JP2003299488A - グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質 - Google Patents
グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質Info
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Abstract
する酵素のうち、N-ガラクトサミン転移酵素活性を実質
的に有さず、グルクロン酸転移酵素活性を有する酵素を
遺伝子工学的に得る際に有用である融合タンパク質及び
そのような融合タンパク質を得るためのベクター、形質
転換体を提供する。 【解決手段】 配列番号4記載のアミノ酸配列又
は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ
酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してな
り、コンドロイチンの基本骨格中に存在する非還元末端
のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を転移
する活性を有する融合タンパク質、それをコードする核
酸を含むベクター、形質転換体。
Description
融合タンパク質に関し、より詳細にはコンドロイチン骨
格中に存在する非還元末端のN-アセチルガラクトサミン
残基にグルクロン酸を転移する酵素活性を有する融合タ
ンパク質に関する。
はD-グルクロン酸(以下単に「グルクロン酸」又は「Gl
cA」とも記載する)残基とN-アセチルガラクトサミン
(以下単に「N-アセチルガラクトサミン」又は「GalNA
c」とも記載する)残基の二糖の繰り返し構造(すなわ
ち、-[GlcAβ(1,3)-GalNAcβ(1,4)-]n:nは2以上の整数
を示す)を基本骨格とするグリコサミノグリカンの一種
である。
ロイチンやコンドロイチン硫酸は従来、動物の臓器等か
ら抽出・精製されていたが、原料の不足から、コンドロ
イチンやコンドロイチン硫酸に共通する前記二糖の繰り
返し構造からなる基本骨格(コンドロイチン骨格とも称
される)を人工的に合成する手法が模索されている。特
に、ヒト由来の酵素であれば、人工的に合成したコンド
ロイチン又はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混入して
いても、抗原抗体反応などの生体防御機構が強く作用す
ることもないが、現時点においてこのような基本骨格を
合成するための酵素、その中でも特にヒト由来であって
グルクロン酸転移酵素活性を有していて、N-アセチルガ
ラクトサミン転移酵素活性は有していない酵素は未だに
発見されていない。
-38188
合成に関わるヒト由来の酵素のうち、グルクロン酸転移
酵素活性を有しているが、N-アセチルガラクトサミン転
移酵素活性を実質的に有しない酵素の大量合成のために
その酵素をコードする遺伝子が必要とされており、また
遺伝子治療の可能性を模索するためにもそのような遺伝
子が必要とされていたにも関わらず、そのような酵素の
遺伝子は得られていなかった。
格の合成に関与する酵素のうち、N-アセチルガラクトサ
ミン転移酵素活性を実質的に有さず、グルクロン酸転移
酵素活性を有する酵素(以下「GlcAT」とも略記する)
と識別ペプチドとの融合タンパク質及びその遺伝子工学
的な製造法並びにコンドロイチン骨格を有する糖鎖の製
造方法を提供することに存する。
成するために鋭意検討した結果、ヒトのGlcATのcDNAを
見つけだし、ヒトのGlcATの大量合成を可能として、本
発明を完成した。
記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、欠
失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、グルクロ
ン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在する非還元
末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を
転移する酵素活性を有することを特徴とする融合タンパ
ク質。 (2) グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセ
チルガラクトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を
有する7糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサ
ミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチ
ルガラクトサミン供与体から、非還元末端がグルクロン
酸残基であり、コンドロイチン骨格を有する6糖からな
るオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセ
チルガラクトサミン残基を転移する活性を有しないこと
を特徴とする(1)記載の融合タンパク質。 (3) 識別ペプチドがシグナルペプチド、プロテイン
キナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、His
タグ、mycタグ、FLAGタンパク質、T7タグ、Sタグ、HSV
タグ、pelB、HAタグ、Trxタグ、CBPタグ、CBDタグ、CBR
タグ、β-lac/blu、β-gal、luc、HP-Thio、HSP、Ln
γ、Fn、GFP、YFP、CFP、BFP、DsRed、DsRed2、MBP、La
cZ、IgG、アビジン、及びプロテインGからなる群から選
択されるいずれか一のペプチドであることを特徴とする
(1)又は(2)記載の融合タンパク質。 (4) (1)〜(3)いずれか記載の融合タンパク質
をコードするDNA。 (5) (4)記載のDNAを含むベクター。 (6) (5)記載のベクターが宿主細胞に導入されて
なる形質転換体。 (7) (6)記載の形質転換体を生育させ、生育物か
ら融合タンパク質を単離することを特徴とする(1)〜
(3)いずれか記載の融合タンパク質の製造方法。 (8) (1)〜(3)何れか記載の融合タンパク質を
特異的に認識することを特徴とする抗体。 (9) 下記性質を有するグルクロン酸転移酵素。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 エチレンジアミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に
示さない。 (10) 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列番号
