JPH11506927A

JPH11506927A - 少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法

Info

Publication number: JPH11506927A
Application number: JP9500960A
Authority: JP
Inventors: エフ．ジョンソン，カール; ロース，ステフェン; エル．バクゼイラ，ステファニー
Original assignee: ネオーズテクノロジーズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-22
Also published as: US20030207406A1; US6379933B1; EP0832277A1; AU709942B2; AU5965596A; EP0832277A4; CA2224144A1; US6127153A; WO1996040971A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法、ポリグリコシルトランスフェラーゼおよびそのようなポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法発明の背景発明の分野本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフェラーゼ並びにポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に関する。背景の説明オリゴ糖の生合成オリゴ糖類は残基、リンケージおよびサブユニットの数が変動するポリマーである。その基本的なサブユニットは、マンノースやグルコース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンなどの炭水化物単糖または糖である。種々の考えられる立体異性オリゴ糖鎖の数は厖大である。オリゴ糖類や多糖類は、有効半減期モジュレーターとして働くことにより、また、ある場合には構造を与えることによって、タンパク質の機能および活性に重要な役割を果たしている。前記したように、オリゴ糖類はナイセリア属(Neisseria)、特に淋菌の抗原変異性に不可欠であり、従って、その免疫回避に不可欠である。炭水化物の合成には数多くの古典的な方法が開発されてきたが、これらの方法は選択的な保護および脱保護を要するという難点がある。オリゴ糖類の有機合成はさらに、多くのグリコシド結合の不安定性や領域選択的(regioselective)な糖カップリングを達成する困難さが妨げとなり、一般に合成収率は低い。要するに、ペプチド合成での経験とは異なり、伝統的な合成有機化学では相当簡単なオリゴ糖類でさえも定量的に信頼性をもって合成することはできない。最近オリゴ糖の合成は、自然界からグリコシルトランスフェラーゼ類を単離したことで進歩してきている。これらの酵素はイン・ビトロで使用でき、オリゴ糖類や多糖類を製造する(例えば、ロスの米国特許第5,180,674号参照)。グリコシルトランスフェラーゼを使う生合成の利点は、酵素によって生成したグリコシド結合が高度に立体および領域特異的だという点にある。しかしながら、各酵素は、特定の糖ドナー残基と他の特定アクセプター分子、例えば、オリゴ糖や脂質とのリンケージを触媒する。従って、所望のオリゴ糖の合成には、それぞれに異なるサッカリド・ユニットを転移する、異なったグリコシルトランスフェラーゼを使用することが必要であった。さらに詳しく説明すれば、そのようなグリコシルトランスフェラーゼ類は、そのグリコシルトランスフェラーゼに特異的なサッカリド・ユニット一個を転移するだけに過ぎなかった。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼはガラクトースだけを、グリコシルトランスフェラーゼはグルコースだけを、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼはN-アセチルグルコサミンだけを、シアリルトランスフェラーゼはシアル酸だけを転移するに過ぎない。しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼ類に一般性が欠如していることは、それぞれ異なる糖ドナーを転移するために、異なるグリコシルトランスフェラーゼを使用する必要性を生じる。オリゴ糖化合物の有用性が広がるにつれ、二以上の糖ドナーを転移することができれば、必要なグリコシド結合を生成するのに要するグリコシルトランスフェラーゼの数が減少するので、大変な利点となるであろう。さらに、少なくとも二つの異なる糖ドナーを転移するグリコシルトランスフェラーゼは、同じグリコシルトランスフェラーゼを使用して、少なくともトリサッカリドのうち二つのグリコシド結合を合成するのに好都合でもある。淋菌のリポオリゴ糖(LOS)の生合成に係わる遺伝子座は、淋菌F62株からクローニングされると報告されている(ゴッチュリッヒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第180巻、2181-2190頁、1994年)。lgtA、lgtB、lgtC、lgtDおよびlgt Eという５個の遺伝子が報告されており、欠失実験に基づいて、活性はグリコシルトランスフェラーゼをコードすると推定されている。欠失実験の性質による不確実性のせいで、上記遺伝子のそれぞれによってコードされるタンパク質の正確な活性は確認されておらず、上記遺伝子のうちいくつかが二者択一で一方か他方かの活性の原因であると示唆されているに過ぎない。lgtA遺伝子は、GlcNAcトランスフェラーゼをコードする可能性が最も高いと示唆されている。