JP5207137B2 - Bcl−xLトランスジェニック動物およびその利用 - Google Patents
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Description
骨粗鬆症の治療薬としては、活性化ビタミンD3、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビタミンK2、ビスフォスフォネート、副甲状腺ホルモン(米国でのみ認可)等がある。これらの治療薬は、破骨細胞の活性化を抑制するものがほとんどであり、骨芽細胞に働きかけて骨形成を促進させるものは少ない。破骨細胞を抑制した場合は、骨は増えるが、骨のリモデリングが低下して骨質の低下を来たし、それにより骨の強度を低下させる可能性がある。前記治療薬の中で、ビスフォスフォネートと副甲状腺ホルモンで骨折頻度の低下が観察されているが、いまだ不十分であり、新たな治療薬の開発が望まれている。
Bcl−xLは、Bcl−2ファミリーに属し、アポトーシスを抑制する分子である。Bcl−2ファミリーは、Bcl−2およびBcl−xL以外に、BCL−w、BFL−1、A1、MCL−1、BOO、BRAG−1、NR−13、CDN−1、CDN−2、CDN−3、BHRF−1、LMW5−HL、CED−9などが知られている。Bcl−xLは、主としてミトコンドリアの外膜上に存在し、少なくとも部分的にチトクロームcの細胞質への放出を妨げることにより、アポトーシスの一般的な経路を阻害する(非特許文献1〜3)。しかし、Bcl−xLの骨形成および骨の維持に関する機能は明らかになっていない。
Adams,J.M.,and Cory,S.Science,281:p.1322−1326,1998. Gross,A.,McDonnell,J.M.,and Korsmeyer,S.J.Genes Dev.,13:p.1899−1911,1999. Tsujimoto Y.J.Cell.Physiol.195:p.158−167,2003.
本発明者らは、Bclファミリーの中でアポトーシス抑制型として主要な役割を果たしているBcl−xLに注目し、骨芽細胞のアポトーシス抑制により正常の骨量を増加させることができるかを検討するため、骨芽細胞特異的プロモーターを用いて骨芽細胞で強発現するBcl−xLトランスジェニック動物を作出した。本発明者らは、トランスジェニック動物を解析し、鋭意検討した結果、正常骨の形成および維持とBcl−xLとの用量依存性を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔1〕Bcl−xLをコードする遺伝子を含有してなる骨量および骨強度増加剤。
〔2〕前記Bcl−xLコード遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されている、前記〔1〕記載の増加剤。
〔3〕前記プロモーターがI型コラーゲンプロモーターである前記〔2〕記載の増加剤。
〔4〕発現ベクターである前記〔1〕〜〔3〕いずれか1項に記載の増加剤。
〔5〕骨芽細胞特異的プロモーターおよびBcl−xLをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入してなるトランスジェニック動物。
〔6〕前記プロモーターがI型コラーゲンプロモーターである前記〔5〕に記載の動物。
〔7〕同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している前記〔5〕または〔6〕に記載の動物。
〔8〕骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて2倍前後に増加している前記〔5〕〜〔7〕いずれか1項に記載の動物。
〔9〕骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて約3〜5倍に増加している前記〔5〕〜〔7〕いずれか1項に記載の動物。
〔10〕骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて10倍前後に増加している前記〔5〕〜〔7〕いずれか1項に記載の動物。
〔11〕前記動物が実験動物または家畜である前記〔5〕〜〔10〕いずれか1項に記載の動物。
〔12〕前記実験動物がマウスである前記〔11〕に記載の動物。
〔13〕前記動物が成体であり、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも1種のパラメータが有意差を有する、前記〔5〕〜〔12〕いずれか1項に記載の動物。
〔14〕骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして使用される前記〔5〕〜〔13〕いずれか1項に記載の動物。
〔15〕骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用される前記〔5〕〜〔13〕いずれか1項に記載の動物。
〔16〕前記〔5〕〜〔15〕いずれか1項に記載の動物の子孫動物。
〔17〕前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られる骨疾患モデル動物。
〔18〕前記骨疾患が骨粗鬆症、骨芽細胞のアポトーシスの亢進を来す疾患、骨芽細胞の増殖亢進を来す疾患または早期に老化を来す疾患である前記〔17〕に記載のモデル動物。
〔19〕前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物または前記〔17〕もしくは〔18〕に記載のモデル動物から得られる組織または細胞。
〔20〕前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物または前記〔17〕もしくは〔18〕に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔21〕下記工程:
(a)前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物または前記〔17〕もしくは〔18〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)前記比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔22〕下記工程:
(a)前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物または前記〔17〕もしくは〔18〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
を含む、骨量および/または骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法。
〔23〕下記工程:
(a)前記〔5〕〜〔16〕いずれか1項に記載の動物または前記〔17〕もしくは〔18〕に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
(d)工程(a)で用いた動物に、工程(c)で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
(e)工程(d)で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(f)工程(e)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程
を含む、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔24〕下記工程:
(a)骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるBcl−xLの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
(c)前記比較結果に基づいて、Bcl−xLの発現を増加させる被験物質を選択する工程
を含む、Bcl−xLの発現増加を介した骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
〔25〕Bcl−xLを含有してなる骨量および骨強度増加剤。
本発明の骨量および骨強度増加剤によると、Bcl−xL遺伝子またはBcl−xLを主成分とするものであることから、骨芽細胞に導入し、発現させた場合に、骨量および骨強度の増加を伴った骨、すなわち、質・量ともに優れた海綿骨を有する骨を形成または再生することが可能である。本発明のトランスジェニック動物および疾患モデル動物によると、Bcl−xLが骨芽細胞で強発現することにより骨組織での様々な生理学的状態を解明する理想的なモデルとして役立つ。本発明の組織または細胞によると、前記動物から得られるものであることから、in vivoのみならずin vitroで骨量と骨強度の研究に利用することが可能である。前記動物を用いる本発明のスクリーニング方法によると、Bcl−xLを介した骨形成を促進する薬剤であって、形成される骨の質および強度に優れた薬剤等の開発に貢献することができる。
図2は、10週齢のメストランスジェニックマウス(K1、K2、およびK3)および野生型マウス(WT)の大腿骨のX線写真である。
図3は、10週齢のトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウス(WT)の全身(図3A)、大腿骨(図3B)および椎骨(図3C)のX線写真である。
図4は、10週齢、7ヶ月齢および1年齢のトランスジェニックマウスおよび野生型マウス大腿骨遠心部の写真である。
図5は、様々な週齢のトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウス(WT)の皮質骨における様々な組織像の比較を示す図である。上段より、10週齢雄大腿骨遠心部のHE像、10週齢雄大腿骨皮質骨のTUNEL染色、4週齢皮質骨透過電子顕微鏡像(TEM)、10週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡(SEM)による10週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
図6は、5週齢のトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウス(WT)の骨芽細胞におけるI型コラーゲン(Type I)、オステオポンチン(OP)およびオステオカルチン(OC)の発現をノーザンブロッティングにより調べた結果を示す。
図7は、10週齢のトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウス(WT)の大腿骨におけるHE染色、I型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルチンの発現をin situハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す。
