ト尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の組
み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体のｃＤＮＡ量の
２倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。
外見上骨病態を呈していない上記ホモ体のトランスジェ
ニックラットの中から、継体的に安定して生存している
雌雄のラットを、試験区のＳＤ系骨病態モデルラット
（ホモ体）として用い、骨の形態学的測定評価（骨密
度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ）と骨
成分の生化学的測定評価（カルシウム量、骨芽細胞・造
骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活
性、骨組織中の細胞数指標であるＤＮＡ量）を行った。
また、対照区として雌雄のＳＤ系野生型正常ラットを用
いた。なお、各測定評価において、試験区・対照区と
も、ラットは各群５匹を使用し、各測定値は平均値±標
準誤差で示し、統計的有意差検出は、Student's t-test
を用いて行い、Ｐ＜０．０１（１％）以下を有意差あり
とした。
られたトランスジェニックラット（ヘテロ体）の系統の
内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系
統同士を交配することにより、トランスジェニックラッ
ト（ホモ体）を得た。また、ホモ体であることは、ラッ
ト尾組織より抽出したゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の組
み込みをＰＣＲ法にて確認し、ヘテロ体のｃＤＮＡ量の
２倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。
外見上骨病態を呈していない上記ホモ体のトランスジェ
ニックラットの中から、継体的に安定して生存している
雌雄のラットを、試験区のＳＤ系骨病態モデルラット
（ホモ体）として用い、骨の形態学的測定評価（骨密
度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ）と骨
成分の生化学的測定評価（カルシウム量、骨芽細胞・造
骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活
性、骨組織中の細胞数指標であるＤＮＡ量）を行った。
また、対照区として雌雄のＳＤ系野生型正常ラットを用
いた。なお、各測定評価において、試験区・対照区と
も、ラットは各群５匹を使用し、各測定値は平均値±標
準誤差で示し、統計的有意差検出は、Student's t-test
を用いて行い、Ｐ＜０．０１（１％）以下を有意差あり
とした。
【００４５】（骨の形態学的測定評価）５〜６週齢の雌
雄のＳＤ系骨病態モデルラット（試験区）及びＳＤ系野
生型正常ラット（対照区）をエーテル麻酔下で解剖して
大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に
供するまで７０％エタノール溶液中に完全に浸して保存
したものを標本とした。この標本を動物研究用ｐＱＴＣ
骨密度測定装置（XCT Reserch SA+：Stratec Medizinte
cnik GmbH Pforzhein Germany）を用いて、骨幹端部に
おいては遠位骨端（成長軟骨板）から２．０ｍｍの部位
よりスライス幅０．５ｍｍずつで５箇所のスキャンを行
った。また、骨長の約１／２の部位を骨幹部とし、１ヶ
所スキャンを行った。スキャンの結果を図５（試験区；
上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）と図６（対
照区；上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）に示
す。スキャン後、各群骨幹部と骨幹端部の骨密度、骨強
度、骨幹部組織の皮質骨厚、及び骨幹部組織の皮質骨外
膜周囲長が自動的に算出・表示された。結果をそれぞれ
表２〜表５に示す。なお、表６に、上記ｐＱＴＣ測定に
おける測定パラメーターと解析パラメーターを示す。
雄のＳＤ系骨病態モデルラット（試験区）及びＳＤ系野
生型正常ラット（対照区）をエーテル麻酔下で解剖して
大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に
供するまで７０％エタノール溶液中に完全に浸して保存
したものを標本とした。この標本を動物研究用ｐＱＴＣ
骨密度測定装置（XCT Reserch SA+：Stratec Medizinte
cnik GmbH Pforzhein Germany）を用いて、骨幹端部に
おいては遠位骨端（成長軟骨板）から２．０ｍｍの部位
よりスライス幅０．５ｍｍずつで５箇所のスキャンを行
った。また、骨長の約１／２の部位を骨幹部とし、１ヶ
所スキャンを行った。スキャンの結果を図５（試験区；
上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）と図６（対
照区；上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部）に示
す。スキャン後、各群骨幹部と骨幹端部の骨密度、骨強
度、骨幹部組織の皮質骨厚、及び骨幹部組織の皮質骨外
膜周囲長が自動的に算出・表示された。結果をそれぞれ
表２〜表５に示す。なお、表６に、上記ｐＱＴＣ測定に
おける測定パラメーターと解析パラメーターを示す。
【００４６】ｐＱＴＣ測定の結果、雄雌とも正常ラット
と比較して骨病態モデルラットでは骨密度が減少し、特
に雌において顕著であった（表２）。骨強度において
は、雄の正常ラットと比較して雄の骨病態モデルラット
では骨強度が減少していたが、雌においては骨幹部、骨
幹端部ともに骨病態モデルラットで骨強度が正常ラット
の約４０〜４５％にまで減少することが明らかになった
（表３）。骨幹部（皮質骨）組織の皮質は、雄雌共に、
正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質骨厚が
有意に減少していた（表４）。骨幹部（皮質骨）組織の
皮質外膜周囲長は、雄においては２群間で有意な差は認
められなかったが、雌においては、正常ラットと比較し
て骨病態モデルラットで皮質外膜周囲長が有意に減少し
た（表５）。
と比較して骨病態モデルラットでは骨密度が減少し、特
に雌において顕著であった（表２）。骨強度において
は、雄の正常ラットと比較して雄の骨病態モデルラット
では骨強度が減少していたが、雌においては骨幹部、骨
幹端部ともに骨病態モデルラットで骨強度が正常ラット
の約４０〜４５％にまで減少することが明らかになった
（表３）。骨幹部（皮質骨）組織の皮質は、雄雌共に、
正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質骨厚が
有意に減少していた（表４）。骨幹部（皮質骨）組織の
皮質外膜周囲長は、雄においては２群間で有意な差は認
められなかったが、雌においては、正常ラットと比較し
て骨病態モデルラットで皮質外膜周囲長が有意に減少し
