JPH11506927A - 少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法 - Google Patents
少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法、ポリグリコシルトランスフェラーゼおよびそのようなポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
少なくとも二つのサッカリド・ユニットを
ポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法
発明の背景 発明の分野
本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフ
ェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフェラーゼ並びにポリグ
リコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に関する。背景の説明 オリゴ糖の生合成
オリゴ糖類は残基、リンケージおよびサブユニットの数が変動するポリマーで
ある。その基本的なサブユニットは、マンノースやグルコース、ガラクトース、N-ア
セチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンなどの炭水化物単糖または糖で
ある。種々の考えられる立体異性オリゴ糖鎖の数は厖大である。
オリゴ糖類や多糖類は、有効半減期モジュレーターとして働くことにより、また、
ある場合には構造を与えることによって、タンパク質の機能および活性に重要な
役割を果たしている。前記したように、オリゴ糖類はナイセリア属(Neisseria)、特
に淋菌の抗原変異性に不可欠であり、従って、その免疫回避に不可欠である。
炭水化物の合成には数多くの古典的な方法が開発されてきたが、これらの方法
は選択的な保護および脱保護を要するという難点がある。オリゴ糖類の有機合成
はさらに、多くのグリコシド結合の不安定性や領域選択的(regioselective)な糖
カップリングを達成する困難さが妨げとなり、一般に合成収率は低い。要するに、
ペプチド合成での経験とは異なり、伝統的な合成有機化学では相当簡単なオリゴ
糖類でさえも定量的に信頼性をもって合成することはできない。
最近オリゴ糖の合成は、自然界からグリコシルトランスフェラーゼ類を単離した
ことで進歩してきている。これらの酵素はイン・ビトロで使用でき、オリゴ糖類や
多糖類を製造する(例えば、ロスの米国特許第5,180,674号参照)。グリコシルトラ
ンスフェラーゼを使う生合成の利点は、酵素によって生成したグリコシド結合が
高度に立体および領域特異的だという点にある。しかしながら、各酵素は、特定の
糖ドナー残基と他の特定アクセプター分子、例えば、オリゴ糖や脂質とのリンケー
ジを触媒する。従って、所望のオリゴ糖の合成には、それぞれに異なるサッカリド・
ユニットを転移する、異なったグリコシルトランスフェラーゼを使用することが
必要であった。
さらに詳しく説明すれば、そのようなグリコシルトランスフェラーゼ類は、そのグ
リコシルトランスフェラーゼに特異的なサッカリド・ユニット一個を転移するだ
けに過ぎなかった。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼはガラクトースだけ
を、グリコシルトランスフェラーゼはグルコースだけを、N-アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼはN-アセチルグルコサミンだけを、シアリルトランスフェ
ラーゼはシアル酸だけを転移するに過ぎない。
しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼ類に一般性が欠如していることは、
それぞれ異なる糖ドナーを転移するために、異なるグリコシルトランスフェラー
ゼを使用する必要性を生じる。オリゴ糖化合物の有用性が広がるにつれ、二以上
の糖ドナーを転移することができれば、必要なグリコシド結合を生成するのに要
するグリコシルトランスフェラーゼの数が減少するので、大変な利点となるであ
ろう。
さらに、少なくとも二つの異なる糖ドナーを転移するグリコシルトランスフェ
ラーゼは、同じグリコシルトランスフェラーゼを使用して、少なくともトリサッカ
リドのうち二つのグリコシド結合を合成するのに好都合でもある。
淋菌のリポオリゴ糖(LOS)の生合成に係わる遺伝子座は、淋菌F62株からクローニ
ングされると報告されている(ゴッチュリッヒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メディシン、第180巻、2181-2190頁、1994年)。lgtA、lgtB、lgtC、lgtDおよびlgt
Eという5個の遺伝子が報告されており、欠失実験に基づいて、活性はグリコシル
トランスフェラーゼをコードすると推定されている。欠失実験の性質による不確
実性のせいで、上記遺伝子のそれぞれによってコードされるタンパク質の正確な
活性は確認されておらず、上記遺伝子のうちいくつかが二者択一で一方か他方か
の活性の原因であると示唆されているに過ぎない。lgtA遺伝子は、GlcNAcトランス
フェラーゼをコードする可能性が最も高いと示唆されている。
二以上の異なるサッカリド部をポリグリコシルトランスフェラーゼで転移させ
ることはこれまで報告されていない。
