JP2002533077A - 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2 - Google Patents
活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループi−s1及びi−s2Info
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Abstract
Description
の追加のアミノ酸残基を有する、新規サブチラーゼ酵素サブグループI-S1及びI-
S2に関する。これらプロテアーゼは洗浄剤、洗剤及び洗浄剤組成物に利用された
場合に、優れた洗浄性能又は改良された洗浄能力を獲得するのに有益である。発
明は更に好適な宿主細胞又は生物体に挿入された時に、前記酵素の発現に関する
コーディング遺伝子;及びそれにより形質転換された前記酵素変異体を発現でき
る宿主細胞;及び新規酵素を製造する方法に関する。
れら処方体中に用いられる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セル
ラーゼ、及びその他酵素ならびにそれらの混合体を含む。 天然に生ずる野生型のプロテアーゼを遺伝子工学による変異体タンパク質であ
るプロテアーゼ、例えばDURAZYM(Novo Nordisk A/S), RELASE(Novo Nordisk A
/S), MAXAPEM(Gist-Brocades, N.V.),PURAFECT(Genencor International, Inc.,
)の商業利用が増加している。
5(HENKEL);WO87/04461(AMGEN);WO87/05050(ENEX);EP210105(GENENCOR)
;Thomas, Russell及びPerht(1985)Nature 318 375-376; Thomas, Rusell及びFe
rshet(1987)J.Mol.Biol. 193 83-813; Russel及びPersht Nature 328 4
96-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033(Amgen); WO 95/27049(SOLA
Y S.A.); WO 95/30011(PROCTER &GAMBLE COMPANY); WO 95/30010(PROCTER & GAM
BLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5,543,302(SOLVA
Y S.A.); EP 251 446(GENENCOR); WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S); WO 91/0034
5 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 A1(SOLVY); 及びWO 94/02618(GIST-BROCADE
S N.V.)の様な各種プロテアーゼ変異体が当分野で報告されている。
に関して新しい改良型プロテアーゼまたはプロテアーゼ変異体に対する需要はま
だある。 従って、本発明の目的は、特に洗剤産業での利用に適した改良されたプロテア
ーゼ又はタンパク質工学で作られたプロテアーゼ変異体を提供することである。
ブチリシンが、洗剤構成物中に改良された洗浄性能特性を有することを見いだし
た。その特定は、サブチリシン変異体、特に親の野生型酵素に比べ改良された洗
剤組成物の洗浄性能特性を持つサブチリシン309(GLSAVI又はSavinase)を構築
することで成された。このことは、前の出願DK1332/97に記述されている。
00と101の間)に少なくとも1個の追加のアミノ酸残基を持つI-S1(真の“サブ
チリシン”)及びI-S2(高アルカリサブチリシン)のサブグループが、現在既知
のもの及び前記出願に記載されたものに比べて驚くべき改良された洗浄性能を示
すことを見いだした。
ーゼ中の位置100と101(活性部位及び位置番号の定義については以下参照)の間
の活性部位ループ(b)内に少なくとも更に1個のアミノ酸残基を導入(挿入)す
ることで得ることができる。 この発見は、サブチリシン309についてなされたものであるが、同様に有益な
サブチラーゼまたはサブチラーゼ変異体の製造又は単離が可能であると推測され
る。
の間に1つの挿入アミノ酸残基を持ち、そしてサブチリシン309の様な既知の近
縁サブチリシンに比べ洗浄中に於いて優れた洗浄性能を示すと考えられる、サブ
チリシン309の様な既知野生型サブチラーゼ中の該当活性部位ループに比べて長
い活性部位ループ(b)を含む新規野生型サブチラーゼを特定することができるだ
ろう。
ASBPN)(a)及びサブチリシン309(BLSAVI)(b)間のアラインメント、サブチリシ
ンBPN’(a)(BASBPN)とサブチリシンCarlsberg(g)(BLSCAR)とのアラインメントを
示す、以下図1、1a、2及び2aが参照される。図1及び2では、アラインメント
は下記に示す如くGCGパッケージのGAPルーチンを利用することで確立されている
が、一方図1a及び2aはWO91/00345に示したものに同一である。本出願では、これ
らアラインメントは残基の番号付けの基準として利用されている。
む)は以下に示す断片中のアミノ酸残基を包含するものとして定義される: (a) アミン酸残基33と43の間の領域; (b) アミン酸残基95と103の間の領域; (c) アミン酸残基125と132の間の領域; (d) アミン酸残基153と173の間の領域; (e) アミン酸残基181と195の間の領域; (f) アミン酸残基202と204の間の領域; (g) アミン酸残基218と219の間の領域。
置100に少なくとも1個の追加アミノ酸残基をもち、それにより前記追加アミノ
酸が位置100と101の間の少なくとも1個のアミノ酸残基の挿入に想定するI-S1及
びI-S2サブグループのサブチラーゼ酵素を単離すること(即ち純度10%以上で)
である。 本発明の第2の観点は、本発明のサブチラーゼ変異体をコードする単離された
DNA配列に関する。 本発明の第3の観点は、発明のサブチラーゼ変異体をコードする単離されたDN
A配列を含む発現ベクターに関する。 本発明の第4の観点は、第3の観点による発現ベクターにより形質転換された
微生物宿主細胞に関する。
物株の培養;又は本発明の第4の観点による発現ベクターを好適な微生物宿主に
挿入し、この宿主細胞を培養し所望のサブチラーゼ酵素を発現させ、そして酵素
産物を回収することにより製造することができる。 さらに本発明は、本発明のサブチラーゼ又はサブチラーゼ変異体を含む組成物
に関する。 さらに本発明は、多くの産業上の関連利用、特に洗浄組成物及び変異体酵素を
含む洗浄組成物、特には変異体サブチリシン酵素を含む洗浄組成物に関する、本
発明の酵素の利用に関する。
の利便性より以下の命名及び慣用名が適用されている: 引用のフレームは、まずサブチリシンBPN’(BASBPN)と、単離された又は親の
野生型酵素とを並列させることで規定される。 アラインメントは、以下のパラメータを利用した、多くの変異体に対するGCG
パッケージバージョン9.1のGAPルーチンにより得ることができる:ギャップ・ク
リエーション・ペナルティー=8及びギャップ・エクステンション・ペナルティ
ー=8、及びその他パラメータはデフォルト値。
アラインメントを利用することである。多くの場合、その差はそれほど重要では
ない。 この様なサブチリシンBPN’(BASBPN)やサブチリシン309(BLSAVI)及びサブ
チリシンCarlsberg(BLSCAR)間のアラインメントは、それぞれ図1、1a、2及
び2aに例示されている。この様に欠失及び挿入の番号はBASBPNに関連して規定さ
れるだろう。
2及び164の位置に欠失を有しているが、一方図1aではサブチリシン309はBASBPN
と比較した場合では位置36、56、159、164、165の位置に同一の欠失を有してい
る。図2では、サブチリシンCarlsbergはBASBPNに比べ位置58に1個の欠失を持
っているが、図2aではサブチリシンCarlsbergはBASBPNに比較し、位置56に1個
の欠失を有している。これら欠失は図1、1a、2及び2aでは星印(*)で示され
ている。
: 元のアミノ酸 位置 置換アミノ酸 すなわちG915Eという表記は位置195にあるグリシンがグルタミン酸により置換
されていることを意味する。 元のアミノ酸残基がいずれかのアミノ酸残基により置換された場合には、位置
と置換アミノ酸を示す省略表現が利用されるだろう。 位置 置換アミノ酸 この表記は特に相同的サブチラーゼ(下記参照)中の変更との関連で有用であ
る。
位置のみ、例えば170が示される。 元のアミノ酸及び/又は置換アミノ酸が1以上のアミノ酸を含むが、全てのア
