JP2011510681A - 改変された特性をもつｔｓ２３アルファ‐アミラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載の発明は、アルファ‐アミラーゼ活性を有し、親アルファ‐アミラーゼに比較して改変される特性を有する親アルファ‐アミラーゼの変異体（ミュータント）及びその使用方法に関する。
【選択図】図９

Description

優先権
本出願は２００８年２月４日に出願した米国仮特許出願第６１／０２６，０５６及び２００８年６月６日に出願した６１／０５９，４０３に対して優先権を主張する。それにより、それら全体が参照により取り込まれる。

技術分野
本発明は記載のＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ（以後アルファ‐アミラーゼと称する）の変異体に関する組成物及び方法であり、変異体が親アミラーゼに対して改変される生化学的特性及び有利な性能特徴を有することを特徴とする。変異体は例えば、デンプン転換、エタノール生産、洗濯及び食器洗剤、硬い表面洗浄、織物湯通し、及び／又は甘味料生産における使用に有用である。

デンプンはアミロース（１５から３０％ｗ／ｗ）とアミロペクチン（７０から８５％ｗ／ｗ）の混合物である。アミロースは約６０、０００から約８００、０００の分子量（ＭＷ）を有する直鎖アルファ‐１，４‐結合グルコースユニットからなる。アミロペクチンは２４から３０のグルコースのユニットごとにアルファ‐１、６分岐点を含む枝分かれポリマーである。そのＭＷは一億に達し得る。

濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、
（１）アルファ‐アミラーゼでの固体デンプンの液状化（又は粘度低下）による約７から１０の平均重合度を有するデキストリンの生成、及び
（２）アミログルコシダーゼ（またグルコアミラーゼ又はＧＡと呼ばれる）で得られた液化デンプン（即ち、デンプン加水分解物）の糖化
を含む酵素の触媒によるプロセスで生産される。得られたシロップは高いグルコース含有量を有する。商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後に、イソシロップで知られるデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。

アルファ‐アミラーゼ類（アルファ‐１，４‐グルカン‐４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は不規則に内部のアルファ‐１，４‐グルコシド結合を切断することによりデンプン、グリコーゲン、関連する多糖を加水分解する酵素群を構成する。この酵素のクラスは、例えばデンプン処理の最初の段階（液状化）にて、織物の湯通しにて、再利用紙の脱インク処理にて、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの改変にて、浸漬穀物の粉砕にて、アルコール生産にて、甘味料（例えば、糖）の製造にて、飲料産業にて、醸造にて、油田にて、動物飼料にて、及び洗剤マトリクス中の洗浄剤として、数多くの重要な産業上の利用を有する。例えば、このような酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除くため用いることができる。

アルファ‐アミラーゼは、広範囲の細菌類、菌類、植物、及び動物の供給源から単離される。産業的に、多くの重要なアルファ‐アミラーゼは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）から単離されたものである。ある特徴的なアルファ‐アミラーゼは好アルカリ性バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼであって、デンプン加水分解活性を有する少なくとも５種類の酵素を生産する（Lin他、1998,Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23, Biotechnol. Appl. Biochem. 28: 61-68）。広いｐＨ範囲（即ち、ｐＨ４．７からｐＨ１０．８）に渡って安定であるけれども、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）番号ＴＳ‐２３のアルファ‐アミラーゼは最適ｐＨ９を有する。酵素は低い温度、例えば１５℃から２０℃で活性を有するけれども、ポリペプチドは４５℃の最適温度を有する。

改変される生化学的特性を有し、産業上利用において改善される性能を提供するアルファ‐アミラーゼの変異体の必要性が残っている。

本明細書に記載の発明は、例えば、デンプンの処理（デンプン液化、糖化等）、織物の処理（例えば、湯通し）、及び洗剤への添加剤として（デンプンベースの汚れを洗浄するため）のような多様な産業処理に関連して有利である改変される特性を有するＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼの変異体（ミュータント）に関する。

改変は特異的活性、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、酸化に対する安定性、Ｃａ^２＋依存性、ｐＨ活性プロファイル、ｐＨ安定性プロファイル、及び他の所望の特性における改変を含むが、これらに限定されない。典型的な改変されるｐＨ安定性プロファイルは低いｐＨ（例えば、ｐＨ＜６及びｐＨ＜５でさえも）にて増加される安定性及び又は高いｐＨ（例えばｐＨ＞９）にて増加される安定性である。

ある態様において、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％でさえも親アルファ‐アミラーゼに対して相同性を有するアミノ酸配列を有し、下記の少なくとも二つを含む。
（ａ）Ｃ末端の欠失、
（ｂ）アミノ酸２０１の置換、又は
（ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失
ここで、変異体はアルファ‐アミラーゼ活性を有する（番号を付するために配列番号１を用いる）。いくつかの実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは配列番号１である。いくつかの実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは配列番号１に対して特定の相同性を有する。

別の態様はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）番号ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む手作業又は自動食器洗浄組成物を含む。組成物はさらに界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤及び香料の一以上を含んでよい。食器洗浄組成物は手作業又は自動食器洗浄用に用いる組成物でよい。

関連する態様はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）番号ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗濯洗剤添加剤を含む。上述のように、組成物は、さらに界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤及び香料の一以上を含んでよい。また、組成物は界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料の一以上を含んでよい。

さらなる態様は、本明細書に記載の変異体をコードする核酸に関し、そのような核酸を含むベクターに関する。また、本発明は、ベクター、ファージ又はウイルスによりそのような核酸が挿入される細胞に関する。単離される宿主細胞は例えば、細菌又は菌類のような微生物である。細菌は、バシルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバシルス ステアロテルモフィルス（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（以前はバシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれる）、バシルス アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、及び バシルス ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）又はストレプトミセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、又は、ストレプトミセス ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）から選択されるグラム陽性菌である。あるいは、グラム陰性菌であって、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。

他の態様は変異体ポリペプチドを調製する方法に関し、デンプン液化のような多様な産業処理での変異体ポリペプチド単独又はアルファーデンプン分解酵素を含む他の酵素と組み合わせでの使用に関する。幾つかの態様は洗濯洗浄及び／又は食器洗浄のための変異体ポリペプチドの使用を含む。また、変異体ポリペプチドを用いる織物及び／又は他の固い表面を洗浄する方法を含む。別の態様においては本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼ又は織物湯通し組成物中の任意のアルファ‐アミラーゼ変異体の使用を含み、ここで、組成物は水性溶液である。また、前記組成物を用いる織物を湯通しする方法を含む。

変異体ポリペプチドは非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、微粒子、安定化液体又は被保護酵素の形態中に任意に存在してよい。別の態様は洗剤添加剤又は洗剤組成物がセルラーゼ、プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又は酵素の任意の組み合わせからなる群から選択される酵素をさらに含む。組成物中に用いるために考えられる他のアミラーゼは二以上の他のアルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、イソアミラーゼ、又はグルコアミラーゼを含む。

幾つかの態様は、水溶液中バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン処理のための組成物に関する。また、デンプン処理のためのそのような組成物を使用する方法に関する。方法又は組成物はさらにグルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、又はそれらの組み合わせを含んでよい。別の態様は溶液又はゲル中にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含み、さらに任意にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、抗菌剤、又はそれらの任意の組み合わせを含むバイオフィルム分解（例えば、加水分解）組成物に関する。また、前記組成物を用いるバイオフィルムを加水分解する方法に関する。

別の態様は、溶液中バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン糖化のための組成物に関する。従って、前記デンプンを糖化するのに十分な時間本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼを含む組成物を適用することを含むデンプンを糖化する方法も含む。

別の態様は、溶液中バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプンを液化するための組成物に関する。デンプンを液化するのに十分な時間組成物を適用することを含むデンプンを液化するの組成物を処理することを含むデンプンを液化する方法も含む。

組成物及び方法の幾つかの特定の態様を以下に示す。

ある態様において、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体であって、前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸を有し、下記の少なくとも二つを含む。
（ａ）Ｃ末端の欠失、
（ｂ）２０１残基の置換、又は
（ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失
ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸配列をいう。幾つかの態様において、変異体がアルファ‐アミラーゼ活性を有する。

幾つかの実施態様においては、変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも９０％の相同性を有する。幾つかの実施態様においては、変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも９５％の相同性を有する。ある実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する。

幾つかの実施態様においては、さらに、変異体が、残基８７、残基２２５、残基２７２、及び残基２８２からなる群から選択される残基の一以上にて置換を含む。

別の実施態様においては、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体であって、前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８５％の相同性を有し、Ｃ末端の欠失を含む。幾つかの実施態様においては、変異体は配列番号２のアミノ酸配列を有する。変異体が親アミラーゼと比較して冷水中デンプン汚れに対して増加される洗浄活性を有する

さらに、幾つかの実施態様においては、変異体が、Ｒ１８０及びＳ１８１の位置にて残基の欠失を含み、ここで、前記アミノ酸残基の位置が配列番号１のアミノ酸配列をいう。変異体は親アミラーゼと比較して増加される洗剤安定性を有してよい。

幾つかの実施態様においては、さらに変異体が２０１位置にて残基の置換を含み、ここでアミノ酸残基の位置が配列番号１のアミノ酸をいう。前記変異体が親アミラーゼに比較して増加される酸化安定性を有してよい。変異体は置換Ｍ２０１Ｌを有してよい。

さらに、変異体が、残基８７、残基２２５、残基２７２、及び残基２８２からなる群から選択される残基の一以上にて置換を含み、ここでアミノ酸残基の位置は配列番号１のアミノ酸をいう。

関連する態様において、本発明は本明細書に記載の変異体をコードする核酸に関する。幾つかの実施態様においては、本発明は適切なプロモーター下にこの核酸を含む発現ベクターに関する。幾つかの実施態様においては、本発明は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

関連する態様において、本発明は、手作業又は自動食器洗浄組成物であって、本明細書に記載の変異体及び界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤及び香料の一以上を含むことを特徴とする組成物に関する。

関連する態様において、本発明は、洗濯洗剤添加剤であって、本明細書に記載の変異体及び界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料の一以上を含むことを特徴とする組成物に関する。

別の態様において、本発明は、織物からデンプンを除く方法であって、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体存在下に織物をインキュベーションすることを含み、ここで前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、下記の少なくとも二つを含む方法に関する。
（ａ）Ｃ末端の欠失、
（ｂ）２０１残基の置換、又は
（ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失、
ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸をいい、前記インキュベーションは織物からデンプンを除去することを特徴とする。

関連する態様において、本発明は、デンプンを処理する方法であって、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体存在下に織物をインキュベーションすることを含み、ここで前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、下記の少なくとも二つを含む方法に関する。
（ａ）Ｃ末端の欠失、
（ｂ）２０１残基の置換、又は
（ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失、
ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸をいい、前記インキュベーションは前記デンプンを加水分解することを特徴とする。

これら及び本発明の組成物及び方法の他の態様及び実施態様は、明細書及び図面にかんがみて明らかである。

図１は親ＴＳ‐２３アミラーゼのアミノ酸配列（完全長、成熟、配列番号１）を示す。 図２はＡｍｙＴＳ２３ｔ欠失ポリペプチドのアミノ酸配列（成熟、配列番号２）を示す。太字及び下線部のテキストはＲ１８０、Ｓ１８１及びＭ２０１アミノ酸残基を示す。 図３は最適化ａｍｙＴＳ２３遺伝子のＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。 図４は最適化ａｍｙＴＳ２３ｔ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。 図５はＡｍｙＴＳ２３及びＡｍｙＴＳ２３ｔ用の発現カセットを示す。 図６は完全長ＡｍｙＴＳ２３アミラーゼ（ＡｍｙＴＳ２３ｆｌ）及びＯｘＡｍコントロールを用いる布見本洗浄試験の結果を示すグラフである。 図７はアミラーゼＡｍｙＴＳ２３ｆｌ及びＯｘＡｍコントロールを用いる布見本洗浄試験の結果を示すグラフである。 図８はアミラーゼＡｍｙＴＳ２３ｔ及びＯｘＡｍコントロールを用いる布見本洗浄試験の結果を示すグラフである。 図９はアミラーゼＡｍｙＴＳ２３ｔ及びＯｘＡｍコントロールを用いる布見本洗浄試験の結果を示すグラフである。 図１０は二つの異なる洗濯洗浄製剤におけるＡｍｙＴＳ２３ｔ及びＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳを用いる促進される安定性試験を示すグラフである。 図１１はＡｍｙＴＳ２３ｔ、ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ及びＡｍｙＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１＋ΔＲＳ）の酸化安定性を示すグラフである。 図１２はコメデンプン布見本における液体洗剤中ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの性能を示すグラフである。 図１３は電荷変化の関数として残留活性を表示したグラフである。 図１４は本明細書にて言及するさらなるアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。

詳細な説明
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）番号ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ及びその変異体に関する組成物及び方法を記載する。ＴＳ‐２３の変異体は改変される生化学的特徴を有し及び例えば、洗濯及び食器洗浄適用において高い性能を発揮する。変異体のこれら及び他の特徴及び変異体を使用するための適用を詳しく述べる。

１．略語及び定義
次の略語及び定義を適用する。単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」はそんな酵素の複数を含み、「製剤（ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」の意味は一以上の製剤及び当業者等が知っているそれらと同等な製剤のー又は複数の意味を含む。

本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。

組成物及び方法のいくつかの態様は遺伝子工学及び分子生物学の分野にて用いる規定の技術及び方法に依存する。次の資料は本組成物及び本発明に従って有用な遺伝子工学の記載を含む。それはSambrook他MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2nd Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990)及び Ausubel他、Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994)である。これらの一般的参考書は当業者に周知の定義及び方法を記載する。しかしながら、本明細書に記載の組成物及び方法は任意の特定の方法、手順、及び記載される試薬に限定すべきではない。なぜならこれらは変化するからである。本明細書に記載のものと類似及び同等の任意の方法及び材料が本明細書に開示される化合物、組成物及び使用方法の実施又は試験に用いてよいけれども、ここには好ましい方法及び材料を開示する。

タンパク質及びそれらをコードする遺伝子を記載する場合、遺伝子の名前は一般的に、イタリック体であり、大文字ではないが、一方、タンパク質の名前はイタリック体ではなく、一般的に最初の文字が大文字である。

特許及び刊行物内に記載されるすべての配列を含む本明細書に言及されるすべての特許及び刊行物は、参照により明確に取り込まれる。

１．１ 定義
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここで「ｘ」は任意の数字である。実際に、その用語は任意の植物ベースの原料であって、穀物、草、塊茎、及び根を含むが、これらに限定されず、特に、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、コメ、ソルガム、ふすま、キャッサバ、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカを含むがこれらに限定されない。

本明細書にて用いる用語「アミラーゼ」は、デンプンの分解を触媒できる酵素を意味する。アミラーゼ類はデンプン中のアルファ‐Ｄ‐（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、アルファ‐アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１； α‐Ｄ‐（ｌ→４）‐グルカン グルカノヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐Ｄ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。それに対して、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断し、例えば、ベータ‐アミラーゼ（ＥＣ ３．２.１．２．α‐Ｄ‐（ｌ→４）−グルカン マルトヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））及びマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ α‐ａｍｙｌａｓｅ）（ＥＣ ３．２．１．１３３）のようなある産物特異的アミラーゼ類である。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ (ＥＣ ３．２．１．２０; α‐Ｄ‐グルコシド グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、グルコアミラーゼ (ＥＣ ３．２．１．３; α‐Ｄ‐（ｌ→４）-グルカン グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、及び産物特異的アミラーゼ類はデンプンから特徴的な長さの麦芽オリゴ糖を生産する。本明細書にて用いるアミラーゼは、任意／すべてアミラーゼを含み、グルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、及び例えばバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のような野生型アルファ‐アミラーゼを含む。

「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」及び同様なフレーズは、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３由来のアルファ‐アミラーゼをいう。アルファ‐アミラーゼをコードする遺伝子は、野生型遺伝子又はアルファ‐アミラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドである。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３の成熟アルファ‐アミラーゼ（アミノからカルボキシの方向）（配列番号１、図１）を示す。

本明細書にて用いる「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ変異体」及び同様なフレーズは、野生型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼの変異体／ミュータントを意味し、それはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３の親（野生型、参照）アミノ酸配列についてアミノ酸置換、追加、及び／又は欠失を含む。「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、「ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）」という用語と互換可能に用いてよい。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ変異体は親シグナル配列に関してシグナル配列中に変異を含んでよい。さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ変異体は、例えば、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＬＡＴ）由来の異種のアルファ‐アミラーゼシグナル配列を含む融合タンパク質の形態でもよい。

本明細書にて用いる語句「親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、「野生型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、「参照バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ」、及び同様な語句はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３のポリペプチドをいう。用語は、「親酵素（ｐａｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）」、「野生型酵素（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｅｎｚｙｍｅ）」、「親ポリペプチド（ｐａｒｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、参照ポリペプチド（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」等に便宜的に略されてよい。親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼは親ポリペプチドのシグナル配列における変異を含んでよい。さらに、親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼは、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）のような異種のアルファ‐アミラーゼシグナルペプチドを含む融合タンパク質の形態でもよい。

「親核酸／ポリヌクレオチド」、「野生型核酸／ポリヌクレオチド」又は「参照核酸／ポリヌクレオチド」は、親ポリペプチドをコードする核酸配列及びそれらに相補的な核酸をいう。

「変異体核酸／ポリヌクレオチド」は、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列又はそれらに相補的な核酸、又は親ポリヌクレオチド配列又はそれらに相補的な核酸に対して置換、挿入、欠失を少なくとも一つ有するポリヌクレオチド配列をいう。そのような特定の核酸は参照配列に特定の割合で相同性を有するもの又は参照配列にハイブリダイズできるものを含んでよい。例えば、ストリンジェント条件下[例えば、５０℃及び０．２ＸＳＳＣ(１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ Ｎａ_３ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ ７．０])、又は高いストリンジェント条件下[例えば、６５℃及び０．１ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ Ｎａ_３ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ ７．０）]である。変異体核酸は、例えば、メチロトローフ酵母（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）等）又は糸状菌（例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ））又は、他の発現宿主（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等）のような特定の宿主生物にとって有用な所望のコドンを反映して最適化してよい。

用語「組み換え」は、対象の細胞、核酸、タンパク質又はベクターに言及して用いる場合、対象が、異種核酸又はタンパク質の導入又は天然の核酸又はタンパク質の改変により修飾されていること、又は細胞が、そのように修飾された細胞由来であることを示す。即ち、例えば、「組み換え細胞」は、細胞の天然（非組み換え）形態の中に見られない遺伝子を発現し、さもなければ発現する又はまったく発現しない条件下過剰に発現した天然遺伝子を発現する。

用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合し及び自然に見られる少なくとも一つの成分から除去される化合物、タンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。

本明細書にて用いる用語「精製される」は、相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋又は少なくとも約９９％純粋である材料（例えば、単離されるポリペプチド又はポリヌクレオチド）をいう。

用語「熱安定性の」及び「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、活性を維持するような酵素能力を意味する。例えば、アルファ‐アミラーゼ酵素のような酵素の熱安定性はその半減期によって測定される。半減期（ｔ_１／２）は、所定の条件下、半分の酵素活性が消失する間の分、時間、日の単位で表す時間である。半減期の値は高い温度にさらされた（即ち、高温に挑んだ）後残りのアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。

「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を有するもとでのｐＨの範囲をいう。

本明細書にて用いる用語「ｐＨ安定の」及び「ｐＨ安定性」は、所定の時間（例えば、１５分、３０分、１時間等）にｐＨの広い範囲に渡って活性を維持する酵素能力に関する。

本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義語であり、互換可能に用いる。そのようなアミノ酸配列が活性を有する場合、それらの用語は「酵素」をいう。従来の１文字又は３文字アミノ酸残基コードを本明細書にて用いる。

用語「核酸」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及びポリペプチドをコードできる合成分子を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖でよく及び化学的修飾でよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は互換可能に用いてよい。遺伝子コードは縮退するので、二以上のコドンを特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、明細書に記載の組成物及び方法は特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

他に指示しない限り、それぞれ核酸は５’から３’の方向を左から右へ記載し、アミノ酸はアミノからカルボキシルの方向を左から右へそれぞれ記載する。

「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある度合いの相同性を有する物を意味する。周知の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴ等）用いて、相同配列は対象配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％でさえも相同的なアミノ酸配列を含むと考えられる。一般的に、特に断りがない限り、相同性は対象アミノ酸配列の同様の活性部位残基を含む。

本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション法及びポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法の間で生じる相補鎖を有する核酸塩基対の一本鎖による過程をいう。

本明細書にて用いる「合成の」分子は、生物によって生産されるよりむしろインビトロで化学的又は酵素的合成によって生産される。

本明細書にて、細胞に関して用いる場合の用語「形質転換される」「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして保持される外来種（例えば、異種の）の核酸配列を有することを意味する。

細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、周知技術の「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味する。

「宿主菌株」又は「宿主細胞」は、所望のポリペプチド（例えば、変異体アルファ‐アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス又はＤＮＡ構築体が導入された微生物を意味する。例えば、宿主菌株は細菌細胞である。用語「宿主細胞」はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の細胞のような細胞から創製されるプロトプラストを含む。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「異種の」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然的に発生するポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。

本明細書にて用いる用語「発現」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。プロセスは転写及び翻訳両方を含む。

用語「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は遺伝子を保持する宿主細胞の選択に役立つように宿主中に発現可能な遺伝子をいう。選択可能なマーカーの例は抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。

用語「培養する」は液体又は固体培地において適切な条件下に微生物細胞の集団を増殖することをいう。培養するは、最終産物への粒状デンプンを含むデンプン基質の発酵性バイオコンバージョンをいう（一般的に容器又は反応器）。

「発酵」は、単純な有機化合物を生産するために行われる微生物による有機基質の酵素的及び嫌気的分解である。発酵は嫌気的条件下に行われるけれども、酸素存在下でも発酵が行われるので、その用語は厳格な嫌気的条件に限定されることを意図していない。

「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するＤＮＡセグメントをいい、コード領域、コード領域の前後の領域、及び個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。

「ベクター」は一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。

「発現ベクター」は適切な宿主においてＤＮＡの発現に影響をあたえられる適切な制御配列に作動可能に結合された所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。

「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。プロモーターは誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。プロモーターの例はバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＬ）プロモーターである。

用語「作動可能に結合する」は、特定の成分が意図する態様で機能を行うようにそれらを許可する関係（並列を含むがこれに限定されない）であることを意味する。例えば、コード配列に作動可能に結合する調節配列は、コード配列に作動可能に結合し、コード配列の発現が調節配列の制御下にある。

「転写コントロール下に」はポリヌクレオチドの配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動可能に結合することにより依存することを意味する。

「翻訳コントロール下に」は、ポリヌクレオチドの配列、通常ＲＮＡ配列の翻訳が翻訳の開始又は翻訳の促進に貢献する要素に作動可能に結合することにより依存することを意味する。