発明の要約
本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフ
ェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフェラーゼ並びにポリグ
リコシルトランスフェラーゼをコードする核酸に関する。
従って本発明は、一観点において、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリ
グリコシルトランスフェラーゼで転移する方法に関する。
従って、本発明の他の観点は、ポリグリコシルトランスフェラーゼ(GlcNAcおよびG
alNAc両方を転移する)で少なくとも二つのサッカリド・ユニットを対応する糖ヌ
クレオチドから糖アクセプターへ転移させる方法に関する。
本発明の他の観点によれば、ポリグリコシルトランスフェラーゼは、ナイセリア属
、エシェリキア属またはシュードモナス属の細菌から得られる。
本発明の他の観点によれば、本発明は、同じアクセプターから、ポリグリコシル
トランスフェラーゼで少なくとも二つのオリゴサッカリド化合物を製造する方法
に関する。
従って本発明の他の観点は、GlcNAcおよびGalNAc両方を対応する糖ヌクレオチ
ドから糖アクセプターへ転移するポリグリコシルトランスフェラーゼを使って、
同じアクセプターから少なくとも二つのオリゴサッカリド化合物を製造する方法
に関する。
本発明の他の態様によれば、配列番号:3のグリコシルトランスフェラーゼを使
用してN-アセチルガラクトサミンを転移する方法に関する。
特定の実施態様において、本発明は、配列番号:3に示されるポリペプチドをコード
する塩基配列をもつ核酸に関する。
機能的に活性な本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、GalNAcβ1→3のG
al への付加、GlcNAcβ1→3のGal への付加両方を触媒することによって特徴づけ
られる。
図面の簡単な説明
第1図は、配列番号:3のポリグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を
示す。
第2図は、ナイセリア・ゴノロエエ(N.gonorrhoeae)から分離された、LOSをコー
ドするポリヌクレオチド配列を示し、そのヌクレオチド445-1488は、ポリグリコシ
ルトランスフェラーゼをコードする。
発明の詳細な説明
以上開示したように、本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリ
グリコシルトランスフェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子、並びにポリグリコシルトランスフェラーゼに関す
る。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、ヒト血液型抗原のコアとなる
オリゴ糖、すなわち、ラクト-N-ネオテトロースのような、様々なオリゴ糖類のイン・
ビトロ生合成に使用することができる。
本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現は、本明
細書に開示されているように、常法を用いて行うことができる。そのようなポリグ
リコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖類のイン・ビトロ生合成に有用である。
あるいは、そのようなポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、
酵母細胞や真核細胞のような細胞に形質転換(トランスフェクト)して、タンパク
質や脂質の代替グリコシル化を行うことができる。
本発明は、ナイセリア・ゴノロエエから分離されたポリグリコシルトランスフェ
ラーゼが、GlcNAcβ1-3およびGalNAcβ1-3の両方をGalへ、対応する糖ヌクレオチ
ドから転移させることができるという発見に一部基づいている。
タンパク質、グリコシルトランスフェラーゼの活性は、淋菌LOS F62株の生合成に
係わる遺伝子座をクローニングすることによって、ゴッチュリッヒらにより1994
年9月26日の米国特許出願第08/312,387号に報告されている。今、348個のアミノ酸
タンパク質であり、配列番号:3として同定されたタンパク質の配列がポリグリコ
シルトランスフェラーゼ活性をもつことを見出した。さらに詳しくは、配列番号:3
として同定されたタンパク質配列は、GlcNAcβ1-3およびGalNAcβ1-3の両方をGal
へ、対応する糖ヌクレオチドから転移することが見出された。
配列番号:3のタンパク質配列および米国特許出願第08/312,387号に報告されたも
のをコードする核酸配列に加えて、新規なポリグリコシルトランスフェラーゼが、
二つの相異なる糖ユニットを転移することが発見された。このタンパク質は、lgtA
のアミノ酸番号86-90間にある5個のグリシン・ユニットのうち、一または二以上欠
失している点で、配列番号:3のタンパク質と類似している。ポリグリコシルトラン
スフェラーゼ活性を保持しながら、さらに付加的なアミノ酸配列 -Tyr-Ser-Arg-A
sp-Ser-Ser(配列番号:7)が配列番号:3のイソロイシンIle(アミノ酸348)のカルボ
キシ末端に付いていてもよい。
ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、N.
