JP2003299488A - グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質 - Google Patents

グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質

Info

Publication number
JP2003299488A
JP2003299488A JP2003030398A JP2003030398A JP2003299488A JP 2003299488 A JP2003299488 A JP 2003299488A JP 2003030398 A JP2003030398 A JP 2003030398A JP 2003030398 A JP2003030398 A JP 2003030398A JP 2003299488 A JP2003299488 A JP 2003299488A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
leu
ala
arg
gly
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2003030398A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4275960B2 (ja
Inventor
Hisashi Narimatsu
久 成松
Hiroharu Kimata
弘治 木全
Masashiki Goto
雅式 後藤
Toshikazu Yada
俊量 矢田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kazusa DNA Research Institute Foundation
Seikagaku Corp
Original Assignee
Kazusa DNA Research Institute Foundation
Seikagaku Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kazusa DNA Research Institute Foundation, Seikagaku Corp filed Critical Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority to JP2003030398A priority Critical patent/JP4275960B2/ja
Publication of JP2003299488A publication Critical patent/JP2003299488A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4275960B2 publication Critical patent/JP4275960B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コンドロイチン骨格の合成に関与
する酵素のうち、N-ガラクトサミン転移酵素活性を実質
的に有さず、グルクロン酸転移酵素活性を有する酵素を
遺伝子工学的に得る際に有用である融合タンパク質及び
そのような融合タンパク質を得るためのベクター、形質
転換体を提供する。 【解決手段】 配列番号4記載のアミノ酸配列又
は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ
酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してな
り、コンドロイチンの基本骨格中に存在する非還元末端
のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を転移
する活性を有する融合タンパク質、それをコードする核
酸を含むベクター、形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素活性を有する
融合タンパク質に関し、より詳細にはコンドロイチン骨
格中に存在する非還元末端のN-アセチルガラクトサミン
残基にグルクロン酸を転移する酵素活性を有する融合タ
ンパク質に関する。
【0002】
【従来の技術】コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン
はD-グルクロン酸(以下単に「グルクロン酸」又は「Gl
cA」とも記載する)残基とN-アセチルガラクトサミン
(以下単に「N-アセチルガラクトサミン」又は「GalNA
c」とも記載する)残基の二糖の繰り返し構造(すなわ
ち、-[GlcAβ(1,3)-GalNAcβ(1,4)-]n:nは2以上の整数
を示す)を基本骨格とするグリコサミノグリカンの一種
である。
【0003】近年、グリコサミノグリカン、特にコンド
ロイチンやコンドロイチン硫酸は従来、動物の臓器等か
ら抽出・精製されていたが、原料の不足から、コンドロ
イチンやコンドロイチン硫酸に共通する前記二糖の繰り
返し構造からなる基本骨格(コンドロイチン骨格とも称
される)を人工的に合成する手法が模索されている。特
に、ヒト由来の酵素であれば、人工的に合成したコンド
ロイチン又はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混入して
いても、抗原抗体反応などの生体防御機構が強く作用す
ることもないが、現時点においてこのような基本骨格を
合成するための酵素、その中でも特にヒト由来であって
グルクロン酸転移酵素活性を有していて、N-アセチルガ
ラクトサミン転移酵素活性は有していない酵素は未だに
発見されていない。
【非特許文献】 J. Biol. Chem.,277(2002), pp.38179
-38188
【0004】
【発明が解決しようとする課題】コンドロイチン骨格の
合成に関わるヒト由来の酵素のうち、グルクロン酸転移
酵素活性を有しているが、N-アセチルガラクトサミン転
移酵素活性を実質的に有しない酵素の大量合成のために
その酵素をコードする遺伝子が必要とされており、また
遺伝子治療の可能性を模索するためにもそのような遺伝
子が必要とされていたにも関わらず、そのような酵素の
遺伝子は得られていなかった。
【0005】従って、本発明の目的はコンドロイチン骨
格の合成に関与する酵素のうち、N-アセチルガラクトサ
ミン転移酵素活性を実質的に有さず、グルクロン酸転移
酵素活性を有する酵素(以下「GlcAT」とも略記する)
と識別ペプチドとの融合タンパク質及びその遺伝子工学
的な製造法並びにコンドロイチン骨格を有する糖鎖の製
造方法を提供することに存する。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成するために鋭意検討した結果、ヒトのGlcATのcDNAを
見つけだし、ヒトのGlcATの大量合成を可能として、本
発明を完成した。
【0007】すなわち、本発明は以下の通りである。 (1) 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列番号4
記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、欠
失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、グルクロ
ン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在する非還元
末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を
転移する酵素活性を有することを特徴とする融合タンパ
ク質。 (2) グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセ
チルガラクトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を
有する7糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサ
ミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチ
ルガラクトサミン供与体から、非還元末端がグルクロン
酸残基であり、コンドロイチン骨格を有する6糖からな
るオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセ
チルガラクトサミン残基を転移する活性を有しないこと
を特徴とする(1)記載の融合タンパク質。 (3) 識別ペプチドがシグナルペプチド、プロテイン
キナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、His
タグ、mycタグ、FLAGタンパク質、T7タグ、Sタグ、HSV
タグ、pelB、HAタグ、Trxタグ、CBPタグ、CBDタグ、CBR
タグ、β-lac/blu、β-gal、luc、HP-Thio、HSP、Ln
γ、Fn、GFP、YFP、CFP、BFP、DsRed、DsRed2、MBP、La
cZ、IgG、アビジン、及びプロテインGからなる群から選
択されるいずれか一のペプチドであることを特徴とする
(1)又は(2)記載の融合タンパク質。 (4) (1)〜(3)いずれか記載の融合タンパク質
をコードするDNA。 (5) (4)記載のDNAを含むベクター。 (6) (5)記載のベクターが宿主細胞に導入されて
なる形質転換体。 (7) (6)記載の形質転換体を生育させ、生育物か
ら融合タンパク質を単離することを特徴とする(1)〜
(3)いずれか記載の融合タンパク質の製造方法。 (8) (1)〜(3)何れか記載の融合タンパク質を
特異的に認識することを特徴とする抗体。 (9) 下記性質を有するグルクロン酸転移酵素。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 エチレンジアミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に
示さない。 (10) 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列番号
4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする(9)記載のグルクロン酸転移酵素。 (11) 非還元末端にN-アセチルガラクトサミン残基
を有するとともにコンドロイチン骨格を有する糖鎖に対
し、(1)〜(3)いずれか記載の融合タンパク質或い
は(9)又は(10)記載のグルクロン酸転移酵素を作
用させ、グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元末端の
N-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を転移す
ることを特徴とする、コンドロイチン骨格を有する糖鎖
の製造方法。 (12) 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列番号
4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からなるポ
リペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元末端にN-
アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロイチン骨
格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグルクロン酸
を転移する活性を有する糖鎖合成剤。 (13) タンパク質が配列番号4記載のアミノ酸配列
又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミ
ノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配
列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの融合タンパ
ク質を含むことを特徴とする(12)記載の糖鎖合成
剤。
【0008】
【発明の実施の形態】以下、発明の実施の形態により本
発明を詳説する。 (1)本発明酵素 本発明酵素は下記性質を有する。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 二価金属陽イオン非存在下では酵素活性を実質的に示さ
ない。
【0009】本発明酵素におけるグルクロン酸供与体と
しては、グルクロン酸ヌクレオチドが例示され、例えば
ADP(アデノシン二リン酸)-GlcA、UDP(ウリジン二リ
ン酸)-GlcA、CDP(シチジン二リン酸)-GlcA、GDP(グ
アノシン二リン酸)-GlcA等が例示されるが、その中で
も生体内で一般的にグルクロン酸供与体として働くUDP-
GlcAが最も好ましい。
【0010】非還元末端がN-アセチルガラクトサミン残
基であり、コンドロイチン骨格を有する7糖からなるオ
リゴ糖とは、例えば実施例に記載された様に睾丸ヒアル
ロニダーゼによりクジラ軟骨由来又はサメ軟骨由来のコ
ンドロイチン硫酸を限定分解して精製したコンドロイチ
ン硫酸6糖を基質とし、N-アセチルガラクトサミン供与
体存在下において、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合
成酵素を作用させてN-アセチルガラクトサミンを非還元
末端に転移して調製することができる。
【0011】N-アセチルガラクトサミン供与体とは、N-
アセチルガラクトサミンヌクレオチド例えばADP-GalNA
c、UDP-GalNAc、CDP-GalNAc、GDP-GalNAc等が例示され
るが、その中でも生体内で一般的にN-アセチルガラクト
サミン供与体として働くUDP-GalNAcが最も好ましく例示
される。非還元末端がグルクロン酸残基であり、コンド
ロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ糖とは、実施
例に記載された様に睾丸ヒアルロニダーゼによりクジラ
軟骨由来又はサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を限定
分解して精製することで得られるコンドロイチン硫酸6
糖が例示される。
【0012】グルクロン酸残基を転移する活性や、N-ア
セチルガラクトサミン残基を転移する活性は、例えば各
供与体を放射能(好ましくは炭素同位体:14C、3H(ト
リチウム)等)や蛍光物質(基質に立体障害などを起こ
さないことから放射能が好ましい)でラベルし、この供
与体を使用して酵素を反応させ、反応生成物を液体シン
チレーションカウンター、又はオートラジオグラフィ
等、ラベルした物質を検出するための方法で解析するこ
とで酵素活性を検出することが可能である。これらの活
性の測定は、実施例1中<4>記載の方法に従って行う
ことができる。なお、「実質的に活性を有しない」と
は、実施例1の<4>に記載された方法に従って測定し
ても、陰性対照と同程度の活性しか観察されないことを
指して使用する。
【0013】二価金属陽イオンによる酵素反応への影響
は、例えば実施例記載の様に、反応系に二価金属陽イオ
ン、好ましくはマンガンイオン(Mn2+)を共存させた際
の酵素反応と、その反応系にさらにエチレンジアミン四
酢酸(以下「EDTA」とも記載する)などの金属イオンに
対するキレート剤を添加した反応系での酵素反応とを比
較することで容易に対比することが可能である。
【0014】配列番号4記載のアミノ酸配列が融合タン
パク質とした際に同様の酵素活性を有することが後述の
実施例から明かとなっているため、本発明酵素は配列番
号4記載のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番
号4記載のアミノ酸配列にさらに10〜20の疎水性アミノ
酸残基からなる膜貫通領域などを有していても良い。し
かし、遺伝子工学的手法で本発明酵素を調製する際に
は、疎水性アミノ酸領域からなる膜貫通領域は、本発明
酵素の精製・単離を煩雑な作業をするため、最も好まし
い本発明酵素は、配列番号4記載のアミノ酸配列のみか
らなるポリペプチド或いはそれに糖鎖が結合した糖ポリ
ペプチドである。
【0015】(2)本発明物質 本発明物質は配列番号4記載のアミノ酸配列からなるポ
リペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、コンド
ロイチン骨格中に存在する非還元末端のN-アセチルガラ
クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する活性を有
することを特徴とする融合タンパク質である。
【0016】ここで、識別ペプチドとは、融合タンパク
質を遺伝子組み換えによって調製する場合に、形質転換
体の生育物から融合タンパク質の分泌、分離、精製、検
出を容易とするために用いられるペプチドであり、例え
ばシグナルペプチド(多くのタンパク質のN末端に存在
し、タンパク質の選別のために細胞内では機能している
15〜30アミノ酸残基からなるペプチド:例えばOmpA、Om
pT、Dsb等)、プロテインキナーゼA、プロテインA(黄
色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタン
パク質)、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ(ヒスチジ
ン残基を6〜10個並べて配した配列)、mycタグ(cMycタ
ンパク質由来の13アミノ酸配列)、FLAGペプチド(8ア
ミノ酸配列からなる分析用マーカー)、T7タグ(gene10
タンパク質の最初の11アミノ酸配列)、Sタグ(膵臓RNa
seA由来の15アミノ酸配列)、HSVタグ、pelB(大腸菌外
膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列)、HAタグ(ヘマグ
ルチニン由来の10アミノ酸配列)、Trxタグ(チオレド
キシン配列)、CBPタグ(カルモジュリン結合ペプチ
ド)、CBDタグ(セルロース結合ドメイン)、CBRタグ
(コラーゲン結合ドメイン)、β-lac/blu(βラクタマ
ーゼ)、β-gal(βガラクトシダーゼ)、luc(ルシフ
ェラーゼ)、HP-Thio(His-patchチオレドキシン)、HS
P(熱ショックペプチド)、Lnγ(ラミニンγペプチ
ド)、Fn(フィブロネクチン部分ペプチド)、GFP(緑