二以上の異なるサッカリド部をポリグリコシルトランスフェラーゼで転移させることはこれまで報告されていない。発明の要約本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフェラーゼ並びにポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸に関する。従って本発明は、一観点において、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法に関する。従って、本発明の他の観点は、ポリグリコシルトランスフェラーゼ(GlcNAcおよびG alNAc両方を転移する)で少なくとも二つのサッカリド・ユニットを対応する糖ヌクレオチドから糖アクセプターへ転移させる方法に関する。本発明の他の観点によれば、ポリグリコシルトランスフェラーゼは、ナイセリア属、エシェリキア属またはシュードモナス属の細菌から得られる。本発明の他の観点によれば、本発明は、同じアクセプターから、ポリグリコシルトランスフェラーゼで少なくとも二つのオリゴサッカリド化合物を製造する方法に関する。従って本発明の他の観点は、GlcNAcおよびGalNAc両方を対応する糖ヌクレオチドから糖アクセプターへ転移するポリグリコシルトランスフェラーゼを使って、同じアクセプターから少なくとも二つのオリゴサッカリド化合物を製造する方法に関する。本発明の他の態様によれば、配列番号:3のグリコシルトランスフェラーゼを使用してN-アセチルガラクトサミンを転移する方法に関する。特定の実施態様において、本発明は、配列番号:3に示されるポリペプチドをコードする塩基配列をもつ核酸に関する。機能的に活性な本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、GalNAcβ1→3のG al への付加、GlcNAcβ1→3のGal への付加両方を触媒することによって特徴づけられる。図面の簡単な説明第１図は、配列番号:3のポリグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す。第２図は、ナイセリア・ゴノロエエ(N．gonorrhoeae)から分離された、LOSをコードするポリヌクレオチド配列を示し、そのヌクレオチド445-1488は、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする。発明の詳細な説明以上開示したように、本発明は、少なくとも二つのサッカリド・ユニットをポリグリコシルトランスフェラーゼで転移する方法およびポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、並びにポリグリコシルトランスフェラーゼに関する。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、ヒト血液型抗原のコアとなるオリゴ糖、すなわち、ラクト-N-ネオテトロースのような、様々なオリゴ糖類のイン・ビトロ生合成に使用することができる。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現は、本明細書に開示されているように、常法を用いて行うことができる。そのようなポリグリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖類のイン・ビトロ生合成に有用である。あるいは、そのようなポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞や真核細胞のような細胞に形質転換(トランスフェクト)して、タンパク質や脂質の代替グリコシル化を行うことができる。本発明は、ナイセリア・ゴノロエエから分離されたポリグリコシルトランスフェラーゼが、GlcNAcβ1-3およびGalNAcβ1-3の両方をGalへ、対応する糖ヌクレオチドから転移させることができるという発見に一部基づいている。タンパク質、グリコシルトランスフェラーゼの活性は、淋菌LOS F62株の生合成に係わる遺伝子座をクローニングすることによって、ゴッチュリッヒらにより1994 年9月26日の米国特許出願第08/312,387号に報告されている。今、348個のアミノ酸タンパク質であり、配列番号:3として同定されたタンパク質の配列がポリグリコシルトランスフェラーゼ活性をもつことを見出した。さらに詳しくは、配列番号:3 として同定されたタンパク質配列は、GlcNAcβ1-3およびGalNAcβ1-3の両方をGal へ、対応する糖ヌクレオチドから転移することが見出された。配列番号:3のタンパク質配列および米国特許出願第08/312,387号に報告されたものをコードする核酸配列に加えて、新規なポリグリコシルトランスフェラーゼが、二つの相異なる糖ユニットを転移することが発見された。このタンパク質は、lgtA のアミノ酸番号86-90間にある5個のグリシン・ユニットのうち、一または二以上欠失している点で、配列番号:3のタンパク質と類似している。ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性を保持しながら、さらに付加的なアミノ酸配列 -Tyr-Ser-Arg-A sp-Ser-Ser(配列番号:7)が配列番号:3のイソロイシンIle(アミノ酸348)のカルボキシ末端に付いていてもよい。ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、N. ゴノロエエから分離したLOSの核酸番号445-1488の配列に類似している(第2図、配列番号:1参照)。この配列では、核酸700-715間にある3または6個のグアニン・ユニットが欠失している。他のポリヌクレオチド配列は、N.