ゴノロエエから分離したLOSの核酸番号445-1488の配列に類似している(第2図、配
列番号:1参照)。この配列では、核酸700-715間にある3または6個のグアニン・ユニ
ットが欠失している。
他のポリヌクレオチド配列は、N.ゴノロエエから分離したLOSの核酸番号445-14
88の配列に類似しており(第2図参照)、アミノ酸配列 -Tyr-Ser-Arg-Asp-Ser-Ser(
配列番号:7)をコードするのに十分な複数の核酸を1488番目の核酸に付けてもよ
い。
本明細書で使用される略号を以下に示す。
リポポリサッカリド、LPS;リポオリゴ糖、LOS;シチジン一リン酸 N-アセチル
ノイラミン酸、CMP-NANA;野生型、wt;Gal,ガラクトース;Glc,グルコース;NA
c,N-アセチル(例:GalNAc、GlcNAc)。ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の分離
ナイセリア属の細菌であればいずれも、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺
伝子の分子クローニング用核酸源となり得る。以下の特定の一実施態様において、
前記遺伝子はナイセリア・ゴノロエエから分離される。DNAは、クローニングされた
DNA(例えば、DNA「ライブラリー」)から、化学合成やcDNAクローニング、あるいは、所
望の細胞から精製したゲノムDNAまたはその断片のクローニングなどの当分野に
公知の常法によって得ることができる(例えば、サムブルック他の上記文献、1989
年;ディ・エム・グローバー編「DNAクローニング:実用的アプローチ、第1巻(1985年)、
英国オックスフォードMRLプレス社刊)。例えば、N.ゴノロエエのゲノムDNAは、Sa
u3A等の一またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼでファージベクターに消
化することができ、このファージベクターは、ファージゲノム・ライブラリーを創
るために、例えば、BamHI/EcoRIのような制限エンドヌクレアーゼ(一又はそれ以上
)で消化される。起源が何であれ、遺伝子は遺伝子増殖用に、適当なベクターへ分子
的にクローニングしなければならない。
遺伝子をゲノムDNAから分子クローニングするには、DNA断片を生成させるが、そ
のうちのいくつかは所期の遺伝子をコードするはずである。そのDNAは、種々の制
限酵素を用いて特定の位置で分解することができる。あるいは、マンガンの存在下
DNAaseを使用してDNAを断片化してもよいし、このDNAを例えば超音波処理によっ
て物理的に剪断することができる。線状DNA断片は、次いでアガロースおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動やカラムクロマトグラフィを含む(これらに限定さ
れない)常法により、サイズに応じて分離することができる。
DNA断片を生成させると、所望のポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む特定のDNA断片は、多くの方法で特定することができる。例えば、生成したDNA断
片を、ここに開示された配列で合成された標識プローブに対する核酸のハイブリ
ッド形成によってスクリーニングをおこなってもよい(ベントンおよびデーヴィ
ス、サイエンス、第196巻、180頁、1977年;グルンシュタインおよびホグネス、プロシ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第72巻、396
1頁、1975年)。プローブに対して実質的なホモロジーをもつDNA断片はハイブリッ
ドを形成するはずである。
適切なプローブは、ランダム・プライマーを用いてPCRにより生成することがで
きる。特に、4または5のグリシン残基(すなわち、12または15のグアニン残基)をコ
ードするポリヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するプローブは、ポリグリ
コシルトランスフェラーゼ用の適切なプローブであろう。
上記したように、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的、化学的あるいは免疫
学的性質に基づくアッセイ法によって検出することができる。例えば、類似または
同一の電気泳動の移動度や等電点電気泳動の挙動、タンパク分解消化地図、タンパ
ク分解活性、あるいは機能的性質、特にポリグリコシルトランスフェラーゼ活性、
すなわち、二つの相異なるサッカリド・ユニットが一つのアクセプター分子へ転移
するのを仲介するポリグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の能力をもつタ
ンパク質を生成するDNAクローン。
ポリグリコシルトランスフェラーゼ・ゲノムDNAを分離する他の方法としては、
以下の例に限定されるものではないが、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコ
ードする既知の配列から、前記遺伝子配列そのものを化学的に合成する方法を挙
げることができる。さらに他の実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のDNAは、本明細書に開示されているヌクレオチド配列から設計したオ
リゴヌクレオチド・プライマーを使用するPCRによって分離することができる。そ
の他の方法も可能であり、それらの方法も本発明の範囲に含まれる。
特定し分離した遺伝子は、次いで適当なクローニング・ベクターへ挿入することが
できる。当分野に公知の多数のベクター・宿主系を使用してもよい。使用できるベ
クターとしては、以下の例示に限定されるものではないが、プラスミドや改変ウィ
ルスがある。しかしながら、ベクター系は使用する宿主細胞と適合するものでなけ
ればならない。本発明の特定の観点においては、ポリグリコシルトランスフェラー