図8は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いて骨芽細胞におけるDNAの複製を調べた結果を示す。
図9は、TUNEL法を用いて骨芽細胞におけるアポトーシスの割合を調べた結果を示す。
図10は、野生型(WT)およびBcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部海綿骨領域における骨形態計測学的検討を行ったグラフである。
図11は、pQCTによる大腿骨骨幹皮質骨の解析結果を示すグラフ(上段、中段)および大腿骨遠心部皮質骨のpQCT像(下段)である。
図12は、μCTによる大腿骨骨幹皮質骨の解析結果を示すグラフである。
図13は、pQCTによる大腿骨遠心部海綿骨の解析結果を示すグラフである。
図14は、μCTによる大腿骨遠心部海綿骨の解析結果を示すグラフである。
図15は、トランスジェニックマウス(K1)および野生型マウス(WT)の大腿骨遠心部海綿骨(上段)および第2腰椎海綿骨(下段)のμCT像である。
図16は、10週齢、7ヶ月齢、1年齢における雄のトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウスの大腿骨遠心部X線像およびμCTによる大腿骨遠心部海綿骨像を示す。
図17は、10週齢、7ヶ月齢、1年齢における雄のトランスジェニックマウス(K1)と野生型マウスのμCTによる大腿骨遠心部海綿骨骨量(BV/TV)の解析結果を示すグラフである(mean±SD、*:p<0.05。10週齢WT:n=6、K1:n=9;7ヶ月齢WT:n=4、K1:n=6;1年齢WT:n=3、K1:n=8)。
図18は、トランスジェニックマウスおよび野生型マウスにおけるmRNA発現をノーザンブロットにより調べた結果を示す。左:2系統のBcl−2トランスジェニックマウス(N2、N3)および野生型マウス(WT)におけるBcl−2のmRNA発現;右:2系統のBcl−xLトランスジェニックマウス(K1、K2)および野生型マウス(WT)におけるBcl−xLのmRNA発現。
図19は、トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの10週齢雄大腿骨遠心部のX線像を示す。左:2系統のBcl−2トランスジェニックマウス(N2、N3)および野生型マウス(WT)のX線像;右:2系統のBcl−xLトランスジェニックマウス(K1、K2)および野生型マウス(WT)のX線像。
図20は、pQCTによるトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフおよび皮質骨横断像を示す。
左上段:10週齢雄、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)(黒丸)および野生型マウス(白抜き)の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフ。WT:n=4、N2:n=5。
左下段:10週齢雌、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)(黒丸)および野生型マウス(白抜き)の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフ。WT:n=5、K1:n=5。
右上段:10週齢雄、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)および野生型マウスの皮質骨横断像。
右下段:10週齢雌、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)と野生型マウスの皮質骨横断像。
図21は、μCTを用いた10週齢雄の野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部海綿骨像と第2腰椎海綿骨像を示す。
図22は、μCTを用いた10週齢雄の野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部海綿骨(骨量、連結性、SMI、骨梁数、骨梁幅)および皮質骨(皮質骨幅)の解析結果を示す(mean±SD、*:p<0.05。WT:n=6、N2:n=7、K1:n=9)。
図23は、10週齢雄、野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部二次海綿骨領域における骨形態計測の結果を示す(WT:n=5、N2:n=4、K1:n=4)。
図24は、野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の2週齢大腿骨一次海綿骨領域における、BrdUおよびTUNEL染色像を示す。それぞれのパネル内に一次海綿骨領域における全骨芽細胞に対する陽性骨芽細胞の割合(%)を示す。また、TUNEL染色写真には陽性細胞を黒矢印で示す。
図25は、BrdU、TUNELの陽性骨芽細胞の割合を野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)ごとに算出したグラフを示す(BrdU WT:n=6、N2:n=6、K1:n=4、mean±SD、*:p<0.05;TUNEL WT:n=12、N2:n=4、K1:n=7、mean±SD、*:p<0.05)。
図26は、様々な週齢のトランスジェニックマウス(N2、K1)および野生型マウス(WT)の皮質骨における様々な組織像の比較を示す図である。上段より、10週齢雄大腿骨遠心部のHE像、10週齢雄大腿骨皮質骨のTUNEL染色、4週齢皮質骨透過電子顕微鏡像(TEM)、10週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡(SEM)による、10週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
図27は、4週齢の野生型マウス(WT)とBcl−2トランスジェニックマウス(N2)、5週齢の野生型マウスとBcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の骨芽細胞におけるI型コラーゲン(Type I collagen)、オステオポンチン(osteopontin)およびオステオカルシン(osteocalcin)の発現をノーザンブロッティングにより調べた結果を示す。
図28は、8週齢野生型マウス(WT)の脛骨、8週齢N2マウスの脛骨、10週齢K1マウスの脛骨においてI型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現をin situハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す。
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子(ホモログ)は、HomoloGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877,1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にかけて一致する(Scoreが最も高く、E−valueが0でかつIdentityが100%を示す)配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)に入力して得られたUniGene Cluster ID(Hs.で示す番号)をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子(ホモログ)としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
本発明においてBcl−xLをコードする遺伝子(以下、Bcl−xL遺伝子と省略すること場合もある)は、いかなる動物由来の遺伝子であってもよい。トランスジェニック動物の作出の場合、外因性のBcl−xL遺伝子を用いるが、ヒトモデルの作出のためにはヒトBcl−xL遺伝子を用いることが好ましい。例えば、ヒトBcl−xL遺伝子は、Boiseらの文献(Boise L.H.et al.,1993,Cell 74(4),pp.597−608)およびGenbank Accession No.Z23115などで公表されており、自体公知の方法により単離することができる。また、マウスBcl−xL遺伝子は、Genbank Accession No.L35049などで公表されており、自体公知の方法により単離することができる。
本発明において「Bcl−xL遺伝子」または「Bcl−xLのDNA」とは、特定塩基配列(配列番号:1)で示されるヒトBcl−xL遺伝子(DNA)ならびに、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子(DNA)を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:1に記載のヒトBcl−xL遺伝子ならびに、そのマウスホモログおよびラットホモログなどが包含される。なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本発明において「タンパク質」または「ペプチド」には、特定のアミノ酸配列(配列番号2)で示される「タンパク質」または「ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体(ホモログやスプライスバリアント)、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。前記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、変異のないタンパク質または(ポリ)ペプチドと、少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、さらにより好ましくは97%相同なものをあげることができる。前記誘導体には、タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端または側鎖を置換したものが包含される。前記アミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体があげられる。
本発明において「Bcl−xL」という用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列(配列番号2)で示されるヒトBcl−xLやその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。