色蛍光ペプチド)、YFP(黄色蛍光ペプチド)、CFP(シ
アン蛍光ペプチド)、BFP(青色蛍光ペプチド)、DsRe
d、DsRed2(赤色蛍光ペプチド)、MBP(マルトース結合
ペプチド)、LacZ(ラクトースオペレーター)、IgG
(免疫グロブリンG)、アビジン、プロテインGからなる
群から選択されるいずれかのペプチドを指称し、何れの
識別ペプチドであっても使用することが可能である。そ
の中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼ
A、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、my
cタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB
又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明物質の発
現、精製がより容易となることから好ましい。
【0017】本発明物質中での配列番号4記載のアミノ
酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの配置
は、識別ペプチドが配列番号4記載のアミノ酸配列から
なるポリペプチドのC末端側に結合していても或いはN末
端側に結合していてもよい。またこのような結合は、何
ら生理活性を有しないアミノ酸配列(2〜10個程度の
アミノ酸配列からなるペプチド)からなるスペーサーを
介してなされていても、本発明物質がコンドロイチンの
基本骨格中に存在するN-アセチルガラクトサミン残基に
グルクロン酸残基を転移する活性(以下、「GlcAT活
性」とも記載する)を有する限りにおいて制限はされな
い。
【0018】ここで、GlcAT活性は、例えばKitagawa et
al., J. Biol. Chem.,276(2001),38721-38726を改変し
た方法(後述の実施例に記載)を用いることにより検出
することが可能である。かかる方法によって本発明物質
のGlcAT活性を測定した際に得られるミカエリス定数(K
m値)は、後述の実施例記載の「コンドロイチン硫酸由
来の11糖(CS11)」に対しては100μmol/l以下であるこ
とが好ましく、特に90μmol/l以下であることが好まし
く、特に80μmol/l以下であることが好ましい。また、
更にグルクロン酸供与体の好ましい例であるUDP-GlcUA
に対するKm値は、100μmol/l以下であることが好まし
く、95μmol/lであることがより好ましく、90μmol/l以
下であることが最も好ましい。このような極めて特異性
の高いGlcAT活性は本発明物質が配列番号4記載のアミ
ノ酸配列という特定のアミノ酸配列を融合タンパク質と
した形態であることによる驚くべき効果の一つと考えら
れる。
【0019】本発明物質が有する「N-アセチルガラクト
サミン残基へのグルクロン酸残基の転移活性」における
グルクロン酸の結合様式は、コンドロイチン骨格のN-ア
セチルガラクトサミン残基の3位ヒドロキシル基とグル
クロン酸残基の1位ヒドロキシル基とのβ1-3グリコシド
結合であることから、特に限定はされないが、β1-3グ
リコシド結合であることが好ましい。
【0020】一般に、酵素タンパク質のアミノ酸配列の
うち、1又は複数(通常は2以上50以下)の構成アミノ
酸が置換、欠失、挿入、及び/又は転位しても酵素活性
が維持されることが知られ、同一酵素のバリアントであ
るということができるが、本発明物質においても配列番
号4記載のアミノ酸配列に1又は複数(2以上50以下)
の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は転位等
の部分的な変異が起こっていても融合タンパク質がGlcA
T活性を保持している限りにおいて、本発明物質と実質
的に同一の物質であるということができる(このような
配列番号4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに
部分的な変異を有するポリペプチドを便宜的に「修飾ポ
リペプチド」と記載する)。このような修飾ポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、配列番号4に示されるアミノ酸配
列と93%以上、好ましくは95%以上、さらに97%以上の
相同性を有することを好ましい(すなわちアミノ酸の変
異の数は最大50個、36個以下が好ましく、22個以下であ
ることが最も好ましい)。アミノ酸配列の相同性は、FA
STAのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて
容易に算出することができ、このようなソフトウェアは
インターネットによっても利用に供されている。
【0021】なお、上記融合タンパク質は、そのアミノ
酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性
を有するものであればタンパク質に糖鎖が結合していて
も良い。すなわち本発明物質の融合タンパク質には糖タ
ンパク質の形態の融合タンパク質も包含する。
【0022】このような本発明物質は、コンドロイチン
骨格を有するグリコサミノグリカンを基質とし、グルク
ロン酸供与体存在下、非還元末端のガラクトサミン残基
に対して、グルクロン酸残基を転移する後述の「本発明
糖鎖合成剤」の有効成分として使用することが可能であ
る。
【0023】また、更に本発明物質は後述の実施例に記
載の方法に従って、その酵素活性を容易に測定できるた
め、例えばかかる酵素活性の測定系に、被験物質を添加
し、被験物質が「本発明物質が有する酵素活性」を制御
(促進又は抑制)するか否かを測定・判定し、酵素活性
を制御する働きを有する被験物質を選択する方法、すな
わち「グルクロン酸転移酵素活性を制御する物質をスク
リーニングする方法」に本発明物質を使用することが可
能である。
【0024】(3)本発明物質の調製法 本発明物質は、配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列
番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置
換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列をコー
ドするDNAと識別ペプチドをコードするDNAとを同一読み
出し領域に配置してなり、且つ配列番号4記載のアミノ
酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構
成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとが発現
しうるようなプロモーター領域を有するベクターでトラ
ンスフェクトした適当な宿主細胞を生育させることで、
GlcAT遺伝子を発現させ生育物中に蓄積させて調製を行
うことが可能である。なお、ここで宿主細胞は上記遺伝
子が発現しうるものであれば原核細胞(例えば大腸菌、
枯草菌等)であると真核細胞(例えば酵母、哺乳動物由
来の細胞又は昆虫由来の細胞等)であると限定はされな
い。特に配列番号4記載のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドは本来真核細胞中で発現しているポリペプチドで
あることから、真核細胞が宿主細胞として好ましく、特
にほ乳類由来の細胞が好ましい。
【0025】ここで、宿主細胞の生育とは、宿主細胞を
培養することの他、宿主細胞を生体などに投与し、その
生体内で宿主細胞を生育させることも含む。また、生育
物とは、培養された宿主細胞、培養上清の他、宿主細胞
を生体内で生育させた場合には、その生体の***物、分
泌物なども含む。
【0026】本発明者らは実施例記載の方法により、Ge
nBank受け入れ番号AB037823のcDNA(配列番号1記載の
塩基配列からなる)が、ヒトのGlcATをコードするDNAで
あることを明らかとしたため、当該cDNAを基に本発明物
質を調製することが可能である。上記cDNAは、pBluescr
iptII SK(+)プラスミドに挿入された形態でかずさDNA研
究所(千葉県木更津市かずさ鎌足)に保管され、分譲を
受けることができる。
【0027】本発明物質の識別ペプチドとして例えばFL
AGペプチドを使用し、宿主細胞として哺乳動物由来の細
胞を使用する場合には、例えばpFLAG-CMV-3ベクター
(シグマ社製)などを発現ベクターとして使用すること
ができる。
【0028】pBluescriptII SK(+)プラスミドに挿入さ
れている上記cDNAをpFLAG-CMV-3ベクターに挿入するた
めには、pBluescriptII SK(+)プラスミドベクターから
例えばNarI及びBamHIなどの適当な制限酵素を用いてcDN
Aを切り出して、cDNAの粘着末端を平滑化してcDNA断片
を得(配列番号3記載の塩基配列からなる)、pFLAG-CM
V-3ベクターに挿入するために例えばHindIIIの様な適当
な制限末端を連結させて、適当な制限酵素で処理したpF
LAG-CMV-3ベクターに挿入することが可能である。
【0029】このようにして調製したpFLAG-CMV-3ベク
ター(pFLAGGlcAT)を、例えばpFLAG-CMV-3ベクターの
宿主細胞として機能するCOS-1細胞やCOS-7細胞にエレク
トロポレーション法などの常法を用いて導入して形質転
換体を得ることができる。
【0030】形質転換体はその基となった宿主細胞が生
育するのに適した条件下で生育させて、その生育物から
本発明物質を調製することができる。例えばCOS-7細胞
を宿主細胞として選択した場合には、in vitroで形質転
換体を培養し、その培養物(培養後の形質転換体及び培
養上清)から本発明物質を単離して精製することが可能
である。上記pFLAG-CMV-3ベクターを用いた場合には本
発明物質はFLAGペプチドを含むことになるので、本発明
物質は例えば抗FLAG抗体や後述の本発明抗体を用いて、
例えばアフィニティー精製などの方法で本発明物質を単
離、精製することが可能である。単離、精製の方法は、
本発明物質における識別ペプチドによって適宜、適当な
方法を常套的に選択することが可能である。
【0031】また、識別ペプチドは例えばコラゲナーゼ
などによって特異的に認識されるアミノ酸配列(例えば
特開平11−137256号公報の配列番号3記載のア
ミノ酸配列等)を使用することにより、配列番号4記載
のアミノ酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1
以上の構成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有
するアミノ酸配列を含む(1)で記載した本発明酵素を
得ることができる。
【0032】(4)本発明抗体 本発明抗体は、本発明物質に特異的に結合することを特
徴とする抗体である。本発明抗体は、抗体の抗原結合部
位を介して、本発明物質に特異的に結合する。したがっ
て、本発明抗体を製造は、本発明物質を「免疫原」とし
て使用し、公知の方法を用いることが可能である。より
具体的には、本発明物質を用いて、ウサギ、マウス、ラ
ット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サルなどの動
物を免疫し、これらの動物の血清を採取して抗血清(ポ
リクローナル抗体)を得るが、これらの動物から抗体産
生細胞(脾臓細胞など)を採取し、これと骨髄腫細胞株
(ミエローマ細胞)などの持続的な増殖能を有する細胞
とを融合させ、融合細胞(ハイブリドーマ)を得て、こ
れらを培養するか又は動物の腹腔内で増殖させることに
よりモノクローナル抗体を効率よく製造することができ
る。かかるハイブリドーマは、当業者であれば本明細書
を基に容易に調製することが可能である。
【0033】本発明抗体は、本発明物質又はその一部を
抗原決定基又はエピトープ(これらを総合して「エピト
ープ等」とも記載する)とし、本発明物質を特異的に認
識して結合する能力を有する。したがって本発明抗体
は、in vitro又はin vivoのいずれかにおいて、前記エ
ピトープ等を含む本発明物質の断片又は本発明物質の検
出を行なうアッセイで使用することが可能である。ま
た、本発明抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーによって、エピトープ等を含む本発明物質の断片又
は本発明物質を精製する際にも使用することが可能であ
る。
【0034】上述のエピトープ等は、直鎖でも高次構造
的(conformational)(断続的)でもどちらでもよい。
なお、エピトープ等は、当該技術分野に知られる常法に
よって同定することができる。したがって、本発明の1
つの側面は、本発明のグルクロン酸転移酵素のタンパク
質と識別ペプチドとの融合タンパク質の抗原性エピトー
プに関する。このようなエピトープは、以下により詳細
に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を
作成するのに有用である。さらに、本発明物質に含まれ
るエピトープの部分は本発明抗体に特異的に結合するの
で、本発明抗体の生体中又は試料中における存在量を測
定するためのアッセイにおいて使用することが可能であ
る。
【0035】本発明抗体は、本発明物質若しくはその一
部、又は上述のエピトープの部分を用いて調製すること
ができる。本発明抗体は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであっても良く、何れも慣用的技術
によって調製することが可能である。例えば、Kennetら
(監修), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N
ew York, 1980を参照すると当業者であれば容易に本発
明抗体を調製することができる。しかし、用途の多様性
からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【0036】モノクローナル抗体である本発明抗体は、
キメラ抗体(ネズミモノクローナル抗体のヒト化型抗体
や、サルモノクローナル抗体のヒト化型抗体などが例示
される)が含まれる。このようなヒト化抗体を既知の技
術によって調製すると、抗体をヒトに投与した際に、免
疫原性が少ないという利点が存在する。慣用的技術によ
って産生可能な、抗体の抗原結合断片も、本発明に含ま
れる。このような断片の例は、特に限定されるわけでは
ないが、例えばFabおよびF(ab')断片が含まれる。ま
た遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘
導体も例示される。
【0037】(5)本発明糖鎖合成剤 本発明糖鎖合成剤は、配列番号4記載のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元
末端にN-アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロ
イチン骨格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグル
クロン酸を転移する活性を有する。
【0038】本発明糖鎖合成剤に含有されるタンパク質
は、配列番号4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドと識別ペプチドとの融合タンパク質であることが好ま
しく、前記本発明物質によってなることが最も好まし
い。
【0039】本発明糖鎖合成剤は、コンドロイチン骨格
の非還元末端に存在するN-アセチルガラクトサミン残基
に対してグルクロン酸を転移する試薬として使用するこ
とが可能である。また、本発明糖鎖合成剤を構成する目
的酵素活性を有する部分である配列番号4記載のアミノ
酸配列がヒト由来のアミノ酸配列であるため、本発明糖
鎖合成剤をヒトに投与したとしても抗原性が低いことが
期待され、また培養軟骨などを本発明糖鎖合成剤で修飾
した後に生体に対して移植したとしても、本発明糖鎖合
成剤に起因する抗原抗体反応や炎症は惹起されないこと
が期待される。
【0040】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例1 <1>ヒトGlcATを発現させるためのベクターの調製 GenBank受け入れ番号AB037823のcDNA(配列番号1記載
の塩基配列からなる)を含むpBluescriptII SK(+)プラ
スミド(かずさDNA研究所:KIAA1402)を常法に従って
制限酵素NarI及びBamHIにより消化した。この消化産物
をアガロースゲル電気泳動に供し、5.4kbpのバンドをGe
l Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて回収した。回
収した消化産物をTaKaRa Blunting Kit(宝酒造株式会
社製)を用いて平滑化した後、HindIIIリンカー(宝酒
造株式会社製)を結合させ、セルフライゲーションさせ
た。
【0041】このようにして調製したDNA断片を、制限
酵素HindIIIおよびNotIによって消化し、消化産物をア
ガロースゲル電気泳動に供し、2.3kbpの断片を回収し
た。このDNA断片を、常法に従って制限酵素HindIIIおよ
びNotIで消化したpFLAG-CMV-3に連結させた。得られた
プラスミドの塩基配列を、常法に従ってシークエンス
し、配列番号3記載の塩基配列からなるGlcATcDNAをFLA
Gタンパク質との融合タンパク質として発現するように
構築されたベクターをpFLAGGlcATとした。
【0042】<2>組換体の調製 組換体を調製するための宿主細胞としては、サル腎臓由
来の培養細胞COS-7細胞(ダルベッコの調整最小培地:
以下「DMEM」とも記載する)を使用した。上記で調製し
たpFLAGGlcAT(2μg)をTransFast(商標名:プロメガ
社製)を用いて、添付されたプロトコールに従ってCOS-
7細胞(サル腎臓由来の培養細胞)に導入し、一過性発
現細胞を常法に従って回収するととも(transient:K
2)、600μg/mlの濃度の抗生物質G418を培地に添加する
ことにより、薬剤耐性スクリーニングを行って安定株を
回収した(stable:K2-2〜K2-21)。
【0043】得られた各クローンの培養物を、細胞と培
養上清に遠心分離を用いて分離し、細胞溶解液及び培養
上清から、抗FLAG抗体アフィニティゲル(M2アフィニテ
ィゲル:シグマ社製)を用いて融合タンパク質を回収