ゼをコードする配列を大腸菌クローニング・ベクターに挿入する。他のベクターの
例としては、以下の例示に限定されるものではないが、ラムダ誘導体のようなバク
テリオファージ、pBR322誘導体の如きプラスミド、あるいはpUCプラスミド誘導体、
例えば、pGEXベクター、pmal-c、pFLAGなどがある。クローニング・ベクターへの挿入
は、例えば、相補性付着端をもつクローニング・ベクターへDNA断片を連結すること
によって行うことができる。しかしながら、DNAを断片化するのに使われる相補性
制限サイトがクローニング・ベクターに存在しなければ、DNA分子末端を酵素的に
修飾改変してもよい。あるいは、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結す
ることによって所望のサイトを作ってもよい。これら連結したリンカーは、制限エ
ンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学的に合成されたオリゴヌク
レオチドからなってもよい。特定の態様においては、そのようなリンカー部位を含
むPCRプライマーを使用してクローニング用のDNAを増幅することができる。リコ
ンビナント分子は、形質転換やトランスフェクション、感染、エレクトロポレーシ
ョン等により、宿主細胞へ導入することができ、その結果、多数の遺伝子配列コピ
ーが得られる。
分離したポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子や合成したDNA配列へ挿入
するリコンビナントDNA分子で宿主細胞を形質転換すると、遺伝子の多重コピーを
発生させることができる。こうして形質転換体を増殖させ、その転換体からリコン
ビナントDNA分子を分離し、必要ならば、挿入した遺伝子を分離したリコンビナン
トDNAから回収することによって、前記遺伝子を大量に得ることができる。
本発明はまた、ポリグリコシルトランスフェラーゼと同じ機能的活性をもつト
ランケートな(先端を切った)型の酵素(フラグメント)およびポリグリコシルトラ
ンスフェラーゼ誘導体をコードする遺伝子を含むベクターに関する。ポリグリコ
シルトランスフェラーゼに関連する断片および誘導体を製造および使用すること
は、本発明の範囲内である。特定の一実施態様において、前記断片または誘導体は
機能的に活性であり、すなわち、二つの糖ドナーが一つのアクセプター成分分に転
移するのを仲介する能力をもっている。
ポリグリコシルトランスフェラーゼのトランケートなフラグメントは、タンパ
ク質の、機能的活性には不要なN-末端領域やC-末端領域あるいは内部領域を除去
することによって製造することができる。通常、そのような除去部分のアミノ酸残
基は少なく、例えば、1乃至5の間にあるだけであるが、これより大きなセグメン
トを除去してもよい。
他のタンパク質に結合した本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼのすべ
て、またはその機能的活性部を含むキメラ分子、例えば、融合タンパク質もま考え
られる。ポリグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、少なくともポリグ
リコシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの機能的活性部に結合したペプチド
を介して結合した非グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも機能的に活性な
部分からなる。この非グリコシルトランスフェラーゼ配列は、ポリグリコシルトラ
ンスフェラーゼ配列に対して、アミノ末端であってもよいし、カルボキシ末端であ
ってもよい。
融合タンパク質の発現によって、酵素的に不活性なポリグリコシルトランスフ
ェラーゼ融合タンパク質を得ることができる。そのような融合タンパク質をコー
ドするリコンビナントDNA分子は、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードす
る配列にイン・フレーム結合した非グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも
機能的に活性な部分からなり、好ましくはポリグリコシルトランスフェラーゼ・非
グリコシルトランスフェラーゼ結合位置で、例えば、トロンビンやXa因子のような
特定プロテアーゼの切断部位をコードしていることが望ましい。特定の一実施態
様において、この融合タンパク質は大腸菌で発現させていもよい。
特に、ポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体は、機能的に同等な分子を与え
る、置換や付加、欠失によって、コードする核酸配列を変更することにより作るこ
とができる。ヌクレオチドをコードする配列の縮重があるので、本発明を実施する
にあたっては、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と実質的に同じアミノ
酸配列をコードする他のDNA配列を使用してもよい。そのDNA配列としては、以下の
例に限定されるものではないが、前記配列内の同じアミノ酸残基をコードする、異
なったコドンの置換によって改変した、従ってサイレント(無症状の)変更となる、
ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のすべてまたは一部を含む塩基配列を
例示することができる。同様に、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導
体としては、以下の例示に限定されるものではないが、保存型アミノ酸置換を生じ
る配列内の残基が機能的に同等なアミノ酸残基に置換されている改変配列を含む、
ポリグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列すべてまたはその一部をプ