4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする(9)記載のグルクロン酸転移酵素。 (11) 非還元末端にN-アセチルガラクトサミン残基
を有するとともにコンドロイチン骨格を有する糖鎖に対
し、(1)〜(3)いずれか記載の融合タンパク質或い
は(9)又は(10)記載のグルクロン酸転移酵素を作
用させ、グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元末端の
N-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を転移す
ることを特徴とする、コンドロイチン骨格を有する糖鎖
の製造方法。 (12) 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列番号
4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からなるポ
リペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元末端にN-
アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロイチン骨
格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグルクロン酸
を転移する活性を有する糖鎖合成剤。 (13) タンパク質が配列番号4記載のアミノ酸配列
又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミ
ノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配
列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの融合タンパ
ク質を含むことを特徴とする(12)記載の糖鎖合成
剤。
発明を詳説する。 (1)本発明酵素 本発明酵素は下記性質を有する。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 二価金属陽イオン非存在下では酵素活性を実質的に示さ
ない。
しては、グルクロン酸ヌクレオチドが例示され、例えば
ADP(アデノシン二リン酸)-GlcA、UDP(ウリジン二リ
ン酸)-GlcA、CDP(シチジン二リン酸)-GlcA、GDP(グ
アノシン二リン酸)-GlcA等が例示されるが、その中で
も生体内で一般的にグルクロン酸供与体として働くUDP-
GlcAが最も好ましい。
基であり、コンドロイチン骨格を有する7糖からなるオ
リゴ糖とは、例えば実施例に記載された様に睾丸ヒアル
ロニダーゼによりクジラ軟骨由来又はサメ軟骨由来のコ
ンドロイチン硫酸を限定分解して精製したコンドロイチ
ン硫酸6糖を基質とし、N-アセチルガラクトサミン供与
体存在下において、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合
成酵素を作用させてN-アセチルガラクトサミンを非還元
末端に転移して調製することができる。
アセチルガラクトサミンヌクレオチド例えばADP-GalNA
c、UDP-GalNAc、CDP-GalNAc、GDP-GalNAc等が例示され
るが、その中でも生体内で一般的にN-アセチルガラクト
サミン供与体として働くUDP-GalNAcが最も好ましく例示
される。非還元末端がグルクロン酸残基であり、コンド
ロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ糖とは、実施
例に記載された様に睾丸ヒアルロニダーゼによりクジラ
軟骨由来又はサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を限定
分解して精製することで得られるコンドロイチン硫酸6
糖が例示される。
セチルガラクトサミン残基を転移する活性は、例えば各
供与体を放射能(好ましくは炭素同位体:14C、3H(ト
リチウム)等)や蛍光物質(基質に立体障害などを起こ
さないことから放射能が好ましい)でラベルし、この供
与体を使用して酵素を反応させ、反応生成物を液体シン
チレーションカウンター、又はオートラジオグラフィ
等、ラベルした物質を検出するための方法で解析するこ
とで酵素活性を検出することが可能である。これらの活
性の測定は、実施例1中<4>記載の方法に従って行う
ことができる。なお、「実質的に活性を有しない」と
は、実施例1の<4>に記載された方法に従って測定し
ても、陰性対照と同程度の活性しか観察されないことを
指して使用する。
は、例えば実施例記載の様に、反応系に二価金属陽イオ
ン、好ましくはマンガンイオン(Mn2+)を共存させた際
の酵素反応と、その反応系にさらにエチレンジアミン四
酢酸(以下「EDTA」とも記載する)などの金属イオンに
対するキレート剤を添加した反応系での酵素反応とを比
較することで容易に対比することが可能である。
パク質とした際に同様の酵素活性を有することが後述の
実施例から明かとなっているため、本発明酵素は配列番
号4記載のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番
号4記載のアミノ酸配列にさらに10〜20の疎水性アミノ
酸残基からなる膜貫通領域などを有していても良い。し
かし、遺伝子工学的手法で本発明酵素を調製する際に
は、疎水性アミノ酸領域からなる膜貫通領域は、本発明
酵素の精製・単離を煩雑な作業をするため、最も好まし
い本発明酵素は、配列番号4記載のアミノ酸配列のみか
らなるポリペプチド或いはそれに糖鎖が結合した糖ポリ
ペプチドである。
リペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、コンド
ロイチン骨格中に存在する非還元末端のN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する活性を有
することを特徴とする融合タンパク質である。
質を遺伝子組み換えによって調製する場合に、形質転換
体の生育物から融合タンパク質の分泌、分離、精製、検
出を容易とするために用いられるペプチドであり、例え
ばシグナルペプチド(多くのタンパク質のN末端に存在
し、タンパク質の選別のために細胞内では機能している
15〜30アミノ酸残基からなるペプチド:例えばOmpA、Om
pT、Dsb等)、プロテインキナーゼA、プロテインA(黄
色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタン
パク質)、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ(ヒスチジ