し、抗FLAG抗体(M2:シグマ社製)を一次抗体、二次抗
体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(ザイ
メッド社製)を用いてウエスタンブロッティング法(To
wbin et al., PNAS U.S.A., (1979),76:4350-4354)を
行った(図1)。その結果、K2-5の細胞株が培地中に特
に高濃度でFLAGタンパク質とGlcATとの融合タンパク質
を発現することが明らかとなった。
【0044】<3>FLAGタンパク質とGlcATとの融合タ
ンパク質の精製 上記で得られたK2-5株を150mm培養皿を用いて、20mlのD
MEM(10%牛胎児血清、100U/mlペニシリンGカリウム、10
0μg/mlストレプトマイシン硫酸塩、600μg/mlG418を含
む)で培養し、コンフルエントになった後、培地を交換
してさらに3日間培養して得られた培養上清を回収し
た。
【0045】この培養上清に1mol/l Tris-HCl、 pH7.
4、グリセロールをそれぞれ終濃度50mmol/l、20%になる
ように加え、使用するまで-80℃で保存した。保存した
培地を融解後、Anti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (S
IGMA社)を加え、4℃、一晩、転倒混和した。反応後、ゲ
ルをトリス緩衝生理的食塩水(以下「TBS」とも記載す
る)/0.05% Tween20(商標名:ICN社製)で、3回、つ
づいてTBSで1回洗浄した後、27Gの注射針をつけたシリ
ンジを用い余分な洗浄液を除き、融合タンパク質を精製
した。
【0046】<4>精製した融合タンパク質の活性測定 (1)N-アセチルガラクトサミン転移酵素(GalNAcT)
活性の測定 10mmol/lのMnCl2、171μmol/lのアデノシン三リン酸(A
TP)ナトリウム塩を含む50mmol/lのMES緩衝液(pH6.
5)に、培養上清10ml相当の上記<3>で得られた融合
タンパク質を添加し、N-アセチルガラクトサミン残基供
与体としてトリチウムラベルしたUDP(ウリジン二リン
酸)-GalNAc(9×105cpm:NEN社製)、ガラクトサミン
残基受容体としてコンドロイチン(0.28μg:生化学工
業株式会社製)を添加して、全量を100μlとなるように
蒸留水で調整した。この反応液を37℃で3時間反応させ
た。その後、100℃で5分加熱することで酵素を失活させ
て反応を停止した。反応液をポアサイズ0.22μmのマイ
クロフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、流速0.
5ml/分の0.2mol/lのNaClを移動相とするSuperdex pept
ideカラム(30×10mm:ファルマシア社製)に通筒して
0.5ml毎の画分として溶出液を回収した。そして各画分
の放射能をシンチレーションカウンターにより計数した
(図2)。尚、陽性対照としては、大腸菌K4株由来の
コンドロイチン合成酵素標品(J. Biol. Chem., 277(20
02), 21567-21575:生化学工業株式会社二宮氏より恵
与)3μUを使用した。その結果、陽性対象はコンドロイ
チンに対してN-アセチルガラクトサミン残基を転移して
いるのに対し、本発明の融合タンパク質は、コンドロイ
チンに対してはN-アセチルガラクトサミン残基を転移し
ないことが明かとなった。
【0047】さらに、睾丸ヒアルロニダーゼにより限定
分解して精製したコンドロイチン硫酸6糖(1nmol:生化
学工業株式会社多和田氏より恵与)を受容体として同様
の測定を行った(図3)。その結果、このようなオリゴ
糖に対しても本発明の融合タンパク質は、N-アセチルガ
ラクトサミン残基を転移しないことが明らかとなった。
【0048】(2)グルクロン酸転移酵素(GlcAT)活
性の測定 10mmol/lのMnCl2を含む50mmol/lの酢酸ナトリウム緩衝
液(pH5.6)に、培養上清10ml相当の上記<3>で得ら
れた融合タンパク質を添加し、グルクロン酸残基供与体
として14CでラベルしたUDP-GlcA(9×105cpm:ICN社
製)、グルクロン酸残基受容体としてコンドロイチン
(0.28μg:生化学工業株式会社製)を添加して、全量
を100μlとなるように蒸留水で調整した。この反応液を
37℃で3時間反応させた。その後、100℃で5分加熱する
ことで酵素を失活させて反応を停止した。反応液をポア
サイズ0.22μmのマイクロフィルター(ミリポア社製)
で濾過した後、流速0.5ml/分の0.2mol/lのNaClを移動
相とするSuperdex peptideカラム(30×10mm:ファルマ
シア社製)に通筒して0.5ml毎の画分として溶出液を回
収した。そして各画分の放射能をシンチレーションカウ
ンターにより計数した(図4)。尚、陽性対象として
は、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素標品(J.
Biol. Chem., 277(2002), 21567-21575:生化学工業株
式会社二宮氏より恵与)3μUを使用した。その結果、陽
性対象においてはコンドロイチンに対してグルクロン酸
残基の転移活性が観察されたのに対し、本発明の融合タ
ンパク質は、コンドロイチンに対してはグルクロン酸残
基を転移しないことが明かとなった。
【0049】さらに、睾丸ヒアルロニダーゼにより限定
分解して精製したコンドロイチン硫酸6糖(1nmol:生化
学工業株式会社多和田氏より恵与)に、その非還元末端
に大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素(J. Biol.
Chem., 277(2002), 21567-21575:生化学工業株式会社
二宮氏より恵与)によりN-アセチルガラクトサミンを転
移して調製したコンドロイチン硫酸7糖を受容体として
同様の測定を行った(図5)。その結果、このようなオ
リゴ糖に対して、本発明の融合タンパク質はグルクロン
酸残基を転移してコンドロイチン硫酸8糖が得られるこ
とが明かとなった。
【0050】なお、上記受容体としてのコンドロイチン
硫酸7糖は、20mmol/lのMnCl2、0.1mol/lの(NH4)2SO4、1
mol/lのエチレングリコールを含む50mmol/lのTris-HCl
緩衝液(pH7.2)に大腸菌K4株由来のコンドロイチン
合成酵素12μUを用い、N-アセチルガラクトサミン受容
体として睾丸ヒアルロニダーゼにより限定分解して精製
したコンドロイチン硫酸6糖(50μg:生化学工業株式会
社多和田氏より恵与)を使用して調製した。この反応に
おいてN-アセチルガラクトサミン供与体としては1.5mmo
l/lのUDP-GalNAc(シグマ社製)を加えて、全量を蒸留
水により500μlに調整した。この反応液を30℃で1時間
反応させ、その後100℃で5分間加熱して酵素を失活させ
ることで反応を停止した。この反応液を流速2ml/分の0.
2mol/l NH4HCO3を移動相とするSuperdex 30カラム(60
×16mm:ファルマシア社製)で精製し、溶出液を215nm
でモニターしながら2ml毎に分画した。そしてコンドロ
イチン硫酸7糖相当画分をプールし、凍結乾燥後、50μ
lの蒸留水に溶解して調製した。
【0051】さらに、本発明の融合タンパク質を10mmol
/lのEDTA存在下で、Mn2+をキレートして上記7糖へのGlc
AT活性の測定を行ったところ、活性が完全に失われるこ
とが明らかとなった(図6)。このことは、少なくとも
本発明の融合タンパク質は二価陽イオンを反応に必要と
していることを示している。
【0052】(3)本発明の融合タンパク質の反応生成
物の解析 (2)で、コンドロイチン硫酸7糖に本発明の融合タン
パク質を反応させて得たコンドロイチン硫酸8糖の構造
を解析するために、生成した前記8糖をコンドロイチナ
ーゼABCで消化して、どの様な消化産物が得られるかを
解析した。
【0053】すなわち、上記8糖の放射能が観察された2
3〜27番目の画分を回収し凍結乾燥した後、流速1ml/分
の0.2mol/l NH4HCO3を移動相として用いた脱塩カラム
(FastDesalting Column:ファルマシア社製)により脱
塩し、さらに溶出液を二分して凍結乾燥した。一方(対
照群)を30mmol/lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/lのTr
is-HCl緩衝液(pH8.0)200μlに溶解し、他方(試験
群)は100mUのコンドロイチナーゼABC(生化学工業株式
会社製)、30mmol/lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/lの
Tris-HCl緩衝液(pH8.0)200μlに溶解した。各々を37
℃で30分間反応させ、その後100℃で5分間加熱してコン
ドロイチナーゼABCを失活させて酵素反応を停止した。
この反応液をポアサイズ0.22μmのマイクロフィルター
(ミリポア社製)で濾過した後、流速0.5ml/分の0.2mol
/l NaClを移動相とするSuperdex peptideカラム(30×1
0mm:ファルマシア社製)により溶出し、溶出液を0.5ml
毎に分画した。そして各画分の放射能をシンチレーショ
ンカウンターにより計数した(図7)。
【0054】その結果、対照群はコンドロイチナーゼAB
Cで消化しない元の状態と同じパターンで溶出される
が、試験群ではΔdi-0S(不飽和ウロン酸−N-アセチル
ガラクトサミンからなる硫酸基を有しない二糖)とほぼ
同じ位置にピークがシフトした。このことから本発明の
融合タンパク質は、コンドロイチン骨格の非還元末端の
N-アセチルガラクトサミン残基に対してβ1,3結合でグ
ルクロン酸残基を転移することが明かとなった。
【0055】(4)基質の鎖長による酵素反応の変化 サメ由来コンドロイチン硫酸(コンドロイチン硫酸C:
生化学工業株式会社製)及びコンドロイチン(上記サメ
由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したもの:
生化学工業株式会社製)とを使用してJ. Biochem. , 11
1(1992), pp.91-98に記載された方法に従ってこれらを
分解、精製し、それぞれ5糖、7糖、9糖、11糖、及び13
糖からなるオリゴ糖を調製した(コンドロイチン硫酸由
来のこれらオリゴ糖はそれぞれCS5、CS7、CS9、CS11、
及びCS13と表記し、同様にコンドロイチン由来のこれら
オリゴ糖はそれぞれCH5、CH7、CH9、CH11、及びCH13と
表記する)。
【0056】これらをグルクロン酸残基受容体として用
いて、(2)と同様の方法でそれぞれのオリゴ糖の「グ
ルクロン酸残基受容体としての働き」を測定した(表
1)。その結果、特に9糖以上のオリゴ糖がグルクロン
酸残基受容体として好ましいことが明らかとなった。
【0057】
【表1】
【0058】上記(2)の条件下で、上記CS11の濃度を
変化させた場合と、UDP-GlcUAの濃度を変化させた場合
のGlcAT活性の変化を測定した(CS11の濃度を変化させ
た場合:図8、UDP-GlcUAの濃度を変化させた場合:図
9)。その結果、何れも濃度を上げていくと反応速度が
飽和する傾向を示すことが明かとなった。これらを使用
してCS11とUDP-GlcUAに対するミカエリス定数(Km)値
を算出したところ、CS11のKm値は65.3μmol/l、UDP-Glc
UAのKm値は82.4μmol/lであった。この値を見る限りに
おいて、本発明物質の基質への親和性は極めて高いこと
が明かである。
【0059】<5>ヒト健常組織及び株化細胞における
GlcATの発現の定量 ヒト正常組織及び株化細胞のcDNAを用いて、定量的ポリ
メラーゼチェイン反応(PCR)によりGlcAT遺伝子の発現
量を定量した。cDNAとしてはMarathon Ready cDNA(ク
ロンテック社製)を使用した。GlcATの定量的PCRにはプ
ライマーとしてK2-Fw(配列番号5記載)及びK2-Rv(配列
番号6記載)を使用し、プローブとしてはアプライドバ
イオシステムズ社のマイナーグルーブバインダーを結合
したK2-MGB(配列番号7記載)を使用した。酵素及び反
応液としてUniversal PCR MasterMix(アプライドバイ
オシステムズ社製)を使用し、ABI PRISM 770 Sequence
Detection System(アプライドバイオシステムズ社
製)により反応液量25μlで定量を行った。定量の標準
遺伝子としてはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵
素(GAPDH)遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型DNAにより
定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行っ
た。反応温度は50℃2分、95℃10分のあと、95℃15秒・6
0℃1分を50サイクル行った(図10)。その結果、GlcA
Tは、ほぼ全ての健常組織、株化細胞で発現が観察され
たものの、胎盤、小腸、膵臓および脾臓、特に胎盤にお
いて大量に発現していることが明かとなった。
【0060】
【発明の効果】本発明により、コンドロイチン骨格の合
成に関与する酵素のうち、N-アセチルガラクトサミン転
移酵素活性を実質的に有さず、グルクロン酸転移酵素活
性を有する酵素を遺伝子工学的に得る際に有用である融
合タンパク質及びその製造が提供される。
【0061】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kazusa DNA Research Institute Seikagaku Corporation <120> A fusion protein having glucronic acid transferase activity <140> <141> <160> 7 <210> 1 <211> 3970 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1466)..(3832) <400> 1 aggggctgtg aggtggcagc ggctgcagcg gcggagccgg cgcctcagcg ggcactgggg 60 tctgttcccc cttccccgtc cctgctccct gccaggcgcg tgcgggacgc cgctcttggt 120 ccccacgcct ccgccccgcc ccctcccggg acgccgggag accccggccg tcctttatcc 180 ggtgtccgcc ggcccccggc cctgaaaccc gggcctcctc cccgagggcc ttgggcgtcc 240 ctcctggtcc tgcgctcgcg gcctcgatgc tgtctctggc gcggcctccg ctcccgccga 300 ctggcctgag aacgaggtct gtgccccagt ctcccagccg cgacctccga ccccgcctcg 360 cagaacgacc cgagctggtc tcccgagccc ccttctcagc agcccggtga cgtggccagt 420 ttatttctgt tttgagacga acggcgaaga ctcgcgtcgg gtcttcgttc tagggctaga 480 cttggtctct gatcgccgag aggtagcgca ggggctgtgg gcccccggca ggggtcctgt 540 cggaagctgg ccgcgcttct gtttgcgttc ccaggaccct ggcattgtct ctagttgctg 600 cttgtgctct ctctttgctt ttggtttgct tcatttggcc cctggggccc tggtaaaacc 660 aggcaccgaa tcgctcgcac acagagttcc agtccccgcc tgctgtctcc tcagcagctg 720 gggttccgag gagaatgccc tgcaagatgg ctccatcggc catggcgctc ctgagaggct 780 gtcagtgctg agtcaccgat ctacctcatt cgggtgggca gaacttatgt gtgccatgcg 840 agtggctcca gaccgctcct gagtgggagg aggggttcct gtagccgttg cgtcttctca 900 aacacgggga gcagagtaga aagaggctct ggccccttcc cttgtgccca ccgggcctgc 960 cgcagtggct cagcagcccc ttcagtagcc cgcctgagga ccgatgccag aggcaggcat 1020 tcttccggaa aggcccactg aggcaggctc cggctcctct ggttggggct gttgttttga 1080 tggatcgtgt gcttttccct tacctcttat cacttgctgt catctgttga cttaggccca 1140 gtctgcagat gtgtgtagtg ttcctttttg ggttagcttt ggcagtattg agttttactt 1200 cctcctcttt ttagtggaag acagaccata atcccagtgt gagtgaaatt gattgtttca 1260 tttattaccg ttttggctgg gggttagttc cgacaccttc acagttgaag agcaggcaga 1320 aggagttgtg aagacaggac aatcttcttg gggatgctgg tcctggaagc cagcgggcct 1380 cgctctgtct ttggcctcat tgaccccagg ttctctggtt aaaactgaaa gcctactact 1440 ggcctggtgc ccatcaatcc attga tcc ttg agg ctg tgc ccc tgg ggc acc 1492 Ser Leu Arg Leu Cys Pro Trp Gly Thr 1 5 cac ctg gca ggg cct acc acc atg cga ctg agc tcc ctg ttg gct ctg 1540 His Leu Ala Gly Pro Thr Thr Met Arg Leu Ser Ser Leu Leu Ala Leu 10 15 20 25 ctg cgg cca