ライマリーアミノ酸配列として含む誘導体を例示することができる。たとえば、そ
の配列内にある一または二以上のアミノ酸残基は、同様の極性をもつ他のアミノ
酸、すなわち、機能的に同等な作用をもつためにサイレント改変となる他のアミノ
酸で置換することができる。前記配列内のアミノ酸置換は、そのアミノ酸が属する
クラスのその他のアミノ酸から選択してもよい。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸
としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、
トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、グ
リシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミ
ンが含まれる。陽性に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒ
スチジンが含まれる。陰性に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、
グルタミン酸が含まれる。
本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体およびその類似体をコード
する遺伝子は、当分野に公知の様々な方法で産生することができる(例えば上記19
89年のサムブルック他の文献参照)。配列を適当な位置で一または二以上の制限エ
ンドヌクレアーゼで切断し、所望により、さらに酵素的修飾改変を行い、分離して
イン・ビトロ連結を行う。ポリグリコシルトランスフェラーゼの誘導体またはその
類似体をコードする遺伝子を製造する際には、所望の活性をコードする遺伝子領
域において、修飾改変された遺伝子が、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子
と同じ翻訳リーディング・フレーム内で翻訳停止信号によって妨害されることの
ない状態を確実にするよう注意しなければならない。
さらに、ポリグリコシルトランスフェラーゼ核酸配列は、イン・ビトロまたはイ
ン・ビボで突然変異を起こして、翻訳開始および/または終結配列を創出すること、
および/または破壊することができ、または、コード領域における変異を創出する
ことができ、および/または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したり、既
存の部位を破壊したりすることができ、さらにイン・ビトロ改変を行うこともでき
る。イン・ビトロの特定部位突然変異誘発(シー・ハッチンソン他、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、第253巻、6551頁、1978年;ゾラーおよびスミス、DN
A、第3巻、479-488頁。1984年;オリファント他、ジーン、第44巻、177頁、1986年;ハッ
チンソン他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
U.S.A.、第83巻、710頁、1986年)、TABOリンカー(ファルマシア製)の使用など、当分
野に公知の突然変異誘発技術であればいずれも、これらに限定されることなく用
いることができる。特定部位の突然変異誘発にはPCR法が好ましい(エイチ・エール
リッヒ編、PCRテクノロジー:DNA増幅の原理と応用、ストックトン・プレス刊、第6章
における、ヒグチ、「DNAを工学的に作るためのPCR使用」、第61-70頁、1989年参照)。
ポリグリコシルトランスフェラーゼはナイセリア・ゴノロエエの細菌から分離
されているが、ポリグリコシルトランスフェラーゼ類はナイセリア属の他の細菌
種から分離することもできる。ナイセリア属の細菌源としては、ナイセリア・アニ
マリス(ATCC19573)、ナイセリア・カニス(ATCC14687)、ナイセリア・シネレエ(ATCC1
4685)、ナイセリア・クニクリ(ATCC14688)、ナイセリア・デニトリフィカンス(ATCC1
4686)、ナイセリア・エロンガータ(ATCC25295)、ナイセリア・エロンガータ亜種グリ
コリチカ(ATCC29315)、ナイセリア・エロンガータ亜種ニトロレデュセンス(ATCC49
377)、ナイセリア・フラベッセンス(ATCC13115)、ナイセリア・ゴノロエエ(ATCC3308
4)、ナイセリア・ラクタミカ(ATCC23970)、ナイセリア・マカカ(ATCC33926)、ナイセ
リア・メニンギチジス、ナイセリア・ムコーザ(ATCC19695)、ナイセリア・ムコーザ亜
種ハイデルベルゲンシス(ATCC25998)、ナイセリア・ポリサッカレエ(ATCC43768)、
ナイセリア・シッカ(ATCC29256)およびナイセリア・サブフラバ(ATCC49275)を例示
することができる。さらに、ポリグリコシルトランスフェラーゼ類は、ブランハメ
ラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンゼ、エシェリキア・コリ、シュードモ
ナス・アエルギノーザおよびシュードモナス・セパシアからも分離することができ
る。ポリグリコシルトランスフェラーゼの発現
ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子またはその機能的活性
フラグメントあるいはその他の誘導体は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入さ
れたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入
することができる。発現ベクターは複製起点も含むのが好ましい。この必要な転写
および翻訳信号は、天然のポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子および/また
はそのフランク領域からも供給できる。種々の宿主・ベクター系を利用してタンパ