「シグナル配列」はタンパク質のＮ末端の一部に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞外へのタンパク質の分泌を手助けする。細胞外タンパク質の成熟型は分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。

本明細書にて用いる「生物学的活性な」は、酵素活性のような特定の生物学的活性を有する配列をいう。本発明のアミラーゼの場合、活性はアルファ‐アミラーゼ活性である。

「水の硬度」とは、水中に存在する鉱物（例えば、カルシウム及びマグネシウム）の評価である。

「糖化」はグルコースへのデンプンの酵素的転換をいう。

「ゼラチン化」はクッキングによりデンプン分子の可溶化を意味し、粘性懸濁液となる。

「液化」はゼラチン化デンプンが加水分解され低い分子量の可溶化デキストリンとなる時のデンプン転換段階をいう。

用語「重合度（ＤＰ）」は所定のサッカライドにおけるアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）をいう。ＤＰ１の例は、グルコース及びフルクトースのようなモノサッカライドである。ＤＰ２の例は、マルトース及びスクロースのようなジサッカライドである、ＤＰ３＞は３より大きい重合度を有するポリマーを示す。

デンプン転換に関して、用語「最終産物」又は「所望の最終産物」はデンプン基質から酵素的に転換される特定の炭素供給源由来分子いう。

本明細書にて用いる用語「乾燥固体容量（ｄｓ）」は乾燥重量％表すスラリー中の全体固体をいう。

用語「スラリー」は不溶性固体を含む水溶性混合物をいう。

用語「残留デンプン」は発酵又は基質を含むデンプンの酵素的加水分解後組成物に残されたデンプン（可溶又は不溶）をいう。

本明細書にて用いる「再循環段階」はマッシュ成分の再循環をいい、残留デンプン、酵素及び／又はデンプンを含む基質を発酵する微生物を含む。

用語「マッシュ」はアルコールのような発酵産物を生産するために用いる発酵炭素源（炭水化物）を含む水溶性の混合物をいう。用語「ビ−ル（ｂｅｅｒ）」及び「マッシュ（ｍａｓｈ）」は互換可能に用いる。

用語「蒸留残液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）」は非発酵性固体及び水の混合物を意味し、発酵マッシュからアルコールを除去した後の残渣である。

用語「乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）」及び可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎ ｐｌｕｓ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)は穀物発酵の有用な副産物をいう。

本明細書にて用いる「エタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」は糖又はオリゴサッカライドをエタノールへ転換する能力を有する微生物をいう。エタノール生産微生物は一以上の酵素を発現する能力によりエタノールを生産し、別個に又は共に糖をエタノールへ転換する。

本明細書にて用いる用語「エタノール生産するもの」又は「エタノール生産微生物」はヘキソース又はペントースからエタノールを生産することができる任意の微生物又は細胞をいう。一般的にエタノール生産細胞はアルコール脱水酵素及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。エタノール生産微生物の例は酵母のような真菌微生物を含む。好ましい酵母はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌株を含み、特にサッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。

アミラーゼ酵素及びその基質に関して、用語「接触する」は酵素が基質を最終産物に転換できるように基質に十分に接近する状態に各酵素を配置することをいう。接触は混合を含んでよい。

用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は文脈次第で「から得られる（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」、「に基づく（ｂａｓｅｄ ｏｎ）」、「から得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ）」、又は「から得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ ｆｒｏｍ）」及び「から単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ）」を意味する。

用語「酵素転換」は一般的に酵素作用（例えば、アミラーゼ）による基質（例えば、デンプン）の修飾をいう。

本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下に単位時間当たり酵素調製物によって産物に転換される基質のモル数をいう。特異的活性は単位（Ｕ）／タンパク質のｍｇとして表わされる。

用語「収率」は方法により生産される最終産物又は所望の最終産物の量をいい、例えば濃度、体積、量、又は出発原料の割合で表される。

「ＡＴＣＣ」はマナッサス、Ｖａ、２０１０８に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）をいう。

「ＮＲＲＬ」はアグリカルチャー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナルセンター・フォー・アグリカルチャー・ユーティリゼーション・リサーチ（以前はＵＳＤＡ ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーとして知られる）ピオリア、Ｉｌｌをいう。

数字範囲は範囲を規定する数字すべてを含む。

一般的に、見出しは、説明であり、限定するものとして意味しない。

１．２ 略語
特に断りの無い限り次の略語を適用する。
ＡＥ アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯ アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯＳ アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）
ＡＥＳ アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）
ＡＦＡＵ 酸性菌類アルファ‐アミラーゼユニット（ａｃｉｄ ｆｕｎｇａｌ α−ａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔｓ）
ＡＧＵ グルコアミラーゼ活性単位（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｉｔ）
ＡＯＳ アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＡＳ アルコール硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
ＢＡＡ バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ
ＢＬＡ バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（又はＬＡＴ）
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）
ＣＭＣ カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
ＤＮＡ デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＤＰ３ ３つのサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）
ＤＰｎ ｎ個のサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）
ＤＴＭＰＡ ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＣ 酵素委員会（ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＯ エチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）
Ｆ＆ＨＣ 繊維及び家庭用ケア（ｆａｂｒｉｃ ＆ ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ ｃａｒｅ）
ＦＡＵ 菌アルファ‐アミラーゼ単位（ｆｕｎｇａｌ ａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔ）
ＧＡ グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）
ｇｐｇ １ガロン当たりのグレイン（ｇｒａｉｎｓ ｐｅｒ ｇａｌｌｏｎ）
ＨＦＣＳ 高フルクトーストウモロコシシロップ（ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）
ＨＦＳＳ 高フルクトースデンプンベースシロップ（ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｓｔａｒｃｈ ｂａｓｅｄ ｓｙｒｕｐ）
ＩＰＴＧ イソプロピル ベータ‐Ｄ‐１‐チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）
ＬＡＳ リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＬＯＭ ラウンダー‐Ｏ‐メーター（Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ）
ＬＵ リクイフオン単位（Ｌｉｑｕｉｐｈｏｎ Ｕｎｉｔｓ）
ＭＷ 分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）
ＭＷＵ 修飾ウォールゲムート（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）単位
ＮＯＢＳ ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩 （ｎｏｎａｎｏｙｌｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＮＴＡ ニトリロ三酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＣＲ ポリメラーゼチェーン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＰＥＧ ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）
ＰＶＡ ポリ（ビニル アルコール）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ））
ＰＶＰ ポリ（ビニルピロリドン）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））
ＲＮＡ リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＳＡＳ 第二級アルカンスルホン酸塩（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｋａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）
ＴＡＥＤ テトラアセチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）
ＴＣＡ トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＴＳＢ トリプティックソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）
ＵＦＣ 限外ろ過濃縮（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）
ｗ／ｖ 質量／体積（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）
ｗ／ｗ 質量／質量（ｗｅｉｇｈｔ／ｗｅｉｇｈｔ）
ｗｔ 野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）

１．３ 命名法
本明細書及び特許請求の範囲において、従来のアミノ酸残基用の１文字及び３文字コードを用いる。見やすいように、本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼ変異体は次の命名法を用いて記載する。
原型のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸

この命名法に従って、例えば２４２位のアラニンによるセリンの置換を次のように示し、
Ser242Ala又はS242A
３０位でのアラニンの欠失を次のように示し、
Ala30*又はA30*又はΔA30

及びリジンのような追加するアミノ酸残基の挿入を次のように示す
Ala30AlaLys又はA30AK。

アミノ酸残基３０−３３のようなアミノ酸残基の連続欠失を(30-33)*又はΔ(A30-N33)又はΔ30-33のように示す。アミノ酸残基R18O-S181のような二つの連続するアミノ酸の欠失をΔRS又はΔ18O-181のように示す。

特別なアルファ‐アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼと比較して「欠失」を含み、そのような位置に挿入される場合次のように示す
例えば３６位にアスパラギン酸を挿入する場合
*36Asp又は*36D。

複数の変異はプラス記号によって分離され、即ち、
Ala30Asp+Glu34Ser又はA30N+E34S
であり、３０及び３４位にてそれぞれアラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンへ置換する変異を表す。

一以上の別のアミノ酸残基が与えられる位置に挿入される場合それは次のように示す
A30N,E又は
A30N又はA30E。

さらに、修飾に有用な位置が任意の具体的修飾が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置に存在するそのアミノ酸残基のかわりに置換されてよいことが理解される。すなわち、例えば、これに特定されないが、３０位でアラニンの修飾が意図される場合、アラニンが欠失又は他のアミノ酸、即ち、
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V
のいずれかひとつに置換されてよいことが理解される。

さらに、「A30X」は次の置換のいずれか一つを意味する
A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y,又はA30V;

又は略した場合、A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,Vとなる。

親酵素が、ナンバリングのために用られ、その位置での置換を示唆される問題のアミノ酸残基をすでに有する場合、次の命名法を用いる
例えば、Ｎ又はＶのひとつが野生型に存在する場合
「X30N」又は「X30N,V」
つまり、親酵素に相当する他のものは３０位にて「Asn」又は「Val」に置換される。

１．４ アミノ酸残基の特徴
荷電アミノ酸、
Asp, Glu, Arg, Lys, His

負の電荷を持つアミノ酸（最も負に帯電している残基が最初に来る）
Asp, Glu

正の電荷を持つアミノ酸（最も正に帯電している残基が最初に来る）
Arg, Lys, His

中性アミノ酸
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro

疎水性アミノ酸残基（最も疎水性が高い残基を最後に記載する）
Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp

親水性アミノ酸残基（最も親水性が高い残基を最後に記載する）
Thr, Ser, Cys, Gｌn, Asn

１．５ 相同性（同一性）
整列後に別の配列に対して特定のパーセント（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％さえ）の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは塩基又はアミノ酸残基の割合が二つの配列を比較して同じである。このアライメント及びパーセント相同性又は同一性は周知の任意の適切なソフトウエアプログラムを用いて決定できる。例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel他、(eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18)に記載される。好ましいプログラムはthe Vector NTI Advance（商標） 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup program, FASTA (Pearson 他 (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)、及びBLAST (BLAST Manual, Altschul 他, Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md.及びAltschul他, (1997) Nuc．Acid Res． 25:3389-3402)を含む。他の好ましいアライメントプログラムはALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)であり、好ましくはデフォルトパラメータを用いる。使用に適した別の配列ソフトウエアプログラムはthe Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)で入手できるTFASTA Data Searching Programである。

相同性は第二から第一配列の導出を示す二つの配列間の相同性割合として決定されてよい。相同性はＧＣＧプログラムパッケージ（上述）が提供するＧＡＰのような周知のコンピュータープログラム手段により適切に決定されてよい。つまり、Gap GCG v8は相同性用デフォルトスコアリングマトリックス及び次のデフォルトパラメータを用いてよい。それは、核酸配列比較のためにそれぞれ５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．３のエクステンションペナルティー及びタンパク質配列比較のためにそれぞれ３．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．１のエクステンションペナルティーである。アライメントを作り、相同性を計算するためにＧＡＰはNeedleman and Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443-453 (1970)の方法を用いる。

ＡｍｙＴＳ２３（配列番号１）及び例えば、別のアルファ‐アミラーゼの間の構造アライメントはＡｍｙＴＳ２３と高い相同性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９６％、９７％、９８％、又は９９％さえも有する他のアルファ‐アミラーゼにおける同等／相当の位置を同定するために用いてよい。前記構造アライメントを得る一つの方法はギャップペナルティーのデフォルト値、即ち、３．０のギャップクリエーションペナルティー及び０．１のギャップエクステンションペナルティーを用いるＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ Ｕｐプログラムを用いることである。他の構造アライメント方法は疎水性クラスター分析(Gaboriaud他, FEBS Lｅｔｔ． 224, pp.149-155 (1987))及びリバーススリーディング（reverse threading）(Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No.1 pp. 142-149 (1998))を含む。

１．６ ハイブリダイゼーション
上記ＡｍｙＴＳ２３の特徴を用いたオリゴヌクレオチドプローブは問題とするアルファ‐アミラーゼの完全又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列の基礎として適切に調製される。

ハイブリダイゼーションを試験するために適した条件は５ＸＳＳＣに予浸及び２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ`ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、及び５０ｍｇの変性超音波処理仔牛胸腺ＤＮＡ溶液に４０℃にて１時間予ハイブリダイゼーションを行い、引き続き、１００ｍＭ ＡＴＰを補給した同様の溶液に４０℃にて１８時間ハイブリダイゼーションをし、それから２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中４０℃で３０分間（低いストリンジェンシー）好ましくは５０℃（中程度のストリンジェンシー）で、より好ましくは６５℃（高いストリンジェンシー）でさらに好ましくは７５℃（より高いストリンジェンシー）で三回のフィルター洗浄を行う。より詳しいハイブリダイゼーション方法についてはSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring がHarbor, 1989に記載される。

本明細書において、「から由来する」は該当生物の菌株により生産された、もしくは生産され得るアルファ‐アミラーゼを示すだけでなく、そのような菌株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされるアルファ‐アミラーゼ及び前記ＤＮＡ配列で形質転換される宿主生物中に生産されるアルファ‐アミラーゼも示すように用いられる。最後に、その用語は合成の及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、該当アルファ‐アミラーゼとして同定される特徴を有しているアルファ‐アミラーゼ示すように用いられる。また、その用語は親アルファ‐アミラーゼが自然に発生するアルファ‐アミラーゼの変異体、即ち、自然に発生するアルファ‐アミラーゼのアミノ酸残基の一以上の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体を示すこともある。

また、本発明の組成物及び方法により含まれる配列が、例示するａｍｙＴＳ２３配列（例えば、図４に示す配列番号４）を伴うストリンジェントハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイゼーションする能力によって明らかとなることを当業者は理解できる。核酸の一本鎖の形態が温度及びイオン強度の溶液の適切な条件下に他の核酸にアニールできる場合、核酸は別の核酸配列とハイブリダイゼーションできる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知である（例えば、Sambrook(1989)上述、特に9章及び11章を参照願いたい）。いくつかの実施態様においては、ストリンジェントな条件は６５℃のＴｍ及び０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する。

１．７ 親アルファ‐アミラーゼ
本明細書によれば、任意のＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼは、上記に明らかにするように、親（即ち、バックボーン）アルファ‐アミラーゼとして用いてよい。好ましい実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは、例えば、上記に参照されるものの一つ、配列番号１（図１参照）に示すアミノ酸配列を有するＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼのようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３の由来である。

１．８ 改変される特性
次のセクションは本明細書にて記載する変異体アミラーゼ中に存在する変異及びそれらから得られる特徴（親ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼの特徴と相対的に）についての所望の改変との関係を記載する。本発明の組成物及び方法により含まれる変異体を本明細書を通して詳しく記載し、次のパラグラフにて単にまとめるにすぎない。

上述のように、本発明の組成物及び方法の態様はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３由来及び由来できるアルファ‐アミラーゼに関連し、親アミラーゼに比較して改変される特性を有するその変異体／ミュータントを含む。親アミラーゼは上述の親ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ及び成熟ポリペプチドのアミノ酸配列のような、ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼの少なくとも一部を含むハイブリッド又はキメラアミラーゼである。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ（配列番号１）が変異体アミラーゼを検討するための開始点として用いられる一方、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼに高い度合いで相同性を有する他のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼが本発明の組成物及び方法の範囲を逸脱せずに親アミラーゼとして役立つと理解できる。これは本明細書に記載の対象であって、置換、欠失、又は挿入を含まないバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼに比較して非常にわずかな配列の違いを含む他の自然的に発生するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼに特にあてはまる。

本発明の組成物及び方法の最初の実施態様においては、親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株アルファ‐アミラーゼの変異体を提供し、変異体は以下の改変を少なくとも二つ含む。
（ａ）Ｃ末端の欠失、
（ｂ）配列番号１のナンバリングを用いてアミノ酸２０１（即ち、Ｍ２０１）の置換、又は
（ｃ）Ｒ１８０、Ｓｌ８１、Ｔ１８２及びＧ１８３からなる群から選択される少なくとも二つの残基の欠失。ここでアミノ酸残基のナンバリングは配列番号１をいう。
いくつかの実施態様においては、改変は（ａ）及び（ｂ）を含む。他の実施態様においては、改変は（ａ）及び（ｃ）を含む。幾つかの実施態様においては、さらに、変異体は残基８７、残基２２５、残基２７２、及び残基２８２からなる群から選択される残基の一以上にて置換を含んでよい。好ましくは、変異体アミラーゼはアルファ‐アミラーゼ活性を有する。特定の改変が明確化されることを除いて、変異体の他の維持されるアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸配列相同性を有してよい。

関連する態様において、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体を提供し、ここで変異体は親アルファ‐アミラーゼに対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、Ｃ末端欠失を有する。変異体は配列番号２のアミノ酸配列でもよい。変異体は親アミラーゼに比較して冷水中デンプン基質に対して増加される洗浄活性を有してよい。

いくつかの実施態様においては、Ｃ末端の欠失を含む変異体はさらにＲ１８０及びＳ１８1（配列番号１のアミノ酸配列をいう）の位置での残基の欠失を含んでよい。得られる変異体は親アミラーゼに比較して増加する洗剤安定性を有してよい。

いくつかの実施態様においては、Ｃ末端の欠失を含む変異体は、さらに２０１位（再度、配列番号１のアミノ酸配列をいう）での残基の置換を含んでよい。得られる変異体は親アミラーゼに比較して増加する酸化安定性を有してよい。

いくつかの実施態様においては、任意の前述の変異体は、さらに残基８７、残基２２５、残基２７２、及び残基２８２からなる群から選択される残基の一以上での置換を含んでよい。

１．８．１ 安定性
本明細書にて記載する変異体の文脈において、改変される安定性（即ち、より高い又はより低い安定性）、特に、安定性の改善、特に高い温度（即ち、７０−１２０℃）及び／又は極端なｐＨ（即ち、低い又は高いｐＨ、即ち、それぞれｐＨ４−６又はｐＨ８−１１）、特に、６０ｐｐｍ以下の遊離（即ち、溶液中のその非結合）カルシウム濃度での安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、「改変される特性」セクションに記載される変異のいずれかを含む。安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．２ Ｃａ ^２＋ 安定性
改変されるＣａ^２＋安定性はＣａ^２＋減少下に酵素の安定性が改善される、即ち、高い又はより低い安定性を意味する。本明細書に記載する変異体の文脈において、改変されるＣａ^２＋安定性、特に、Ｃａ^２＋安定性の改善、即ちより高い又はより低い安定性、特に、高いｐＨ（即ち、ｐＨ８−１０．５）の安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、「改変される特性」セクションに記載される変異のいずれかを含む。

１．８．３ 特異的活性
さらなる実施態様においては、改変される特異的活性、特に特異的活性の増減、特に、１０から６０℃までの温度、好ましくは２０から５０℃、特に３０から４０℃の温度で特異的活性を有する変異体を得ることに関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠失を含む）は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。特異的活性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．４ 酸化安定性
本明細書にて記載される変異体は、親アルファ‐アミラーゼと比較して、改変される酸化安定性、特に高い酸化安定性を有してよい。増加される酸化安定性は例えば、洗剤組成物において有利であり、減少される酸化安定性はデンプン液化用組成物において有利である。酸化安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．５ 改変されるｐＨプロファイル
改変されるｐＨプロファイル、特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８−１０．５）又は低いｐＨ（即ち、ｐＨ４−６）で活性を改善されるプロファイルを有する重要な位置及び変異は活性部位残基のそばに位置するアミノ酸残基の変異を含む。

好ましい具体的変異／置換は問題とする位置について「改変される特性」セクションにおいて上述したもののひとつである。適切な試験は下記の「方法」のセクションにて記載される。

１．８．６ 洗浄能力
改善される洗浄能力、特に高いｐＨ（即ち、ｐＨ８．５−１１）での洗浄能力を有する変異体を得ることに関して重要な位置及び変異は、該当位置における「改変される特徴」セクションにおいて上述する具体的な変異体／置換を含む。洗浄能力は下記の「方法」のセクションにて記載されるように試験される。

２．アルファ‐アミラーゼ変異体の調製方法
すなわち、ある実施態様は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼの変異体を生産するために、すでに他の決定されているアミノ酸の置換、欠失、トランスバージョン、挿入、及びそれらの組み合わせを含む組み換え体を創るバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ配列を提供する。これらの変異体はさらに生産増強、ｐＨ安定性の増加、温度安定性の増加、Ｃａ^２＋の要求性の低減、特異的活性の増加、食器洗浄又は洗浄能力の増加、可溶性の増加、保存安定性の増加、又はこれらの組み合わせを有することができる。変異体を遺伝子組み換えで生産する方法は提供される配列及びベクターを用いて実施され、又は他の周知の方法で実施されるであろう。

遺伝子に変異を導入するための幾つかの方法は周知である。アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列のクローニングの手短な説明の後、アルファ‐アミラーゼコード配列内の具体的な位置にて変異を作成する方法を説明する。

２．１ アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、周知の多様な方法を用いて、該当アルファ‐アミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離されてよい。まず、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、対象となるアルファ‐アミラーゼを生産する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築される。それから、アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、該当生物から調製する遺伝子ライブラリーからのアルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するために相同体、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを合成して用いる。あるいは、知られているアルファ‐アミラーゼ遺伝子に相同性のある配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーション及び低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのプローブとして用いることができる。

アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのさらに別の方法はプラスミドのような発現ベクターに遺伝子ＤＮＡのフラグメントを挿入し、アルファ‐アミラーゼ陰性細菌を得られる遺伝子ＤＮＡライブラリーを用いて形質転換し、及びそれからアルファ‐アミラーゼに対する基質を含む寒天培地の上に形質転換細菌を平板培養し、それによってアルファ‐アミラーゼを発現するクローンを同定できる。

あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列を例えば、S. L. Beaucage及びM. H. Caruthers (1981)により記載されるフォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法又はMatthes他 (1984)により記載される方法のような確立した標準方法により合成的に調製してもよい。フォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法において、オリゴヌクレオチドを例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、及び適切なベクターへクローニングする。

最後にＤＮＡ配列は、標準的な方法に従って、合成フラグメント、遺伝子、又はｃＤＮＡ原型（必要に応じて、完全なＤＮＡ配列の多様な一部に相当するフラグメント）をライゲーションにより調製される遺伝子及び合成の原型の混合、合成の及びｃＤＮＡの原型の混合又は遺伝子及びｃＤＮＡ原型の混合でよい。また、ＤＮＡ配列を例えば、米国特許第４，６８３，２０２又はR. K. Saiki他 (1988)に記載されるように、特異的なプローブを用いるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）により調製してよい。