た（表５）。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】（骨成分の生化学的測定評価）５〜６週齢
の雌雄のＳＤ系ホモタイプ骨病態モデルラット（試験
区）及びＳＤ系野生型正常ラット（対照区）をエーテル
麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去
し、所定の測定に供するまで７０％エタノール溶液中に
完全に浸して保存したものを標本とした。この標本か
ら、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）に分けて、
カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であ
るアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標
であるＤＮＡ量の測定を行った。
の雌雄のＳＤ系ホモタイプ骨病態モデルラット（試験
区）及びＳＤ系野生型正常ラット（対照区）をエーテル
麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去
し、所定の測定に供するまで７０％エタノール溶液中に
完全に浸して保存したものを標本とした。この標本か
ら、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）に分けて、
カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であ
るアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標
であるＤＮＡ量の測定を行った。
【００５３】骨組織中のカルシウム量（ｍｇ／ｇ骨乾燥
重量）の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿
骨）を、それぞれ６４０℃で２４時間灰化し、重量を測
り、その後６Ｎ塩酸に溶解して骨カルシウム量を原子吸
光度にて測定した。骨組織中のカルシウム量をｍｇ／ｇ
骨乾燥重量で表した結果を表７に示す。表７からもわか
るように、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデル
ラットでは骨カルシウム量が有意に減少していたが、特
に雌において骨カルシウム量の減少が顕著であった。
重量）の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿
骨）を、それぞれ６４０℃で２４時間灰化し、重量を測
り、その後６Ｎ塩酸に溶解して骨カルシウム量を原子吸
光度にて測定した。骨組織中のカルシウム量をｍｇ／ｇ
骨乾燥重量で表した結果を表７に示す。表７からもわか
るように、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデル
ラットでは骨カルシウム量が有意に減少していたが、特
に雌において骨カルシウム量の減少が顕著であった。
【００５４】
【表７】
【００５５】骨組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性
の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、
それぞれ氷冷した６．５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ
７．４）３ｍｌに浸し、小片にカットし、テフロン（登
録商標）乳棒のついたPotter-Elvehjemホモジナイザー
にて均質とし、超音波装置にて６０秒間かけて破壊し
た。６００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、得られた上清
を酵素活性の測定に使用した。アルカリ性ホスファター
ゼ活性はWalterとSchuttの方法（Bergmeyer HU (ed) Me
thodsof enzymatic analysis, Vol.1-2,Academic Pres
s, New York, PP856-860, 1965）に準じて測定した。ま
た、タンパク質の濃度はLowryらの方法（J. Biol. Che
m., 193, 265-273, 1951）に準じて測定した。骨組織中
のアルカリ性ホスファターゼ活性を遊離したｐ−ニトロ
フェノールのμｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質として表し
た結果を表８に示す。表８から、正常ラットと比較して
骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質骨）においては
雄でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇してお
り、また骨幹端部（海綿骨）においては雌でアルカリ性
ホスファターゼ活性が有意に上昇していた。
の測定は、骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、
それぞれ氷冷した６．５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ
７．４）３ｍｌに浸し、小片にカットし、テフロン（登
録商標）乳棒のついたPotter-Elvehjemホモジナイザー
にて均質とし、超音波装置にて６０秒間かけて破壊し
た。６００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、得られた上清
を酵素活性の測定に使用した。アルカリ性ホスファター
ゼ活性はWalterとSchuttの方法（Bergmeyer HU (ed) Me
thodsof enzymatic analysis, Vol.1-2,Academic Pres
s, New York, PP856-860, 1965）に準じて測定した。ま
た、タンパク質の濃度はLowryらの方法（J. Biol. Che
m., 193, 265-273, 1951）に準じて測定した。骨組織中
のアルカリ性ホスファターゼ活性を遊離したｐ−ニトロ
フェノールのμｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質として表し
た結果を表８に示す。表８から、正常ラットと比較して
骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質骨）においては
雄でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇してお
り、また骨幹端部（海綿骨）においては雌でアルカリ性
ホスファターゼ活性が有意に上昇していた。
【００５６】
【表８】
【００５７】骨組織中のＤＮＡ量の測定は、骨幹部（皮
質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、それぞれ氷冷した６．
５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌに浸
し、小片にカットした後、氷冷した０．１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液４．０ｍｌにて２４時間振り混ぜた。アルカ