ク質コード配列を発現することができるが、高い確率で天然のコンフォメーショ
ンをもつタンパク質を高レベルに発現させるには、細菌の発現系を使用するのが
好ましい。使用できる宿主・ベクター系としては、以下の例示に限定されるもので
はないが、ウィルス(例えば、ワクチニア・ウィルス、アデノウィルスなど)に感染
させたほ乳類の細胞系、ウィルス(例えば、バキュロウィルス)に感染させた昆虫細
胞系、酵母ベクターを含む酵母のような微生物、あるいは、バクテリオファージやD
NA、プラスミドDNA、コスミドDNAで形質転換した細菌が含まれる。ベクターの発現
要素は、その強さと特異性によって変わる。利用した宿主・ベクター系に応じて、多
くの適当な転写および翻訳要素の中からいずれか一つを使用してもよい。
タンパク質を大腸菌のペリプラズムへ、あるいは、バシラス・サチリスに基づく
発現系に輸送するためには、ペリプラズム型のポリグリコシルトランスフェラー
ゼ(信号配列を含む)を製造するのが好ましい。
DNA断片をベクターへ挿入する方法として前記した方法はいずれも、適当な転写
/翻訳調節信号とタンパク質コード配列とからなるキメラ遺伝子を含む発現ベク
ターを構築するのに用いることができる。これらの方法は、イン・ビトロのリコ
ンビナントDNAおよび合成技術、イン・ビボ組み替え(遺伝子組み換え)を含んでも
よい。
ポリグリコシルトランスフェラーゼまたはそのペプチド断片をコードする核酸
配列の発現は、第二の核酸配列によって制御することもできるので、このポリグリ
コシルトランスフェラーゼまたはペプチドはリコンビナントDNA分子で形質転換
した宿主で発現される。例えば、ポリグリコシルトランスフェラーゼの発現は、当
分野に公知のプロモーター/エンハンサー要素で調節することができるが、これら
の調節要素は、発現用に選択された宿主において機能するものでなければならな
い。細菌での発現には、細菌のプロモーターが必要である。以下に詳述するように、
ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターを、一時的発現対象物
に直接注入して、細菌感染に対する異種防御を起こさせる場合には、組織特異性プ
ロモーターを含む、真核ウィルスプロモーターや真核プロモーターが好ましい。ポ
リグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現を調節するのに使用することができ
るプロモーターとしては、以下の例示に限定されるものではないが、SV40初期プロ
モーター領域(ベノイストおよびシャンボン、ネイチャー、第290巻、304-310頁、198
1年)、ラウス肉腫ウィルスの31ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモー
ター(ヤマモト他、セル、第22巻、787-797頁、1980年)、ヘルペス・チミジンキナーゼ・
プロモーター(ワグナー他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンスU.S.A.、第78巻、1441-1445頁、1981年)、メタロチオネイン遺伝子の
調節配列(ブリンスター他、ネイチャー、第296巻、39-42頁、1982年)、ο-ラクタマー
ゼ・プロモーターの如き原核発現ベクター(ヴィラ-カマロフ他、プロシーディング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第75巻、3727-3731頁、1
978年)、またはtacプロモーター(デボア他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第80巻、21=25頁、1983年)を例示することが
できる。さらに、サイエンティフィック・アメリカン、第242巻、74-94頁、1980年の論
文「組換細菌から得られる有用タンパク質」も参照。
ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子インサートを含む発現ベクターは、一
般に、以下の4方法によって特定することが出来る。すなわち、
(a)所望のプラスミドDNAまたは特定のmRNAのPCR増幅
(b)核酸のハイブリッド形成
(c)「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および
(d)挿入した配列の発現
である。最初の方法によれば、放射性ヌクレオチドまたはエチジウムブロミドで染
色した放射性ヌクレオチドを挿入してPCRにより核酸を増幅し、増幅生成物を検出
することができる。第二の方法では、挿入されたポリグリコシルトランスフェラー
ゼ遺伝子に相同する配列を含むプローブを用いて核酸のハイブリッド形成を行う
ことにより、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を検出することができ
る。第三の方法では、ベクターに外来遺伝子を挿入することによって生じる、ある
種の「マーカー」遺伝子機能(例えば、β-ガラクトシダーゼ活性、PhoA活性、チミヂ
ンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける閉塞
体(occlusion body)生成など)の存在または不存在に基づいて、リコンビナントベ
クター・宿主系を同定し選択することができる。ポリグリコシルトランスフェラー
ゼ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、ポリグリコ
シルトランスフェラーゼ・インサートを含むリコンビナントは、そのマーカー遺
伝子機能の不存在によって同定することができる。第四の方法(d)では、そのリコ
ンビナントによって発現されるポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物の
活性を測定することによって、リコンビナントの発現ベクターを同定することが