ミノ酸を含まない場合には、選択されたアミノ酸をブレース{}内に示す。 元のアミノ酸 位置{置換アミノ酸1,・・・、置換アミノ酸n} 特定の変異体に関しては、いずれかのアミノ酸残基を示すコードXaa及びXを含
む特別な3又は4文字コードが利用される。
表される; Gly195Xaa 又は G195X あるいは Gly195 又は G195 位置170にあるいずれかのアミノ酸残基がセリンに置換する場合には以下の様
に表されるだろう; Xaa170Ser 又は X170S あるいは 170Ser 又は170S
連する場合に特に有効である。従って170Serは、例えばBASBPN中のLys170Ser変
更及びBLASAVI中のArg170Ser変更の両方を含んでいる(図1参照)。 元のアミノ酸及び/又は置換アミノ酸が1より多いが全てではないアミノ酸を
含む場合には、位置170のアルギニンに関するグリシン、アラニン、セリン又は
スレオニンの置換は次により表され、 Arg170{Gly、Ala、Ser、Thr} 又はR170{G、A、S、T} 以下の変異体を指示する。 R170G、R170A、R170S及びR170T。
多くのアミノ酸残基の欠失は次のように表される: Gly195*+Leu196* 又は G195*+L195*
が挿入される場合は以下の様に表される。 Gly195GlyLysAlaSer 又はG195GKAS この様な場合、挿入されたアミノ酸残基は挿入されたアミノ酸残基の前のアミ
ノ酸残基位置番号に小文字を加えて番号付けを行う。上記の例では、配列194か
ら196は次のようになる:
こることは明瞭である。例えば上記の例でグリシンの後にグリシンが挿入された
場合はG195GGにより表されるだろう。
挿入に対応した表示は相当する縮重指示を含むことを意味している。
在する場合、この様な位置の挿入は次の様に表される: 位置36中のアスパラギン酸の挿入について *36Asp 又は *36D。
びグルタミン酸に置換していることを表す。 あるいは、例えばTyr167{Gly、Ala、Ser、Thr}+Arg170{Gly、Ala,Ser,Thr
}は次の変異体を表す:
的な共通特性を持つアミノ酸残基の置換、交換、挿入又は欠失を目的とする変更
、あるいは小型アミノ酸が別の小型アミノ酸に置換されたことを表すTyr167{Gl
y、Ala、Ser、Thr}+Arg170{Gly、Ala、Ser、Thr}の保存的アミノ酸変更に有
用である。更に詳しくは“発明の詳細な説明”を参照せよ。
ペプチダーゼ(Walsh、1979、酵素反応メカニズム(Enzymatic Reaction Mechanis
ms.)W.H.Freeman and Company、San Francisco、3章)。アミノ酸位置/残基の番号付け 特別に記載が無い限り、ここに使用するアミノ酸番号付けは、サブチラーゼBP
N‘(BASBPN)配列のそれに対応する。BPN’配列に関するより詳細は図1及び2、
又はSiezenら、Protein Engng.4(1991)719-737。
部位のセリン残基が必須である(White、Handler及びSmith、1973“生化学の原理
(Principles of Biochemistry、”第5版、McGraw-Hill Book Company、NY、pp.
271-272)。
ある。それらはジイソプロピルフルオロリン酸により阻害される。これらは単純
末端エステルを加水分解し、同様のセリンプロテアーゼである真核生物のキモト
リプシンに似た活性を持つ。より狭義な意味では、サブグループをカバーするア
ルカリプロテアーゼは、高い最適pH、pH9.0ないし11.0を持つセリンプロテアー
ゼの幾つかを指す(レビューとしては、Priest(1977)Bacteriological Rev.41 7
11-753を参照)。
、Protein Engng.4(1991)719-737及びSiezenら、Protein Science 6(1997)501-5
23により提案されたものである。それらは従来サブチリシン様プロテアーゼと称
されるセリンプロテアーゼの170アミノ酸配列以上の相同性分析により定義され
る。これまでサブチリシンは、Siezenらにより現在サブチラーゼのサブグループ
として規定されているグラム陽性細菌又は真菌により産生されるセリンプロテア
ーゼと規定されることが多かった。非常に多様なサブチラーゼが同定されており
、多くのサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。これらサブチラーゼの
より詳細な記述、及びそれらのアミノ酸配列の参照はSiezenら(1997)により成さ
れている。
リシン168(BSS168)、サブチリシンBPN’、サブチリシンCarlsberg(ALCALASE、NO
VO NORDISK A/S)及びサブチリシンDY(BSSDY)の様な“古典的”サブチリシンを含
む。 サブチリシンの別のサブグループI−S2又は高アルカリサブチリシンは、S
iezenら(上記)により認められた。サブグループI−S2プロテアーゼは
、高アルカリサブチリシンと記述され、サブチリシンBP92(BAALKP)(MAXACLA、Gi
st-Brocades NV)、サブチリシン309(SAVINASE、NOVO NORDISK A/S)、サブチリシ
ン147(BLS147)(ESPERASE、NOVO NORDISK A/S)及びアルカリエステラーゼYaB(BSE
YAB)の様な酵素を含む。
ペプチダーゼ(Mesentericopeptidase))、 サブチリシンBPN’、BASBPN、 サブチリシンDY、BSSDY、 サブチリシンCarlsberg、BLSCAR(BLKERA(ケラチナーゼ)、BLSCA1、BLSCA2、BLS
CA3)、 BSSPRC、セリンプロテアーゼC BSSPRD、セリンプロテアーゼD
1)、 サブチリシン309、Savinase(商標)、BLS309/BLSAVI(BSKSMK(M-プロテアーゼ)
、BAALKP(サブチリシン PB92、Bacillus好アルカロ性アルカリプロテアーゼ)
、BLSUBL(サブチリシン BL)、 アルカリエラスターゼ YaB、SYSYAB。
由来のサブチラーゼ309であり、BAALKPと1位置(N87S、本件図1を参照)のみ異
なっている。サビナーゼ(商標)”は図1内にb)と印されたアミノ酸配列を有
する。
ーゼを表す。より詳細については、上記“サブチラーゼ”の記述を参照のこと。
親サブチラーゼは天然源から分離されるサブチラーゼでもあり、これはサブチラ
ーゼの特性を保持しつつその後変更が行われた。あるいは用語“親サブチラーゼ
”は用語“野生型サブチラーゼ”である。
及びサブチラーゼをコードするDNAの遺伝的修飾を含むものとして定義される。
修飾は、アミノ酸側鎖の置換、問題のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入であ
る。サブチラーゼ変異体 本発明の観点では、用語サブチラーゼ変異体(variant)又は変異型(mutated
)サブチラーゼは、元のあるいは親の遺伝子を持ち、対応する親酵素を産生する
親微生物にあって、好適宿主細胞内にて発現した場合に前記変異体サブチラーゼ
プロテアーゼが生産される様に親遺伝子が変異された遺伝子により産生されるサ
ブチラーゼを意味する。
は、発明のサブチラーゼ変異体を得るための本書の修飾に適したカ所として認識
される。 しかし、発明はこの具体的なサブチラーゼの修飾に限定されるものではなく、
SAVINASE(商標)の一次構造に相同な一次構造を持つ別の親(野生型)サブチラ
ーゼにも拡大される。2アミノ酸配列間の相同性は、本観点においてはパラメー
ター“同一性”により記述される。
ッケージバージョン9.1のGAPルーチンが利用できる(上記)。このルーチンから
の出力は、アミノ酸アラインメント及び2配列間の“%同一性”の計算である。 この記述に基づけば、当業者にとって発明により修飾することができる、好適
な相同的サブチラーゼ及び対応する相同的な活性部位ループを同定することは日
常の作業である。
然基質の分解を触媒する酵素の能力は、しばしばそれが持つ洗浄能力、洗濯能力
、界面活性能、又は洗浄性能として参照される。本明細書では、洗浄性能という
用語はこの特性を包含するのに利用いられるだろう。
現より取り出されたDNA配列を意味しており、従って多の外来性又は不要なコー
ド配列を含んでおらず、遺伝子工学により蛋白質産生システムでの利用に好適な
形状にある。この様な単離された分子は、その天然環境から単離されたものであ
り、cDNA及びゲノムクローンを含む。本発明の分離DNA分子は元来不随している
その他遺伝子を持たないが、プロモーター及びターミネーターの様な天然に生ず
る5’及び3’非翻訳領域は含むだろう。付随領域の特定は、当分野通常の熟練者
にとっては明らかであろう(例えばDynanとTijan、Natrure 316:774-78, 1985参