gcg ctt ccc ctc atc tta ggg ctg tct ctg ggg tgc agc 1588 Leu Arg Pro Ala Leu Pro Leu Ile Leu Gly Leu Ser Leu Gly Cys Ser 30 35 40 ctg agc ctc ctg cgg gtt tcc tgg atc cag ggg gag gga gaa gat ccc 1636 Leu Ser Leu Leu Arg Val Ser Trp Ile Gln Gly Glu Gly Glu Asp Pro 45 50 55 tgt gtc gag gct gta ggg gag cga gga ggg cca cag aat cca gat tcc 1684 Cys Val Glu Ala Val Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gln Asn Pro Asp Ser 60 65 70 aga gct cgg cta gac caa agt gat gaa gac ttc aaa ccc cgg att gtc 1732 Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ser Asp Glu Asp Phe Lys Pro Arg Ile Val 75 80 85 ccc tac tac agg gac ccc aac aag ccc tac aag aag gtg ctc agg act 1780 Pro Tyr Tyr Arg Asp Pro Asn Lys Pro Tyr Lys Lys Val Leu Arg Thr 90 95 100 105 cgg tac atc cag aca gag ctg ggc tcc cgt gag cgg ttg ctg gtg gct 1828 Arg Tyr Ile Gln Thr Glu Leu Gly Ser Arg Glu Arg Leu Leu Val Ala 110 115 120 gtc ctg acc tcc cga gct aca ctg tcc act ttg gcc gtg gct gtg aac 1876 Val Leu Thr Ser Arg Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Asn 125 130 135 cgt acg gtg gcc cat cac ttc cct cgg tta ctc tac ttc act ggg cag 1924 Arg Thr Val Ala His His Phe Pro Arg Leu Leu Tyr Phe Thr Gly Gln 140 145 150 cgg ggg gcc cgg gct cca gca ggg atg cag gtg gtg tct cat ggg gat 1972 Arg Gly Ala Arg Ala Pro Ala Gly Met Gln Val Val Ser His Gly Asp 155 160 165 gag cgg ccc gcc tgg ctc atg tca gag acc ctg cgc cac ctt cac aca 2020 Glu Arg Pro Ala Trp Leu Met Ser Glu Thr Leu Arg His Leu His Thr 170 175 180 185 cac ttt ggg gcc gac tac gac tgg ttc ttc atc atg cag gat gac aca 2068 His Phe Gly Ala Asp Tyr Asp Trp Phe Phe Ile Met Gln Asp Asp Thr 190 195 200 tat gtg cag gcc ccc cgc ctg gca gcc ctt gct ggc cac ctc agc atc 2116 Tyr Val Gln Ala Pro Arg Leu Ala Ala Leu Ala Gly His Leu Ser Ile 205 210 215 aac caa gac ctg tac tta ggc cgg gca gag gag ttc att ggc gca ggc 2164 Asn Gln Asp Leu Tyr Leu Gly Arg Ala Glu Glu Phe Ile Gly Ala Gly 220 225 230 gag cag gcc cgg tac tgt cat ggg ggc ttt ggc tac ctg ttg tca cgg 2212 Glu Gln Ala Arg Tyr Cys His Gly Gly Phe Gly Tyr Leu Leu Ser Arg 235 240 245 agt ctc ctg ctt cgt ctg cgg cca cat ctg gat ggc tgc cga gga gac 2260 Ser Leu Leu Leu Arg Leu Arg Pro His Leu Asp Gly Cys Arg Gly Asp 250 255 260 265 att ctc agt gcc cgt cct gac gag tgg ctt gga cgc tgc ctc att gac 2308 Ile Leu Ser Ala Arg Pro Asp Glu Trp Leu Gly Arg Cys Leu Ile Asp 270 275 280 tct ctg ggc gtc ggc tgt gtc tca cag cac cag ggg cag cag tat cgc 2356 Ser Leu Gly Val Gly Cys Val Ser Gln His Gln Gly Gln Gln Tyr Arg 285 290 295 tca ttt gaa ctg gcc aaa aat agg gac cct gag aag gaa ggg agc tcg 2404 Ser Phe Glu Leu Ala Lys Asn Arg Asp Pro Glu Lys Glu Gly Ser Ser 300 305 310 gct ttc ctg agt gcc ttc gcc gtg cac cct gtc tcc gaa ggt acc ctc 2452 Ala Phe Leu Ser Ala Phe Ala Val His Pro Val Ser Glu Gly Thr Leu 315 320 325 atg tac cgg ctc cac aaa cgc ttc agc gct ctg gag ttg gag cgg gct 2500 Met Tyr Arg Leu His Lys Arg Phe Ser Ala Leu Glu Leu Glu Arg Ala 330 335 340 345 tac agt gaa ata gaa caa ctg cag gct cag atc cgg aac ctg acc gtg 2548 Tyr Ser Glu Ile Glu Gln Leu Gln Ala Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val 350 355 360 ctg acc ccc gaa ggg gag gca ggg ctg agc tgg ccc gtt ggg ctc cct 2596 Leu Thr Pro Glu Gly Glu Ala Gly Leu Ser Trp Pro Val Gly Leu Pro 365 370 375 gct cct ttc aca cca cac tct cgc ttt gag gtg ctg ggc tgg gac tac 2644 Ala Pro Phe Thr Pro His Ser Arg Phe Glu Val Leu Gly Trp Asp Tyr 380 385 390 ttc aca gag cag cac acc ttc tcc tgt gca gat ggg gct ccc aag tgc 2692 Phe Thr Glu Gln His Thr Phe Ser Cys Ala Asp Gly Ala Pro Lys Cys 395 400 405 cca cta cag ggg gct agc agg gcg gac gtg ggt gat gcg ttg gag act 2740 Pro Leu Gln Gly Ala Ser Arg Ala Asp Val Gly Asp Ala Leu Glu Thr 410 415 420 425 gcc ctg gag cag ctc aat cgg cgc tat cag ccc cgc ctg cgc ttc cag 2788 Ala Leu Glu Gln Leu Asn Arg Arg Tyr Gln Pro Arg Leu Arg Phe Gln 430 435 440 aag cag cga ctg ctc aac ggc tat cgg cgc ttc gac cca gca cgg ggc 2836 Lys Gln Arg Leu Leu Asn Gly Tyr Arg Arg Phe Asp Pro Ala Arg Gly 445 450 455 atg gag tac acc ctg gac ctg ctg ttg gaa tgt gtg aca cag cgt ggg 2884 Met Glu Tyr Thr Leu Asp Leu Leu Leu Glu Cys Val Thr Gln Arg Gly 460 465 470 cac cgg cgg gcc ctg gct cgc agg gtc agc ctg ctg cgg cca ctg agc 2932 His Arg Arg Ala Leu Ala Arg Arg Val Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser 475 480 485 cgg gtg gaa atc cta cct atg ccc tat gtc act gag gcc acc cga gtg 2980 Arg Val Glu Ile Leu Pro Met Pro Tyr Val Thr Glu Ala Thr Arg Val 490 495 500 505 cag ctg gtg ctg cca ctc ctg gtg gct gaa gct gct gca gcc ccg gct 3028 Gln Leu Val Leu Pro Leu Leu Val Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala 510 515 520 ttc ctc gag gcc ttt gca gcc aat gtc ctg gag cca cga gaa cat gca 3076 Phe Leu Glu Ala Phe Ala Ala Asn Val Leu Glu Pro Arg Glu His Ala 525 530 535 ttg ctc acc ctg ttg ctg gtc tac ggg cca cga gaa ggt ggc cgt gga 3124 Leu Leu Thr Leu Leu Leu Val Tyr Gly Pro Arg Glu Gly Gly Arg Gly 540 545 550 gct cca gac cca ttt ctt ggg gtg aag gct gca gca gcg gag tta gag 3172 Ala Pro Asp Pro Phe Leu Gly Val Lys Ala Ala Ala Ala Glu Leu Glu 555 560 565 cga cgg tac cct ggg acg agg ctg gcc tgg ctc gct gtg cga gca gag 3220 Arg Arg Tyr Pro Gly Thr Arg Leu Ala Trp Leu Ala Val Arg Ala Glu 570 575 580 585 gcc cct tcc cag gtg cga ctc atg gac gtg gtc tcg aag aag cac cct 3268 Ala Pro Ser Gln Val Arg Leu Met Asp Val Val Ser Lys Lys His Pro 590 595 600 gtg gac act ctc ttc ttc ctt acc acc gtg tgg aca agg cct ggg ccc 3316 Val Asp Thr Leu Phe Phe Leu Thr Thr Val Trp Thr Arg Pro Gly Pro 605 610 615 gaa gtc ctc aac cgc tgt cgc atg aat gcc atc tct ggc tgg cag gcc 3364 Glu Val Leu Asn Arg Cys Arg Met Asn Ala Ile Ser Gly Trp Gln Ala 620 625 630 ttc ttt cca gtc cat ttc cag gag ttc aat cct gcc ctg tca cca cag 3412 Phe Phe Pro Val His Phe Gln Glu Phe Asn Pro Ala Leu Ser Pro Gln 635 640 645 aga tca ccc cca ggg ccc ccg ggg gct ggc cct gac ccc ccc tcc cct 3460 Arg Ser Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Gly Pro Asp Pro Pro Ser Pro 650 655 660 665 cct ggt gct gac ccc tcc cgg ggg gct cct ata ggg ggg aga ttt gac 3508 Pro Gly Ala Asp Pro Ser Arg Gly Ala Pro Ile Gly Gly Arg Phe Asp 670 675 680 cgg cag gct tct gcg gag ggc tgc ttc tac aac gct gac tac ctg gcg 3556 Arg Gln Ala Ser Ala Glu Gly Cys Phe Tyr Asn Ala Asp Tyr Leu Ala 685 690 695 gcc cga gcc cgg ctg gca ggt gaa ctg gca ggc cag gaa gag gag gaa 3604 Ala Arg Ala Arg Leu Ala Gly Glu Leu Ala Gly Gln Glu Glu Glu Glu 700 705 710 gcc ctg gag ggg ctg gag gtg atg gat gtt ttc ctc cgg ttc tca ggg 3652 Ala Leu Glu Gly Leu Glu Val Met Asp Val Phe Leu Arg Phe Ser Gly 715 720 725 ctc cac ctc ttt cgg gcc gta gag cca ggg ctg gtg cag aag ttc tcc 3700 Leu His Leu Phe Arg Ala Val Glu Pro Gly Leu Val Gln Lys Phe Ser 730 735 740 745 ctg cga gac tgc agc cca cgg ctc agt gaa gaa ctc tac cac cgc tgc 3748 Leu Arg Asp Cys Ser Pro Arg Leu Ser Glu Glu Leu Tyr His Arg Cys 750 755 760 cgc ctc agc aac ctg gag ggg cta ggg ggc cgt gcc cag ctg gct atg 3796 Arg Leu Ser Asn Leu Glu Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gln Leu Ala Met 765 770 775 gct ctc ttt gag cag gag cag gcc aat agc act tag cccgcctggg 3842 Ala Leu Phe Glu Gln Glu Gln Ala Asn Ser Thr 780 785 ggccctaacc tcattacctt tcctttgtct gcctcagccc caggaagggc aaggcaagat 3902 ggtggacaga tagagaattg ttgctgtatt ttttaaatat gaaaatgtta ttaaacatgt 3962 cttctgcc 3970 <210> 2 <211> 788 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Leu Arg Leu Cys Pro Trp Gly Thr His Leu Ala Gly Pro Thr Thr 1 5 10 15 Met Arg Leu Ser Ser Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Ala Leu Pro Leu 20 25 30 Ile Leu Gly Leu Ser Leu Gly Cys Ser Leu Ser Leu Leu Arg Val Ser 35 40 45 Trp Ile Gln Gly Glu Gly Glu Asp Pro Cys Val Glu Ala Val Gly Glu 50 55 60 Arg Gly Gly Pro Gln Asn Pro Asp Ser Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ser 65 70 75 80 Asp Glu Asp Phe Lys Pro Arg Ile Val Pro Tyr Tyr Arg Asp Pro Asn 85 90 95 Lys Pro Tyr Lys Lys Val Leu Arg Thr Arg Tyr Ile Gln Thr Glu Leu 100 105 110 Gly Ser Arg Glu Arg Leu Leu Val Ala Val Leu Thr Ser Arg Ala Thr 115 120 125 Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Asn Arg Thr Val Ala His His Phe 130 135 140 Pro Arg Leu Leu Tyr Phe Thr Gly Gln Arg Gly Ala Arg Ala Pro Ala 145 150 155 160 Gly Met Gln Val Val Ser His Gly Asp Glu Arg Pro Ala Trp Leu Met 165 170 175 Ser Glu Thr Leu Arg