２．２ 部位特異的突然変異誘発法
一度アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列を単離し、変異のための必要な部位を同定すると、変異を合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。これらのオリゴヌクレオチドは必要な変異部位を攻撃するヌクレオチド配列を含む。すなわち、オリゴヌクレオチドを合成する間に変異ヌクレオチドを挿入する。具体的方法において、アルファ‐アミラーゼコード配列をブリッジングするＤＮＡの一本鎖ギャップをアルファ‐アミラーゼ遺伝子を保持するベクター中に創製する。それから、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同性のある部分にアニーリングする。それから、残されるギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ））で満たし、構築体をＴ４リガーゼを用いてライゲーションする。Morinaga他 (1984)米国特許第４，７６０，０２５に記載のこの方法の具体例は、カセットのマイナー改変を実施することにより多数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、多数の、種々の長さのオリゴヌクレオチドが導入できるので、多くの変異でさえもＭｏｒｉｎａｇａの方法によって一度で導入できる。

アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列に変異を導入する別の方法がNelson及びLong (1989)に記載される。それはＰＣＲ反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成されるＤＮＡ鎖を用いることによって導入される所望の変異を含むＰＣＲフラグメントの３段階の生成を含む。ＰＣＲ生成フラグメントから変異を有するＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼの切断により単離し、発現プラスミドへ再挿入してよい。

変異体を提供する別の方法は、例えばＷＯ ９５／２２６２５(Affymax Technologies N. V.から)又はＷＯ ９６／００３４３(Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから)に記載のように、遺伝子シャッフリング、又は該当変異例えば、置換及び／又は欠失を含むハイブリッド酵素を得る他の相当する方法を含む。

２．３ アルファ‐アミラーゼ変異体の発現
上述する方法により又は任意の別の周知の方法により生産する変異体をコードするＤＮＡ配列をプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意の抑制遺伝子又は種々の活性遺伝子をコードする制御配列を任意に含む発現ベクターを用いて、変異体アミラーゼ（即ち酵素）を発現できる。

アルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えＤＮＡ手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。つまり、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、即ち、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。

ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は適切なプロモーター配列に作動可能に結合する。プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同のまたは異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向付ける適切なプロモーターの例は、特に細菌の宿主において、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、ゲオバシルス ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）麦芽アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バシルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。菌類の宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)、アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)リパーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。

発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼの変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合するポリアデニル化配列を含んでもよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に由来してもよい。

さらに、ベクターは問題とする宿主細胞でベクターが複製可能なＤＮＡ配列を含んでもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製の原型である。

また、ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。例えば、バシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ｄａｌ遺伝子のような、宿主細胞中の欠点を補完する遺伝子産物、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を有する遺伝子である。さらに、ベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｓＣのようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー、ハイグロマイシン耐性を増加するマーカー、又は例えば、ＷＯ ９１／１７２４３に記載のような同時形質転換によって行われる選択マーカーを含んでよい。

例えば、ある細菌又は菌類を宿主細胞として用いる場合、細胞内発現が幾つかの点で有利であるが、一般的に発現は細胞外であることが好ましい。一般的に本明細書にて記載するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは、培地への発現酵素の分泌を可能とするプレ領域を含む。必要ならば、このプレ領域を、異なるプレ領域又は個別のプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって便利に行われるシグナル配列により置換してもよい。

本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築体をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、 ２ｎｄ ｅｄ．, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９を参照）。

ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含む細胞は、アルファ‐アミラーゼ変異体の組み換えの生産での宿主細胞として有効に用いられる。宿主染色体にＤＮＡ構築体（一以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、細胞は、変異体をコードする本発明の組成物及び方法のＤＮＡ構築体で形質転換される。ＤＮＡ配列が細胞で安定的に維持される可能性が高いので、この組み込みは有利であると一般的に考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型では上述のように発現ベクターで形質転換されてもよい。細胞は哺乳動物又は昆虫のような高等生物の細胞でもよく、しかし、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は真菌類（酵母を含む）細胞である。

適切な細菌微生物の例は、グラム陽性菌であって、例えば、バシルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバシルス ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バシルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及び バシルス ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）又はストレプトミセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）あるいは、グラム陰性菌であって、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である。例えば、細菌の形質転換はプロトプラスト形質転換により、又はそれ自体周知の方法であるコンピテント細胞を用いることにより達成される。

好ましい酵母生物を例えばサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種から選択してよい。糸状菌は、例えば、アスペルギルス オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に有利に属してよい。菌細胞をプロトプラスト形成及びそれ自体知られている方法の細胞壁の再生を伴うプロトプラストの形質転換を含むプロセスにより形質転換してよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、ＥＰ２３８０２３の記載を含む。

さらなる実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ変異体を生産する方法は、変異体の生産をもたらす条件下、上述のように、宿主細胞を培養すること及び細胞及び／又は培養培地から変異体を回収する方法を含んでいる。

細胞を培養のために用いる培地は、アルファ‐アミラーゼ変異体の発現が得られ、問題となる宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。適切な培地は業者から入手可能であり、又は出版された手順（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載のように）に従って調製してもよい。

宿主細胞から分泌されるアルファ‐アミラーゼ変異体は周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地のタンパク質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。

３．産業用利用
本明細書に記載のアルファ‐アミラーゼ変異体は多様な産業上利用できる有益な特性を有する。特に、酵素変異体は洗浄、食器洗浄、及び固い表面用洗浄洗剤組成物における成分として利用できる。

改変される特性を有する一以上の変異体はデンプンプロセスのために用いてよく、特にデンプン転換であって、特にデンプンの液化（例えば、米国特許第３，９１２，５９０、ＥＰ 特許出願番号 ２５２ ７３０及び６３ ９０９、ＷＯ ９９／１９４６７、及び ＷＯ ９６／２８５６７を参照願いたい。すべての引用文献はそれらの全体を参照によりとりこまれる）に用いてよい。また、デンプン転換目的の組成物も考えられ、本発明の組成物及び方法の変異体はさらにグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、及び他のアルファ‐アミラーゼを含んでよい。

さらに、一以上の変異体は特に甘味料及び例えばデンプン又は全粒穀物からの燃料、飲料、及び工業用エタノールのようなエタノール（例えば、米国特許第 ５，２３１，０１７を参照願いたく、参照によりその全体を本明細書に取り込む）の生産にも有用である。

また、本明細書に記載の変異体は織物、布地、及び衣類（例えば、ＷＯ ９５／２１２４７、米国特許第４，６４３，７３６、及びＥＰ １１９，９２０を参照願いたく、参照により全体が本明細書に取り込まれる）の湯通し、ビール製造又は醸造、パルプ及び紙の生産において有用である。

３．１ デンプン転換
液化及び糖化プロセスのような従来のデンプン転換プロセスは例えば、米国特許第３，９１２，５９０及びＥＰ ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｓ．２５２，７３０と６３，９０９に記載され、参照により全体が本明細書に取り込まれる。

実施態様においては、デンプンを糖又は脂肪代替物のような小さい分子量炭水化物成分へ分解するデンプン転換プロセスは脱分岐段階を含む。

３．２ デンプンから糖への転換
デンプンの糖への転換の場合、デンプンは脱重合される。そのような脱重合プロセスは前処理段階及び２又は３の連続プロセス段階、つまり液化プロセス、糖化プロセス、及び所望の最終産物次第で、任意に異性化プロセスからなる。

３．３ 生デンプンの前処理
生デンプンは微粒子からなり室温にて水に不溶性である。水溶性デンプンスラリーを温めた場合、粒子は膨張し、最終的に破裂し、デンプン分子が溶液中に分散する。この「ゼラチン化」プロセスの間、粘度の劇的な増加がある。一般的な工業用プロセスにおいて固体レベルが３０‐４０％なので、デンプンが処理できるようにデンプンは薄くされ又は「液化」されなければならない。この粘度の低減は今日大半が酵素的分解によって得られる。

３．４ 液化
液化段階の間、長鎖デンプンはアルファ‐アミラーゼにより分岐及び直鎖の短い単位（マルトデキストリン）へ分解される。液化プロセスを１０５‐から１１０℃にて５から１０分実施し、続いて９５℃にて１‐２時間実施する。ｐＨは５．５と６．２の間にある。これらの条件下最適酵素安定性を確保するために、１ｍＭのカルシウムを添加（４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）する。この処理後、液化デンプンは１０‐１５の「デキストロース等量」（ＤＥ）を有する。

３．５ 糖化
液化プロセス後、マルトデキストリンはグルコアミラーゼ（例、ＯＰＴＩＤＥＸ（商標） Ｌ−４００）及びイソアミラーゼ（米国特許第４，３３５，２０８）又はプルラナーゼのような脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換する。この段階の前に、ｐＨは約４．５以下の値に下げられ、高温（９５℃以上）に維持され、液化アルファ‐アミラーゼ活性を不活化し、脱分岐酵素によって的確に加水分解されない「パノース前駆体（ｐａｎｏｓｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）」と呼ばれる短いオリゴサッカロイドの形成を低減する。

温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を加える。糖化プロセスは２４時間から７２時間で行う。

通常、液化段階後アルファ‐アミラーゼ変性する場合、約０．２‐０．５％の糖化産物は分岐トリサッカライド、Ｇｌｃｐαｌ‐６Ｇｌｃｐαｌ‐４Ｇｌｃ（パノース（ｐａｎｏｓｅ））であり、プルラナーゼにより分解されない。もし、活性ならば、液化段階からアミラーゼは糖化の間存在し（即ち、変性しない）、このレベルは１‐２％高くでき、これはかなり好ましくなく、糖化収率が著しく低下する。

３．６ 異性化
所望の最終糖生産物が、例えば高フルクトースシロップである場合、デキストロースシロップをフルクトースへ転換してよい。糖化プロセスの後、ｐＨを６．０から８．０の範囲の値、好ましくは、ｐＨ７．５に上げ、カルシウムをイオン交換により除去する。デキストロースシロップをそれから例えば、固定化グルコースイソメラーゼ（ＧＥＮＳＷＥＥＴ（商標）ＩＧＩ‐ＨＦのような）を用いてフルクトースシロップに転換する。

３．７ エタノール生産
一般的に全粒粉砕穀物からのアルコール生産（エタノール）は４つの主な段階に分かれ、
粉砕、
液化、
糖化、
発酵、
である。

３．７．１ 粉砕
構造を破壊し、さらなる工程にて処理するために穀物を粉砕する。用いる二つのプロセスは湿式又は乾式粉砕である。乾式粉砕において、全粒を粉砕し、工程の残りの部分に用いる。湿式粉砕は胚芽と粉末（デンプン顆粒及びタンパク質）の非常に良い分離を有し、若干の例外はあるが、シロップの並列プロダクションの領域にて利用する。

３．７．２ 液化
液化プロセスにおいて、デンプン顆粒はほとんどのＤＰが４より高いマルトデキストリンへの加水分解により溶解する。加水分解を酸処理により又はアルファ‐アミラーゼによる酵素的に行ってよい。酸性加水分解の利用は比較的限定的である。生原料は粉砕全粒穀物又はデンプンプロセスからの副流でよい。

酵素的液化は一般的に三段階高温スラリープロセスとして実施する。スラリーを６０‐９５℃の間、好ましくは、８０‐８５℃に加熱し、酵素を添加する。それからスラリーを９５‐１４０℃の間、好ましくは、１０５‐１２５℃にてジェットクック処理し、６０‐９５℃に冷却し、さらに酵素を添加し、最終加水分解を得る。液化プロセスはｐＨ４．５‐６．５にて、一般的には５と６の間のｐＨにて実施する。また、粉砕及び液化穀物はマッシュとして知られる。

３．７．３ 糖化
酵母により代謝される低分子糖ＤＰ_１−３を生産するために液化からマルトデキストリンをさらに加水分解しなければならない。一般的に加水分解はグルコアミラーゼにより酵素的に行われ、あるいはアルファ‐グルコシダーゼ又は酸性アルファ‐アミラーゼを用いてよい。完全な糖化段階は７２時間まで続けてよいが、通常４０‐９０分間予じめ糖化を行い、それから発酵（ＳＳＦ）の間に完全な糖化を行う。一般的に糖化を３０‐６５℃、一般的に約６０℃の温度にて、及びｐＨ４．５にて実施する。

３．７．４ 発酵
一般的にサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）由来酵母をマッシュに加え発酵を２４‐９６時間、例えば一般的に３５‐６０時間行う。温度は２６‐３４℃の間、一般的に約３２℃にて、ｐＨはｐＨ３から６、好ましくは約ｐＨ４‐５である。

最も広く用いられるプロセスは同時糖化発酵（ＳＳＦ）であり、糖化用のホールド段階を有さず、酵母と酵素を共に添加することを意味する。ＳＳＦを実施する場合、発酵直前に５０℃以上の温度にて予備糖化段階を導入することは共通する。

３．８ 蒸留
発酵に続いて、マッシュをエタノールを抽出するために蒸留する。その方法に従って得られるエタノールを例えば、燃料用エタノール、飲料用エタノール、即ち飲料用中性スピリッツ又は工業用エタノールとして用いてよい。

３．９ 副産物
発酵由来の使い残しは穀物であり、一般的に液体形状又は乾燥形状いずれかで動物用飼料として用いてよい。

液化、糖化、発酵、蒸留、及びエタノールの回収の実施方法について詳細は当業者に周知である。

本明細書に記載のプロセスに従って、糖化及び発酵を同時又は個別に実施してよい。

３．１０ パルプ及び紙の生産
また、本発明のアルファ‐アミラーゼをデンプン強化廃棄紙及び段ボールからパルプ、紙及び段ボールのようなリグノセルロース性原料の生産に用いてよく、特に再パルプ化がｐＨ７以上にて起こり、アミラーゼが強化デンプンの分解を通して廃棄物の分解に作用する。アルファ‐アミラーゼは特にデンプンコーティング印刷紙から製紙用パルプを生産するためのプロセスに有用である。プロセスをＷＯ ９５／１４８０７に記載のように実施してよく、次の、
ａ）紙を分解し、パルプを生産する段階、
ｂ）ａ）段階の前、間、後にデンプン分解酵素で処理する段階、及び
ｃ）ａ）段階とｂ）段階の後パルプからインク粒子を分離する段階
を含む。

また、アルファ‐アミラーゼはデンプン修飾に有用であり、酵素修飾デンプンを炭酸カルシウム、カオリン、及びクレイのようなアルカリ充填剤と一緒に製紙プロセスに用いる。本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼを用いて、充填剤存在下デンプンを修飾できるようになり、より簡単な分解プロセスが可能となる。

３．１１ 織物、布地、及び衣類の湯通し
また、アルファ‐アミラーゼは織物、布地、衣類の湯通しに有用である。織物加工産業においてアルファ‐アミラーゼは伝統的に湯通しプロセスの補助剤として用いられ、機織りの間横糸の保護コーティングとして働くデンプン含有サイズを除く作用がある。機織り後サイズコーティングの完全な除去はその後のプロセスである布地を洗浄、漂白及び染色において最適な結果を確保するために重要である。繊維原料になんら傷をつける影響がないので、酵素的デンプン分解は好ましい。プロセスコストを低減し、粉砕処理能力を増加するために、湯通しプロセスは時々洗浄及び漂白段階を組み合わせる。このような場合、従来のアルファ‐アミラーゼは高いｐＨレベル及び漂白剤にあまり適していないので、アルカリ剤又は酸化剤のような非酵素的充填剤は、デンプンを分解するために一般的に使用される。デンプンサイズの非酵素的分解は繊維の傷みを招く。なぜならかなり作用の強い化学薬品を用いるからである。従って、アルファ‐アミラーゼ変異体はアルカリ溶液中改善される性能を有するので、本発明の組成物及び方法のアルファ‐アミラーゼ変異体を使用することは好ましい。セルロースを含む布地又は織物を湯通しする場合、アルファ‐アミラーゼを単独に又はセルラーゼと組み合わせて用いてよい。

湯通し及び漂白プロセスは周知である。例えば、そのようなプロセスはＷＯ ９５／２１２４７、米国特許第４，６４３，７３６、及びＥＰ １１９，９２０に記載され、参照により全体を本明細書に取り込まれる。

湯通し用の商業的に入手可能な製品はＧｅｎｅｎｃｏｒ製ＯＰＴＩＳＩＺＥ（商標）ＦＬＥＸである。

また、本発明は、一以上のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を用いる布地の処理（例えば、織物の湯通し）の組成物及び方法を含む。酵素は任意の布地処理方法を用いてよく、それは周知技術であり、例えば、米国特許第６，０７７，３１６を参照願いたい。例えば、ある実施態様においては、布地の手触り及び外観が、溶液中布地をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触することを含む方法により改善される。ある実施態様においては、布地を加圧下その溶液で処理する。

ある実施態様においては、酵素を織物の製織の間又は後、又は湯通し段階、又は一以上の追加する布地処理段階の間に適用してよい。織物の製織の間、糸に相当な機械的負荷がかかる。機械織機で製織する前に、伸長強度の増加及び切断防止のために、縦糸をしばしばサイジングデンプン又はデンプン誘導体でコートする。酵素をこれらのサイジングデンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用する。織物が織られた後、布地を湯通し段階へ進めてよい。これは一以上の布地処理段階を伴う。湯通しは織物からサイズを除く作用がある。製織後、さらに布地を処理する前に均一で洗浄にたえる結果物を確保するためにサイズのコーティングは除かなければならない。また、本発明は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の作用によりサイズの酵素的加水分解を含む湯通しの方法を提供する。

酵素を綿素材の布地を含む布地を湯通しするため単独又は他の湯通し用化学試薬及び／又は湯通し用酵素と共に用いてよく、例えば液体組成物中の洗剤添加剤として用いてよい。また、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３菌株アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をインディゴ染色デニム生地及び衣類に見られるストーンウォッシュを生産する方法に及び組成物中に用いてよい。衣類製造のために、布地は衣服及び衣類に裁断及製縫され、その後完成する。特に、デニムのジーンズの製造のために異なる酵素的仕上げ方法が開発されている。衣類がデンプン分解酵素の作用を受けている間布地に柔軟性を与え、綿が次の酵素仕上げ段階をより受けやすくするためにデニム衣類の仕上げは通常酵素的湯通し段階で始まる。酵素をデニム衣類の仕上げ（例えば、「バイオ‐ストーン処理」（ｂｉｏ‐ｓｔｏｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）、酵素的湯通し及び布地に柔軟性を与え、及び／又はプロセスの仕上げに用いてよい。アミラーゼの用量はプロセスのタイプで決まり多様である。小用量は大用量の同じ酵素より時間が必要となる。しかしながら、溶液の物理的制約条件によって示す量以外に湯通しアミラーゼ含有量に上限はない。すなわち、酵素の限界量は溶液中に溶解できる量でよい。一般的に、アルファ‐アミラーゼのような湯通し酵素は、布地の重量で酵素タンパク質の約０．００００１％から約２％の量、又は布地の重量で酵素タンパク質の約０．０００１％から約１％の量、又は布地の重量で酵素タンパク質の約０．００１％から約０．５％の量で処理組成物に取り込まれるし、他の実施例では布地の重量で酵素タンパク質の約０．０１％から約０．２％の量である。

３．１２ ビール製造
また、本明細書に記載の多様なアルファ‐アミラーゼはビール製造プロセスに大変有用であり、アルファ‐アミラーゼを一般的にマッシュにするプロセスの間に添加する。

３．１３ 洗剤組成物
本明細書に記載の多様なアルファ‐アミラーゼは洗剤組成物に添加され、即ち、洗剤組成物の成分となる。

本明細書に記載の洗剤組成物は例えば、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業、又は機械用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。

具体的な実施態様においては、本明細書に記載の変異体酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤及び洗剤組成物はプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のタンパク質分解酵素、例えば、別のアルファ‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトジェニックアルファ‐アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ及び／又はセルロース、マンナナーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ 製ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（商標）のような）ペクチナーゼ、ペクチン リアーゼ、クチナーゼ、及び／又はラッカーゼのような一以上の酵素を含んでよい。

一般的に選択される酵素の特性は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。

プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。微生物が好ましい。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよく、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼ又はキモトリプシン様プロテアーゼでよい。アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えばサブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｎｏｖｏ）、サブチリシンカールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８ (ＷＯ ８９／０６２７９に記載)のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例、豚又は牛由来の）、及びＷＯ ８９／０６２７０及びＷＯ ９４／２５５８３に記載のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。

また、有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ９８／２３７３２、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ ９２／１９７２９、ＷＯ ９８／２０１１５、 ＷＯ ９８／２０１１６、及びＷＯ ９８／３４９４６に記載の変異体であって特に次の位置、すなわち２７、３６、５７、７６、８７、９７、 １０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、及び２７４の位置の一以上に置換を有する変異体を含むが、これらに限定されない。

商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はアルカラーゼ（商標）（ＡＬＣＡＬＡＳＥ）、サビナーゼ（商標）（ＳＡＶＩＮＡＳＥ）、プリマーゼ（商標）（ＰＲＩＭＡＳＥ）、ドゥララーゼ（商標）（ＤＵＲＡＬＡＳＥ）、エスペラーゼ（商標）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ）、及びカンナーゼ（商標）（ＫＡＮＮＡＳＥ）(ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ)製）、マキサターゼ（商標）（ＭＡＸＡＴＡＳＥ）、マキサカール（商標）（ＭＡＸＡＣＡＬ）、マキサペム（商標）（ＭＡＸＡＰＥＭ）、プロペラーゼ（商標）（ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ）、プラフェクト（商標）（ＰＵＲＡＦＥＣＴ）、プラフェクトＯＸＰ（商標）（ＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）、ＦＮ４（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ製）を含む。

リパーゼ：適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語 サーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)）由来のリパーゼであって、例えば、ＥＰ ２５８０６８及びＥＰ ３０５２１６記載のフミコーラ ラヌギノサ（Ｈ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ (Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)）由来、又は例えばＷＯ ９６／１３５８０記載のフミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来であり又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ由来であり、例えば、シュードモナス アルカリゲネス（Ｐ． ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナス シュードアルカリゲネス（Ｐ． ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ ２１８ ２７２)、シュードモナス セパシア（Ｐ． ｃｅｐａｃｉａ）(ＥＰ ３３１ ３７６)、シュードモナス スタッチェリ（Ｐ． ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ １，３７２，０３４)、シュードモナス フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の菌株ＳＤ ７０５（ＷＯ ９５／０６７２０及びＷＯ ９６／２７００２)、シュードモナス ウィスコンシネンシス（Ｐ． ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＷＯ ９６／１２０１２）由来であり、又は バシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼであって、例えば、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ他、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １１３１ ： ２５３−３６０)、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＪＰ ６４／７４４９９２)、又はバシルス プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＷＯ ９１／１６４２２)由来を含むが、これらに限定されない。製剤設計の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体例は、例えば ＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ ９４／０１５４１、ＥＰ ４０７２２５、ＥＰ ２６０１０５ ＷＯ ９５／３５３８１、ＷＯ ９６／００２９２、ＷＯ ９５／３０７４４、ＷＯ ９４／２５５７８、ＷＯ ９５／１４７８３、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９、及びＷＯ ９７／０７２０２に記載のものも含む。

