JPH07123985A

JPH07123985A - レギュカルチンをコードするｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH07123985A
Application number: JP5279349A
Authority: JP
Inventors: Masayoshi Yamaguchi; 正義山口
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1993-11-09
Publication date: 1995-05-16

Abstract

(57)【要約】【構成】肝細胞質由来のレギュカルチンをコードする
ＤＮＡ断片、当該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ
及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。【効果】レギュカルチンを大量に製造することを可能
にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査薬、試薬とし
ての有用性が期待されるＣａ²⁺結合蛋白質であるレギュ
カルチンをコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む
組換え体ＤＮＡ及び該組換え体ＤＮＡを保有する形質転
換体細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃａ²⁺による細胞機能調節の主な役割は
細胞内代謝に関与する酵素の活性調節にある。

【０００３】従来、Ｃａ²⁺がカルモジュリンを介して酵
素の活性化を増幅させる機構は知られていた。

【０００４】これに対し、レギュカルチンはラット肝細
胞質から単離された新しいＣａ²⁺結合蛋白質である。レ
ギュカルチンは上記カルモジュリンとは異なり肝臓に顕
著に存在する等電点pI５．２０の酸性蛋白質であり、そ
のＣａ²⁺結合定数は４．１９×１０⁵Ｍ^-1を示し、６〜
７個の高親和性Ｃａ²⁺結合部位を持ち、α−ヘリックス
構造を３４％含む。レギュカルチンにＣａ²⁺が結合する
とレギュカルチンの構造はルーズになるという特徴を有
する。また、レギュカルチンはＣａ²⁺による肝臓の酵素
の活性化を制御していることが知られており、Ｃａ²⁺に
よる細胞内情報伝達系の制御因子としての役割を果して
いる。さらに、四塩化炭素肝障害時において肝細胞内の
レギュカルチン量の減少とともに血清中に漏洩している
ことが見出されていることから、肝病態との関係が示唆
される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このようにレギュカル
チンは既存のＣａ²⁺結合蛋白質と異なる性質を有してお
り、すでに試薬として市販されているカルモジュリンと
同様に、研究用試薬として有用性は高い。また、肝病態
との関係が示唆されており、臨床検査薬としても期待さ
れる。しかし、レギュカルチンは肝臓からの抽出、精製
でのみしか入手できず少量しか得ることができなかっ
た。

【０００６】従って本発明の目的は、レギュカルチンの
アミノ酸配列を解明し、これをコードするＤＮＡ断片を
得、これを基に、レギュカルチンを遺伝子組換え技術に
より量産する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み、本発
明者は鋭意研究を行った結果、ラットの肝臓からｍＲＮ
Ａを分離し、これを基にｃＤＮＡを得、この塩基配列を
解析することに成功し本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、レギュカルチンをコー
ドするＤＮＡ断片、当該断片を含有する組換え体ＤＮ
Ａ、及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。

【０００９】本発明のＤＮＡ断片は、例えば遺伝子組換
え技術を利用して次の如くして製造される。

【００１０】すなわちラットの肝臓からｍＲＮＡを調製
し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを発現ベク
ターに組み込み、大腸菌で発現させる。得られた蛋白質
の中から抗レギュカルチン抗体と反応するクローンをス
クリーニングし、陽性クーロンからｃＤＮＡを抽出すれ
ばよい。得られたｃＤＮＡは、シークエンサにより塩基
配列を分析することができる。

【００１１】詳細には、次の如くしてＤＮＡ断片を調製
する。まず、ラットからｍＲＮＡを抽出する。ラットは
ウイスター系雄性ラットが好ましく、これから肝臓を摘
出し、ホモジナイズする。これを、フェノール等で抽出
し、遠心分離、アルコール沈澱等の方法を適宜組合せれ
ばｍＲＮＡが得られる。

【００１２】得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵
素を用い、１本鎖のｃＤＮＡを合成する。この一本鎖ｃ
ＤＮＡを新たな鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより
二本鎖のｃＤＮＡを得ることができる。

【００１３】二本鎖のＤＮＡは、ファージにパッケージ
ングし、これを大腸菌等に感染させ、培養する。培養
後、例えば抗レギュカルチン抗体に結合した分子を色素
発色反応によって特異的に染め出すことにより、レギュ
カルチンｃＤＮＡ陽性プラークを同定することができ
る。