照)。“単離されたDNA配列”はあるいは“クローン化DNA配列”とも呼ばれる。
の環境から取り出されていることを示す。 好適形態では、単離された蛋白質は実質その他蛋白質、特にその他相同的蛋白
質(即ち“相同的不純物”(以下参照))を含まない。
、好ましくは20%より高く純粋であり、更に好ましくは30%より高く純粋である
。 更に、蛋白質はより精製された形状、SDS-PAGEで決定した時に、即ち40%より高
く純粋であり、60%より高く純粋であり、80%より高く純粋である、より好まし
くは95より高く純粋である、より更に好ましくは99%より高く純粋である形状で
提供されることが好ましい。 用語“単離された蛋白質”は又は“精製された蛋白質”とも呼ばれるだろう。
チド以外のポリペプチド)は、本発明のポリペプチドを本来得る相同的細胞に由
来する不純物を意味する。
される場合には、特定の源、又はその源が挿入された遺伝子を持つ細胞により生
成されるポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドを意味する。
アーゼによる加水分解に感受性であるペプチド結合を少なくとも1個含んでいる
化合物を含むものとして、広義な形状に解釈すべきである。産物 プロテアーゼの酵素反応に由来する産物と関連し用いられる用語“産物”は、
本発明の文脈に於いて、サブチラーゼプロテアーゼが関与する加水分解反応の産
物を含むと解釈すべきである。産物は、その後の加水分解反応の基質になるだろ
う。
ループ(b)領域内の位置100に少なくとも1個の追加のアミノ酸残基を有し、それ
により該追加アミノ酸残基が位置100と101間の少なくとも1個のアミノ酸残基の
挿入に対応している単離された(即ち10%より高く純粋である)I-S1及びI-S2サ
ブグループのサブチラーゼ酵素に関する。
ープ(b)を含み、且つ親又は既知野生型サブチラーゼと比較した場合に位置100と
101の間に追加アミノ酸残基が挿入されているか、又は挿入されていると考える
ことができることを特徴とする。 本発明の第1の観点のサブチラーゼは、天然から単離されそして同定された親
又は野生型サブチラーゼであろう。 この様な親野生型サブチラーゼは、当分野で既知の標準的技術により特異的に
スクリーニングされるだろう。
由来のサブチラーゼ中に活性部位ループをコードしていることが既知であるDNA
領域を特異的にPCR増幅するものであろう。 サブチラーゼはそのDNA及びアミノ酸配列が相同であるという意味で保存的な
酵素の1グループである。従って、活性部位ループを挟む、比較的特異的なプラ
イマーを構築することができる。
である(例えばSiezenら、Protein Science 6 (1997) 501-523参照)。BLSAVIの
様なI-S1又はI-S2グループの何れかのグループ中のアミノ酸残基95ないし103間
にある活性部位ループ(b)に相当する活性部位ループを挟むPCRプライマーを構築
することは、当業者にとっては通常であるこの作業に由来する。
ライマーを用い、該増幅PCR断片のDNA配列を決定すれば、例えば位置95ないし10
3の活性部位ループ域に対応し、且つ位置100及び101の間に挿入が存在すると考
えられる、BLSAVIに比べ長い活性部位域を含むこれらグループのサブチラーゼを
産生する株を特定することができる。目的のこの様なサブチラーゼの株及び部分
DNA配列を同定すれば、発明のこの様なサブチラーゼを完全クローニングし、発
現させ、精製することは当業者にとって通常の作業である。
想される。 従って実施態様の一つでは、本発明は本発明の第1観点による単離されたサブ
チラーゼ酵素に関し、前記サブチラーゼ酵素はアミノ酸残基100と101の間に少な
くとも1アミノ酸残基の挿入を有することで、その親酵素に比べ長い活性部位ル
ープ(b)を持つ様に構築された変異体である。 発明のサブチラーゼは洗剤中にて優れた洗浄性を発揮し、そして酵素が構築さ
れた変異体である場合には、サブチリシン309の様なその近縁のサブチラーゼに
比較して、洗剤中の洗浄性能は改善されている。
示すだろう。発明のサブチラーゼは、各種洗剤組成物の大部分に於いてその近縁
体に比べ、改良された洗浄性能を有している。 好ましくは、発明のサブチラーゼ酵素は本明細書実施例3(下記)に示す洗剤
組成物中にて近縁体に比べ優れた洗浄性能を持つ。
ゼ配列又は部位特異的変異導入法以外の方法で作成されたサブチラーゼ変異体配
列であるか否かに関わらず)が発明の範囲内であるかは、以下の工程を利用し決
定される: i)該サブチラーゼ配列をサブチリシンBPN’(本明細書“定義”の章を参照
(上記))のアミノ差配列と並置し; ii)上記工程i)で実施されたアラインメントに基づき、該サブチラーゼ配列
中にある95ないし103のアミノ酸残基間の領域を含む(端のアミノ酸を含む)サ
ブチリシンBPN’の活性部位ループ(b)に相当する活性部位ループ(b)を特定し; iii)もし工程ii)にて特定された該サブチラーゼ配列中にある活性部位ループ(
b)がBLSAVI中にある対応する活性部位ループより長く、そして該延長が位置100
及び101間への少なくとも1アミノ酸残基の挿入によるものであるかを決定する
。
である。 上記の工程i)にて実施されたアラインメントは、GAPルーチンを利用して前
記同様に実施される。 本明細書の記述に基づき、サブチラーゼ中の活性部位ループ(b)を特定し、問
題のサブチリシンが発明の範囲内にあるか決定することは当業者にとって通常の
ことである。
異体が本発明の範囲内であることは事前に明白である。 本発明のサブチラーゼ変異体は、部位特異的/ランダム変異導入法又は異なる
サブチラーゼ配列のDNAシャッフリングによる様な、当分野既知の標準的技術に
より構築されるだろう。詳細は“好適変異体の製造”の章及び本書材料と方法(
下記)を参照のこと。
る、発明の単離されたサブチラーゼ酵素; 2.該少なくとも1個の挿入アミノ酸残基がD、E、H、K、及びR、より好まし
くはD、E、K及びRを含む荷電アミノ酸残基の群から選択される、発明の単離され
たサブチラーゼ酵素;
、S及びTを含む親水性アミノ酸残基の群から選択される、発明の単離されたサ
ブチラーゼ酵素; 4.該少なくとも1個の挿入アミノ酸が、A、G及びV含む小型の疎水性アミノ
酸残基の群から選択される、発明の単離されたサブチラーゼ酵素;又は 5.該少なくとも1個の挿入アミノ酸が、F、I、L、M、P、W及びY、好ましく
はF、I、L、M及びYを含む大型の親水性アミノ酸残基の群から選択される、発明
の単離されたサブチラーゼ酵素に関する。
る活性部位ループに比べ少なくとも2アミノ酸を含んでいる、本発明の単離され
たサブチラーゼに関する。 別の実施態様では、本発明は以下の修飾: X100X[T、G、A、S] X100X[D、E、K、R] X100X[H、V、C、N、Q] X100X[F、I、L、M、P、W、Y] を含む群から選択される少なくとも1個の挿入を含む単離されたサブチラーゼ
酵素に関する(BASBPN番号付け)。
シンに対してより特異的であり、 G100GA、G100GT、G100GG、G100GS、G100GD、G100GE、G100GK、G100GR、G100GH、
G100GV、G100GC、G100GN、G100GQ、G100GF、G100GI、G100GL、G100GM、G100GP、
G100GW、及びG100GY、である。 又は以下の組合せのいずれかである: A98G+G100GA+S101A+S103T S99G+G100GGT+S101T。
性に極微小な変化のみ生ずることが期待されることは当分野でよく知られている
。 下表8は、保存的アミノ酸置換のグループを掲載する。
むサブチリシン変異体は、相互に大きく異ならない特性を示すことが期待される
。 ここに開示されそして/又は例示されているサブチリシンに基づけば、当業者
は当分野通常同様に改良された洗浄性能を示すその他サブチリシン変異体を獲得
することを目的として、これら変異体にとって好適である保存的修飾を通常に同
定する。
の多様態からの分離、及び親サブチラーゼからの変異体の設計及び産生に関して
、サブグループI-S1及びIS-2、特にサブグループIS-2に属する。 サブグループI-S1の変異体に関しては、BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BL
SAVI(BSKSMK、BAALKP、BLSUBL)、BYSYAB及びBSAPRS、又はサブグループI-S2の特
性を保持するその機能的変異体を含むグループより親サブチラーゼを選択するこ
とが好ましい。 具体的には、該親サブチラーゼはBLSAVI(SAVINASE(商標)NOVO NORDISK A/S)
であり、従って発明の好適サブチラーゼ変異体はSAVINASE(商標)の変異体であ
る。
ブチラーゼも含む。酵素に改良された特性を紆余することに関し当分野既知であ