ゴノロエエから分離したLOSの核酸番号445-14 88の配列に類似しており(第2図参照)、アミノ酸配列 -Tyr-Ser-Arg-Asp-Ser-Ser( 配列番号:7)をコードするのに十分な複数の核酸を1488番目の核酸に付けてもよい。本明細書で使用される略号を以下に示す。リポポリサッカリド、LPS；リポオリゴ糖、LOS；シチジン一リン酸 N-アセチルノイラミン酸、CMP-NANA；野生型、wt；Gal,ガラクトース；Glc,グルコース；NA c,N-アセチル(例:GalNAc、GlcNAc)。ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の分離ナイセリア属の細菌であればいずれも、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の分子クローニング用核酸源となり得る。以下の特定の一実施態様において、前記遺伝子はナイセリア・ゴノロエエから分離される。DNAは、クローニングされた DNA(例えば、DNA「ライブラリー」)から、化学合成やcDNAクローニング、あるいは、所望の細胞から精製したゲノムDNAまたはその断片のクローニングなどの当分野に公知の常法によって得ることができる(例えば、サムブルック他の上記文献、1989 年;ディ・エム・グローバー編「DNAクローニング:実用的アプローチ、第1巻(1985年)、英国オックスフォードMRLプレス社刊)。例えば、N.ゴノロエエのゲノムDNAは、Sa u3A等の一またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼでファージベクターに消化することができ、このファージベクターは、ファージゲノム・ライブラリーを創るために、例えば、BamHI/EcoRIのような制限エンドヌクレアーゼ(一又はそれ以上 )で消化される。起源が何であれ、遺伝子は遺伝子増殖用に、適当なベクターへ分子的にクローニングしなければならない。遺伝子をゲノムDNAから分子クローニングするには、DNA断片を生成させるが、そのうちのいくつかは所期の遺伝子をコードするはずである。そのDNAは、種々の制限酵素を用いて特定の位置で分解することができる。あるいは、マンガンの存在下 DNAaseを使用してDNAを断片化してもよいし、このDNAを例えば超音波処理によって物理的に剪断することができる。線状DNA断片は、次いでアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動やカラムクロマトグラフィを含む(これらに限定されない)常法により、サイズに応じて分離することができる。 DNA断片を生成させると、所望のポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む特定のDNA断片は、多くの方法で特定することができる。例えば、生成したDNA断片を、ここに開示された配列で合成された標識プローブに対する核酸のハイブリッド形成によってスクリーニングをおこなってもよい(ベントンおよびデーヴィス、サイエンス、第196巻、180頁、1977年;グルンシュタインおよびホグネス、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第72巻、396 1頁、1975年)。プローブに対して実質的なホモロジーをもつDNA断片はハイブリッドを形成するはずである。適切なプローブは、ランダム・プライマーを用いてPCRにより生成することができる。特に、4または5のグリシン残基(すなわち、12または15のグアニン残基)をコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するプローブは、ポリグリコシルトランスフェラーゼ用の適切なプローブであろう。上記したように、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的、化学的あるいは免疫学的性質に基づくアッセイ法によって検出することができる。例えば、類似または同一の電気泳動の移動度や等電点電気泳動の挙動、タンパク分解消化地図、タンパク分解活性、あるいは機能的性質、特にポリグリコシルトランスフェラーゼ活性、すなわち、二つの相異なるサッカリド・ユニットが一つのアクセプター分子へ転移するのを仲介するポリグリコシルトランスフェラーゼタンパク質の能力をもつタンパク質を生成するDNAクローン。ポリグリコシルトランスフェラーゼ・ゲノムDNAを分離する他の方法としては、以下の例に限定されるものではないが、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする既知の配列から、前記遺伝子配列そのものを化学的に合成する方法を挙げることができる。さらに他の実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のDNAは、本明細書に開示されているヌクレオチド配列から設計したオリゴヌクレオチド・プライマーを使用するPCRによって分離することができる。その他の方法も可能であり、それらの方法も本発明の範囲に含まれる。特定し分離した遺伝子は、次いで適当なクローニング・ベクターへ挿入することができる。当分野に公知の多数のベクター・宿主系を使用してもよい。使用できるベクターとしては、以下の例示に限定されるものではないが、プラスミドや改変ウィルスがある。しかしながら、ベクター系は使用する宿主細胞と適合するものでなければならない。本発明の特定の観点においては、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列を大腸菌クローニング・ベクターに挿入する。