商業的に入手可能なリパーゼ酵素はリポラーゼ（商標）（ＬＩＰＯＬＡＳＥ）及びリポラーゼウルトラ（商標）（ＬＩＰＯＬＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（商標））(Ｎｏｖｏｚｙｍｅ Ａ／Ｓ製）である。

ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼを組成物に含むことができる。適切なポリエステラーゼは、例えば、ＷＯ ０１／３４８９９及びＷＯ ０１／１４６２９に記載のものを含む。

アミラーゼ：一以上の追加的アミラーゼ（本明細書に記載の多様なアミラーゼに加えて）も含んでよい。適切なアミラーゼは（アルファ及び／又はベータ）は細菌類又は菌類由来のものを含む。化学修飾又はタンパク質工学的に処理される変異体を含む。アミラーゼは例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるアルファ‐アミラーゼを含み、例えばＧＢ １，２９６，８３９に詳しく記載のバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な菌株である。有用なアミラーゼの例はＷＯ ９４/１８３１４、ＷＯ ９６/３９５２８、ＷＯ ９４/０２５９７、ＷＯ ９４/１８３１４、ＷＯ ９６/２３８７３、及びＷＯ ９７/４３４２４記載の変異体であり、特に、次の一以上の位置に置換を有する変異体である。その位置は、１５, ２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４である。

商業的に入手可能なアルファ‐アミラーゼはデュラミル（商標）（ＤＵＲＡＭＹＬ）、リクエザイム（商標）（ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ）、ターマミル（商標）（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）、ナタラーぜ（商標）（ＮＡＴＡＬＡＳＥ）、ステインザイム（商標）プラス（ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ）、ステインザイム（商標）ウルトラ（ＳＴＡＩＮＺＹＭ ＵＬＴＲＡ）ファンガミル（商標）（ＦＵＮＧＡＭＹＬ）、及びバン（商標）（ＢＡＮ）(Ｎｏｖｏｚｙｍｅ Ａ／Ｓ製）又はラピダーゼ（商標）（ＲＡＰＩＤＡＳＥ）、及びプラスター（商標）（ＰＵＲＡＳＴＡＲ）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ製）である。

セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加してよい。適切なセルラーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼを含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，４３５，３０７、米国特許第５，６４８，２６３、米国特許第５，６９１，１７８、米国特許第５，７７６，７５７、及び国際ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９／０９２５９に開示されるフミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生産される菌類のセルラーゼである。一般的なトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼは米国特許第４，６８９，２９７、米国特許第５，８１４，５０１、米国特許第５，３２４，６４９、ＷＯ ９２／０６２２１及びＷＯ ９２/０６１６５に記載される。一般的なバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）セルラーゼは米国特許第６，５６２，６１２に記載される。

商業的に入手可能なセルラーゼはセルザイム（商標）（ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ）及びケアザイム（商標）（ＣＡＲＥＺＹＭＥ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製）又はクラジネース（商標）（ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ）及びプラダックス ＨＡ（商標）（ＰＵＲＡＤＡＸ ＨＡ）（ジェネンコ インターナショナル インク（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．））及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王社）を含む。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス シネレウス（Ｃ． ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のようなコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びＷＯ ９３／２４６１８、ＷＯ ９５／１０６０２、及びＷＯ ９８／１５２５７に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。

商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム（商標）（ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製）を含む。

洗剤酵素は一以上の酵素を含む個別の添加物を加えることによって、又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。本発明の組成物及び方法の洗剤添加物、すなわち、個別の添加物又は組合せ添加物は、例えば粒子、液体、スラリー等として製剤設計される。好ましい洗剤添加物製剤は、粒子、特に非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、液体、特に安定化液体又はスラリーを含む。

非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子を、米国特許第４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。ワックスコーティング材の例は、平均分子量１０００から２００００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティング材の例は、ＧＢ １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製物は、プロピレングリコール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸のようなポリオールを確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。被保護酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って調製されてよい。

一般的に、洗剤組成物は例えば棒状、錠剤、粉、粒子、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。液体洗剤は水性、典型的には、約７０％水分まで、及び０％から約３０％の有機溶剤まで含んでよい。例えば、約３０％以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルである。

洗剤組成物は一以上の界面活性剤を含み、それは、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性イオン性を含む非イオン性でもよい。界面活性剤は一般的に、０．１％から６０ｗｔ．％の範囲に存在する。

界面活性剤が含まれる場合、洗剤は通常約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコール エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。

界面活性剤を含む場合、通常、洗剤は約０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミン（「グルカミド」）のＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキル誘導体である。

洗剤はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例、ヘキスト社製ＳＫＳ−６）のような０％から６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよい。

洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル‐ピロリドン）、ポリ（エチレン グリコール）、ポリ（ビニル アルコール）、ポリ（ビニルピリジン‐Ｎ‐オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。

洗剤は、過酸形成漂白活性化剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と結合する過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ_２Ｏ_２供給源を含む漂白システムを含んでよい。あるいは、漂白システムは、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸）を含んでよい。また、漂白システムは、酵素的漂白システムでもよい。例えば、ＷＯ ０５/０５６７８２を参照願いたい。

本発明の組成物及び方法の洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤を用いて安定化してよい。例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体、又は例えば４−フォルミルフェニルホウ酸のようなフェニルホウ酸誘導体である。組成物はＷＯ ９２／１９７０９及びＷＯ ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてよい。

また、洗剤組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、クレー、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトープ、曇り防止剤、及び／又は香料を含む布地コンディショナーである。

洗剤組成物として、特にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を洗浄液１リットル当たり０．０１から１００ｍｇの酵素蛋白質、例えば、洗浄液１リットル当たり約０．０５から約５．０ｍｇの酵素蛋白質、又は洗浄液１リットル当たり約０．１から約１．０ｍｇの酵素蛋白質に相当する量を添加してよいことが本発明にて意図される。

本明細書に記載の変異体酵素の一以上をＷＯ ９７/０７２０２に記載の洗剤製剤に追加的に取り込んでよく、参照によりここに組み込まれる。

４．組成物及び使用
また、本明細書に記載の変異体酵素の一以上を洗剤における、特に洗濯洗剤組成物及び食器洗浄洗剤組成物、固い表面洗浄組成物、及び織物、布地、衣料の湯通し用組成物、パルプ及び紙の生産、醸造、エタノール生産、及び上記に記載のようにデンプン転換プロセスにおいてアルファ‐アミラーゼ変異体を使用する方法に用いてよい。

４．１ 洗濯洗剤組成物及び使用
実施態様によれば、一以上のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、一般的に、洗濯洗剤組成物の成分としてよい。そのような場合、非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、安定化した液体、又は保護された酵素の形態での洗浄組成物を含んでもよい。ドライ製剤は粒子又は微粒子の形態でもよい。非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子は例えば米国特許第４，１０６，９９１、及び４，６６１，４５２に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。ワックスのコーティング原料の例は、平均分子量１、０００から２０、０００であるポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、モノ、ジ、トリグリセリドの脂肪酸である。流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばＧＢ １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製物は、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。他の酵素の安定化剤は周知の技術である。被保護酵素を例えばＥＰ Ａｐｐｌｎ．２３８、２１６に記載される方法に従って調製してよい。ポリオールは蛋白質の安定化剤としても、蛋白質溶解性の改善としても長い間認められている。例えば、Ｊ． Ｋ． Ｋａｕｓｈｉｋ他、「Ｗｈｙ ｉｓ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ? Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｏｓｍｏｌｙｔｅ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２６４５８−６５ （２００３）及び そこに引用されている文献、及びＭｏｎｉｃａ Ｃｏｎｔｉ他、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ： ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ７５７： ２３７−２４５ （１９９７）を参照願いたい。

組成物は、主要な酵素成分、例えば、単一成分組成物として、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような複合酵素活性も以下に記載の他の酵素のような複合酵素活性も含んでもよい。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（例、フミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ））及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を含む。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス（Ｆ． ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅ）、フザリウム セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロオクウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム グラミナム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネガンディニス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム レティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スルフリューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルローサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム トリコテキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を含む。

洗剤組成物は例えば、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。一般的に、液体洗剤は、約７０％までの水及び０％から約３０％の有機溶剤を含有する液体でよい。また、約３０％の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態における洗剤組成物でもよい。酵素は酵素の安定性に適合する任意の洗剤組成物を用いてよい。一般的に、酵素は、カプセル化という周知の形態によって有害な成分から保護され、例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。酵素及び特定のアルファ‐アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄に適用に限定されず、また、表面洗浄剤、デンプン又はバイオマスからのエタノール産物でも用いられる。

洗剤組成物はそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンである界面活性剤の一以上を含む。洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＬＡＳ）、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）(脂肪アルコール硫酸塩（ｆａｔｔｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｕｌｆａｔｅ）)（ＡＳ）、アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）第二級アルカンスルホネート（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）（ＳＡＳ）、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル（α‐ｓｕｌｆｏ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）、アルキル‐又はアルケニルコハク酸（ａｌｋｙｌ‐ ｏｒ ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）又は石鹸のような０％から約５０％の陰イオン界面活性剤を含む。また、組成物は、アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコール エトキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、ノニルフェノールエトキシレート（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、アルキルポリグリコシド（ａｌｋｙｌｐｏｌｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アルキルジメチルアミンオキシド（ａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｏｘｉｄｅ）、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、脂肪酸モノエタノールアミド（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋｙｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｍｉｄｅ） (例えばＷＯ ９２／０６１５４に記載されるように)のような０％から約４０％の非イオン界面活性剤を含んでもよい。

さらに、洗剤組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又は任意の組み合わせのラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。上記を参照願いたい。

洗剤は、任意に、約１％から約６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよく、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例えば、ヘキスト製ＳＫＳ−６）である。また、洗剤は、アンビルト（ｕｎｂｕｉｌｔ）でもよい。即ち、本質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。

洗剤は、任意に、一以上のポリマーを含んでよい。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル アルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。

洗剤は、任意に、漂白システムを含んでよく、それは、過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなＨ_２Ｏ_２供給源を含んでよく、ここで、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と組み合わせてもよい。あるいは、漂白システムは、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでよい。また、漂白システムは、例えば、ＷＯ ２００５／０５６７８３に記載される、ペルヒドロラーゼが過酸を活性化する酵素的漂白システムでもよい。

洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が例えばＷＯ ９２／１９７０９及びＷＯ ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてもよい。

また、洗剤は、クレイ、発泡剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、蛍光増白剤、又は香料を含む例えば繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。

ｐＨ（用いる濃度での水溶液で測定）は通常中性又はアルカリ、例えば、ｐＨ約７．０から約１１．０である。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有洗剤組成物の特定の形態は下記を含むように製剤設計される。

１）約７％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１８}アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１６−１８}）、約５％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１４−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約２から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約１５％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約６％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７／Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、約１１％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約６％のＴＡＥＤ、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

２）約６％から約１１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約３％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１８}アルコール、１−２ＥＯ）、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１６−１８}）、約５％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１４−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１５％から約２１％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２４％から約３４％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約４％から約１０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７／Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−６％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

３）約５％から約９％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約７％から約１４％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１から約３％脂肪酸（例、Ｃ_{１６−２２}脂肪酸）としての石鹸、約１０％から約１７％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約３％から約９％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２３％から約３３％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約４％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約８％から約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約１％のホスホン酸塩（例、ＥＤＴＭＰＡ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

４）約８％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１０％から約２５％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ_２ＣＯ_３として）、約１％から約５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２５％から約３５％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約１０％の硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

５）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１２％から約１８％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１３％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、０％から約１３％のアルケニルコハク酸（ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｃ_{１２−１４}）、約８％から約１８％のアミノエタノール、約２％から約８％のクエン酸、０％から約３％のホスホン酸塩、０％から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０％から約２％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約３％のエタノール、約８％から約１４％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

６）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、３−９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１０％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、約１４％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約９％から約１８％のクエン酸カリウム、０％から約２％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０から約３％のポリマー（例、ＰＥＧ、ＰＶＰ）、０から約３％の例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、分子量３８００のような固着用ポリマー、０％から約５％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性構造化液体洗剤組成物。

７）約５％から約１０％の脂肪アルコール硫酸塩、約３％から約９％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０−３％脂肪酸としての石鹸、約５％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２０％から約４０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約２％から約８％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約１２％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約７％のＴＡＥＤ、約１％から約５％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

８）約８％から約１４％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約５％から約１１％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０％から約３％脂肪酸としての石鹸、約４％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約３０％から約５０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約３％から約１１％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約５％から約１２％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７）、約１％から約５％のポリマー（例、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。

９）約６％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％の非イオン界面活性剤、約２％から約６％脂肪酸としての石鹸、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１８％から約３２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約５％から約２０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約３％から約８％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７）、約４％から約９％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約１％から約５％の漂白活性剤（例、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、約１％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１０）約１５％から約２３％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約８％から約１５％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、２−３ＥＯ）、約３％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、０％から約３％脂肪酸（例、ラウリン酸）としての石鹸、約１％から約５％のアミノエタノール、約５％から約１０％のクエン酸ナトリウム、約２％から約６％のハイドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）（例トルエンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、０％から約２％のホウ酸塩（例、Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、約１％から約３％のエタノール、約２％から約５％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１１）約２０％から約３２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、６−１２％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約２％から約６％のアミノエタノール、約８％から約１４％のクエン酸、約１％から約３％のホウ酸塩（例、Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー）、約３％から約８％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１２）約２５％から約４０％の陰イオン界面活性剤（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸）、約１％から約１０％の非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）、約８％から約２５％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約５％から約１５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、０％から約５％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約１５％から約２８％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３４Ｈ_２Ｏ）、約０％から約５％の漂白活性剤（例、ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約３％の少量の成分（例、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１３）上記組成物１）−１２）に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル硫酸塩により置換される洗剤組成物。

１４）約９％から約１５％の（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル硫酸塩、約３％から約６％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋｙｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｍｉｄｅ）、約１０％から約２０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約１０％から約２０％層状２ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例、ヘキストからＳＫ５６）、約３％から約１２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、０％から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約４％から約８％のクエン酸ナトリウム、約１３％から約２２％の過ホウ酸ナトリウム、約３％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、光退色、香料、石鹸泡抑制剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１５）約４％から約８％の（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル硫酸塩、約１１％から約１５％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約４％の石鹸、約３５％から約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ、約２％から約８％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、０％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約１３％から約２２％の過炭酸ナトリウム、１―８％のＴＡＥＤ、０％から約３％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０％から約３％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０から約３％の少量の成分（例、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１６）追加的成分か又はすでに特定された漂白系に置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述１）から１５）に記載の洗剤製剤。

１７）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、１）、３）、７）、９）、及び１２）に上述するような洗剤製剤。

１８）マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に上述するような洗剤製剤。例えば、該マンガン触媒は、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ‐ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６３７‐６３９ （１９９４）に記載の化合物の一つである。

１９）例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダーシステム（例、リン酸塩）、酵素、及びアルカリのような液体非イオン性界面活性剤を含む非水性洗剤液として製剤設計される洗剤組成物。洗剤は陰イオン界面活性剤及び／又は漂白システムを含んでもよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗剤中に従来使用される濃度で含まれてよい。本発明において、洗剤組成物中バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗浄液のリットル当たり０．００００１‐１．０ｍｇ（純粋酵素蛋白質として計算）の酵素に相当する量を加えることを意図する。

他の実施態様おいては、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び／又は産業用の織物／洗濯に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に用いてよい。

例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業、又は機械用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。

特定の実施態様においては、洗剤組成物はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及びプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はこれ等の組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素に加えて２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、一以上のアルファ‐アミラーゼをさらに含んでもよい。

一般的に選択される酵素の特性は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。

４．２ 食器洗浄洗剤組成物
また、本発明のアルファ‐アミラーゼを食器洗浄洗剤組成物に使用してよく、下記を含む。
１）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 ０．４‐２．５％
メタケイ酸ナトリウム ０‐２０％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ） ３‐２０％
３リン酸ナトリウム ２０‐４０％
炭酸ナトリウム ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム ２‐９％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） １‐４％
硫酸ナトリウム ５‐３３％
酵素 ０．０００１‐０．１％

２）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 １‐２％
(例、アルコールエトキシレート)
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ） ２‐３０％
炭酸ナトリウム １０‐５０％
ホスホン酸ナトリウム ０‐５％
クエン酸３ナトリウム２水和物 ９‐３０％
ニトリロトリソジウム酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）（ＮＴＡ）０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物 ５‐１０％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） １‐２％
ポリアクリル酸ポリマー ６‐２５％
(例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー)
酵素 ０．０００１‐０．１％
香料 ０．１‐０．５％
水 ５‐１０％

３）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 ０．５‐２．０％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ） ２５‐４０％
クエン酸ナトリウム ３０‐５５％
炭酸ナトリウム ０‐２９％
重炭酸ナトリウム ０−２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物 ０‐１５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） ０‐６％
マレイン酸／アクリル酸性コポリマー ０‐５％
クレイ １−３％
ポリアミノ酸 ０−２０％
ポリアクリルナトリウム ０−８％
酵素 ０．０００１‐０．１％

４）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 １‐２％
ゼオライト ＭＡＰ １５‐４２％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ） ３０‐３４％
クエン酸ナトリウム ０‐１２％
炭酸ナトリウム ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物 ７‐１５％
テトラアセチルエチレン ０−３％
ジアミン（ＴＡＥＤ）ポリマー ０‐４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー ０‐５％
有機ホスホン酸塩（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ） ０‐４％
クレイ １‐２％
酵素 ０．０００１‐０．１％
硫酸ナトリウム 適量

５）粉状自動食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 １‐７％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）１８‐３０％
クエン酸３ナトリウム １０‐２４％
炭酸ナトリウム １２‐２０％
１過硫酸 １５−２１％
（２ＫＨＳＯ_５．ＫＨＳＯ_４．Ｋ_２ＳＯ_４）
漂白安定剤 ０．１−２％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー ０‐６％
ジエチレントリアミン５酢酸、５ナトリウム塩 ０−２．５％
酵素 ０．０００１‐０．１％
硫酸ナトリウム、水 適量

６）洗浄界面活性剤システムを有する粉状及び液状食器洗浄組成物
非イオン界面活性剤 ０‐１．５％
オクタデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物 ０−５％
オクタデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物及びヘキサデシルジメチルアミンＮ‐オキシド２水和物の８０：２０ｗｔ． Ｃ１８／Ｃ１６ブレンド ０−４％
オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ‐オキシド無水和物及びヘキサデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ‐オキシド無水和物の７０：３０ｗｔ． Ｃ１８／Ｃｌ６のブレンド ０−５％、
平均エトキシ化度が３であるＣ_１３−Ｃ_１５アルキルエトキシ硫酸塩 ０−１０％
平均エトキシ化度が３であるＣ_１２−Ｃ_１５アルキルエトキシ硫酸塩 ０−５％
平均エトキシ化度が１２であるＣ_１３−Ｃ_１５エトキシ化アルコール ０−５％
平均エトキシ化度が９であるＣ_１２−Ｃ_１５エトキシ化アルコールのブレンド ０−６．５％
平均エトキシ化度が３０であるＣ_１３−Ｃ_１５エトキシ化アルコールのブレンド ０−４％
２ケイ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ） ０‐３３％、
トリポリリン酸ナトリウム ０‐４６％
クエン酸ナトリウム ０−２８％
クエン酸 ０−２９％
炭酸ナトリウム ０‐２０％
過ホウ酸ナトリウム１水和物 ０‐１１．５％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐４％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー ０‐７．５％
硫酸ナトリウム ０−１２．５％
酵素 ０．０００１‐０．１％

７）非水溶性液状自動食器洗浄組成物
液状非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート） ２．０‐１０．０％
アルカリ金属ケイ酸塩 ３．０‐１５．０％
アルカリ金属リン酸塩 ２０．０‐４０．０％
高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液状担体 ２５．０‐４５．０％
安定剤 (例、リン酸エステルの一部及びＣ_１６−Ｃ_１８アルカノール) ０．５‐７．０％
泡抑制剤(例、シリコーン) ０‐１．５％
酵素０．０００１‐０．１％

８）非水溶性液状食器洗浄組成物
液状非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート） ２．０‐１０．０％
ケイ酸ナトリウム ３．０‐１５．０％
アルカリ金属炭酸塩 ７．０‐２０．０％
クエン酸ナトリウム０．０‐１．５％
安定化システム(例、微粉化シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合) ０．５‐７．０％
低分子量ポリアクリレートポリマー ５．０‐１５．０％
クレイゲル増粘剤（ｃｌａｙ ｇｅｌ ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）(例、ベントナイト) ０．０‐１０．０％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒ） ０．０‐０．６％
酵素 ０．０００１‐０．１％
高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエーテルから選択される液状担体 適量

９）チキソトロピック液状自動食器洗浄組成物
Ｃ_１２−Ｃ_１４脂肪酸 ０−０．５％
ブロックコポリマー界面活性剤 １．５−１５．０％
クエン酸ナトリウム ０‐１２％
トリポリリン酸ナトリウム ０−１５％
炭酸ナトリウム ０−８％
トリステアレートアルミニウム ０−０．１％
クメンスルホン酸ナトリウム ０−１．７％
ポリアクリレート増粘剤 １．３２−２．５％
ポリアクリル酸ナトリウム ２．４−６．０％
ホウ酸 ０−４．０％
蟻酸ナトリウム ０−０．４５％
蟻酸カルシウム ０−０．２％
ｎ−デシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム ０−４．０％
モノエタノールアミン（ＭＥＡ） ０−１．８６％
水酸化ナトリウム（５０％） １．９−９．３％
１，２−プロパンジオール ０−９．４％
酵素 ０．０００１‐０．１％
泥抑制剤、染料、香料、水 適量

１０）液状自動食器洗浄組成物
アルコールエトキシレート ０‐２０％
脂肪酸エステルスルホン酸塩 ０‐３０％
ドデシル硫酸ナトリウム ０‐２０％
アルキル ポリグリコシド ０‐２１％
オレイン酸 ０‐１０％
２ケイ酸ナトリウム１水和物 １８‐３３％
クエン酸ナトリウム２水和物 １８‐３３％
ステアリン酸ナトリウム ０‐２．５％
過ホウ酸ナトリウム１水和物 ０‐１３％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） ０‐８％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー ４‐８％
酵素 ０．０００１‐０．１％

１１）被保護漂白粒子を含む液状自動食器洗浄組成物
ケイ酸ナトリウム ５‐１０％
ピロリン酸４カリウム １５‐２５％
３リン酸ナトリウム ０‐２％
炭酸カリウム ４‐８％
被保護漂白粒子、例、塩素 ５‐１０％
重合増粘剤 ０．７‐１．５％
水酸化カリウム ０‐２％
酵素 ０．０００１‐０．１％
水 適量
１２）過ホウ酸が過炭酸塩によって置き換えられる１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載の自動食器洗浄組成物。
１３）さらにマンガン触媒を含む１）‐６）に記載の自動食器洗浄組成物。例えば、該マンガン触媒は、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ‐ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６９，１９９４，ｐｐ．６３７−６３９に記載の化合物の一つである。