るその他修飾との組合せが考えられる。当分野では各種改良された特性を持つ多
くのサブチラーゼ変異体が報告されており、それらの幾つかは本書“発明の背景
”の小児記載されている(上記参照)。これら参考資料は、ここでは発明のサブ
チラーゼ変異体と有益に組み合わせることができるサブチラーゼ変異体を特定す
るための参照物として開示されている。
(熱安定性を改良する)、酵素を安定化するCa−結合部位、例えば位置76の置
換、及びその他多くが当分野に於いて明あらかである。 別の実施態様では、発明のサブチラーゼ変異体は以下の何れかの位置の1又は
それ以上の修飾と有利に組み合わされるだろう: 27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224
、235及び274。 具体的には、以下のBLSAVI、BLSUBL、BSKSMK及びBAALKP変異体は組合せに適当
と考えられる:K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S010G、S103A、V104A、V
104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A
、T224S、K235L及びT274A。
+V104I又はN76D+V104A、あるいは上記修飾の1またはそれ以上とのこれら変異
体のその他組合せ(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)
のいずれかを含む別の変異体は改良された特性を示す。
133及び194、好ましくは129K、131H、133P、133D及び194Pの修飾、最も好ましく
はP129K、P131H、A133P、A133D及びA194Pの修飾の何れかの修飾の1又は複数と
好ましく組合わさる。これら修飾はその製造に於いて、発明のサブチラーゼ変異
体のより高い発現レベルを提供することが期待される。 従って、発明の更に別の実施態様は、前記修飾が以下を含むグループから選択
される、発明による変異体に関する。
チラーゼ遺伝子)に挿入体を導入するための方法は当分野既知であり、“発明の
背景”の章に引用された参考資料を参照のこと。
又は部位特異的)に適した標準的手段は、発明のサブチラーゼ変異体をえるのに
利用できるだろう。好適技術の更に詳細な記述に関しては、ここの実施例(以下
参照)及び(Sambrookら、(1989)Molecular cloning: A laboratory manual, Co
ld Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M.ら、(編集
)“Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995;
Harwood, C.R.,及びcutting, S.M.(編集)”Molecular Biological Methods fo
r Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990); 及びWO96/34946を参照のこと。
フリング(WO95/22625;Stemmer WPC, Nature 370:389-91(1994))の様な多様性
を人工的に作るための標準的技術により構築されるだろう。天然に同定された1
又はそれ以上の部分的サブチラーゼ配列により、例えばSavinase(商標)をコー
ドしている遺伝子をDNAシャッフリングしてSavinase(商標)の活性部位(b)ルー
プよりも長い活性部位(b)ループ域を含む様にし、続いて改良された洗浄性能に
ついてスクリーニングを行い、発明によるサブチラーゼ変異体を提供する。
NA操作に簡便に供することができる何れかのベクターであろう。 ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多いだろう。
従って、ベクターは自己増殖型ベクター、即ち染色体外成分として存在するベク
ターであり、その複製は例えばプラスミドの様に染色体の複製から独立している
。あるいは、ベクターは宿主細胞内への導入に際してそれが宿主細胞ゲノム内に
その一部又はその全てが組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製さ
れるベクターである。
断片と作動可能に連結されている発現ベクターであることが好ましい。一般に、
発現ベクターはプラスミド又はウイルスDNAに由来しており、その両方を含むだ
ろう。用語“作動可能に連結して”とは、断片がその意図する目的、例えばプロ
モーター中での転写開始及び酵素をコードしているDNA配列中の進行に関し、協
調して機能する様に配置されていることを意味する。 プロモーターは選択された宿主細胞内にて転写活性を示す何れかのDNA配列で
あり、宿主細胞に相同な、又は非相同的である蛋白質をコードする遺伝子に由来
するだろう。
テアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミ
ラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)アルファ
アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliqu
efaciens)アルファアミラーゼ遺伝子、バチルス・ズブチリス(Bacillus subti
lis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス(Bacillus pumilu
s)キシロシダーゼ遺伝子、又はラムダファージのPR又はPLプロモーター、あ
るいはE.coliのlac、trp又はtacプロモーターが含まれる。 発明の酵素をコードしているDNA配列はまた、必要に応じて好適なターミネー
ターに作動可能に接続されるだろう。
とができるDNA配列を含むだろう。 ベクターは更に選択マーカー、例えば宿主細胞の欠損を補う産物の遺伝子、又
は耐性、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テト
ラサイクリン、スペクチノマイシン頭の構成物質に対する耐性、又は重金属ある
いは殺虫剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むだろう。
又はリーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる)が組換え体
ベクター内に提供されるだろう。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配
列と正確な読みとり枠内に結合されるだろう。分泌シグナル配列は通常は酵素を
コードするDNA配列に5’側に位置する。分泌シグナル配列は、一般には酵素に不
随する配列である、あるいは別の分泌蛋白質をコードする遺伝子に由来するもの
である。
び/又は分泌配列それぞれを連結するのに用いる方法、又は好適なPCR増幅によ
りこれら配列を組み立てるのに用いる方法は、及びそれらを複製又は組み込みに
必要な情報を含む好適ベクター内に挿入するのに用いる方法は、当業者に公知で
ある(例えばSambrookら、上記引用を参照)。
し相同又は非相同のいずれかであろう。宿主細胞に相同である場合、即ち転々に
宿主細胞により産生される場合、典型的には天然環境以外の別のプロモーター配
列と作動可能に接続されるか、可能であれば別の分泌シグナル配列及び/又はタ
ーミネーター配列と作動可能に連結される。“相同”という用語は、問題の宿主
生物が天然の酵素をコードするDNA配列を含むことを意味する。“非相同”とい
う用語は、天然には宿主細胞により発現されないDNAは配列を含むことを意味す
る。即ち、DNA配列は別の生物体に由来するか、又は合成配列によるものであろ
う。
生することができる細胞であり、細菌、酵母、真菌及びより植物を含む高度な真
核生物細胞を含むだろう。 培養により発明の酵素を産生できる細菌宿主細胞の例は、バチルス・ズブチリ
ス(B. subtilis), バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis), バチル
ス・レンタス(B. lentus), バチルス・ブレビス(B. brevis), バチルス・ス
テアロサーモフィルス(B. stearothermophilus), バチルス・アルカロフィル
ス(B. alkalophilus), バチルス・アミロリクエファシエンス(B. amylolique
faciens), バチルス・コアグランス(B. coagulans), バチルス・サークラン
ス(B. circulans), バチルス・ラウタス(B. lautus), バチルス・メガテリ
ウム(B. megatherium)又はバチルス・チュリンジエンシス(B. thuringiensis
