JPH11313684A - Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基
転移酵素のポリペプチド、及びこれをコードするＤＮＡ
を提供する。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
ド。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ）のポリ
ペプチド及びそれをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】以下に本発明に最も近い技術について説
明する。Biochem.J.,319,209-216(1996)及びJ.Biol.Che
m.,272,29493-29501(1997)には、ラット及びヒトのミク
ロソーム画分中にＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−
硫酸基転移酵素活性が存在することが記載されている。
しかし、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転
移酵素のポリペプチドの単離及び物質同定についての報
告はなく、またこのポリペプチドをコードするDNAにつ
いても知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドが得られ
れば、L-セレクチン(リンパ球のホーミングや炎症初期
に起こる白血球のローリング等に関与している)のリガ
ンドであるGlyCAM-1等の糖鎖の合成に用いることができ
る。またこのポリペプチドをコードするDNAは、当該ポ
リペプチドの大量生産への利用や、遺伝子移入による生
体内(細胞)でのGlyCAM-1(NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-
3)(SO₄-6)GlcNAc-構造を有する)の人工的合成等への利
用が期待される。

【０００４】すなわち本発明は、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチド、及びこ
れをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、GlcNAcβ
1-3Galβ1-4GlcNAc(GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン
残基を、Galはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリ
コシド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ
示す)の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の
６位水酸基に特異的に硫酸基を転移する活性を有する、
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素の
ポリペプチドをコードするDNAのクローニングに成功し
た。また該DNAによりＮ−アセチルグルコサミン−６−
Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドが発現されることを
確認し、該ポリペプチドを同定することに成功して本発
明を完成させた。

【０００６】すなわち本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）のポリペプチド（以下「本発明ポリペプチド」と
もいう）を提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）

【０００７】本発明ポリペプチドには、以下の（ａ）又
は（ｂ）のポリペプチドも包含される。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）

【０００８】また本発明ポリペプチドには、下記の性質
を有するポリペプチドも包含される。 作用：硫酸基供与体から、下記式１で示されるオリゴ
糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位
水酸基に硫酸基を転移する。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す） 基質特異性：コンドロイチン、コンドロイチン4-硫
酸、コンドロイチン6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン
硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃
由来ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン及び下記式２で示さ
れるオリゴ糖には硫酸基を転移しない。 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式２） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す） Ｎ末端のアミノ酸配列 配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４８で表されるア
ミノ酸配列からなる。

【０００９】また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下「本発明DNA」
ともいう）を提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）

【００１０】また本発明DNAには、以下の（ａ）又は
（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡも包含され
る。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）

【００１１】本発明DNAとしてより好ましいものとし
て、配列番号１において塩基番号４７０〜１９１８で表
される塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号３において
塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含むＤ
ＮＡが挙げられる。

【００１２】また本発明には、上記に記載のポリペプチ
ドを、下記式３で示される糖鎖に作用させる工程を少な
くとも含む、下記式４で示される硫酸化糖の製造方法
（以下「本発明製造方法１」ともいう）を提供する。 GlcNAc−Ｒ（式３） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−
Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ
示す） (SO₄-6)GlcNAc−Ｒ（式４） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SO
₄-6は６位の水酸基が硫酸化されていることを、−Ｒは
水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示
す）

【００１３】また本発明は、本発明ＤＮＡを細胞に移入
し、次いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫
酸化糖の製造方法（以下「本発明製造方法２」ともい
う）を提供する。この製造方法の好ましい態様として、
本発明ＤＮＡ及びフコシルトランスフェラーゼをコード
するｃＤＮＡを共に細胞に移入する態様が挙げられる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。なお、以下特にことわりがない限り、Galはガ
ラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン
残基を、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸残基を、Fuc
はフコース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合を、β
1-4はβ1-4グリコシド結合を、α2-3はα2-3グリコシド
結合を、α1-3はα1-3グリコシド結合を、SO₄-6は６位
の水酸基が硫酸化されていることを、Cerはセラミド残
基をそれぞれ示す。

【００１５】＜１＞本発明ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリ
ペプチドである。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） この中でも、（ａ）のポリペプチドが好ましい。

【００１６】なお本明細書中において、「１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミ
ノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１(Glc
NAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc)で示されるオリゴ糖の非還元
末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫
酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、
硫酸基供与体から、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの非還
元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に
硫酸基を選択的に転移する活性を実質的に害さない１も
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位
を有していてもよいことを示す。

【００１７】すなわち、天然に存在するポリペプチドに
は、それをコードするDNAの多形や変異の他、生成後の
ポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによ
ってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず
変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生
物学的活性を示すものがあることが知られている。この
ように構造的に若干の差違があってもその機能について
は大きな違いが認められないものも、本発明ポリペプチ
ドに包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列
に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この
場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能
である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）
のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置
換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持す
ることが知られている(Science,224,1431(1984))。ま
た、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプ
チド領域を有していることが知られている。例えば、細
胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプ
チドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列な
どがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、
または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去され
る。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった
形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポ
リペプチドであり、本発明ポリペプチドに包含されるも
のである。

【００１８】なお本明細書における「数個のアミノ酸」
とは本発明ポリペプチドの活性が失われない程度の変異
を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００ア
ミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下
の数を示す。

【００１９】なお、硫酸基供与体から、GlcNAcβ1-3Gal
β1-4GlcNAcで示されるオリゴ糖の非還元末端のＮ−ア
セチルグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移す
る酵素活性は、後述の本発明ポリペプチド活性の測定方
法を用いることによって測定できる。よって当業者であ
れば、本発明ポリペプチド活性の有無を指標として、該
活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができ
る。

【００２０】なおこのポリペプチドは、もともとはマウ
スから得られたものであるが、遺伝子工学的手法や化学
合成等により製造されたポリペプチドも当然に包含され
る。また本発明ポリペプチドには、以下の（ａ）又は
（ｂ）のポリペプチドも包含される。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１）

【００２１】この中でも（ａ）のポリペプチド（配列番
号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が、前記の
本発明ポリペプチドの（ａ）(配列番号２のアミノ酸配
列からなるポリペプチド)と８５％以上の相同性を有す
ることから好ましい。このように、本発明ポリペプチド
には、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
と８５％以上の相同性を有するポリペプチドも包含され
る。

【００２２】なおこのポリペプチドは、もともとはヒト
から得られたものであるが、遺伝子工学的手法や化学合
成等により製造されたポリペプチドも当然に包含され
る。

【００２３】また本発明ポリペプチドには、下記の性質
を有するポリペプチドも包含される。 作用：硫酸基供与体から、下記式１で示されるオリゴ
糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位
水酸基に硫酸基を転移する。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） 基質特異性：コンドロイチン、コンドロイチン4-硫
酸、コンドロイチン6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン
硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃
由来ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン及び下記式２で示さ
れるオリゴ糖には硫酸基を転移しない。 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式２） Ｎ末端のアミノ酸配列 配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４８で表されるア
ミノ酸配列からなる。

【００２４】なお本発明ポリペプチドにおいて、硫酸基
供与体としては3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸(以
下、PAPSともいう)が好ましい。これら本発明ポリペプ
チドは、本発明によりそのアミノ酸配列や性質が開示さ
れたので、天然物からの単離・精製や、化学合成等によ
って製造することも可能であるが、後述の本発明DNAを
用いて製造することが好ましい。本発明DNAを用いた本
発明ポリペプチドの製造方法については後述する。なお
本発明ポリペプチドは、必ずしも単独のポリペプチドで
なくてもよく、必要により融合タンパク質の一部となっ
ていてもよい。例えば、本発明ポリペプチドと、発現に
必要な他のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドが例
示される。

【００２５】本発明ポリペプチドは、硫酸基供与体か
ら、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの非還元末端のＮ−ア
セチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基
を転移する作用を有しているので、非還元末端のＮ−ア
セチルグルコサミン残基の６位特異的硫酸化やGlyCAM-1
構造を有する糖鎖等の合成に利用できる。

【００２６】＜２＞本発明DNA 本発明DNAは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
をコードするＤＮＡである。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAが好
ましい。

【００２７】このようなDNAとして具体的には、例えば
配列番号１において塩基番号４７０〜１９１８で表され
る塩基配列を含むＤＮＡが例示される。なおこのDNA
は、もともとはマウス由来のものであるが、その由来は
限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造さ
れたDNAも当然に包含される。

【００２８】また本発明DNAには、以下の（ａ）又は
（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡも包含され
る。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） この中でも（ａ）のポリペプチドをコードするDNAは、
当該DNAによってコードされる本発明ポリペプチドが配
列番号２のアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドと
８５％以上の相同性を有することから好ましい。

【００２９】このようなDNAとして具体的には、例えば
配列番号３において塩基番号３９０〜１８４１で表され
る塩基配列を含むＤＮＡが例示される。なおこのDNA
は、もともとはヒト由来のものであるが、その由来は限
定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造され
たDNAも当然に包含される。

【００３０】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するDNAも本発明DNAに包含されることは、当業
者であれば容易に理解されるところである。また、本発
明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA又はRNAも包含され
る。さらに本発明DNAは、本発明ポリペプチドをコード
するコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖
およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖またはRNA
鎖からなる二本鎖であってもよい。

【００３１】なお前記＜１＞で述べた通り、本発明ポリ
ペプチドとは構造的に若干の差違があっても、その機能
については大きな違いが認められないようなポリペプチ
ドも本発明ポリペプチドに包含される。本発明ＤＮＡも
同様に、本発明ポリペプチドとは構造的に若干の差違が
あっても、その機能については大きな違いが認められな
いようなポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明Ｄ
ＮＡに包含される。

【００３２】具体的には、ＤＮＡの多形や変異等によっ
て本発明ＤＮＡとは構造的に若干の差違があるが、本発
明ポリペプチドとほぼ同等の機能を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡが挙げられる。

【００３３】また染色体由来の本発明ポリペプチドの遺
伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想され
るが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断
片であっても、本発明ポリペプチドをコードする限り、
本発明ＤＮＡに包含される。すなわち、本明細書におい
て「コードする」とは、転写時にプロセッシング等を受
けて最終的に目的のポリペプチドを発現し得る塩基配列
を有することも包含する。

【００３４】なお本発明DNAにおいて、硫酸基供与体と
してはPAPSが好ましい。

【００３５】１．本発明ＤＮＡの製造方法 本発明DNAは、その塩基配列が本発明により明らかにさ
れたので、その配列に基づいて合成し、あるいはその配
列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを
用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発
明ＤＮＡを増幅することによって取得することも可能で
ある。なお本発明DNAは、後記実施例に示すように、以
下に示す各工程からなるcDNAクローニングによって初め
て得られたものである。

【００３６】(1)マウス由来の本発明DNAの製造 ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの作製。 マウスの全ＲＮＡを鋳型とした逆転写ＰＣＲ(ＲＴ−
ＰＣＲ)による増幅。

【００３７】ＰＣＲ産物を用いた、マウスcDNAライブ
ラリーからの本発明DNAのスクリーニング。

【００３８】(2)ヒト由来の本発明DNAの製造 上記(1)で得られたcDNAを用いた、ヒトcDNAライブ
ラリーからの本発明DNAのスクリーニング。

【００３９】得られたcDNAの塩基配列解析。 しかし本発明DNAの製造方法はこれに限定されるもので
はなく、他の公知のcDNAクローニングの手法によっても
製造することができる。

【００４０】以下に、本発明ＤＮＡの製造方法の一例を
具体的に説明する。

【００４１】(1)ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマ
ーの作製。 マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼ
の触媒部位と相同性を有するマウスの発現配列tag(expr
essed sequence tag)(EST)配列(Genbank accession番
号：AA103962)をベースにして、オリゴヌクレオチドプ
ライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマ
ー）を作製する。オリゴヌクレオチドプライマーとして
具体的には、センスプライマーとして 5'-GTCGTCGGACTG
GTGGACGA-3'（配列番号５）が、アンチセンスプライマ
ーとして 5'-CCCAGAGCGTGGTAGTCTGC-3'（配列番号６）
がそれぞれ挙げられ、かつ好ましい。

【００４２】(2)マウスの全ＲＮＡを鋳型としたＲＴ−
ＰＣＲによる増幅。 全ＲＮＡは、公知の方法（例えば、Kingston, R. S.,
(1991) in Current Protocols in Molecular Biology,
Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates
and Wiley Interscience, New Yorkなど）で得ることが
できる。材料は、本発明ポリペプチドのｍＲＮＡを発現
している材料であれば限定されないが、マウスの胚、例
えば１３日胚等を用いることができる。

【００４３】この全RNAを鋳型とし、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、本発明ポリ
ペプチドの部分的ｃＤＮＡを増幅することができる。Ｐ
ＣＲは、通常の方法と同様に行えばよい。