本発明の骨量および骨強度増加剤は、Bcl−xLをコードする遺伝子を含有する。前記増加剤は、骨芽細胞に導入されることによりその作用を発揮するものである。したがって、前記増加剤は、前記Bcl−xLをコードする遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されているものを含有することが好ましい。
前記骨芽細胞特異的プロモーターとは、Bcl−xLをコードする遺伝子が当該プロモーターの下流に作動可能に連結された場合、骨芽細胞特異的にBcl−xLをコードする遺伝子の転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する塩基配列を有するDNAをいう。前記プロモーターは、骨芽細胞が由来する動物に応じて適宜選択することができる。
前記骨芽細胞特異的プロモーターとしては、I型コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター等があげられるが、I型コラーゲンプロモーターが好ましい。I型コラーゲンプロモーターとしては、例えばヒト由来のプロモーターの場合、Jimenez,S.A.,Varga,J.,Olsen,A.,Li,L.,Diaz,A.,Herhal,J.and Koch,J.Functional analysis of human alpha 1(I)procollagen gene promoter.Differential activity in collagen−producing and−nonproducing cells and response to transforming growth factor beta 1 J.Biol.Chem.269(17),12684−12691(1994)、マウス由来のプロモーターの場合、Ravazzolo,R.,Karsenty,G.and de Crombrugghe,B.A fibroblast−specific factor binds to an upstream negative control element in the promoter of the mouse alpha 1(I)collagen gene J.Biol.Chem.266(12),7382−7387(1991)、Rossert,J.,Eberspaecher,H.,and de Crombrugghe,B.(1995).Separate cis−acting DNA elements of the mouse pro−a1(I)collagen promoter direct expression of reporter genes to different type I collagen−producing cells in transgenic mice.J.Cell Biol.129,1421−1432.などに記載されている。
前記増加剤は、前記プロモーターおよびBcl−xL遺伝子を骨芽細胞で機能させるためには発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、公知または市販のものを使用することができ、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが例示される。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルスなどのウイルスベクターがあげられる。前記プロモーターおよび遺伝子を発現ベクターに連結する方法は、自体公知の方法により行うことができる。
前記増加剤は、前記プロモーター、Bcl−xL遺伝子、それらを含む発現ベクターが所望の細胞に導入されるために、任意の成分を含有していてもよい。任意成分としては、特に限定されるものではないが、溶媒、緩衝剤、キレート剤、防腐剤などがあげられる。また、細胞への導入効率を上げるため、前記増加剤は、リポソーム製剤の形態であってもよい。
前記増加剤中のプロモーター、Bcl−xL遺伝子および/またはそれらを含む発現ベクターの総含有量は、特に限定されるものではないが、通常0.001重量%〜100重量%である。
前記増加剤を所望の細胞(好ましくは骨芽細胞)に導入する方法は、例えば、in vivo法またはex vivo法があげられる。in vivo法は、前記増加剤を、例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、関節内、筋肉内などに投与することができる。ex vivo法の場合、前記増加剤を、対象の生体内から取り出した細胞をin vitroで培養中に公知の方法によりトランスフェクション、インフェクションまたはインジェクションし、一定期間培養してBcl−xL遺伝子の発現を確認した後、同一対象の体内に戻す方法を採用することができる。
これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、プロモーターおよびBcl−xL遺伝子の合計として、患者成人1人当たり約0.0001−100mg、好ましくは約0.001−10mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。レトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1×103pfuないし1×1015pfuとなる量の範囲から選ぶことができる。ex vivo法で本増加剤を導入した細胞の場合は、1×104細胞/bodyないし1×1015細胞/body程度を投与すればよい。
本発明の骨量および骨強度増加剤は、前記Bcl−xLタンパク質を含有するものであってもよい。本発明の増加剤は、Bcl−xLタンパク質の活性を阻害しない程度において、任意の成分を含有してもよい。任意成分としては、特に限定されるものではないが、溶媒、緩衝剤、防腐剤、ジチオスレイトール(DTT)などのSH基保護剤、界面活性剤などがあげられる。また、増加剤中のBcl−xLタンパク質の含有量は、特に限定されるものではないが、通常0.001重量%〜100重量%である。
本発明は、骨芽細胞特異的プロモーターおよびBcl−xLをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入したトランスジェニック動物を提供する。
本発明において、「トランスジェニック」とは、外因性のBcl−xL遺伝子を骨芽細胞特異的プロモーターの下流に結合させた発現ベクターを染色体遺伝子に導入することをいう。また、導入された動物およびその子孫をトランスジェニック動物と称する。
用いられる動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではないが、骨格が発達した動物が好ましい。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、自体公知の方法により製造できる。次に、本発明のトランスジェニック動物の作出方法について説明する。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば下記の工程(a)〜(c)を含む方法により製造できる。
(a)ヒトBcl−xL遺伝子と骨芽細胞特異的プロモーターとを連結した発現ベクターを調製する工程;
(b)前記発現ベクターを受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程;
(c)前記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程;
(d)前記選別した動物(ファウンダー)から系統を樹立する工程。
前記工程(a)において、発現ベクターは、本発明の骨量および骨密度増加剤を発現ベクターとしたものを好適に用いることができる。発現ベクターは、制限酵素等により直鎖状にして工程(b)に供することが好ましい。
前記工程(b)において、前記発現ベクターを受精卵に導入する方法は、例えば、交配後の雌の卵管を洗浄して受精卵を採取し、***または卵子由来の前核にマイクロインジェクション法により前記発現ベクターを直接注入する方法があげられる。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
前記工程(c)において、工程(b)で移植した動物が出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する方法としては、例えば、注入した発現ベクターが染色体DNAに組み込まれているか否かについて、産仔の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンブロット法またはPCR法によりスクリーニングする方法があげられる。
前記工程(d)において、工程(c)で選別した動物(ファウンダー)から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、発現ベクターが組み込まれた動物とC57BL/6、FVBなどの近交系の野生型動物とを戻し交配をする方法があげられる。
このようにして得られた本発明のトランスジェニック動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織があげられ、長管骨、頭蓋骨、椎骨などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株があげられ、具体的には骨芽細胞などが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、Bcl−xLの発現が調節されている。すなわち、同種野生型動物と比べて、骨芽細胞においてBcl−xLが過剰発現している。それにより、本発明のトランスジェニック動物は、同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している。本発明は、Bcl−xLの発現量と骨量および骨強度の増加との用量依存性を初めて見出したものであり、本発明により、下記トランスジェニック動物が提供される。
本発明のトランスジェニック動物は、大別して、骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて2倍前後に増加している動物(以下、低発現動物ともいう)、骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて約3〜5倍に増加している動物(以下、中発現動物ともいう)または骨芽細胞における前記Bcl−xLの発現が同種野生型動物に比べて10倍前後に増加している動物(以下、高発現動物ともいう)に分類することができる。