)の様な枯草菌の株、又はストレプトマイセス・リビダンス(S. lividans)あ
るいはストレプトマイセス・ムリヌス(S. murinus)の様な放線菌の株の様なグ
ラム陰性細菌、又は大腸菌(Escherichia coli)の様なグラム陰性細菌である。
、又はコンペテント細胞を既知の方法により使用することで実施されるだろう(
例えばSambrookら、上記参照)。
型的には不溶性の顆粒として(封入体としても知られる)保持されるか、又は細
菌の分泌経路により細胞周辺腔内に分泌されるだろう。前者では、細胞は溶解さ
れ、顆粒が回収されて変性され、その後変性剤が希釈されて酵素は巻き戻される
だろう。後者の場合、酵素は細胞を破壊、例えば超音波処理又は浸透圧ショック
により破壊し、その内容物を細胞周辺腔に放出させて回収し、酵素が回収される
ことで細胞周辺腔から回収されるだろう。
は細胞質内に保持されるか、又は細菌の分泌経路を介し細胞外培地に放出される
だろう。後者の場合、酵素は培地より以下記述の様にして回収されるだろう。
が、酵素の製造を可能にする条件下に培養され、そして生じた酵素を培地から回
収する、発明による単離された酵素を製造する方法を提供する。 酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが非相同的宿主細胞内に形質転
換された場合、発明の酵素の非相同的組換え体産物が製造できる。 これにより、相同的不純物を含まないことを特徴とする、極めて精製度の高い
サブチラーゼ組成物を作ることができる。
とする不純物(例えば、発明の酵素以外のその他ポリペプチド)を意味する。 形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させる
のに好適ないずれかの通常培地であろう。発現されたサブチラーゼは好都合に培
養培地中に分泌され、そしてそこから遠心分離、濾過、硫安の様な塩を利用した
培地からの沈殿により培地から細胞を分離し、さらにイオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法を実施する
ことを含む既知方法により回収されるだろう。
利用できるだろう。 更に、発明は発明のサブチラーゼ変異体を含む酵素組成物に関する。 好ましい産業応用の概要、及びそれに対応する好ましい酵素組成物を以下記述
する。 この概要は、発明のサブチラーゼ変異体の好適応用を完全に一覧することを意
図するものではない。発明サブチラーゼ変異体は、プロテアーゼ、特にサブチラ
ーゼの利用を含む当分野既知の他産業応用に利用されるだろう。
サブチリシン酵素を含む組成物の利用を含む。この様な洗浄及び洗剤組成物は当
分野にて良く記述されており、好適洗浄及び洗剤組成物に関する詳細な記述に関
してはWO96/34946;WO97/07202;WO/95/30011が参照される。 更に、以下実施例は発明の多くのサブチラーゼ変異体に関する洗浄性能の改善
を示す。
添加織物柔軟組成物を含む、手又は機械による洗濯用洗剤組成物として配合され
、又は一般の家庭用硬質表面洗浄作業への利用に適した洗剤組成物として処方さ
れるが、又は手あるいは機械による皿洗い作業に適した形に配合されるだろう。
ならびに洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、口ナーゼ、アミラーゼ、アラ
ビナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナンアーゼ、ア
ラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ
、及び/又はペルオキシダーゼの様な酵素を1またはそれ以上含むだろう。 一般に、選択された酵素の特性は、選択した洗剤に適合しており(即ち至適pH
、他酵素又は非酵素性成分との適合性等)、酵素は有効量存在しなければならな
い。
物起源が好ましい。化学的に変更された、又は蛋白質工学による変異体も含まれ
る。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、又は金属プロテアーゼであり、好まし
くはアルカリ性の微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼである。
アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン、特に枯草菌由来のものであり、例え
ばサブチリシンNovo、サブチリシンCarlsberg、サブチリシン309、サブチリシン
147及びサブチリシン168(WO89/06279に記載)である。トリプシン様プロテアー
ゼの例は、トリプシン(例えばブタ又はウシ起源)及びWO89/06270及びWO94/255
83に記載のフサリウム(Fusarium)プロテアーゼ である。
4946に記載の変異体であり、特に以下の位置に1またはそれ以上の置換を持つ変
異体である:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、2
06、218、222、224、235及び274。 好ましい市販プロテアーゼ酵素には、Alcalase(商標)、Savinase(商標)、
Primase(商標)、Duralase(商標)、Esperase(商標)及びKannase(商標)(
Novo Nordisk A/S)、Maxatase(商標)、Maxacal(商標)、Maxapem(商標)、
Properase(商標)、Purafect(商標)、Purafect OxP(商標), FN2(商標)及
びFN3(商標)(Genencor International Inc.)がある。
は蛋白質工学による変異体が含まれる。有益なリパーゼの例には、フミコラ(Hu
micola)(サーモミセス(Thermomyces)と同意)、例えばEP 258 068及びEP 30
5 216記載のフミコラ・ラヌギノサ(H. lanuginosa)(サーモミセス・ラヌギノ
サ(T. lauginosus))又はWO96/13580記載のフミコラ・インソレンス(H.insole
ns)、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ、例えばシュードモナス・アル
カリゲネス(P. alcaligenes)又はシュードモナス・シュードアルカリゲネス(
P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272),
ツツエリ(P. stutzeri)(GB 1,372,034), シュードモナス・フルオレセンス(P
. fluorescens), シュードモナススペーシス(Pseudomonas sp.)SD 705株(WO
95/06720及びWO 96/27002), シュードモナス・ウイスコンシネンシス(P. Wisc
onsinensis)(WO 96/ 12012)由来のリパーゼ、バチルス属リパーゼ、例えばバチ
ルス・ズブチリス(B. subtilis)(Dartoisら、(1993)、Biochemica et Biophys
ica Acta, 1131, 253-360), バチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothe
rmophilus)(JP 64/744992)又はバチルス・プイルス(B. puilus)(WO 91/16422
)が含まれる。
35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615,
WO 97/04079及びWO 97/07202に記載の如くのリパーゼ変異体である。 好ましい市販リパーゼ酵素には、LipoLase(商標)及びLipolase Ultra(商標
)(Novo Nordisk A/S)が含まれる。
化学的に変更された、又は蛋白質工学による変異体が含まれる。有益なアミラー
ゼには、例えば枯草菌に由来する、例えばGB 1,296,839に詳細記載されているバ
チルス・リケニホルミス(B. licheniformis)の特別な株に由来するα−ミラー
ゼ変異体が含まれる。
97/43424に記載の変異体、特に以下の位置の1又はそれ以上に置換を持つ屁似た
いである:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197
、202、208、209、243、264、304、305、391、408及び444。 市販のアミラーゼはDuramyl(商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(商標)
及びBAN(商標)(Novo Nordisk A/S), Rapidase(商標)及びPurastar(商標)
(Genencor International Inc製.)