【００４４】(3)ＰＣＲ産物を用いた、マウスcDNAライ
ブラリーからの本発明DNAのスクリーニング。 上記(2)のＲＴ−ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を³²Ｐ等
でラベルし、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ（本発
明DNA）断片をスクリーニングするためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いることができる。用いる
ことができるマウスcDNAライブラリーは特に限定されな
いが、例えばマウス胚cDNAを保持するλgt11ライブラリ
ー(λgt11マウス胚cDNAライブラリー)を例示することが
できる。

【００４５】ハイブリダイゼーションは公知の方法(例
えば、J.Biol.Chem.,270,18575-18580(1995))により行
うことができる。DNAインサートはEcoRI消化によって陽
性クローンから分離し、例えばpBluescript II SK-(ス
トラタジーン(STRATAGENE)社)等にサブクローニングす
る。その後塩基配列を、例えばジデオキシチェインター
ミネーション法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5
467(1977))等の公知の方法により決定することができ
る。

【００４６】これら一連の方法により得られた本発明DN
Aの塩基配列、及びこの塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２
に示す。

【００４７】(4)上記で得られたcDNA(マウス由来)を用
いた、ヒトcDNAライブラリーのスクリーニング及び塩基
配列解析。 上記で得られたcDNA(マウス由来)を用いてヒトのcDNAラ
イブラリー(例えば、ヒト胎児脳のｃＤＮＡを保持する
λｇｔ１１ライブラリー等)をスクリーニングすること
によって、ヒト由来の本発明DNAを得ることができる。
この塩基配列も、上記と同様の方法によって決定するこ
とができる。

【００４８】この方法により得られた本発明DNAの塩基
配列、及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を
配列番号３に、アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。

【００４９】２．本発明DNAを用いた本発明ポリペプチ
ドの製造方法 本発明ＤＮＡを移入した細胞を、好適な培地で培養し、
本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生
成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプチドを採取
することによって、本発明ポリペプチドを製造すること
ができる。

【００５０】本発明ＤＮＡを移入した細胞は、公知の発
現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換プラス
ミドを構築し、この組換プラスミドを細胞に移入するこ
とによって得ることができる。ここで用いる本発明DNA
は、本発明DNAである限りにおいて特に限定されない
が、配列番号１における塩基番号４７０〜１９１８で表
される塩基配列を含むDNAが好ましく、なかでも配列番
号１における塩基番号４６７〜１９２１で表される塩基
配列からなるDNAが特に好ましい。また配列番号３にお
いて塩基番号３９０〜１８４１で表される塩基配列を含
むＤＮＡも好ましく、なかでも配列番号３における塩基
番号３８７〜１８４４で表される塩基配列からなるDNA
が特に好ましい。

【００５１】細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳
類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細
胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるポ
リペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付加
されていない本発明ポリペプチドを得ることが可能であ
り、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、本
発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖が
付加しうるため、糖鎖を含む本発明ポリペプチドの形態
で得ることも可能である。

【００５２】この製造方法においては、タンパク質の製
造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することが
でき、例えば、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類由来の培養細
胞と、pcDNA3発現ベクター(インビトロジェン(Invitrog
en)社)等の哺乳類細胞発現ベクターとの組み合わせを採
用することが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主
すなわち細胞に合わせて適宜選択される。

【００５３】本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、
他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させ
てもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよ
いし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。

【００５４】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行う
ことができる。なお培養物には、培地および当該培地中
の細胞が包含される。

【００５５】本発明ポリペプチドの抽出方法として具体
的には、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処
理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽
出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処
理操作が挙げられる。

【００５６】例えば、本発明ポリペプチドを上記培養物
から抽出する場合には、ホモジナイズが好ましい。より
具体的には、培養物から細胞を集め、これに緩衝液(界
面活性剤を適宜含有させてもよい)を添加して細胞懸濁
液とし、ホモジナイザーでホモジナイズした後、遠心分
離等の分離手段で細胞残渣と上清液(抽出液)とに分離す
ることにより抽出を行うことができ、かつ好ましい。

【００５７】抽出液からの本発明ポリペプチドの精製方
法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や
硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾
過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、
これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。

【００５８】精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、
作用、基質特異性等を分析し、前記＜１＞で説明した本
発明ポリペプチドの物性と比較することにより、本発明
ポリペプチドの製造が確認できる。

【００５９】本発明DNAは、本発明ポリペプチドの大量
生産や、生体内(細胞)でのGlyCAM-1の人工的合成等への
利用が期待される。

【００６０】＜３＞本発明製造方法１ 本発明製造方法１は、本発明ポリペプチドを、下記式３
で示される糖鎖に作用させる工程を少なくとも含む、下
記式４で示される硫酸化糖の製造方法である。 GlcNAc−Ｒ（式３） (SO₄-6)GlcNAc−Ｒ（式４） （−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示
す）

【００６１】本発明製造方法１において用いることがで
きる本発明ポリペプチドは、本発明ポリペプチドである
限りにおいて特に限定されない。またここで用いること
ができる本発明ポリペプチドは、本発明ポリペプチドの
作用が実質的に害されない限りにおいては完全に精製さ
れている必要はなく、部分精製されたものや、細胞抽出
物であってもよい。

【００６２】本発明製造方法１は、本発明ポリペプチド
が、硫酸基供与体から硫酸基を、非還元末端に存在する
Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に特異的に
転移する酵素活性を有していることを見い出し、これを
硫酸化糖の製造に応用したものである。従って本発明製
造方法１において最も重要かつ必須なのは上記式３及び
４における−Ｒ以外の部分であり、逆に−Ｒは任意の構
造で良く、糖残基の構造も特に限定されない。例えば−
Ｒは、末端に脂質(例えばセラミド残基等)を有する糖鎖
(糖脂質)等であってもよい。

【００６３】上記式３及び４は、それぞれ下記式５及び
６で示される糖鎖であることが好ましい。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc−Ｒ’（式５） (SO₄-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc−Ｒ’（式６） （−Ｒ’は水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示
す） なおＲ’は、水素原子又は１〜１５糖の糖鎖が好まし
く、水素原子又は１〜１０糖の糖鎖がより好ましく、水
素原子又は１〜２糖の糖鎖が特に好ましく、水素原子が
極めて好ましい。また−Ｒ’が糖鎖の場合、−Ｒ’は(-
3Galβ1-4GlcNAcβ1-)（ラクトサミン）の繰り返し構造
を基本骨格とするものが好ましい。この場合、−Ｒ’の
基本骨格にはシアル酸残基、フコース残基、硫酸基等が
付加していても良い。

【００６４】本発明製造方法１において、本発明ポリペ
プチドを、上記式３で示される糖鎖に作用させる場合、
硫酸基供与体を共存させておくことが好ましい。なお本
発明製造方法１において、硫酸基供与体としてはPAPSが
好ましい。

【００６５】本発明ポリペプチドを上記式３で示される
糖鎖に作用させる反応は、本発明ポリペプチド、上記式
３で示される糖鎖及び硫酸基供与体を共存させることに
より行うことができる。この時のｐＨは、本発明ポリペ
プチドの活性が保持されている限りにおいて特に限定さ
れないが、中性ｐＨ付近（例えばｐＨ６．８程度）の条
件下で反応を行うことが好ましく、該ｐＨ下で緩衝作用
を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。ま
たこの時の温度は、本発明ポリペプチドの活性が保持さ
れている限りにおいて特に限定されないが、３０〜４０
℃程度が例示される。また本発明ポリペプチドの活性を
増加させる物質がある場合は、その物質を添加しても良
い。反応時間は、用いる糖鎖、硫酸基供与体及び本発明
ポリペプチドの量、並びにその他の反応条件に応じて当
業者が適宜決定できる。反応の際、MnCl₂等を共存させ
てもよい。

【００６６】少量生産であれば、上記式３で示される糖
鎖及び硫酸基供与体の共存下に、本発明ポリペプチドを
存在させて該ポリペプチドを作用させれば良いが、大量
生産する場合は、適当な固相（ビーズ等）に本発明ポリ
ペプチドを結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析
膜等を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に本発明
ポリペプチドを作用させることもできる。また硫酸基供
与体を再生(合成)するバイオリアクターを組み合わせて
用いても良い。

【００６７】本発明ポリペプチドの作用により、上記式
３で示される糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチル
グルコサミン残基の６位水酸基に特異的に硫酸基が導入
され、上記式４で示される糖鎖が生成する。反応液から
上記式４で示される糖鎖を回収するには、通常の糖鎖の
分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着ク
ロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロ
マトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアル
コール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいは
これらの組み合わせ等の操作により行うことができる
が、これらに限定されるものではない。

【００６８】得られた上記式４で示される糖鎖は、例え
ばGlyCAM-1やその糖鎖基本骨格製造の中間体として利用
され得る。

【００６９】＜４＞本発明製造方法２ 本発明製造方法２は、本発明ＤＮＡを細胞に移入し、次
いで該細胞を培養する工程を少なくとも含む、硫酸化糖
の製造方法である。

【００７０】このような工程を少なくとも含む限りにお
いては、他の工程を追加したとしても本発明製造方法２
に包含される。例えば、本発明ＤＮＡを移入した細胞を
好適な培地で培養し、その培養物から細胞を分離し、当
該細胞上に発現した硫酸化糖を採取することによる硫酸
化糖の製造方法も、本発明製造方法２に包含される。

【００７１】なお、硫酸化糖は必ずしも細胞から分離、
精製する必要はなく、硫酸化糖が細胞表面に発現した細
胞自体を所望の場合は、培養物中の細胞を採取してその
まま用いることもできる。

【００７２】本発明ＤＮＡの細胞への移入は、DEAE-デ
キストラン、リン酸カルシウム、ポリブレン等を用いた
公知の方法や、その他遺伝子工学分野において公知の方
法で行うことができる。

【００７３】細胞に移入させる本発明DNAは、公知の発
現ベクターに本発明DNAが挿入された組換プラスミドの
形態で細胞に移入することが好ましい。ここで用いる本
発明DNAは、本発明DNAである限りにおいて特に限定され
ないが、配列番号１における塩基番号４７０〜１９１８
で表される塩基配列を含むDNAが好ましく、なかでも配
列番号１における塩基番号４６７〜１９２１で表される
塩基配列からなるDNAが特に好ましい。

【００７４】細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳
類細胞等の真核細胞が例示される。この製造方法におい
ては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクタ
ー系を使用することができ、例えば、ＣＯＳ−７細胞等
の哺乳類由来の培養細胞と、pcDNA3発現ベクター(イン
ビトロジェン(Invitrogen)社)等の哺乳類細胞発現ベク
ターとの組み合わせを採用することが好ましい。培地や
培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選
択され、当該条件下で培養することによって培養物を得
ることができる。

【００７５】培養物からの硫酸化糖の採取は、公知の糖
脂質の抽出、精製方法によって行うことができる。なお
培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含され
る。糖脂質の抽出方法として具体的には、メタノール、
クロロホルム等による有機溶媒抽出、ホモジナイズ、音
波処理等の細胞破砕による抽出、またはこれらの組み合
わせ等の処理操作が挙げられる。培養物中の細胞に対し
てこのような抽出操作を行うことにより硫酸化糖を含有
する抽出物を得ることができる。

【００７６】抽出液からの硫酸化糖の分離、精製は、通
常の糖鎖の分離、精製の手法を用いることができる。例
えば吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲ
ル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロ
マトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒
（例えばアルコール、アセトン等が好ましい）による分
画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作により行うこ
とができるが、これらに限定されるものではない。

【００７７】本発明方法２により製造される硫酸化糖
は、本発明DNAの細胞内への移入により発現された本発
明ポリペプチドの作用により、糖鎖の非還元末端のＮ-
アセチルグルコサミン残基の６位水酸基が硫酸化される
過程を経て細胞表面に発現する。発現する硫酸化糖は、
少なくとも下記式７の糖鎖骨格を有する。

【００７８】NeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc-R （−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示
す。なお、水素原子又はグリコシド結合した糖残基に
は、セラミド等の脂質が結合していても良い）この糖鎖
骨格は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド（6-Sulfo
SLeXセラミド）及びSL2L4(NeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)G
lcNAcβ1-3(SO₄-6)Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc)に反応する
が、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド（6'-Sulfo SL
eXセラミド）やシアリルパラグロボシド（ＳＰＧ）には
反応しない抗体（反応に必要な最小構造がNeuAcα2-3Ga
lβ1-4(SO₄-6)GlcNAcである）により認識される。この
ような抗体は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドを用
いて、通常の抗体の調製方法により調製することができ
る。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。