本発明のトランスジェニック動物は、本動物を用いた骨疾患の研究または骨疾患の予防または治療薬のスクリーニングにおいて、前記低発現動物、中発現動物および高発現動物の中から目的に応じて、適する動物を選択して用いることができる。例えば、マウスの場合、様々な程度の骨粗鬆症モデルマウスと低発現、中発現、高発現Bcl−xLトランスジェニックマウスと交配し、骨量・骨強度を正常レベルに戻すために必要なBcl−xLのレベルを推測できる。また、後述する、Bcl−xLのプロモーターを用いたスクリーニングから得られた物質の野生型動物を用いた効果判定において、低発現、中発現、高発現Bcl−xLトランスジェニックマウスそれぞれと比較することにより、Bcl−xLの発現誘導程度と骨量・骨強度・骨の微細構造の相関を比較検討することができる。すなわち、低発現、中発現、高発現Bcl−xLトランスジェニックマウスのどれに相当する骨の増加をもたらすことができるか、そして、骨量の増加をもたらした時、その他の負の作用(骨強度の低下、骨微細構造の異常、骨の低回転等)を来していないかを比較検討できる。また、後述するように、低発現マウスは、Bcl−xLシグナルの活性化物質のスクリーニングに、中発現、高発現マウスは、抑制物質のスクリーニングに適している。
本発明のトランスジェニック動物は、骨粗鬆症の治療および予防を含む骨疾患の研究に用いる場合、成体を用いることが好ましい。その理由は、前記骨疾患は、通常加齢により発生頻度が高くなることによる。成体とは動物によってその時期が異なるが、少なくとも胎仔および出生直後を除く時期をいい、マウスの場合、6週齢から12月齢が例示され、加齢とともに野生型との有意差が大きくなることから、加齢により死亡するまで(最長2年くらいまで)であってもよい。10週齢前後が好適に使用される。
本発明のトランスジェニック動物が成体の場合、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも1種のパラメータが有意差を有することが好ましい。例えば、10週齢、雄、野生型マウス(n=6)、トランスジェニックマウス(n=9)における大腿骨遠心部海綿骨のマイクロCT(μCT)による解析の結果、以下の5項目のパラメータについて有意差を認めることができる。
骨量:p=0.012<0.05
連結性:p=0.004<0.01
ストラクチャーモデルインデックス(SMI):p=0.017<0.05
骨梁数:p=0.005<0.01
骨梁厚:p=0.048<0.05
特に、連結性および骨梁数のパラメータは有意差が大きい。
前記計測パラメータは、マイクロCT(μCT)により計測することができ、その詳細は、実施例に記載されている。
本発明のトランスジェニック動物は、同種野生型動物と比べて骨の量および質ともに増加していることから、骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして、または骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用されることが好ましい。
骨疾患研究のモデルとして使用する場合、本発明のトランスジェニック動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られるモデル動物を作出して用いてもよい。本発明は、かかるモデル動物を提供する。
前記他の疾患モデルとしては、骨粗鬆症モデル、骨芽細胞増殖亢進モデル、骨芽細胞アポトーシス亢進モデル、早期老化モデル、骨量減少を来す各種ノックアウト動物等があげられる。例えばマウスの場合、CDK6/CyclinD1ダブルトランスジェニックマウス、Klothoマウス、Bcl−2トランスジェニックマウス(例、骨芽細胞特異的に外来性Bcl−2を発現するマウス)等が好適に用いられ得る。
本発明は、前記トランスジェニック動物または前記モデル動物を用いることを特徴とする骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法(スクリーニング方法I)を提供する。この場合、前記低発現動物を用いることが好ましい。
[スクリーニング方法I]
本発明のスクリーニング方法Iは、具体的には、下記工程を含む:
(a)本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)前記比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程。
前記(a)において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の2種以上の混合物を試料として供することもできる。
前記被験物質を本発明の動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内等の全身投与、あるいは関節内、標的細胞付近への局所投与等があげられる。
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
前記工程(b)において、被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、X線解析、μCTおよびpQCTなどがあげられる。
前記工程(b)において、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。また、陽性対照として、公知の骨量増加剤を同様に投与することも望ましい。
前記工程(c)において、工程(b)で得られた比較結果に基づき、骨量および/または骨強度を増加させる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与していないBcl−xLトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるBcl−xLのシグナル伝達経路を活性化しうる作用を有するものであり、骨量および/または骨密度の量および/または質を向上させる候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨粗鬆症、歯周病、重度の骨折、骨欠損、歯槽骨の吸収に対する治療剤である。
[スクリーニング方法II]
また、本発明は、下記工程を含むBcl−xLを介した骨量および骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法(スクリーニング方法II)を提供する。この場合、前記中発現動物または高発現動物を用いることが好ましい。
(a)本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程。
工程(a)において、被験物質は、スクリーニング方法Iと同様のものがあげられ、投与方法もスクリーニング方法Iと同様である。
前記工程(b)において、被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、X線解析、μCTおよびpQCTなどがあげられる。
前記工程(b)において、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
前記工程(c)において、工程(b)で得られた比較結果に基づき、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与しないトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるBcl−xLのシグナル伝達経路を抑制して骨量および/または骨密度を低下させうる作用を有するものであり、骨量および/または骨密度が異常に増加した疾患を治療または予防する候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨大理石病に対する治療剤である。
[スクリーニング方法III]
また、本発明は、下記工程を含む骨量および骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法(スクリーニング方法III)を提供する。この場合、目的により前記低発現動物、中発現動物および高発現動物のいずれの動物を用いてもよい。
(a)本発明のトランスジェニック動物またはモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
(d)工程(a)で用いた動物に、工程(c)で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
(e)工程(d)で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(f)工程(e)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程。
前記工程(a)〜(c)は、前記スクリーニング方法IIと同様である。
前記工程(d)において、前記工程(c)で選択された被験物質に対するアンタゴニスト候補物質としては、前記工程(a)でスクリーニング対象となる候補物質の中から適宜選択することができる。アンタゴニスト候補物質は、選択された被験物質がタンパク質の場合、当該タンパク質に対する中和抗体が好ましく選択され、選択された被験物質が特定の配列を有する核酸の場合、当該核酸に対するアンチセンス核酸、二本鎖RNAなどが好ましく選択される。
前記工程(d)において、被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与する方法は、スクリーニング方法Iの工程(b)と同様であるが、投与のタイミングは、同時であってもよく、一定の間隔を置いて別々であってもよい。また、投与経路も同一経路または異なる経路であってもよい。
前記工程(e)において、被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べる方法としては、例えば、X線解析、μCTおよびpQCTなどがあげられる。
前記工程(e)において、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度も同時にまたは別途調べ、アンタゴニスト候補物質投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
前記工程(f)において、前記工程(e)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する。選択する基準は、アンタゴニスト候補物質を投与しないトランスジェニックマウスを指標にすればよい。
このようにして選択されたアンタゴニスト候補物質は、骨芽細胞におけるBcl−xLの発現系を介した阻害作用を抑制しうる作用を有するものであり、Bcl−xLの発現抑制により骨量および/または骨密度が低下した疾患を治療または予防する候補薬となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる骨疾患治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、骨粗鬆症やステロイド骨粗鬆症に対する治療剤である。