他のベクターの例としては、以下の例示に限定されるものではないが、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322誘導体の如きプラスミド、あるいはpUCプラスミド誘導体、例えば、pGEXベクター、pmal-c、pFLAGなどがある。クローニング・ベクターへの挿入は、例えば、相補性付着端をもつクローニング・ベクターへDNA断片を連結することによって行うことができる。しかしながら、DNAを断片化するのに使われる相補性制限サイトがクローニング・ベクターに存在しなければ、DNA分子末端を酵素的に修飾改変してもよい。あるいは、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結することによって所望のサイトを作ってもよい。これら連結したリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからなってもよい。特定の態様においては、そのようなリンカー部位を含むPCRプライマーを使用してクローニング用のDNAを増幅することができる。リコンビナント分子は、形質転換やトランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等により、宿主細胞へ導入することができ、その結果、多数の遺伝子配列コピーが得られる。分離したポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子や合成したDNA配列へ挿入するリコンビナントDNA分子で宿主細胞を形質転換すると、遺伝子の多重コピーを発生させることができる。こうして形質転換体を増殖させ、その転換体からリコンビナントDNA分子を分離し、必要ならば、挿入した遺伝子を分離したリコンビナントDNAから回収することによって、前記遺伝子を大量に得ることができる。本発明はまた、ポリグリコシルトランスフェラーゼと同じ機能的活性をもつトランケートな(先端を切った)型の酵素(フラグメント)およびポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体をコードする遺伝子を含むベクターに関する。ポリグリコシルトランスフェラーゼに関連する断片および誘導体を製造および使用することは、本発明の範囲内である。特定の一実施態様において、前記断片または誘導体は機能的に活性であり、すなわち、二つの糖ドナーが一つのアクセプター成分分に転移するのを仲介する能力をもっている。ポリグリコシルトランスフェラーゼのトランケートなフラグメントは、タンパク質の、機能的活性には不要なN-末端領域やC-末端領域あるいは内部領域を除去することによって製造することができる。通常、そのような除去部分のアミノ酸残基は少なく、例えば、１乃至５の間にあるだけであるが、これより大きなセグメントを除去してもよい。他のタンパク質に結合した本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼのすべて、またはその機能的活性部を含むキメラ分子、例えば、融合タンパク質もま考えられる。ポリグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、少なくともポリグリコシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの機能的活性部に結合したペプチドを介して結合した非グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも機能的に活性な部分からなる。この非グリコシルトランスフェラーゼ配列は、ポリグリコシルトランスフェラーゼ配列に対して、アミノ末端であってもよいし、カルボキシ末端であってもよい。融合タンパク質の発現によって、酵素的に不活性なポリグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質を得ることができる。そのような融合タンパク質をコードするリコンビナントDNA分子は、ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列にイン・フレーム結合した非グリコシルトランスフェラーゼの少なくとも機能的に活性な部分からなり、好ましくはポリグリコシルトランスフェラーゼ・非グリコシルトランスフェラーゼ結合位置で、例えば、トロンビンやXa因子のような特定プロテアーゼの切断部位をコードしていることが望ましい。特定の一実施態様において、この融合タンパク質は大腸菌で発現させていもよい。特に、ポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体は、機能的に同等な分子を与える、置換や付加、欠失によって、コードする核酸配列を変更することにより作ることができる。ヌクレオチドをコードする配列の縮重があるので、本発明を実施するにあたっては、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を使用してもよい。そのDNA配列としては、以下の例に限定されるものではないが、前記配列内の同じアミノ酸残基をコードする、異なったコドンの置換によって改変した、従ってサイレント(無症状の)変更となる、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のすべてまたは一部を含む塩基配列を例示することができる。同様に、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体としては、以下の例示に限定されるものではないが、保存型アミノ酸置換を生じる配列内の残基が機能的に同等なアミノ酸残基に置換されている改変配列を含む、ポリグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列すべてまたはその一部をプライマリーアミノ酸配列として含む誘導体を例示することができる。