４．３ バイオフィルム除去組成物及び使用
組成物は主要な酵素成分、例えばバイオフィルムを除去するときに用いるための単一成分組成物として、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。あるいは、組成物は複数の酵素的活性を含んでよく、例えば複数アミラーゼ又は次の任意の組み合わせを含むカクテル酵素であり、それは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ（ベータ‐、又はアルファ‐、又はグルコアミラーゼ）、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及び／又はキシラナーゼ、又はバイオフィルムを除去用のそれらの組み合わせである。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（例、フミコーラ インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を含む。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス（Ｆ． ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅ）、フザリウム セレアリス（Ｆ． ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロオクウェレンセ（Ｆ． ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモルム（Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム グラミナム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆ． ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネガンディニス（Ｆ． ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）, フザリウム レティクラタム（Ｆ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆ． ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サンブシヌム（Ｆ． ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆ． ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スルフリューム（Ｆ． ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルローサム（Ｆ． ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム トリコテキオイデス（Ｆ． ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム ベネナツム（Ｆ． ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。

組成物を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は周知の方法に従って調製されてよく、液体又は乾燥組成物の形態でよい。例えば、組成物を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は粒子又は微粒子の形態でよい。組成物中に含まれるポリペプチドは周知の方法に従って安定化される。

ポリペプチド組成物の一般的な使用が下記に示す実施例である。組成物及びその組成物が用いられる他の条件下バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の用量は周知の方法を用いて決定してよい。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体が２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼ又はその変異体と共に組成物中に用いられることも考えられる。

もう一つの実施態様はバイオフィルムを分解し及び／又は除去するための組成物及び方法を意図する。本明細書にて用いる用語「分解（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」はバイオフィルム中の個々の微生物の細胞を一緒に連結及び結合するバイオフィルムマトリックス中のポリサッカライドの加水分解として理解され、それにより、微生物細胞をバイオフィルムから放出及び除去できる。バイオフィルムは一般的に表面に存在し、バイオフィルムの分解を接触表面を持ってくることにより行う。例えば、表面をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又は一以上の例えば２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼであるが、これに限定されないバイオフィルムを破壊することのできる他の酵素を含む水溶性培地で浸し、覆い、濡らすことによる。組成物を例えば、パルプ及び製紙産業での白濁した水、スライムを加水分解するのに用いてよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は０．０００１から１００００ｍｇ／Ｌ、０．００１‐１０００ｍｇ／Ｌ、０．０１‐１００ｍｇ／Ｌ、又は０．１‐１０ｍｇ／Ｌの用量で存在してよい。追加酵素及び酵素変異体は同量またはそれ以下で存在してよい。

プロセスを室温から約７０℃の温度で適切に行う。一般的な温度範囲は約３０℃から約６０℃を含み、例えば、約４０℃から約５０℃である。

バイオフィルの加水分解に適切なｐＨは約３．５から約８．５内にある。一般的なｐＨ範囲は約ｐＨ５．５から約８を含み、例えば、約６．５から約７．５である。バイオフィルムを効果的に除去するための酵素の接触時間又は反応時間は、バイオフィルムの特性及び表面を酵素単独又は２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼのような他のバイオフィルム分解酵素との組み合わせに依存し、かなり多様である。一般的な反応時間は約０．２５時間から約２５時間及び約１時間から約１０時間内を含むことができ、例えば約２時間である。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及び２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼと組み合わせできる追加バイオフィルム分解酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、他のアルファ‐アミラーゼを含む他のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及び／又はペクチナーゼを含むが、これらに限定されない。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は酵素的又は非酵素的バイオサイドのような、抗生剤と組み合わせてよい。酵素的バイオサイド例えば、オキシドレダクターゼを含む組成物、例えばラッカーゼ又はペルオキシダーゼ、特にハロペルオキシダーゼ、及び国際ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４２８２５及びＤＫ ９７／１２７３記載のようにアルキルシリンゲート（ａｌｋｙｌ ｓｙｒｉｎｇａｔｅ）のような任意の増強剤でよい。

例えば、バイオフィルムを除き及び／又は洗い流す表面は固い表面であり、任意の表面で実質的に微生物に非透過的な面であると定義できる。表面の例は、例えば、ステンレススチール合金のような金属、プラスチック／合成ポリマー、ゴム、板、グラス、木材、紙、繊維、コンクリート、石、大理石、ジプサム及び任意に例えば、ペイント、エナメル、ポリマー等を用いてコーティングされるセラミック原料から作られる。従って、表面は、水供給システム、食品プロセッシングシステム、冷却システム、化学プロセッシングシステム、又は薬剤プロセッシングシステムのような水溶液を保持し、輸送し、処理するシステムの一部をなし、又は水溶液と接触するものでよい。パルプ及び／又は製紙産業のような木材プロセッシング産業においてバイオフィルムを除去するための組成物を用いる方法及び組成物である。従って、酵素及び酵素を含む組成物は従来の定置洗浄（Ｃ‐Ｉ‐Ｐ）システムに有用である。表面はパイプ、タンク、ポンプ、膜、フィルター、熱変換機、遠心分離機、蒸発機、ミキサー、噴霧塔、バルブ、及び反応器の一部をなすものである。また、表面は、汚染内視鏡、人工補装具又は医療用インプラントのような医療科学及び医療産業で用いる器具又は器具の一部である。

また、バイオフィルム除去用の組成物は、金属表面、例えばパイプラインが微生物のバイオフィルムによる攻撃される時に起こるいわゆるバイオ腐食をバイオフィルムを分解することにより防ぎ、それによりバイオフィルムの微生物細胞が付着する金属表面を腐食するバイオフィルムの環境を作ることを防止することを意図する。

抗バイオフィルム組成物のための別の適用はオーラルケアである。しかしながら、表面は、粘膜、皮膚、歯、毛髪、爪等のような生物由来である。

例えば、酵素を歯磨き粉に含むことにより、プラークを有する歯及び汚れたコンタクトレンズは表面として考えられる。従って、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ‐２３アルファ‐アミラーゼ及びその変異体は人間又は動物の歯に存在するプラークの分解のための薬剤を作るための組成物及びプロセスに用いることができる。さらに、嚢胞性線維症を発症している患者の肺中のバイオフィルムのような粘膜由来のバイオフィルムの分解の使用である。

従って、さらなる実施態様においては、実質的にいずれの活性汚染物質が無い精製酵素のような組み換え酵素を含むオーラルケア組成物に関する。オーラルケア組成物は組み換え酵素の量を適切に含有してよい。

オーラルケア組成物に用いる他のバイオフィルム分解酵素はオーラルケア組成物における２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼ活性を含むが、これに限定されない。考えられる酵素活性はデキストラナーゼ、ムタナーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ、ＷＯ ９５／１０６０２記載のヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐ．）ペルオキシダーゼ、又はラクトペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、特に、カーブリア ウェルクロサ（Ｃ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）及びカーブラリア イナエクアリス（Ｃ． ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）のようなカーブラリア種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．）由来のハロペルオキシダーゼのようなオキシダーゼ、ラッカーゼ、パパイン、酸性プロテアーゼ（例、ＷＯ ９５／０２０４４記載の酸性プロテアーゼ）、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、ＡＭＧ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）のようなアミログルコシダーゼを含むアミラーゼのようなプロテアーゼ、抗菌性酵素、及びそれらの混合物を含む酵素の群由来の活性を含む。

オーラルケア組成物は任意の適切な物理的形態（即ち、粉、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等）でよい。「オーラルケア組成物（ｏｒａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、虫歯を防止し、歯のプラーク及び歯石の形成を防止し、歯のプラーク及び歯石を除去し、歯の病気など予防及び／又は治療することにより、人間及び動物の口中の口腔衛生を維持又は改善するために用いてよい組成物を含む。また、少なくともオーラルケア組成物という用語は入れ歯、人工歯等を洗浄するための製品を含む。そのようなオーラルケア組成物の例は練り歯磨き、デンタルクリーム、ゲル又は歯磨き粉、歯科用洗口剤、歯磨き前又は後の漱ぎ製剤、チューインガム、トローチ及びキャンディーを含む。一般的な練り歯磨き及びゲルは研磨磨き剤、発泡剤、香料、保湿剤、バインダー、増粘剤、甘味剤、ホワイトニング／漂白／染み除去剤、水、および任意に追加酵素及び酵素の組み合わせを含む。

マウスウォッシュはプラーク除去液を含み、一般的に水／アルコール溶液、香味料、保湿剤、甘味料、発泡剤、着色剤、及び任意に追加の酵素及び酵素組み合わせを含む。

また、研磨磨き剤も歯磨き剤のようなオーラルケア組成物へ含まれてよい。

従って研磨磨き剤はアルミナ及びその水和物を含み、例えば、アルファアルミナ３水和物、３ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、か焼アルミナケイ酸塩、及びケイ酸アルミニウムのようなアルミノケイ酸塩、炭酸カルシウム、ケイ酸ジリコニウム、及び塩化ポリビニルのような粉状プラスティックも、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノールホルムアルデヒド樹脂、メラミン‐ホルムアルデヒド樹脂、尿素‐ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉状ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル、及びエアロゲル等である。また、適切な研磨剤はピロリン酸カルシウム、水に不溶のアルカリメタリン酸塩、リン酸二カルシウム、及び／又はその二水和物、オルトリン酸２カルシウム、リン酸３カルシウム、特にハイドロキシアパタイト等である。また、これらの物質の混合物を用いることができる。

オーラルケア組成物次第で、研磨用製品は約０ｗｔ.％から約７０ｗｔ.％、又は約１％から約７０％存在してよい。練り歯磨きにとって、研磨剤は最終練り歯磨の一般的に１０ｗｔ.％から７０ｗｔ.％の範囲内にある。

保湿剤は例えば歯みがきのペーストから水分の消失を防ぐために使用する。オーラルケア組成物に用いる適切な保湿剤は次の化合物及びそれらの混合物を含む。それは、グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、１，３‐プロパンジオール、１，４‐ブタンジオール、部分的な水素化加水分解ポリサッカライド等である。保湿剤は一般的に練り歯磨きの重量で０ｗｔ．％から約８０ｗｔ．％、又は約５ｗｔ．％から７０ｗｔ．％存在する。

シリカ、デンプン、トラガカントゴム、キサンタンゴム、アイリッシュモスの抽出物、アルギン酸塩、ペクチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロロリドンは有用な増粘剤及びバインダーの例として意味し、歯みがき製品を安定するのに役立つ。増粘剤は練り歯磨きクリーム及びゲルに約０．１ｗｔ．％から約２０％ｗｔ．％の量で存在し、バインダーは最終製品の重量で約０．０１から約１０％の範囲で存在してよい。

発泡剤石鹸として、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、両性イオン性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）及び／又は両性イオン性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤を用いてよい。これらは、最終製品の重量で０％から約１５％、約０．１％から約１３％又は約０．２５％から約１０％のレベルで存在してよい。

界面活性剤はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に不活性化の影響を及ぼさない適切な範囲のみに用いられる。界面活性剤は脂肪アルコール硫酸塩、モノグルセリドスルホン酸塩又は１０から２０炭素原子を有する脂肪酸、脂肪酸アルブミン濃縮産物、脂肪酸アミド及びタウリンの塩及び／又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩を含む。

適切な甘味料は製剤に用いるサッカリンを含む。

通常スペアミントのような香味料は重量で約０．０１ｗｔ．％から約５ｗｔ．％特に約０．１％から約５％のような低い量で存在する。ホワイトニング／漂白剤はＨ_２Ｏ_２を含み最終製品の重量で計算して約５％未満又は約０．２５％から４％の量で添加してよい。ホワイトニング／漂白剤はオキシドレダクターゼのような酵素でよい。適切な漂白酵素の例は、例えば、ＷＯ ９７/０６７７５に記載のものである。

通常水は例えば、練り歯磨きのように流動性を有する形態を与える量を加える。

さらに、水溶性抗菌剤、例えばクロロヘキシジン ジグルコネート（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ヘキセチジン（ｈｅｘｅｔｉｄｉｎｅ）、アレキシジン（ａｌｅｘｉｄｉｎｅ）、トリクロサン（商標）（Ｔｒｉｃｌｏｓａｎ（商標））、第４級アンモニウム抗菌剤化合物であり、特定の金属イオンの水溶性供給源、例えば、亜鉛、銅、銀、及びスズ（例えば、塩化亜鉛、塩化銅及び塩化スズ、及び硝酸銀）も含んでよい。

また、フッ化物供給源、染料／着色剤、保存剤、ビタミン剤、ｐＨ調整剤、虫歯予防剤、除痛剤等として用いることができる化合物の添加を含む。

口腔の洗浄に用いる場合、バイオフィルム分解酵素はいくつかの利点を有する。プロテアーゼは歯の表面に吸着し、菌膜を形成し、プラークに至る最初の層である唾液蛋白質を分解する。リパーゼとともにプロテアーゼを用いると微生物の細胞壁及び細胞膜の構造成分を作る蛋白質及び脂質を溶かすことにより、微生物を分解する。

デキストラナーゼ及び他のカルボヒドラーゼ、例えば２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は微生物の接着マトリックスを形成する微生物により生産される有機骨格構造を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼはプラーク形成を防ぐだけでなく、石化の防止、つまり、カルシウムに結合する炭水化物蛋白質を分解することにより歯石形成も防ぐ。

練り歯磨きは一般的に次の成分（最終練り歯磨き組成物の重量％中）を含んでよい。それは、研磨剤約７０％まで、保湿剤０％から約８０％、増粘剤約０．１％から約２０％、バインダー約０．０１％から約１０％、甘味料約０．１％から約５％、発泡剤０％から約１５％、増白剤０％から約５％及び酵素約０．０００１％から約２０％である。

ある実施態様においては、練り歯磨きは約６．０から約８．０の範囲のｐＨを有してよく、ａ）研磨剤約１０％から約７０％、ｂ）保湿剤０％から約８０％、ｃ）増粘剤約０．１％から約２０％、ｄ）バインダー約０．０１％から約１０％、ｅ）甘味料約０．１％から約５％、ｆ）発泡剤０％から約１５％、ｇ）増白剤０％から約５％ｉ）酵素約０．０００１％から約２０％を含む。

i）で述べた酵素は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体単独又は２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）のような他のバイオフィルム分解酵素及び練り歯磨き等に用いるものとして知られる上記酵素の他の任意のタイプとの組み合わせを含む。

一般的に口腔洗浄は次の成分（最終口腔洗浄組成物の重量中）を含む。それは保湿剤０％から約２０％、界面活性剤０％から約２％、酵素０％から約５％、エタノール０％から２０％、他の成分（例えば、香味料、甘味料、フッ化物のような活性成分）０％から約２％である。また、組成物は約０％から約７０％の水を含んでよい。

口腔洗浄組成物は、クエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウムのような適切な緩衝液で約６．０から約７．５のｐＨ範囲に調整されてよい。口腔洗浄は非希釈形態で使用してよい（即ち、使用前に希釈してよい。）

オーラルケア組成物はオーラルケアの任意の周知技術を用いて生産されてよい。

４．４ デンプンプロセス組成物及び使用
他の実施態様においては、開示するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はデンプン液化又は糖化に用いてよい。

ある実施態様は、デンプンから甘味料を生産するための組成物使用及び組成物を含む。デンプンをフルクトースシロップへ転換する「伝統的な」プロセスは通常３つの連続的酵素プロセスからなり、つまり、液化プロセス、引き続き、糖化プロセス、及び異性化プロセスからなる。液化プロセスの間、デンプンは約２時間の間約５．５と約６．２の間のｐＨの値及び約９５℃から約１６０℃の温度でバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体によりデキストリンに分解される。これらの条件下最適酵素安定性を評価するために、１ｍＭのカルシウムを加える（少なくとも４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）。デンプンプロセスはアルコール（例えば、燃料用の穀物液状化及び飲料アルコール、アルコール醸造）、甘味料生産用のデンプン液状化、サトウキビプロセス、及びデンプンプロセスをゴールとする他の関連食品を生産するのに有用である。異なるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体には他の条件を用いることができる。

液化プロセス後、デキストリンはグルコアミラーゼ（例、ＡＭＧ（商標））及びイソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例、ＰＲＯＭＯＺＹＭＥ（商標））のような脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換する。この段階の前に、ｐＨは約４．５未満の値に下げられ、高温（９５℃以上）に維持され、液化バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の活性は変性される。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を加える。一般的に糖化プロセスは約２４時間から約７２時間で行う。

糖化プロセスの後、ｐＨを約６．０から約８．０の範囲の値、例えば、ｐＨ７．５に上げ、カルシウムをイオン交換により除去する。デキストロースシロップをそれから例えば、固定化グルコースイソメラーゼ（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）のような）を用いて高いフルクトースシロップに転換する。

このプロセスの少なくとも一つの酵素的改善が行われる。液化バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のカルシウム依存性の低下である。遊離カルシウムの添加がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の高い安定性を十分に確保するために必要だが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害し、３‐５ｐｐｍ未満の遊離カルシウムレベルに低減する範囲まで、高価な単位操作手段で除去する必要がある。もし、そのような操作が避けられ、液化プロセスが遊離カルシウムイオンなしで実行できるならば、節約ができる。

例えば、少ないカルシウム依存酵素、つまり、低い遊離カルシウム濃度（＜４０ｐｐｍ）で安定及び高い活性である酵素は、組成物及び方法に用いることができる。そのようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は約４．５から約６．５の範囲又は、約４．５から約５．５の範囲のｐＨで最適ｐＨを有する。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、デンプン又は多様な目的のための任意のマルトデキストリン含有化合物を加水分解するために実験室及び産業用施設で用いてよい。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は特異的加水分解を提供するために単独で用いてよく、又は活性の広いスペクトルをもつ「カクテル」を提供するために他のアミラーゼと組み合わせて用いてよい。一般的な使用は生物製剤、食品、動物用飼料、薬剤製剤、又は産業用試料からデンプン又は任意のマルトデキストリン含有化合物の除去又は一部又は完全な加水分解を含む。

他の実施態様においては、組成物及び発酵プロセス中にその組成物を用いる方法を含み、酵母のような発酵生物により発酵産物の転換に有用なグルコース及び／又はマルトースを生産するために、デンプン基質がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体存在下液化及び／又は糖化することである。そのような発酵プロセスは燃料用エタノール又は飲料用エタノール（飲料用アルコール）を生産するプロセス、飲料水を生産するプロセス、所望の有機化合物（例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような）ケトン、アミノ酸（グルタミン酸、モノグルタミンナトリウムのような）だけでなくより複雑な化合物（例えば、ペニシリン、テトラサイクリンのような抗生物質）、酵素、ビタミン（例えば、リボフラビン、ビタミンＢ_１２、ベータ‐カロテン）及び合成的に生産するのが困難なホルモンも生産するプロセスを含む。

処理されるデンプンは高度に精製されるデンプン品質でよく、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％の純度である。あるいは、デンプンは、麦芽残留及び繊維のような非デンプン分画を有する粉砕全粒穀物を含む材料を含有する未精製デンプンでよい。全粒穀物のような生原料の構造を破壊し、さらに処理するために、これを粉砕する。二つの粉砕プロセスを用いてよい。それは湿式及び乾式粉砕である。粉砕ひき割りトウモロコシのようなひき割りトウモロコシを用いてよい。

乾式粉砕穀物はデンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。そのような異種の材料がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３を用いるジェットクッキングにより処理される場合、しばしば一部のデンプンゼラチン化のみしか行われない。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は非ゼラチン化デンプンへの高い活性を有するので、乾式粉砕デンプンをジェットクッキング処理する液化及び／又は糖化を含むプロセスに積極的に適用してよい。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の優れた加水分解活性により、糖化段階の間グルコアミラーゼの必要性が大幅に低減する。これにより低いレベルのグルコアミラーゼ活性で糖化を実施することができる。グルコアミラーゼ活性は無いか、もし存在するならば０．５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、又は０．４ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、０．３ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、０．１ＡＧＵ／ｇＤＳ未満で、０．０５ＡＧＵ／ｇＤＳデンプン基質以下又は未満のような量で存在する。「ＤＳ」は乾燥固体基質の一グラム当たりに加える酵素の単位である。ミリグラム酵素蛋白質（ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表現するとき、グルコアミラーゼ活性を有する酵素が約０．５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．４ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．３ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．１ｍｇＥＰ／ｇＤＳ（例えば、約０．０５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満又は約０．０２ｍｇＥＰ／ｇＤＳデンプン基質以下又は未満）以下又は未満の量で存在するか又は全く存在しない。グルコアミラーゼはアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、 タラロミセス種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、パチキトスポラ種（Ｐａｃｈｙｋｙｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、又はトラメテス種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｓｐ．）内の菌株由来であり、一般的例はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、タラロミセス エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トラメテス シングラタ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、又はパチキトスポラ パピラケア（Ｐａｃｈｙｋｙｔｏｓｐｏｒａ ｐａｐｙｒａｃｅａ）である。

プロセスは
ａ）アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチド、を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体とデンプン基質を接触させ、
ｂ）少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％ｗ／ｗの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するのに十分な時間及び温度で、前記酵素と前記デンプン基質をインキュベーションし、
ｃ）発酵産物を生産するために発酵し、及び
ｄ）任意に発酵産物を回収する
ことを含む。ｂ）及び／又はｃ）段階の間グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．００１から２．０ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０１から１．５ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０５から１．０ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０１から０．５ＡＧＵ／ｇＤＳの量で存在するか又は存在しない。グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、又は０．４ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、０．３ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、０．１ＡＧＵ／ｇＤＳ（例えば、０．０５ＡＧＵ／ｇＤＳデンプン基質以下又は未満）、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。ミリグラム酵素蛋白質（ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）で表現する場合、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は０．４ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、０．３ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、０．１ｍｇＥＰ／ｇＤＳ（例えば、０．０５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満又は０．０２ｍｇＥＰ／ｇＤＳデンプン基質以下又は未満）、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。プロセスにおいて段階ａ）、ｂ）ｃ）及び／又はｄ）は別々に又は同時に実施される。

別の実施態様においては、プロセスは
ａ）アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現するために形質転換した酵母細胞とデンプン基質を接触させ、
ｂ）少なくとも９０％ｗ／ｗの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するために十分な時間及び温度で、前記酵母と前記デンプン基質をインキュベーションし、
ｃ）エタノールを生産するために発酵し、
ｄ）任意にエタノールを回収する
ことを含む。ａ）、ｂ）及びｃ）段階は、各別に又は同時に実施される。

