JP2003047467A

JP2003047467A - コンドロイチン合成酵素

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Publication number: JP2003047467A
Application number: JP2001234112A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Sugawara; 一幸菅原; Hiroyuki Kitagawa; 裕之北川
Original assignee: New Industry Research Organization NIRO
Current assignee: New Industry Research Organization NIRO
Priority date: 2001-08-01
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2003-02-18
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: US20050048604A1; JP4702819B2; US8334115B2; WO2003012099A1; US8685674B2; AU2002323753B2; US7947481B2; CA2456120C; CA2456120A1; US20110262972A1; EP1420067A1; US20130034878A1; US20090291470A1; US7354741B2; US20070059805A1; EP1420067A4

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ヒトコンドロイチン合成酵素をコードするＤ
ＮＡ及びその用途を提供する。【解決手段】ヒト由来の特定のアミノ酸配列を含むタ
ンパク質または同効物をコードするＤＮＡ。このＤＮＡ
の発現によりヒトコンドロイチン合成酵素が得られる。
ヒトコンドロイチン合成酵素を用いて、コンドロイチン
の二糖繰返し単位を有する糖鎖を製造できる。上記ＤＮ
Ａまたはその一部は、ヒトコンドロイチン合成酵素に対
するハイブリダイゼーション用プローブとして使用でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コンドロイチン合
成酵素をコードするＤＮＡを含むベクター、コンドロイ
チン合成酵素の製造方法、コンドロイチンの二糖繰返し
単位を有する糖鎖の製造方法、ならびに、コンドロイチ
ン合成酵素に対するハイブリダイゼーション用プローブ
に関する。

【０００２】

【従来の技術】コンドロイチン硫酸はグリコサミノグリ
カン（ＧＡＧ）の一種であり、細胞表面や細胞外マトリ
ックスにおいてプロテオグリカンとして存在する。コン
ドロイチン硫酸は、哺乳類の発生過程における脳におい
て神経系ネットワーク形成に重要な役割を担っているこ
とから(Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000);T
rends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000))
注目を集めるに至っている。

【０００３】コンドロイチン硫酸は、グルクロン酸残基
(GlcUA)とN-アセチルガラクトサミン残基(GalNAc)の繰
り返し二糖単位から構成される直鎖状のポリマー構造を
有しており、独特な４糖構造（GlcUAβ1-3Galβ1-3Gal
β1-4Xylβ1）を介して、コアタンパク質のセリン残基
に共有結合する(Glycoproteins, ed. Gottschalk, A.
(Elsevier Science, New York), pp. 491-517 (1972);
The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycan
s, ed. Lennarz, W. J. (Plenum, New York), pp.267-3
71 (1980))。

【０００４】ＧＡＧの生合成は、UDP-糖から単糖が糖鎖
の非還元末端に順々に転移されることによって行われ
る。ヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖繰り返し構造の生合
成に関与するグリコシルトランスフェラーゼはウシ血清
から精製され、そのcDNAクローニングによって、単一の
タンパク質がN-アセチルグルコサミン残基(GlcNAc)とGl
cUAの両方のトランスフェラーゼ反応を触媒することが
判明している。

【０００５】一方、コンドロイチン硫酸の二糖単位の生
合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼは、細菌
由来のコンドロイチン合成酵素(J. Biol. Chem. 275, 2
4124-24129 (2000))を除いてまだクローニングされてい
ない。ニワトリの軟骨(J. Biol.Chem. 272, 14399-1440
3 (1997))とウシ血清(Eur. J. Biochem. 264, 461-467
(1999))からGlcUAトランスフェラーゼII（GlcAT-II）お
よびGalNAcトランスフェラーゼII（GalNAcT-II）が精製
されてはいるが、これらの酵素を均一に精製することが
困難であるため、cDNAクローニングは未だ行われていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトコンド
ロイチン合成酵素をコードするＤＮＡを含むベクター、
ヒトコンドロイチン合成酵素の製造方法、コンドロイチ
ンの二糖繰返し単位を有する糖鎖の製造方法、ならび
に、ヒトコンドロイチン合成酵素に対するハイブリダイ
ゼーション用プローブを提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ヒトcDNAデ
ータベースを、特定のキーワードに基づいて検索するこ
とにより、ヒトコンドロイチン合成酵素をコードするＤ
ＮＡの候補を見出すのに成功するとともに、候補ＤＮＡ
を実際に発現させることにより、候補ＤＮＡがヒトコン
ドロイチン合成酵素をコードするＤＮＡであることを確
認し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、以下のものを提供す
る。

【０００９】（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの
ＤＮＡを保持するベクターであって、前記（ｂ）又は
（ｃ）のＤＮＡが、下記（イ）及び（ロ）の触媒活性を
有するタンパク質をコードしている前記ベクター（但
し、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜８０２で示さ
れるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮ
Ａを含むものを除く）。（ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（ｂ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列を
含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）

【００１０】（２）前記（ａ）のＤＮＡが、配列番号
１におけるヌクレオチド番号６３３〜２９００で示され
るＤＮＡである、（１）に記載のベクター。

【００１１】（３）タンパク質が可溶性である、
（１）又は（２）に記載のベクター。

【００１２】（４）発現ベクターである（１）〜
（３）のいずれかに記載のベクター。

【００１３】（５）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの
ＤＮＡを保持するベクターであって、前記（ｂ）又は
（ｃ）のＤＮＡが、下記（イ）及び（ロ）の触媒活性を
有するタンパク質をコードしている前記ベクターによっ
て宿主が形質転換された形質転換体。（ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（ｂ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列を
含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）

【００１４】（６）前記（ａ）のＤＮＡが、配列番号
１におけるヌクレオチド番号６３３〜２９００で示され
るＤＮＡである、（５）に記載の形質転換体。

【００１５】（７）タンパク質が可溶性である、
（５）又は（６）に記載の形質転換体。

【００１６】（８）（５）〜（７）のいずれか１項に
記載の形質転換体を生育させ、その生育物からコンドロ
イチン合成酵素を採取することを特徴とする、コンドロ
イチン合成酵素の製造方法。

【００１７】（９）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミ
ノ酸配列をそのアミノ酸配列中に包含し、かつ下記
（イ）及び（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパク質を
含有する、コンドロイチン合成用試薬。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列。（Ｂ）上記（Ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸
が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）

【００１８】（１０）酵素タンパク質が可溶性である
（９）の試薬。

【００１９】（１１）（９）又は（１０）に記載の試
薬を、GalNAc供与体及び下記一般式(1)で示される糖鎖
に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式(3)で
示される糖鎖の製造方法。

【００２０】GlcUA-GalNAc-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-GalNAc-R¹ (3) （各式中、GlcUA及びGalNAcは、いずれも前記と同義で
ある。 - はグリコシド結合を、R¹は任意の基を示
す。）

【００２１】（１２）（９）又は（１０）に記載の試
薬を、GlcUA供与体及び下記一般式(2)で示される糖鎖に
接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式(4)で示
される糖鎖の製造方法。

【００２２】GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (4) （各式中、GlcUA、GalNAc、及び - は、いずれも前記と
同義である。R²は任意の基を示す。）

【００２３】（１３）（９）又は（１０）に記載の試
薬を、GalNAc供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般
式(1)で示される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含
む、下記一般式(5)及び(7) から選ばれる糖鎖の製造方
法。

【００２４】GlcUA-GalNAc-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (5) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (7) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、
及び - は、いずれも前記と同義である。またR¹は任意
の基を示す。）

【００２５】（１４）（９）又は（１０）に記載の試
薬を、GalNAc供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般
式(2)で示される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含
む、下記一般式(6)及び(8) から選ばれる糖鎖の製造方
法。

【００２６】GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (6) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (8) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、
及び - は、いずれも前記と同義である。またR²はいず
れも任意の基を示す。）

【００２７】（１５）配列番号１におけるヌクレオチ
ド番号４９５〜２９００で示される塩基配列又はその一
部に相補的な配列を有するハイブリダイゼーション用プ
ローブ。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を発明の実施の形態
により詳説する。（１）本発明ベクター本発明ベクターは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤ
ＮＡを保持するベクターである（但し、配列番号２にお
けるアミノ酸番号１〜８０２で示されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質をコードするＤＮＡを含むものを除
く）。（ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（ｂ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列を
含むタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００２９】前記（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡは、下記
（イ）及び（ロ）の触媒活性を有するタンパク質をコー
ドしている。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。

【００３０】なお、コンドロイチンは、GlcUAとGalNAc
の繰り返し二糖単位からなるポリマーであり、その非還
元末端がGlcUAであるものとGalNAcであるものとの双方
を含んでいる。よって、GalNAcの転移は非還元末端がGl
cUAであるコンドロイチンに対するものであり、GlcUAの
転移は非還元末端がGalNAcであるコンドロイチンに対す
るものであると言える。

【００３１】後記実施例に記載したように、配列番号２
に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号４７〜８０２で示さ
れるアミノ酸配列を含むタンパク質は、ヒトコンドロイ
チン合成酵素の酵素活性を有することが確認されてい
る。配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜
４６で示されるアミノ酸配列の部分は、膜貫通領域を含
むと考えられる。よって、アミノ酸番号１〜４６で示さ
れるアミノ酸配列をコードする配列を含まないＤＮＡを
用いることにより、可溶性形態でコンドロイチン合成酵
素を発現させることができる点で好ましい。すなわち、
「アミノ酸番号４７〜８０２で示されるアミノ酸配列を
コードするＤＮＡであって、アミノ酸番号１〜４６で示
されるアミノ酸配列をコードする配列を含まないＤＮ
Ａ」を保持するベクターが好ましい。