、又は蛋白質工学による変異体が含まれる。有益なセルラーゼには、例えば枯草
菌、シュードモナス、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、チエラ
ビラ(Thielavia)、アクレモニウム(Acremonium)属由来のサルラーゼ、例え
ば米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特許5,691,178号、米
国特許第5,776,757号及びWO 89/09259に開示されているフミコラ・インソレンス
(Humicola insolens), ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora ther
mophila), スザリウム・オキスホルム(Fusarium oxysporum)由来の真菌セル
ロースが含まれる。
ある。この様なセルラーゼの例は、EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262,
WO 96/29397, WO 98/08940に記載のセルラーゼである。その他の例は、WO 94/0
7998, EP 0 531 315, 米国特許第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特
許第5,763,254号、WO 95/24471, WO 98/12307及びPCR/DK98/00299に記載のセル
ラーゼ変異体である。 市販のセルラーゼにはCelluzyme(商標)及びGarexyme(商標)(Novo Nordisk
A/S), Clazinase(商標)及びPuradax HA(商標)(Genencor International In
c.,) KAC-500(B)(商標)(Kao Corporation)が含まれる。
細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学的に変更された、又は蛋白質工学によ
る変異体が含まれる。有益なペルオキシダーゼの例にはコプリヌス(Coprinus)
、例えばWO 93/24618, WO 95/10602及びWO 98/15257に記載の様なコプリヌス・
シネレウス(C.cinereus)由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体が含まれる
。 市販のペルオキシダーゼにはGuardzyme(商標)(Novo Nordisk A/S)が含まれ
る。
ら酵素を全て含む組合せ添加物を加えることで、洗剤組成物中に含められるだろ
う。発明の洗剤添加物、即ち個別添加物又は組合せ添加物は、例えば顆粒、液体
、スラリー等として調合できる。好適洗剤手化物調合体は顆粒であり、特に非粉
剤顆粒、液体、解くに安定した液体、又はスラリーである。
に製造され、そして随意当分野既知の方法によりコーティングされるだろう。ワ
ックスコーティング材料の例は、分子量1000ないし20000のポリ(エチレンオキ
サイド)製品(ポリエチレングリコール、PEG);16ないし50のエチレンオキサイ
ド単位を持つエトキシル化ノニルフェノール;アルコールが12ないし20個の炭素
原子を含み、そして15ないし80のエチレンオキサイド単位が存在しているエトキ
シルか脂肪アルコール;及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
流動床技術による応用に好適なフィルムコーティング材料はGB 1483591に示され
ている。液体酵素製剤は、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、
乳酸、又はホウ酸の様なポリオールの確立された方法による添加によって安定化
される。保護酵素は、EP 238,216に開示の方法により調整されるだろう。
様な通常の形状である。液体洗剤は水性であり、典型的には70%までの水と0〜3
0%の有機溶媒を含むか、あるいは非水性であろう。 洗剤組成物は、半極性を含む非イオン性、及び/又は陽イオン性及び/又は陰
イオン性、及び/又は両性イオン性である1又はそれ以上の界面活性剤を含む。
界面活性剤は典型的には重量の0.1%ないし60%のレベルで存在している。
ゼンスルホン酸エステル、アルファ−オレフィンスルホン酸エステル、アルキル
硫酸塩(脂肪アルコール硫酸塩)、アルコールエトキシ硫酸塩、2級アルカンス
ルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキ−又はアルケニル
コハク酸の様な陰イオン性界面活性剤、又は石鹸を含むだろう。
シレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキ
ルジメチルアミンオキサイド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪
酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサ
ミンのN−アシルN−アルキル誘導体(“グルカミド”)の様な非イオン性界面
活性剤を含むだろう。
、炭酸エステル、クエン酸エステル、ニトリロ3酢酸、エチレンジアミン4酢酸
、ジエチレントリアミン5酢酸、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性ケ
イ酸エステル、又は多層ケイ酸エステル(例えばHoechst社製SKS-6)の様な洗剤
結合剤又は錯化剤を0〜65%含むだろう。
ース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニル
アルコール)、ポリ(ビニルピリジン−N−オキサイド)、ポリ(ビニルイミダ
ゾール)、ポリアクリル酸エステルの様なポリカルボン酸エステル、マレイン酸
/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリル酸エステル/アクリル酸コポリ
マー。 洗剤は、過ホウ酸塩又は過炭酸塩の様なH2O2源を含み、テトラアセチレンジア
ミン又は野ナノイルオキシベンゼンスルホン酸エステルの様な過酸形成漂白活性
化剤と組合せた漂白システムを含むだろう。あるいは、漂白システムは例えばア
ミド、イミド、又はスルホン型のペルオキソ酸を含むだろう。
グリセロールの様なポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は芳香
性ホウ酸エステルの様なホウ酸誘導体、あるいは4-フォルミルフェニルホウ素酸
の様なフェニルホウ素酸誘導体により安定化され、そして組成物は例えばWO 92/
19709及びWO 92/19708に記載の如くに処方されるだろう。 洗剤は更にその他通常の洗剤成分、例えばクレー、発泡ブースター、石鹸水抑
制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ付着防止剤、色素、殺菌剤、光学的光沢剤
、ヒドロトロープ、曇り防止剤又は芳香剤も含むだろう。
として0.01〜100mg/1L洗浄液、好ましくは0.05〜5mg酵素蛋白質/1L洗浄液、特
には0.1〜1mg酵素蛋白量/1L洗浄に相当する量加えられると予想される。 発明の酵素は更に、参照されここに取り込まれているWO 97/07202に開示の洗
剤処方中に取り込まれるだろう。
素組成物中に好ましく利用される。 好適なその他プロテアーゼのより詳細な説明については、洗剤組成物(上記)
への利用に関する好適酵素に関連する章を参照のこと。
れだろう。 前記応用では、発明のサブチラーゼ変異体は、更に別のプロテアーゼを含む酵
素組成物中に好ましく利用される。 好適なその他プロテアーゼのより詳細な説明については、洗剤組成物(上記)
への利用に関する好適酵素に関連する章を参照のこと。 発明は以下の実施例中により詳細に記載されるが、これらはクレームされる発
明の範囲を限定することを意図していない。
lentus)の特異的株であり、NCIBに寄託され、受付番号NCIB10309及び10147が
付与され、且つここに参照され取り込まれている米国特許第3,723,250号に記載
されている。 E.coliMC1000(M.J.CasadabanとS.M.Cohen(1980);J.Mol.Biol.138 179-207
)は、通常の方法によりr-、m+とされており、同時に米国特許出願連続番号03
9,298に記載されている。
トルベクター。(Jacob Schiodtら、Protein and Peptide Letters 3:39-44(199
6)内に記載)。 pSX222:B.subtilis発現ベクター(WO96/34946に記載)。
された(Sambrookら、(1989)Molecular cloning: A laboratory manual, Cold S