本発明は、骨芽細胞を用いることを特徴とするBcl−xLの発現増加を介した骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法(スクリーニング方法IV)を提供する。この場合、前記骨芽細胞は、野生型動物由来の細胞を用いることが好ましい。
[スクリーニング方法IV]
本発明のスクリーニング方法IVは、具体的には、下記工程を含む:
(a)骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるBcl−xLの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
(c)前記比較結果に基づいて、Bcl−xLの発現を増加させる被験物質を選択する工程。
工程(a)において、骨芽細胞をBcl−xLの発現が維持される条件下に置いたものを用いることができる。かかる条件下としては、骨芽細胞を適当な培地中に入れ、約25〜40℃のインキュベーター中で生存または培養させることが好ましい。次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。
前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞の感受性等によって適宜設定することができる。
工程(b)において、前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるBcl−xLの発現量は、自体公知の方法により調べることができる。内在性のBcl−xLの発現量は、例えば、細胞からタンパク質を抽出してBcl−xLを認識する抗体を用いるウェスタンブロッティング等により測定する方法;細胞からRNAを抽出してRT−PCRまたはノーザンブロッティング等により転写されたBcl−xLmRNAを測定する方法;Bcl−xLを認識する抗体を用いて、免疫組織化学によりin situでBcl−xLを調べる方法等があげられる。内在性のBcl−xLの発現量は、Bcl−xLのプロモーター領域とレポーター遺伝子とを連結した発現ベクターを骨芽細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を測定するレポーターアッセイ等によっても推定できる。レポーターアッセイが好ましく用いられる。レポーター遺伝子は、公知の遺伝子を限定なく使用することができ、例えば、ルシフェラーゼ、GFP(緑色蛍光タンパク質)、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)などがあげられるが、これに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、用いるレポーター遺伝子に応じて、自体公知の方法により測定することができる。
前記工程(b)において、被験物質を接触させない骨芽細胞も同時にまたは別途調べ、接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。また、陽性対照として、例えば、FGFまたはBMP−2等を同様に接触させた骨芽細胞も準備することが好ましい。
前記工程(c)において、工程(b)で得られた比較結果に基づき、Bcl−xLの発現を増加させる被験物質を選択する。選択する基準は、Bcl−xLのタンパク質またはmRNAが増加していることを指標にすればよい。レポーター遺伝子の発現が増加していることを指標にすることが好ましい。
このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるBcl−xLのアゴニスト作用を有する剤として有用であるとともに、例えば、スクリーニング方法Iのようなさらなるスクリーニングや薬理試験を実施することにより、副作用の少ない骨粗鬆症等の骨疾患治療剤の候補薬ともなりうる。
[実施例1]
Bcl−xLトランスジェニックマウスの作出
ヒトBcl−xLcDNA(大阪大学、辻本博士より供与された)をプラスミドpUC−CAGGS/Xholにクローニングした。前記プラスミドを、EcoR Iで消化し、得られたフラグメントを、マウスI型コラーゲンプロモーターを含むプラスミドpNASSβにサブクローニングし、トランスジェニック構築物とした(大阪大学、辻本博士より頂いたpCAGGS−hbcl−xLについては、Oncogene 19:5736,2000を参照のこと)。EcoR IとSal Iで直鎖状にしたDNA構築物を、C57BL/6Cr(日本SLC)接合体の前核にマイクロインジェクションし、それを、仮親メスに移し、Bcl−xLトランスジェニックファウンダーを作出した。Bcl−xL cDNA全長をプローブとして用いて、サザンブロット法により遺伝子型を調べた。
前記トランスジェニックファウンダーをC57BL/6Crと戻し交配をし、Bcl−xLトランスジェニックマウスを作出した。得られたトランスジェニックマウスの各組織から常法によりRNAを抽出し、ノーザンブロット法によりBcl−xLの発現を調べたところ、骨芽細胞および歯の象牙細胞にのみ発現していることが確認された。
[実施例2]
Bcl−xLトランスジェニックマウスからの発現レベルの異なる系統の樹立
実施例1で得られた3系統のBcl−xLトランスジェニックマウス(4週齢)の大腿骨および脛骨から、RNA抽出キットISOGEN(NIPPON GENE)を用いて、RNAを単離した。常法に従って、ノーザンブロットによりBcl−xLの発現を調べた。結果を図1に示す。
図1より、3系統のトランスジェニックマウス(K1、K2およびK3)は、野生型マウス(WT)に比べて、Bcl−xLの発現レベルが上昇していることがわかった。デンシトメーターで野生型マウスとトランスジェニックマウスとの発現レベルを比較したところ、K1は約10倍、K2は約3倍、K3は約2倍高いことが明らかになった。以下、K1を強発現系統、K2を中発現系統、K3を弱発現系統に分類し、解析を進めた。
[実施例3]
Bcl−xLトランスジェニックマウスのX線解析
10週齢のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール(0.75mg/10g体重)を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、micro−FX1000(Fuji Film,Inc.)を用いて全身像のX線撮影を行った。さらにマウスを解剖し、大腿骨・椎骨を採取し、70%エタノールを用いて固定した後、micro−FX1000(Fuji Film,Inc.)を用いてX線撮影を行った。
[結果]
図2:10週齢 雌 野生型マウスとCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスの大腿骨X線像
野生型と比較して、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスはその発現レベルに比例して二次海綿骨領域の骨量が増加しており、最も弱発現のライン(K3)でも野生型と比較して二次海綿骨領域の骨量が多い。
図3(A):10週齢 雄 X線像(全身)野生型(左)とCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス強発現ライン(右)
(B):10週齢 雌 X線像(大腿骨)野生型(左)とCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス強発現ライン(右)
(C):10週齢 雄 X線像(椎骨)野生型(左)とCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス強発現ライン(右)
野生型と比較してCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは、長管骨や椎骨の二次海綿骨の増加が認められる。
[実施例4]
Bcl−xLトランスジェニックマウスの解析
10週齢、7ヶ月齢および1年齢のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスおよび野生型マウスを用いた。ネンブタール(0.75mg/10g体重)で全身麻酔後、4%パラホルムアルデヒドで灌流固定を行った。大腿骨を採取し、同固定液にて4℃で一晩浸透固定し、0.01M PBSで洗浄後、10%EDTA溶液で約1週間脱灰を行った。脱灰終了後、通法に従いパラフィンブロックを作製した。このブロックを3μmで薄切し、ヘマトキシリン−エオジン(HE)染色を施した。
[結果]
図4より、野生型マウスと比較してCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは、大腿骨遠心部の二次海綿骨が多く認められ、骨幹部にも多数の二次海綿骨が認められる。そして、1年齢の野生型マウスではほとんどの二次海綿骨が吸収されてしまっているが、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスでは1年齢においても多数の二次海綿骨が認められる。
次に、皮質骨における様々な組織像の比較を行った。4週齢および10週齢のBcl−XLトランスジェニックマウス(K1)および野生型マウスの皮質骨を、HE染色、TUNEL染色、透過電子顕微鏡(TEM)観察、鍍銀染色、走査電子顕微鏡(SEM)観察により詳細に検討した。
[結果]
図5は、上段より、10週齢雄大腿骨遠心部のHE像、10週齢雄大腿骨皮質骨のTUNEL染色、4週齢皮質骨透過電子顕微鏡像(TEM)、10週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡(SEM)による10週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。皮質骨の観察によりトランスジェニックマウス(K1)の骨細胞は透過電子顕微鏡像や鍍銀染色で認められるように、若い形態(細胞質が野生型に比較し豊富に存在)を示していたが、鍍銀染色・走査電子顕微鏡の二次電子像より、野生型と全く変わらない多数の骨細管および骨細胞突起が認められた(一般に骨細胞が幼若な場合、骨細管および骨細胞突起が減少する)。
[実施例5]
ノーザンブロッティング