ン残基を6〜10個並べて配した配列)、mycタグ(cMycタ
ンパク質由来の13アミノ酸配列)、FLAGペプチド(8ア
ミノ酸配列からなる分析用マーカー)、T7タグ(gene10
タンパク質の最初の11アミノ酸配列)、Sタグ(膵臓RNa
seA由来の15アミノ酸配列)、HSVタグ、pelB(大腸菌外
膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列)、HAタグ(ヘマグ
ルチニン由来の10アミノ酸配列)、Trxタグ(チオレド
キシン配列)、CBPタグ(カルモジュリン結合ペプチ
ド)、CBDタグ(セルロース結合ドメイン)、CBRタグ
(コラーゲン結合ドメイン)、β-lac/blu(βラクタマ
ーゼ)、β-gal(βガラクトシダーゼ)、luc(ルシフ
ェラーゼ)、HP-Thio(His-patchチオレドキシン)、HS
P(熱ショックペプチド)、Lnγ(ラミニンγペプチ
ド)、Fn(フィブロネクチン部分ペプチド)、GFP(緑
色蛍光ペプチド)、YFP(黄色蛍光ペプチド)、CFP(シ
アン蛍光ペプチド)、BFP(青色蛍光ペプチド)、DsRe
d、DsRed2(赤色蛍光ペプチド)、MBP(マルトース結合
ペプチド)、LacZ(ラクトースオペレーター)、IgG
(免疫グロブリンG)、アビジン、プロテインGからなる
群から選択されるいずれかのペプチドを指称し、何れの
識別ペプチドであっても使用することが可能である。そ
の中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼ
A、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、my
cタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB
又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明物質の発
現、精製がより容易となることから好ましい。
酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの配置
は、識別ペプチドが配列番号4記載のアミノ酸配列から
なるポリペプチドのC末端側に結合していても或いはN末
端側に結合していてもよい。またこのような結合は、何
ら生理活性を有しないアミノ酸配列(2〜10個程度の
アミノ酸配列からなるペプチド)からなるスペーサーを
介してなされていても、本発明物質がコンドロイチンの
基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン残基に
グルクロン酸残基を転移する活性(以下、「GlcAT活
性」とも記載する)を有する限りにおいて制限はされな
い。
al., J. Biol. Chem.,276(2001),38721-38726を改変し
た方法(後述の実施例に記載)を用いることにより検出
することが可能である。かかる方法によって本発明物質
のGlcAT活性を測定した際に得られるミカエリス定数(K
m値)は、後述の実施例記載の「コンドロイチン硫酸由
来の11糖(CS11)」に対しては100μmol/l以下であるこ
とが好ましく、特に90μmol/l以下であることが好まし
く、特に80μmol/l以下であることが好ましい。また、
更にグルクロン酸供与体の好ましい例であるUDP-GlcUA
に対するKm値は、100μmol/l以下であることが好まし
く、95μmol/lであることがより好ましく、90μmol/l以
下であることが最も好ましい。このような極めて特異性
の高いGlcAT活性は本発明物質が配列番号4記載のアミ
ノ酸配列という特定のアミノ酸配列を融合タンパク質と
した形態であることによる驚くべき効果の一つと考えら
れる。
サミン残基へのグルクロン酸残基の転移活性」における
グルクロン酸の結合様式は、コンドロイチン骨格のN-ア
セチルガラクトサミン残基の3位ヒドロキシル基とグル
クロン酸残基の1位ヒドロキシル基とのβ1-3グリコシド
結合であることから、特に限定はされないが、β1-3グ
リコシド結合であることが好ましい。
うち、1又は複数(通常は2以上50以下)の構成アミノ
酸が置換、欠失、挿入、及び/又は転位しても酵素活性
が維持されることが知られ、同一酵素のバリアントであ
るということができるが、本発明物質においても配列番
号4記載のアミノ酸配列に1又は複数(2以上50以下)
の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は転位等
の部分的な変異が起こっていても融合タンパク質がGlcA
T活性を保持している限りにおいて、本発明物質と実質
的に同一の物質であるということができる(このような
配列番号4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに
部分的な変異を有するポリペプチドを便宜的に「修飾ポ
リペプチド」と記載する)。このような修飾ポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、配列番号4に示されるアミノ酸配
列と93%以上、好ましくは95%以上、さらに97%以上の
相同性を有することを好ましい(すなわちアミノ酸の変
異の数は最大50個、36個以下が好ましく、22個以下であ
ることが最も好ましい)。アミノ酸配列の相同性は、FA
STAのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて
容易に算出することができ、このようなソフトウェアは
インターネットによっても利用に供されている。
酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性
を有するものであればタンパク質に糖鎖が結合していて
も良い。すなわち本発明物質の融合タンパク質には糖タ
ンパク質の形態の融合タンパク質も包含する。
骨格を有するグリコサミノグリカンを基質とし、グルク
ロン酸供与体存在下、非還元末端のガラクトサミン残基
に対して、グルクロン酸残基を転移する後述の「本発明
糖鎖合成剤」の有効成分として使用することが可能であ
る。
載の方法に従って、その酵素活性を容易に測定できるた
め、例えばかかる酵素活性の測定系に、被験物質を添加
し、被験物質が「本発明物質が有する酵素活性」を制御
(促進又は抑制)するか否かを測定・判定し、酵素活性
を制御する働きを有する被験物質を選択する方法、すな
わち「グルクロン酸転移酵素活性を制御する物質をスク
リーニングする方法」に本発明物質を使用することが可
能である。
番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置