【００３２】天然に存在するタンパク質には、それをコ
ードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後のタンパク質
の細胞内および精製中の修飾反応などによってそのアミ
ノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の
変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しな
いタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示
すものがあることが知られている。このように構造的に
若干の差違があってもその機能については大きな違いが
認められないタンパク質をコードするＤＮＡを保持する
ベクターは、本発明ベクターに包含される。人為的にタ
ンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した
場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異
体を作製することが可能である。例えば、ヒトインター
ロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイ
ン残基をセリンに置換したタンパク質がインターロイキ
ン２活性を保持することが知られている(Science,224,1
431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必
須でないペプチド領域を有していることが知られてい
る。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在する
シグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られ
るプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとん
どは翻訳後、または活性型タンパク質への転換に際して
除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異
なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有
するタンパク質である。このようなタンパク質をコード
するＤＮＡとして上記（ｂ）及び（ｃ）のＤＮＡが挙げ
られる。

【００３３】上記（ｂ）における「ストリンジェントな
条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう
（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laborat
ory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor Labo
ratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな
条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳ
Ｃ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's soluti
on、100μg/mlサケ***DNAを含む溶液中、42℃でハイブ
リダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ
溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄す
る条件が挙げられる。

【００３４】上記（ｃ）における、なお本明細書におけ
る「数個のアミノ酸」とは、後述する（イ）及び（ロ）
の触媒活性が失われない程度の変異を起こしてもよいア
ミノ酸の数を示し、例えば８００アミノ酸残基からなる
タンパク質の場合、４〜４０程度、好ましくは４〜２
０、より好ましくは４〜１０の数を示す。

【００３５】なお、本発明ベクターに保持されるＤＮＡ
として、遺伝暗号の縮重による種々の異なった塩基配列
を有するＤＮＡが存在することは、当業者であれば容易
に理解されるところである。

【００３６】前記（イ）及び（ロ）の触媒活性は、グリ
コシルトランスフェラーゼの一般的なアッセイ方法によ
って検出することができる。

【００３７】具体的には、後記実施例に示すように、UD
P-Ｎ−アセチルガラクトサミン（UDP-GalNAc）を供与体
として用い、コンドロイチンへのGalNAcの転移反応を利
用した測定方法、及び、UDP-グルクロン酸（UDP-GlcU
A）を供与体として用い、コンドロイチンへのGlcUAの転
移反応を利用した測定方法を用いることによってそれぞ
れ測定できる。よって当業者であれば、これらの転移活
性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ
以上の、特に１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入又は転位を容易に選択することができる。ま
た、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮ
Ａの中から前記（イ）及び（ロ）の触媒活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡを容易に選択できる。

【００３８】なお、ここで用いるコンドロイチンには、
非還元末端がGlcUAであるものと、GalNAcであるものと
の双方が含まれることは、前記で説明した通りである。

【００３９】また、前記（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡによ
ってコードされるタンパク質は、さらに下記（ハ）の全
ての性質を有していることが好ましい。（ハ）下記のいずれの受容体にも、下記の供与体（カッ
コ内）から実質的に単糖を転移しない。

【００４０】・Galβ1-3Galβ1-4Xyl（UDP-GlcUA）・GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser（UDP-GalN
Ac）・α−トロンボモジュリン（UDP-GalNAc）・ヒツジ顎下腺アシアロムチン（UDP-Gal）・GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（UD
P-Gal）

【００４１】なお、α−トロンボモジュリンには、GlcU
Aβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylからなる４糖が含まれてい
る。またヒツジ顎下腺アシアロムチンには、GalNAcα1-
O-Ser/Thrが含まれている。

【００４２】なお、上記において、Galはガラクトース
残基を、Xylはキシロース残基を、Serはセリン残基を、
Thrはスレオニン残基をそれぞれ示し、その他は前記と
同義である。

【００４３】本発明ベクターに保持されるＤＮＡにより
保持されるタンパク質は可溶性タンパク質であることが
好ましい。可溶性タンパク質とは、通常には膜貫通ドメ
インを有さないタンパク質であり、発現させたときに水
性溶媒等に可溶であり、精製が容易なことから好ましい
ものである。

【００４４】本発明ベクターに保持されるＤＮＡは、配
列番号２におけるアミノ酸番号１〜４６で示されるアミ
ノ酸配列をコードする配列を含まないものが好ましく、
最も好ましいＤＮＡは、配列番号１におけるヌクレオチ
ド番号６３３〜２９００で示されるＤＮＡである。

【００４５】またこのベクターは、後述するコンドロイ
チン合成酵素の製造方法に好ましく用いられることか
ら、発現ベクターであることが好ましい。

【００４６】例えば、アミノ酸番号４７〜８０２で示さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（アミノ酸番号１
〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする配列を含ま
ない）を保持する発現ベクターは、以下の手法により調
製することができる。

【００４７】＜Ａ＞ベクターに組み込むＤＮＡの調製 HUGEプロテインデータベースにおいて「KIAA0990」とし
て特定されるｃＤＮＡクローン(GenBankアクセション番
号；AB023207)を入手し、これを鋳型として、XhoI部位
を含む5'-プライマー(5'-CCCTCGAGGGGCTGCCGGTCCGGGC-
3'(配列番号３))、および、終止コドンから138bp下流に
位置するXhoI部位を含む3'-プライマー(5'-CCCTCGAGCAA
TCTTAAAGGAGTCCTATGTA-3'(配列番号４))を用いてＰＣＲ
で増幅を行う。

【００４８】PCR反応は一般的な方法を用いることがで
きるが、例えば5%(v/v)ジメチルスルホキシド中で、Pfu
ポリメラーゼ（Stratagene社、ラホヤ、カリフォルニア
州）を用いて、94°Cで30秒、55°Cで30秒、および72°
Cで180秒のサイクルを34サイクル行うことにより実施す
ることができる。

【００４９】＜Ｂ＞ベクターへのＤＮＡ断片の導入上記手法によって得られたＤＮＡを公知のベクターに導
入することで本発明ベクターを調製することができる。

【００５０】上記DNAを導入するベクターとしては、例
えば、導入したDNAを発現させることが可能な適当な発
現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクタ
ー等）を使用することができ、本発明ベクターを組み込
む宿主細胞で上記DNAを発現することが可能なベクター
を適宜選択する。このような宿主−ベクター系として
は、COS細胞、3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、pGIR2
01（Kitagawa, H., and Paulson, J. C. (1994) J. Bio
l. Chem. 269, 1394-1401）、pEF-BOS（Mizushima,S.,
and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 532
2）、pCXN2(Niwa, H.,Yamanura, K. and Miyazaki, J.
(1991) Gene 108, 193-200)、pCMV-2（イーストマン
コダック(Eastman Kodak)製）、pCEV18、pME18S（丸山
ら,Med. Immunol., 20, 27(1990)）又はpSVL（ファルマ
シアバイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクタ
ーの組み合わせ、大腸菌（E. coli）と、pTrcHis（イン
ビトロゲン社製）、pGEX（ファルマシアバイオテック
社製）、pTrc99（ファルマシアバイオテック社製）、pK
K233-3（ファルマシアバイオテック社製）、pEZZZ18
（ファルマシアバイオテック社製）、pCH110（ファル
マシアバイオテック社製）、pET（ストラタジーン社
製）、pBAD（インビトロゲン社製）、pRSET（インビト
ロゲン社製）、及びpSE420（インビトロゲン社製）等の
原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせの他、宿主細
胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これ
らに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−
ベクター系の中でも特に哺乳類細胞とpEF-BOSとの組み
合わせが好ましい。

【００５１】また、上記DNAを組み込むベクターは、組
み込んだDNAがコードするタンパク質とマーカーペプチ
ドとの融合タンパク質を発現するように構築されたもの
を用いることもでき、本発明ベクターを用いて発現され
るコンドロイチン合成酵素を精製する場合には特に好ま
しい。上記マーカーペプチドとしては例えばプロテイン
Ａ、インスリンシグナル配列、His、FLAG、CBP（カルモ
ジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ）などが挙げられる。プロテインＡと
融合させれば容易にアフィニティー精製することが可能
となり、インスリンシグナル配列等と融合させれば酵素
を細胞外（培地等）に分泌させることができる。

【００５２】いずれのベクターを用いる場合であっても
常法に従って、上記DNAとベクターとを連結することが
可能なように例えば制限酵素などによって処理し、必要
に応じて平滑化や粘着末端の連結を行った後、前記DNA
とベクターとの連結をすることが可能である。

【００５３】具体的には、例えば上記＜Ａ＞で得られた
ＤＮＡ（PCR断片）をXhoIで消化し、断片の両端をクレ
ノウ断片（New England Biolabs, Beverly、マサチュー
セッツ州）、dCTP及びdTTPを用いて部分的に充填し、Ba
mHIで消化したpGIR201protA(J. Biol. Chem., 269, 139
4-1401 (1994))ベクターについても同様にdATPとdGTPで
部分的に充填する。これにより得られた断片をpGIR201p
rotAにサブクローニングし、上記＜Ａ＞で得られたＤＮ
ＡによってコードされるＤＮＡと、ベクター中のインス
リンシグナル配列およびプロテインＡ配列とを融合させ
る。この融合タンパク配列を含むNheI断片を、発現ベク
ターpEF-BOS(Nucleic Acid Res., 18, 5322 (1990))のX
baI部位に挿入することにより、インスリンシグナル配
列及びプロテインＡと融合したコンドロイチン合成酵素
を発現する発現ベクターを得ることができる。

【００５４】（２）本発明形質転換体本発明形質転換体は、本発明ベクター（配列番号２にお
けるアミノ酸番号１〜８０２で示されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質をコードするＤＮＡを含むものも含
む）によって宿主が形質転換された形質転換体である。