リ抽出後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得
られた上清をＤＮＡ量の測定に使用した。ＤＮＡ量はCe
riottiの方法（J. Biol.Chem., 214,39-77,1955）に準
じて測定した。骨組織中のＤＮＡ量をｍｇ／ｇ骨組織湿
重量として表した結果を表９に示す。表９から、正常ラ
ットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質
骨）においては雌でＤＮＡ量が有意に減少しており、ま
た骨幹端部（海綿骨）においては雌雄ともにＤＮＡ量が
有意に減少していた。
質骨）と骨幹端部（海綿骨）を、それぞれ氷冷した６．
５ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌに浸
し、小片にカットした後、氷冷した０．１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液４．０ｍｌにて２４時間振り混ぜた。アルカ
リ抽出後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得
られた上清をＤＮＡ量の測定に使用した。ＤＮＡ量はCe
riottiの方法（J. Biol.Chem., 214,39-77,1955）に準
じて測定した。骨組織中のＤＮＡ量をｍｇ／ｇ骨組織湿
重量として表した結果を表９に示す。表９から、正常ラ
ットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部（皮質
骨）においては雌でＤＮＡ量が有意に減少しており、ま
た骨幹端部（海綿骨）においては雌雄ともにＤＮＡ量が
有意に減少していた。
【００５８】
【表９】
【００５９】以上のように、本発明の骨病態モデル動物
においては、大腿骨組織の明らかな骨変化が見い出さ
れ、この骨変化は、大腿骨の骨幹部（皮質骨）と骨幹端
部（海綿骨）の両部において、形態学的並びに生化学的
（骨成分）に認められ、骨組織が骨吸収（骨塩溶解）を
引き起こし、骨形成も障害されていることに基づくこと
が明らかになった。特に、雄（male）よりも雌（femal
e）において、その骨変化は顕著であった。また、本発
明の骨病態モデル動物においては、骨病態の発現形質が
継体的に安定していることも確認されている。
においては、大腿骨組織の明らかな骨変化が見い出さ
れ、この骨変化は、大腿骨の骨幹部（皮質骨）と骨幹端
部（海綿骨）の両部において、形態学的並びに生化学的
（骨成分）に認められ、骨組織が骨吸収（骨塩溶解）を
引き起こし、骨形成も障害されていることに基づくこと
が明らかになった。特に、雄（male）よりも雌（femal
e）において、その骨変化は顕著であった。また、本発
明の骨病態モデル動物においては、骨病態の発現形質が
継体的に安定していることも確認されている。
【００６０】
【発明の効果】本発明のレギュカルチントランスジェニ
ック非ヒト動物、特にレギュカルチントランスジェニッ
クラットは、肝障害、腎障害、糖尿病、心筋梗塞、高血
圧、アルツハイマーなどＣａ2+シグナリングが関与する
成人病、生活習慣病、老人病など病態評価用実験モデル
動物として有用である。また、レギュカルチンは細胞内
Ｃａ2+シグナリングに関連した細胞機能を調節してお
り、本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト
動物はかかるレギュカルチンを過剰発現することから、
臓器特異的な病態（肝癌、心筋梗塞、大脳痴呆症）の修
復・改善のための遺伝子治療薬開発のためのモデル動物
として有用な手段になりうる。また、本発明の骨病態モ
デル動物は、骨粗鬆症等の骨疾患治療のための病態モデ
ル動物として、骨病態機構の解明や新薬の開発を目的と
した前臨床試験等に有利に用いることができる。
ック非ヒト動物、特にレギュカルチントランスジェニッ
クラットは、肝障害、腎障害、糖尿病、心筋梗塞、高血
圧、アルツハイマーなどＣａ2+シグナリングが関与する
成人病、生活習慣病、老人病など病態評価用実験モデル
動物として有用である。また、レギュカルチンは細胞内
Ｃａ2+シグナリングに関連した細胞機能を調節してお
り、本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト
動物はかかるレギュカルチンを過剰発現することから、
臓器特異的な病態（肝癌、心筋梗塞、大脳痴呆症）の修
復・改善のための遺伝子治療薬開発のためのモデル動物
として有用な手段になりうる。また、本発明の骨病態モ
デル動物は、骨粗鬆症等の骨疾患治療のための病態モデ
ル動物として、骨病態機構の解明や新薬の開発を目的と
した前臨床試験等に有利に用いることができる。
【００６１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
<120> Regucalcin gene-transferred non-human animals
<130> 13-217
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 900
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(900)
<400> 1
atg tct tcc atc aag att gaa tgt gtt tta agg gag aac tac agg tgt 48
Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys
1 5 10 15
ggg gag tcc cct gtg tgg gag gag gca tca aag tgt ctg ctg ttt gta 96
Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val
20 25 30
gac atc cct tca aag act gtc tgc cga tgg gat tcg atc agc aat cga 144
Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg
35 40 45
gtg cag cga gtt ggt gta gat gcc cca gtc agt tca gtg gca ctt cga 192
Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg
50 55 60
cag tca gga ggc tat gtt gcc acc att gga acc aag ttc tgt gct ttg 240
Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu
65 70 75 80
aac tgg gaa gat caa tca gta ttt atc cta gcc atg gtg gat gaa gat 288
Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp
85 90 95
aag aaa aac aat cga ttc aat gat ggg aag gtg gat cct gct ggg aga 336
Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg
100 105 110