His Leu His Thr His Phe Gly Ala Asp Tyr Asp 180 185 190 Trp Phe Phe Ile Met Gln Asp Asp Thr Tyr Val Gln Ala Pro Arg Leu 195 200 205 Ala Ala Leu Ala Gly His Leu Ser Ile Asn Gln Asp Leu Tyr Leu Gly 210 215 220 Arg Ala Glu Glu Phe Ile Gly Ala Gly Glu Gln Ala Arg Tyr Cys His 225 230 235 240 Gly Gly Phe Gly Tyr Leu Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Arg Leu Arg 245 250 255 Pro His Leu Asp Gly Cys Arg Gly Asp Ile Leu Ser Ala Arg Pro Asp 260 265 270 Glu Trp Leu Gly Arg Cys Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Gly Cys Val 275 280 285 Ser Gln His Gln Gly Gln Gln Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Lys Asn 290 295 300 Arg Asp Pro Glu Lys Glu Gly Ser Ser Ala Phe Leu Ser Ala Phe Ala 305 310 315 320 Val His Pro Val Ser Glu Gly Thr Leu Met Tyr Arg Leu His Lys Arg 325 330 335 Phe Ser Ala Leu Glu Leu Glu Arg Ala Tyr Ser Glu Ile Glu Gln Leu 340 345 350 Gln Ala Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Leu Thr Pro Glu Gly Glu Ala 355 360 365 Gly Leu Ser Trp Pro Val Gly Leu Pro Ala Pro Phe Thr Pro His Ser 370 375 380 Arg Phe Glu Val Leu Gly Trp Asp Tyr Phe Thr Glu Gln His Thr Phe 385 390 395 400 Ser Cys Ala Asp Gly Ala Pro Lys Cys Pro Leu Gln Gly Ala Ser Arg 405 410 415 Ala Asp Val Gly Asp Ala Leu Glu Thr Ala Leu Glu Gln Leu Asn Arg 420 425 430 Arg Tyr Gln Pro Arg Leu Arg Phe Gln Lys Gln Arg Leu Leu Asn Gly 435 440 445 Tyr Arg Arg Phe Asp Pro Ala Arg Gly Met Glu Tyr Thr Leu Asp Leu 450 455 460 Leu Leu Glu Cys Val Thr Gln Arg Gly His Arg Arg Ala Leu Ala Arg 465 470 475 480 Arg Val Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Arg Val Glu Ile Leu Pro Met 485 490 495 Pro Tyr Val Thr Glu Ala Thr Arg Val Gln Leu Val Leu Pro Leu Leu 500 505 510 Val Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Phe Leu Glu Ala Phe Ala Ala 515 520 525 Asn Val Leu Glu Pro Arg Glu His Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Val 530 535 540 Tyr Gly Pro Arg Glu Gly Gly Arg Gly Ala Pro Asp Pro Phe Leu Gly 545 550 555 560 Val Lys Ala Ala Ala Ala Glu Leu Glu Arg Arg Tyr Pro Gly Thr Arg 565 570 575 Leu Ala Trp Leu Ala Val Arg Ala Glu Ala Pro Ser Gln Val Arg Leu 580 585 590 Met Asp Val Val Ser Lys Lys His Pro Val Asp Thr Leu Phe Phe Leu 595 600 605 Thr Thr Val Trp Thr Arg Pro Gly Pro Glu Val Leu Asn Arg Cys Arg 610 615 620 Met Asn Ala Ile Ser Gly Trp Gln Ala Phe Phe Pro Val His Phe Gln 625 630 635 640 Glu Phe Asn Pro Ala Leu Ser Pro Gln Arg Ser Pro Pro Gly Pro Pro 645 650 655 Gly Ala Gly Pro Asp Pro Pro Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Ser Arg 660 665 670 Gly Ala Pro Ile Gly Gly Arg Phe Asp Arg Gln Ala Ser Ala Glu Gly 675 680 685 Cys Phe Tyr Asn Ala Asp Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Ala Gly 690 695 700 Glu Leu Ala Gly Gln Glu Glu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Leu Glu Val 705 710 715 720 Met Asp Val Phe Leu Arg Phe Ser Gly Leu His Leu Phe Arg Ala Val 725 730 735 Glu Pro Gly Leu Val Gln Lys Phe Ser Leu Arg Asp Cys Ser Pro Arg 740 745 750 Leu Ser Glu Glu Leu Tyr His Arg Cys Arg Leu Ser Asn Leu Glu Gly 755 760 765 Leu Gly Gly Arg Ala Gln Leu Ala Met Ala Leu Phe Glu Gln Glu Gln 770 775 780 Ala Asn Ser Thr 785 <210> 3 <211> 2222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: fragment from cDNA of KIAA1402 <220> <221> CDS <222> (3)..(2222) <400> 3 gg atc cag ggg gag gga gaa gat ccc tgt gtc gag gct gta ggg gag 47 Ile Gln Gly Glu Gly Glu Asp Pro Cys Val Glu Ala Val Gly Glu 1 5 10 15 cga gga ggg cca cag aat cca gat tcc aga gct cgg cta gac caa agt 95 Arg Gly Gly Pro Gln Asn Pro Asp Ser Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ser 20 25 30 gat gaa gac ttc aaa ccc cgg att gtc ccc tac tac agg gac ccc aac 143 Asp Glu Asp Phe Lys Pro Arg Ile Val Pro Tyr Tyr Arg Asp Pro Asn 35 40 45 aag ccc tac aag aag gtg ctc agg act cgg tac atc cag aca gag ctg 191 Lys Pro Tyr Lys Lys Val Leu Arg Thr Arg Tyr Ile Gln Thr Glu Leu 50 55 60 ggc tcc cgt gag cgg ttg ctg gtg gct gtc ctg acc tcc cga gct aca 239 Gly Ser Arg Glu Arg Leu Leu Val Ala Val Leu Thr Ser Arg Ala Thr 65 70 75 ctg tcc act ttg gcc gtg gct gtg aac cgt acg gtg gcc cat cac ttc 287 Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Asn Arg Thr Val Ala His His Phe 80 85 90 95 cct cgg tta ctc tac ttc act ggg cag cgg ggg gcc cgg gct cca gca 335 Pro Arg Leu Leu Tyr Phe Thr Gly Gln Arg Gly Ala Arg Ala Pro Ala 100 105 110 ggg atg cag gtg gtg tct cat ggg gat gag cgg ccc gcc tgg ctc atg 383 Gly Met Gln Val Val Ser His Gly Asp Glu Arg Pro Ala Trp Leu Met 115 120 125 tca gag acc ctg cgc cac ctt cac aca cac ttt ggg gcc gac tac gac 431 Ser Glu Thr Leu Arg His Leu His Thr His Phe Gly Ala Asp Tyr Asp 130 135 140 tgg ttc ttc atc atg cag gat gac aca tat gtg cag gcc ccc cgc ctg 479 Trp Phe Phe Ile Met Gln Asp Asp Thr Tyr Val Gln Ala Pro Arg Leu 145 150 155 gca gcc ctt gct ggc cac ctc agc atc aac caa gac ctg tac tta ggc 527 Ala Ala Leu Ala Gly His Leu Ser Ile Asn Gln Asp Leu Tyr Leu Gly 160 165 170 175 cgg gca gag gag ttc att ggc gca ggc gag cag gcc cgg tac tgt cat 575 Arg Ala Glu Glu Phe Ile Gly Ala Gly Glu Gln Ala Arg Tyr Cys His 180 185 190 ggg ggc ttt ggc tac ctg ttg tca cgg agt ctc ctg ctt cgt ctg cgg 623 Gly Gly Phe Gly Tyr Leu Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Arg Leu Arg 195 200 205 cca cat ctg gat ggc tgc cga gga gac att ctc agt gcc cgt cct gac 671 Pro His Leu Asp Gly Cys Arg Gly Asp Ile Leu Ser Ala Arg Pro Asp 210 215 220 gag tgg ctt gga cgc tgc ctc att gac tct ctg ggc gtc ggc tgt gtc 719 Glu Trp Leu Gly Arg Cys Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Gly Cys Val 225 230 235 tca cag cac cag ggg cag cag tat cgc tca ttt gaa ctg gcc aaa aat 767 Ser Gln His Gln Gly Gln Gln Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Lys Asn 240 245 250 255 agg gac cct gag aag gaa ggg agc tcg gct ttc ctg agt gcc ttc gcc 815 Arg Asp Pro Glu Lys Glu Gly Ser Ser Ala Phe Leu Ser Ala Phe Ala 260 265 270 gtg cac cct gtc tcc gaa ggt acc ctc atg tac cgg ctc cac aaa cgc 863 Val His Pro Val Ser Glu Gly Thr Leu Met Tyr Arg Leu His Lys Arg 275 280 285 ttc agc gct ctg gag ttg gag cgg gct tac agt gaa ata gaa caa ctg 911 Phe Ser Ala Leu Glu Leu Glu Arg Ala Tyr Ser Glu Ile Glu Gln Leu 290 295 300 cag gct cag atc cgg aac ctg acc gtg ctg acc ccc gaa ggg gag gca 959 Gln Ala Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Leu Thr Pro Glu Gly Glu Ala 305 310 315 ggg ctg agc tgg ccc gtt ggg ctc cct gct cct ttc aca cca cac tct 1007 Gly Leu Ser Trp Pro Val Gly Leu Pro Ala Pro Phe Thr Pro His Ser 320 325 330 335 cgc ttt gag gtg ctg ggc tgg gac tac ttc aca gag cag cac acc ttc 1055 Arg Phe Glu Val Leu Gly Trp Asp Tyr Phe Thr Glu Gln His Thr Phe 340 345 350 tcc tgt gca gat ggg gct ccc aag tgc cca cta cag ggg gct agc agg 1103 Ser Cys Ala Asp Gly Ala Pro Lys Cys Pro Leu Gln Gly Ala Ser Arg 355 360 365 gcg gac gtg ggt gat gcg ttg gag act gcc ctg gag cag ctc aat cgg 1151 Ala Asp Val Gly Asp Ala Leu Glu Thr Ala Leu Glu Gln Leu Asn Arg 370 375 380 cgc tat cag ccc cgc ctg cgc ttc cag aag cag cga ctg ctc aac ggc 1199 Arg Tyr Gln Pro Arg Leu Arg Phe Gln Lys Gln Arg Leu Leu Asn Gly 385 390 395 tat cgg cgc ttc gac cca gca cgg ggc atg gag tac acc ctg gac ctg 1247 Tyr Arg Arg Phe Asp Pro Ala Arg Gly Met Glu Tyr Thr Leu Asp Leu 400 405 410 415 ctg ttg gaa tgt gtg aca cag cgt ggg cac cgg cgg gcc ctg gct cgc 1295 Leu Leu Glu Cys Val Thr Gln Arg Gly His Arg Arg Ala Leu Ala Arg 420 425 430 agg gtc agc ctg ctg cgg cca ctg agc cgg gtg gaa atc cta cct atg 1343 Arg Val Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Arg Val Glu Ile Leu Pro Met 435 440 445 ccc tat gtc act gag gcc acc cga gtg cag ctg gtg ctg cca ctc ctg 1391 Pro Tyr Val Thr Glu Ala Thr Arg Val Gln Leu Val Leu Pro Leu Leu 450 455 460 gtg gct gaa gct gct gca gcc ccg gct ttc ctc gag gcc ttt gca gcc 1439 Val Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Phe Leu Glu Ala Phe Ala Ala 465 470 475 aat gtc ctg gag cca cga gaa cat gca ttg ctc acc ctg ttg ctg gtc 1487 Asn Val Leu Glu Pro Arg Glu His Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Val 480 485 490 495 tac ggg cca cga gaa ggt ggc cgt gga gct cca gac cca ttt ctt ggg 1535 Tyr Gly Pro Arg Glu Gly Gly Arg Gly Ala Pro Asp Pro Phe Leu Gly 500 505 510 gtg aag gct gca gca gcg gag tta gag cga cgg tac cct ggg acg agg 1583 Val Lys Ala Ala Ala Ala Glu Leu Glu Arg Arg Tyr Pro Gly Thr Arg 515 520 525 ctg