たとえば、その配列内にある一または二以上のアミノ酸残基は、同様の極性をもつ他のアミノ酸、すなわち、機能的に同等な作用をもつためにサイレント改変となる他のアミノ酸で置換することができる。前記配列内のアミノ酸置換は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のアミノ酸から選択してもよい。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンが含まれる。陰性に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれる。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼ誘導体およびその類似体をコードする遺伝子は、当分野に公知の様々な方法で産生することができる(例えば上記19 89年のサムブルック他の文献参照)。配列を適当な位置で一または二以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、所望により、さらに酵素的修飾改変を行い、分離してイン・ビトロ連結を行う。ポリグリコシルトランスフェラーゼの誘導体またはその類似体をコードする遺伝子を製造する際には、所望の活性をコードする遺伝子領域において、修飾改変された遺伝子が、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子と同じ翻訳リーディング・フレーム内で翻訳停止信号によって妨害されることのない状態を確実にするよう注意しなければならない。さらに、ポリグリコシルトランスフェラーゼ核酸配列は、イン・ビトロまたはイン・ビボで突然変異を起こして、翻訳開始および/または終結配列を創出すること、および/または破壊することができ、または、コード領域における変異を創出することができ、および/または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したり、既存の部位を破壊したりすることができ、さらにイン・ビトロ改変を行うこともできる。イン・ビトロの特定部位突然変異誘発(シー・ハッチンソン他、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第253巻、6551頁、1978年;ゾラーおよびスミス、DN A、第３巻、479-488頁。1984年;オリファント他、ジーン、第44巻、177頁、1986年;ハッチンソン他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス U.S.A.、第83巻、710頁、1986年)、TABOリンカー(ファルマシア製)の使用など、当分野に公知の突然変異誘発技術であればいずれも、これらに限定されることなく用いることができる。特定部位の突然変異誘発にはPCR法が好ましい(エイチ・エールリッヒ編、PCRテクノロジー:DNA増幅の原理と応用、ストックトン・プレス刊、第6章における、ヒグチ、「DNAを工学的に作るためのPCR使用」、第61-70頁、1989年参照)。ポリグリコシルトランスフェラーゼはナイセリア・ゴノロエエの細菌から分離されているが、ポリグリコシルトランスフェラーゼ類はナイセリア属の他の細菌種から分離することもできる。ナイセリア属の細菌源としては、ナイセリア・アニマリス(ATCC19573)、ナイセリア・カニス(ATCC14687)、ナイセリア・シネレエ(ATCC1 4685)、ナイセリア・クニクリ(ATCC14688)、ナイセリア・デニトリフィカンス(ATCC1 4686)、ナイセリア・エロンガータ(ATCC25295)、ナイセリア・エロンガータ亜種グリコリチカ(ATCC29315)、ナイセリア・エロンガータ亜種ニトロレデュセンス(ATCC49 377)、ナイセリア・フラベッセンス(ATCC13115)、ナイセリア・ゴノロエエ(ATCC3308 4)、ナイセリア・ラクタミカ(ATCC23970)、ナイセリア・マカカ(ATCC33926)、ナイセリア・メニンギチジス、ナイセリア・ムコーザ(ATCC19695)、ナイセリア・ムコーザ亜種ハイデルベルゲンシス(ATCC25998)、ナイセリア・ポリサッカレエ(ATCC43768)、ナイセリア・シッカ(ATCC29256)およびナイセリア・サブフラバ(ATCC49275)を例示することができる。さらに、ポリグリコシルトランスフェラーゼ類は、ブランハメラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンゼ、エシェリキア・コリ、シュードモナス・アエルギノーザおよびシュードモナス・セパシアからも分離することができる。ポリグリコシルトランスフェラーゼの発現ポリグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子またはその機能的活性フラグメントあるいはその他の誘導体は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。発現ベクターは複製起点も含むのが好ましい。この必要な転写および翻訳信号は、天然のポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子および/またはそのフランク領域からも供給できる。種々の宿主・ベクター系を利用してタンパク質コード配列を発現することができるが、高い確率で天然のコンフォメーションをもつタンパク質を高レベルに発現させるには、細菌の発現系を使用するのが好ましい。