【００５５】ここでいう「宿主」は、本発明ベクターに
よる組換えが可能なものであればよいが、本発明ベクタ
ーの保持するＤＮＡ又はそのＤＮＡを組み込んだ組換え
ベクターの機能を発揮できるものが好ましい。宿主とし
ては、動物細胞、植物細胞、微生物細胞（菌体）が包含
され、COS細胞（COS-1細胞、COS-7細胞等）、3LL-HK46
細胞などの哺乳類細胞、大腸菌（E. coli）、昆虫細
胞、酵母、枯草菌などが例示される。宿主は、本発明ベ
クターにあわせて適宜選択することができるが、例えば
pEF-BOSをベースとする本発明ベクターを用いる場合に
は哺乳類由来の細胞を選択することが好ましく、中でも
COS細胞が好ましい。

【００５６】宿主の本発明ベクターによる形質転換は、
常法によって行うことができる。例えば、市販のトラン
スフェクション用試薬を用いる方法や、DEAE-デキスト
ラン法、エレクトロポレーション法等によって本発明ベ
クターを宿主に導入し、形質転換を行うことができる。

【００５７】このようにして得られる本発明形質転換体
は、後述する通り、コンドロイチン合成酵素の製造等に
用いることができる。

【００５８】（３）コンドロイチン合成酵素の製造方法本発明のコンドロイチン合成酵素の製造方法は、本発明
形質転換体を生育させ、その生育物からコンドロイチン
合成酵素を採取することを特徴とする。

【００５９】ここで「生育」とは、本発明形質転換体で
ある細胞や微生物自体の増殖、本発明形質転換体である
細胞を組み込んだ動物、昆虫等の生育を含む概念であ
る。また、ここでいう「生育物」とは、本発明形質転換
体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養され
た宿主細胞、分泌物、排出物等を包含する概念である。

【００６０】生育の条件（培地や培養条件等）は、用い
る宿主に合わせて適宜選択される。

【００６１】この製造方法によれば、用いる形質転換体
に応じて種々の形態のコンドロイチン合成酵素を産生さ
せることができる。

【００６２】例えば本発明ベクターとして、配列番号２
におけるアミノ酸番号４７〜８０２で示されるアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターによっ
て形質転換された形質転換体を生育させれば、可溶性の
コンドロイチン合成酵素が産生される。

【００６３】また、配列番号２におけるアミノ酸番号１
〜８０２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
保持する発現ベクターによって形質転換された形質転換
体を生育させれば、不溶性（膜結合性）のコンドロイチ
ン合成酵素が産生される。

【００６４】さらに、マーカーペプチドとの融合タンパ
ク質を発現するよう構築された発現ベクターによって形
質転換された形質転換体を生育させれば、マーカーペプ
チドと融合したコンドロイチン合成酵素が産生される。

【００６５】生育物からのコンドロイチン合成酵素の採
取は、産生されるコンドロイチン合成酵素の形態に応じ
て、公知のタンパク質の抽出・精製方法によって行うこ
とができる。

【００６６】例えばコンドロイチン合成酵素が、培地
（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生さ
れる場合には、培地を採取し、これをそのままコンドロ
イチン合成酵素として用いてもよい。またコンドロイチ
ン合成酵素が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は
不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素
キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガ
ラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融
解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、または
これらの組み合わせ等の処理操作によってコンドロイチ
ン合成酵素を抽出することができ、抽出物をそのままコ
ンドロイチン合成酵素として用いてもよい。

【００６７】これらの培地や抽出物から、コンドロイチ
ン合成酵素をさらに精製することもでき、かつ好まし
い。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完
全な精製であってもよく、コンドロイチン合成酵素の使
用目的等に応じて適宜選択することができる。

【００６８】精製方法として具体的には、例えば硫酸ア
ンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠
心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作
が挙げられる。

【００６９】例えば、コンドロイチン合成酵素をプロテ
インＡとの融合タンパク質として産生させれば、ＩｇＧ
を結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによって簡便に精製することができる。同様に、
Hisとの融合タンパク質として産生させれば、磁性ニッ
ケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融
合タンパク質として産生させれば抗FLAG抗体を結合させ
た固相を用いることができる。さらにインスリンシグナ
ルと融合させることにより、細胞破砕等の抽出操作が不
要となる。

【００７０】精製されたコンドロイチン合成酵素の製造
は、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析すること
によって確認できる。

【００７１】（４）本発明試薬本発明試薬は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸配
列をその配列中に包含し、かつ下記（イ）及び（ロ）の
触媒活性を有する酵素タンパク質を含有する、コンドロ
イチン合成用試薬である。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列。（Ｂ）上記（Ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸
が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。

【００７２】（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、本発
明ベクターに関して説明した（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列であり、上記（ａ）及
び（ｃ）のＤＮＡがコードするアミノ酸配列に関して説
明した通りである。（イ）及び（ロ）については、本発
明ベクターに関して説明した通りである。

【００７３】本発明試薬に含有される酵素タンパク質に
は、配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で示
されるアミノ酸配列からなるもののみならず、アミノ酸
番号１〜８０２で示されるアミノ酸配列からなるもの等
も含まれる。

【００７４】本発明試薬は、上記（Ａ）又は（Ｂ）の酵
素タンパク質（コンドロイチン合成酵素）が有する「Ga
lNAcの転移作用」及び「GlcUAの転移作用」を、コンド
ロイチンの合成試薬として応用したものである。

【００７５】本発明試薬はコンドロイチンの合成に用い
るものである。本明細書において「コンドロイチンの合
成」あるいは「コンドロイチン合成」とは、コンドロイ
チンに糖を転移・付加して、コンドロイチンの糖鎖を延
長することを含む概念である。

【００７６】本発明試薬の形態も限定されず、溶液形
態、凍結形態、凍結乾燥形態のいずれの形態であっても
よい。またコンドロイチン合成酵素の活性に影響を与え
ない限りにおいて他の成分（例えば、試薬的に許容され
る担体等）を含んでいてもよい。

【００７７】（５）糖鎖の製造方法本発明の糖鎖の製造方法は、いずれも本発明試薬を用い
るものであり、使用する糖供与体と受容体基質に応じ
て、以下の４つに分けることができる。

【００７８】＜１＞本発明試薬を、GalNAc供与体及び下
記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる工程を少なく
とも含む、下記一般式(3)で示される糖鎖の製造方法。

【００７９】GlcUA-GalNAc-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-GalNAc-R¹ (3)

【００８０】＜２＞本発明試薬を、GlcUA供与体及び下
記一般式(2)で示される糖鎖に接触させる工程を少なく
とも含む、下記一般式(4)で示される糖鎖の製造方法。

【００８１】GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (4)

【００８２】＜３＞本発明試薬を、GalNAc供与体及びGl
cUA供与体、並びに下記一般式(1)で示される糖鎖に接触
させる工程を少なくとも含む、下記一般式(5)及び(7)か
ら選ばれる糖鎖の製造方法。

【００８３】GlcUA-GalNAc-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (5) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (7)

【００８４】＜４＞本発明試薬を、GalNAc供与体及びGl
cUA供与体、並びに下記一般式(2)で示される糖鎖に接触
させる工程を少なくとも含む、下記一般式(6)及び(8)か
ら選ばれる糖鎖の製造方法。

【００８５】GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (6) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (8)

【００８６】GalNAc供与体としては、ヌクレオシドジリ
ン酸−GalNAcが好ましく、UDP-GalNAcが特に好ましい。

【００８７】GlcUA供与体としては、ヌクレオシドジリ
ン酸−GlcUAが好ましく、UDP-GlcUAが特に好ましい。

【００８８】「接触」のさせ方は、本発明試薬中に含ま
れるコンドロイチン合成酵素、供与体、及び受容体（糖
鎖）の分子が相互に接触して酵素反応が生ずる限りにお
いて特に限定されない。例えばこれら三者が溶解した溶
液中で接触させてもよい。また本発明試薬中に含まれる
コンドロイチン合成酵素を適当な固相（ビーズ等）に結
合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等を用いる
膜型リアクター等を用いて連続的に酵素反応させること
もできる。また、ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ００
／２７４３７号に記載された方法と同様に、受容体を固
相に結合させて酵素反応させることもできる。さらに、
供与体を再生（合成）するバイオリアクターを組み合わ
せて用いてもよい。

【００８９】また、上記＜３＞及び＜４＞においては、
必ずしもGalNAc供与体とGlcUA供与体とを同時に本発明
試薬及び上記一般式(1)又は(2)で示される糖鎖に接触さ
せる必要はなく、これら供与体を交互に接触させてもよ
い。

【００９０】酵素反応させる条件は、コンドロイチン合
成酵素が作用する条件である限りにおいて特に限定され
ないが、中性ｐＨ付近（例えばpH6.5程度）で反応させ
ることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝
液中で反応を行うことがより好ましい。またこのときの
温度もコンドロイチン合成酵素の活性が保持されている
限りにおいて特に限定されないが、３０〜４０℃程度
（例えば３７℃）が例示される。またコンドロイチン合
成酵素の活性を増加させる物質がある場合には、その物
質を添加してもよい。例えばＭｎ²⁺等を共存させること
が好ましい。反応時間は、使用する本発明試薬、供与体
及び受容体の量、並びにその他の反応条件に応じて当業
者が適宜決定することができる。

【００９１】生成物からのコンドロイチンの単離等は、
公知の方法によって行うことができる。

【００９２】また、本発明試薬（コンドロイチン合成酵
素）と、硫酸基転移酵素（スルホトランスフェラーゼ）
とを組み合わせて用いることによって、コンドロイチン
硫酸を製造することもできる。

【００９３】例えば、上記の糖鎖の製造方法（コンドロ
イチンの製造方法）において、さらに硫酸基供与体（3'
-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸(PAPS)など）と硫酸
基転移酵素を共存せしめ、コンドロイチンの生成と硫酸
基の転移とを同時に行うことにより、コンドロイチン硫
酸を製造することができる。硫酸基転移酵素は、前記と
同様に適当な固相（ビーズ等）に結合させた固定化酵素
として用いてもよく、限外濾過膜、透析膜等を用いる膜
型リアクターを用いて、連続的に反応させてもよい。こ
の際、硫酸基供与体を再生（合成）するバイオリアクタ
ーを組み合わせて用いてもよい。