tac ttt gct ggt acc atg gct gag gaa acc gcc cca gct gtt ctg gag 384
Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu
115 120 125
cgg cac caa ggg tcc ttg tac tcc ctt ttt cct gat cac agt gtg aag 432
Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys
130 135 140
aaa tac ttt aac caa gtg gat atc tcc aat ggt ttg gat tgg tcc ctg 480
Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu
145 150 155 160
gac cat aaa atc ttc tac tac att gac agc ctg tcc tac act gtg gat 528
Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp
165 170 175
gcc ttt gac tat gac ctg cca aca gga cag att tcc aac cgc agg act 576
Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr
180 185 190
gtt tac aag atg gaa aaa gat gaa caa atc cca gat gga atg tgc att 624
Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile
195 200 205
gat gtt gag ggg aag ctt tgg gtg gcc tgt tac aat gga gga aga gta 672
Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val
210 215 220
att cgc cta gat cct gag aca ggg aaa aga ctg caa act gtg aag ttg 720
Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu
225 230 235 240
cct gtt gat aaa aca act tca tgc tgc ttt gga ggg aag gat tac tct 768
Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser
245 250 255
gaa atg tac gtg aca tgt gcc agg gat ggg atg agc gcc gaa ggt ctt 816
Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu
260 265 270
ttg agg cag cct gat gct ggt aac att ttc aag ata aca ggt ctt ggg 864
Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly
275 280 285
gtc aaa gga att gct cca tat tcc tat gca ggg taa 900
Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly
290 295 300
<210> 2
<211> 299
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 2
Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys
1 5 10 15
Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val
20 25 30
Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg
35 40 45
Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu
65 70 75 80
Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp
85 90 95
Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg
100 105 110
Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu
115 120 125
Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys
130 135 140
Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu
145 150 155 160
Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp
165 170 175
Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr
180 185 190
Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile
195 200 205
Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val
210 215 220
Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu
225 230 235 240
Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser
245 250 255
Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu
260 265 270
Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly
275 280 285
Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly
290 295
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer huRC-1
<400> 3
ggaggctatg ttgccaccat tgga 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer huRC-2
<400> 4
ccctccaaag cagcatgaag ttg 23
【図１】本発明のトランスジェニックラット作製用発現
ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤ
ＮＡよりＯＲＦ部分を切り出す過程を示す図である。
ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤ
ＮＡよりＯＲＦ部分を切り出す過程を示す図である。
【図２】本発明のトランスジェニックラット作製用発現
ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤ
ＮＡのＯＲＦ部分を発現ベクターpCXN2に導入する過程
を示す図である。
ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長ｃＤ
ＮＡのＯＲＦ部分を発現ベクターpCXN2に導入する過程
を示す図である。
【図３】本発明のトランスジェニックラット作製用のリ
ニアライズされた導入遺伝子断片調製の過程を示す図で
ある。
ニアライズされた導入遺伝子断片調製の過程を示す図で
ある。
【図４】本発明のトランスジェニックラット中のレギュ
カルチン遺伝子のＰＣＲによる確認におけるプライマー
の位置を示す図である。
カルチン遺伝子のＰＣＲによる確認におけるプライマー
の位置を示す図である。
【図５】動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置を用いた、
本発明の骨病態モデルラットの大腿骨組織（骨幹端部及
び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
本発明の骨病態モデルラットの大腿骨組織（骨幹端部及
び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
【図６】動物研究用ｐＱＴＣ骨密度測定装置を用いた、
対照のＳＤ系野生型正常ラットの大腿骨組織（骨幹端部
及び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
対照のＳＤ系野生型正常ラットの大腿骨組織（骨幹端部
及び骨幹部）のスキャンの結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10
１０１ １０１
9/12 9/12
13/12 13/12
19/08 19/08
19/10 19/10
25/00 １０１ 25/00 １０１
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/42
1/42 1/68 Ｚ
1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB13
4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07
DA02 DA06 EA03 EA04 GA18
GA19 HA20
4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ33 QQ42
QQ89 QR77 QR80 QS12 QS28
QX01
4C084 AA17 MA01 NA14 ZA022
ZA152 ZA362 ZA402 ZA422
ZA452 ZA702 ZA812 ZA962
ZA972 ZC212 ZC352
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40
EA50 FA74
Claims (39)
- 【請求項１】 レギュカルチン遺伝子が導入され、レギ
ュカルチンを過剰発現することを特徴とするトランスジ
ェニック非ヒト動物。 - 【請求項２】 サイトメガロウイルス−ＩＥエンハンサ
ー，チキンβ−アクチンプロモーター，レギュカルチン
遺伝子，ラビットβ−グロビンポリＡシグナルの順に配
列された直鎖ＤＮＡが導入されたことを特徴とする請求
項１記載のトランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項３】 レギュカルチン遺伝子が、配列表の配列
番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
する遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載
のトランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配
列番号１記載のＤＮＡ配列からなるラットレギュカルチ
ン遺伝子であることを特徴とする請求項３記載のトラン
スジェニック非ヒト動物。 - 【請求項５】 ホモ体であることを特徴とする請求項１
〜４のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項６】 体重増加抑制能を有することを特徴とす
る請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニック非
ヒト動物。 - 【請求項７】 大脳機能障害発症性であることを特徴と
する請求項１〜６のいずれか記載のトランスジェニック
非ヒト動物。 - 【請求項８】 インスリン非依存性糖尿病発症性である
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のトラン
スジェニック非ヒト動物。 - 【請求項９】 腎性高血圧発症性であることを特徴とす
る請求項１〜８のいずれか記載のトランスジェニック非
ヒト動物。 - 【請求項１０】 尿細管再吸収障害発症性であることを
特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のトランスジェ
ニック非ヒト動物。 - 【請求項１１】 非ヒト動物がラットであることを特徴
とする請求項１〜１０のいずれか記載のトランスジェニ
ック非ヒト動物。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか記載のトラ
ンスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とするレ
ギュカルチンの製造方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜１１のいずれか記載のトラ
ンスジェニック非ヒト動物又は該トランスジェニック非
ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物質とを
用いることを特徴とするレギュカルチン過剰発現に起因
する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１４】 トランスジェニック非ヒト動物に被検
物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物におけ
る体重増加の程度を測定・評価することを特徴とする請
求項１３記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病
の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１５】 レギュカルチン過剰発現に起因する疾
病が、大脳機能障害であることを特徴とする請求項１３
又は１４記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病
の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１６】 レギュカルチン過剰発現に起因する疾
病が、インスリン非依存性糖尿病であることを特徴とす