【００１４】この陽性プラークを単離し、ヘルパーファ
ージと共に大腸菌等の宿主に感染させ、得られたファー
ジ液をさらに大腸菌等に感染させ、レギュカルチンのｃ
ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ（プラスミド）と
して宿主細胞内で複製させる。この宿主細胞をアンピシ
リン含有プレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニー
を選択すれば、本発明のＤＮＡ断片を含有する組換え体
ＤＮＡを保有する形質転換体細胞が得られる。

【００１５】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えＤＮＡを採取するには常法により抽出すれば
よく、得られた組換えＤＮＡから本発明のＤＮＡ断片を
切り出すには制限酵素等を用いればよい。

【００１６】かくして得られる本発明ＤＮＡ断片の塩基
配列も常法により決定することができる。配列番号２に
本発明ＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１に当該塩基
配列に相当するアミノ酸配列を、配列番号３にこの塩基
配列及びアミノ酸配列を示す。この配列をもとに合成化
学の手法により、このような完全な塩基配列あるいはそ
の一部を合成することができる。また、この塩基配列に
対応したアミノ酸も合成することができる。合成した全
塩基配列あるいはその一部をプローブとしてｍＲＮＡの
定量、ｃＤＮＡの分離を行うこともできる。また、既知
の組換えＤＮＡ技術により、この蛋白質あるいは一部修
飾した蛋白質を発現させることもできる。なお、これら
はラットに限らずヒトを含めた他の動物種にも応用でき
る。本発明ＤＮＡ断片を発現させ、レギュカルチンを生
産するには、上記の形質転換体細胞又は当該ＤＮＡ断片
を強力なプロモータを有するベクターに組込んだ組換え
プラスミドで形質転換された細胞を栄養培地にて培養
し、その培養物から採取すればよい。この場合における
培養は、用いる形質転換体細胞の性質に応じて行なわれ
る。

【００１７】

【発明の効果】本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体細胞を用いれば、活性の高いレギュカルチンを多
量に生産することが可能となる。

【００１８】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものでは
ない。なお、実施例に用いた試薬、酵素等はすべて市販
のものである。ただし、抗レギュカルチン抗体は精製し
たレギュカルチンをウサギに免疫し作製したものであ
る。

【００１９】実施例１（ＲＮＡの調製）ウイスター系雄性ラット（３週齢）か
ら肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液
（４Ｍグアニジニウムチオシアネート，２５mMクエン酸
ナトリウム（pH７．０），０．５％サルコシル，０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール，２Ｍ酢酸ナトリウム）で
ホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール混液で抽出し、４℃、１０，００
０×ｇで２０分遠心した。水層にイソプロパノールを加
え、−２０℃で放置し、ＲＮＡを沈澱させた。回収した
沈澱はジエチルピロカーボネート処理した０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムに通し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し
た。

【００２０】（ｃＤＮＡライブラリーの作製）精製した
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）に５０ｕｎｉｔのＭｏｌ
ｏｎｅｙ−ＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａウイルス逆
転写酵素とオリゴ（ｄＴ）₁₈プライマーリンカーを添加
し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。さらに合成した１本鎖
ｃＤＮＡに大腸菌リボヌクレアーゼＨとＤＮＡポリメラ
ーゼＩを添加し、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにＥ
ｃｏＲＩアダプターを付加し、ＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩで
消化したファージ発現ベクター（λＺＡＰＩＩ）と連結
した。さらにパッケージングエキストラクトを用いてフ
ァージにパッケージングしｃＤＮＡライブラリーのファ
ージを作製した。

【００２１】（レギュカルチンｃＤＮＡクローンの選
抜）ラット肝のｃＤＮＡライブラリーのファージ約１×
１０⁶個を大腸菌と混合し２０個の寒天プレートに植菌
した。４２℃で３時間半インキュベートした後、プレー
トに１０mMイソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシドで処
理したニトロセルロース膜をのせ、３７℃で３時間半イ
ンキュベートした。ニトロセルロース膜はブロッキング
した後、抗レギュカルチンウサギ血清（×２００）と室
温で２時間インキュベートした。膜は洗浄した後、アル
カリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を加えイン
キュベートした。これを発色液（０．３５mMニトロブル
ーテトラゾリウム，０．４mM５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェート）に浸し発色させ、レギュ
カルチンｃＤＮＡ陽性プラークを同定した。