使用できる宿主・ベクター系としては、以下の例示に限定されるものではないが、ウィルス(例えば、ワクチニア・ウィルス、アデノウィルスなど）に感染させたほ乳類の細胞系、ウィルス(例えば、バキュロウィルス)に感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母のような微生物、あるいは、バクテリオファージやD NA、プラスミドDNA、コスミドDNAで形質転換した細菌が含まれる。ベクターの発現要素は、その強さと特異性によって変わる。利用した宿主・ベクター系に応じて、多くの適当な転写および翻訳要素の中からいずれか一つを使用してもよい。タンパク質を大腸菌のペリプラズムへ、あるいは、バシラス・サチリスに基づく発現系に輸送するためには、ペリプラズム型のポリグリコシルトランスフェラーゼ(信号配列を含む)を製造するのが好ましい。 DNA断片をベクターへ挿入する方法として前記した方法はいずれも、適当な転写 /翻訳調節信号とタンパク質コード配列とからなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するのに用いることができる。これらの方法は、イン・ビトロのリコンビナントDNAおよび合成技術、イン・ビボ組み替え(遺伝子組み換え)を含んでもよい。ポリグリコシルトランスフェラーゼまたはそのペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって制御することもできるので、このポリグリコシルトランスフェラーゼまたはペプチドはリコンビナントDNA分子で形質転換した宿主で発現される。例えば、ポリグリコシルトランスフェラーゼの発現は、当分野に公知のプロモーター/エンハンサー要素で調節することができるが、これらの調節要素は、発現用に選択された宿主において機能するものでなければならない。細菌での発現には、細菌のプロモーターが必要である。以下に詳述するように、ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクターを、一時的発現対象物に直接注入して、細菌感染に対する異種防御を起こさせる場合には、組織特異性プロモーターを含む、真核ウィルスプロモーターや真核プロモーターが好ましい。ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現を調節するのに使用することができるプロモーターとしては、以下の例示に限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(ベノイストおよびシャンボン、ネイチャー、第290巻、304-310頁、198 1年)、ラウス肉腫ウィルスの31ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター(ヤマモト他、セル、第22巻、787-797頁、1980年)、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター(ワグナー他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第78巻、1441-1445頁、1981年)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(ブリンスター他、ネイチャー、第296巻、39-42頁、1982年)、ο-ラクタマーゼ・プロモーターの如き原核発現ベクター(ヴィラ-カマロフ他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第75巻、3727-3731頁、1 978年)、またはtacプロモーター(デボア他、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスU.S.A.、第80巻、21=25頁、1983年)を例示することができる。さらに、サイエンティフィック・アメリカン、第242巻、74-94頁、1980年の論文「組換細菌から得られる有用タンパク質」も参照。ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子インサートを含む発現ベクターは、一般に、以下の4方法によって特定することが出来る。すなわち、 (a)所望のプラスミドDNAまたは特定のmRNAのPCR増幅 (b)核酸のハイブリッド形成 (c)「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および (d)挿入した配列の発現である。最初の方法によれば、放射性ヌクレオチドまたはエチジウムブロミドで染色した放射性ヌクレオチドを挿入してPCRにより核酸を増幅し、増幅生成物を検出することができる。第二の方法では、挿入されたポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に相同する配列を含むプローブを用いて核酸のハイブリッド形成を行うことにより、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を検出することができる。第三の方法では、ベクターに外来遺伝子を挿入することによって生じる、ある種の「マーカー」遺伝子機能(例えば、β-ガラクトシダーゼ活性、PhoA活性、チミヂンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける閉塞体(occlusion body)生成など)の存在または不存在に基づいて、リコンビナントベクター・宿主系を同定し選択することができる。ポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、ポリグリコシルトランスフェラーゼ・インサートを含むリコンビナントは、そのマーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。