pring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M.ら、(編集)“C
urrent protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harw
ood, C. R.,とCutting, S.M.(編集) ”Molecular Biological Methods for Baci
llus”. John Wiley and Sons, 1990)。 DNA操作に関する酵素は、供給元の仕様書に従い利用した。
England Biolabs, Incより得た。
)にて表現されている。この活性は酵素標準(SAVINASER)に対し決定されるも
のであり、その値は標準的条件、即ち50℃,pH、反応時間8.3分、測定時間3分で
の蛋白質分解性酵素によるジメチルカゼイン(DMC)溶液の分解に基づく。関連資
料ホルダーはNovo Nordisk A/S, Denmarkに請求することにより入手可能であり
、前記ホルダーは参照されここに引用されている。
下にN-アセチルカゼインを基質とした場合の、1モルのグリシンに等しい量のNH 2 -基の量を生じる蛋白質分解性酵素の活性として規定される。 酵素活性は、更にJounral of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M
.,Goodlander, B.D., Garrison, P.H.,及びSmith, L.A.,(1988)に記載の可溶性
基質スクシニル−アラニン−アラニンープロリン−アラニン−パラ−ニトロ−フ
ェノールとの反応に基づくPNAアッセイによっても測定できる。
、30℃にて、100mlのBPX培地を含む500mlのバッフル型エーレンマイヤーフラス
コ中にて、5日間行われた。 従って、例えば2リットルのブロスを作るには、20本のエーレンマイヤー フラスコを同時に発酵させた。
滅菌された。滅菌後、培地のpHはNaHCO3が.1Mになるよう加えられ9に調製
された。
サブチラーゼ309部位特異的変異体は、所望挿入を含むオリゴのPCRにより作られ
たDNA断片の通常のクローニングによって作製された(Sambrookら、Molecular C
loning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor, 1989)(以下参照
)。 鋳型のプラスミドDNAはpJS3、又はサブチラーゼ309の変異体を含むその類似体
である。
され(X=位置100と101間にいずれかのアミノ酸残基が挿入)、その結果G100GX
サブチラーゼ309変異体が生じた。 サブチラーゼ309変異体はE.coli内に形質転換された。これら形質転換体を一
晩培養したものから精製されたDNAを制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA断片の精
製、連結及びバチルス・ズブチリス(B.subtilis)の形質転換により、バチルス
・ズブチリス(B.subtilis)内に形質転換された。 バチルス・ズブチリス(B.subtilis)の形質転換は、Dubnauら、1971, J. Mol
.Biol.56. pp.209-221記載の如くに実施された。
: 挿入部位に隣接するDNA配列に対応し、挿入を規定するDNA塩基対分離れた変異
プライマー(オリゴヌクレオチド)を合成した。 次に、得られた変異導入プライマーを好適な相方プライマーと共にPCR反応内
に用いた。生じたPCR断片を精製し、第2PCR-反応にてこれを延長し、次にエン
ドヌクレアーゼにて消化し、E.coli−B.subtilisシャトルベクター内にクローニ
ングした(以下参照)。
適な第2の相方プライマーと共に用い、シャトルベクター内に変異導入域を消化
、クローニングした。PCR反応は通常の条件下に実施される。 この方策に従い、部位100と101間の活性部位ループ域内に挿入が導入されてい
る局所のランダムライブラリーをSAVINASEについて構築した。
個のアミノ酸が示された(A、T、C及びGのN=25%;一方S=50%C及びG。重複配列
と以下のプライマーによるPCR-増幅により生じたPCR断片との組合せによって更
にPCRを行い、上記で得たPCR断片をSavinaseのN-末端側に延長した;5’ CTA AA
T ATT CGT GGTGGC GC 3’(センス)及び5’ GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC
3’(アンチセンス)。延長されたDNA断片を修飾型プラスミドpJS3のHindIII-及
びNluI-部位にクローニングし(上記参照)、10個の無作為に選別したE.coliコ
ロニーを配列決定し、計画された変異を確認した。
GTC AGC TCG ATT 3’(センス))をpJS3のMluI部位の下流にある、好適なアン
チセンス相方プライマー(例えば5’-CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3’(アン
チセンス))と共に、pJS3を鋳型とするPCR反応に用いた。その結果得られたPCR
産物を、制限酵素HindIII及びMulIを用いてpJS3シャトルベクター内にクローニ
ングした。 ランダムライブラリーはよく知られる技術によりE.coli内に形質転換された。 調製されたライブラリーは約100,000個のクローン/ライブラリーを含んだ。
。 発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、発明の変異体を含むB.subtilis
pJS3発現プラスミドをコンペテントB.subtilis株内に形質転換し、上記の如く1
0μg/mlのクロラムフェニコール(CAM)を含む培地中で発酵させた。
スケールの発酵の精製に関する。 約1.6リットルの発酵ブロスを1リットルのビーカーに入れ、5000rpmで35
分間遠心分離した。上清を10%酢酸を用いてpH6.5に調製し、Seitz Supra S100フ
ィルタープレートを使い濾過した。
い約400mlに濃縮した。UF濃縮液を遠心分離し、濾過してから室温にてBactitrac
inアフィニティーカラムにpH7にて吸着させた。プロテアーゼをBacitracinカラ
ムより、室温にて25%の2-プロパノールと1Mの塩化ナトリウムを含むpH7に調製さ
れた0.01ジメチルグルタール酸、0.1Mホウ酸及び0.002Mの塩化カルシウムの溶液
を用いて溶出した。
ジメチルグルタール酸、0.2Mホウ酸及び0.002m塩化カルシウムを含むpH6.5に調
製された緩衝液で平衡化された750mlのSephadexG25カラム(直径5cm)にかけた。 SephadexG25カラムからの蛋白質分解活性を持つ分画を一つにまとめ、0.01Mの
ジメチルグルタール酸、0.2Mホウ酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む、pH6.5
に調製された緩衝液で平衡化された150mlのCM Sepharose CL6Bカチオン効果カラ
ム(直径5cm)にかけた。
テアーゼを溶出した(サブチリシン147の場合には0〜0.2M塩化ナトリウム)。 最終精製工程では、CMSepharoseカラムからの分画を含むプロテアーゼを一つ
にまとめ、GR81PPメンブレン(Danish Sugar Factories Inc.製)を装着したAmic
on限外濾過セルを使い濃縮した。 構築体と発酵に関する実施例1及び上記分離法の技術を利用し、以下のサブチ
リシン309変異体を作製、分離した:
る。
(OMO、Datasheet ED-9745105)及び米国(Wisk、Datasheet ED-9711893)のスー
パーマーケットにて購入した。使用する前に、洗剤中の全ての酵素活性を超音波
処理により不活性化した。 洗剤95は、単純なモデル製剤である。pHは、粉末洗剤について正常な範囲であ
る10.5に調整される。モデル洗剤95は次の組成を有する。
12, CH-9015 St. Gall, スイスより得た。反射率: 試験材料の反射率(R)の測定はMacbeth ColorEye 7000フォトメーターを利用し
、460nmにて実施された。測定はメーカーのプロトコールに従い実施された。
又は性能係数により決定された。 改善係数、IF量/応答は調査対象のサブチラーゼを含む洗剤と、対照のサブチ
ラーゼを含む同一洗剤に関する洗浄曲線に対する0を通るサブチラーゼの漸近線
の傾斜の比として定義されている。 IF量/応答=a/aref
線との交点であり;aはcが0の時の漸近線の傾きであり;cは酵素濃度であり
;そして△Rmaxはcが無限大の時の、理論上の最大洗浄効果である。
ナーゼは10nMのSavinaseで洗浄した時の試験材料の反射であり;Rブランスは酵
素なしで洗浄した時の試験材料の反射である。
b)間のアラインメントを示す。
ンメントを示す。