【００９４】また、本発明ベクターで形質転換された宿
主（本発明形質転換体）において、直接コンドロイチン
を生成させることにより、コンドロイチンを製造するこ
ともできる。

【００９５】さらに、本発明ベクターと硫酸基転移酵素
をコードするｃＤＮＡとを共に宿主に導入し、宿主（硫
酸基転移酵素をコードするｃＤＮＡを含有する本発明形
質転換体）において、コンドロイチン合成酵素と硫酸基
転移酵素とを同時に発現させ、宿主において直接コンド
ロイチン硫酸を製造することができる。

【００９６】ここで用いることができる硫酸基転移酵素
（又はそれをコードするｃＤＮＡ）は、コンドロイチン
に硫酸基を転移する酵素（又はそれをコードするｃＤＮ
Ａ）であればよく、所望のコンドロイチン硫酸のタイプ
に応じて、公知のものから適宜選択することができる。
また、硫酸基の転移位置が異なる２種類以上の硫酸基転
移酵素（又はそれをコードするｃＤＮＡ）を組み合わせ
て用いてもよい。

【００９７】硫酸基転移酵素の一例として、例えばコン
ドロイチン６−Ｏ−硫酸基転移酵素（J. Biol. Chem.,
275(28), 21075-21080 (2000)）を挙げることができる
が、これに限定されず、他の酵素を用いることもでき
る。

【００９８】（６）本発明プローブ本発明プローブは、配列番号１におけるヌクレオチド番
号４９５〜２９００、好ましくは６３３〜２９００で示
される塩基配列又はその一部に相補的な配列を有するハ
イブリダイゼーション用プローブである。

【００９９】本発明プローブは、配列番号１におけるヌ
クレオチド番号４９５〜２９００、好ましくは６３３〜
２９００で示される塩基配列又はその一部に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを作成し、これをハイブ
リダイゼーションに適した標識（例えば、放射性同位
体）で標識することにより得ることができる。

【０１００】オリゴヌクレオチドの長さは、本発明プロ
ーブを用いるハイブリダイゼーションの条件によって適
宜選定される。

【０１０１】本発明プローブは、コンドロイチン硫酸の
生物学的機能を調べる有用な道具となることが期待され
る。コンドロイチン硫酸は、広く発現し、かつ、多くの
組織、特に脳において重要な役割を果たしているからで
ある。このプローブはさらに、遺伝子と疾患との関連を
探るのにも有用と考えられる。

【０１０２】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【０１０３】

【実施例１】（１）新規ヒトグリコシルトランスフェラ
ーゼcDNAのインシリコ・クローニング(in silico cloni
ng) かずさDNA研究所（千葉県）のHUGEプロテインデータベ
ース( HYPERLINK http://www.kazusa.or.jp/huge/) htt
p://www.kazusa.or.jp/huge/)において、「一個の膜貫
通ドメイン(one transmembrane domain)」と「ガラクト
シルトランスフェラーゼファミリー(galactosyltransfe
rase family)」をキーワードとしてスクリーニングを行
った。この結果、一つのクローン(KIAA0990)が特定され
た(GenBankアクセション番号；AB023207)。このクロー
ンは、塩基配列の解析から、494bpの5'-未翻訳領域、N-
グリコシル化される可能性がある3つの部位（図１中の
星印）を含む802個のアミノ酸から成るタンパク質をコ
ードする2406 bpの、単一のオープンリーディングフレ
ーム、および、1.7kbであってポリアデニル化シグナル
を有すると予想される3'-未翻訳領域を含むことが明ら
かになった。塩基配列及びその塩基配列から推測される
アミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列
番号２に示す。

【０１０４】このクローンをかずさＤＮＡ研究所から入
手した。ノーザンブロット分析（実施例２参照）によ
り、このクローンに相当するmRNAは、各種ヒト組織にお
いて、約5.0 kb長を有することが明らかになった。この
ことから、上記クローンのcDNAはほぼ全長であることが
示唆された。推定されるアミノ酸配列は、91,728-Daの
タンパク質に相当する。予想される翻訳開始部位は、Ko
zakの共通開始配列(Nucleic Acids Res. 12, 857-872
(1984))と一致し、かつ、インフレーム終止コドンが、
割り当てられた開始ATGコドンの上流に存在した。

【０１０５】Kyte-Doolittleのヒドロパシー分析(J. Mo
l. Biol. 157, 105-132 (1982))により、NH₂末端領域に
17個のアミノ酸残基からなる、１個の顕著な疎水性領域
が存在することが明らかになった。これは、今日までに
クローンされている多くの、ゴルジ局在性グリコシルト
ランスフェラーゼに特徴的な、II型膜貫通形態を持つこ
とを予想させるものである（図１）。

【０１０６】データベース検索により、このアミノ酸配
列は、アミノ末端側では、ヒトのコア1 UDP-Gal:GalNAc
α-R β1,3-Galトランスフェラーゼ（GenBankアクセシ
ョン番号AF155582）に僅かに相同性を有しており、カル
ボキシル末端側ではヒトのUDP-Gal:GlcNAcβ-R β1,4-G
alトランスフェラーゼII（GenBankアクセション番号AB0
24434）に僅かに相同性を有していた。相同性を有する
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に特徴的な点とし
て、異なるメンバーは供与体または受容体に関して異な
った特異性を有するにも拘わらず、形成される糖鎖の結
合様式はしばしば保存されている、という点を挙げるこ
とができる(Biochim. Biophys. Acta 1254, 35-53 (199
9))。

【０１０７】したがって、コードされるアミノ酸配列の
特徴から、この同定された遺伝子の産物は、β1,3-GlcU
Aトランスフェラーゼ（GlcAT-II）およびβ1,4-GalNAc
トランスフェラーゼ（GalNAcT-II）の両方の活性を有す
る可能性が示唆された。さらに、今回同定されたヒト遺
伝子の同族体が、Caenorhabditis elegansまたはDrosop
hilaゲノムの中に見出された。ヒト、C. elegansおよび
Drosophila由来のタンパク質配列の相互の一致度を図１
に示す。ヒトの配列は、C. elegansやDrosophilaに対し
て、それぞれ、36および42%の相同性を有していた。こ
れら３つのタンパク質は、いずれもアミノ末端側にDDD
を、カルボキシル末端側にDVDを含んでおり（図１）、
多くのグリコシルトランスフェラーゼに見られる、保存
されたDXDモチーフに相当すると考えられる (Proc. Nat
l. Acad. Sci. U. S. A. 95, 7945-7950 (1998))。

【０１０８】さらに、ヒトゲノムプロジェクトのデータ
ベース検索を行った。この結果、このcDNA配列と同一の
ゲノム配列（アクセス番号NT010274.3）が示された。こ
のcDNAとゲノム配列とを比較することにより、この遺伝
子のゲノム構造と染色体上の位置が明らかになった。こ
の遺伝子は40 kbを超える長さを持ち、そのコード領域
は、図２に示すように、三つの不連続なエキソンに分割
されていた。イントロン／エキソン接合部は、GT/AGル
ールに従っており、その両側は保存配列によって挟まれ
ていた。この遺伝子は、ヒトの第１５番染色体に存在す
る。

【０１０９】（２）可溶性の新規グリコシルトランスフ
ェラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドの構築この新規なグリコシルトランスフェラーゼにおいて、N-
末端の46個のアミノ酸残基を欠いたグリコシルトランス
フェラーゼのcDNAをPCRで増幅した。すなわち、KIAA099
0 cDNAを鋳型として、XhoI部位を含む5'-プライマー(5'
-CCCTCGAGGGGCTGCCGGTCCGGGC-3'(配列番号３))、およ
び、終止コドンから138bp下流に位置するXhoI部位を含
む3'-プライマー(5'-CCCTCGAGCAATCTTAAAGGAGTCCTATGTA
-3'(配列番号４))を用いて増幅を行った。PCR反応は、5
%(v/v)ジメチルスルホキシド中で、Pfuポリメラーゼ（S
tratagene社、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて、9
4°Cで30秒、55°Cで30秒、および72°Cで180秒のサイ
クルを34サイクル行った。このPCR産物をXhoIで消化
し、断片の両端をクレノウ断片（New England Biolabs
社, Beverly、マサチューセッツ州）、dCTP及びdTTPを
用いて部分的に充填した。BamHIで消化したpGIR201prot
A(J. Biol. Chem. 269, 1394-1401 (1994))ベクターに
ついても同様に、dATPとdGTPで部分的に充填した。得ら
れた断片をpGIR201protAにサブクローニングし、この新
規グリコシルトランスフェラーゼと、ベクター中のイン
スリンシグナル配列およびプロテインA配列とを融合さ
せた。上記の融合タンパク配列を含むNheI断片を、発現
ベクターpEF-BOS(Nucleic Acids Res. 18, 5322 (199
0))のXbaI部位に挿入し、発現プラスミドを得た。

【０１１０】この発現プラスミドは、グリコシルトラン
スフェラーゼの最初の46個のアミノ酸が、切断可能なイ
ンスリンシグナル配列と、プロテインAのIgG結合ドメイ
ンとによって置換されたタンパク質、すなわち、インス
リンシグナル配列及びプロテインＡと融合した可溶性コ
ンドロイチン合成酵素をコードする。