第四の方法(d)では、そのリコンビナントによって発現されるポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物の活性を測定することによって、リコンビナントの発現ベクターを同定することができる。そのような測定は、例えば、イン・ビトロ測定系におけるポリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子生成物の物理的または機能的性質、例えば、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性をもとに行うことができる。適当な宿主系および増殖条件が確立されたら、リコンビナントの発現ベクターを増殖させて定量的に製造することができる。オリゴ糖類の生合成本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖類の生合成に使用することができる。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼは、二つの活性化された特定のサッカリド・ユニットを特定のアクセプター分子へ立体特異的にコンジュゲートすることができる。そのような活性化サッカリドは、通常、サッカリドのうちのウリジン-またはグアノシン二リン酸誘導体とシチジン一リン酸誘導体とからなり、そこでヌクレオシド一リン酸や二リン酸は脱離基として作用する。従って、前記活性化サッカリドは、サッカリド-UDP、サッカリド-GDPまたはサッカリド-CMPであってもよい。特定の実施態様において、前記活性化サッカリドは、UDP-G lcNAC,UDP-GalNAcまたはUDP-Galである。本明細書において、二つの異なるサッカリド・ユニットとは、C₁以外の位置で構造および/または立体化学において異なるサッカリドを意味し、従って、グルコースとガラクトース(すなわち、Ｃ₄異性体)は異なると見なされるが、同じ炭素骨格のピラノースとフラノースとは同じサッカリド・ユニットと見なされる。特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性を持つとされるためには、通常グリコシルトランスフェラーゼは約１乃至250ターンオーバー/秒の触媒活性を持っている。従って、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼそれぞれ個々のグリコシルトランスフェラーゼ活性は、１乃至250ターンオーバー/秒の範囲であり、好ましくは5乃至100ターンオーバー/秒、さらに好ましくは10乃至30ターンオーバー/ 秒である。絶対グリコシルトランスフェラーゼ活性の他に、ポリグリコシルトランスフェラーゼには同定されたポリグリコシルトランスフェラーゼ活性それぞれの相対速度は、0.1乃至10倍、好ましくは0.2から３倍、さらに好ましくは0.5から２倍、そして最も好ましくは0.8から1.5倍の相対活性をもっており、他のグリコシルトランスフェラーゼ活性のうち、いずれか一つの速度である。本明細書で使用される「アクセプター成分」なる用語は、ポリグリコシルトランスフェラーゼが活性化された糖を転移する分子を意味する。オリゴ糖を合成するには、転移に有効な条件下、ポリグリコシルトランスフェラーゼを適当な活性化サッカリドおよび適当なアクセプター成分に接触させ、前記サッカリドをアクセプター成分に共有結合させる。特定のサッカリド・ユニット転移に適当な至適時間や温度、pH条件は、ルーチンテストによって決定することができる。一般に、生理学的条件は具合がよい。ある種の共存反応剤も好ましい。例えば、二価のカチオン存在下、ポリグリコシルトランスフェラーゼを活性化サッカリドおよびアクセプター分に接触させるとより効果的である。本発明によれば、セファデックスやセファロース、ポリ(アクリルアミド・N-アクリルオキシサクシンイミド共重合体)(PAN)樹脂のような固相支持体上に、共有結合または非共有結合によりポリグリコシルトランスフェラーゼ酵素を固定化することができる。反応生成物から簡単に固相酵素を分離することにより、別の反応溶液中で特定の反応を行うことができる。固相支持体に付けた特定のポリグリコシルトランスフェラーゼにより、カラム中ランダムにあるいは特定された順序で別々のゾーンに配置した支持体により、または、前記カラムを通る反応溶液を通過させて最後に所望のオリゴ糖を溶出することにより、酵素を固定化すれば、継続的な生合成行程とすることができる。ポリグリコシルトランスフェラーゼを固相支持体に付着する効率のよい方法および前記固定化ポリグリコシルトランスフェラーゼを用いる効率的な方法は、1993年1月19日に特許されたロスの米国特許第5,180, 674号に記載されており、これを引用してその全体を本明細書の開示に含める。本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼを用いて製造した、例えばジサッカリドのようなオリゴ糖は、本発明の他のポリグリコシルトランスフェラーゼかまたは当分野に公知のグリコシルトランスフェラーゼを用いて更に合成をすすめる際のアクセプター成分として作用させることができる(例えば、ロスの米国特許第5,180,674号参照)。あるいは、本発明のポリグリコシルトランスフェラーゼを使用して、ラクトースまたはラクトサミンから、それぞれ、GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβl-3-Galβ1- 4-GlcまたはGalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcを製造することができる。ここで、ポリグリコシルトランスフェラーゼは、GlcNAcβ1-3-Gal連結とGalNAcβ1-3連結両方を合成するのに使われる。