換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列をコー
ドするDNAと識別ペプチドをコードするDNAとを同一読み
出し領域に配置してなり、且つ配列番号4記載のアミノ
酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構
成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとが発現
しうるようなプロモーター領域を有するベクターでトラ
ンスフェクトした適当な宿主細胞を生育させることで、
GlcAT遺伝子を発現させ生育物中に蓄積させて調製を行
うことが可能である。なお、ここで宿主細胞は上記遺伝
子が発現しうるものであれば原核細胞(例えば大腸菌、
枯草菌等)であると真核細胞(例えば酵母、哺乳動物由
来の細胞又は昆虫由来の細胞等)であると限定はされな
い。特に配列番号4記載のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドは本来真核細胞中で発現しているポリペプチドで
あることから、真核細胞が宿主細胞として好ましく、特
にほ乳類由来の細胞が好ましい。
培養することの他、宿主細胞を生体などに投与し、その
生体内で宿主細胞を生育させることも含む。また、生育
物とは、培養された宿主細胞、培養上清の他、宿主細胞
を生体内で生育させた場合には、その生体の***物、分
泌物なども含む。
nBank受け入れ番号AB037823のcDNA(配列番号1記載の
塩基配列からなる)が、ヒトのGlcATをコードするDNAで
あることを明らかとしたため、当該cDNAを基に本発明物
質を調製することが可能である。上記cDNAは、pBluescr
iptII SK(+)プラスミドに挿入された形態でかずさDNA研
究所(千葉県木更津市かずさ鎌足)に保管され、分譲を
受けることができる。
AGペプチドを使用し、宿主細胞として哺乳動物由来の細
胞を使用する場合には、例えばpFLAG-CMV-3ベクター
(シグマ社製)などを発現ベクターとして使用すること
ができる。
れている上記cDNAをpFLAG-CMV-3ベクターに挿入するた
めには、pBluescriptII SK(+)プラスミドベクターから
例えばNarI及びBamHIなどの適当な制限酵素を用いてcDN
Aを切り出して、cDNAの粘着末端を平滑化してcDNA断片
を得(配列番号3記載の塩基配列からなる)、pFLAG-CM
V-3ベクターに挿入するために例えばHindIIIの様な適当
な制限末端を連結させて、適当な制限酵素で処理したpF
LAG-CMV-3ベクターに挿入することが可能である。
ター(pFLAGGlcAT)を、例えばpFLAG-CMV-3ベクターの
宿主細胞として機能するCOS-1細胞やCOS-7細胞にエレク
トロポレーション法などの常法を用いて導入して形質転
換体を得ることができる。
育するのに適した条件下で生育させて、その生育物から
本発明物質を調製することができる。例えばCOS-7細胞
を宿主細胞として選択した場合には、in vitroで形質転
換体を培養し、その培養物(培養後の形質転換体及び培
養上清)から本発明物質を単離して精製することが可能
である。上記pFLAG-CMV-3ベクターを用いた場合には本
発明物質はFLAGペプチドを含むことになるので、本発明
物質は例えば抗FLAG抗体や後述の本発明抗体を用いて、
例えばアフィニティー精製などの方法で本発明物質を単
離、精製することが可能である。単離、精製の方法は、
本発明物質における識別ペプチドによって適宜、適当な
方法を常套的に選択することが可能である。
などによって特異的に認識されるアミノ酸配列(例えば
特開平11−137256号公報の配列番号3記載のア
ミノ酸配列等)を使用することにより、配列番号4記載
のアミノ酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1
以上の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有
するアミノ酸配列を含む(1)で記載した本発明酵素を
得ることができる。
徴とする抗体である。本発明抗体は、抗体の抗原結合部
位を介して、本発明物質に特異的に結合する。したがっ
て、本発明抗体を製造は、本発明物質を「免疫原」とし
て使用し、公知の方法を用いることが可能である。より
具体的には、本発明物質を用いて、ウサギ、マウス、ラ
ット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サルなどの動
物を免疫し、これらの動物の血清を採取して抗血清(ポ
リクローナル抗体)を得るが、これらの動物から抗体産
生細胞(脾臓細胞など)を採取し、これと骨髄腫細胞株
(ミエローマ細胞)などの持続的な増殖能を有する細胞
とを融合させ、融合細胞(ハイブリドーマ)を得て、こ
れらを培養するか又は動物の腹腔内で増殖させることに
よりモノクローナル抗体を効率よく製造することができ
る。かかるハイブリドーマは、当業者であれば本明細書
を基に容易に調製することが可能である。
抗原決定基又はエピトープ(これらを総合して「エピト
ープ等」とも記載する)とし、本発明物質を特異的に認
識して結合する能力を有する。したがって本発明抗体
は、in vitro又はin vivoのいずれかにおいて、前記エ
ピトープ等を含む本発明物質の断片又は本発明物質の検
出を行なうアッセイで使用することが可能である。ま
た、本発明抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーによって、エピトープ等を含む本発明物質の断片又
は本発明物質を精製する際にも使用することが可能であ
る。
的(conformational)(断続的)でもどちらでもよい。
なお、エピトープ等は、当該技術分野に知られる常法に
よって同定することができる。したがって、本発明の1
つの側面は、本発明のグルクロン酸転移酵素のタンパク
質と識別ペプチドとの融合タンパク質の抗原性エピトー
プに関する。このようなエピトープは、以下により詳細
に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を
作成するのに有用である。さらに、本発明物質に含まれ
るエピトープの部分は本発明抗体に特異的に結合するの
で、本発明抗体の生体中又は試料中における存在量を測
定するためのアッセイにおいて使用することが可能であ
る。
部、又は上述のエピトープの部分を用いて調製すること
ができる。本発明抗体は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであっても良く、何れも慣用的技術