【０１１１】（３）可溶性の新規グリコシルトランスフ
ェラーゼの発現および酵素アッセイ FuGENE（商標）6（Roche Molecular Biochemicals、東
京）を用い、メーカーの説明書に従って、発現プラスミ
ド（6.7 μg）を100 mmプレート上でCOS-1細胞にトラン
スフェクトさせた。トランスフェクションから２日後
に、培養液1 mｌを採取して、10 μlのIgG-セファロー
ス(Amersham Pharmacia Biotech)と共に4°Cで1時間イ
ンキュベートした。遠心して回収したIgG-セファロース
のビーズをアッセイ緩衝液で洗浄し、同じ緩衝液に再懸
濁して、GalNAcトランスフェラーゼ、GlcUAトランスフ
ェラーゼ、およびGalトランスフェラーゼのアッセイに
用いた。すなわち、培養液中で発現した融合タンパク質
を、IgG-セファロースビーズに吸着させて内在性のグリ
コシルトランスフェラーゼ類を除去し、次いでこの酵素
結合ビーズを、酵素源として用い、このビーズに結合さ
せた融合タンパク質のグリコシルトランスフェラーゼ活
性を、各種の受容体基質及び供与体基質を用いてアッセ
イした。

【０１１２】GalNAcトランスフェラーゼの受容体として
は、コンドロイチンのポリマー(167μg)、α-トロンボ
モジュリン(1 nmol)、またはGlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1
-4Xylβ1-O-Ser(1 nmol)を用いた。また、GlcUAトラン
スフェラーゼの受容体としては、コンドロイチンのポリ
マー(167 μg)、またはGalβ1-3Galβ1-4Xyl(1 nmol)を
用いた。Galトランスフェラーゼの受容体としては、ヒ
ツジ顎下腺アシアロムチン(300 μg)またはGlcNAcβ1-3
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc(1 nmol)を用い
た。GalNAcトランスフェラーゼのアッセイには、全容量
30 μl中に、再懸濁したビーズ10 μl、受容体基質、8.
57μM UDP-[³H]GalNAc (3.60 x 10⁵ dpm)、50 mM MES緩
衝液、pH 6.5、10 mM MnCl₂、およびATPのナトリウム塩
171 μMを含有する混合物を用いた(J. Biochem. 117, 1
083-1087 (1995))。

【０１１３】リンケージ部位の4糖の合成に必要なGlcUA
トランスフェラーゼI(GlcAT-I)のアッセイには、全容量
30 μl中に、再懸濁したビーズ10 μl、1 nmol Galβ1-
3Galβ1-4Xyl、14.3 μM UDP-[¹⁴C]GlcUA (1.46 x 10⁵
dpm)、50 mM MES緩衝液、pH6.5、および2 mM MnCl₂を含
有する混合物を用いた(FEBS lett. 459, 415-420 (199
9))。GlcAT-IIのアッセイには、全容量は30 μl中に、
再懸濁したビーズ10 μl、167 μgのコンドロイチンの
ポリマー、14.3 μM UDP-[¹⁴C]GlcUA (1.46 x 10 ⁵ dp
m)、50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6、および10 m
M MnCl₂を含んでいた(Glycobiology 7, 905-911 (199
7))。Galトランスフェラーゼのアッセイには、全容量30
μl中に、再懸濁したビーズ10 μl、受容体基質、60
μM UDP-[³H]Gal (5.30 x 10⁵ dpm)、50 mM MES緩衝
液、pH 6.5、10 mM MnCl₂、およびATPのナトリウム塩17
1 μMを含有する混合物を用いた。反応混合物を37°Cで
1時間インキュベートし、放射標識された生成物を、セ
ファデックスG-25（スーパーファイン）を充填したシリ
ンジカラム、スーパーデックスペプチド・カラム、また
は、Dowex 1-X8 (PO₄ ^2-型、100-400メッシュ、Bio-Rad
社、東京)を含むパスツールピペット・カラムを用いた
ゲル濾過によって、UDP-[³H]GalNAc、UDP-[¹⁴C]GlcUA、
または、UDP-[³H]Galから分離した(J. Biochem. 117, 1
083-1087 (1995); J. Biol. Chem. 273, 6615-6618 (19
98); FEBS Lett. 459, 415-420 (1999); Glycobiology
7, 905-911 (1997); Glycobiology 7, 531-537 (199
7))。回収した標識生成物を、液体シンチレーション分
光法によって定量した。

【０１１４】なお、基質等の入手先は以下の通りであっ
た。UDP-[U-¹⁴C]GlcUA(285.2 mCi/mmol)、UDP-[³H]GalN
Ac(10 Ci/mmol)、および、UDP-[³H]Gal(15 Ci/mmol)
は、NENLife Science Products社から購入した。未標識
のUDP-GlcUA、UDP-GalNAcおよびUDP-Galは、Sigmaから
入手した。コンドロイチン（クジラ軟骨由来のコンドロ
イチン硫酸Aを化学的に脱硫酸化した誘導体）は、生化
学工業株式会社（東京）から購入した。均一に精製し
た、Ampullaria（淡水産アップルスネイル）由来の肝膵
臓β-グルクロニダーゼ（EC3.2.1.31）(Comp. Biochem.
Physiol. 86B, 565-569 (1987))は、東京臓器化学社
（東京）から提供された。Galβ1-3Galβ1-4Xylは、Nan
cy B. Schwartz博士（シカゴ大学）から恵与された。精
製α-トロンボモジュリン(Biochem. Biophys. Res. Com
mun. 171, 729-737 (1990))は、第一製薬株式会社（東
京）から提供されたもので、リンケージ部分の4糖（Glc
UAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xyl）(J. Biol. Chem. 273, 3
3728-33734 (1998))を含む。N-アセチルコンドロシン
（GlcUAβ1-3GalNAc）およびGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNA
cβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、K. Yoshida博士（生化学工業
株式会社）から恵与された。化学的に合成されたリンケ
ージ4糖−セリン（GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-
O-Ser）(Liebigs Ann. 1239-1257 (1996))は、T. Ogawa
博士（理化学研究所、埼玉県）から恵与された。

【０１１５】ヒツジ顎下腺アシアロムチンは、Tettaman
tiとPigmanの方法(Arch. Biochem.Biophys. 124, 45-50
(1968))に従って調製したヒツジ顎下腺ムチンを、Arth
robacter ureafaciens由来のシアリダーゼ（ナカライテ
スク社、京都）で処理して得た。Superdex（商標）ペプ
チドHR10/30カラムは、Amersham Pharmacia Biotech社
（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。結果を表１
に示す。活性は、コンドロイチンのポリマーを受容体と
し、UDP-GlcUAまたはUDP-GalNAcのいずれかを供与体と
して使用した場合に検出された。一方、他の受容体基質
と、UDP-GlcUA、UDP-GalNAcまたはUDP-Galのいずれかを
供与体として使用した場合には活性は検出されなかっ
た。そのような活性としては、コンドロイチン硫酸の生
合成の開始に関わるGlcAT-Iや、GalNAcトランスフェラ
ーゼI、コア1 UDP-Gal:GalNAcα-R β1,3-Galトランス
フェラーゼ、およびUDP-Gal:GlcNAcβ-R β1,4-Galトラ
ンスフェラーゼ活性が含まれる。コントロールとしてpE
F-BOSをトランスフェクトしたサンプルのアフィニティ
ー精製物では、グリコシルトランスフェラーゼ活性は検
出されなかった。これらの結果は、発現されたタンパク
質が、コンドロイチンのポリマーに対して高い特異性を
持つGlcUA/GalNAcトランスフェラーゼであることを明確
に示すものである。

【０１１６】なお、前記した通り、コンドロイチン（コ
ンドロイチンのポリマー）には、非還元末端がGlcUAで
あるものとGalNAcであるものとの双方が含まれ、GalNAc
の転移は非還元末端がGlcUAであるコンドロイチンに対
するものであり、GlcUAの転移は非還元末端がGalNAcで
あるコンドロイチンに対するものであるといえる。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】（４）酵素反応生成物の特定コンドロイチンのポリマーを受容体とした、GalNAcトラ
ンスフェラーゼ反応またはGlcUAトランスフェラーゼ反
応の生成物の単離を、0.25M NH₄HCO₃/7% l-プロパノー
ルで平衡化したスーパーデックスペプチド・カラムを用
いたゲル濾過によって行った。各酵素反応生成物を含む
放射能ピークをプールして蒸発乾燥させた。この単離し
たGalNAcトランスフェラーゼ反応生成物（約120 μg）
を、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0 を含む30 μl
の反応液中で、37°Cで一晩、100 mIUの、Arthrobacter
aurescens（アルトロバクター・オーレッセンス）由来
のコンドロイチナーゼAC-II（EC4.2.2.5）（生化学工業
株式会社（東京））で消化して、その消化性を評価し
た。単離したGlcUAトランスフェラーゼ反応生成物（約1
80 μg）は、100 mIUのコンドロイチナーゼAC-IIを含有
する30μlの50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0におい
て、または、22 mIUのβ-グルクロニダーゼを含有する3
0 μlの0.05M クエン酸ナトリウム緩衝液、pH4.5におい
て、37°Cで一晩消化した。各酵素の消化物を、前記と
同じスーパーデックスペプチド・カラムを用いて分析し
た。

【０１１９】GlcUAトランスフェラーゼ反応生成物の分
析結果を図３のＡに示す。標識された生成物はβ-グル
クロニダーゼまたはコンドロイチナーゼAC-IIによって
完全に消化され、遊離の[¹⁴C]GlcUAまたは[¹⁴C]GlcUAβ
1-3GalNAcの位置にピークが見られた。この結果から、G
lcUA残基は、コンドロイチンのポリマーの非還元末端に
存在するGalNAcに転移され、β1-3結合を形成したこと
が示唆される。

【０１２０】GalNAcトランスフェラーゼ反応生成物の分
析結果を図３のＢに示す。標識された生成物は、コンド
ロイチナーゼAC-IIによって完全に消化され、遊離の
[³H]GalNAcの位置にピークが見られた。この結果から、
GalNAc残基はコンドロイチンのポリマーの非還元末端に
存在するGluUAに転移され、β1-4結合を形成したことが
示唆される。