総RNAを、5週齢のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスの大腿骨から抽出した。液体窒素で凍結した大腿骨をISOGEN(NIPPON GENE)1ml中でホモジナイズし、5分間室温で放置したのち、クロロホルム200μlを加え、転倒混和後、3分間室温で放置した。4℃冷却、15,000 X gで15分間遠心したのち、水層(上層)を抽出し、イソプロパノール500μlを加え、室温で10分間放置した。4℃冷却、15,000 X gで15分間遠心したのち、上清を除去し、DEPC水に懸濁させた。フェノールを加え、15,000 X gで5分間、遠心したのち、上層を抽出し、酢酸ナトリウムと100%エタノールを加え、15,000 X gで20分間、遠心した。上清を除去したのち、RNA沈殿をDEPC水に懸濁させた。20μgの総RNAをホルムアミドで変性させ、1.0%アガロースゲルにて電気泳動した後、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。メンブレンは、pro−α1(1)コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの32PでラベルされたcDNAプローブと相補鎖結合させた。
図6より、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスとで骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現を検討した結果、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較してI型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの発現レベルはほとんど変わらなかった。
in situハイブリダイゼーション
脱パラフィン後、切片を0.01M PBSで洗浄し、4%PFA溶液で前固定後、0.1M PBにて洗浄し、8μg/mlのプロテアーゼK(Roche Diagnostics)で37℃15分処理したのち、4%PFA溶液で後固定を行った。0.25%無水酢酸を含む0.1M トリエタノールアミンでアセチル化処理を10分間行い、0.1M PBによる洗浄後、エタノールにより脱水し、乾燥を行った。その後、ハイブリダイゼーション液で1ng/mlに希釈したプローブを用いて、50℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、2×標準クエン酸ナトリウム溶液(以下SSCと略す)を含む50%ホルムアミド溶液中で52℃30分間洗浄し、18μg/mlのRNase A(Roche Diagnostic)で37℃ 30分間処理した。2×SSCで52℃ 20分間の洗浄を2回繰り返し、0.2×SSCで52℃ 20分間洗浄を行った。室温でBlocking Reagent(Roche Diagnostic)を用いてブロッキングを1時間行なったのち、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体(Roche Diagnostic)と室温で45分間反応させた。洗浄後、4−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸(BCIP)(Roche Diagnostic)を基質として約0.5−2時間発色反応を行い、シグナルを検出した。検出反応終了後、水洗し、水溶性封入剤クリスタルマウント(biomeda corp.Foster City,CA)による封入を行った。
[結果]
Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスにおける骨芽細胞の分化段階を調べるため、10週齢時の脛骨を用い、骨芽細胞分化のマーカー遺伝子であるI型コラーゲン遺伝子(Col(I))、オステオポンチン遺伝子(OP)およびオステオカルシン遺伝子(OC)の発現パターンをin situハイブリダイゼーションにより検討した。図7より、野生型マウスでは、I型コラーゲンは広範な分化段階の骨芽細胞で発現していた。オステオポンチンはおもに未熟骨芽細胞で発現しており、主として海綿骨に存在する骨芽細胞が染色されていた。オステオカルシンは、おもに皮質骨骨内膜に存在する成熟骨芽細胞で発現していた。Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、I型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシンの発現領域および発現レベルは全く変わらないことから、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスにおいて骨芽細胞は正常に分化していることが示された。
[実施例6]
BrdU
2週齢のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスにBrdU(Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)100μg/gを腹腔内投与し、1時間後にネンブタール(0.75mg/10g体重)で全身麻酔後、左心室に5単位/mlヘパリンを含む生理食塩水を注入し、4% PFAで灌流固定を行った。前述に従い、大腿骨の切片を作製し、BrdU Staining Kit(Zymed Laboratories,South San Francisco,USA)を用いて、BrdU染色を行った。すなわち、切片をキシレンにて脱パラフィンし、エタノールで洗浄した。切片をPeroxidase quenching solutionに10分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害したのち、PBSで洗浄した。0.0625%トリプシンで37℃5分間タンパク分解処理し、DNAを露出後、Denaturing solutionを滴下し、室温で20分間インキュベート、変性させたのち、Blocking solutionを滴下し、室温で10分間ブロッキングを行った。ビオチン化抗BrdU Reagentで室温60分間処理し、PBSで洗浄したのち、Streptavidin−peroxidase Reagentを滴下し、室温で10分間インキュベートしたのち、DAB染色を行った。発色反応後、対比染色として、ヘマトキシリン染色を行った。
図8より、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、一次海綿骨領域の骨芽細胞においてBrdU取り込みの有意な増加が認められた。
TUNEL
2週齢のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスから、前述に従って大腿骨の切片を作製し、terminal deoxynucleotidyltransferase−mediated dUTP−digoxigenin nicked end labeling(TUNEL)染色を行った。TUNEL染色はApopTag(登録商標)システム(Intergen,NY,USA)を用いた。すなわち、切片をキシレンにて脱パラフィンし、エタノールで洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて洗浄した。Proteinase K(20μg/ml)を加え、室温下で15分インキュベートし、DNAを露出させたのち、蒸留水で洗浄後、3% H2O2/PBSに室温で5分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。PBSにて洗浄後、Equilibration Bufferを切片に滴下し、室温で10分間インキュベートしたのち、TdT/digoxigenin−labeled dUTPを加え、37℃で一時間、反応させた。室温下で30分間、切片をstop/washバッファーに浸し、反応をとめたのち、PBSにて洗浄し、Antidigoxigenin peroxidase標識抗体を滴下し、室温30分間インキュベートした。PBSにて洗浄後、Diaminobenzidine(DAB)溶液にて発色させた。発色反応後、対比染色として、メチルグリーン染色、またTUNEL positive骨芽細胞をカウントするためにトルイジンブルー染色を行った。
図9より、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、一次海綿骨領域の骨芽細胞においてアポトーシス陽性細胞の有意な減少が認められた(TUNEL陽性骨芽細胞を、図中矢印で示した)。
[実施例7]
骨形態計測
10週齢 雄のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスを用いて、静的な骨形態計測を行った。また、動的な骨形態計測を行うため、10週齢時のマウスにカルセイン(0.16mg/10g体重)を4日間の間隔を空けて、二度、腹腔内に注射し、翌日に屠殺した。大腿骨を摘出し、70%エタノールで固定したのち、グリコールメタクリレートで包埋した。大腿骨の遠心部より7μm厚の縦断切片を作製し、トルイジンブルー染色を行った後、Bone Histomorphometric System,(System Supply,Nagano,Japan)を用いて骨形態計測を行った。
図10より、10週齢 雄のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスを比較した結果、静的パラメータについては、骨量(BV/TV)のみ有意な差を認めたが、その他のパラメータについては有意差を認めなかった。骨石灰化速度・骨形成速度・骨石灰化面/骨面といった動的パラメータについてもCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと有意差は認められなかったが、骨石灰化面/骨面・骨形成速度の二つのパラメータが野生型よりも亢進している傾向が認められた。
[実施例8]
pQCTによる大腿骨骨幹皮質骨の解析
10週齢 雄のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール(0.75mg/10g体重)を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、70%EtOHを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、動物研究用pQCT骨密度測定装置 XCT Research SA+(Stratec Medizintechnik GmbH,Pforzheim,Germany)を用いてpQCT解析を行った。海綿骨パラメーターは大腿骨遠位成長板から骨幹部に向かって0.19mm間隔で連続的に測定し、皮質骨パラメーターは大腿骨骨幹部で測定した。スライス厚は0.46mm、ボクセルサイズは0.08mmで測定を行なった。
図11より、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、皮質骨塩量・皮質骨平均厚・皮質骨密度・XSSIすべてのパラメータにおいて有意差が認められなかった。また、大腿骨遠心部皮質骨のpQCT像を比較しても、トランスジェニックマウスと野生型マウスの皮質骨の性状は全く変わらなかった。
[実施例9]
μCTによる大腿骨骨幹皮質骨の解析