によって調製することが可能である。例えば、Kennetら
(監修), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N
ew York, 1980を参照すると当業者であれば容易に本発
明抗体を調製することができる。しかし、用途の多様性
からモノクローナル抗体であることが好ましい。
キメラ抗体(ネズミモノクローナル抗体のヒト化型抗体
や、サルモノクローナル抗体のヒト化型抗体などが例示
される)が含まれる。このようなヒト化抗体を既知の技
術によって調製すると、抗体をヒトに投与した際に、免
疫原性が少ないという利点が存在する。慣用的技術によ
って産生可能な、抗体の抗原結合断片も、本発明に含ま
れる。このような断片の例は、特に限定されるわけでは
ないが、例えばFabおよびF(ab')2断片が含まれる。ま
た遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘
導体も例示される。
らなるポリペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元
末端にN-アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロ
イチン骨格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグル
クロン酸を転移する活性を有する。
は、配列番号4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドと識別ペプチドとの融合タンパク質であることが好ま
しく、前記本発明物質によってなることが最も好まし
い。
の非還元末端に存在するN-アセチルガラクトサミン残基
に対してグルクロン酸を転移する試薬として使用するこ
とが可能である。また、本発明糖鎖合成剤を構成する目
的酵素活性を有する部分である配列番号4記載のアミノ
酸配列がヒト由来のアミノ酸配列であるため、本発明糖
鎖合成剤をヒトに投与したとしても抗原性が低いことが
期待され、また培養軟骨などを本発明糖鎖合成剤で修飾
した後に生体に対して移植したとしても、本発明糖鎖合
成剤に起因する抗原抗体反応や炎症は惹起されないこと
が期待される。
る。 実施例1 <1>ヒトGlcATを発現させるためのベクターの調製 GenBank受け入れ番号AB037823のcDNA(配列番号1記載
の塩基配列からなる)を含むpBluescriptII SK(+)プラ
スミド(かずさDNA研究所:KIAA1402)を常法に従って
制限酵素NarI及びBamHIにより消化した。この消化産物
をアガロースゲル電気泳動に供し、5.4kbpのバンドをGe
l Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて回収した。回
収した消化産物をTaKaRa Blunting Kit(宝酒造株式会
社製)を用いて平滑化した後、HindIIIリンカー(宝酒
造株式会社製)を結合させ、セルフライゲーションさせ
た。
酵素HindIIIおよびNotIによって消化し、消化産物をア
ガロースゲル電気泳動に供し、2.3kbpの断片を回収し
た。このDNA断片を、常法に従って制限酵素HindIIIおよ
びNotIで消化したpFLAG-CMV-3に連結させた。得られた
プラスミドの塩基配列を、常法に従ってシークエンス
し、配列番号3記載の塩基配列からなるGlcATcDNAをFLA
Gタンパク質との融合タンパク質として発現するように
構築されたベクターをpFLAGGlcATとした。
来の培養細胞COS-7細胞(ダルベッコの調整最小培地:
以下「DMEM」とも記載する)を使用した。上記で調製し
たpFLAGGlcAT(2μg)をTransFast(商標名:プロメガ
社製)を用いて、添付されたプロトコールに従ってCOS-
7細胞(サル腎臓由来の培養細胞)に導入し、一過性発
現細胞を常法に従って回収するととも(transient:K
2)、600μg/mlの濃度の抗生物質G418を培地に添加する
ことにより、薬剤耐性スクリーニングを行って安定株を
回収した(stable:K2-2〜K2-21)。
養上清に遠心分離を用いて分離し、細胞溶解液及び培養
上清から、抗FLAG抗体アフィニティゲル(M2アフィニテ
ィゲル:シグマ社製)を用いて融合タンパク質を回収
し、抗FLAG抗体(M2:シグマ社製)を一次抗体、二次抗
体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(ザイ
メッド社製)を用いてウエスタンブロッティング法(To
wbin et al., PNAS U.S.A., (1979),76:4350-4354)を
行った(図1)。その結果、K2-5の細胞株が培地中に特
に高濃度でFLAGタンパク質とGlcATとの融合タンパク質
を発現することが明らかとなった。
ンパク質の精製 上記で得られたK2-5株を150mm培養皿を用いて、20mlのD
MEM(10%牛胎児血清、100U/mlペニシリンGカリウム、10
0μg/mlストレプトマイシン硫酸塩、600μg/mlG418を含
む)で培養し、コンフルエントになった後、培地を交換
してさらに3日間培養して得られた培養上清を回収し
た。
4、グリセロールをそれぞれ終濃度50mmol/l、20%になる
ように加え、使用するまで-80℃で保存した。保存した
培地を融解後、Anti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (S
IGMA社)を加え、4℃、一晩、転倒混和した。反応後、ゲ
ルをトリス緩衝生理的食塩水(以下「TBS」とも記載す
る)/0.05% Tween20(商標名:ICN社製)で、3回、つ
づいてTBSで1回洗浄した後、27Gの注射針をつけたシリ
ンジを用い余分な洗浄液を除き、融合タンパク質を精製
した。
活性の測定 10mmol/lのMnCl2、171μmol/lのアデノシン三リン酸(A
TP)ナトリウム塩を含む50mmol/lのMES緩衝液(pH6.
5)に、培養上清10ml相当の上記<3>で得られた融合
タンパク質を添加し、N-アセチルガラクトサミン残基供
与体としてトリチウムラベルしたUDP(ウリジン二リン
酸)-GalNAc(9×105cpm:NEN社製)、ガラクトサミン
残基受容体としてコンドロイチン(0.28μg:生化学工
業株式会社製)を添加して、全量を100μlとなるように
蒸留水で調整した。この反応液を37℃で3時間反応させ
た。その後、100℃で5分加熱することで酵素を失活させ
て反応を停止した。反応液をポアサイズ0.22μmのマイ
クロフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、流速0.