【０１２１】以上の結果をまとめると、この同定された
タンパク質は、GlcAT-IIとGalNAcT-IIの両方の活性を持
つコンドロイチン合成酵素であることが明らかになっ
た。

【０１２２】

【実施例２】分析には、市販のヒト12レーン含有多数組
織用ノーザンブロット（CLONETEC）膜を用いた。各レー
ンに、1 μgのポリアデニル化RNAをアプライした。この
膜に、放射標識され(>1 x 10⁹ cpm/μg)、ゲルで精製さ
れた0.84 kbコンドロイチン合成酵素特異的断片（KIAA0
990 cDNA(GenBankアクセション番号；AB023207)のヌク
レオチド631-1469に相当する）をプローブとして探索し
た。

【０１２３】この結果、調べた限りにおいて全てのヒト
組織で〜5.0 kbの単一バンドが示された（図４）。この
コンドロイチン合成酵素遺伝子は、ヒト組織において広
汎に存在するが、その発現の程度は組織によって異なっ
ていた。注目すべきことに、このｍＲＮＡは胎盤で特に
多く発現しており、脾臓、肺、および、末梢血白血球が
それに続いた。これらの所見は、コンドロイチン硫酸プ
ロテオグリカンが、多くの細胞の表面と、ほとんど全て
の組織の細胞外マトリックスに分布するという知見と一
致する。

【０１２４】

【発明の効果】ヒトコンドロイチン合成酵素をコードす
るＤＮＡを含むベクター、ヒトコンドロイチン合成酵素
の製造方法、コンドロイチンの二糖繰返し単位を有する
糖鎖の製造方法、ならびに、ヒトコンドロイチン合成酵
素に対するハイブリダイゼーション用プローブが提供さ
れる。