【００７９】モノクローナル抗体の調製は、KohlerとMi
lsteinの方法(Nature 256,495-497(1975))によって行う
ことができる。例えば、6-硫酸化シアリルルイスＸセラ
ミドをSalmonella minnesota 等の菌体に吸着させ、こ
れを用いてマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるいは足蹠
(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出
し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエロ
ーマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られ
たハイブリドーマから6-硫酸化シアリルルイスＸセラミ
ド及びSL2L4に反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸ
セラミドやシアリルパラグロボシドには反応しない抗体
（反応に必要な最小構造がNeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)G
lcNAcである抗体）を継続的に産生する細胞株を選別す
る。こうして選別された株を好適な培地で培養すること
により、培地中にモノクローナル抗体が得られる。ある
いは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドー
マを培養することによって、モノクローナル抗体を大量
に製造することができる。細胞融合に用いる細胞として
は、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ
細胞等を用いることもできる。ミエローマ細胞株は、異
種細胞種由来のものに比べ、同種細胞株由来のものが望
ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることがで
きる。このような抗体としては、後述の実施例において
説明するG72抗体等が挙げられる。

【００８０】本発明製造方法２によって製造された硫酸
化糖は、以上に説明した抗体を用いてその製造を確認す
ることができる。抗体を用いた確認は、公知の免疫学的
手法を用いることができる。例えばイムノブロッティン
グ法、標識化免疫測定法(例えばEIA法、ELISA法、ラジ
オイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法等)、硫酸
化糖が細胞表面に発現された細胞における当該硫酸化糖
を確認する場合は、フローサイトメトリー等の手法を用
いることができる。もちろん、本発明製造方法２によっ
て製造される硫酸化糖は、公知の糖鎖構造解析技術を用
いて確認することもできる。

【００８１】なお本発明製造方法２において、本発明Ｄ
ＮＡを細胞移入する際に、同時にフコシルトランスフェ
ラーゼをコードするｃＤＮＡも共に細胞に移入すること
ができる。すなわち本発明製造方法２には、本発明ＤＮ
Ａ及びフコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮ
Ａを共に細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を
少なくとも含む、硫酸化糖の製造方法も包含される。

【００８２】移入するフコシルトランスフェラーゼは特
に限定されないが、フコシルトランスフェラーゼIVは、
フコースをN-アセチルラクトサミンに転移することによ
ってルイスＸ構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)を形成で
きることが知られている(J.Biol.Chem.,266,17467-1747
7(1991),Cell,63,1349-1356(1990))ことから好ましい。
フコシルトランスフェラーゼをコードするcDNAは、公知
のフコシルトランスフェラーゼのcDNAを適当な発現ベク
ターに組込んで、本発明DNAと共に細胞に移入すること
ができる。好ましい発現ベクター等は、本発明DNAに用
いる発現ベクターと同様である。

【００８３】この方法により製造される硫酸化糖は、本
発明DNAおよびフコシルトランスフェラーゼのcDNAの細
胞内への移入により発現された本発明ポリペプチドおよ
びフコシルトランスフェラーゼの作用により、糖鎖の非
還元末端のＮ-アセチルグルコサミン残基の６位水酸基
が硫酸化され、またフコースがN-アセチルラクトサミン
に転移される過程を経て細胞表面に発現する。発現する
硫酸化糖は、少なくとも下記式８の糖鎖骨格を有する。 Galβ1-4(Fucα1-3)(SO₄-6)GlcNAc-R（式８） （−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基を示
す。なお、水素原子又はグリコシド結合した糖残基に
は、セラミド等の脂質が結合していても良い） この糖鎖骨格は、6-硫酸化ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-
3)(SO₄-6)GlcNAc；6-sulfo LeX)構造に特異的に反応
し、ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc；LeX)や6'-硫
酸化ルイスＸ((SO₄-6)Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc；6'-s
ulfo LeX)構造には反応しないモノクローナル抗体によ
り認識される。このような抗体は、6-硫酸化ルイスＸセ
ラミド(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO₄-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-
4Glcβ1-Cer)を用いて、通常の抗体の調製方法により調
製することができる。抗体はモノクローナル抗体である
ことが好ましい。

【００８４】モノクローナル抗体の調製は、前述と同様
の方法で行うことができる。ここで免疫に用いる抗原と
しては、例えば、6-硫酸化ルイスＸセラミドをSalmonel
la minnesota 等の菌体に吸着させたものが好ましい。

【００８５】上述の方法で作製したハイブリドーマか
ら、6-硫酸化ルイスＸ構造に特異的に反応し、ルイスＸ
や6'-硫酸化ルイスＸ構造には反応しないモノクローナ
ル抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして
選別された株を好適な培地で培養することにより、培地
中にモノクローナル抗体が得られる。あるいは、マウス
の腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養する
ことによって、モノクローナル抗体を大量に製造するこ
とができる。細胞融合に用いる細胞についても上述と同
様である。

【００８６】このような抗体としては、後述の実施例に
おいて説明するAG223抗体等が挙げられる。この方法に
よって製造された硫酸化糖は、以上に説明した抗体を用
いてその製造を確認することができる。抗体を用いた確
認は、公知の免疫学的手法を用いることができ、もちろ
ん公知の糖鎖構造解析技術を用いて確認することもでき
る。これらの説明は上述と同様である。

【００８７】得られた上記式７又は８で示される糖鎖
は、例えばGlyCAM-1やその糖鎖基本骨格製造の中間体と
して利用され得る。

【００８８】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 ＜１＞本実施例中で共通して用いた材料及び方法 （１）材料

【００８９】³⁵S-PAPS(3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ
硫酸；58.1GBq/mmol)（デュポンNEN(DuPont NEN)社）³ H-NaBH₄(16.3GBq/mmol)及びα-³²P-dCTP(110GBq/nmol)
（アマシャム(Amersham)社）

【００９０】コンドロイチン硫酸Ａ(クジラ軟骨由来)、
コンドロイチン硫酸Ｃ(サメ軟骨由来)、デルマタン硫
酸、ＣＤＳＮＳ−ヘパリン(N,O-硫酸基を脱硫酸化後、
再N-硫酸化したヘパリン；completely desulfated and
N-resulfated heparin)及びストレプトコッカス β-ガ
ラクトシダーゼ(Streptococcus β-galactosidase)（生
化学工業株式会社）

【００９１】非標識PAPS、ブタ胃ムチン、ウシ顎下腺由
来ムチン（シグマ(Sigma)社） Hiload Superdex 30 HR 16/60、高速脱塩カラム(fast d
esalting column)HR 10/10（ファルマシアバイオテク(P
harmacia Biotech)社） Partisil SAX-10（ワットマン(Whatman)社製）

【００９２】マウス７日胚 5'-STRETCH PLUS λgt11 cD
NAライブラリー（クローンテック(CLONTECH)社） 抗ルイスＸ(Lewis X)抗体 LeuM1（ベクトン・ディッキ
ンソン(Becton Dickinson)社）

【００９３】ケラタン硫酸(ウシ角膜由来)、Galβ1-4Gl
cNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc(本明細書中において「L1L1」
ともいう)（生化学工業株式会社）

【００９４】部分的脱硫酸化ケラタン硫酸(硫酸基／グ
ルコサミン＝0.62)は、角膜由来のケラタン硫酸から(J.
Biol.Chem.,272,32321-32328(1997),J.Biochem.(Tokyo)
86,1323-1329(1979))記載の方法で調製した。

【００９５】GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、L1L1をβ-
ガラクトシダーゼ消化することにより調製した。β-ガ
ラクトシダーゼ消化のための反応混合液100μLには、２
mgのL1L1、5μmolesの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)、4
0mUのβ-ガラクトシダーゼを含有させた(J.Biochem.(To
kyo)80,9-17(1976))。この反応混合液を37℃で24時間イ
ンキュベートした。β-ガラクトシダーゼ消化後、GlcNA
cβ1-3Galβ1-4GlcNAcをSuperdex 30クロマトグラフィ
ーで精製し、凍結乾燥により脱塩した。

【００９６】Galβ1-4-³H-(SO₄-6)2,5-アンヒドロマン
ニトール(anhydromannitol)及び(SO₄-6)2,5-³H-アンヒ
ドロマンニトールは、ケラタン硫酸をＮ−脱アセチル
化、脱アミノ化、NaB³H₄還元、部分的酸加水分解の順に
反応させて製造した(Glycobiology,6,51-57(1996),Bioc
hem.J.235,225-236(1986))。

【００９７】本実施例で用いた合成糖脂質は次の通りで
ある；シアリルルイスＸセラミド(sialyl Lewis X cera
mide)＝NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Gal
β1-4Glcβ1-Cer；6-硫酸化シアリルルイスＸセラミド
(6-sulfo sialyl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3Galβ
1-4(Fucα1-3)(SO₄-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Ce
r；6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド(6'-sulfo sial
yl Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3(SO₄-6)Galβ1-4(Fu
cα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer； 6,6'-bis-硫
酸化シアリルルイスＸセラミド(6,6'-bis-sulfo sialyl
Lewis X ceramide)＝NeuAcα2-3(SO₄-6)Galβ1-4(Fuc
α1-3)(SO₄-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer(Carbohy
dr.Res.,209,c1-c4(1991)、Carbohydr.Res.,285,c1-c8
(1996)、J.Med.Chem.,39,1339-1343(1996))。これらの
糖脂質は岐阜大学農学部の木曾 真博士より恵与された
ものを使用した。アシアロ(asialo)化合物は、対応する
合成糖脂質をArthrobacter ureafaciens由来ノイラミニ
ダーゼ(neuraminidase)（ナカライテスク(Nakarai Tesq
ue)社）で消化することにより調製した。シアリル化パ
ラグロボシド(sialylated paraglobosides；NeuAcα2-3
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer及びNeuAcα2-
6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)は、ヒトの
腸癌及び肝癌組織より調製した。

【００９８】NeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAcβ1-3(S
O₄-6)Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc(本明細書中において「SL2
L4」ともいう)及びGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal
β1-4GlcNAcは生化学工業株式会社の吉田圭一より供与
され、前者については還元的アミノ化によりコレステリ
ルアニリン(cholesteryl aniline)に結合させた(Blood,
82,2797-2805(1993))。

【００９９】（２）本発明DNAの分離 （２−１）マウス由来の本発明DNAの分離 マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼ
の触媒部位と相同性を有するマウスの発現配列tag(expr
essed sequence tag)(EST)配列(Genbank accession番
号：AA103962)を、マウスの１３日胚の全ＲＮＡを鋳型
としたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。

【０１００】センスプライマー GTCGTCGGACTGGTGGACGA
（配列番号５）及びアンチセンスプライマー CCCAGAGCG
TGGTAGTCTGC（配列番号６）をＰＣＲ増幅に用いた。Ｐ
ＣＲ増幅は、94℃で３分、次いで94℃で0.5分、60℃で
１分及び72℃で１分を35サイクルで行った。ＰＣＲ産物
(368bp)を、Megaprime^TM DNA labeled kit(アマシャム
(Amersham)社)で³²P-ラベルし、λgt11マウス７日胚のc
DNAライブラリーのスクリーニングに用いた。

【０１０１】ハイブリダイゼーションは(J.Biol.Chem.,
270,18575-18580(1995))に記載の方法により行った。DN
AインサートはEcoRI消化によって陽性λgt11クローンか
ら分離し、pBluescript II SK-(ストラタジーン(STRATA
GENE)社)にサブクローニングした。塩基配列は、アプラ
イド・バイオシステム(Applied Biosystems)社の自動シ
ークエンサーを用いたジデオキシチェインターミネーシ
ョン法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5467(197
7))により決定した。

【０１０２】（２−２）ヒト由来の本発明DNAの分離 上記で得られたマウス由来の本発明DNAを、メガプライ
ム DNA ラベリングシステム(Megaprime DNA labeling s
ystems；アマシャム(Amersham)社)を用いて³²Ｐラベル
した。これをプローブとして、ヒト胎児脳のcDNAを保持
するλgt11ライブラリー(クローンテック(CLONTECH)社)
をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、J.
Biol.Chem.,272,32321-32328(1997)に記載の方法で行っ
た。

【０１０３】DNAインサートはEcoRI消化によって陽性λ
gt11クローンから分離し、pBluescript II SK-(ストラ
タジーン(STRATAGENE)社)にサブクローニングした。塩
基配列は、前記のマウス由来の本発明DNAと同様の方法
で決定した。

【０１０４】（３）発現ベクターの構築 本発明ポリペプチドのオープン・リーディング・フレー
ムをコードするcDNAフラグメント(マウス由来の本発明D
NA)を、クローニングしたマウス由来のcDNAフラグメン
トを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。センスプライマ
ー ACGAATTCGGGATGAAGGTATTTCGCAGG（配列番号７）及び
アンチセンスプライマー ATGAATTCTCAAAGCCGGGGCTTCCTG
AG（配列番号８）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ増幅
は、５％(v/v)ジメチルスルホキシド中、94℃で３分、
次いで94℃で１分、60℃で１分及び72℃で２分を35サイ
クルで行った。本発明ポリペプチドのオープンリーディ
ングフレームを含むＰＣＲ産物(配列番号１における塩
基番号467-1921)をEcoRIで消化し、pcDNA3発現ベクター
(インビトロジェン(Invitrogen)社)にサブクローニング
した。DNAフラグメントが正しい方向に挿入された組換
えプラスミド(pcDNA3-GlcNAc6ST)を発現に用いた。DNA
フラグメントが逆方向に挿入された組換えプラスミド(p
cDNA3-GlcNAc6STA)は対照実験に用いた。