10週齢 雌のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス3系統(K1、K2、K3)と野生型マウスに、ネンブタール(0.75mg/10g体重)を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、70%EtOHを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、マイクロ−CT(Scanco Medical社)を用いて50kV、0.1mAのX線ビームにより、ビーム幅20μm、スライス間隔12μmで大腿骨骨幹部より1スライスのボリュームデータを取得した。そして、三次元画像処理プログラム(TRI/3D−Bone,ラトックシステムエンジニアリング)にて皮質骨部位の画像抽出と骨パラメータの解析を行った。
図12より、10週齢 雌のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス3系統(K1、K2、K3)と野生型マウスについて、大腿骨骨幹部皮質骨の、骨面積に対する皮質骨面積・皮質骨幅を検討した結果、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型と比較して有意差を認めなかった。さらに発現レベルの異なるCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス3系統(K1、K2、K3)同士についても有意差は認められなかった。
[実施例10]
pQCTによる大腿骨遠心部海綿骨の解析
10週齢 雌のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスと野生型マウスに、ネンブタール(0.75mg/10g体重)を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨を採取し、70%エタノールを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、動物研究用pQCT 骨密度測定装置 XCT Research SA+(Stratec Medizintechnik GmbH,Pforzheim,Germany)を用いてpQCT解析を行った。海綿骨パラメーターは大腿骨遠位成長板から骨幹部に向かって0.19mm間隔で連続的に測定した。スライス厚は0.46mm、ボクセルサイズは0.08mmで測定を行なった。
図13より、大腿骨遠心部海綿骨の骨密度についてCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較し、骨密度が有意に大きいことが認められた。
[実施例11]
μCTによる大腿骨遠心部海綿骨の解析
10週齢 雌のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス3系統(K1、K2、K3)と野生型マウスに、ネンブタール(0.75mg/10g体重)を腹腔内注射し全身麻酔を施した後、大腿骨および第2腰椎を採取し、70%EtOHを用いて固定した。採取した大腿骨に対して、マイクロCT(Scanco Medical社)を用いて50kV、0.1mAのX線ビームにより、ビーム幅20μm、スライス間隔12μmで遠心部成長板直下より200スライスのボリュームデータを取得した。そして、三次元画像処理プログラム(TRI/3D−Bone,ラトックシステムエンジニアリング)にて海綿骨部位の画像抽出と骨パラメータの解析を行った。採取した第2腰椎も同様に、マイクロCTを用いて海綿骨部位の画像抽出を行った。
図14より、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは3系統とも野生型マウスと比較して、骨量、骨梁数および骨梁間距離については有意差が認められた。骨梁幅については有意差は認められなかったが、Col I−Bcl−XLトランスジェニックマウスの方が野生型より大きい傾向が認められた。骨強度に関連する連結性およびSMIについてもCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して有意差が認められた。
図15より、トランスジェニックマウス(K1)は、野生型マウスと比較して大腿骨海綿骨および椎体海綿骨も増加していた。
10週齢、7ヶ月齢および1年齢の雄のCol I−Bcl−XLトランスジェニックマウス(K1)と野生型マウスの大腿骨遠心部海綿骨骨量(BV/TV)のX線およびμCTでの解析結果を図16および17に示す。
図16および17より、トランスジェニックマウス(K1)は10週齢、7ヶ月齢、1年齢のすべてにおいて野生型マウスと比較して、有意に骨量が増加していた。また、野生型マウスでは10週齢時の海綿骨骨量は(22±8%)であったが、7ヶ月齢時点(9±6%)で半分以下に減少していた。トランスジェニックマウス(K1)では10週齢時点で、(34±3%)の骨量であり、7ヶ月齢時点で(19±4%)の骨量を示し、骨量の減少度合いは野生型マウスよりも小さかった。
[比較例1]
Bcl−2トランスジェニックマウスの作出とBcl−xLトランスジェニックマウスとの比較
実施例1において、ヒトBcl−xLcDNAの代わりにヒトBcl−2cDNAを用いること以外は実施例1と同様の作出方法で、骨芽細胞特異的Bcl−2トランスジェニックマウスを樹立した。Bcl−2蛋白も抗アポトーシス作用を有し、骨芽細胞におけるその機能と役割を解明するためにBcl−xLとの比較検討を行った。
[比較例2]
ノーザンブロット
実施例5と同様の方法により、Bcl−2トランスジェニックマウスでの遺伝子発現をノーザンブロットにより調べた。結果を図18に示す。
図18左:2系統のBcl−2トランスジェニックマウス(N2、N3)および野生型マウス(WT)におけるBcl−2のmRNA発現の結果を示す。N2を強発現系統のライン、N3を弱発現系統のラインとし、以降のBcl−xLトランスジェニックマウスとの比較は強発現のN2マウスを用いた。
図18右:2系統のBcl−xLトランスジェニックマウス(K1、K2)および野生型マウス(WT)におけるBcl−xLのmRNA発現を調べた結果を示す。
[比較例3]
X線解析
実施例3に記載の方法と同様にして、Bcl−2トランスジェニックマウスの大腿骨遠心部のX線撮影を行った。結果を図19に示す。
図19左:2系統のBcl−2トランスジェニックマウス(N2、N3)および野生型マウス(WT)の10週齢雄大腿骨遠心部のX線像を示す。N2、N3マウスとも野生型マウスと比較して骨幹部領域まで二次海綿骨が認められ、大腿骨全体でみると骨量が増加していたが、成長板直下の一次海綿骨領域においてはむしろ骨量が減少している像を示した。
図19右:2系統のBcl−xLトランスジェニックマウス(K1、K2)および野生型マウス(WT)の10週齢雄大腿骨遠心部のX線像を示す。K1、K2マウスとも野生型マウスと比較して、骨量が増加していた。また、N2、N3マウスと違い、成長板直下においても、骨量が増加していた。
[比較例4]
pQCT解析
実施例8および10に記載の方法と同様にして、Bcl−2トランスジェニックマウスの海綿骨および皮質骨をpQCT解析した。結果を図20に示す。
図20左上段:10週齢雄、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)(黒丸)と野生型マウス(白抜き)の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフを示す。
図20左下段:10週齢雌、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)(黒丸)と野生型マウス(白抜き)の海綿骨および皮質骨の骨密度を解析したグラフを示す。
図20右上段:10週齢雄、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)と野生型マウスの皮質骨横断像を示す。
図20右下段:10週齢雌、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)と野生型マウスの皮質骨横断像を示す。
骨塩量のグラフより、N2マウスは野生型マウスと比較して、海綿骨の骨密度は変わらないが、皮質骨の骨密度が有意に低くなっており、皮質骨横断像においても骨密度の低い黄色の部位(赤−黄色−青−白の順に骨密度が高くなる)が多く認められた。K1マウスは野生型マウスと比較して海綿骨骨密度が有意に増加しており、皮質骨密度は変わらなかった。
[比較例5]
μCTを用いた10週齢雄マウス海綿骨像
実施例9および11に記載の方法と同様にして、10週齢雄の野生型マウス、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部海綿骨と第2腰椎海綿骨をμCTにより解析した。結果を図21に示す。
図21より、N2マウスは野生型マウスと比較して、大腿骨遠心部、第2腰椎とも骨量が少なく細い骨梁を示した。K1マウスは野生型マウスと比較して、大腿骨遠心部、第2腰椎とも骨量が増加している像を示した。
[比較例6]
μCTを用いた10週齢雄大腿骨遠心部海綿骨および皮質骨の解析
実施例11に記載の方法と同様にして、10週齢雄の野生型マウス、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)およびBcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部海綿骨(骨量、連結性、SMI、骨梁数、骨梁幅)および皮質骨(皮質骨幅)をμCTにより解析した。結果を図22に示す。
図22より、K1マウスは海綿骨の骨量、連結性、骨梁数および骨梁幅が有意に増加しているのに対し、N2マウスは野生型マウスと比較して海綿骨骨量が有意に少なく、連結性が悪いというまったく正反対の表現型を示した。
[比較例7]
10週齢雄大腿骨遠心部二次海綿骨領域における形態計測
実施例7に記載の方法と同様にして、10週齢雄、野生型マウス、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)、Bcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の大腿骨遠心部二次海綿骨領域における骨形態を計測した。結果を図23に示す。
図23より、N2マウスは野生型マウスと比較して、骨芽細胞面(Ob.S/BS)および骨芽細胞数(N.Ob/BPm)が有意に増加しているにもかかわらず、骨量(BV/TV)が有意に減少していた。そして、骨形成速度(BFR/BS)や石灰化速度(MAR)は野生型と変わらなかった。すなわち、N2マウスでは野生型マウスに比較して骨芽細胞一個あたりの機能が低下しているものと思われた。また、N2マウスは皮質骨中に非常に多くの骨細胞が存在していた。これに対し、K1マウスでは、骨量(BV/TV)、石灰化面(MS/BS)および骨形成速度(BFR/BS)が増加し、骨芽細胞は正常の機能を保持していた。またN2マウスと異なり、骨細胞密度は正常であった。