さらに他の実施態様においては、ゼラチン化又は粒状デンプンのスラリーの加水分解を含むプロセス、特に前記粒状デンプンの初期のゼラチン化温度未満の温度で可溶性デンプン加水分解物へ粒状デンプンを加水分解するプロセスである。さらに、アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むポリペプチドと接触することである。デンプンを任意の一以上の菌類のアルファ‐アミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．１)及び一以上のベータ‐アミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．２)、及びグルコアミラーゼ (ＥＣ ３．２．１．３)と接触させてよい。さらなる実施態様においては、別のデンプン分解酵素又はイソアミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．６８)又はプルラナーゼ(ＥＣ ３．２.１．４１)のような脱分岐酵素をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に追加してよい。

実施態様においては、プロセスは初期ゼラチン化温度以下の温度で実施される。そのようなプロセスをしばしば少なくとも３０℃、少なくとも３１℃、少なくとも３２℃、少なくとも３３℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４３℃、少なくとも４４℃、少なくとも４５℃、少なくとも４６℃、少なくとも４７℃、少なくとも４８℃、少なくとも４９℃、少なくとも５０℃、少なくとも５１℃、少なくとも５２℃、少なくとも５３℃、少なくとも５４℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、又は少なくとも６０℃で行う。プロセスを実施するｐＨは約３．０から約７．０、又は約３．５から約６．０、又は約４．０から約５．０でよい。ある実施態様は発酵を含むプロセスを意図し、例えば、エタノール生産のための酵母、例えば、３０℃から３５℃のような約３２℃である。

別の実施態様においては、プロセスは同時糖化発酵を含み、３０℃から３５℃温度のような、例えば、約３２℃温度にて、エタノール生産のための酵母、又は所望の有機化合物を生産するための別の適切な発酵生物を用いる。

上記の発酵プロセスにおいて、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％のようなエタノールに達する。

任意の上記実施態様に用いるデンプンスラリーは約２０％から約５５％乾燥固体粒状デンプン、約２５％から約４０％乾燥固体粒状デンプン、又は約３０％から約３５％乾燥固体粒状デンプンを有する。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触後、酵素は可溶性デンプンを少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の量の粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解物へ転換する。

別の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はアルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチドを含んでよく、液化プロセス、ゼラチンデンプンの糖化に用いられ、例えば、ジェットクッキングによりゼラチン化を含むが、これに限定さない。プロセスは発酵産物、例えばエタノールを生産するための発酵を含む。発酵によりデンプン含有材料からエタノールを生産するためのそのようなプロセスは
ｉ）第一態様のポリペプチドのような、アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒部位及び炭水化物結合モジュールを含むポリペプチドと前記デンプン含有材料を液化させ、
ｉｉ）得られる液化マッシュを糖化し、及び
ｉｉｉ）発酵生物存在下（ｉｉ）段階で得られる材料を発酵する
ことを含む。さらに、プロセスは任意にエタノールを回収することを含む。糖化及び発酵プロセスは同時糖化発酵プロセス（ＳＳＦプロセス）として行ってよい。発酵の間、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％のようなエタノールに達する。

上記実施態様のプロセスで処理するデンプンは特に塊茎、根、茎、鞘、穀物又は未精白の穀物から得られる。より具体的には、粒状デンプンはトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、サゴ、カッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得られる。また、トウモロコシ及び大麦のろう様又は非ろう様タイプ両方を含む。

上述の組成物はゼラチン化デンプン又は粒状デンプン及び一部ゼラチン化デンプンを液化及び／又は糖化するために用いてよい。部分的ゼラチン化デンプンはある程度ゼラチン化しているデンプンで、即ち、デンプン部分が不可逆的に膨張及びゼラチン化し、デンプンの一部がまだ粒状の状態で存在している。

上記組成物は０．０１から１０．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、又は０．１から５．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、又は０．５から３．０ＡＦＡＵ／ｇＡＧＵ、又は０．３から２．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳの量で存在する酸性アルファ‐アミラーゼ変異体を含んでよい。組成物は上記任意のデンプンプロセスに適用してよい。

本明細書にて用いる用語「液化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と同時に又はその後に添加するデンプンのゼラチン化を含む。追加的な液化導入酵素もまた加えてよい。

本明細書にて用いる用語「第一液化（ｐｒｉｍａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」はスラリーの温度がそのゼラチン化温度に上昇する又は近づいた場合の液化段階をいう。温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通して送られ、２００°Ｆから３００°Ｆ、例えば２２０‐２３５°Ｆの温度となる。熱交換器又はジェット温度に投入に引き続き、スラリーを３‐１０分間その温度で維持する。スラリーを２００°Ｆから３００°Ｆに維持するこの段階は第一液化である。

本明細書にて用いる用語「第二液化（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第一液化（２００°Ｆから３００°Ｆに加熱）に引き続く液化段階をいい、このときスラリーは室温に冷やされる。この冷却段階は、３０分から１８０分（３時間）であってよく、例えば９０分から１２０分（２時間）である。

本明細書にて用いる用語「第二液化の時間（ｍｉｎｕｔｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第二液化の開始からＤＥが測定される時間までの経過する時間をいう。

他の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有組成物中のベータ‐アミラーゼのさらなる使用を意味する。ベータ‐アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）はエキソ作用のマルトジェニックアミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅｓ）であり、アミロース、アミロペクチン、及び関連するグルコースポリマー中の１，４‐α‐グルコシド結合の加水分解を触媒し、それにより、マルトースが放出される。

ベータ‐アミラーゼは種々の植物及び微生物（W. M. Fogarty and C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979）から単離される。これらのベータ‐アミラーゼは４０℃から６５℃の範囲の最適温度及び約４．５から約７．０の範囲の最適ｐＨを有することで特徴付けられる。考えられるベータ‐アミラーゼはオオムギ由来のベータ‐アミラーゼ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＢＢＡ １５００、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＤＢＡ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＭＥ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＢＢＡ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｃ．)及びＮＯＶＯＺＹＭ（商標）ＷＢＡ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ)を含むがこれらに限定されない。

組成物に用いるために考えられる別の酵素はグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）である。グルコアミラーゼは微生物又は植物由来である。グルコアミラーゼの例は菌類又は細菌由来である。細菌のグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼであり、特に、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼ（Boel 他、EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984)）又はＷＯ ９２／００３８１及びＷＯ ００／０４１３６に記載のようなその変異体、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ (ＷＯ ８４／０２９２１)、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）(Agric. Biol. Chem., 55(4): 941-949 (1991))、又はその変異体又はフラグメントである。

他の考えられるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼ変異体は熱安定性を増強する変異体を含み、Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ(Chen他、Prot. Eng. 9: 499-505 (1996)); D257E及びD293E/Q (Chen他、Prot. Eng. 8: 575-582 (1995)); N182(Chen他、 Biochem. J. 301: 275-281 (1994));ジスルフィド結合、A246C(Fierobe他、Biochemistry, 35: 8698-8704 (1996))及びA435及びS436位にＰｒｏ残基の導入である(Li他、Protein Eng. 10: 1199-1204 (1997))。他の考えられるグルコアミラーゼはタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ、特に、タラロミセス エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）(ＷＯ ９９／２８４４８)、タラロミセス レイセタヌス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ） (Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ＲＥ ３２，１５３)、タラロミセス デュポンチ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｕｐｏｎｔｉ）、タラロミセス サーモフィリス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）(米国特許第４，５８７，２１５)由来である。考えられる細菌由来グルコアミラーゼはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属由来のグルコアミラーゼであり、特に、クロストリジウム サーモアミロリティカム（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）(ＥＰ １３５１３８)及びクロストリジウム サーモヒドロスルフリカム（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）(ＷＯ ８６／０１８３１)である。一般的に、グルコアミラーゼはアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼを含む。また、商業的に入手可能なグルコアミラーゼはＡＭＧ ２００Ｌ、ＡＭＧ ３００Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ)、ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）３００(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．製)、 ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ (ＤＳＭ)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９００(Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ‐Ｓｙｓｔｅｍｓ)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９０ ＺＲ(アスペルギルス ニガー（Ａ. ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量)を含む。

グルコアミラーゼを０．０２‐２．０ＡＧＵ／ｇＤＳ又は０．１‐１．０ＡＧＵ／ｇＤＳ例えば、０．２ＡＧＵ／ｇＤＳの量で加えてよい。

また、追加酵素及び酵素変異体は組成物中に抱合されると考えられる。一以上のアルファ‐アミラーゼをバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又に加えて用いてよく、又は本明細書にて記載の他の酵素をさらに含むことができる。

任意に加える別の酵素はイソアミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．６８)又はプルラナーゼ(ＥＣ ３．２.１．４１)のような脱分岐酵素である。イソアミラーゼはアミロペクチン及びβ‐限界デキストリン中のα‐１，６‐Ｄ‐グルコシド分岐結合を加水分解し、及びイソアミラーゼがプルランを攻撃できない点及びα‐限界デキストリンに対する作用が限られている点がプルラナーゼと異なる。脱分岐酵素を当業者が周知の効果的な量で加えてよい。

プロセスの生産物の正確な組成は適用酵素の組み合わせや粒状デンプンプロセスのタイプに依存する。例えば、可溶性加水分解物は少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％の純度を有するマルトースでよい。あるいは、可溶性デンプン加水分解は、グルコース又は少なくとも約９４．５％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％のＤＸ（溶解乾燥固体の総量のグルコースの割合）を有するデンプン加水分解物でよい。プロセスは特製シロップである生産物を含むことができ、例えば、アイスクリーム、ケーキ、キャンディー、缶詰のフルーツの製品に用いるためのグルコース、マルトース、ＤＰ３、及びＤＰｎの混合物を含む特製シロップである。

二つの粉砕プロセスは湿式及び乾式粉砕である。乾式粉砕において、実全体を粉砕し用いる。湿式粉砕は胚芽と粉末（デンプン粒子及び蛋白質）のよい分離をもたらし、若干の例外はあるが、デンプン加水分解物がシロップの生産に用いられる場所で適用できる。乾式及び湿式粉砕両方ともデンプン処理の周知の技術であり、開示される組成物及び方法に用いるために均等として考えられる。プロセスは限外ろ過システムで行われ、同システムにおいて、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物は可溶性デンプン加水分解物である。未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性デンプン加水分解物である限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスは前記プロセスと均等であると考える。また、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物であるマイクロろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。

ある点において、プロセスに用いる可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）のような高フルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）に転換される。この転換はグルコースイソメラーゼを用いて実施され、固体支持体に担持する固定化グルコースイソメラーゼにより実施される。考えられるイソメラーゼは市販用製品Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）ＩＭＧＩ及びＧ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３, ＫＥＴＯＭＡＸ（商標）Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３（Ｒｈｏｄｉａ)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９３ ｌｉｑｕｉｄ、ＧＥＮＳＷＥＥＴ（商標）ＩＧＩ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)を含む。

他の実施態様においては、これらの方法により生産される可溶性デンプン加水分解物を燃料又は飲料用エタノールの生産に用いてよい。第三番目の態様のプロセスにおいて、発酵を粒状デンプンスラリーの加水分解へ同時又は別々に／続けて行ってよい。発酵を加水分解と同時に行う場合、温度は３０℃と３５℃の間、又は３１℃と３４℃の間である。プロセスは未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体を含むエタノールである限外ろ過システムを導入してよい。未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体含有エタノールである限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。

また、プロセスの可溶性デンプン加水分解物は、クエン酸、グルタミン酸１ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような発酵産物へ処理デンプンを発酵することを含む発酵産物の生産のために用いてよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のデンプン分解活性はジャガイモデンプンを基質として用いて検出してよい。この方法は酵素による修飾ジャガイモデンプンの分解に基づき、反応はヨウ素液を有するデンプン／酵素液のサンプルを混合することにより行う。最初黒っぽい青色になり、しかしデンプン分解の間に青色が薄くなり、次第に赤褐色になり、基準となる着色ガラスで比較する。

５．方法
５．１ フィルタースクリーニング試験
下記に説明する試験を親アルファ‐アミラーゼ酵素に比してＣａ^２＋減少条件下及び／又は高い又は低いｐＨにて改変される安定性を有するＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼ変異体のスクリーニング中に用いてよい。

５．２ 高いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃にて１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＴＹ寒天プレート上にセルロースアセテート(ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)とニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜はＴＹ寒天プレートに置かれる。

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、インキュベーション前であって、固定後、具体的に針で印を入れ、変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液を有する容器へ移し、１５分間室温（１０‐６０℃変化できる）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレート上で同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

５．３ 低いカルシウムフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で例えば、カナマイシン又はクロラムフェニコールのような関連抗生物質含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート(ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、インキュベーション前であって、固定後、具体的に針で印を入れ、及び変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液及び異なるＥＤＴＡ濃度（０．００１ｍＭ‐１００ｍＭ）を有する容器へ移す。フィルターを１時間室温にてインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレート上で同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

５．４ 低いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート (ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは具体的に針で印を入れ、変異体を結合しているニトロセルロースフィルターをｐＨ４．５のクエン酸を有する容器へ移し、フィルターを２０分間８０℃（野生型バックボーン中変異体をスクリーニングする場合）又は、６０分間８５℃（親型アルファ‐アミラーゼ変異体をスクリーニングする場合）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性をｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中１％寒天、０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、５０℃にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

５．５ 第二次スクリーニング
再スクリーニング後、陽性形質転換体を保管プレートから拾い、第二次プレート試験を実施する。陽性形質転換体を５ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中３７℃にて２２時間培養する。各陽性形質転換体のバシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物及びコントロールとして対応するバックボーンを発現するクローンを９０℃にてクエン酸緩衝液ｐＨ４．５中インキュベーションし、サンプルを０、１０、２０、３０、４０、６０、及び８０分にて採取する。３μＬのサンプルを試験用プレートに付ける。試験用プレートを１０％ルゴール液で染色する。改善変異体がバックボーンより高い残留活性（試験用プレート上ハローとして検出される）を有する変異体として得らる。改善変異体はヌクレオチドスシーケンスによって決定される。

５．６ 未精製変異体の安定性試験
変異体の安定性を次のように試験できる。それは、分析すべき変異体を発現するバシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を１０ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中３７℃にて２１時間で培養する。８００μＬ培養物を２００μＬのクエン酸緩衝液ｐＨ４．５で混合する。サンプリング時点の数に相当する７０μＬのサンプルをＰＣＲ試験管に入れ、種々の時間（一般的に５、１０、１５、２０、２５、及び３０分）７０℃又は９０℃にてインキュベーションする。０分サンプルは高い温度でインキュベーションしていない。サンプル中の活性を「アルファ‐アミラーゼ活性用試験」の下、下記に記載のように２０μＬを２００μＬのアルファ‐アミラーゼＰＮＰ−Ｇ_７基質ＭＰＲ３ ((Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１６６０７３０)に移すことにより測定する。結果を時間に対して活性率（０時点と比較して）としてグラフに表す、又は特定の時間のインキュベーション後の残留活性率として表す。

５．７ アルファ‐アミラーゼ変異体の発酵及び精製
関連する発現プラスミドを保持しているバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を次のように発酵及び精製する。菌株を−８０℃にて保管される１０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩培養する。コロニーを５００ｍｌ振盪フラスコ中１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有１００ｍｌのＰＳ−１培地に移す。

ＰＳ−１培地の組成
パールシュガー（Ｐｅａｒｌ ｓｕｇａｒ） １００ｇ／ｌ
大豆ミール（Ｓｏｙ Ｂｅａｎ Ｍｅａｌ） ４０ｇ／ｌ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１２Ｈ_２Ｏ １０ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ６１００ ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣＯ_３ ５ｇ／ｌ。

培養物を５日間２７０ｒｐｍで３７℃にて振盪培養する。

細胞及び細胞かすを２０から２５分間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより培養培地から除く。後で、完全に透明な溶液を得るために上清をろ過する。ろ過物を濃縮しＵＦ−フィルター（１００００カットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液を２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．５に変える。ＵＦ−ろ過物をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し同じ緩衝液で０．２ＭＮａＣｌを用いる溶出ステップにて溶出を行う。溶出物を１０ｍＭトリスｐＨ９．０にて透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し６カラム体積以上、０から０．３ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出する。活性（ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験により測定）を含む分画を集め、ｐＨをｐＨ７．５に調整し、着色を５分間、０．５％Ｗ／ｖｏｌの活性炭素で処理することにより除く。

５．８ 特異的活性の検出
特異的活性を活性／ｍｇ酵素（ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ）としてファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））試験(ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ)）を用いて検出する。取扱説明書は次に示す（また下記「アルファ‐アミラーゼ活性試験」を参照願いたい）。

５．９ 等電点の検出
ｐＩを等電点電気泳動法 (例：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ，ｐＨ ３．５−９．３)にて検出する。

５．１０ 促進される安定性試験
５０ｍｌのプロピレン試験管に、１０ｍｌの対象となる洗剤を加えた。適切な希釈をＡｍｙＴＳ２３ｔ及びＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ両者に行い、各１８０ｐｐｍをピペットで洗剤を含む別々の試験管に移し測定した。各変異体酵素を含む洗剤を３０秒間ボルテックスし、それから１０分間ＲｏｔａＭｉｘ（ＡＴＲ ＲＫＶＳ Ｍｏｄｅｌ）に固定した。変異体酵素を有する１００マイクロリットルの洗剤をピペットで測定し、１：６５１に希釈した。変異体の初期の活性をブロック化Ｐ‐ニトロ‐フェニル‐マルトヘプタオース（Ｂｌｏｃｋｅｄ Ｐ−Ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅｎｙｌ−Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）(Ｂｌｏｃｋｅｄ ＰＢＮＰＧ７)基質を用いてＫｏｎｅｌａｂ，Ｍｏｄｅｌ ２０ＸＴにて試験をした。洗剤サンプルをそれから３７℃にセットした一定温度のインキュベーターでインキュベーションした。サンプルを１、２、４、７、及び１７日で採取し、酵素活性を測定した。

５．１１ アルファ‐アミラーゼ活性試験
５．１１．１ ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験
アルファ‐アミラーゼ活性をファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））錠剤を基質として用いる方法によって検出する。ファデバス錠剤（ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））アミラーゼ試験、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃより供給）は、架橋された不溶性青色デンプンポリマーを含み、このポリマーは、ウシ血清アルブミン及び緩衝基質と混合され、錠剤化される。

一つの測定ごとに、ひとつの錠剤を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液（５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭＣａＣl_２，ｐＨをＮａＯＨを用いて対象となる値に調整）含有試験管に懸濁する。試験を対象となる温度にて水浴中で行う。試験すべきアルファ‐アミラーゼをｘｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液で希釈する。１ｍｌのこのアルファ‐アミラーゼ溶液を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液に加える。デンプンは可溶性青色フラグメントを与えるアルファ‐アミラーゼによって加水分解される。得られる青色溶液の吸光度を６２０ｎｍで分光光度的に測定し、アルファ‐アミラーゼ活性の関数である。

１０分又は１５分（試験時間）のインキュベーション後、測定された６２０ｎｍ吸光度は６２０ｎｍで０．２から２．０単位の範囲であることが重要である。この吸収範囲において活性と吸光度（ランベルトベールの法則）の間に直線性がある。それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するように調整すべきである。具体的な設定条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液の条件）下、１ｍｇの得られるアルファ‐アミラーゼは特定量の基質を加水分解し、青色を生じる。色の強さを６２０ｎｍで測定する。測定吸光度は、与えられる設定条件下、該当アルファ‐アミラーゼの特異的活性（純粋アルファ‐アミラーゼ蛋白質のａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ）に正比例する。

５．１１．２ 代替方法
アルファ‐アミラーゼ活性をＰＮＰ‐Ｇ_７基質を用いる方法で検出する。（ｐ−ニトロフェニル‐アルファ‐Ｄ‐マルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ‐ａｌｐｈａ‐Ｄ‐ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）の略語であるＰＮＰ‐Ｇ_７はエンドアミラーゼにより切断できるブロック化オリゴサッカライドである。切断に続き、黄色を有する遊離ＰＮＰ分子を放出するためにキット中のアルファグルコシダーゼが基質を消化し、即ち、λ＝４０５ｎｍ（４００‐４２０ｎｍ）での可視分光光度法により測定する。ＰＮＰ‐Ｇ_７基質及びアルファ‐グルコシダーゼを含むキットはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ(カタログ番号１０５４６３５)にて作られる。

試薬液を調整するために１０ｍｌの基質／緩衝液を製造業者によって推奨される５０ｍｌの酵素／緩衝液に追加する。２０μＬのサンプルを９６穴マイクロプレートに移し、２５℃でインキュベーションすることにより試験を実施する。２５℃に前もって平衡化する２００μＬの試薬液を加える。溶液を混合し、一分間インキュベーションし、吸収をＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ４０５ｎｍにて４分以上３０秒ごとに測定する。

吸収曲線に依存する時間の勾配は与えられる設定条件下問題とするアルファ‐アミラーゼの活性に正比例する。

５．１２ 洗剤組成物中の酵素性能の検出
５．１２．１ ＵＳ洗濯条件
Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒの使用、ユーナイテッド・ステーツ・テスティング（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ）、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ.Ｊ.-
ＵＳ洗浄条件下洗浄試験をシミュレートするために、対象となる変異体酵素の検量効率曲線（ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を蛍光増白剤を含まないＬｉｑｕｉｄ ＡＡＴＣＣ ２００３及び／又は粉ＡＡＴＣＣ １９９３ (Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔｓ)のような標準的な洗剤を用いて２０℃で実施した。比較アルファ‐アミラーゼの相当するＤＥＣを本発明の変異体酵素の汚れ除去能力を比較するために実施した。このプロセスを４０℃で繰り返した。一般的に、ＣＳ‐２８コメデンプン汚れ(オランダのＣＦＴ)の４つの見本を１リットルのＤＩ水及び１．５ｇの液体ＡＡＴＣＣで満たしたＴｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒのスチール製容器へ移した。粉体ＡＡＴＣＣを用いる場合、１．５ｇの洗剤粉を化学天秤（Ｍｏｄｅｌ ＰＭ４８００， Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．， Ｈｉｇｈｓｔｏｗｎ， ＮＪ． ０８５２０）で重量測定後、Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒへ加えた。二回の再現テストを同時に行った。他に述べていない限り、試験を１２分間で行い、３分間すすいだ。洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をコニカミノルタ製Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＣＲ‐４１０で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。

５．１２．２ 欧州洗濯条件
Ａｔｌａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ａｔｌａｎｔａ, Ｇｅｏｒｇｉａ製のＬａｕｎｄｅｒ‐Ｏ‐ｍｅｔｅｒの使用‐
欧州洗浄条件下洗浄をシミュレートするために対象となる変異体酵素の検量効率曲線（ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を標準欧州試験洗剤、ＩＥＣ Ａ及び漂白（ＴＡＥＤ‐テトラ‐アセチル‐エチレン‐ヂアミンアセテート）及び過ホウ酸ナトリウムを有するＩＥＣ Ａ洗剤を用いて４０℃で実施した。比較変異体酵素の相当するＤＥＣ曲線を本発明の変異体酵素汚れ除去能力を比較するために実施した。もし必要ならば、このプロセスを高い洗浄温度で繰り返してよい。一般的に、ＥＭＰＡ １６１の４つの見本であるトウモロコシデンプン（ＥＭＰＡ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６．８ｇ／ＬのＩＥＣ Ａ洗剤又は漂白洗剤を有する８．０ｇ／ＬのＩＥＣ Ａを有する２５０ｍｌのＤＩ水をスチール製容器へ移した。二回の再現テストを同時に実施した。他に述べていない限り、試験を４５分間で行い、５分間すすいだ。洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をＣｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＣＲ‐４１０で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。