【０１０５】また、ヒト由来の本発明DNAを用いて上記
と同様に発現ベクターを構築した。すなわち、CTGAATTC
GGAATGAAGGTGTTCCGTA（配列番号９）及び GAGAATTCTTAG
AGACGGGGCTTCCGA（配列番号１０）をプライマーとし、
クローニングしたヒト由来のcDNAフラグメントを鋳型と
してＰＣＲを行い、本発明ポリペプチドのオープンリー
ディングフレームを含むＰＣＲ産物(配列番号３におけ
る塩基番号387-1844)を得た。これをEcoRIで消化し、pc
DNA3発現ベクターにサブクローニングした。DNAフラグ
メントが正しい方向に挿入された組換えプラスミド(pcD
NA3-hGlcNAc6ST)を発現に用い、DNAフラグメントが逆方
向に挿入された組換えプラスミド(pcDNA3-hGlcNAc6STA)
は対照実験に用いた。

【０１０６】既にクローニングされているマウスのフコ
シルトランスフェラーゼIV遺伝子の1544bpのフラグメン
ト(J.Biochem.(Tokyo)119,302-308(1996))を、上述と同
様にpcDNA3発現ベクターのBamHI及びEcoRI部位にサブク
ローニングした。DNAフラグメントが正しい方向に挿入
された組換えプラスミド(pcDNA3-FucTIV)を用いた。

【０１０７】（４）本発明DNAのCOS-7細胞における一過
性発現 DEAE-デキストラン法(Aruffo,A.(1991)in Current Prot
ocols in Molecular Biology, Suppl.14, Unit 16.13,
Greene Publishing Associates and Wiley Interscienc
e, New York)により、15μgの発現プラスミドをCOS-7細
胞(理研細胞バンクより入手；3x10⁶細胞／10cmディッシ
ュ)にトランスフェクトした。これを10％ウシ胎児血清
(fetal calf serum)を含むダルベッコの改変最小必須培
地(Dulbecco-modified minimum essential medium)中で
65時間培養した。その後細胞をリン酸緩衝生理食塩液(P
BS)で洗浄し、デイッシュをこすって細胞をはがした。
この細胞を集めて0.25M シュークロース、10mM Tris-HC
l(pH7.2)及び0.5％ TritonX-100を含有する溶液(１ディ
ッシュあたり1.5mL)中で、ダウンスホモジナイザー(Dou
nce homogenizer)を用いてホモジナイズした。ホモジネ
ートを10,000 x gで15分間遠心し、上清を集めた。この
上清を以下「抽出物」という。FACS(fluorescence-acti
vated cell sorter)による分析のために、トランスフェ
クトされた細胞を48時間培養し、25cm²培養フラスコに
移して(3x10⁵細胞／フラスコ)さらに36時間培養した。

【０１０８】（５）種々の高分子量基質への硫酸基転移
活性の分析 種々のグリコサミノグリカンを基質(受容体)として用
い、硫酸基転移活性を公知の方法で測定した(J.Biol.Ch
em.,272,32321-32328(1997))。ムチンを受容体として用
いた場合は、2.5μmolのイミダゾール-塩酸(pH6.8)、0.
25μmolのCaCl₂、0.1μmolのジチオスレイトール、0.1
μmolのNaF、0.1μmolのAMP、2.0μgのムチン、50pmol
の³⁵S-PAPS(約5.0x10⁵cpm)及び５μLの抽出物を含む50
μLの溶液を37℃で１時間インキュベートした。

【０１０９】高速脱塩カラムを用いてムチンを単離し、
ムチンに取り込まれた放射活性を測定した。

【０１１０】（６）オリゴ糖への硫酸基転移活性の分析 2.5μmolのイミダゾール-塩酸(pH6.8)、0.5μmolのMnCl
₂、0.1μmolのAMP、1.0μmolのNaF、25nmolのオリゴ
糖、50pmolの³⁵S-PAPS(約5.0x10⁵cpm)及び５μLの抽出
物を含む50μLの溶液を反応混合液とした。この反応混
合液を30℃で５時間インキュベートし、反応チューブを
沸騰水中に１分間浸すことによって反応を停止させた。
³⁵S-ラベルされたオリゴ糖を、Superdex 30 ゲルクロマ
トグラフィーによって³⁵SO₄及び³⁵S-PAPSから分離し、
放射活性を測定した。GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを受
容体として用いた場合、硫酸基転移反応は分析条件下に
おいて５時間まで直線的に進行した。

【０１１１】（７）Superdex 30 クロマトグラフィー、
濾紙電気泳動、濾紙クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ(高
速液体クロマトグラフィー)及びＴＬＣ(薄層クロマトグ
ラフィー) Hiload Superdex 30 16/60カラムを0.2M NH₄HCO₃で平衡
化した。流速は１mL/分で行った。１mLの画分を集め、
４mLのクリアゾル(Clearsol；ナカライテスク(Nakarai
Tesque)社)と混合し、放射活性を測定した。オリゴ糖は
210nmの吸光度でモニターした。濾紙電気泳動は、ワッ
トマン(Whatman) No.3濾紙(2.5cm x 57cm)を用い、ピリ
ジン／酢酸／水(体積比１：10：400, pH4)中、30V/cmで
40分間行った。濾紙クロマトグラフィー用のサンプル
は、Whatman No.3濾紙(2.5cm x 57cm)にスポットし、1-
ブタノール／酢酸／1M NH₄OH(体積比３：２：１)で展開
した。濾紙電気泳動または濾紙クロマトグラフィー後、
濾紙を乾燥させ、この濾紙を1.25cmの小片に切り、放射
活性を液体シンチレーションカウンティングにより測定
した。

【０１１２】³⁵S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ
1-4GlcNAcから得られた³⁵S-ラベルされた産物のＨＰＬ
Ｃ分析は、５mM KH₂PO₄で平衡化されたPartisil SAX-10
カラム(4.5mm x 25cm)で行った。このカラムを５mMのK
H₂PO₄で展開した。なお流速は１mL/分で、カラム温度は
40℃で行った。0.5mLづつ画分を採取し、４mLのクリア
ゾルと混合し、放射活性を測定した。ＴＬＣは、0.1mm
厚のセルロースでコートされたアルミニウムシート(メ
ルク(Merck)社)を用い、エチルアセテート／ピリジン／
テトラヒドロフラン／水／酢酸(体積比50：22：15：1
5：４)中で行った(Biochem.J.,319,209-216(1996))。

【０１１３】（８）³⁵S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-
3Galβ1-4GlcNAcのＮ−脱アセチル化、脱アミノ化及びN
aBH₄還元³⁵ S-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc
は、発現させた本発明ポリペプチド(抽出物中の蛋白量
として2.1μg)を用い、³⁵S-PAPS量を６倍増やし、イン
キュベーション時間を25時間にする以外は前記と同様の
方法で製造した。Superdex 30カラムから溶出された³⁵S
-ラベルされた硫酸化GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcは、凍
結乾燥し、濾紙電気泳動で精製し、1.0％ヒドラジン硫
酸を含む70％ヒドラジン中で95℃、６時間脱アセチル化
した(Anal.Biochem.176,96-104(1989))。脱アセチル化
した物質はSuperdex 30クロマトグラフィーにより精製
し、亜硝酸(pH4)中で脱アミノ化し、NaBH₄中で還元した
(Biochem.J.235,225-236(1986))。最終的に、サンプル
を60μLの水に溶解し、濾紙クロマトグラフィーに付し
た。

【０１１４】（９）免疫学的手法 6-硫酸化ルイスＸ(6-sulfo Lewis X；Galβ1-4(Fucα1-
3)(SO₄-6)GlcNAc)に反応するマウスIgMモノクローナル
抗体(AG223)を産生するハイブリドーマセルライン AG22
3は、KohlerとMilsteinの方法(Nature 256,495-497(197
5))により作製し、抗糖鎖抗体の産生に用いた(Kannagi,
R.,and Hakomori,S.(1986) in Handbookof Experimenta
lImmunology, Vol.4, Applications of immunological
methodsin biomedical sciences (Weir,D.M.,Herzenber
g,L.,Blackwell,C.,and Herzenberg,L.A.,eds)pp.117.1
-117.20, Blackwell Scientific Pub. Inc., Boston)。
6-硫酸化ルイスＸセラミド(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO₄-6)
GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)をSalmonella minneso
ta R595株に吸着させ、BALB/cマウスの腹腔内免疫に用
いた。免疫は、０日目(5μg糖脂質)、３日目(10μg)、
７日目(15μg)、12日目(20μg)、17日目(25μg)及び31
日目(35μg)と、繰り返し行った。最終免疫から３日
後、脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ P3/X63-Ag8U
1と融合させた。同じ糖脂質を、クローニングの際に行
うハイブリドーマ培養上清のELISAの抗原として用い
た。ELISAは、96ウエルの培養プレートの底に固相化し
た糖脂質抗原を用い、標準的な方法(Hakomori,S.,and K
annagi,R.(1986) in Handbook of Experimental Immuno
logy, Vol.1, Immunochemistry(Weir,D.M.,Herzenberg,
L.,Blackwell,C.,and Herzenberg,L.A.,eds)pp.9.1-9.3
9, Blackwell Scientific Pub. Inc., Boston)で行っ
た。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgM(μ鎖特異
的、カペル社(Cappel Inc.)）を二次抗体として用い
た。

【０１１５】6-硫酸化シアリルN-アセチルラクトサミン
(NeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc)構造に反応するマ
ウスIgMモノクローナル抗体(G72)を産生するハイブリド
ーマセルライン G72は、6-硫酸化シアリルルイスＸセラ
ミドを用いて同様に作製した。

【０１１６】6-硫酸化シアリルルイスＸセラミドに反応
するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6,6'-bi
s-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6-硫酸化ルイスＸ
セラミド、ルイスＸセラミド等には反応しない（従っ
て、6-硫酸化シアリルルイスＸ抗原を認識する）マウス
IgMモノクローナル抗体(G152)は、6-硫酸化シアリルル
イスＸセラミドを抗原として、J.Biol.Chem.,273,11225
-11233(1998)に記載の方法で作製した。

【０１１７】CSLEX-1モノクローナル抗体（Cancer Re
s.,44,5279-5285(1984)；シアリルルイスＸ抗原に反応
する）は、シアリルルイスＸ抗原を検出するために用い
た。抗原エピトープの細胞表面上での発現は、FACScan
(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)社)を用
いたFACS（Biochem.Biophys.Res.Commun.,230,546-551
(1997)）で解析した。

【０１１８】（１０）ノーザン及びゲノムサザンブロッ
ト解析 （１０−１）マウス C57 BL/6Jマウスの組織から、Anal.Biochem.,162,156-1
59(1987)に記載の方法で全RNA(20μg)を調製した。マウ
スD3胚性幹細胞から調製したゲノムDNA(10μg)(J.Embry
ol.Exp.Morphol.,87,27-45(1985))を適当な制限酵素で
４時間消化した。放射性プローブは、マウス７日胚cDNA
ライブラリーのスクリーニングに用いたものと同じもの
を用いた。ブロットは、55℃条件下で2xSSPE(塩化ナト
リウム／リン酸ナトリウム／EDTA緩衝液)、0.1％ SDS中
で、最終的には0.1xSSPE、0.1％SDS中で55℃条件下で洗
浄した。メンブランはBAS-イメージングプレート(BAS-i
maging plate)に露光し、メンブラン上の放射活性をBAS
2000ラジオイメージアナライザー(富士写真フィルム)で
測定した。

【０１１９】（１０−２）ヒト ヒトの組織から、上記（１０−１）と同様の方法で全RN
Aを調製した。ヒト由来の本発明DNAのBpu1102 I-BamH I
368bpフラグメント(配列番号３における塩基番号910-1
277)をプローブとして用いた。ブロットは、上記（１０
−１）と同様に行った。

【０１２０】（１１） In situ ハイブリダイゼーショ
ン C57 BL/6Jマウスから作製した標本を、ヘマトキシリン
−エオシン染色又は insitu ハイブリダイゼーションに
付した。本発明ポリペプチドのプローブとして、cDNAの
0.6kbp Pst Iフラグメント(配列番号１における塩基番
号962-1561)を pBluescript II SK-にサブクローニング
した。センス及びアンチセンス cRNAプローブは、DIG R
NAラベリングキット(ベーリンガー・マンハイム(Boehri
nger Mannheim))を用いたin vitro転写により調製し
た。

【０１２１】（１２）蛍光 in situ ハイブリダイゼー
ション分析 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(fluorescence i
n situ hybridization(FISH)分析は、ヒト由来の本発明
DNA(配列番号３における塩基番号１〜２４０９)をプロ
ーブとして用いて、Genomics,17,514-515(1993)に記載
の方法に従って行った。

【０１２２】＜２＞結果 （１）本発明DNAのクローニング マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェラーゼ
が既にクローニングされており、ESTデータベースによ
る探索の結果、マウスのコンドロイチン 6-スルホトラ
ンスフェラーゼの触媒部位に相同性を有する短い配列(G
enbank accession番号：AA103962)が見つかった。相当
するcDNAフラグメントをＲＴ−ＰＣＲで得た(配列番号
１における塩基番号1139-1506)。このcDNAフラグメント
をプローブとして、約8x10⁵プラークのマウス７日胚cDN
Aライブラリーをスクリーニングし、６つの独立のクロ
ーンを得た。最も長いcDNAインサート(2.2kb)の塩基配
列を決定した(配列番号１)。決定された2150bpのcDNA
は、483アミノ酸残基（分子量：52829ダルトン(Da)、Ｎ
−結合グリコシレーションが可能な部位(potential N-l
inked glycosylation sites)を４つ有している）からな
る単一のオープンリーディングフレームを含んでいた
(配列番号１)。最初のATGコドンの周辺の配列はKozakの
ルール(Cell,44,283-292(1986))に適合しており、上流
領域はインフレーム停止コドン(in-frame stop codon)
を含んでいた。ヒドロパシープロット分析により、アミ
ノ末端側に２０残基(８番目のAla〜２７番目のLeu)から
なる１つの顕著な疎水性領域が存在することが示され、
このことから本発明ポリペプチドはII型膜貫通タンパク
質であることが示唆された (図１)。本発明ポリペプチ
ドは、マウスのコンドロイチン 6-スルホトランスフェ
ラーゼ及びヒトのケラタン硫酸 Gal-6-スルホトランス
フェラーゼ(J.Biol.Chem.,272,32321-32328(1997))に対
し、それぞれ25％及び27％の相同性を有していた。しか
しながら、このタンパク質のアミノ酸配列と他の公知の
スルホトランスフェラーゼ(J.Biol.Chem.,267,15744-15
750(1992)、J.Biol.Chem.,272,13980-13985(1997)、J.B
iol.Chem.,272,28008-28019(1997)、J.Biol.Chem.,272,
29942-29946(1997)、J.Biol.Chem.,272,4864-4868(199
7))のアミノ酸配列との間に有意な相同性は見られなか
った。

【０１２３】また配列番号１で示されるDNAを用いてヒ
ト胎児脳ｃＤＮＡを保持するλｇｔ１１ライブラリーを
スクリーニングすることによって、ヒト由来の本発明DN
Aを得た（配列番号３）。得られたDNAは2409bpからな
り、484アミノ酸残基からなる単一のオープンリーディ
ングフレームを含んでいた（配列番号３）。ヒドロパシ
ープロット分析により、このポリペプチドは、アミノ末
端側に膜貫通ドメインを有するII型膜貫通タンパク質で
あることが示唆された。

【０１２４】最初のATGコドンの周辺の配列はKozakのル
ール(Cell,44,283-292(1986))に適合していた。なお最
初のATGコドンの41塩基上流に他のATGコドンが存在して
いる。このATGコドンの周辺もKozakのルールに適合して
おり、このATGコドンはマウス由来の本発明DNAの対応す
る部分にも存在している。ヒト由来、マウス由来のいず
れにおいても、最初のATGコドンとこのATGコドンの間に
終止コドンは存在していない。従って本発明DNAにおい
ては上記２箇所のATGコドンのいずれもが開始コドンと
して機能しうると考えられる。

【０１２５】配列番号１のDNAによってコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、配列番号３
のDNAによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号２及び配列番
号４の間の相同性は８５％以上であった。

【０１２６】（２）本発明DNAからの本発明ポリペプチ
ドの発現 5'-及び3'-の非コード領域を除去した本発明DNA(配列番
号１における塩基番号467-1921)を哺乳類発現ベクター
pcDNA3に挿入し、COS-7細胞中で過剰発現させた。³⁵S-
ラベルしたPAPSを硫酸基供与体、種々の複合糖質を硫酸
基受容体として用い、トランスフェクトされた細胞の抽
出物の硫酸基転移活性を調べた結果、コンドロイチン、
コンドロイチン 4-硫酸、コンドロイチン 6-硫酸、デル
マタン硫酸、ケラタン硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CD
SNS-ヘパリン、ブタ胃由来ムチン及びウシ顎下腺由来ム
チンには硫酸基が転移されなかった。

【０１２７】GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを硫酸基受容
体として実験した。反応混合物のSuperdex 30クロマト
グラフィーの結果、正しい方向のcDNA(センスcDNA)が挿
入されたベクター(pcDNA3-GlcNAc6ST)でトランスフェク
トした細胞では受容体よりもわずかに高い放射活性ピー
クが示され、受容体が硫酸化されていることが示された
(図２A)。トランスフェクトしなかった細胞や、逆方向
のcDNA(アンチセンスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA
3-GlcNAc6STA)でトランスフェクトした細胞では、硫酸
基転移活性は非常に低かった(表１)。

【０１２８】

【表１】 ──────────────────────────────────── ベクター 硫酸基転移活性(pmole/時間/mgタンパク質) ──────────────────────────────────── なし(トランスフェクトせず) １．１±０．７ センスcDNA １０．６±２．４ アンチセンスcDNA １．８±０．９ ──────────────────────────────────── (Superdex 30クロマトグラフィー(図２A)の画分番号85-
89の放射活性から算出。受容体存在下での測定値から受
容体非存在下での測定値を差し引いた値を示す。３回実
験したS.D.も併せて示した)

【０１２９】これに対し、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-
4GlcNAcは受容体とはならなかった(図２B)。このことか
ら本発明ポリペプチドは、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc
には硫酸基を転移するが、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-
4GlcNAcには硫酸基を転移しないことが確認された。

【０１３０】また、5'-及び3'-の非コード領域を除去し
た本発明DNA(配列番号３における塩基番号387-1844)を
上記と同様にCOS-7細胞にトランスフェクトし、この細
胞の抽出物の硫酸基転移活性（硫酸基受容体として、Gl
cNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc を用い
た）を上記と同様に調べた。その結果、正しい方向のcD
NA(センスcDNA)が挿入されたベクター(pcDNA3-hGlcNAc6
ST)でトランスフェクトした細胞は、トランスフェクト
しなかった細胞や、逆方向のcDNA(アンチセンスcDNA)が
挿入されたベクター(pcDNA3-hGlcNAc6STA)でトランスフ
ェクトした細胞に比べて５倍以上硫酸基転移活性が高か
った（表２）。

【０１３１】

【表２】 ──────────────────────────────────── ベクター 硫酸基転移活性(pmole/時間/mgタンパク質) ──────────────────────────────────── なし(トランスフェクトせず) １．３３±０．６２ センスcDNA ６．６７±０．５１ アンチセンスcDNA １．２９±０．２３ ──────────────────────────────────── (Superdex 30クロマトグラフィー画分の放射活性から算
出。受容体存在下での測定値から受容体非存在下での測
定値を差し引いた値を示す。３回実験したS.D.も併せて
示した)

【０１３２】（３）本発明ポリペプチドにより硫酸基が
転移される位置の決定（本発明ポリペプチド活性の測定
方法） GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcに転移された³⁵SO₄の位置を
決定するため、放射活性産物をＮ−脱アセチル化、脱ア
ミノ化及びNaBH₄還元の順に処理して分解した。分解
後、濾紙クロマトグラフィーにより２つの放射活性産物
が検出された(図３A)。早く移動するピークは(SO₄-6)2,
5-アンヒドロマンニトールの位置に移動した。³⁵Sラベ
ルされたGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを長時間ヒドラジ
ン分解処理すると遅く移動するピークが減少することか
ら、遅く移動するピークは不完全な脱アセチル化による
非分解産物であると考えられる。早く移動するピークを
ＨＰＬＣにより解析した結果、³⁵S-放射活性は(SO₄-6)³
H-2,5-アンヒドロマンニトールと共に溶出された(図３
B)。³⁵S-及び³H-放射活性は、6-硫酸化 2,5-アンヒドロ
マンニトールを4-硫酸化又は3-硫酸化 2,5-アンヒドロ
マンニトールから分離できる溶媒系(Biochem.J.,319,20
9-216(1996))を用いたＴＬＣ上でも共に移動した。これ
らの結果から、³⁵SO₄は、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcの
非還元末端のGlcNAcの６位に転移することが示された。
従ってクローニングされた本発明DNAは本発明ポリペプ
チドをコードしていることが示された。

【０１３３】（４）本発明DNAの細胞内への移入によ
る、硫酸化糖の発現 マウス由来の本発明DNAでトランスフェクトしたCOS-7細
胞における、新しい抗原エピトープの発現を調べた。G7
2抗体を用いて硫酸化シアリル-N-アセチルラクトサミン
構造の発現解析を行った。この抗体は6-硫酸化シアリル
ルイスＸセラミド及びSL2L4に反応するが、6'-硫酸化シ
アリルルイスＸセラミドやシアリルパラグロボシドには
反応しない(図４)。このことは、この抗体の反応に必要
な最小構造がNeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAcである
ことを示している。本発明DNAでトランスフェクトしたC
OS-7細胞がG72抗原を発現することが示された(図５B)。
トランスフェクトしていない細胞(図５A)及びアンチセ
ンスcDNAでトランスフェクトした細胞(図５C)はこの抗
体に反応しなかった。ノイラミニダーゼ処理すると抗原
性は消失した(図５E)。これらの結果から、本発明ポリ
ペプチドはNeuAcα2-3Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc抗原の合
成に関与していると結論された。

【０１３４】本発明ポリペプチドが6-硫酸化N-アセチル
ラクトサミン構造の形成に関与していることの証拠を更
に得るため、COS-7細胞をマウス由来の本発明DNA及びフ
コシルトランスフェラーゼIVのcDNAで二重にトランスフ
ェクトした。フコシルトランスフェラーゼIVは、フコー
スをN-アセチルラクトサミンに転移することによってル
イスＸ構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)を形成できるこ
とが知られている(J.Biol.Chem.,266,17467-17477(199
1),Cell,63,1349-1356(1990))。トランスフェクション
による細胞表面の変化をモニターするために、6-硫酸化
ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)(SO₄-6)GlcNAc)構造に特
異的に反応し、ルイスＸ(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)や
6'-硫酸化ルイスＸ((SO₄-6)Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)
構造には反応しないモノクローナル抗体 AG223を用いた
(図4)。本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼのcD
NAでトランスフェクトした結果、細胞は6-硫酸化ルイス
Ｘ抗原陽性となった(図６C)。しかしどちらか一方のcDN
Aだけでトランスフェクトした場合、細胞は6-硫酸化ル
イスＸ抗原陽性にはならなかった(図６A、B)。フコシル
トランスフェラーゼのcDNAだけでトランスフェクトした
場合、細胞はルイスＸ抗原陽性となった(図６D)。

【０１３５】また、ヒト由来の本発明DNAでトランスフ
ェクトしたCOS-7細胞における、新しい抗原エピトープ
の発現を調べた。CSLEX-1抗体（Cancer Res.,44,5279-5
285(1984)；シアリルルイスＸ抗原に反応する）、G72抗
体、およびG152抗体（6-硫酸化シアリルルイスＸセラミ
ドに反応するが、6'-硫酸化シアリルルイスＸセラミ
ド、6,6'-bis-硫酸化シアリルルイスＸセラミド、6-硫
酸化ルイスＸセラミド、ルイスＸセラミド等には反応し
ない）を用いて、上記と同様に細胞表面上での硫酸化糖
の発現解析を行った。結果を図７に示す。

【０１３６】その結果、トランスフェクトしなかった細
胞はいずれの抗体にも反応しなかった。フコシルトラン
スフェラーゼのcDNAのみでトランスフェクトした細胞は
CSLEX-1抗体のみに反応した。またヒト由来の本発明DNA
のみでトランスフェクトした細胞はG72抗体のみに反応
した。またヒト由来の本発明DNA及びフコシルトランス
フェラーゼのcDNAでトランスフェクトした細胞はCSLEX-
1抗体、G72抗体及びG152抗体のいずれにも反応した。

【０１３７】これらの結果から、本発明DNAを細胞に移
入することによって6-硫酸化シアリル-N-アセチルラク
トサミン構造を有する硫酸化糖を製造することができ、
また本発明DNA及びフコシルトランスフェラーゼのcDNA
を共に細胞に移入することにより、6-硫酸化シアリルル
イスＸ構造を有する硫酸化糖を製造することができるこ
とが示された。

【０１３８】（５）ノーザンブロット及びサザンブロッ
ト解析 成体マウスの組織（小脳、大脳、眼球、心臓、肺、筋
肉、脾臓、胸腺、肝臓、膵臓、腎臓、胃、小腸、子宮、
卵巣及び精巣）を用いて調べた結果、本発明ポリペプチ
ドは大脳、小脳、目、肺及び膵臓で強く発現していた
(図８A)。腸、子宮、卵巣、腸間膜リンパ節およびその
周辺に中等度のシグナルが観察された(図８A)。主要な
転写産物のサイズは3.9kbであった。サザンブロットに
おいて、Eco RI、Rco RV又はSac Iによる消化産物が、
いずれも単一のバンドでプローブに反応した。このこと
は本発明ポリペプチドの遺伝子は単一コピー遺伝子(sin
gle copygene)であることを示している(図８B)。

【０１３９】またヒトの組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝
臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、
卵巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、胃、甲状腺、脊
髄、リンパ節、気管、副腎、骨髄）を用いて調べた結
果、本発明ポリペプチドは骨髄、末梢血リンパ球、脾
臓、脳、脊髄、卵巣及び胎盤で強く発現していた。リン
パ節、胸腺、心臓、肺、気管、胃、小腸、結腸、甲状
腺、前立腺及び副腎に中程度のシグナルが観察された。
主要な転写産物のサイズは3.6kbであった。

【０１４０】（６）In situハイブリダイゼーション分
析 本発明ポリペプチドの発現部位を決定するためにIn sit
uハイブリダイゼーションを行った。成体マウスの脳に
おいては、海馬のCA3野の錐状体細胞、小脳核及びプル
キンエ細胞で強いシグナルが検出された。CA1野を含む
海馬の他の部分、視床、橋核、嗅結節、嗅球で中等度の
シグナルが検出された。

【０１４１】リンパ系組織内での本発明DNAの転写産物
の局在を、腸間膜リンパ節を用いて調べた。HEV(高内皮
細静脈；high endothelial venules；L-セレクチンのリ
ガンドが局在している(J.Cell Biol.,113,1213-1221(19
91)))が傍皮質中に存在していた。HEVは、長円形の大き
な核と少量の細胞質とからなる立方内皮である。本発明
ポリペプチドのシグナルは、これら内皮に特異的に発現
していた。

【０１４２】（７）蛍光 in situ ハイブリダイゼーシ
ョン分析 ヒト由来の本発明DNAの染色体上での位置を決定するた
め、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション分析を行っ
た。その結果、ヒト由来の本発明DNAは染色体７ｑ３１
部位に存在することが示された。

【０１４３】（８）図面の説明 図１ マウス由来の本発明ポリペプチドのヒドロパシ
ープロット。ヒドロパシープロットは、Kyte 及び Dool
ittle(J.Mol.Biol.,157,105-132(1982))の方法で、11ア
ミノ酸のウインドウで算出した。

【０１４４】図２ マウス由来の本発明ポリペプチドの
基質特異性。A：GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcを硫酸基受
容体として用いた場合。B：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1
-4GlcNAc(L1L1)を硫酸基受容体として用いた場合。酵素
反応後、生成物をSuperdex 30ゲルクロマトグラフィー
で分析した。●は受容体存在下、○は受容体非存在下で
の結果を示す。矢印は受容体の溶出位置を示す。

【０１４５】図３ A：³⁵SラベルされたGlcNAcβ1-3Gal
β1-4GlcNAcをＮ−脱アセチル化、脱アミノ化分解及び
還元し、濾紙クロマトグラフィーで分離した。矢印１、
２及び３は標準物質の移動位置を示す。１は(SO₄-6)Gal
β1-4(SO₄-6)2,5-アンヒドロマンニトールを、２はGal
β1-4(SO₄-6)2,5-アンヒドロマンニトールを、３は(SO₄
-6)2,5-アンヒドロマンニトールを示す。 Ｂ：A中の横棒で示した画分(³⁵Sラベルされた(SO₄-6)2,
5-アンヒドロマンニトール画分)を³H-ラベルされた(SO₄
-6)2,5-アンヒドロマンニトール(標準品)と混合し、SAX
-10カラムを用いたＨＰＬＣで分析した。それぞれの画
分の³H放射活性(○)及び³⁵S放射活性(●)を測定した。

【０１４６】図４ ELISAによるAG223及びG72モノクロ
ーナル抗体の特異性の解析。糖脂質を96ウエルの培養プ
レート底面に固相化し、ELISA解析を行った。SはNeuAc
を、LexはルイスＸセラミドを、PGはパラグロボシド
を、SL2L4はNeuAcα2-3Galβ1-4(SO ₄-6)GlcNAcβ1-3(SO
₄-6)Galβ1-4(SO₄-6)GlcNAc-コレステリルアニリン(cho
lesteryl aniline)を示す。

【０１４７】図５ マウス由来の本発明DNAのトランス
フェクションによるG72抗原の発現。トランスフェクシ
ョン前のCOS-7細胞(A及びD)、センス(正しい方向の)cDN
Aでトランスフェクトした細胞(B及びE)又はアンチセン
ス(逆方向の)cDNAでトランスフェクトした細胞(C及びF)
を、G72モノクローナル抗体と反応させ、FACSで解析し
た。太線は抗体と反応後のパターンを、細線は抗体と反
応前のパターンを示す。-NANaseはノイラミニダーゼ消
化前、+NANaseは0.02ユニット/mLPBS(pH7.4)の Arthrob
acter ureafaciens由来ノイラミニダーゼで37℃下、30
分間消化後の結果を示す。

【０１４８】図６ マウス由来の本発明DNAとフコシル
トランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェク
ションによるAG223抗原(6-硫酸化ルイスＸ)の発現。フ
コシルトランスフェラーゼ cDNAのみでトランスフェク
トしたCOS-7細胞(A及びD)、本発明DNAのみでトランスフ
ェクトしたCOS-7細胞(B及びE)、両方のDNAでトランスフ
ェクトしたCOS-7細胞(C及びF)を、AG223モノクローナル
抗体と反応させ(A-C)、又はLeuM1(抗ルイスＸ抗体)と反
応させ(D-F)、FACSで解析した。太線は抗体と反応後の
パターンを、細線は抗体と反応前のパターンを示す。

【０１４９】図７ ヒト由来の本発明DNAのトランスフ
ェクションによるG72抗原（6-硫酸化シアリル-N-アセチ
ルラクトサミン抗原）の発現、並びにヒト由来の本発明
DNAとフコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルト
ランスフェクションによるG152抗原(6-硫酸化シアリル
ルイスＸ抗原)の発現。データは、トランスフェクトさ
れた細胞における抗原陽性群の平均蛍光強度である。

【０１５０】図８ マウス由来の本発明ポリペプチドの
ノーザン及びサザンブロット解析。A：ノーザンブロッ
ト解析。矢印は、13.5、9.8及び3.9kbの異なるmRNAを示
す。リボゾームRNAの位置は左側に示した。グリセロア
ルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼプローブとのハイ
ブリダイゼーションでは、膵臓のバンド強度が弱かった
以外は、それぞれのレーンで同程度のバンド強度を呈し
た。B：ゲノムサザンブロット解析。EcoRI、EcoRV又は
SacIによる消化後、単一バンドが検出された。

【０１５１】

【発明の効果】本発明ポリペプチドは、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドで
あり、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残
基の６位水酸基に特異的に硫酸基を転移する作用を有す
るので、GlyCAM-1(抗炎症剤等への利用が期待されてい
る)等の機能性糖鎖の合成に有用である。また本発明DNA
は、本発明ポリペプチドの大量合成や生体（細胞）にお
けるGlyCAM-1等の機能性糖鎖の人工的発現等に用いるこ
とができる。本発明方法１および２は、GlyCAM-1等の機
能性糖鎖またはその合成中間体の製造方法として有用で
ある。

【０１５２】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：2150 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：マウス 組織の種類：胚 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：470..1921 特徴を決定した方法：S 配列 GGCTAGGGCA GCGGAGTCTC GCGGCTCCCT CGAAGGCTTG GGGACCCCTA GCAGAAGAGA 60 ACCGGAGAGA AACCGAGGAG AGTGCTAGCC GGACAGTCCG CCGGTCGGGG ATCTGGGGAC 120 GCTCCGAGGC GCACCCTCCG CTCCAGGTCC TTCTCGGAGC CGCTGCCATG GGAGAGCCAG 180 CCCTGGGCGC CGGGGACCAG CAGCCTCTGC CGCCGCGCCC GCCTCGGATC GGCGGCCCCA 240 GTCCCGGCGC CCGCAGCCGG CCTGCAGCGT CCCCCTCCTG GGCTGCAGGG CCGCCTCCGC 300 CGCGCCGCCG GCCCCGGCTG TGCCTGTGAT GAGCCGCAGC TCGCCGCGAG CTCTGCCCCC 360 CGGTGCGCTT CCCCGGCCGC TGCCGGCCGC GCCTGCCGCC GTGCAGCGGG CCCTGCTCCC 420 GCCGTGGCCC CGGCGCGCAG GACGCCGCTG GCCTGCGTCC CCGCTCGGG ATG AAG 475 Met Lys 1 GTA TTT CGC AGG AAG GCG CTG GTG CTG TGC GCG GGC TAT GCA CTG CTA 523 Val Phe Arg Arg Lys Ala Leu Val Leu Cys Ala Gly Tyr Ala Leu Leu 5 10 15 CTG GTG CTC ACG ATG CTC AAC CTC TTG GAC TAC AAG TGG CAT AAA GAG 571 Leu Val Leu Thr Met Leu Asn Leu Leu Asp Tyr Lys Trp His Lys Glu 20 25 30 CCG CTG CAG CAG TGC AAC CCC GAC GGG CCT CTG GGT GCC GCG GTA GGG 619 Pro Leu Gln Gln Cys Asn Pro Asp Gly Pro Leu Gly Ala Ala Val Gly 35 40 45 50 GCG GCC GGG GCC GGC TGG GGA CGG CCG GGG TCG CCT CCT GCA GCG CCA 667 Ala Ala Gly Ala Gly Trp Gly Arg Pro Gly Ser Pro Pro Ala Ala Pro 55 60 65 CCC CGC GCT CAC TCT CGC ATG GAC CCC CGC ACC CCG TAC CGC CCT CCT 715 Pro Arg Ala His Ser Arg Met Asp Pro Arg Thr Pro Tyr Arg Pro Pro 70 75 80 GCC GCG GGC GTG GGG GCA GTT CCC GCA GCC GCG GCT GGG AGT GCA GGA 763 Ala Ala Gly Val Gly Ala Val Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly 85 90 95 GCT GCG GCC TCT CTG GGC AAT GCT ACT CGA GGC ACC AGG GGT GGA GGG 811 Ala Ala Ala Ser Leu Gly Asn Ala Thr Arg Gly Thr Arg Gly Gly Gly 100 105 110 GAC AAG CGG CAG TTG GTG TAT GTG TTC ACC ACG TGG CGC TCG GGC TCG 859 Asp Lys Arg Gln Leu Val Tyr Val Phe Thr Thr Trp Arg Ser Gly Ser 115 120 125 130 TCC TTC TTC GGT GAG CTC TTC AAC CAG AAC CCT GAG GTG TTC TTC CTC 907 Ser Phe Phe Gly Glu Leu Phe Asn Gln Asn Pro Glu Val Phe Phe Leu 135 140 145 TAT GAG CCT GTG TGG CAC GTG TGG CAA AAA CTG TAC CCC GGG GAC GCC 955 Tyr Glu Pro Val Trp His Val Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Gly Asp Ala 150 155 160 GTT TCC CTG CAG GGG GCA GCG CGG GAC ATG CTG AGC GCT CTC TAC CGC 1003 Val Ser Leu Gln Gly Ala Ala Arg Asp Met Leu Ser Ala Leu Tyr Arg 165 170 175 TGC GAT CTT TCG GTT TTC CAG CTG TAT AGC CCC GCA GGC AGT GGG GGG 1051 Cys Asp Leu Ser Val Phe Gln Leu Tyr Ser Pro Ala Gly Ser Gly Gly 180 185 190 CGC AAC CTC ACC ACT CTG GGC ATC TTT GGG GCA GCC ACT AAC AAG GTG 1099 Arg Asn Leu Thr Thr Leu Gly Ile Phe Gly Ala Ala Thr Asn Lys Val 195 200 205 210 GTA TGC TCC TCG CCA CTC TGT CCT GCC TAC CGC AAG GAG GTC GTC GGA 1147 Val Cys Ser Ser Pro Leu Cys Pro Ala Tyr Arg Lys Glu Val Val Gly 215 220 225 CTG GTG GAC GAC CGC GTG TGC AAA AAG TGC CCA CCT CAA CGC CTG GCA 1195 Leu Val Asp Asp Arg Val Cys Lys Lys Cys Pro Pro Gln Arg Leu Ala 230 235 240 CGC TTC GAG GAG GAG TGT CGC AAG TAC CGC ACG GTG GTT ATC AAG GGC 1243 Arg Phe Glu Glu Glu Cys Arg Lys Tyr Arg Thr Val Val Ile Lys Gly 245 250 255 GTG CGG GTC TTC GAT GTG GCT GTG TTG GCG CCG CTG CTT AAA GAT CCA 1291 Val Arg Val Phe Asp Val Ala Val Leu Ala Pro Leu Leu Lys Asp Pro 260 265 270 GCC TTG GAC CTC AAG GTC ATC CAC CTA GTA CGT GAT CCT CGT GCT GTT 1339 Ala Leu Asp Leu Lys Val Ile His Leu Val Arg Asp Pro Arg Ala Val 275 280 285 290 GCC AGC TCC CGC ATC CGC TCG CGT CAC GGC CTC ATC CGG GAA AGC CTA 1387 Ala Ser Ser Arg Ile Arg Ser Arg His Gly Leu Ile Arg Glu Ser Leu 295 300 305 CAG GTG GTG CGA AGC CGG GAT CCA AGA GCC CAC CGC ATG CCC TTC CTG 1435 Gln Val Val Arg Ser Arg Asp Pro Arg Ala His Arg Met Pro Phe Leu 310 315 320 GAG GCT GCT GGC CAC AAG CTT GGT GCC AAG AAG GAG GGT ATG GGT GGC 1483 Glu Ala Ala Gly His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Glu Gly Met Gly Gly 325 330 335 CCA GCA GAC TAC CAC GCT CTG GGT GCA ATG GAG GTC ATC TGC AAC AGT 1531 Pro Ala Asp Tyr His Ala Leu Gly Ala Met Glu Val Ile Cys Asn Ser 340 345 350 ATG GCC AAG ACG CTG CAA ACA GCC CTG CAG CCT CCT GAC TGG CTG CAG 1579 Met Ala Lys Thr Leu Gln Thr Ala Leu Gln Pro Pro Asp Trp Leu Gln 355 360 365 370 GGA CAC TAC TTG GTG GTG AGG TAC GAG GAT CTG GTG GGA GAC CCC GTT 1627 Gly His Tyr Leu Val Val Arg Tyr Glu Asp Leu Val Gly Asp Pro Val 375 380 385 AAG ACC CTA CGG AGG GTA TAT GAC TTT GTG GGG CTG CTG GTG AGT CCC 1675 Lys Thr Leu Arg Arg Val Tyr Asp Phe Val Gly Leu Leu Val Ser Pro 390 395 400 GAA ATG GAG CAG TTT GCC CTG AAC ATG ACC AGT GGT TCG GGC TCC TCC 1723 Glu Met Glu Gln Phe Ala Leu Asn Met Thr Ser Gly Ser Gly Ser Ser 405 410 415 TCC AAG CCT TTC GTG GTG TCA GCT CGC AAT GCC ACT CAG GCC GCC AAT 1771 Ser Lys Pro Phe Val Val Ser Ala Arg Asn Ala Thr Gln Ala Ala Asn 420 425 430 GCC TGG CGG ACC GCG CTC ACC TTC CAG CAG ATC AAA CAG GTG GAG GAG 1819 Ala Trp Arg Thr Ala Leu Thr Phe Gln Gln Ile Lys Gln Val Glu Glu 435 440 445 450 TTT TGC TAC CAG CCC ATG GCC GTG CTG GGC TAT GAG CGG GTT AAC AGT 1867 Phe Cys Tyr Gln Pro Met Ala Val Leu Gly Tyr Glu Arg Val Asn Ser 455 460 465 CCT GAG GAG GTC AAA GAC CTC AGC AAG ACC TTG CTC AGG AAG CCC CGG 1915 Pro Glu Glu Val Lys Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu Arg Lys Pro Arg 470 475 480 CTT TGAGAAGGGT TCCCAAGAGA TCTGACACTC TCCGGAGACA CCCACAAAAA 1968 Leu GGATGGTGTT GTGTTTAAAC AAACACAGCC CAGACCCAAG CTGAGGAAGC CCACATATTC 2028 TATTATAGAT ATATAATATA AATAACCACA CAGGCACTTG CTGTCAACGT TTTGAGTCAG 2088 TGCATTTCAA GGAACAGCCC TCAACTCACA CGACAAACTT CTGGCCCTCC AACAAGACAC 2148 AC 2150

【０１５３】 配列番号：２ 配列の長さ：483 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Val Phe Arg Arg Lys Ala Leu Val Leu Cys Ala Gly Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Thr Met Leu Asn Leu Leu Asp Tyr Lys Trp His 20 25 30 Lys Glu Pro Leu Gln Gln Cys Asn Pro Asp Gly Pro Leu Gly Ala Ala 35 40 45 Val Gly Ala Ala Gly Ala Gly Trp Gly Arg Pro Gly Ser Pro Pro Ala 50 55 60 Ala Pro Pro Arg Ala His Ser Arg Met Asp Pro Arg Thr Pro Tyr Arg 65 70 75 80 Pro Pro Ala Ala Gly Val Gly Ala Val Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ser 85 90 95 Ala Gly Ala Ala Ala Ser Leu Gly Asn Ala Thr Arg Gly Thr Arg Gly 100 105 110 Gly Gly Asp Lys Arg Gln Leu Val Tyr Val Phe Thr Thr Trp Arg Ser 115 120 125 Gly Ser Ser Phe Phe Gly Glu Leu Phe Asn Gln Asn Pro Glu Val Phe 130 135 140 Phe Leu Tyr Glu Pro Val Trp His Val Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ala Val Ser Leu Gln Gly Ala Ala Arg Asp Met Leu Ser Ala Leu 165 170 175 Tyr Arg Cys Asp Leu Ser Val Phe Gln Leu Tyr Ser Pro Ala Gly Ser 180 185 190 Gly Gly Arg Asn Leu Thr Thr Leu Gly Ile Phe Gly Ala Ala Thr Asn 195 200 205 Lys Val Val Cys Ser Ser Pro Leu Cys Pro Ala Tyr Arg Lys Glu Val 210 215 220 Val Gly Leu Val Asp Asp Arg Val Cys Lys Lys Cys Pro Pro Gln Arg 225 230 235 240 Leu Ala Arg Phe Glu Glu Glu Cys Arg Lys Tyr Arg Thr Val Val Ile 245 250 255 Lys Gly Val Arg Val Phe Asp Val Ala Val Leu Ala Pro Leu Leu Lys 260 265 270 Asp Pro Ala Leu Asp Leu Lys Val Ile His Leu Val Arg Asp Pro Arg 275 280 285 Ala Val Ala Ser Ser Arg Ile Arg Ser Arg His Gly Leu Ile Arg Glu 290 295 300 Ser Leu Gln Val Val Arg Ser Arg Asp Pro Arg Ala His Arg Met Pro 305 310 315 320 Phe Leu Glu Ala Ala Gly His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Glu Gly Met 325 330 335 Gly Gly Pro Ala Asp Tyr His Ala Leu Gly Ala Met Glu Val Ile Cys 340 345 350 Asn Ser Met Ala Lys Thr Leu Gln Thr Ala Leu Gln Pro Pro Asp Trp 355 360 365 Leu Gln Gly His Tyr Leu Val Val Arg Tyr Glu Asp Leu Val Gly Asp 370 375 380 Pro Val Lys Thr Leu Arg Arg Val Tyr Asp Phe Val Gly Leu Leu Val 385 390 395 400 Ser Pro Glu Met Glu Gln Phe Ala Leu Asn Met Thr Ser Gly Ser Gly 405 410 415 Ser Ser Ser Lys Pro Phe Val Val Ser Ala Arg Asn Ala Thr Gln Ala 420 425 430 Ala Asn Ala Trp Arg Thr Ala Leu Thr Phe Gln Gln Ile Lys Gln Val 435 440 445 Glu Glu Phe Cys Tyr Gln Pro Met Ala Val Leu Gly Tyr Glu Arg Val 450 455 460 Asn Ser Pro Glu Glu Val Lys Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu Arg Lys 465 470 475 480 Pro Arg Leu

【０１５４】 配列番号：３ 配列の長さ：2409 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 組織の種類：胎児脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：390..1844 特徴を決定した方法：S 配列 CGAGGAACGA GTGACAGCCG GACAGTCCGC CGGGCGGTGA TCCGGGGCCG CTCCCGGGCG 60 CGCCCTCGGC TCCAGGTCCT ACCCGGAGCC GCTGCCATGG GAGAGCCAGC CTTGGGCGCT 120 GGGGACCAGC CGCCGCGCCC GCCTCGGAGT CGCGGCCCGA GTCCCGGCGC CAGCAGCCAG 180 CCCGCTGCGT CCCCTTCCCG GGCTGCAGGG CTGCCTCCGC CGCGCCGCCG GCCCGGATTG 240 TGCCTGTGAT GAGCCGCAGC CCGCAGCGAG CTCTGCCCCC GGGCGCGCTC CCTCGGCTGC 300 TCCAGGCTGC GCCTGCAGCG CAGCCGCGTG CCCTGCTCCC GCAGTGGCCC CGGCGCCCAG 360 GACGCCGCTG GCCCGCGTCC CCTCTCGGA ATG AAG GTG TTC CGT AGG AAG GCG 413 Met Lys Val Phe Arg Arg Lys Ala 1 5 CTG GTG TTG TGC GCG GGC TAT GCA CTG CTG CTG GTG CTC ACT ATG CTC 461 Leu Val Leu Cys Ala Gly Tyr Ala Leu Leu Leu Val Leu Thr Met Leu 10 15 20 AAC CTC CTG GAC TAC AAG TGG CAC AAG GAG CCG CTG CAG CAG TGC AAC 509 Asn Leu Leu Asp Tyr Lys Trp His Lys Glu Pro Leu Gln Gln Cys Asn 25 30 35 40 CCC GAT GGG CCG CTG GGT GCC GCA GCG GGG GCA GCC GGA GGC AAG CTG 557 Pro Asp Gly Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Lys Leu 45 50 55 GGG GCG CCC AGG GCC GCC TCC GGC CGG GCC GCC CCG TGC TCA TGC CCG 605 Gly Ala Pro Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ala Pro Cys Ser Cys Pro 60 65 70 TTT GGA CCT CCG CAC TCC TTA CCG CCC TCC CGC TGC CGC CGT CGG GGC 653 Phe Gly Pro Pro His Ser Leu Pro Pro Ser Arg Cys Arg Arg Arg Gly 75 80 85 GAT ACT CTG CAG CCG CGG CAG GGA TGG CGG GGG TTG CGG CCC CTC CAG 701 Asp Thr Leu Gln Pro Arg Gln Gly Trp Arg Gly Leu Arg Pro Leu Gln 90 95 100 GCA ATG GCA CTC GGG GCA CCG GAG GGC GTC GGG GAC AAG CGG CAC TGG 749 Ala Met Ala Leu Gly Ala Pro Glu Gly Val Gly Asp Lys Arg His Trp 105 110 115 120 ATG TAC GTG TTC ACC ACG TGG CGC TCT GGC TCG TCG TTC TTC GGC GAG 797 Met Tyr Val Phe Thr Thr Trp Arg Ser Gly Ser Ser Phe Phe Gly Glu 125 130 135 CTA TTC AAC CAG AAT CCC GAG GTG TTC TTT CTC TAC GAG CCA GTG TGG 845 Leu Phe Asn Gln Asn Pro Glu Val Phe Phe Leu Tyr Glu Pro Val Trp 140 145 150 CAT GTA TGG CAA AAA CTG TAT CCG GGG GAC GCC GTT TCC CTG CAG GGG 893 His Val Trp Gln Lys Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Val Ser Leu Gln Gly 155 160 165 GCA GCG CGG GAC ATG CTG AGC GCT CTT TAC CGC TGC GAC CTC TCT GTC 941 Ala Ala Arg Asp Met Leu Ser Ala Leu Tyr Arg Cys Asp Leu Ser Val 170 175 180 TTC CAG TTG TAT AGC CCC GCG GGC AGC GGG GGG CGC AAC CTC ACC ACG 989 Phe Gln Leu Tyr Ser Pro Ala Gly Ser Gly Gly Arg Asn Leu Thr Thr 185 190 195 200 CTG GGC ATC TTC GGC GCA GCC ACC AAC AAG GTG GTG TGC TCG TCA CCA 1037 Leu Gly Ile Phe Gly Ala Ala Thr Asn Lys Val Val Cys Ser Ser Pro 205 210 215 CTC TGC CCC GCC TAC CGC AAG GAG GTC GTG GGG TTG GTG GAC GAC CGC 1085 Leu Cys Pro Ala Tyr Arg Lys Glu Val Val Gly Leu Val Asp Asp Arg 220 225 230 GTG TGC AAG AAG TGC CCG CCA CAG CGC CTG GCG CGT TTC GAG GAG GAG 1133 Val Cys Lys Lys Cys Pro Pro Gln Arg Leu Ala Arg Phe Glu Glu Glu 235 240 245 TGC CGC AAG TAC CGC ACA CTA GTC ATA AAG GGT GTG CGC GTC TTC GAC 1181 Cys Arg Lys Tyr Arg Thr Leu Val Ile Lys Gly Val Arg Val Phe Asp 250 255 260 GTG GCG GTC TTG GCG CCA CTG CTG CGA GAC CCG GCC CTG GAC CTC AAG 1229 Val Ala Val Leu Ala Pro Leu Leu Arg Asp Pro Ala Leu Asp Leu Lys 265 270 275 280 GTC ATC CAC TTG GTG CGT GAT CCC CGC GCG GTG GCG AGT TCA CGG ATC 1277 Val Ile His Leu Val Arg Asp Pro Arg Ala Val Ala Ser Ser Arg Ile 285 290 295 CGC TCG CGC CAC GGC CTC ATC CGT GAG AGC CTA CAG GTG GTG CGC AGC 1325 Arg Ser Arg His Gly Leu Ile Arg Glu Ser Leu Gln Val Val Arg Ser 300 305 310 CGA GAC CCG CGA GCT CAC CGC ATG CCC TTC TTG GAG GCC GCG GGC CAC 1373 Arg Asp Pro Arg Ala His Arg Met Pro Phe Leu Glu Ala Ala Gly His 315 320 325 AAG CTT GGC GCC AAG AAG GAG GGC GTG GGC GGC CCC GCA GAC TAC CAC 1421 Lys Leu Gly Ala Lys Lys Glu Gly Val Gly Gly Pro Ala Asp Tyr His 330 335 340 GCT CTG GGC GCT ATG GAG GTC ATC TGC AAT AGT ATG GCT AAG ACG CTG 1469 Ala Leu Gly Ala Met Glu Val Ile Cys Asn Ser Met Ala Lys Thr Leu 345 350 355 360 CAG ACA GCC CTG CAG CCC CCT GAC TGG CTG CAG GGC CAC TAC CTG GTG 1517 Gln Thr Ala Leu Gln Pro Pro Asp Trp Leu Gln Gly His Tyr Leu Val 365 370 375 GTG CGG TAC GAG GAC CTG GTG GGA GAC CCC GTC AAG ACA CTA CGG AGA 1565 Val Arg Tyr Glu Asp Leu Val Gly Asp Pro Val Lys Thr Leu Arg Arg 380 385 390 GTG TAC GAT TTT GTG GGA CTG TTG GTG AGC CCC GAA ATG GAG CAG TTT 1613 Val Tyr Asp Phe Val Gly Leu Leu Val Ser Pro Glu Met Glu Gln Phe 395 400 405 GCC CTG AAC ATG ACC AGT GGC TCG GGC TCC TCC TCC AAG CCT TTC GTG 1661 Ala Leu Asn Met Thr Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Lys Pro Phe Val 410 415 420 GTA TCT GCA CGC AAT GCC ACG CAG GCC GCC AAT GCC TGG CGG ACC GCC 1709 Val Ser Ala Arg Asn Ala Thr Gln Ala Ala Asn Ala Trp Arg Thr Ala 425 430 435 440 CTC ACC TTC CAG CAG ATC AAA CAG GTG GAG GAG TTT TGC TAC CAG CCC 1757 Leu Thr Phe Gln Gln Ile Lys Gln Val Glu Glu Phe Cys Tyr Gln Pro 445 450 455 ATG GCC GTC CTG GGC TAT GAG CGG GTC AAC AGC CCT GAG GAG GTC AAA 1805 Met Ala Val Leu Gly Tyr Glu Arg Val Asn Ser Pro Glu Glu Val Lys 460 465 470 GAC CTC AGC AAG ACC CTG CTT CGG AAG CCC CGT CTC TAAAAGGGGT 1851 Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu Arg Lys Pro Arg Leu 475 480 TCCCAGGAGA CCTGATTCCC TGTGGTGATA CCTATAAAGA GGATCGTAGT GTGTTTAAAT 1911 AAACACAGTC CAGACTCAAA CGGAGGAAGC CCACATATTC TATTATAGAT ATATAAATAA 1971 TCACACACAC ACTTGCTGTC AATGTTTTGA GTCAGTGCAT TTCAAGGAAC AGCCACAAAA 2031 TACACACCCC TAAGAAAAGG CAAGACTTGA ACGTTCTGAC CAGGTGCCCC TCTTCTTCTT 2091 TGCCTTCTCT TGTCCTCTTT CTCCTATTTC TTACCCTGTC CTCCACCTGC CTTCCATTTT 2151 GAAGTGGGAT GTTAATGAAA TCAAGTTCCA GTAACCCAAA TCTTGTTTAC AAAATATTCG 2211 TGGTATCTGT GAACATGTTA AGAGTAATTT GGATGTGGGG GTGGGGGTGG AGAAAGGGGA 2271 AGTGGTCCAG AAACAAAAAG CCCCATTGGG CATGATAAGC CGAGGAGGCA TTCTTCCTAA 2331 AAGTAGACTT TTGTGTAAAA AGCAAAGGTT ACATGTGAGT ATTAATAAAG AAGATAATAA 2391 ATAAAAAAAA AAAAAAAA 2409