【００２２】（プラスミドベクターへのサブクローニン
グ）ファージベクターλＺＡＰＩＩは、その配列中にプ
ラスミドベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの塩基
配列を含み、λＺＡＰＩＩにクローニングされたレギュ
カルチンのｃＤＮＡ断片はこのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
に挿入されている。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの両
端にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在し
ている。そこで同定したプラークよりファージを単離
し、Ｒ４０８ヘルパーファージとともに大腸菌ＳＵＲＥ
に感染させ、レギュカルチンのｃＤＮＡ断片を含むｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔを大腸菌内で合成させ、ヘルパーフ
ァージの形で大腸菌体外に放出させた。このファージ液
をさらに大腸菌ＳＵＲＥに感染させ、レギュカルチンの
ｃＤＮＡ断片を有するプラスミドとして菌内で複製させ
た。この大腸菌を５０μｇ／mlアンピシリン含有のＬＢ
プレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニーを選択し
た。

【００２３】（ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定）
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅシステム（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社製）を用いてｃＤＮＡインサートの全塩基配列
を決定した。すなわちプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断し、断片はアルカリ変性処理した後、プライマーを
加えアニーリングした。これに³⁵ＳｄＣＴＰ、０．１Ｍ
ＤＴＴ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ用酵素液を添加した後４
等分し、各々にｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、
ｄｄＣＴＰを加え、３７℃５分間インキュベートした。
これらはアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オート
ラジオグラフィーを行ない、塩基配列を読み取った。配
列番号３にｃＤＮＡインサートの全塩基配列を示す。
５′末側から８０番目に翻訳開始コドンＡＴＧのＡがみ
られ、９７７〜９７９番目に終始コドンＴＡＡがみられ
た。この読み枠に相当する塩基配列をアミノ酸に変換す
ると合計２９９個のアミノ酸をコードすることがわかっ
た。得られたアミノ酸配列も配列番号３に示す。これか
ら計算されるレギュカルチンの分子量は３３，３８８で
あった。この値は精製したレギュカルチンをＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法により算出した分子量と一致
した。このレギュカルチンをコードするｃＤＮＡの塩基
配列はＥＭＢＬやＧｅｎｂａｎｋのデータベースに登録
されている塩基配列とは一致せず、既存のものとは異な
ることがわかった。また、他のＣａ²⁺結合蛋白質のアミ
ノ酸配列と比較したところ相同性は低かった（カルモジ
ュリン，１３．３％；カルビンデン−Ｄ２８Ｋ，１６．
３％；Ｓ−１００β，１１．０％）。

【００２４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２９９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyl Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asn Gly Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295

【００２５】

【配列表】配列番号：２配列の長さ：８９７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ラット配列： ATGTCTTCCA TCAAGATTGA ATGTGTTTTA AGGGAGAACT ACAGGTGTGG GGAGTCCCCT 60 GTGTGGGAGG AGGCATCAAA GTGTCTGCTG TTTGTAGACA TCCCTTCAAA GACTGTCTGC 120 CGATGGGATT CGATCAGCAA TCGAGTGCAG CGAGTTGGTG TAGATGCCCC AGTCAGTTCA 180 GTGGCACTTC GACAGTCAGG AGGCTATGTT GCCACCATTG GAACCAAGTT CTGTGCTTTG 240 AACTGGGAAG ATCAATCAGT ATTTATCCTA GCCATGGTGG ATCAAGATAA GAAAAACAAT 300 CGATTCAATG ATGGGAAGGT GGATCCTGCT GGGAGATACT TTGCTGGTAC CATGGCTGAG 360 GAAACCGCCC CAGCTGTTCT GGAGCGGCAC CAAGGGTCCT TGTACTCCCT TTTTCCTGAT 420 GACAGTGTGA AGAAATACTT TAACCAAGTG GATATCTCCA ATGGTTTGGA TTGGTCCCTG 480 GACCATAAAA TCTTCTACTA CATTGACAGC CTGTCCTACA CTGTGGATGC CTTTGACTAT 540 GACCTGCCAA CAGGACAGAT TTCCAACCGC AGGACTGTTT ACAAGATGGA AAAAGATGAA 600 CAAATCCCAG ATGGAATGTG CATTGATGTT GAGGGGAAGC TTTGGGTGGC CTGTTACAAT 660 GGAGGAAGAG TAATTCGCCT AGATCCTGAG ACAGGGAAAA GACTGCAAAC TGTGAAGTTG 720 CCTGTTGATA AAACAACTTC ATGCTGCTTT GGAGGGAAGG ATTACTCTGA AATGTACGTG 780 ACATGTGCCA GGGATGGGAT GAGCGCCGAA GGTCTTTTGA GGCAGCCTGA TGCTGGTAAC 840 ATTTTCAAGA TAACAGGTCT TGGGGTCAAA GGAATTGCTC CATATTCCTA TGCAGGG 897