５．１２．３ 洗剤組成物を評価する微小見本方法
多くのアルファ‐アミラーゼ洗浄試験が存在する。洗浄試験の典型的な記載は次を含む。

「見本（ｓｗａｔｃｈ）」は、布地に着いた染みを有する布地のような材料の一片をいう。例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合から作製してよい。さらに、該見本は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスのような固い材料でもよい。アミラーゼにとって、汚れはデンプンベースであり、血液、牛乳、インク、草、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含むが、これらに限定されない。

「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ ｓｗａｔｃｈ）」は、一穴式の穴開け器でカットされた見本片であり、又はカスタムメードの９６穴用穴開け器であって、多数の穴が標準９６穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされた見本片、又は別な方法で見本から切り出された部分である。見本は繊維、紙、金属、又は他の適切な材料である。小さな見本は、その見本が、２４‐、４８‐、又は９６‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ ｓｗａｔｃｈ）」はまた少量の材料に染みを適用して作成してもよい。例えば、小さな見本は、汚れが付いた直径５／８″又は０．２５″の布地のものでよい。カスタムメードの穴開け器は９６穴プレートのすべての穴に同時に９６個の見本が挿入されるように設計されている。装置は、単に同じ９６穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の見本が搬送されるように設けられる。複数穴用穴開け器は、任意の型式プレートに見本の同時挿入をすることができるものであり、この型式プレートは２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズであり、繊維以外材料での洗浄組成物試験に用いるためにコーティングされる。一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ９６‐、４８‐、又は２４‐穴プレート又はより大きい穴型式のプレートに挿入される。この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。また、分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。さらにマイクロスクリーニング試験は、例えばインディゴ染色デニムの見本をマルチウェルプレートの穴に供給し、固定し、砂のような粒子又は例えば６から８、又は９ゲージの粒子を含むふるいで得たガーネットのようなより大きな粒子を加え、添加粒子によって見本を摩耗させるようにプレートを攪拌する。この試験はストーンウォッシング適用におけるセルラーゼの評価に有用である。酵素の有効性を、反応液への色の放出（例えば、放出インディゴをジメチルスルホキシドに溶解し、Ａ_６００ｎｍの吸収で測定する。）によって又は摩耗する見本の反射率の測定により判断する。

例えば、未処理のＢＭＩ（血液（ｂｌｏｏｄ）／牛乳（ｍｉｌｋ）／インク（ｉｎｋ））見本を漂白剤のない洗剤で洗浄する場合、インクの大部分はプロテアーゼの助けなしでも除去される。プロテアーゼの添加によりインクの除去が少し増大する。これは大きなバックグラウンドにおいては定量化が困難である。本発明は、染みの固定度合いを制御する処理手順を提供する。結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、汚れの量を変えて放出することのできる見本の作製が可能となる。固定化見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の比に劇的な改善が得られる。さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。

種々のタイプの材料の周知の「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」の汚れを有する見本は商業的に入手可能であり（ＥＭＰＡ， Ｓｔ． Ｇａｌｌｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ； ｗｆｋ-Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｋｒｅｆｅｌｄ Ｇｅｒｍａｎｙ;又はＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び／又は、専門家（Ｍｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｐｒａｔｏ， Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ５２（４）： ２８０ ２８６ （１９８２））によっても作成される。他の試験用見本は、綿を含む繊維上の血液／牛乳／インク（ＢＭI）染み、綿を含む繊維上のホウレンソウの染み、綿を含む繊維上の草の染み、及び、綿を含む繊維上のチョコレート／牛乳／すすを含むがこれらに限定されない。

ＢＭＩ染みは０．０００３％から０．３％の過酸化水素で綿に固定される。他の組み合わせは０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、ゼラチン及び０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるクーマシィーブリリアントブルー染色又は０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。

また、見本を酵素及び／又は洗剤製剤でインキュベーションする間、攪拌する。洗浄能力データはウェル、特に９６穴プレートにおける見本の方向（水平対垂直）に依存する。これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示すであろう。インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計され得る。これの設置の仕方は単純で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆い、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで９６穴プレートに固定すれば足りる。それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。振盪機を約４００ｒｐｍで設定することによって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。これは、見本から除去された蛋白質の量の測定に役立つ（例えば、Ｃａｙｏｔ ａｎｄ Ｔａｉｎｔｕｒｉｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４９： １８４−２００ １９９７を参照願いたい）。しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から）を生じる場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、即ち「ノイズ」が生じる。

血液／牛乳／インク又は他の染みに対する洗浄能力を測定する他の手段は、インク放出に基づく。見本上の蛋白質の蛋白質分解によって、洗浄液の吸光度を測定することにより定量されるインク粒子の放出が得られる。吸光度を３５０ｎｍと８００ｎｍの間の任意の波長で測定する。波長を４１０ｎｍ又は６２０ｎｍで測定する。また洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、又はクーマシィーブリリアントブルー染色を含む汚れにおける洗浄能力を決定するために試験を行う。これらの染みに対する典型的な波長は、ホウレンソウ、又は草について６７０ｎｍ及びゼラチン又はクーマシィーについては６２０ｎｍを含む。例えば、洗浄液（例えば、一般的に９６穴プレートから１００‐１５０μＬ）の一部を除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。

またシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適切な物質上の血液／牛乳／インク染みを用いて食器洗浄用の強化酵素及び／又は洗剤組成物を決定するために用いる。

ある実施態様においては、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間２５℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定し、又は０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間６０℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定する。約０．２５″の小さな見本をＢＭＩ／綿見本から切り離し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異蛋白質のような酵素の周知の混合を添加する。マイクロタイタープレートの上に粘着プレート用シールを固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約１０から６０分間、約２５０ｒｐｍでオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートに移され、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは０．０１％グルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿見本又は草／綿見本に３０分間２５℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及び／又はすすの染みで行われる。さらに血液／牛乳／インク試験及び条件を米国特許第７，１２２，３３４ (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)に記載する。

５．１３ ＬＡＳ感受性の検出
変異体を４０℃にて１０分間、異なる濃度のＬＡＳ（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、Ｎａｎｓａ １１６９/Ｐ）とインキュベーションする。

残留活性をファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））試験方法又はＰＮＰ−Ｇ_７基質を用いる代替方法を用いて測定する。

ＬＡＳを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５で希釈する。

次の濃度を用いる。それは５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍを含むか、又はＬＡＳを含まない。

変異体を全体積１０ｍｌ中０．０１‐５ｍｇ／ｌの濃度になるように異なるＬＡＳ緩衝液で希釈し、温度を制御する水浴にて１０分間インキュベーションする。インキュベーションを少量のサンプルの一部を低温の試験緩衝液に移すことにより停止する。活性測定に影響しないために、活性測定の間ＬＡＳ濃度を１ｐｐｍ未満にすることは重要である。

それから残留活性を上記ファデバス（商標）（ＰＨＡＤＥＢＡＳ（商標））試験又は代替方法を用いて２回再現する。

活性はブランクを除いた後測定する。

ＬＡＳを含まない活性を１００％とする。

本出願は読みやすいように多くのセクションで編成されている。しかながら、読み手があるセクションの記載が他のセクションへ適用してよいと理解できる。この場合、開示する異なるセクションに用いる見出しはその範囲を限定すべきでないと理解できる。

さらに本発明の組成物及び方法及びその効果を説明するために、次に具体的な実施例を示す。これらの実施例は本発明の組成物及び方法のをさらに説明するために提供されるという理解をもって記載され、特許請求の範囲を限定するとして決して理解すべきでない。

開示通して、次の略語が適用される。
ｗｔ％（質量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｒｃｅｎｔ）、℃（摂氏(ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ)、Ｈ_２Ｏ（水（ｗａｔｅｒ））、ｄＨ_２Ｏ又はＤＩ（脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ））、ｄＩＨ_２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ,Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)、ｇまたはｇｍ（グラム（ｇｒａｍｓ））、μg（マイクログラム(ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ)）、ｍｇ（ミリグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、ｋｇ（キログラム（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、μｌ及びμL（マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル(ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ)、ｍｍ（ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、μｍ（マイクロメートル(ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ)）、Ｍ（モル（ｍｏｌａｒ））、ｍＭ（ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、μＭ（マイクロモル(ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ)）、Ｕ（単位(ｕｎｉｔｓ)）、ＭＷ（分子量(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ)）、ｓｅｃ（秒(ｓｅｃｏｎｄｓ)）、ｍｉｎ（ｓ）（分(ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ)）、ｈｒ（ｓ）（時間(ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ)）、ＤＯ（溶解酸素(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ)）、Ｗ／Ｖ（重量／体積(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｗ／Ｗ（重量／重量(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｗｅｉｇｈｔ)）、Ｖ／Ｖ（体積／体積(ｖｏｌｕｍｅ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、Ｎｃｍ（ニュートン センチメートル(Ｎｅｗｔｏｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ)）、及びＥＴＯＨ（エタノール(ｅｔｈａｎｏｌ)）。ｅｑ（当量(ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ)、Ｎ（規定(Ｎｏｒｍａｌ)）ｄｓ又はＤＳ（乾燥固体含有量(ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ)）

実施例１
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡｍｙＴＳ２３の発現
ＡｍｙＴＳ２３完全長の発現を試験するために、図３（Ｇｅｎｅａｒにより作成、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ）に記載の合成ＤＮＡ配列をＬＡＴ（バシルス リチェニフォルミス（Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ）プロモーターの後ろに、及びフレーム中ＬＡＴシグナルペプチド（図５）をコードする配列に融合するようにｐＨＰLＴベクターへクローン化し（例えば、ＷＯ２００５１１１２０３及び[Solingen他、(2001) Extremophiles 5: 333-341]を参照願いたい）、９プロテアーゼ欠損バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（degU^Hy32、oppA、ΔspoII3501、amyE::xylRPxylAcomK-ermC、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB) へ形質転換した(ＵＳ２００５０２０２５３５Ａ１を参照願いたい)。ヨウ素染色（WO2005111203を参照願いたい）後、デンプンプレート上ハロー形成により判断することによってネオマイシン（１０μｇ／ｍｌ）耐性形質転換体はＡｍｙＴＳ２３を分泌する。これらのアミラーゼ陽性形質転換体の一つを選択し、ＢＧ６００６(ｐＨＰＬＴ‐ＡｍｙＴＳ２３)を設計する。この菌株の培養を一般的に３７℃にて６０から７２時間２５０ｒｐｍにて次の培地中にて培養した。それは１リットル当たり、１０ｇソイトン、７５ｇグルコース、７．２ｇ尿素、４０ｍＭ ＭＯＰＳ、４ｍＭ トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、３ｍＭ リン酸水素２カリウム、２１．４ｍＭ ＫＯＨ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２７６μＭ 硫酸カリウム、５２８μＭ 塩化マグネシウム、５０μＭ クエン酸３ナトリウム２水和物、１００μＭ 塩化カルシウム２水和物、１４μＭ 硫酸鉄７水和物、5.9μＭ硫酸マグネシウム２水和物、５．７μＭ 硫酸亜鉛１水和物、2.9μＭ 塩化（第二）銅２水和物、４．２μＭ 塩化コバルト５水和物、４．５μＭ モリブデン酸ナトリウム２水和物である。１Ｌの体積に対してソイトン以外の成分を５００ｍＬ中に混合し、滅菌ろ過し、オートクレーブにより滅菌処理した２Ｘソイトンの等量を加えた。微量金属及びクエン酸塩を１００Ｘ又は１０００Ｘ保存溶液として調製した。緩衝液、水酸化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、及び塩化マグネシウム及び微量金属を１０Ｘ保存溶液として調製した。すべての成分を混合し、ｐＨを７．３に調整した。使用前にこの培地を２０ｍＭ塩化カルシウムで補完した。

培養物は二つの主な形態であるアミラーゼを発現した。高分子量形態は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上６６ｋＤａにて観察された。短い形態は５５ｋＤａにて観察された。

高分子量成分をβ‐シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ｃ４７６７）及びエポキシ‐活性化‐セファロース‐６Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｎ．Ｊ． カタログ番号17-0480-01）から標準的手順により実験室にて合成されるβ‐シクロデキストリン‐セファロース親和性マトリックス樹脂の１０ｍＬ静置体積を用いて、４℃にて終夜穏やかな攪拌を伴って５００ｍＬの培地を処理し、樹脂を集め、２ｍＭ塩化カルシウム(ＣａＣｌ_２)含有２５ｍＭビス‐トリスプロパン緩衝液(ｐＨ８．５)で洗浄することにより培養培地から単離した。高分子量酵素を５０ｍＭβ‐シクロデキストリンを補完した同じ緩衝液を用いて樹脂を洗浄することにより溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、酵素を含むものを集め、透析し、β‐シクロデキストリンを除いた。酵素タンパク質の濃度をタンパク質スタンダードとして役立つＯｘＡｍアミラーゼ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ)を用いてゲル濃度測定により評価した。

実施例２
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡｍｙＴＳ２３ｔの発現
遺伝子的に欠失されるＡｍｙＴＳ２３（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）の発現を試験するために、図４に記載の合成ＤＮＡフラグメントをｐＨＰＬＴへクローン化し、実施例１に記載のように９プロテアーゼ欠損バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株へ形質転換した。ヨウ素染色後、デンプンプレート上ハロー形成により判断することによってネオマイシン（１０μｇ／ｍｌ）耐性形質転換体はＡｍｙＴＳ２３ｔを分泌する。これらのアミラーゼ陽性形質転換体の一つを選択し、ＢＧ６００６(ｐＭＥ６２２．１)を設計する。この菌株を実施例１に記載のようにＡｍｙＴＳ２３ｔアミラーゼを生産するために培養した。培地上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより試験し、予想サイズの５５ｋＤａの産物を生産していることが示された。

アミラーゼタンパク質は５００ｍＬの培養物にＮＨ_４ＳＯ_４を１Ｍの最終濃度になるように添加して部分的に精製した。次に、フェニルセファロース樹脂の１０ｍＬ静置体積に添加し、混合物を４℃にて終夜穏やかに攪拌した。樹脂を回収し、１Ｍ ＮＨ_４ＳＯ_４及び２ｍＭ 塩化カルシウム（ＣａＣl₂）含有２５ｍＭ ビス‐トリスプロパン緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて洗浄した。酵素活性をＮＨ_４ＳＯ_４含まない同じ緩衝液にて溶出した。分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析し、酵素を含むものを回収し、残留ＮＨ_４ＳＯ_４を除去するために透析した。酵素タンパク質の濃度をタンパク質スタンダードとして役立つＯｘＡｍアミラーゼ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)を用いてゲル濃度測定により評価した。

実施例３
ＡｍｙＴＳ２３洗浄スクリーニング試験
実施例１に記載の部分的精製ＡｍｙＴＳ２３完全長を９６穴ＣＳ２８オレンジ‐染色コメデンプン汚れ布地見本微小適用洗浄試験により分析した。この試験を実施するために、９６穴プレートに一時間室温にて水で予洗浄し、空気乾燥した布地から切り取られる１／４インチ布地見本を入れる。このすすぎにより弱い結合汚れの多くの量が除かれる。あるいは、見本をプレートに添加後予洗浄してもよい。両方の手法は同じ結果を与える。選択する緩衝液をプレートのウェルへ添加し、プレートを所望の温度に平衡化させる。本実施例において、試験を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）及び２５ｍＭＣＡＰＳ（ｐＨ１０．３）緩衝液中実施し、インキュベーションは２０℃又は４０℃であった。平衡化の後、酵素を所望濃度に添加し、インキュベーションを３０分から１時間７５０ｒｐｍにて攪拌しながらＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ制御温度ブロック中連続的に行う。性能は溶液中へ放出する色素に依存する酵素量により判定した。色素放出を４８８ｎｍにて分光光度法的に定量した。試験に関する更なる情報は、米国特許第７，１２２，３３４を参照願いたい。

この試験にかかるこの酵素の洗浄データを図６（２０℃）及び図７（４０℃）に示す。完全長ＡｍｙＴＳ２３（ＡｍｙＴＳ２３ｆｌ）はｐＨ８．０にて汚れ除去において高い効率性を有し、ｐＨ１０．３にて驚くべき汚れ除去も示した。

データはＡｍｙＴＳ２３ｆｌが、両方のｐＨの値にてコントロール（ＯｘＡｍ）よりよい性能を示す。

この見本試験を異なる目的のために幾つかの方法に修飾できる。９６穴試験は、見本と酵素のインキュベーション後、分光光度法的に吸光度を測定することによって、高いスループット洗浄試験としてかなり有効であり、一方、例えば、ウェルに合うようにカットした見本を有する２４穴プレートを周知なように測定される反射率で大きな見本洗浄のために用いてよい。二つの測定方法である上清吸光度及び見本反射率はほとんど完璧な相関関係があった。

上清の吸光度と洗浄見本の反射率の相関関係は高かった。決定係数であるｒ^２は０．９９という値であった。原則として、試験を３８４穴プレートへ拡大してよい。試験を任意の汚れ布見本を用いて実施してよく、さらにＣＳ２８見本、ＣＳ２６、ＣＳ２７、及びＣＳ２９布見本を実施例３に記載の測定の効率性を決定するために同様に（例えば、それぞれ、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｐｉｔｔｉｓｔｏｎ， ＰＡ）試験してよい。また、試験を洗剤組成物を用いて使用してよく、異なる温度にて及び異なるｐＨ値にて実施してよい。これらの試験は米国特許第７，１２２，３３４に記載される。

実施例４
ＡｍｙＴＳ２３ｔでの洗浄スクリーニング試験
実施例２に記載のように部分的精製欠失ＡｍｙＴＳ２３（ＡｍｙＴＳ２３ｔ）を９６穴ＣＳ２８オレンジ染色コメデンプン汚れ布地見本微小適用洗浄試験について分析した。この試験にかかるこの酵素の洗浄データを図８（２０℃）及び図９（４０℃）に示す。データは両方のｐＨ値にてＡｍｙＴＳ２３ｔがコントロールアミラーゼ（ＯｘＡｍ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ製アミラーゼ商品）より優れた性能を示す。図６及び８の比較ははっきりと欠失ＡｍｙＴＳ２３がＡｍｙＴＳ２３完全長分子より２０℃にて優れた性能を示す。つまり欠失分子は洗濯適用に有利な分子である。

実施例５
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡｍｙＴＳ２３変異体の発現
この実施例において、ＡｍｙＴＳ２３ｔの変異体を発現するバシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の構築体を記載する。ＡｍｙＴＳ２３遺伝子（図３）最適コドンを含む合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６ (Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨにより作成,Ｊｏｓｅｆ‐Ｅｎｇｅｒｔ‐ｓｔｒａｓｓｅ １１, Ｄ−９３０５３ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ)を鋳型ＤＮＡとして用いた。ｐＨＰＬＴベクター（Solingen 他、Extremophiles 5:333-341, 2001）であって、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）プロモーター及びＬＡＴシグナルペプチド（ｐｒｅＬＡＴ）引き続きクローニングのためにＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限酵素認識部位を含むベクターをＡｍｙＴＳ２３ｔ変異体の発現に用いた。

三つのＤＮＡフラグメントを下記に記載のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲにより作成した。
１．コドン１８０のＣＧＧ及びコドン１８１のＡＧＣ欠失を伴うＡｍｙＴＳ２３ｔ（ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ）
２．ＣＴＧにより置換されるコドン２０１のＡＴＧ伴うＡｍｙＴＳ２３ｔ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ）
３．ＣＴＧにより置換されるコドン２０１のＡＴＧ及びコドン１８０のＣＧＧ及びコドン１８１のＡＧＣ欠失両方を伴うＡｍｙＴＳ２３ｔ（ＡｍｙＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ＋ΔＲＳ））

これらのＤＮＡプライマーはシグマ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ Ｂ．Ｖ．， Ｐｏｓｔｂｕｓ ２７， ３３３０ ＡＡ Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により合成及び脱塩された。

下記に記載のすべてのＰＣＲ反応のために、最終濃度０．２μＭＤＮＡプライマーを用いた（フォワード及びリバースプライマー）、及び０．１−１０ｎｇのＤＮＡ鋳型を用いた（ＤＮＡフラグメント０５６４２６又はｐＤＮＡ ｐＨＰＬＴ）。さらに、すべてのＰＣＲ反応をＦｉｎｎｚｙｍｅｓ (Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ ＯＹ， Ｋｅｉｌａｒａｎｔａ １６ Ａ， ０２１５０ Ｅｓｐｏｏ， Ｆｉｎｌａｎｄ)Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ‐Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (カタログ番号Ｆ‐５３０Ｌ)を用いて５０μｌの体積にて完了した。また、すべてのＰＣＲ反応混合物は１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、1μLの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、０．７５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ(２ｕｎｉｔｓ/μＬ)、１μＬの１００％ＤＭＳＯ及び最終体積を５０μLとする脱イオン化及びオートクレーブ処理水を含んだ。ＰＣＲプログラムは、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ‐２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ (ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５９０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ ０２４５１，ＵＳＡ)を用いてＦｉｎｎｚｙｍｅｓ(使用説明書)のように実施した。それは、３０秒９８℃にて、３０ｘ(１０秒９８℃にて、２０秒５５℃にて、 ２２秒／ｋｂ ７２℃にて)、５分 ７２℃である。

１．ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ変異体の生成
二つのＰＣＲ反応を合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐ｄｅｌＲＳ‐ＦＷとｐＨＰＬＴ‐ＨｐａＩ‐ＲＶを用いて及び合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐ｄｅｌＲＳ‐ＲＶとｐＨＰＬＴ‐ＰｓｔＩ‐ＦＷを用いて実施した。これら二つの生成ＤＮＡフラグメントを融合するために、両方の反応から１μＬの未精製ＰＣＲ混合物をプライマーｐＨＰＬＴ‐ＰｓｔＩ‐ＦＷとｐＨＰＬＴ‐ＨｐａＩ‐ＲＶが添加された３番目のＰＣＲ反応サンプルへ添加した。