従って、GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc構造をもつオリゴ糖を製造する方法は、以下の行程を順次行うことからなる。すなわち、 a)活性化されたGlcNAc(UDP-GlcNAcのような)を含む反応混合物をラクトースと、配列番号:3のアミノ酸配列をもつポリグリコシルトランスフェラーゼまたはその機能的に活性なフラグメントに接触させる行程、 b)β1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下、活性化Gal(すなわち、UDP-Ga l)を含む反応混合物をGlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc残基を含むアクセプター成分と接触させる行程、そして c)行程a)のポリグリコシルトランスフェラーゼの存在下、活性化GalNAc(すなわち、 UDP-GalNAc)を含む反応混合物をGalβ1-4GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc残基を含むアクセプター成分と接触させる行程からなる。適当なβ1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼはウシの乳から分離することができる。ポリグリコシルトランスフェラーゼを用いるオリゴ糖合成は、一般に15℃から3 8℃、好ましくは20℃から25℃で行われる。25℃と37℃とで酵素活性はそう変わらないが、ポリグリコシルトランスフェラーゼの安定性は25℃において一層安定である。好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性はα-ラクトアルブミンの不存在下で観察される。好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性は同じp Hで、さらに好ましくはpH6.5から7.5の範囲で観察される。好ましい一実施態様において、ポリグリコシルトランスフェラーゼ活性は同じ温度で観察される。本発明のその他の特徴は、以下の実施例の記載から明らかになるであろう。実施例の記載は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。実施例1 GalNAc β1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glcの合成ラクトースを、0.5M HEPESバッファ水溶液中25℃で、UDP-N-アセチルグルコサミンおよび配列番号:3のβ-ガラクトシド-β1-3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに接触させた。次いで、生成したトリサッカリドを、0.05M HEPESバッファ水溶液中37℃で、UDP-Galおよび牛乳から分離したβ-N-アセチルグルコサミノシド-β1-4-ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させた。次いで、得られたテトラサッカリドを、0.05M HEPESバッファ水溶液中25℃で、UDP-N-アセチルガラクトサミンと配列番号:3のβ-ガラクトシド-β1-3-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとに接触させた。常法により表題のペンタサッカリドを分離した。上記教示に照らして、本発明の多数の改変および変更が可能であることは明らかである。従って、特許請求の範囲内において上記以外の方法で本発明を実施してもよいことが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:00） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロース，ステフェンアメリカ合衆国 19035 ペンシルバニア州グラッドワイン，ローズグレンロード 1105 (72)発明者バクゼイラ，ステファニーエル. アメリカ合衆国 19046 ペンシルバニア州ジェンキンタウン，ワシントンレーン 155 アパートメントエル−６

Claims

【特許請求の範囲】 1.アクセプター成分および二つの異なる糖ドナーをポリグリコシルトランスフェラーゼに接触させることからなる、少なくとも二つのサッカリド・ユニットを一つの酵素で転移させる方法。 2.前記二つのサッカリド・ユニットがN-アセチルグルコサミンおよびN-アセチルガラクトサミンである特許請求の範囲第1項の方法。 3.前記アクセプター成分が非還元末端にガラクトースを有する特許請求の範囲第１項の方法。 4.前記ポリグリコシルトランスフェラーゼがナイセリア属から分離される特許請求の範囲第１項の方法。 5.前記ポリグリコシルトランスフェラーゼがナイセリア・ゴノロエエから分離される特許請求の範囲第１項の方法。 6.N-アセチルガラクトサミン・ドナーとアクセプター成分とをN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに接触させることからなる、N-アセチルガラクトサミンをアクセプター成分に転移させる方法。 7.前記N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがナイセリア属から分離される特許請求の範囲第６項の方法。 8.前記N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがナイセリア・ゴノロエエから分離される特許請求の範囲第6項の方法。 9.前記アクセプター成分が非還元末端にガラクトースを有する特許請求の範囲第６項の方法。 10.前記ナイセリア・ゴノロエエがATCC33084である、特許請求の範囲第8項の方法。