berg間のアラインメントを示す。
ラインメントを示す。
録1SVN)。図中に活性部位ループ(b)が指示されている。
Claims (34)
- 【請求項1】 位置95ないし103の活性部位ループ(b)領域の位置100に、
少なくとも1個の追加アミノ酸残基を持ち、且つその追加アミノ酸残基が位置10
0と101の間にある少なくとも1個のアミノ酸残基の挿入に対応しているI-S1及び
I-S2サブグループのサブチラーゼ酵素。 - 【請求項2】 前記サブチラーゼ酵素が、前駆体サブチラーゼの位置100と1
01間に少なくとも1個の挿入アミノ酸残基を持つ構築された変異体である、請求
項1の単離されたサブチラーゼ酵素。 - 【請求項3】 以下修飾: X100X[A,T,G,S]、 X100X[D,E,K,R]、 X100X[H,V,C,N,Q]、及び X100X[F,I,L,M,P,W,Y] を含む群より選択される請求項1又は2の単離されたサブチラーゼ酵素。
- 【請求項4】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
: T、G、A、及びS よりなる群から選択される、請求項3の単離されたサブチラーゼ酵素。 - 【請求項5】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
: D,E,H,K及びRであり、好ましくはD,E,K及びR を含む荷電アミノ酸残基の群から選択される、請求項3の単離されたサブチラ
ーゼ酵素。 - 【請求項6】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
: C、N、Q、S及びT、好ましくはN、Q、S及びT を含む疎水性アミノ酸残基の群から選択される、請求項3の単離されたサブチ
ラーゼ酵素。 - 【請求項7】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
: A、G、及びV を含む小型親水性アミノ酸残基の群から選択される、請求項3の単離されたサ
ブチラーゼ酵素。 - 【請求項8】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
: F,I,L,M,P,W、及びY、好ましくはF,I,L,M及びY を含む大型親水性アミノ酸残基の群から選択される、請求項3の単離されたサ
ブチラーゼ酵素。 - 【請求項9】 前記少なくとも1個の追加の又は挿入されたアミノ酸残基が
、活性部位ループ(b)内の1より多い追加の又は挿入されたアミノ酸残基を含
む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離されたサブチラーゼ酵素。 - 【請求項10】 位置100と101の間の前記挿入が、その他位置における1ま
たは複数の他の修飾と組合わさっている、請求項1〜9の何れか1項に記載のサ
ブチラーゼ変異体。 - 【請求項11】 前記他の修飾が位置27、36、57、76、87、97、101、104、
120、123、167、170、206、218、222、224、235及び274の位置の1または複数に
存在している、請求項15のサブチラーゼ変異体。 - 【請求項12】 前記他の修飾が、位置129、131、133及び194の1または複
数の位置の修飾と組合わさっている前記請求項何れかのサブチラーゼ変異体。 - 【請求項13】 前記サブチラーゼ又はサブチラーゼが、あるいは変異体の
場合には親サブチラーゼが、サブグループI-S1に属している、請求項1〜12のい
ずれか1項のサブチラーゼ。 - 【請求項14】 親サブチラーゼがABSS168、BASBPN、BSSDY及びBLSCAR、又
はサブグループI-S1の特徴を保持しているそれらの機能的変異体を含む群から選
択される、請求項13のサブチラーゼ。 - 【請求項15】 サブチラーゼ、又はサブチラーゼが変異体の場合には親サ
ブチラーゼが、サブグループIS-2に属する、請求項1〜14の何れか1項に記載の
サブチラーゼ。 - 【請求項16】 親サブチラーゼがBLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER及びBY
SYAB、又はサブグループI-S2の特徴を保持しているそれらの機能的変異体を含む
群から選択される、請求項15のサブチラーゼ。 - 【請求項17】 以下修飾: G100GA、 G100GT、 G100GG、 G100GS、 G100GD、 G100GE、 G100GK、 G100GR、 G100GH、 G100GV、 G100GC、 G100GN、 G100GQ、 G100GF、 G100GI、 G100GL、 G100GM、 G100GP、 G100GW、及び G100GY を含む群から選択される請求項3、15又は16の単離されたサブチラーゼ酵
素。 - 【請求項18】 前記の他の修飾がK27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、
S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、Q206E、N218S、M2
22S、M222A、T224S、K235L及びT274Aを含む群から選択される、請求項15〜17の
何れか1項のサブチラーゼ変異体。 - 【請求項19】 前記他の修飾が、S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R
+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I又はN76D+V104A、あるいはこれら変
異体のその他組み合せ(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V10
4A)を、請求項1〜14の何れか1項に記載の置換、欠失及び/又は挿入の1又は
複数と組み合せて含んでいる群から選択される、請求項15〜17の何れか1項のサ
ブチラーゼ変異体。 - 【請求項20】 前記他の修飾が、P129K、P131H、A133P、A133D及びA194P
を更に含む群より選択される、請求項15〜17の何れか1項のサブチラーゼ変異体
。 - 【請求項21】 以下の修飾: A98G+G100GA+S101A+S103T、及びS99G+G100GGT+S101T を含む群より選択される修飾を含む請求項1〜20のいずれかに記載の変異体。
- 【請求項22】 以下のアミノ酸配列: 【表1】 を有するI-S1サブグループに属するサブチラーゼ、あるいは位置100aのアミノ
酸残基を有し、該配列に70%、75%、80%、85%、90%、又は95%以上の同一性を示
すアミノ酸配列を持つ相同的サブチラーゼ。 - 【請求項23】 以下のアミノ酸配列: 【表2】 を有するI-S2サブグループに属するサブチラーゼ、あるいは位置100aのアミノ
酸残基を有し、該配列に70%、75%、80%、85%、90%、又は95%以上の同一性を示
すアミノ酸配列を持つ相同的サブチラーゼ。 - 【請求項24】 位置100aのXがT、A、G、S及びPを含む群より選択される、
請求項22又は23のサブチラーゼ変異体。 - 【請求項25】 サブチラーゼ又は請求項1〜24の何れか1項のサブチラー
ゼ変異体をコードする単離されたDNA配列。 - 【請求項26】 請求項25の単離されたDNA配列を含む発現ベクター。
- 【請求項27】 請求項26の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主
細胞。 - 【請求項28】 前記宿主細胞が細菌であり、好ましくはバチルス(Bacill
us)、特にバチルス・レンタス(B.lentus)である請求項27の微生物宿主。 - 【請求項29】 前記宿主細胞が菌類(fungus)又は酵母であり、好ましく
は糸状菌、特にアスペルギルス(Aspergillus)である、請求項27の微生物宿主
。 - 【請求項30】 請求項27〜29の何れか1項の宿主を前記変異体の発現及び
分泌を誘導できる条件下に培養し、変異体を回収する、請求項1〜24何れか1
項のサブチラーゼ又はサブチラーゼ変異体を製造する方法。 - 【請求項31】 請求項1〜24の何れか1項に記載のサブチラーゼ又はサブ
チラーゼ変異体を含む組成物。 - 【請求項32】 セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、酸化還元酵素、その
他のプロテアーゼ又はアミラーゼを更に含む、請求項31の組成物。 - 【請求項33】 前記組成物が洗剤組成物である、請求項31又は32による組
成物。 - 【請求項34】 請求項1〜24何れか1項に記載のサブチラーゼ又はサブチ
ラーゼ変異体、あるいは請求項31又は32に記載の酵素組成物の洗濯及び/又は皿
洗い洗剤への使用。
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