【００２６】

【配列表】

配列番号：３配列の長さ：１２１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ラット TGGATGCTGG AGTGTTTCCT TTGTCTTCTA TTTTAAAGAT ATCTTGAAAA AAACCTGTCA 60 CTGTCCTTTT CCTGCGACC ATG TCT TCC ATC AAG ATT GAA TGT GTT TTA 109 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu 5 10 AGG GAG AAC TAC AGG TGT GGG GAG TCC CCT GTG TGG GAG GAG GCA TCA 157 Arg Glu Asn Tyr Arg Cys Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser 15 20 25 AAG TGT CTG CTG TTT GTA GAC ATC CCT TCA AAG ACT GTC TGC CGA TGG 205 Lys Cys Leu Leu Phe Val Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Alg Trp 30 35 40 GAT TCG ATC AGC AAT CGA GTG CAG CGA GTT GGT GTA GAT GCC CCA GTC 253 Asp Ser Ile Ser Asn Arg Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val 45 50 55 AGT TCA GTG GCA CTT CGA CAG TCA GGA GGC TAT GTT GCC ACC ATT GGA 301 Ser Ser Val Ala Leu Arg Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly 60 65 70 ACC AAG TTC TGT GCT TTG AAC TGG GAA GAT CAA TCA GTA TTT ATC CTA 349 Thr Lys Phe Cys Ala Leu Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu 75 80 85 90 GCC ATG GTG GAT CAA GAT AAG AAA AAC AAT CGA TTC AAT GAT GGG AAG 397 Ala Met Val Asp Glu Asp Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys 95 100 105 GTG GAT CCT GCT GGG AGA TAC TTT GCT GGT ACC ATG GCT GAG GAA ACC 445 Val Asp Pro Ala Gly Arg Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr 110 115 120 GCC CCA GCT GTT CTG GAG CGG CAC CAA GGG TCC TTG TAC TCC CTT TTT 493 Ala Pro Ala Val Leu Glu Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe 125 130 135 CCT GAT GAC AGT GTG AAG AAA TAC TTT AAC CAA GTG GAT ATC TCC AAT 541 Pro Asp His Ser Val Lys Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn 140 145 150 GGT TTG GAT TGG TCC CTG GAC CAT AAA ATC TTC TAC TAC ATT GAC AGC 589 Gly Leu Asp Trp Ser Leu Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser 155 160 165 170 CTG TCC TAC ACT GTG GAT GCC TTT GAC TAT GAC CTG CCA ACA GGA CAG 637 Leu Ser Tyr Thr Val Asp Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln 175 180 185 ATT TCC AAC CGC AGG ACT GTT TAC AAG ATG GAA AAA GAT GAA CAA ATC 685 Ile Ser Asn Arg Arg Thr Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile 190 195 200 CCA GAT GGA ATG TGC ATT GAT GTT GAG GGG AAG CTT TGG GTG GCC TGT 733 Pro Asp Gly Met Cys Ile Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys 205 210 215 TAC AAT GGA GGA AGA GTA ATT CGC CTA GAT CCT GAG ACA GGG AAA AGA 781 Tyr Asn Gly Gly Arg Val Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg 220 225 230 CTG CAA ACT GTG AAG TTG CCT GTT GAT AAA ACA ACT TCA TGC TGC TTT 829 Leu Gln Thr Val Lys Leu Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe 235 240 245 250 GGA GGG AAG GAT TAC TCT GAA ATG TAC GTG ACA TGT GCC AGG GAT GGG 877 Gly Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly 255 260 265 ATG AGC GCC GAA GGT CTT TTG AGG CAG CCT GAT GCT GGT AAC ATT TTC 925 Met Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe 270 275 280 AAG ATA ACA GGT CTT GGG GTC AAA GGA ATT GCT CCA TAT TCC TAT GCA 973 Lys Ile Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala 285 290 295 GGG TAA ACTGCAGCTC TTCCTTGCTG TCAGAAGAAA AAGCTTGAAG ACAACTGAGA 1029 Gly ATTAAACTGC TGCTCTTCCT TGCTGTCAGA AGAAAAAGCT TGAAGACAAC TGAGAATTAA 1089 GGGAGAGAAA TCAATGAACT TTCATATTGT TTTTTTAATG AGGCAGTGAT ATTGACATGG 1149 TTAAACTGCT TTAATTTACA CTTTTGATTG GGTGCTGGGG AATAAACCTA AAGCCATGGC 1209 ATATTAA 1216

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列で表
わされるレギュカルチンをコードするＤＮＡ断片。
【請求項２】配列番号２で示される塩基配列を有する
ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
換え体ＤＮＡ。
【請求項４】請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。