[比較例8]
2週齢大腿骨一次海綿骨領域BrdUおよびTUNEL染色像
実施例6に記載の方法と同様にして、野生型マウス(WT)、Bcl−2トランスジェニックマウス(N2)およびBcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の2週齢大腿骨一次海綿骨領域における、BrdUおよびTUNEL染色を行った。結果を図24に示す。
図24より、各パネル内に一次海綿骨領域における全骨芽細胞に対する陽性骨芽細胞の割合(%)を示した。また、TUNEL染色写真には陽性細胞を黒矢印で示した。
図24で示したBrdUおよびTUNELの陽性骨芽細胞の割合をそれぞれのマウスごとに算出し、グラフに示した。結果を図25に示す。図25より、N2およびK1マウスのBrdU染色における陽性骨芽細胞の割合は、野生型マウスに比較して有意に高く、一次海綿骨領域の骨芽細胞の増殖が亢進していることが示された。TUNEL染色ではK1マウスが野生型マウスに比較して有意に低く、アポトーシスが抑制されていることが示された。一方N2マウスでは、アポトーシスの有意な抑制を認めなかった。しかし、N2マウスでも、骨芽細胞の増殖が亢進しているため、アポトーシスの抑制はある程度起こっていると考えられる。しかし、その程度はK1マウスに比較して軽度である。
[比較例9]
皮質骨における様々な組織像の比較
実施例4に記載の方法と同様にして、様々な週齢のトランスジェニックマウス(N2、K1)と野生型マウスの皮質骨を詳細に検討した。結果を図26に示す。図26の上段より、10週齢雄大腿骨遠心部のHE像、10週齢雄大腿骨皮質骨のTUNEL染色、4週齢皮質骨透過電子顕微鏡像(TEM)、10週齢雄大腿骨皮質骨の鍍銀染色像、走査電子顕微鏡(SEM)による、10週齢皮質骨中の骨細胞および骨細胞突起の二次電子像である。
皮質骨の観察により、K1マウスの骨細胞は透過電子顕微鏡像や鍍銀染色で認められるように、若い形態を示していたが、鍍銀染色・走査電子顕微鏡の二次電子像より、野生型と全く変わらない多数の骨細管が認められた。
しかしながら、N2マウスの皮質骨では、大部分の骨細胞が死滅しており(HE)、残存する骨細胞や死滅した骨小腔はTUNEL陽性を示すことからN2マウスの骨細胞はアポトーシスで死滅しているものと考えられ、透過電子顕微鏡像においても凝縮した核が認められた。鍍銀染色および走査電子顕微鏡を用いて骨細管・骨細胞突起を観察すると、野生型マウスと比較して非常に骨細管・骨細胞突起が少ない像が観察され、骨細胞の増加と骨細管・骨細胞突起の減少が骨細胞のアポトーシスの原因として考えられた。
[比較例10]
ノーザンブロッティング
実施例5に記載の方法と同様にして、4週齢の野生型マウスとBcl−2トランスジェニックマウス(N2)、5週齢の野生型マウスとBcl−xLトランスジェニックマウス(K1)の骨芽細胞におけるI型コラーゲン(Type I collagen)、オステオポンチン(osteopontin)およびオステオカルシン(osteocalcin)の発現をノーザンブロッティングにより調べた。結果を図27に示す。
図27より、前記発現レベルは、K1マウスと野生型で同レベルであったが、N2マウスでは野生型マウスと比較してオステオポンチンの発現が強く、オステオカルシンの発現が低下していた。
[比較例11]
in situハイブリダイゼーション
実施例5に記載の方法と同様にして、8週齢野生型マウスの脛骨、8週齢N2マウスの脛骨、10週齢K1マウスの脛骨においてI型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルシンの発現をin situハイブリダイゼーションにより調べた。結果を図28に示す。
図28より、K1マウスでは成長板直下や内骨膜におけるこれらの遺伝子の発現パターンは野生型マウスと変わらなかったが、N2マウスでは野生型マウスと比較して成長板直下や内骨膜でのオステオポンチンの発現が強く、オステオカルシンの発現が低下している像が認められた。
本出願は、日本で出願された特願2006−138287(出願日:2006年5月17日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
[配列表]
Claims (23)
- Bcl-xLをコードする遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されている遺伝子を含有してなる骨量および骨強度増加剤。
- 前記プロモーターがI型コラーゲンプロモーターである請求項1記載の増加剤。
- 発現ベクターである請求項1または2に記載の増加剤。
- 骨芽細胞特異的プロモーターおよびBcl-xLをコードする遺伝子を含む発現ベクターを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記プロモーターがI型コラーゲンプロモーターである請求項4に記載の非ヒト動物。
- 同種野生型動物に比べて骨量および骨強度が増加している請求項4または5に記載の非ヒト動物。
- 骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて2倍前後に増加している請求項4〜6いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて3〜5倍に増加している請求項4〜6いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 骨芽細胞における前記Bcl-xLの発現が同種野生型動物に比べて10倍前後に増加している請求項4〜6いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 前記動物が実験動物または家畜である請求項4〜9いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 前記実験動物がマウスである請求項10に記載の非ヒト動物。
- 前記動物が成体であり、同種野生型動物の成体に対して、海綿骨骨梁の数の増加、海綿骨骨梁間距離の減少、海綿骨の連結性の増加、および海綿骨のストラクチャーモデルインデックスの変化からなる計測パラメータ群より選ばれる少なくとも1種のパラメータが有意差を有する、請求項4〜11いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 骨量および骨強度が増加した状態のモデルとして使用される請求項4〜12いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 骨粗鬆症の予防または治療のモデルとして使用される請求項4〜12いずれか1項に記載の非ヒト動物。
- 請求項4〜14いずれか1項に記載の非ヒト動物の子孫動物であって、骨芽細胞特異的プロモーター及びBcl-xL遺伝子を含む発現ベクターが導入されている子孫動物。
- 請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物を同種の他の疾患モデルと交配して得られる、骨芽細胞特異的プロモーター及びBcl-xl遺伝子を含む発現ベクターが導入されている骨疾患モデル動物。
- 前記骨疾患が骨粗鬆症、骨芽細胞のアポトーシスの亢進を来す疾患、骨芽細胞の増殖亢進を来す疾患または早期に老化を来す疾患である請求項16に記載のモデル動物。
- 請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項16もしくは17に記載のモデル動物から得られる組織または細胞。
- 請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項16もしくは17に記載のモデル動物を用いることを特徴とする、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
- 下記工程:
(a)請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項16もしくは17に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)前記比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。 - 下記工程:
(a)請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項16もしくは17に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程
を含む、骨量および/または骨強度を低下させる物質のスクリーニング方法。 - 下記工程:
(a)請求項4〜15いずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項16もしくは17に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
(b)前記被験物質を投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質を投与しない動物における骨量および骨強度と比較する工程、
(c)工程(b)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を低下させる被験物質を選択する工程、
(d)工程(a)で用いた動物に、工程(c)で選択された被験物質と当該被験物質に対するアンタゴニスト候補物質とを投与する工程、
(e)工程(d)で被験物質とアンタゴニスト候補物質とを投与した動物における骨量および骨強度を調べ、被験物質のみを投与した動物における骨量および骨強度と比較する工程、ならびに
(f)工程(e)の比較結果に基づいて、骨量および/または骨強度を増強させるアンタゴニスト候補物質を選択する工程
を含む、骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。 - 下記工程:
(a)骨芽細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)前記被験物質を接触させた骨芽細胞におけるBcl-xLの発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞における発現量と比較する工程、および
(c)前記比較結果に基づいて、Bcl-xLの発現を増加させる被験物質を選択する工程
を含む、Bcl-xLの発現増加を介した骨量および/または骨強度を増加させる物質のスクリーニング方法。
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