【０１２５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 生化学工業株式会社(Seikagaku Corporation) <120> コンドロイチン合成酵素 <130> P-9047 <160> 4 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 4565 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (495)..(2900) <400> 1 ggcgagctaa gccggaggat gtgcagctgc ggcggcggcg ccggctacga agaggacggg 60 gacaggcgcc gtgcgaaccg agcccagcca gccggaggac gcgggcaggg cgggacggga 120 gcccggactc gtctgccgcc gccgtcgtcg ccgtcgtgcc ggccccgcgt ccccgcgcgc 180 gagcgggagg agccgccgcc acctcgcgcc cgagccgccg ctagcgcgcg ccgggcatgg 240 tcccctctta aaggcgcagg ccgcggcggc gggggcgggc gtgcggaaca aagcgccggc 300 gcggggcctg cgggcggctc gggggccgcg atgggcgcgg cgggcccgcg gcggcggcgg 360 cgctgcccgg gccgggcctc gcggcgctag ggcgggctgg cctccgcggg cgggggcagc 420 gggctgaggg cgcgcggggc ctgcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cccggcgggc 480 ggagcggcgc gggc atg gcc gcg cgc ggc cgg cgc gcc tgg ctc agc gtg 530 Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Ala Trp Leu Ser Val 1 5 10 ctg ctc ggg ctc gtc ctg ggc ttc gtg ctg gcc tcg cgg ctc gtc ctg 578 Leu Leu Gly Leu Val Leu Gly Phe Val Leu Ala Ser Arg Leu Val Leu 15 20 25 ccc cgg gct tcc gag ctg aag cga gcg ggc cca cgg cgc cgc gcc agc 626 Pro Arg Ala Ser Glu Leu Lys Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Ala Ser 30 35 40 ccc gag ggc tgc cgg tcc ggg cag gcg gcg gct tcc cag gcc ggc ggg 674 Pro Glu Gly Cys Arg Ser Gly Gln Ala Ala Ala Ser Gln Ala Gly Gly 45 50 55 60 gcg cgc ggc gat gcg cgc ggg gcg cag ctc tgg ccg ccc ggc tcg gac 722 Ala Arg Gly Asp Ala Arg Gly Ala Gln Leu Trp Pro Pro Gly Ser Asp 65 70 75 cca gat ggc ggc ccg cgc gac agg aac ttt ctc ttc gtg gga gtc atg 770 Pro Asp Gly Gly Pro Arg Asp Arg Asn Phe Leu Phe Val Gly Val Met 80 85 90 acc gcc cag aaa tac ctg cag act cgg gcc gtg gcc gcc tac aga aca 818 Thr Ala Gln Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Ala Val Ala Ala Tyr Arg Thr 95 100 105 tgg tcc aag aca att cct ggg aaa gtt cag ttc ttc tca agt gag ggt 866 Trp Ser Lys Thr Ile Pro Gly Lys Val Gln Phe Phe Ser Ser Glu Gly 110 115 120 tct gac aca tct gta cca att cca gta gtg cca cta cgg ggt gtg gac 914 Ser Asp Thr Ser Val Pro Ile Pro Val Val Pro Leu Arg Gly Val Asp 125 130 135 140 gac tcc tac ccg ccc cag aag aag tcc ttc atg atg ctc aag tac atg 962 Asp Ser Tyr Pro Pro Gln Lys Lys Ser Phe Met Met Leu Lys Tyr Met 145 150 155 cac gac cac tac ttg gac aag tat gaa tgg ttt atg aga gca gat gat 1010 His Asp His Tyr Leu Asp Lys Tyr Glu Trp Phe Met Arg Ala Asp Asp 160 165 170 gac gtg tac atc aaa gga gac cgt ctg gag aac ttc ctg agg agt ttg 1058 Asp Val Tyr Ile Lys Gly Asp Arg Leu Glu Asn Phe Leu Arg Ser Leu 175 180 185 aac agc agc gag ccc ctc ttt ctt ggg cag aca ggc ctg ggc acc acg 1106 Asn Ser Ser Glu Pro Leu Phe Leu Gly Gln Thr Gly Leu Gly Thr Thr 190 195 200 gaa gaa atg gga aaa ctg gcc ctg gag cct ggt gag aac ttc tgc atg 1154 Glu Glu Met Gly Lys Leu Ala Leu Glu Pro Gly Glu Asn Phe Cys Met 205 210 215 220 ggg ggg cct ggc gtg atc atg agc cgg gag gtg ctt cgg aga atg gtg 1202 Gly Gly Pro Gly Val Ile Met Ser Arg Glu Val Leu Arg Arg Met Val 225 230 235 ccg cac att ggc aag tgt ctc cgg gag atg tac acc acc cat gag gac 1250 Pro His Ile Gly Lys Cys Leu Arg Glu Met Tyr Thr Thr His Glu Asp 240 245 250 gtg gag gtg gga agg tgt gtc cgg agg ttt gca ggg gtg cag tgt gtc 1298 Val Glu Val Gly Arg Cys Val Arg Arg Phe Ala Gly Val Gln Cys Val 255 260 265 tgg tct tat gag atg cag cag ctt ttt tat gag aat tac gag cag aac 1346 Trp Ser Tyr Glu Met Gln Gln Leu Phe Tyr Glu Asn Tyr Glu Gln Asn 270 275 280 aaa aag ggg tac att aga gat ctc cat aac agt aaa att cac caa gct 1394 Lys Lys Gly Tyr Ile Arg Asp Leu His Asn Ser Lys Ile His Gln Ala 285 290 295 300 atc aca tta cac ccc aac aaa aac cca ccc tac cag tac agg ctc cac 1442 Ile Thr Leu His Pro Asn Lys Asn Pro Pro Tyr Gln Tyr Arg Leu His 305 310 315 agc tac atg ctg agc cgc aag ata tcc gag ctc cgc cat cgc aca ata 1490 Ser Tyr Met Leu Ser Arg Lys Ile Ser Glu Leu Arg His Arg Thr Ile 320 325 330 cag ctg cac cgc gaa att gtc ctg atg agc aaa tac agc aac aca gaa 1538 Gln Leu His Arg Glu Ile Val Leu Met Ser Lys Tyr Ser Asn Thr Glu 335 340 345 att cat aaa gag gac ctc cag ctg gga atc cct ccc tcc ttc atg agg 1586 Ile His Lys Glu Asp Leu Gln Leu Gly Ile Pro Pro Ser Phe Met Arg 350 355 360 ttt cag ccc cgc cag cga gag gag att ctg gaa tgg gag ttt ctg act 1634 Phe Gln Pro Arg Gln Arg Glu Glu Ile Leu Glu Trp Glu Phe Leu Thr 365 370 375 380 gga aaa tac ttg tat tcg gca gtt gac ggc cag ccc cct cga aga gga 1682 Gly Lys Tyr Leu Tyr Ser Ala Val Asp Gly Gln Pro Pro Arg Arg Gly 385 390 395 atg gac tcc gcc cag agg gaa gcc ttg gac gac att gtc atg cag gtc 1730 Met Asp Ser Ala Gln Arg Glu Ala Leu Asp Asp Ile Val Met Gln Val 400 405 410 atg gag atg atc aat gcc aac gcc aag acc aga ggg cgc atc att gac 1778 Met Glu Met Ile Asn Ala Asn Ala Lys Thr Arg Gly Arg Ile Ile Asp 415 420 425 ttc aaa gag atc cag tac ggc tac cgc cgg gtg aac ccc atg tat ggg 1826 Phe Lys Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Arg Arg Val Asn Pro Met Tyr Gly 430 435 440 gct gag tac atc ctg gac ctg ctg ctt ctg tac aaa aag cac aaa ggg 1874 Ala Glu Tyr Ile Leu Asp Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Gly 445 450 455 460 aag aaa atg acg gtc cct gtg agg 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tcc aac cct gac aag gcc aaa caa gtt gaa ctg atg aca 2258 Asn Ser Asp Ser Asn Pro Asp Lys Ala Lys Gln Val Glu Leu Met Thr 575 580 585 gat tac cgc att aag tac cct aaa gcc gac atg cag att ttg cct gtg 2306 Asp Tyr Arg Ile Lys Tyr Pro Lys Ala Asp Met Gln Ile Leu Pro Val 590 595 600 tct gga gag ttt tca aga gcc ctg gcc ctg gaa gta gga tcc tcc cag 2354 Ser Gly Glu Phe Ser Arg Ala Leu Ala Leu Glu Val Gly Ser Ser Gln 605 610 615 620 ttt aac aat gaa tct ttg ctc ttc ttc tgc gac gtc gac ctc gtc ttt 2402 Phe Asn Asn Glu Ser Leu Leu Phe Phe Cys Asp Val Asp Leu Val Phe 625 630 635 act aca gaa ttc ctt cag cga tgt cga gca aat aca gtt ctg ggc caa 2450 Thr Thr Glu Phe Leu Gln Arg Cys Arg Ala Asn Thr Val Leu Gly Gln 640 645 650 caa ata tat ttt cca atc atc ttc agc cag tat gac cca aag att gtt 2498 Gln Ile Tyr Phe Pro Ile Ile Phe Ser Gln Tyr Asp Pro Lys Ile Val 655 660 665 tat agt ggg aaa gtt ccc agt gac aac cat ttt gcc ttt act cag aaa 2546 Tyr Ser Gly Lys Val Pro Ser Asp Asn His Phe Ala Phe Thr Gln Lys 670 675 680 act ggc ttc tgg aga aac tat ggg ttt ggc atc acg tgt att tat aag 2594 Thr Gly Phe Trp Arg Asn Tyr Gly Phe Gly Ile Thr Cys Ile Tyr Lys 685 690 695 700 gga gat ctt gtc cga gtg ggt ggc ttt gat gtt tcc atc caa ggc tgg 2642 Gly Asp Leu Val Arg Val Gly Gly Phe Asp Val Ser Ile Gln Gly Trp 705 710 715 ggg ctg gag gat gtg gac ctt ttc aac aag gtt gtc cag gca ggt ttg 2690 Gly Leu Glu Asp Val Asp Leu Phe Asn Lys Val Val Gln Ala Gly Leu 720 725 730 aag acg ttt agg agc cag gaa gta gga gta gtc cac gtc cac cat cct 2738 Lys Thr Phe Arg Ser Gln Glu Val Gly Val Val His Val His His Pro 735 740 745 gtc ttt tgt gat ccc aat ctt gac ccc aaa cag tac aaa atg tgc ttg 2786 Val Phe Cys Asp Pro Asn Leu Asp Pro Lys Gln Tyr Lys Met Cys Leu 750 755 760 ggg tcc aaa gca tcg acc tat ggg tcc aca cag cag ctg gct gag atg 2834 Gly Ser Lys Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Thr Gln Gln Leu Ala Glu Met 765 770 775 780 tgg ctg gaa aaa aat gat cca agt tac agt aaa agc agc aat aat aat 2882 Trp Leu Glu Lys Asn Asp Pro Ser Tyr Ser Lys Ser Ser Asn Asn Asn 785 790 795 ggc tca gtg agg aca gcc taatgtccag ctttgctgga aaagacgttt 2930 Gly Ser Val Arg Thr Ala 800 ttaattatct aatttatttt tcaaaaattt tttgtatgat cagtttttga agtccgtata 2990 caaggatata ttttacaagt ggttttctta cataggactc ctttaagatt gagctttctg 3050 aacaagaagg tgatcagtgt ttgcctttga acacatcttc ttgctgaaca ttatgtagca 3110 gacctgctta actttgactt gaaatgtacc tgatgaacaa aactttttta aaaaaatgtt 3170 ttcttttgag accctttgct ccagtcctat ggcagaaaac gtgaacattc ctgcaaagta 3230 ttattgtaac aaaacactgt aactctggta aatgttctgt tgtgattgtt aacattccac 3290 agattctacc ttttgtgttt tgtttttttt tttttacaat tgttttaaag ccatttcatg 3350 ttccagttgt aagataagga aatgtgataa tagctgtttc atcattgtct tcaggagagc 3410 tttccagagt tgatcatttc ccctcatggt actctgctca gcatggccac gtaggttttt 3470 tgtttgtttt gttttgttct ttttttgaga cggagtctca ctctgttacc caggctggaa 3530 tgcagtggcg caatcttggc tcactttaac ctccacttcc ctggttcaag caattcccct 3590 gcctttgcct cccgagtagc tgggattaca ggcacacacc accacgccca gctagttttt 3650 ttgtattttt agtagagacg gggtttcacc atgcaagccc agctggccac gtaggtttta 3710 aagcaagggg cgtgaagaag gcacagtgag gtatgtggct gttctcgtgg tagttcattc 3770 ggcctaaata gacctggcat taaatttcaa gaaggatttg gcattttctc ttcttgaccc 3830 ttctctttaa agggtaaaat attaatgttt agaatgacaa agatgaatta ttacaataaa 3890 tctgatgtac acagactgaa acacacacac atacacccta atcaaaacgt tggggaaaaa 3950 tgtatttggt tttgttcctt tcatcctgtc tgtgttatgt gggtggagat ggttttcatt 4010 ctttcattac tgttttgttt tatcctttgt atctgaaata cctttaattt atttaatatc 4070 tgttgttcag agctctgcca tttcttgagt acctgttagt tagtattatt tatgtgtatc 4130 gggagtgtgt ttagtctgtt ttatttgcag taaaccgatc tccaaagatt tccttttgga 4190 aacgcttttt cccctcctta atttttatat tccttactgt tttactaaat attaagtgtt 4250 ctttgacaat tttggtgctc atgtgttttg gggacaaaag tgaaatgaat ctgtcattat 4310 accagaaagt taaattctca gatcaaatgt gccttaataa atttgttttc atttagattt 4370 caaacagtga tagacttgcc attttaatac acgtcattgg agggctgcgt atttgtaaat 4430 agcctgatgc tcatttggaa aaataaacca gtgaacaata tttttctatt gtacttttca 4490 gaaccatttt gtctcattat tcctgtttta gctgaagaat tgtattacat ttggagagta 4550 aaaaacttaa acacg 4565 <210> 2 <211> 802 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Ala Trp Leu Ser Val Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Val Leu Gly Phe Val Leu Ala Ser Arg Leu Val Leu Pro Arg Ala Ser 20 25 30 Glu Leu Lys Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Ala Ser Pro Glu Gly Cys 35 40 45 Arg Ser Gly Gln Ala Ala Ala Ser Gln Ala Gly Gly Ala Arg Gly Asp 50 55 60 Ala Arg Gly Ala Gln Leu Trp Pro Pro Gly Ser Asp Pro Asp Gly Gly 65 70 75 80 Pro Arg Asp Arg Asn Phe Leu Phe Val Gly Val Met Thr Ala Gln Lys 85 90 95 Tyr Leu Gln Thr Arg Ala Val Ala Ala Tyr Arg Thr Trp Ser Lys Thr 100 105 110 Ile Pro Gly Lys Val Gln Phe Phe Ser Ser Glu Gly Ser Asp Thr Ser 115 120 125 Val Pro Ile Pro Val Val Pro Leu Arg Gly Val Asp Asp Ser Tyr Pro 130 135 140 Pro Gln Lys Lys Ser Phe Met Met Leu Lys Tyr Met His Asp His Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Lys Tyr Glu Trp Phe Met Arg Ala Asp Asp Asp Val Tyr Ile 165 170 175 Lys Gly Asp Arg Leu Glu Asn Phe Leu Arg Ser Leu Asn Ser Ser Glu 180 185 190 Pro Leu Phe Leu Gly Gln Thr Gly Leu Gly Thr Thr Glu Glu Met Gly 195 200 205 Lys Leu Ala Leu Glu Pro Gly Glu Asn Phe Cys Met Gly Gly Pro Gly 210 215 220 Val Ile Met Ser Arg Glu Val Leu Arg Arg Met Val Pro His Ile Gly 225 230 235 240 Lys Cys Leu Arg Glu Met Tyr Thr Thr His Glu Asp Val Glu Val Gly 245 250 255 Arg Cys Val Arg Arg Phe Ala Gly Val Gln Cys Val Trp Ser Tyr Glu 260 265 270 Met Gln Gln Leu Phe Tyr Glu Asn Tyr Glu Gln Asn Lys Lys Gly Tyr 275 280 285 Ile Arg Asp Leu His Asn Ser Lys Ile His Gln Ala Ile Thr Leu His 290 295 300 Pro Asn Lys Asn Pro Pro Tyr Gln Tyr Arg Leu His Ser Tyr Met Leu 305 310 315 320 Ser Arg Lys Ile Ser Glu Leu Arg His Arg Thr Ile Gln Leu His Arg 325 330 335 Glu Ile Val Leu Met Ser Lys Tyr Ser Asn Thr Glu Ile His Lys Glu 340 345 350 Asp Leu Gln Leu Gly Ile Pro Pro Ser Phe Met Arg Phe Gln Pro Arg 355 360 365 Gln Arg Glu Glu Ile Leu Glu Trp Glu Phe Leu Thr Gly Lys Tyr Leu 370 375 380 Tyr Ser Ala Val Asp Gly Gln Pro Pro Arg Arg Gly Met Asp Ser Ala 385 390 395 400 Gln Arg Glu Ala Leu Asp Asp Ile Val Met Gln Val Met Glu Met Ile 405 410 415 Asn Ala Asn Ala Lys Thr Arg Gly Arg Ile Ile Asp Phe Lys Glu Ile 420 425 430 Gln Tyr Gly Tyr Arg Arg Val Asn Pro Met Tyr Gly Ala Glu Tyr Ile 435 440 445 Leu Asp Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Gly Lys Lys Met Thr 450 455 460 Val Pro Val Arg Arg His Ala Tyr Leu Gln Gln Thr Phe Ser Lys Ile 465 470 475 480 Gln Phe Val Glu His Glu Glu Leu Asp Ala Gln Glu Leu Ala Lys Arg 485 490 495 Ile Asn Gln Glu Ser Gly Ser Leu Ser Phe Leu Ser Asn Ser Leu Lys 500 505 510 Lys Leu Val Pro Phe Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Glu His Lys Glu 515 520 525 Pro Lys Asp Lys Lys Ile Asn Ile Leu Ile Pro Leu Ser Gly Arg Phe 530 535 540 Asp Met Phe Val Arg Phe Met Gly Asn Phe Glu Lys Thr Cys Leu Ile 545 550 555 560 Pro Asn Gln Asn Val Lys Leu Val Val Leu Leu Phe Asn Ser Asp Ser 565 570 575 Asn Pro Asp Lys Ala Lys Gln Val Glu Leu Met Thr Asp Tyr Arg Ile 580 585 590 Lys Tyr Pro Lys Ala Asp Met Gln Ile Leu Pro Val Ser Gly Glu Phe 595 600 605 Ser Arg Ala Leu Ala Leu Glu Val Gly Ser Ser Gln Phe Asn Asn Glu 610 615 620 Ser Leu Leu Phe Phe Cys Asp Val Asp Leu Val Phe Thr Thr Glu Phe 625 630 635 640 Leu Gln Arg Cys Arg Ala Asn Thr Val Leu Gly Gln Gln Ile Tyr Phe 645 650 655 Pro Ile Ile Phe Ser Gln Tyr Asp Pro Lys Ile Val Tyr Ser Gly Lys 660 665 670 Val Pro Ser Asp Asn His Phe Ala Phe Thr Gln Lys Thr Gly Phe Trp 675 680 685 Arg Asn Tyr Gly Phe Gly Ile Thr Cys Ile Tyr Lys Gly Asp Leu Val 690 695 700 Arg Val Gly Gly Phe Asp Val Ser Ile Gln Gly Trp Gly Leu Glu Asp 705 710 715 720 Val Asp Leu Phe Asn Lys Val Val Gln Ala Gly Leu Lys Thr Phe Arg 725 730 735 Ser Gln Glu Val Gly Val Val His Val His His Pro Val Phe Cys Asp 740 745 750 Pro Asn Leu Asp Pro Lys Gln Tyr Lys Met Cys Leu Gly Ser Lys Ala 755 760 765 Ser Thr Tyr Gly Ser Thr Gln Gln Leu Ala Glu Met Trp Leu Glu Lys 770 775 780 Asn Asp Pro Ser Tyr Ser Lys Ser Ser Asn Asn Asn Gly Ser Val Arg 785 790 795 800 Thr Ala <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <223> primer <400> 3 ccctcgaggg gctgccggtc cgggc 25 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <223> primer <400> 4 ccctcgagca atcttaaagg agtcctatgt a 31