5ml/分の0.2mol/lのNaClを移動相とするSuperdex pept
ideカラム(30×10mm:ファルマシア社製)に通筒して
0.5ml毎の画分として溶出液を回収した。そして各画分
の放射能をシンチレーションカウンターにより計数した
(図2)。尚、陽性対照としては、大腸菌K4株由来の
コンドロイチン合成酵素標品(J. Biol. Chem., 277(20
02), 21567-21575:生化学工業株式会社二宮氏より恵
与)3μUを使用した。その結果、陽性対象はコンドロイ
チンに対してN-アセチルガラクトサミン残基を転移して
いるのに対し、本発明の融合タンパク質は、コンドロイ
チンに対してはN-アセチルガラクトサミン残基を転移し
ないことが明かとなった。
分解して精製したコンドロイチン硫酸6糖(1nmol:生化
学工業株式会社多和田氏より恵与)を受容体として同様
の測定を行った(図3)。その結果、このようなオリゴ
糖に対しても本発明の融合タンパク質は、N-アセチルガ
ラクトサミン残基を転移しないことが明らかとなった。
性の測定 10mmol/lのMnCl2を含む50mmol/lの酢酸ナトリウム緩衝
液(pH5.6)に、培養上清10ml相当の上記<3>で得ら
れた融合タンパク質を添加し、グルクロン酸残基供与体
として14CでラベルしたUDP-GlcA(9×105cpm:ICN社
製)、グルクロン酸残基受容体としてコンドロイチン
(0.28μg:生化学工業株式会社製)を添加して、全量
を100μlとなるように蒸留水で調整した。この反応液を
37℃で3時間反応させた。その後、100℃で5分加熱する
ことで酵素を失活させて反応を停止した。反応液をポア
サイズ0.22μmのマイクロフィルター(ミリポア社製)
で濾過した後、流速0.5ml/分の0.2mol/lのNaClを移動
相とするSuperdex peptideカラム(30×10mm:ファルマ
シア社製)に通筒して0.5ml毎の画分として溶出液を回
収した。そして各画分の放射能をシンチレーションカウ
ンターにより計数した(図4)。尚、陽性対象として
は、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素標品(J.
Biol. Chem., 277(2002), 21567-21575:生化学工業株
式会社二宮氏より恵与)3μUを使用した。その結果、陽
性対象においてはコンドロイチンに対してグルクロン酸
残基の転移活性が観察されたのに対し、本発明の融合タ
ンパク質は、コンドロイチンに対してはグルクロン酸残
基を転移しないことが明かとなった。
分解して精製したコンドロイチン硫酸6糖(1nmol:生化
学工業株式会社多和田氏より恵与)に、その非還元末端
に大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素(J. Biol.
Chem., 277(2002), 21567-21575:生化学工業株式会社
二宮氏より恵与)によりN-アセチルガラクトサミンを転
移して調製したコンドロイチン硫酸7糖を受容体として
同様の測定を行った(図5)。その結果、このようなオ
リゴ糖に対して、本発明の融合タンパク質はグルクロン
酸残基を転移してコンドロイチン硫酸8糖が得られるこ
とが明かとなった。
硫酸7糖は、20mmol/lのMnCl2、0.1mol/lの(NH4)2SO4、1
mol/lのエチレングリコールを含む50mmol/lのTris-HCl
緩衝液(pH7.2)に大腸菌K4株由来のコンドロイチン
合成酵素12μUを用い、N-アセチルガラクトサミン受容
体として睾丸ヒアルロニダーゼにより限定分解して精製
したコンドロイチン硫酸6糖(50μg:生化学工業株式会
社多和田氏より恵与)を使用して調製した。この反応に
おいてN-アセチルガラクトサミン供与体としては1.5mmo
l/lのUDP-GalNAc(シグマ社製)を加えて、全量を蒸留
水により500μlに調整した。この反応液を30℃で1時間
反応させ、その後100℃で5分間加熱して酵素を失活させ
ることで反応を停止した。この反応液を流速2ml/分の0.
2mol/l NH4HCO3を移動相とするSuperdex 30カラム(60
×16mm:ファルマシア社製)で精製し、溶出液を215nm
でモニターしながら2ml毎に分画した。そしてコンドロ
イチン硫酸7糖相当画分をプールし、凍結乾燥後、50μ
lの蒸留水に溶解して調製した。
/lのEDTA存在下で、Mn2+をキレートして上記7糖へのGlc
AT活性の測定を行ったところ、活性が完全に失われるこ
とが明らかとなった(図6)。このことは、少なくとも
本発明の融合タンパク質は二価陽イオンを反応に必要と
していることを示している。
物の解析 (2)で、コンドロイチン硫酸7糖に本発明の融合タン
パク質を反応させて得たコンドロイチン硫酸8糖の構造
を解析するために、生成した前記8糖をコンドロイチナ
ーゼABCで消化して、どの様な消化産物が得られるかを
解析した。
3〜27番目の画分を回収し凍結乾燥した後、流速1ml/分
の0.2mol/l NH4HCO3を移動相として用いた脱塩カラム
(FastDesalting Column:ファルマシア社製)により脱
塩し、さらに溶出液を二分して凍結乾燥した。一方(対
照群)を30mmol/lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/lのTr
is-HCl緩衝液(pH8.0)200μlに溶解し、他方(試験
群)は100mUのコンドロイチナーゼABC(生化学工業株式
会社製)、30mmol/lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/lの
Tris-HCl緩衝液(pH8.0)200μlに溶解した。各々を37
℃で30分間反応させ、その後100℃で5分間加熱してコン
ドロイチナーゼABCを失活させて酵素反応を停止した。
この反応液をポアサイズ0.22μmのマイクロフィルター
(ミリポア社製)で濾過した後、流速0.5ml/分の0.2mol
/l NaClを移動相とするSuperdex peptideカラム(30×1
0mm:ファルマシア社製)により溶出し、溶出液を0.5ml
毎に分画した。そして各画分の放射能をシンチレーショ
ンカウンターにより計数した(図7)。
Cで消化しない元の状態と同じパターンで溶出される
が、試験群ではΔdi-0S(不飽和ウロン酸−N-アセチル
ガラクトサミンからなる硫酸基を有しない二糖)とほぼ
同じ位置にピークがシフトした。このことから本発明の
融合タンパク質は、コンドロイチン骨格の非還元末端の
N-アセチルガラクトサミン残基に対してβ1,3結合でグ
ルクロン酸残基を転移することが明かとなった。
生化学工業株式会社製)及びコンドロイチン(上記サメ
由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したもの:
生化学工業株式会社製)とを使用してJ. Biochem. , 11
1(1992), pp.91-98に記載された方法に従ってこれらを
分解、精製し、それぞれ5糖、7糖、9糖、11糖、及び13
糖からなるオリゴ糖を調製した(コンドロイチン硫酸由
来のこれらオリゴ糖はそれぞれCS5、CS7、CS9、CS11、
及びCS13と表記し、同様にコンドロイチン由来のこれら
オリゴ糖はそれぞれCH5、CH7、CH9、CH11、及びCH13と
表記する)。
いて、(2)と同様の方法でそれぞれのオリゴ糖の「グ
ルクロン酸残基受容体としての働き」を測定した(表
1)。その結果、特に9糖以上のオリゴ糖がグルクロン
酸残基受容体として好ましいことが明らかとなった。
変化させた場合と、UDP-GlcUAの濃度を変化させた場合
のGlcAT活性の変化を測定した(CS11の濃度を変化させ
た場合:図8、UDP-GlcUAの濃度を変化させた場合:図
9)。その結果、何れも濃度を上げていくと反応速度が
飽和する傾向を示すことが明かとなった。これらを使用
してCS11とUDP-GlcUAに対するミカエリス定数(Km)値
を算出したところ、CS11のKm値は65.3μmol/l、UDP-Glc
UAのKm値は82.4μmol/lであった。この値を見る限りに
おいて、本発明物質の基質への親和性は極めて高いこと
が明かである。
GlcATの発現の定量 ヒト正常組織及び株化細胞のcDNAを用いて、定量的ポリ
メラーゼチェイン反応(PCR)によりGlcAT遺伝子の発現
量を定量した。cDNAとしてはMarathon Ready cDNA(ク
ロンテック社製)を使用した。GlcATの定量的PCRにはプ
ライマーとしてK2-Fw(配列番号5記載)及びK2-Rv(配列
番号6記載)を使用し、プローブとしてはアプライドバ
イオシステムズ社のマイナーグルーブバインダーを結合
したK2-MGB(配列番号7記載)を使用した。酵素及び反
応液としてUniversal PCR MasterMix(アプライドバイ
オシステムズ社製)を使用し、ABI PRISM 770 Sequence
Detection System(アプライドバイオシステムズ社
製)により反応液量25μlで定量を行った。定量の標準
遺伝子としてはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵
素(GAPDH)遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型DNAにより
定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行っ
た。反応温度は50℃2分、95℃10分のあと、95℃15秒・6
0℃1分を50サイクル行った(図10)。その結果、GlcA
Tは、ほぼ全ての健常組織、株化細胞で発現が観察され
たものの、胎盤、小腸、膵臓および脾臓、特に胎盤にお
いて大量に発現していることが明かとなった。
成に関与する酵素のうち、N-アセチルガラクトサミン転
移酵素活性を実質的に有さず、グルクロン酸転移酵素活
性を有する酵素を遺伝子工学的に得る際に有用である融
合タンパク質及びその製造が提供される。
ィング法により解析した写真である。矢印は本発明物質
のバンドを示す。図中「Transient」は一時的導入株、
「Stable」は安定導入株、「Mock」は陰性対照、「K2」
〜「2-21」は本発明物質をコードする遺伝子を導入した
株を示す。また「Medium」は培養上清を示し、「Cell l
ayer」は細胞溶解液を示す。
サミン転移活性を示す図である。縦軸はN-アセチルガラ
クトサミン転移酵素活性を試験チューブあたりの放射能
により示し、横軸は画分番号を示す。白丸は本発明物質
を、黒丸は陽性対照を示す。
ガラクトサミン転移酵素活性を示す図である。縦軸はN-
アセチルガラクトサミン転移酵素活性を試験チューブあ
たりの放射能により示し、横軸は画分番号を示す。白丸
は本発明物質を、黒丸は陽性対照を示す。
性を示す図である。縦軸はグルクロン酸転移酵素活性を
試験チューブあたりの放射能により示し、横軸は画分番
号を示す。白丸は本発明物質を、黒丸は陽性対照を示
す。
酸転移活性を示す図である。縦軸はグルクロン酸転移酵
素活性を試験チューブあたりの放射能により示し、横軸
は画分番号を示す。白丸は本発明物質を、黒丸は陽性対
照を示す。
転移活性の阻害を示す図である。縦軸はグルクロン酸転
移酵素活性を試験チューブあたりの放射能により示し、
横軸は画分番号を示す。白丸はエチレンジアミン四酢酸
非存在下での本発明物質を、黒丸はエチレンジアミン四
酢酸存在下での本発明物質を、白い四角は陰性対照を示
す。
移されて生じたコンドロイチン硫酸8糖とその酵素分解
による影響を示す図である。縦軸は試験チューブあたり
の14Cによる放射能により示し、横軸は画分番号を示
す。白丸は本発明物質によって調製したコンドロイチン
硫酸8糖を、黒丸は前記コンドロイチン硫酸8糖をコンド