gcc tgg ctc gct gtg cga gca gag gcc cct tcc cag gtg cga ctc 1631 Leu Ala Trp Leu Ala Val Arg Ala Glu Ala Pro Ser Gln Val Arg Leu 530 535 540 atg gac gtg gtc tcg aag aag cac cct gtg gac act ctc ttc ttc ctt 1679 Met Asp Val Val Ser Lys Lys His Pro Val Asp Thr Leu Phe Phe Leu 545 550 555 acc acc gtg tgg aca agg cct ggg ccc gaa gtc ctc aac cgc tgt cgc 1727 Thr Thr Val Trp Thr Arg Pro Gly Pro Glu Val Leu Asn Arg Cys Arg 560 565 570 575 atg aat gcc atc tct ggc tgg cag gcc ttc ttt cca gtc cat ttc cag 1775 Met Asn Ala Ile Ser Gly Trp Gln Ala Phe Phe Pro Val His Phe Gln 580 585 590 gag ttc aat cct gcc ctg tca cca cag aga tca ccc cca ggg ccc ccg 1823 Glu Phe Asn Pro Ala Leu Ser Pro Gln Arg Ser Pro Pro Gly Pro Pro 595 600 605 ggg gct ggc cct gac ccc ccc tcc cct cct ggt gct gac ccc tcc cgg 1871 Gly Ala Gly Pro Asp Pro Pro Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Ser Arg 610 615 620 ggg gct cct ata ggg ggg aga ttt gac cgg cag gct tct gcg gag ggc 1919 Gly Ala Pro Ile Gly Gly Arg Phe Asp Arg Gln Ala Ser Ala Glu Gly 625 630 635 tgc ttc tac aac gct gac tac ctg gcg gcc cga gcc cgg ctg gca ggt 1967 Cys Phe Tyr Asn Ala Asp Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Ala Gly 640 645 650 655 gaa ctg gca ggc cag gaa gag gag gaa gcc ctg gag ggg ctg gag gtg 2015 Glu Leu Ala Gly Gln Glu Glu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Leu Glu Val 660 665 670 atg gat gtt ttc ctc cgg ttc tca ggg ctc cac ctc ttt cgg gcc gta 2063 Met Asp Val Phe Leu Arg Phe Ser Gly Leu His Leu Phe Arg Ala Val 675 680 685 gag cca ggg ctg gtg cag aag ttc tcc ctg cga gac tgc agc cca cgg 2111 Glu Pro Gly Leu Val Gln Lys Phe Ser Leu Arg Asp Cys Ser Pro Arg 690 695 700 ctc agt gaa gaa ctc tac cac cgc tgc cgc ctc agc aac ctg gag ggg 2159 Leu Ser Glu Glu Leu Tyr His Arg Cys Arg Leu Ser Asn Leu Glu Gly 705 710 715 cta ggg ggc cgt gcc cag ctg gct atg gct ctc ttt gag cag gag cag 2207 Leu Gly Gly Arg Ala Gln Leu Ala Met Ala Leu Phe Glu Gln Glu Gln 720 725 730 735 gcc aat agc act tag 2222 Ala Asn Ser Thr 740 <210> 4 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: fragment from cDNA of KIAA1402 <400> 4 Ile Gln Gly Glu Gly Glu Asp Pro Cys Val Glu Ala Val Gly Glu Arg 1 5 10 15 Gly Gly Pro Gln Asn Pro Asp Ser Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ser Asp 20 25 30 Glu Asp Phe Lys Pro Arg Ile Val Pro Tyr Tyr Arg Asp Pro Asn Lys 35 40 45 Pro Tyr Lys Lys Val Leu Arg Thr Arg Tyr Ile Gln Thr Glu Leu Gly 50 55 60 Ser Arg Glu Arg Leu Leu Val Ala Val Leu Thr Ser Arg Ala Thr Leu 65 70 75 80 Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Asn Arg Thr Val Ala His His Phe Pro 85 90 95 Arg Leu Leu Tyr Phe Thr Gly Gln Arg Gly Ala Arg Ala Pro Ala Gly 100 105 110 Met Gln Val Val Ser His Gly Asp Glu Arg Pro Ala Trp Leu Met Ser 115 120 125 Glu Thr Leu Arg His Leu His Thr His Phe Gly Ala Asp Tyr Asp Trp 130 135 140 Phe Phe Ile Met Gln Asp Asp Thr Tyr Val Gln Ala Pro Arg Leu Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Gly His Leu Ser Ile Asn Gln Asp Leu Tyr Leu Gly Arg 165 170 175 Ala Glu Glu Phe Ile Gly Ala Gly Glu Gln Ala Arg Tyr Cys His Gly 180 185 190 Gly Phe Gly Tyr Leu Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Arg Leu Arg Pro 195 200 205 His Leu Asp Gly Cys Arg Gly Asp Ile Leu Ser Ala Arg Pro Asp Glu 210 215 220 Trp Leu Gly Arg Cys Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Gly Cys Val Ser 225 230 235 240 Gln His Gln Gly Gln Gln Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Lys Asn Arg 245 250 255 Asp Pro Glu Lys Glu Gly Ser Ser Ala Phe Leu Ser Ala Phe Ala Val 260 265 270 His Pro Val Ser Glu Gly Thr Leu Met Tyr Arg Leu His Lys Arg Phe 275 280 285 Ser Ala Leu Glu Leu Glu Arg Ala Tyr Ser Glu Ile Glu Gln Leu Gln 290 295 300 Ala Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Leu Thr Pro Glu Gly Glu Ala Gly 305 310 315 320 Leu Ser Trp Pro Val Gly Leu Pro Ala Pro Phe Thr Pro His Ser Arg 325 330 335 Phe Glu Val Leu Gly Trp Asp Tyr Phe Thr Glu Gln His Thr Phe Ser 340 345 350 Cys Ala Asp Gly Ala Pro Lys Cys Pro Leu Gln Gly Ala Ser Arg Ala 355 360 365 Asp Val Gly Asp Ala Leu Glu Thr Ala Leu Glu Gln Leu Asn Arg Arg 370 375 380 Tyr Gln Pro Arg Leu Arg Phe Gln Lys Gln Arg Leu Leu Asn Gly Tyr 385 390 395 400 Arg Arg Phe Asp Pro Ala Arg Gly Met Glu Tyr Thr Leu Asp Leu Leu 405 410 415 Leu Glu Cys Val Thr Gln Arg Gly His Arg Arg Ala Leu Ala Arg Arg 420 425 430 Val Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Arg Val Glu Ile Leu Pro Met Pro 435 440 445 Tyr Val Thr Glu Ala Thr Arg Val Gln Leu Val Leu Pro Leu Leu Val 450 455 460 Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Phe Leu Glu Ala Phe Ala Ala Asn 465 470 475 480 Val Leu Glu Pro Arg Glu His Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Val Tyr 485 490 495 Gly Pro Arg Glu Gly Gly Arg Gly Ala Pro Asp Pro Phe Leu Gly Val 500 505 510 Lys Ala Ala Ala Ala Glu Leu Glu Arg Arg Tyr Pro Gly Thr Arg Leu 515 520 525 Ala Trp Leu Ala Val Arg Ala Glu Ala Pro Ser Gln Val Arg Leu Met 530 535 540 Asp Val Val Ser Lys Lys His Pro Val Asp Thr Leu Phe Phe Leu Thr 545 550 555 560 Thr Val Trp Thr Arg Pro Gly Pro Glu Val Leu Asn Arg Cys Arg Met 565 570 575 Asn Ala Ile Ser Gly Trp Gln Ala Phe Phe Pro Val His Phe Gln Glu 580 585 590 Phe Asn Pro Ala Leu Ser Pro Gln Arg Ser Pro Pro Gly Pro Pro Gly 595 600 605 Ala Gly Pro Asp Pro Pro Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Ser Arg Gly 610 615 620 Ala Pro Ile Gly Gly Arg Phe Asp Arg Gln Ala Ser Ala Glu Gly Cys 625 630 635 640 Phe Tyr Asn Ala Asp Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Ala Gly Glu 645 650 655 Leu Ala Gly Gln Glu Glu Glu Glu Ala Leu Glu Gly Leu Glu Val Met 660 665 670 Asp Val Phe Leu Arg Phe Ser Gly Leu His Leu Phe Arg Ala Val Glu 675 680 685 Pro Gly Leu Val Gln Lys Phe Ser Leu Arg Asp Cys Ser Pro Arg Leu 690 695 700 Ser Glu Glu Leu Tyr His Arg Cys Arg Leu Ser Asn Leu Glu Gly Leu 705 710 715 720 Gly Gly Arg Ala Gln Leu Ala Met Ala Leu Phe Glu Gln Glu Gln Ala 725 730 735 Asn Ser Thr <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' primer for quantitative PCR method <400> 5 gtgaaataga acaactgcag gctc 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3' primer for quantitative PCR method <400> 6 gagaaggtgt gctgctctgt ga 22 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Probe for quantitative PCR method <400> 7 cggaacctga ccgtgc 16
【0062】
【図面の簡単な説明】
【図1】 各形質転換体の培養物をウエスタンブロッテ
ィング法により解析した写真である。矢印は本発明物質
のバンドを示す。図中「Transient」は一時的導入株、
「Stable」は安定導入株、「Mock」は陰性対照、「K2」
〜「2-21」は本発明物質をコードする遺伝子を導入した
株を示す。また「Medium」は培養上清を示し、「Cell l
ayer」は細胞溶解液を示す。
【図2】 コンドロイチンに対するN-アセチルガラクト
サミン転移活性を示す図である。縦軸はN-アセチルガラ
クトサミン転移酵素活性を試験チューブあたりの放射能
により示し、横軸は画分番号を示す。白丸は本発明物質
を、黒丸は陽性対照を示す。
【図3】 コンドロイチン硫酸6糖に対するN-アセチル
ガラクトサミン転移酵素活性を示す図である。縦軸はN-
アセチルガラクトサミン転移酵素活性を試験チューブあ
たりの放射能により示し、横軸は画分番号を示す。白丸
は本発明物質を、黒丸は陽性対照を示す。
【図4】 コンドロイチンに対するグルクロン酸転移活
性を示す図である。縦軸はグルクロン酸転移酵素活性を
試験チューブあたりの放射能により示し、横軸は画分番
号を示す。白丸は本発明物質を、黒丸は陽性対照を示
す。
【図5】 コンドロイチン硫酸7糖に対するグルクロン
酸転移活性を示す図である。縦軸はグルクロン酸転移酵
素活性を試験チューブあたりの放射能により示し、横軸
は画分番号を示す。白丸は本発明物質を、黒丸は陽性対
照を示す。
【図6】 エチレンジアミン四酢酸によるグルクロン酸
転移活性の阻害を示す図である。縦軸はグルクロン酸転
移酵素活性を試験チューブあたりの放射能により示し、
横軸は画分番号を示す。白丸はエチレンジアミン四酢酸
非存在下での本発明物質を、黒丸はエチレンジアミン四
酢酸存在下での本発明物質を、白い四角は陰性対照を示
す。
【図7】 コンドロイチン硫酸7糖にグルクロン酸が転
移されて生じたコンドロイチン硫酸8糖とその酵素分解
による影響を示す図である。縦軸は試験チューブあたり
14Cによる放射能により示し、横軸は画分番号を示
す。白丸は本発明物質によって調製したコンドロイチン
硫酸8糖を、黒丸は前記コンドロイチン硫酸8糖をコンド
ロイチナーゼABCで消化した産物を示す。
【図8】 コンドロイチン硫酸11糖の濃度を変化させた
場合に現れるグルクロン酸転移活性への影響を示す図で
ある。縦軸はグルクロン酸転移酵素活性を示し、横軸は
コンドロイチン硫酸11糖の濃度を示す。
【図9】 UDP-GlcUAの濃度を変化させた場合に現れる
グルクロン酸転移活性への影響を示す図である。縦軸は
グルクロン酸転移酵素活性を示し、横軸はUDP-GlcUAの
濃度を示す。
【図10】 ヒト健常組織及び株化細胞における本発明
酵素の発現を定量的PCR反応で測定した図である。縦軸
はグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素の発現量
(対照)に対するグルクロン酸転移酵素遺伝子発現量の
割合を示し、横軸は被験ヒト正常組織名及び被験株化細
胞名を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/19 C12N 1/21 1/21 9/00 5/10 9/10 9/00 C12P 19/26 9/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 19/26 5/00 A (72)発明者 木全 弘治 愛知県名古屋市名東区社口2−102−1 エスポア社口1201 (72)発明者 後藤 雅式 茨城県つくば市梅園1−1−1 独立行政 法人産業技術総合研究所内 (72)発明者 矢田 俊量 三重県桑名市西矢田町27−2 Fターム(参考) 4B024 AA20 BA07 BA10 BA80 CA01 CA07 DA02 EA04 GA11 HA01 HA03 4B050 CC04 CC05 DD11 FF14E LL05 4B064 AF21 CA10 CA21 CB30 CE10 DA01 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 AC15 BA02 BA25 BD14 CA24 CA29 CA44 CA60 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 BA41 CA40 DA75 DA89 EA20 EA60 FA72 FA74 GA26