る請求項１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現に
起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１７】 レギュカルチン過剰発現に起因する疾
病が、腎性高血圧であることを特徴とする請求項１３又
は１４記載のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の
予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１８】 レギュカルチン過剰発現に起因する疾
病が、尿細管再吸収障害であることを特徴とする請求項
１３又は１４記載のレギュカルチン過剰発現に起因する
疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１９】 請求項１３〜１８のいずれか記載のス
クリーニング方法により得られるレギュカルチン過剰発
現に起因する疾病の予防・治療薬。 - 【請求項２０】 請求項１〜１１のいずれか記載のトラ
ンスジェニック非ヒト動物又は該トランスジェニック非
ヒト動物由来の組織，器官もしくは細胞と被検物質とを
用いることを特徴とするレギュカルチン発現低下に起因
する疾病の原因物質のスクリーニング方法。 - 【請求項２１】 トランスジェニック非ヒト動物に被検
物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物におけ
る体重減少の程度を測定・評価することを特徴とする請
求項２０記載のレギュカルチン発現低下に起因する疾病
の原因物質のスクリーニング方法。 - 【請求項２２】 レギュカルチン発現低下に起因する疾
病が、動脈硬化心筋梗塞であることを特徴とする請求項
２０又は２１記載のレギュカルチン発現低下に起因する
疾病の原因物質のスクリーニング方法。 - 【請求項２３】 レギュカルチン発現低下に起因する疾
病が、心筋梗塞であることを特徴とする請求項２０又は
２１記載のレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原
因物質のスクリーニング方法。 - 【請求項２４】 請求項２０〜２３のいずれか記載のス
クリーニング方法により得られるレギュカルチン発現低
下に起因する疾病の原因物質。 - 【請求項２５】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物であって、骨病態を呈することを特徴とする骨病態
モデル動物。 - 【請求項２６】 骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長
遅延のいずれか１以上の骨病態を呈することを特徴とす
る請求項２５記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項２７】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物から、骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生
化学的測定評価により選抜・確認されたことを特徴とす
る請求項２５又は２６記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項２８】 骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨
強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１
以上の測定評価であることを特徴とする請求項２７記載
の骨病態モデル動物。 - 【請求項２９】 骨成分の生化学的測定評価が、カルシ
ウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮ
Ａ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とす
る請求項２７記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項３０】 骨病態の表現形質が継代的に安定して
いることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれか記載
の骨病態モデル動物。 - 【請求項３１】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物が、レギュカルチン遺伝子が導入されたトランスジ
ェニック非ヒト動物であることを特徴とする請求項２５
〜３０のいずれか記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項３２】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物が、ホモ体であることを特徴とする２６〜３２のい
ずれか記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項３３】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請求項
２５〜３２のいずれか記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項３４】 レギュカルチンを過剰発現する非ヒト
動物が、ラットであることを特徴とする請求項２５〜３
３のいずれか記載の骨病態モデル動物。 - 【請求項３５】 請求項２５〜３４のいずれか記載の骨
病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動
物における骨の形態学的測定評価及び／又は骨成分の生
化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病態の予防・
治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項３６】 骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨
強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか１
以上の測定評価であることを特徴とする請求項３５記載
の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項３７】 骨成分の生化学的測定評価が、カルシ
ウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のＤＮ
Ａ量のいずれか１以上の測定評価であることを特徴とす
る請求項３５記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項３８】 骨病態が骨粗鬆症であることを特徴と
する請求項３５〜３７のいずれか記載の骨病態の予防・
治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項３９】 請求項３５〜３８のいずれか記載のス
クリーニング方法により得られる骨病態の予防・治療
薬。
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