増幅された直線１．５ｋｂＤＮＡフラグメントを精製（Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ精製キットを用いて、カタログ番号２８１０６）し、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限酵素を用いて消化した。続いて、ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ（また、本明細書にてＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳという）ＤＮＡフラグメント及びｐＨＰＬＴ ｐＤＮＡ (５０ ｎｇ/μｌ レンジ、ＰｓｔＩとＨｐａＩ酵素で消化される)を両方とも精製（Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ精製キットを用いて、カタログ番号２８１０６）し、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩ末端にてライゲーションした。反応条件は、
４μＬの精製され及びＰｓｔＩとＨｐａＩで消化されたＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ ＤＮＡフラグメント、２μＬの精製され及びＰｓｔＩとＨｐａＩで消化されたpＨＰＬＴ ＤＮＡフラグメント、８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ番号４６３００‐０１８)、２５μＬの蒸留滅菌水及び１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１ｕｎｉｔ／μＬ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ番号１５２２４‐０１７)である。ライゲーション反応を２０℃にて１６‐２０時間行った。

続いて、ライゲーション混合物をバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株(ΔaprE,ΔnprE,Δepr,ΔispA,Δbpr)及びd（egU^Hy32,oppA,ΔspoIIＥ3501,amyE::xylRPxylAcomK-ermC, （Δvpr,ΔwprA,Δmpr-ybfJ,ΔnprB）へ形質転換した。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換はＷＯ ０２／１４４９０に記載のように行った。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体をハートインフュージョンアガー（Ｄｉｆｃｏ、カタログ番号２４４４００）及び１０ｍｇ／Ｌネオマイシンを含む寒天プレート上にて選択した。ｐＨＰＬＴ‐ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳベクターを保持するバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体の選択的増殖を実施例１に記載のように振盪フラスコにて実施した。この増殖はヨウ素による染色を伴うデンプン寒天プレート上培養上清をスポットすることにより可視化されるようにデンプン加水分解活性を有する分泌ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの生産をもたらした。

２．ＡｍｙＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ）の生成
最初の二つのＰＣＲ反応を除いて「ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ変異体の生成」に記載のように同様の手順で行った。二つのＰＣＲ反応は合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐Ｍ２０１Ｌ‐ＦＷとｐＨＰＬＴ‐Ｈｐａｌ‐ＲＶ及び合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐Ｍ２０１Ｌ‐ＲＶとｐＨＰＬＴ‐ＰｓｔＩ‐ＦＷを用いて実施した。

３．ＡｍｙＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ）−ＲＳ欠失の生成
最初の二つのＰＣＲ反応を除いて上述の「ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳ変異体の生成」に記載のように同様の手順で行った。二つのＰＣＲ反応は合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐ｄｅｌＲＳ／Ｍ２０１Ｌ‐ＦＷとｐＨＰＬＴ‐ＨｐａＩ‐ＲＶ及び合成ＤＮＡフラグメント０５６４２６についてプライマーＴＳ‐ｄｅｌＲＳ／Ｍ２０１Ｌ‐ＲＶとｐＨＰＬＴ‐ＰｓｔＩ‐ＦＷを用いて実施した。

実施例６
洗剤におけるＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの改善される安定性
ＡｍｙＴＳ２３ｔ及びＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの安定性を３７℃にてＭＯＰＳ緩衝液中、熱不活化タイド（Ｔｉｄe）（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）、及びプロトタイプ洗剤（プロトタイプ製剤Ａ）で促進される安定性テストにて実施した。酵素サンプルを不活化液体タイド又はプロトタイプ製剤Ａ液体洗剤中３７℃にてインキュベーションし、残留活性はメガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）試験における時間に対して決定した。結果を図１０に示す。二つの洗剤ベース（不活化Ｔｉｄｅ又はプロトタイプＡ洗剤）いずれかの存在下ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳだけが任意の追加的添加剤を用いずに安定である。図１０に示すように、ＡｍｙＴＳ２３ｔは一日後その活性の大部分を消失し、３７℃にて促進される試験の二日後完全に活性を消失した。ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳは同様の条件下安定であり、１７日後もとの酵素活性の約９０％残存した。

実施例７
ＡｍｙＴＳ２３及びＡｍｙＴＳ２３変異体の酸化安定性
アミラーゼは過酢酸（ＰＡＡ）に暴露する時の反応は多様である。つまり、この実施例はＡｍｙＴＳ２３及びＡｍｙＴＳ２３変異体アミラーゼの酸化安定性を決定することを考える。条件は下記にまとめる。
ストレス条件 メガザイムアッセイ
３０ｍＭ酵素 ブロック化ＰＮＰＧ７
２５ｍＭホウ酸ｐＨ８．６５ ２５ｍＭＢＴＰ／ＣａＣｌ２、ｐＨ６．９
１ｍＭＰＡＡ、４０℃、5分 ４０℃ ４５分 カイネティック
停止２５ｍＭ ＢＴＰ、ｐＨ８．５

酵素希釈を１ｍＬのスピン脱塩カラムにて緩衝液を交換することにより２５ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．６４、２ｍＭ Ｃａ^２＋にて調製した。５μＬ体積中に含まれる過酢酸を０から１ｍＭ過酢酸になるように２５μＬの酵素溶液へ添加した。サンプルを５分間４０℃にてＰＣＲ装置（ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ、 ＢｉｏＲａｄ）にてインキュベーションした。反応を２５ｍＭＢＴＰ、ｐＨ８．５を用いて止めた。残留アミラーゼ活性をメガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）(Ｗｉｃｋｌｏｗ， Ｉｒｅｌａｎｄ)製標準アミラーゼアッセイキットを用いて測定した。

図１１に示すように、ＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ）は低いＰＡＡ濃度にて１００％より高い安定性を有し、安定性は高い濃度にて減少する。ＴＳ２３ｔ（Ｍ２０１Ｌ＋ΔＲＳ）は低いＰＡＡ濃度にて２５％の改善される安定性を有し、１００％未満に低下し、最終的に高いＰＡＡ濃度にて酸化安定性を維持する。ＴＳ２３ｔ、ＴＳ２３ΔＲＳ、及びＡｍｙ７０７はＰＡＡ存在下不安定であり、低い濃度にてベースラインまで安定性が減少する。

実施例８
洗剤における洗浄性能
ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの選択される濃度の用量効果曲線は本出願のセクション５．１２．１に記載の方法を用いて作成した。性能評価はＴｅｒｇｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて２０℃及び４０℃両方にて実施された。ステインザイム（Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ）及びステインザイム プラス（Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ）に対する用量効果曲線を作成するために同様の条件を用いた。データ（図１２）からわかるように、ＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳは２０℃にてステインザイム両者より顕著に優れ、４０℃にてややよい。このデータは冷水における酵素の特有の優れた高い性能としてＡｍｙＴＳ２３ｔΔＲＳの特有な利益を支持する。

実施例９
バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるアミラーゼの生産
この実施例においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ‐２３ｔ及びバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるその変異体の生産を記載する。形質転換を周知の方法（例えば、ＷＯ ０２／１４４９０を参照願いたい）にて実施した。簡単にいえば、親アミラーゼをコードする遺伝子をＬＡＴプロモーター(ＰＬＡＴ)、ＬＡＴシグナルペプチドをコードする配列(ｐｒｅＬＡＴ)、を含み、クローニングのためにＰｓｔＩ及びＨｐａＩ制限部位を伴うｐＨＰＬＴ発現ベクターへクローン化した。

ＬＡＴシグナルペプチドのためのコード領域を以下に示す。
atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca (配列番号5)

ＬＡＴシグナルペプチドのアミノ酸配列を下記に示す。
MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA (配列番号6)

成熟ＡｍｙＴＳ‐２３ｔアミラーゼのコード領域を図４に示す。

本明細書に記載の変異体ライブラリーを作成するために基礎として用いた成熟ＡｍｙＴＳ‐２３ｔアミラーゼのアミノ酸配列を図２に示す。

ＰＣＲ生産物をＱｉａｇｅｎ製Ｑｉａｑｕｉｋカラムを用いて精製し、５０μＬの脱イオン水に再懸濁した。５０μＬの精製ＤＮＡをＨｐａＩ（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｓｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、得られたＤＮＡを３０μＬの脱イオン水に再懸濁した。１０から２０ｎｇ／μＬのＤＮＡをＰｓｔＩ及びＨｐａＩクローニング部位を用いてプラスミドｐＨＰＬＴへクローン化した。ライゲーション混合物をコンピテントバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞(ゲノタイプ: Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)へ直接形質転換した。バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞はキシロース誘導プロモーター下に位置するコンピテンシー遺伝子(comK)を有しており、キシロースはＤＮＡ結合及び取り込みのためのコンピテンシーを誘導するために用いる（Hahn他Moｌ. Microbiol., 21:763-775[1996]を参照願いたい）。

プラスミドｐＨＰＬＴ‐ＡｍｙＳの要素は次を含む。それは
ｐＵＢ１１０=プラスミドｐＵＢ１１０ (McKenzie他、Plasmid 15:93-103[1986])由来のＤＮＡフラグメント
である。
プラスミドの特徴は次を含む。それは、
ｏｒｉ‐ｐＵＢ１１０= ｐＵＢ１１０由来複製部位（ｏｒｉｇｉｎ）、
ｎｅｏ＝ｐＵＢ１１０由来ネオマイシン耐性遺伝子、
Ｐｌａｔ=バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来転写プロモーター
Ｐｒｅ‐ＬＡＴ=バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来シグナルペプチド、
ＳＡＭＹ４２５ｓｓ＝欠失されたＡｍｙＴＳ‐２３遺伝子配列用コード領域（この実験で発現される各欠失ＡｍｙＴＳ‐２３変異体用コード領域により置換される）、及び
ターミネーター =バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ由来転写ターミネーター
である。

アミラーゼ発現−２ｍｌスケール
ＡｍｙＴＳ２３ｔ発現ベクターを含むバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンをスチール製９６穴レプリケーターを用いてグリセロールストックから１５０μｌのＬＢ培地＋１０μｇ／ｍｌネオマシン含有９６穴培養プレート(ＢＤ，３５３０７５)へ複製し、加湿密閉にて２２０ｒｐｍ３７℃にて終夜培養した。終夜培養培地から１００μｌを５ｍＬプラスチック培養管において２０００μｌの規定の培地＋１０μｇ／ｍｌネオマシンへ播種するために用いた。この培養培地は主要な窒素源として尿素を、主な炭素源としてグルコースを伴う、及び好ましい細胞増殖のために１％ソイトン及び５ｍＭカルシウムで補強されるＭＯＰＳ緩衝液に基づく栄養強化半規定培地であった。培養管を２５０ｒｐｍ３７℃にて７２時間培養した。このインキュベーションに続き、培養培地を３０００ｘｇにて１０分間遠心分離をした。上澄み溶液を１５ｍｌポリプロピレン円錐管へデカントし、８０μＬの各サンプルをタンパク質定量のために９６穴プレートへ入れた。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡｍｙＴＳ２３ｔ組合せ電荷ライブラリーの作成
所望の物理的性質の範囲にわたって複数のタンパク質変異体を存在するライブラリー又は周知の部位特異的突然変異の方法（例えば、US Pat. Appln. Ser. Nos., 10/576,331、11/581,102、及び 11/583,334を参照願いたい）により作成されるライブラリーから選択する。それからこの特定したプローブタンパク質のセットを所望の試験において試験する。

ＡｍｙＴＳ２３ｔはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＴＳ−２３アルファ‐アミラーゼの欠失体である（Lin他、1998, Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23, Biotechnol. Appl. Biochem. 28: 61-68を参照願いたい）。複数のプロテアーゼ欠失バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株 (degU_Hy32、oppA、ΔspoII3501、amyE::xylRPxylAcomK-ermC、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)におけるＡｍｙＴＳ２３ｔの発現を本明細書に記載する(例えば、US2005/0202535A1を参照願いたい)。形質転換されたバシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から単離したＡｍｙＴＳ２３ｔプラスミドＤＮＡをＣＣＬ構築物のためのテンプレートとしてＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．(Menlo Park, CA)へ送付した。ＤＮＡ２．０に次の７つの変異をＡｍｙＴＳ２３ｔへ導入することにより、ＣＣＬの親構築物を調製することを依頼した。ここでその変異はＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔ、Ｑ９８Ｒ、Ｍ２０１Ｌ、Ｓ２４３Ｑ、Ｒ３０９Ａ、Ｑ３２０Ｒ、Ｑ３５９Ｅ、及びＫ４４４Ｅと称した。変異体は９６穴プレートにてグリセロールストックとして供給された。続いて、表９−１に示すようにＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔアミラーゼにおける４つの各部位でのポジショナルライブラリーの作成をＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．へ依頼した。

ＡｍｙＴＳ２３ｔ‐７ｍｕｔにおける次の４つの残基であるＧｌｎ８７、Ａｓｎ２２５、Ａｓｎ２７２、及びＡｓｎ２８２を同定することによりＡｍｙＴＳ２３ｔ組み合わせ電荷ライブラリーを設計した。野生型、アルギニン又はアスパラギン酸の３つの可能性のある各部位のすべての組み合わせを作ることにより、４つの部位、８１個のメンバー組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）を創製した。

実施例１０
性能指標
コメ微小布見本試験
試験用洗剤を本明細書に記載のように調製した。装置はＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ ４２３０シェーカー／インキュベーター及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ (３４０タイプ) マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）リーダーを含んだ。ＭＴＰはコーニング社から得た(３６４１タイプ)。オレンジ染料含有熟成コメデンプン見本(ＣＳ‐２８)をＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ (Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ)から入手した。微小布見本を０．２５インチの円に切断する前に布地を水で洗浄した。二つの微小布見本を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を２０℃（北アメリカ）又は４０℃（西ヨーロッパ）にて平衡化した。１９０μｌの洗剤液を微小布見本を含むマイクロタイタープレートの各ウェルへ添加した。この混合物に１０μｌの希釈酵素溶液を加えた。マイクロタイタープレートを粘着ホイルで蓋をし、一時間７５０ｒｐｍで攪拌しながら所望の試験温度（一般的に２０℃又は４０℃）でインキュベーターに置いた。インキュベーションに続いて、各ウェルから１５０μｌの溶液を新しいマイクロタイタープレートへ移した。このマイクロタイタープレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロタイタープレートリーダーを用いて４８８ｎｍで測定し、洗浄を定量した。ブランクコントロール及び微小布見本及び洗剤を含有するが酵素を含んでいないコントロールも含んだ。

洗剤の加熱による不活化
市販洗剤製剤の加熱による不活化は非酵素的成分の性質を維持しながら任意のタンパク質成分の酵素的活性の分解に役立つ。つまり、この方法は本発明の組成物及び方法の酵素変異体を試験する時に使用する商業的に購入する洗剤の調製に有用であった。北アメリカ（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）の強力液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤については、糧る前の液体洗剤（ガラスボトル中）を９５℃にて２時間水浴に置くことにより加熱による不活化を行った。北アメリカ（ＮＡ）及び日本（ＪＰＮ）の強力顆粒洗濯（ＨＤＧ）洗剤の加熱不活化のインキュベーション時間は８時間及び西ヨーロッパ（ＷＥ）のＨＤＧ洗剤は約５時間であった。ＮＡ及びＷＥ自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤の加熱による不活化のインキュベーション時間は約８時間であった。洗剤を地方のスーパーマーケットから購入した。熱未処理及び熱処理洗剤両方は不活化パーセントを正確に決定するために洗剤を溶かして５分以内にアッセイを実施した。酵素活性は１ｍｇ／ｍＬＡＡＰＦを用いるＡＡＰＦアッセイを用いて試験した。

加熱による不活化洗剤における酵素活性の試験のために、洗剤のワーキング溶液を加熱の不活化ストックから作製した。適切な水硬度（６ｇｐｇ又は１２ｇｐｇ）の量及び緩衝液を所望の条件（表１０−１）に適合するように洗剤溶液に添加した。溶液をボルテックス又はボトルを逆さにして混合した。

酵素性能の計算
計算得られた吸光度の値をブランク値（つまり、酵素非存在下で微小布見本のインキュベーション後得られた値）で修正した。得られた吸光度を加水分解活性として測定した。結果を表１０−２及び１０−３に示す。酵素性能を上記に記載のように熱不活化洗剤を用いて評価した。１より大きい性能指標（ＰＩ）を有するものを改善された変異体とした。ＰＩは野生型（ＷＴ）残留活性に対して変異体の残留活性の比である。

実施例１１
組合せＬＡＳ／キレート安定性
この実施例は陰イオン性界面活性剤及びキレートを含む反応媒体におけるタンパク質電荷及び安定性の間の関係を決定することを記載する。ＬＡＳ安定性を０．１％ＬＡＳ（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）及び１０ｍＭＥＤＴＡ存在下試験アミラーゼをインキュベーション後上述に記載の方法に従ってＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイにおける残留活性を測定することにより測定した。ストレスが有る及びストレスが無いサンプルのアルファ‐アミラーゼ活性の決定のために、ＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイを用いた。ストレスのあるプレートからの残渣ＬＡＳ及びＥＤＴＡはＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイに影響を与えない。

試薬は次を含む。
コントロール緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．００５％ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０、ｐＨ８．０及び
ストレス緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＡＳ（ドデシルベンゼン‐スルホン酸、ナトリウム塩 シグマＤ−２５２５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
酵素変異体（２０ｐｐｍ）をコントロール緩衝液又はストレス緩衝液いずれかを含む９６穴非結合平底プレートへ１：２０に希釈し、混合した。コントロールプレートを室温にてインキュベーションし、一方ストレスプレートはすぐに３７℃にて３０から６０分間（試験される酵素の安定性次第）置いた。インキュベーション後、酵素活性をアミラーゼに関してＢＯＤＩＰＹ‐デンプンアッセイを用いて測定した。活性を維持しているフラクション又は残留活性を有するフラクションはコントロールサンプルの反応速度で割ったストレスを有するサンプルの反応速度に等しい。親酵素及び変異体はコントロール緩衝液にて６０分間安定である。

表１１−１は８０変異体を含むライブラリーに関し野生型ＴＳ‐２３ｔ−７ｍｕｔに比較して正味電荷変化に応じて増加したＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性を有する変異体を示す。このライブラリーは親ＴＳ‐２３ｔ−７ｍｕｔ分子に比較していくつかの正味電荷にわたって実施例２に記載の方法に従って設計及び構築された。１より大きい性能指標（ＰＩ）は変異体がこのデンプン基質（トウモロコシデンプン）においてＳ２４２Ｑ親より高い特異的活性を有することを示す。

ＡＳＰ及びＦＮＡにはＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性に関して電荷依存性が有る（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３０９７４ＷＯ‐２を有する2008年６月６日出願ＷＯ／２００８／１５３９２５を参照願いたい）。負電荷を追加すると安定性が増加する。しかし、親より一以上の電荷がより正へ移行する場合であっても、本方法により、親と等しいまたは親より大きい安定性を獲得する電荷変異の調整を見つけることができる。また、このアプローチは図１３に示すＴＳ２３ｔ’のような大きな酵素に効果的であり、ここで安定性での正電荷の追加による不利益な効果は安定性を増加する最適電荷調整により相殺することができる。

上記明細書に言及するすべての文献及び特許は引用により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の修飾及び変化は本発明の範囲及び精神を逸脱しないことは当業者にて明らかである。本発明の組成物及び方法は特定の所望の実施態様との関係で記載されているが、特許請求の範囲にかかる実施態様が、そのような特定の実施例に不当に限定すべきでないことは理解されるところである。実際に、本発明の組成物及び方法を実施するための記載される実施態様の多様な修飾は、当業者とって特許請求の範囲内であることがあきらかであり、以下の特許請求の範囲内であることを意図する。

Claims (23)

1. 親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体であって、前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸を有し、該変異体は下記の少なくとも二つ
   （ａ）Ｃ末端の欠失、
   （ｂ）２０１残基の置換、又は
   （ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失
   を含み、
   ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸配列をいう変異体。
2. 前記変異体がアルファ‐アミラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載の変異体。
3. 前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも９０％の相同性を有する請求項１又は２に記載の変異体。
4. 前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも９５％の相同性を有する請求項３に記載の変異体。
5. 親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体であって、前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８５％の相同性を有し、Ｃ末端の欠失を含む変異体。
6. 配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の変異体。
7. 前記変異体が親アミラーゼと比較して冷水中デンプン汚れに対して増加した洗浄活性を有することを特徴とする請求項５又は６に記載の変異体。
8. さらに、Ｒ１８０及びＳ１８１の位置にて残基の欠失を含み、ここで、前記アミノ酸残基の位置が配列番号１のアミノ酸配列をいうことを特徴とする請求項５又は６に記載の変異体。
9. 前記変異体が親アミラーゼと比較して増加した洗剤安定性を有することを特徴とする請求項８に記載の変異体。
10. さらに２０１位置にて残基の置換を含み、ここで前記アミノ酸残基の位置が配列番号１のアミノ酸をいうことを特徴とする請求項５又は６に記載の変異体。
11. 前記変異体が親アミラーゼに比較して増加した酸化安定性を有することを特徴とする請求項１０に記載の変異体。
12. 前記置換がＭ２０１Ｌであることを特徴とする請求１０又は１１に記載の変異体。
13. 前記親アルファ‐アミラーゼが配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれかに記載の変異体。
14. 請求項１から請求項１３のいずれかに記載の変異体であって、さらに、残基８７、残基２２５、残基２７２、及び残基２８２からなる群から選択される残基の一以上にて置換を含むことを特徴とする変異体。
15. 請求項１から請求項１４のいずれかに記載の変異体をコードする核酸。
16. 適切なプロモーター制御下に設けられる、請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
17. 請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
18. 手作業又は自動食器洗浄組成物であって、請求項１から請求項１４のいずれかに記載の変異体及び界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤及び香料の一以上を含むことを特徴とする組成物。
19. 洗濯洗剤添加剤であって、請求項１から請求項１４のいずれかに記載の変異体及び界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料の一以上を含むことを特徴とする添加剤。
20. 織物からデンプンを除く方法であって、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体存在下織物をインキュベーションすることを含み、ここで前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、該変異体は下記の少なくとも二つ
    （ａ）Ｃ末端の欠失、
    （ｂ）２０１残基の置換、又は
    （ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失
    を含み、
    ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸をいい、前記インキュベーションは織物からデンプンを除去するように設けられる方法。
21. デンプンを処理する方法であって、親ＡｍｙＴＳ２３アルファ‐アミラーゼの変異体存在下に織物をインキュベーションすることを含み、ここで前記変異体が親アルファ‐アミラーゼに少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、該変異体は下記の少なくとも二つ
    （ａ）Ｃ末端の欠失、
    （ｂ）２０１残基の置換、又は
    （ｃ）Ｒ１８０及びＳ１８１残基の欠失
    を含み、
    ここで、前記アミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸をいい、前記インキュベーションは前記デンプンを加水分解するように設けられる方法。
22. 織物からデンプンを除く方法であって、請求項１から請求項１４のいずれかに記載の変異体存在下に織物をインキュベーションすることを含み、前記インキュベーションが織物からデンプンを除去することを特徴とする方法。
23. デンプンを処理する方法であって、請求項１から請求項１４のいずれかに記載の変異体存在下に織物をインキュベーションすることを含み、前記インキュベーションが織物からデンプンを加水分解することを特徴とする方法。
    
    
    

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