できる。そのような測定は、例えば、イン・ビトロ測定系におけるポリグリコシルト
ランスフェラーゼ遺伝子生成物の物理的または機能的性質、例えば、ポリグリコシ
ルトランスフェラーゼ活性をもとに行うことができる。適当な宿主系および増殖
条件が確立されたら、リコンビナントの発現ベクターを増殖させて定量的に製造
することができる。オリゴ糖類の生合成
本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖類の生合成に使用す
ることができる。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、二つの活性化さ
れた特定のサッカリド・ユニットを特定のアクセプター分子へ立体特異的にコン
ジュゲートすることができる。そのような活性化サッカリドは、通常、サッカリド
のうちのウリジン-またはグアノシン二リン酸誘導体とシチジン一リン酸誘導体
とからなり、そこでヌクレオシド一リン酸や二リン酸は脱離基として作用する。従
って、前記活性化サッカリドは、サッカリド-UDP、サッカリド-GDPまたはサッカリ
ド-CMPであってもよい。特定の実施態様において、前記活性化サッカリドは、UDP-G
lcNAC,UDP-GalNAcまたはUDP-Galである。
本明細書において、二つの異なるサッカリド・ユニットとは、C1以外の位置で構
造および/または立体化学において異なるサッカリドを意味し、従って、グルコー
スとガラクトース(すなわち、C4異性体)は異なると見なされるが、同じ炭素骨格
のピラノースとフラノースとは同じサッカリド・ユニットと見なされる。
特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性を持つとされるためには、通常グリ
コシルトランスフェラーゼは約1乃至250ターンオーバー/秒の触媒活性を持って
いる。従って、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼそれぞれ個々のグリコ
シルトランスフェラーゼ活性は、1乃至250ターンオーバー/秒の範囲であり、好ま
しくは5乃至100ターンオーバー/秒、さらに好ましくは10乃至30ターンオーバー/
秒である。
絶対グリコシルトランスフェラーゼ活性の他に、ポリグリコシルトランスフェ
ラーゼには同定されたポリグリコシルトランスフェラーゼ活性それぞれの相対速
度は、0.1乃至10倍、好ましくは0.2から3倍、さらに好ましくは0.5から2倍、そし
て最も好ましくは0.8から1.5倍の相対活性をもっており、他のグリコシルトラン
スフェラーゼ活性のうち、いずれか一つの速度である。
本明細書で使用される「アクセプター成分」なる用語は、ポリグリコシルトラ
ンスフェラーゼが活性化された糖を転移する分子を意味する。
オリゴ糖を合成するには、転移に有効な条件下、ポリグリコシルトランスフェラ
ーゼを適当な活性化サッカリドおよび適当なアクセプター成分に接触させ、前記
サッカリドをアクセプター成分に共有結合させる。特定のサッカリド・ユニット転
移に適当な至適時間や温度、pH条件は、ルーチンテストによって決定することがで
きる。一般に、生理学的条件は具合がよい。ある種の共存反応剤も好ましい。例えば、
二価のカチオン存在下、ポリグリコシルトランスフェラーゼを活性化サッカリド
およびアクセプター分に接触させるとより効果的である。
本発明によれば、セファデックスやセファロース、ポリ(アクリルアミド・N-アク
リルオキシサクシンイミド共重合体)(PAN)樹脂のような固相支持体上に、共有結
合または非共有結合によりポリグリコシルトランスフェラーゼ酵素を固定化する
ことができる。反応生成物から簡単に固相酵素を分離することにより、別の反応溶
液中で特定の反応を行うことができる。固相支持体に付けた特定のポリグリコシ
ルトランスフェラーゼにより、カラム中ランダムにあるいは特定された順序で別
々のゾーンに配置した支持体により、または、前記カラムを通る反応溶液を通過さ
せて最後に所望のオリゴ糖を溶出することにより、酵素を固定化すれば、継続的な
生合成行程とすることができる。ポリグリコシルトランスフェラーゼを固相支持
体に付着する効率のよい方法および前記固定化ポリグリコシルトランスフェラー
ゼを用いる効率的な方法は、1993年1月19日に特許されたロスの米国特許第5,180,
674号に記載されており、これを引用してその全体を本明細書の開示に含める。
本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼを用いて製造した、例えばジサッ
カリドのようなオリゴ糖は、本発明の他のポリグリコシルトランスフェラーゼか
または当分野に公知のグリコシルトランスフェラーゼを用いて更に合成をすすめ
る際のアクセプター成分として作用させることができる(例えば、ロスの米国特許
第5,180,674号参照)。
あるいは、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼを使用して、ラクトース
またはラクトサミンから、それぞれ、GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβl-3-Galβ1-
4-GlcまたはGalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcを製造するこ
とができる。ここで、ポリグリコシルトランスフェラーゼは、GlcNAcβ1-3-Gal連
結とGalNAcβ1-3連結両方を合成するのに使われる。
従って、GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc構造をもつオリゴ糖
を製造する方法は、以下の行程を順次行うことからなる。すなわち、
a)活性化されたGlcNAc(UDP-GlcNAcのような)を含む反応混合物をラクトースと、
配列番号:3のアミノ酸配列をもつポリグリコシルトランスフェラーゼまたはその
機能的に活性なフラグメントに接触させる行程、