【０１５５】 配列番号：４ 配列の長さ：484 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Val Phe Arg Arg Lys Ala Leu Val Leu Cys Ala Gly Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Thr Met Leu Asn Leu Leu Asp Tyr Lys Trp His 20 25 30 Lys Glu Pro Leu Gln Gln Cys Asn Pro Asp Gly Pro Leu Gly Ala Ala 35 40 45 Ala Gly Ala Ala Gly Gly Lys Leu Gly Ala Pro Arg Ala Ala Ser Gly 50 55 60 Arg Ala Ala Pro Cys Ser Cys Pro Phe Gly Pro Pro His Ser Leu Pro 65 70 75 80 Pro Ser Arg Cys Arg Arg Arg Gly Asp Thr Leu Gln Pro Arg Gln Gly 85 90 95 Trp Arg Gly Leu Arg Pro Leu Gln Ala Met Ala Leu Gly Ala Pro Glu 100 105 110 Gly Val Gly Asp Lys Arg His Trp Met Tyr Val Phe Thr Thr Trp Arg 115 120 125 Ser Gly Ser Ser Phe Phe Gly Glu Leu Phe Asn Gln Asn Pro Glu Val 130 135 140 Phe Phe Leu Tyr Glu Pro Val Trp His Val Trp Gln Lys Leu Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Asp Ala Val Ser Leu Gln Gly Ala Ala Arg Asp Met Leu Ser Ala 165 170 175 Leu Tyr Arg Cys Asp Leu Ser Val Phe Gln Leu Tyr Ser Pro Ala Gly 180 185 190 Ser Gly Gly Arg Asn Leu Thr Thr Leu Gly Ile Phe Gly Ala Ala Thr 195 200 205 Asn Lys Val Val Cys Ser Ser Pro Leu Cys Pro Ala Tyr Arg Lys Glu 210 215 220 Val Val Gly Leu Val Asp Asp Arg Val Cys Lys Lys Cys Pro Pro Gln 225 230 235 240 Arg Leu Ala Arg Phe Glu Glu Glu Cys Arg Lys Tyr Arg Thr Leu Val 245 250 255 Ile Lys Gly Val Arg Val Phe Asp Val Ala Val Leu Ala Pro Leu Leu 260 265 270 Arg Asp Pro Ala Leu Asp Leu Lys Val Ile His Leu Val Arg Asp Pro 275 280 285 Arg Ala Val Ala Ser Ser Arg Ile Arg Ser Arg His Gly Leu Ile Arg 290 295 300 Glu Ser Leu Gln Val Val Arg Ser Arg Asp Pro Arg Ala His Arg Met 305 310 315 320 Pro Phe Leu Glu Ala Ala Gly His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Glu Gly 325 330 335 Val Gly Gly Pro Ala Asp Tyr His Ala Leu Gly Ala Met Glu Val Ile 340 345 350 Cys Asn Ser Met Ala Lys Thr Leu Gln Thr Ala Leu Gln Pro Pro Asp 355 360 365 Trp Leu Gln Gly His Tyr Leu Val Val Arg Tyr Glu Asp Leu Val Gly 370 375 380 Asp Pro Val Lys Thr Leu Arg Arg Val Tyr Asp Phe Val Gly Leu Leu 385 390 395 400 Val Ser Pro Glu Met Glu Gln Phe Ala Leu Asn Met Thr Ser Gly Ser 405 410 415 Gly Ser Ser Ser Lys Pro Phe Val Val Ser Ala Arg Asn Ala Thr Gln 420 425 430 Ala Ala Asn Ala Trp Arg Thr Ala Leu Thr Phe Gln Gln Ile Lys Gln 435 440 445 Val Glu Glu Phe Cys Tyr Gln Pro Met Ala Val Leu Gly Tyr Glu Arg 450 455 460 Val Asn Ser Pro Glu Glu Val Lys Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu Arg 465 470 475 480 Lys Pro Arg Leu

【０１５６】 配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：NO 配列 GTCGTCGGAC TGGTGGACGA 20

【０１５７】 配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：YES 配列 CCCAGAGCGT GGTAGTCTGC 20

【０１５８】 配列番号：７ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：NO 配列 ACGAATTCGG GATGAAGGTA TTTCGCAGG 29

【０１５９】 配列番号：８ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：YES 配列 ATGAATTCTC AAAGCCGGGG CTTCCTGAG 29

【０１６０】 配列番号：９ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：NO 配列 CTGAATTCGG AATGAAGGTG TTCCGTA 27

【０１６１】 配列番号：１０ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：YES 配列 GAGAATTCTT AGAGACGGGG CTTCCGA 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 マウス由来の本発明ポリペプチドのヒドロパ
シープロットを示す。

【図２】 マウス由来の本発明ポリペプチドの基質特異
性を示す。

【図３】 マウス由来の本発明ポリペプチドによる硫酸
基転移産物の解析結果を示す。

【図４】 ELISAによるAG223及びG72モノクローナル抗
体の特異性の解析結果を示す。

【図５】 マウス由来の本発明DNAの移入（トランスフ
ェクション）によるG72抗原の発現を示す。

【図６】 マウス由来の本発明DNAとフコシルトランス
フェラーゼIV cDNAとのダブルトランスフェクションに
よるAG223抗原(6-硫酸化ルイスＸ)の発現を示す。

【図７】 ヒト由来の本発明DNAのトランスフェクショ
ンによるG72抗原の発現、並びにヒト由来の本発明DNAと
フコシルトランスフェラーゼIV cDNAとのダブルトラン
スフェクションによるG152抗原の発現を示す。

【図８】 マウス由来の本発明ポリペプチドのノーザン
及びサザンブロット解析結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 門松 健治 愛知県名古屋市天白区中平五丁目1905番地 ライオンズマンション中平101号 (72)発明者 神奈木 玲児 愛知県名古屋市千種区振甫町１−122 振 甫町職員住宅Ｂ−10 (72)発明者 羽渕 脩躬 愛知県名古屋市昭和区八事富士見703番地 (72)発明者 村松 喬 愛知県名古屋市天白区天白町大字平針字黒 石2845の161

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
   ド。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
   オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
   の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
   ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
   ド。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
   オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
   の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
   ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
3. 【請求項３】 下記の性質を有するポリペプチド。 作用：硫酸基供与体から、下記式１で示されるオリゴ
   糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位
   水酸基に硫酸基を転移する。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す） 基質特異性：コンドロイチン、コンドロイチン4-硫
   酸、コンドロイチン6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン
   硫酸、脱硫酸化ケラタン硫酸、CDSNS-ヘパリン、ブタ胃
   由来ムチン、ウシ顎下腺由来ムチン及び下記式２で示さ
   れるオリゴ糖には硫酸基を転移しない。 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式２） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す） Ｎ末端のアミノ酸配列 配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４８で表されるア
   ミノ酸配列からなる。
4. 【請求項４】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
   オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
   の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
   ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
5. 【請求項５】 配列番号１において塩基番号４７０〜１
   ９１８で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
6. 【請求項６】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつ硫酸基供与体から下記式１で示される
   オリゴ糖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基
   の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリ
   ペプチド。 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc（式１） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、Ga
   lはガラクトース残基を、β1-3はβ1-3グリコシド結合
   を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示す）
7. 【請求項７】 配列番号３において塩基番号３９０〜１
   ８４１で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドを、下記式３で示される糖鎖に作用させる工
   程を少なくとも含む、下記式４で示される硫酸化糖の製
   造方法。 GlcNAc−Ｒ（式３） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、−
   Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ
   示す） (SO₄-6)GlcNAc−Ｒ（式４） （但し、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、SO
   ₄-6は６位の水酸基が硫酸化されていることを、−Ｒは
   水素原子又はグリコシド結合した糖残基をそれぞれ示
   す）
9. 【請求項９】 請求項４〜７のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを細胞に移入し、次いで該細胞を培養する工程を少
   なくとも含む、硫酸化糖の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項４〜７のいずれか１項に記載の
    ＤＮＡ及びフコシルトランスフェラーゼをコードするｃ
    ＤＮＡを共に細胞に移入する、請求項９記載の硫酸化糖
    の製造方法。