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトコンドロイチン合成酵素(Human)の推定ア
ミノ酸配列と、C. elegans (T25233)およびDrosophila
(AE003499)における相同性のあるタンパク質のアミノ酸
配列との比較を示す。これらの推定アミノ酸配列は、GE
NETYX-MAC（バージョン10）コンピュータプログラムを
用いて解析した。黒のボックスと灰色のボックスは、そ
れぞれアミノ酸が三者間で一致する、およびいずれか二
者間で一致することを示す。一致の程度を最も高くする
ために導入したギャップを破線で示す。予測される膜貫
通ドメインを四角の枠で囲んだ。保存されたDXDモチー
フは下線で示した。N-グリコシル化部位として考えられ
る3ヶ所を星印でマークした。

【図２】ヒトコンドロイチン合成酵素遺伝子のゲノム構
成を示す。エキソン領域をボックスで示した。黒のボッ
クスはコード配列を示し、白のボックスは、5'-および
3'-未翻訳配列を示す。翻訳開始コドン（ATG）と終止コ
ドン（TAA）も併せて示した。黒の横線は、イントロン
を示す。

【図３】ヒトコンドロイチン合成酵素反応生成物の特定
の結果を示す。（A）スーパーデックスペプチド・カラ
ムから回収した、GlcUAトランスフェラーゼ反応生成物
を、コンドロイチナーゼAC-II、または、β-グルクロニ
ダーゼで消化した。未消化物（黒の四角）、コンドロイ
チナーゼAC-II消化物（黒の丸）、および、β-グルクロ
ニダーゼ消化物（黒塗り三角）を、スーパーデックスペ
プチド・カラムにアプライし、それぞれの溶出画分（各
0.4 ml）について、放射活性を分析した。矢印は飽和２
糖(1, GlcUAβ1-3GalNAc)、または、遊離のGlcUA (2, [
¹⁴C]GlcUA)の溶出位置を示す。（B）スーパーデックス
ペプチド・カラムから回収した、GalNAcトランスフェラ
ーゼ反応生成物をコンドロイチナーゼAC-IIで消化し
た。未消化物（黒の四角）、または、コンドロイチナー
ゼAC-II消化物（黒の丸）をスーパーデックスペプチド
・カラムにアプライし、それぞれの溶出画分（各0.4 m
l）について、放射活性を分析した。矢印は飽和２糖(1,
GlcUAβ1-3GalNAc)、または、遊離のGalNAc (2, [³H]G
alNAc)の溶出位置を示す。

【図４】ヒトの組織におけるコンドロイチン合成酵素の
ノーザンブロット分析の結果（電気泳動写真）を示す。
各種ヒト組織由来のRNAに対し、コンドロイチン合成酵
素のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。レーン1は脳、レーン2は心臓、レーン3は骨格筋、
レーン4は結腸、レーン5は胸腺、レーン6は脾臓、レー
ン7は腎臓、レーン8は肝臓、レーン9は小腸、レーン10
は胎盤、レーン11は肺、レーン12は末梢血白血球であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD11 LL05 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR55 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AF22 CA21 DA16 4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 BA01 CA16 CA19 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ
を保持するベクターであって、前記（ｂ）又は（ｃ）の
ＤＮＡが、下記（イ）及び（ロ）の触媒活性を有するタ
ンパク質をコードしている前記ベクター（但し、配列番
号２におけるアミノ酸番号１〜８０２で示されるアミノ
酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含むも
のを除く）。（ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（ｂ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列を
含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）
【請求項２】前記（ａ）のＤＮＡが、配列番号１にお
けるヌクレオチド番号６３３〜２９００で示されるＤＮ
Ａである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】タンパク質が可溶性である、請求項１又
は２に記載のベクター。
【請求項４】発現ベクターである、請求項１〜３のい
ずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ
を保持するベクターであって、前記（ｂ）又は（ｃ）の
ＤＮＡが、下記（イ）及び（ロ）の触媒活性を有するタ
ンパク質をコードしている前記ベクターによって宿主が
形質転換された形質転換体。（ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（ｂ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配列を
含むタンパク質をコードするＤＮＡ。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）
【請求項６】前記（ａ）のＤＮＡが、配列番号１にお
けるヌクレオチド番号６３３〜２９００で示されるＤＮ
Ａである、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】タンパク質が可溶性である、請求項５又
は６に記載の形質転換体。
【請求項８】請求項５〜７のいずれか１項に記載の形
質転換体を生育させ、その生育物からコンドロイチン合
成酵素を採取することを特徴とする、コンドロイチン合
成酵素の製造方法。
【請求項９】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸配
列をそのアミノ酸配列中に包含し、かつ下記（イ）及び
（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパク質を含有する、
コンドロイチン合成用試薬。（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号４７〜８０２で
示されるアミノ酸配列。（Ｂ）上記（Ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸
が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列。（イ）コンドロイチンに、UDP-GalNAcからGalNAcを転移
する。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GalNAcはＮ−
アセチルガラクトサミン残基を示す。）（ロ）コンドロイチンに、UDP-GlcUAからGlcUAを転移す
る。（UDPはウリジン 5'-二リン酸を、GlcUAはグルクロ
ン酸残基を示す。）
【請求項１０】酵素タンパク質が可溶性である請求項
９の試薬。
【請求項１１】請求項９又は１０に記載の試薬を、Ga
lNAc供与体及び下記一般式(1)で示される糖鎖に接触さ
せる工程を少なくとも含む、下記一般式(3)で示される
糖鎖の製造方法。 GlcUA-GalNAc-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-GalNAc-R¹ (3) （各式中、GlcUA及びGalNAcは、いずれも前記と同義で
ある。 - はグリコシド結合を、R¹は任意の基を示
す。）
【請求項１２】請求項９又は１０に記載の試薬を、Gl
cUA供与体及び下記一般式(2)で示される糖鎖に接触させ
る工程を少なくとも含む、下記一般式(4)で示される糖
鎖の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (4) （各式中、GlcUA、GalNAc、及び - は、いずれも前記と
同義である。R²は任意の基を示す。）
【請求項１３】請求項９又は１０に記載の試薬を、Ga
lNAc供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(1)で示
される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一
般式(5)及び(7)から選ばれる糖鎖の製造方法。 GlcUA-GalNAc-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (5) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-GalNAc-R¹ (7) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、
及び - は、いずれも前記と同義である。またR¹は任意
の基を示す。）
【請求項１４】請求項９又は１０に記載の試薬を、Ga
lNAc供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(2)で示
される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一
般式(6)及び(8) から選ばれる糖鎖の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (6) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (8) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、
及び - は、いずれも前記と同義である。またR²はいず
れも任意の基を示す。）
【請求項１５】配列番号１におけるヌクレオチド番号
４９５〜２９００で示される塩基配列又はその一部に相
補的な配列を有するハイブリダイゼーション用プロー
ブ。