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配列
    番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の置
    換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列からな
    るポリペプチドと、識別ペプチドとが融合してなり、グ
    ルクロン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在する
    非還元末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロ
    ン酸を転移する酵素活性を有することを特徴とする融合
    タンパク質。
  2. 【請求項2】 グルクロン酸供与体から、非還元末端が
    N-アセチルガラクトサミン残基であり、コンドロイチン
    骨格を有する7糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラ
    クトサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、N-
    アセチルガラクトサミン供与体から、非還元末端がグル
    クロン酸残基であり、コンドロイチン骨格を有する6糖
    からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的に
    N-アセチルガラクトサミン残基を転移する活性を有しな
    いことを特徴とする請求項1記載の融合タンパク質。
  3. 【請求項3】 識別ペプチドがシグナルペプチド、プロ
    テインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵
    素、Hisタグ、mycタグ、FLAGタンパク質、T7タグ、Sタ
    グ、HSVタグ、pelB、HAタグ、Trxタグ、CBPタグ、CBDタ
    グ、CBRタグ、β-lac/blu、β-gal、luc、HP-Thio、HS
    P、Lnγ、Fn、GFP、YFP、CFP、BFP、DsRed、DsRed2、MB
    P、LacZ、IgG、アビジン、及びプロテインGからなる群
    から選択されるいずれか一のペプチドであることを特徴
    とする請求項1又は2記載の融合タンパク質。
  4. 【請求項4】 請求項1〜3いずれか一項記載の融合タ
    ンパク質をコードするDNA。
  5. 【請求項5】 請求項4記載のDNAを含むベクター。
  6. 【請求項6】 請求項5記載のベクターが宿主細胞に導
    入されてなる形質転換体。
  7. 【請求項7】 請求項6記載の形質転換体を生育させ、
    生育物から融合タンパク質を単離することを特徴とする
    請求項1〜3いずれか一項記載の融合タンパク質の製造
    方法。
  8. 【請求項8】 請求項1〜3何れか一項記載の融合タン
    パク質を特異的に認識することを特徴とする抗体。
  9. 【請求項9】 下記性質を有するグルクロン酸転移酵
    素。 (a)作用 グルクロン酸供与体から、受容体であるN-アセチルガラ
    クトサミン残基にグルクロン酸残基を転移する。 (b)基質特異性 グルクロン酸供与体から、非還元末端がN-アセチルガラ
    クトサミン残基であり、コンドロイチン骨格を有する7
    糖からなるオリゴ糖の該N-アセチルガラクトサミンに対
    してグルクロン酸残基を転移するが、N-アセチルガラク
    トサミン供与体から、非還元末端がグルクロン酸残基で
    あり、コンドロイチン骨格を有する6糖からなるオリゴ
    糖の該グルクロン酸に対しては実質的にN-アセチルガラ
    クトサミン残基を転移する活性を有しない。 (c)活性の阻害 エチレンジアミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に
    示さない。
  10. 【請求項10】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配
    列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の
    置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を含
    むことを特徴とする請求項9記載のグルクロン酸転移酵
    素。
  11. 【請求項11】 非還元末端にN-アセチルガラクトサミ
    ン残基を有するとともにコンドロイチン骨格を有する糖
    鎖に対し、請求項1〜3いずれか一項記載の融合タンパ
    ク質或いは請求項9又は10記載のグルクロン酸転移酵
    素を作用させ、グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元
    末端のN-アセチルガラクトサミン残基にグルクロン酸を
    転移することを特徴とする、コンドロイチン骨格を有す
    る糖鎖の製造方法。
  12. 【請求項12】 配列番号4記載のアミノ酸配列又は配
    列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構成アミノ酸の
    置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列から
    なるポリペプチドを含むタンパク質を含有し、非還元末
    端にN-アセチルガラクトサミン残基を有するコンドロイ
    チン骨格からなる糖鎖にグルクロン酸供与体からグルク
    ロン酸を転移する活性を有する糖鎖合成剤。
  13. 【請求項13】 タンパク質が配列番号4記載のアミノ
    酸配列又は配列番号4記載のアミノ酸配列に1以上の構
    成アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は転位を有するアミ
    ノ酸配列からなるポリペプチドと識別ペプチドとの融合
    タンパク質を含むことを特徴とする請求項12記載の糖
    鎖合成剤。
JP2003030398A 2002-02-08 2003-02-07 グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質 Expired - Fee Related JP4275960B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003030398A JP4275960B2 (ja) 2002-02-08 2003-02-07 グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002033042 2002-02-08
JP2002-33042 2002-02-08
JP2003030398A JP4275960B2 (ja) 2002-02-08 2003-02-07 グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003299488A true JP2003299488A (ja) 2003-10-21
JP4275960B2 JP4275960B2 (ja) 2009-06-10