ロイチナーゼABCで消化した産物を示す。
場合に現れるグルクロン酸転移活性への影響を示す図で
ある。縦軸はグルクロン酸転移酵素活性を示し、横軸は
コンドロイチン硫酸11糖の濃度を示す。
グルクロン酸転移活性への影響を示す図である。縦軸は
グルクロン酸転移酵素活性を示し、横軸はUDP-GlcUAの
濃度を示す。
酵素の発現を定量的PCR反応で測定した図である。縦軸
はグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素の発現量
(対照)に対するグルクロン酸転移酵素遺伝子発現量の
割合を示し、横軸は被験ヒト正常組織名及び被験株化細
胞名を示す。
Claims (13)
- 【請求項1】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列
番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置
換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からな
るポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、グ
ルクロン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在する
非還元末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロ
ン酸を転移する酵素活性を有することを特徴とする融合
タンパク質。 - 【請求項2】 グルクロン酸供与体から、非還元末端が
N-アセチルガラクトサミン残基であり、コンドロイチン
骨格を有する7糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラ
クトサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、N-
アセチルガラクトサミン供与体から、非還元末端がグル
クロン酸残基であり、コンドロイチン骨格を有する6糖
からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的に
N-アセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有しな
いことを特徴とする請求項1記載の融合タンパク質。 - 【請求項3】 識別ペプチドがシグナルペプチド、プロ
テインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵
素、Hisタグ、mycタグ、FLAGタンパク質、T7タグ、Sタ
グ、HSVタグ、pelB、HAタグ、Trxタグ、CBPタグ、CBDタ
グ、CBRタグ、β-lac/blu、β-gal、luc、HP-Thio、HS
P、Lnγ、Fn、GFP、YFP、CFP、BFP、DsRed、DsRed2、MB
P、LacZ、IgG、アビジン、及びプロテインGからなる群
から選択されるいずれか一のペプチドであることを特徴
とする請求項1又は2記載の融合タンパク質。 - 【請求項4】 請求項1〜3いずれか一項記載の融合タ
ンパク質をコードするDNA。 - 【請求項5】 請求項4記載のDNAを含むベクター。
- 【請求項6】 請求項5記載のベクターが宿主細胞に導
入されてなる形質転換体。 - 【請求項7】 請求項6記載の形質転換体を生育させ、
生育物から融合タンパク質を単離することを特徴とする
請求項1〜3いずれか一項記載の融合タンパク質の製造
方法。 - 【請求項8】 請求項1〜3何れか一項記載の融合タン
パク質を特異的に認識することを特徴とする抗体。 - 【請求項9】 下記性質を有するグルクロン酸転移酵
素。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 エチレンジアミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に
示さない。 - 【請求項10】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配
列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の
置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を含
むことを特徴とする請求項9記載のグルクロン酸転移酵
素。 - 【請求項11】 非還元末端にN-アセチルガラクトサミ
ン残基を有するとともにコンドロイチン骨格を有する糖
鎖に対し、請求項1〜3いずれか一項記載の融合タンパ
ク質或いは請求項9又は10記載のグルクロン酸転移酵
素を作用させ、グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元
末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を
転移することを特徴とする、コンドロイチン骨格を有す
る糖鎖の製造方法。 - 【請求項12】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配
列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の
置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列から
なるポリペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元末
端にN-アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロイ
チン骨格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグルク
ロン酸を転移する活性を有する糖鎖合成剤。 - 【請求項13】 タンパク質が配列番号4記載のアミノ
酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構
成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの融合
タンパク質を含むことを特徴とする請求項12記載の糖
鎖合成剤。
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Cited By (3)
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WO2022227880A1 (zh) * | 2021-04-29 | 2022-11-03 | 温州医科大学 | 一种新型磷酸化腺苷酰化酶及其制备方法与应用 |
CN118147105A (zh) * | 2024-05-09 | 2024-06-07 | 西宝生物科技(上海)股份有限公司 | 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法 |
CN118147105B (zh) * | 2024-05-09 | 2024-08-02 | 西宝生物科技(上海)股份有限公司 | 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法 |
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2003
- 2003-02-07 JP JP2003030398A patent/JP4275960B2/ja not_active Expired - Fee Related
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