b)β1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下、活性化Gal(すなわち、UDP-Ga
l)を含む反応混合物をGlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc残基を含むアクセプター成分と
接触させる行程、そして
c)行程a)のポリグリコシルトランスフェラーゼの存在下、活性化GalNAc(すなわち、
UDP-GalNAc)を含む反応混合物をGalβ1-4GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc残基を含む
アクセプター成分と接触させる行程からなる。
適当なβ1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼはウシの乳から分離することがで
きる。
ポリグリコシルトランスフェラーゼを用いるオリゴ糖合成は、一般に15℃から3
8℃、好ましくは20℃から25℃で行われる。25℃と37℃とで酵素活性はそう変わら
ないが、ポリグリコシルトランスフェラーゼの安定性は25℃において一層安定で
ある。
好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性はα-ラ
クトアルブミンの不存在下で観察される。
好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性は同じp
Hで、さらに好ましくはpH6.5から7.5の範囲で観察される。
好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性は同じ温
度で観察される。
本発明のその他の特徴は、以下の実施例の記載から明らかになるであろう。実施
例の記載は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない
。実施例1 GalNAc β1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glcの合成
ラクトースを、0.5M HEPESバッファ水溶液中25℃で、UDP-N-アセチルグルコサミ
ンおよび配列番号:3のβ-ガラクトシド-β1-3-N-アセチルグルコサミニルトラン
スフェラーゼに接触させた。次いで、生成したトリサッカリドを、0.05M HEPESバッ
ファ水溶液中37℃で、UDP-Galおよび牛乳から分離したβ-N-アセチルグルコサミ
ノシド-β1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させた。次いで、得られた
テトラサッカリドを、0.05M HEPESバッファ水溶液中25℃で、UDP-N-アセチルガラ
クトサミンと配列番号:3のβ-ガラクトシド-β1-3-N-アセチルガラクトサミニル
トランスフェラーゼとに接触させた。常法により表題のペンタサッカリドを分離
した。
上記教示に照らして、本発明の多数の改変および変更が可能であることは明ら
かである。従って、特許請求の範囲内において上記以外の方法で本発明を実施して
もよいことが理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12R 1:00)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AU,AZ,BB
,BG,BR,BY,CA,CN,CZ,EE,FI,
GE,HU,IL,IS,JP,KG,KP,KR,K
Z,LK,LR,LS,LT,LV,MD,MG,MK
,MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,SG,
SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UZ,V
N
(72)発明者 ロース,ステフェン
アメリカ合衆国 19035 ペンシルバニア
州 グラッドワイン,ローズ グレン ロ
ード 1105
(72)発明者 バクゼイラ,ステファニー エル.
アメリカ合衆国 19046 ペンシルバニア
州 ジェンキンタウン,ワシントン レー
ン 155 アパートメント エル−6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.アクセプター成分および二つの異なる糖ドナーをポリグリコシルトランスフェ ラーゼに接触させることからなる、少なくとも二つのサッカリド・ユニットを一つ の酵素で転移させる方法。 2.前記二つのサッカリド・ユニットがN-アセチルグルコサミンおよびN-アセチル ガラクトサミンである特許請求の範囲第1項の方法。 3.前記アクセプター成分が非還元末端にガラクトースを有する特許請求の範囲第 1項の方法。 4.前記ポリグリコシルトランスフェラーゼがナイセリア属から分離される特許請 求の範囲第1項の方法。 5.前記ポリグリコシルトランスフェラーゼがナイセリア・ゴノロエエから分離さ れる特許請求の範囲第1項の方法。 6.N-アセチルガラクトサミン・ドナーとアクセプター成分とをN-アセチルグルコ サミニルトランスフェラーゼに接触させることからなる、N-アセチルガラクトサ ミンをアクセプター成分に転移させる方法。 7.前記N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがナイセリア属から分離さ れる特許請求の範囲第6項の方法。 8.前記N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがナイセリア・ゴノロエエ から分離される特許請求の範囲第6項の方法。 9.前記アクセプター成分が非還元末端にガラクトースを有する特許請求の範囲第 6項の方法。 10.前記ナイセリア・ゴノロエエがATCC33084である、特許請求の範囲第8項の方法 。
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