Family

ID=29405030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003030398A Expired - Fee Related JP4275960B2 (ja) 2002-02-08 2003-02-07 グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4275960B2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022227880A1 (zh) * 2021-04-29 2022-11-03 温州医科大学 一种新型磷酸化腺苷酰化酶及其制备方法与应用
CN118147105A (zh) * 2024-05-09 2024-06-07 西宝生物科技(上海)股份有限公司 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法
CN118147105B (zh) * 2024-05-09 2024-08-02 西宝生物科技(上海)股份有限公司 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022227880A1 (zh) * 2021-04-29 2022-11-03 温州医科大学 一种新型磷酸化腺苷酰化酶及其制备方法与应用
CN118147105A (zh) * 2024-05-09 2024-06-07 西宝生物科技(上海)股份有限公司 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法
CN118147105B (zh) * 2024-05-09 2024-08-02 西宝生物科技(上海)股份有限公司 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP4275960B2 (ja) 2009-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU706747B2 (en) Antibody specific for beta1-&gt;6N- acetylglucosamininyltransferase
JPH09503905A (ja) 糖組成物の合成方法
JP2002530071A (ja) UDPガラクトース:β−N−アセチル−グルコサミンβ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ、β3Gal−T5
US7470529B2 (en) Chondroitin synthase and nucleic acid encoding the enzyme
CN114369584B (zh) 重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用
JP4333880B2 (ja) コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードするdna
JP2007020403A (ja) 新規糖鎖認識蛋白質及びその遺伝子
JP2001224377A (ja) α1,4−ガラクトース転移酵素およびそれをコードするDNA
JP2003047467A (ja) コンドロイチン合成酵素
JP3921271B2 (ja) グルクロン酸転移酵素をコードするdna
JP4275960B2 (ja) グルクロン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質
JP4155779B2 (ja) 糖鎖硫酸化剤
JP2942813B2 (ja) 新規なヒアルロン酸合成酵素のポリペプチド及びそれをコードするdna
WO2003072773A1 (fr) Proteine fusionnee ayant une activite de glucuronyltransferase
JP2002503082A (ja) Gdp―フコースピロホスホリラーゼをコードする核酸
JP4288327B2 (ja) 硫酸基転移酵素、そのポリペプチド及びそれをコードするdna
JP4629214B2 (ja) N−アセチルグルコサミン転移酵素
US7232675B2 (en) Sulfotransferase, its polypeptide and DNA encoding the same
Day et al. Eph/Ephrin membrane proteins: a mammalian expression vector pTIg-BOS-Fc allowing rapid protein purification
JPH10295371A (ja) ラクトシルセラミド合成酵素及びその遺伝子
JP3889863B2 (ja) 糖転移酵素遺伝子
JP2001078780A (ja) マスト細胞特異的シグナル伝達分子とそのcDNA
JP2839837B2 (ja) 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているdna
JP2003164291A (ja) 新規コンドロイチン合成酵素
JP2002209586A (ja) 膜貫通領域欠如型n−アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素をコードするdna

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060112

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080711

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080904

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20081126

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090126

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20090224

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090305

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120313

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130313

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130313

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140313

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313118

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R371 Transfer withdrawn

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313118

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees