JP2003516116A - 立体的に保護されたクリップ部位を有するプロテアーゼ抱合体 - Google Patents
立体的に保護されたクリップ部位を有するプロテアーゼ抱合体Info
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- JP2003516116A JP2003516116A JP2001512566A JP2001512566A JP2003516116A JP 2003516116 A JP2003516116 A JP 2003516116A JP 2001512566 A JP2001512566 A JP 2001512566A JP 2001512566 A JP2001512566 A JP 2001512566A JP 2003516116 A JP2003516116 A JP 2003516116A
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Abstract
(57)【要約】
本開示は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含むサブチリシンプロテアーゼ抱合体に関する。各付加部分は、プロテアーゼ部分のクリップ部位保護位置に共有結合し、該クリップ部位保護位置は、ＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、８４、８５、８８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２６１、２６２、及び２７４位置から選択される。プロテアーゼ抱合体は、親型プロテアーゼに比して低下した免疫原性を有する。本開示はさらに、プロテアーゼ抱合体を含む洗浄用組成物及びパーソナルケア組成物に関する。
Description
【０００１】
本発明は、例えば、パーソナルケア組成物、洗濯組成物、硬質面洗浄組成物、
及び軽質洗浄用組成物のような組成物に有用である化学的に修飾したサブチリシ
ンプロテアーゼに関する。
及び軽質洗浄用組成物のような組成物に有用である化学的に修飾したサブチリシ
ンプロテアーゼに関する。
【０００２】
酵素は、天然由来のタンパク質の最も広範なクラスを構成する。酵素のクラス
の１つには、他のタンパク質の加水分解を触媒するプロテアーゼが挙げられる。
タンパク質を加水分解するこの能力は、典型的には、天然由来の、及び遺伝子操
作したプロテアーゼを、洗浄用組成物、特に洗濯用途に適切なものに組み入れる
ことによって利用されている。
の１つには、他のタンパク質の加水分解を触媒するプロテアーゼが挙げられる。
タンパク質を加水分解するこの能力は、典型的には、天然由来の、及び遺伝子操
作したプロテアーゼを、洗浄用組成物、特に洗濯用途に適切なものに組み入れる
ことによって利用されている。
【０００３】
洗浄用分野において、最も広範に利用されているこれらのプロテアーゼは、セ
リンプロテアーゼである。これらのセリンプロテアーゼのほとんどは、細菌類に
より作られるが、いくつかは真菌類のような他の生物によって作られることもあ
る。シーゼンら（Siezen）らの「サブチラーゼの相同性モデルとタンパク質工学
戦略、サブチリシン様のセリンプロテアーゼファミリー（"Homology Modelling
and Protein Engineering Strategy of Subtilases、the Family of Subtilisin
−Like Serine Proteases"）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engi
neering）の第４巻、７号（１９９１年）の７１９〜７３７ページを参照のこと
。残念なことに、天然環境における野生型プロテアーゼの効力は、洗浄用組成物
の人為環境には最適化されないことが多い。具体的には、例えば、熱安定性、ｐ
Ｈ安定性、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼの特徴は、プロテア
ーゼの天然環境以外での利用には必ずしも最適化されない。
リンプロテアーゼである。これらのセリンプロテアーゼのほとんどは、細菌類に
より作られるが、いくつかは真菌類のような他の生物によって作られることもあ
る。シーゼンら（Siezen）らの「サブチラーゼの相同性モデルとタンパク質工学
戦略、サブチリシン様のセリンプロテアーゼファミリー（"Homology Modelling
and Protein Engineering Strategy of Subtilases、the Family of Subtilisin
−Like Serine Proteases"）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engi
neering）の第４巻、７号（１９９１年）の７１９〜７３７ページを参照のこと
。残念なことに、天然環境における野生型プロテアーゼの効力は、洗浄用組成物
の人為環境には最適化されないことが多い。具体的には、例えば、熱安定性、ｐ
Ｈ安定性、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼの特徴は、プロテア
ーゼの天然環境以外での利用には必ずしも最適化されない。
【０００４】
非天然洗浄環境においてプロテアーゼの効力を高めるという目的で、セリンプ
ロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変える幾つかのアプローチが用いられてきた
。これらのアプローチには、極めて多様な条件下における熱安定性を高め、酸化
安定性を改善するためのプロテアーゼの遺伝子再設計及び／又は化学的修飾が挙
げられる。
ロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変える幾つかのアプローチが用いられてきた
。これらのアプローチには、極めて多様な条件下における熱安定性を高め、酸化
安定性を改善するためのプロテアーゼの遺伝子再設計及び／又は化学的修飾が挙
げられる。
【０００５】
しかしながら、そのように修飾されたプロテアーゼは哺乳類にとって外来物で
あるために、それらは潜在的な抗原である。抗原として、これらのプロテアーゼ
は、哺乳類において免疫原性の及び／又はアレルギー反応（本明細書ではまとめ
て免疫原性反応として記載する）を引き起こす。
あるために、それらは潜在的な抗原である。抗原として、これらのプロテアーゼ
は、哺乳類において免疫原性の及び／又はアレルギー反応（本明細書ではまとめ
て免疫原性反応として記載する）を引き起こす。
【０００６】
その上、プロテアーゼの遺伝子再設計及び化学的修飾は、洗濯用途のためによ
り高い有効性プロテアーゼを継続して探している点で顕著であるが、かかるプロ
テアーゼは、パーソナルケア組成物及び軽質洗剤では商業的には利用されていな
い。例えば、石鹸、ジェル、ボディソープ、シャンプー、軽質食器洗剤のような
製品にこのようなプロテアーゼが不在であることの主な理由は、望ましくない免
疫原性反応を招くヒトへの感作の問題があるためである。従って、免疫原性反応
を誘発しないでプロテアーゼの洗浄特性を与えるパーソナルケア組成物又は軽質
洗剤を提供することは高い利点があるはずである。
り高い有効性プロテアーゼを継続して探している点で顕著であるが、かかるプロ
テアーゼは、パーソナルケア組成物及び軽質洗剤では商業的には利用されていな
い。例えば、石鹸、ジェル、ボディソープ、シャンプー、軽質食器洗剤のような
製品にこのようなプロテアーゼが不在であることの主な理由は、望ましくない免
疫原性反応を招くヒトへの感作の問題があるためである。従って、免疫原性反応
を誘発しないでプロテアーゼの洗浄特性を与えるパーソナルケア組成物又は軽質
洗剤を提供することは高い利点があるはずである。
【０００７】
現在、化学的に修飾されたプロテアーゼが空中に浮遊して、運ばれることを避
けるために、それらの化学的に修飾されたプロテアーゼを固相化する、顆粒化す
る、被覆する、又は溶解することによって、プロテアーゼに対する免疫原性反応
を最小限にとどめることができる。これらの方法は、空中に浮遊するプロテアー
ゼに消費者が暴露されることを対処するとはいえ、最終組成物と皮膚組織とが長
く接触するリスクを未だに生じている。
けるために、それらの化学的に修飾されたプロテアーゼを固相化する、顆粒化す
る、被覆する、又は溶解することによって、プロテアーゼに対する免疫原性反応
を最小限にとどめることができる。これらの方法は、空中に浮遊するプロテアー
ゼに消費者が暴露されることを対処するとはいえ、最終組成物と皮膚組織とが長
く接触するリスクを未だに生じている。
【０００８】
プロテアーゼにポリマーを結合することによってプロテアーゼの免疫原性の低
下が達成され得ることが提案されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３
７号（デービス（Davis）ら、１９７９年１２月１８日発行）；米国特許第５，
８５６，４５１号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月５日に発行され、ノ
ボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ第９９／００４８９号（オルセン（Olsen
）ら、１９９９年１月７日に発行され、ノボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ
第９８／３０６８２号（オルセン（Olsen）ら、１９９８年７月１６日に発行さ
れ、ノボノルディスクに譲渡された）；及びＷＯ第９８／３５０２６号（フォン
・デル・オステン（Von Der Osten）ら、１９９８年８月１３日発行）を参照の
こと。しかしながら、そのような提案は、免疫原性を最も効果的に低下させるた
めに、プロテアーゼの特定のアミノ酸領域にポリマーを結合する重要性を示唆し
てはいない。
下が達成され得ることが提案されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３
７号（デービス（Davis）ら、１９７９年１２月１８日発行）；米国特許第５，
８５６，４５１号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月５日に発行され、ノ
ボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ第９９／００４８９号（オルセン（Olsen
）ら、１９９９年１月７日に発行され、ノボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ
第９８／３０６８２号（オルセン（Olsen）ら、１９９８年７月１６日に発行さ
れ、ノボノルディスクに譲渡された）；及びＷＯ第９８／３５０２６号（フォン
・デル・オステン（Von Der Osten）ら、１９９８年８月１３日発行）を参照の
こと。しかしながら、そのような提案は、免疫原性を最も効果的に低下させるた
めに、プロテアーゼの特定のアミノ酸領域にポリマーを結合する重要性を示唆し
てはいない。
【０００９】
最近、サブチリシンプロテアーゼが、３つのエピトープ領域を含むこと、及び
プロテアーゼの免疫原性において有意な低下を達成するには、１又はそれより多
くのポリマー、ポリペプチド、又はその他の基の抱合を、１又はそれより多くの
このような領域に結合すべきであることが見い出されている。例えば、米国特許
出願出願番号第０９／０８８，９１２号（ウエイスガーバー（Weisgerber）ら、
１９９８年６月２日に提出され、プロクター＆ギャンブル社に譲渡された）を参
照のこと。
プロテアーゼの免疫原性において有意な低下を達成するには、１又はそれより多
くのポリマー、ポリペプチド、又はその他の基の抱合を、１又はそれより多くの
このような領域に結合すべきであることが見い出されている。例えば、米国特許
出願出願番号第０９／０８８，９１２号（ウエイスガーバー（Weisgerber）ら、
１９９８年６月２日に提出され、プロクター＆ギャンブル社に譲渡された）を参
照のこと。
【００１０】
サブチリシンプロテアーゼのエピトープ領域を保護するための別の方法として
、本発明者らは、プロテアーゼの１又はそれより多くの「クリップ部位」（すな
わち、生体内にて加水分解が生じるプロテアーゼの位置）の立体的保護を、エピ
トープの提示を妨げる又は妨害する及びプロテアーゼの免疫原性を低下させるの
に利用してもよいことを見い出した。従って、本発明者らは、化学的修飾が１又
はそれより多くのクリップ部位の立体的近傍領域にある化学的に修飾されたサブ
チリシンを提供する。従って、本発明者らは、低下した免疫原性反応をもたらし
、効果的且つ活性のあるプロテアーゼとしてそれらの活性をなお維持するサブチ
リシンプロテアーゼを見い出した。従って、本発明のプロテアーゼ抱合体は、洗
濯用、食器用、硬質面用、スキンケア用、ヘアケア用、美容用、口内ケア用、及
びコンタクトレンズ用組成物を含むが、これに限定されない数種の組成物におけ
る使用に好適である。
、本発明者らは、プロテアーゼの１又はそれより多くの「クリップ部位」（すな
わち、生体内にて加水分解が生じるプロテアーゼの位置）の立体的保護を、エピ
トープの提示を妨げる又は妨害する及びプロテアーゼの免疫原性を低下させるの
に利用してもよいことを見い出した。従って、本発明者らは、化学的修飾が１又
はそれより多くのクリップ部位の立体的近傍領域にある化学的に修飾されたサブ
チリシンを提供する。従って、本発明者らは、低下した免疫原性反応をもたらし
、効果的且つ活性のあるプロテアーゼとしてそれらの活性をなお維持するサブチ
リシンプロテアーゼを見い出した。従って、本発明のプロテアーゼ抱合体は、洗
濯用、食器用、硬質面用、スキンケア用、ヘアケア用、美容用、口内ケア用、及
びコンタクトレンズ用組成物を含むが、これに限定されない数種の組成物におけ
る使用に好適である。
【００１１】
本発明は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含み、各付
加部分が、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、１６、１８、１
９、２０、２１、８４、８５、８８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２
、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４
、１９６、２５９、２６０、２６１、２６２、及び２７４位置から成る群から選
択される位置にてプロテアーゼ部分のアミノ酸に共有結合するプロテアーゼ抱合
体に関するものであり；付加部分はそれぞれ独立して以下の構造を有する：
加部分が、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、１６、１８、１
９、２０、２１、８４、８５、８８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２
、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４
、１９６、２５９、２６０、２６１、２６２、及び２７４位置から成る群から選
択される位置にてプロテアーゼ部分のアミノ酸に共有結合するプロテアーゼ抱合
体に関するものであり；付加部分はそれぞれ独立して以下の構造を有する：
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、Ｘは不在及び連結部分から成る群から選択され；Ｒ1は、不在、第１の
ポリペプチド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ2は、不在
、第２のポリペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され；少なくと
もＸ、Ｒ1、及びＲ2の１つは不在ではない）。
ポリペプチド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ2は、不在
、第２のポリペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され；少なくと
もＸ、Ｒ1、及びＲ2の１つは不在ではない）。
【００１４】
本発明のプロテアーゼ抱合体は、親型プロテアーゼに比して、免疫原性を低下
させる。従って、かかるプロテアーゼ抱合体は、洗濯用、食器用、硬質面用、ス
キンケア用、ヘアケア用、美容用、口内ケア用、及びコンタクトレンズ用組成物
を含むが、これに限定されない数種の組成物における使用に好適である。
させる。従って、かかるプロテアーゼ抱合体は、洗濯用、食器用、硬質面用、ス
キンケア用、ヘアケア用、美容用、口内ケア用、及びコンタクトレンズ用組成物
を含むが、これに限定されない数種の組成物における使用に好適である。
【００１５】
本発明の必須構成成分は、本明細書で以下に記載する。本発明の実施態様に有
用な種々の任意の構成成分や、好ましい構成成分に関する非限定的な説明も含ま
れる。
用な種々の任意の構成成分や、好ましい構成成分に関する非限定的な説明も含ま
れる。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載した必要な又は任意の構成成分及び／又は限定のう
ちのいずれかを含んでいるか、いずれかからなるか、又はいずれかから本質的に
なることができる。
ちのいずれかを含んでいるか、いずれかからなるか、又はいずれかから本質的に
なることができる。
【００１７】
パーセント及び比率は全て、他に指示しない限り、重量で計算されている。パ
ーセントは全て、他に指示しない限り、総組成物に基づいて計算されている。
ーセントは全て、他に指示しない限り、総組成物に基づいて計算されている。
【００１８】
構成成分又は組成物の値は全て、その構成成分又は組成物の活性値を参照して
おり、そして不純物、例えば、商業的に入手可能な供給物中に存在している可能
性がある残存溶媒又は副生成物は除外されている。
おり、そして不純物、例えば、商業的に入手可能な供給物中に存在している可能
性がある残存溶媒又は副生成物は除外されている。
【００１９】
全ての特許、特許出願、及び出版物を含めて、本明細書中で参考として引用さ
れる全ての文書は、その全てを本明細書に組み入れる。
れる全ての文書は、その全てを本明細書に組み入れる。
【００２０】
酵素を含むがこれに限定されない材料に関する商標名は、本明細書に引用する
。本発明者は本明細書では、或る商品名の材料に限定されるようには意図してい
ない。商標名により引用されているものと等価の材料（例えば、異なる名称又は
カタログ（参照）番号で異なる供給元から得られるもの）は、本明細書のプロテ
アーゼ抱合体及び組成物において置き換えてもよく、利用してもよい。
。本発明者は本明細書では、或る商品名の材料に限定されるようには意図してい
ない。商標名により引用されているものと等価の材料（例えば、異なる名称又は
カタログ（参照）番号で異なる供給元から得られるもの）は、本明細書のプロテ
アーゼ抱合体及び組成物において置き換えてもよく、利用してもよい。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、略語はアミノ酸を記載するのに用いられる。表１
は本明細書で使用された略語の一覧を提供する：
は本明細書で使用された略語の一覧を提供する：
【００２２】
【表１】
【００２３】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「変異」は、それらの遺伝子配列によって生
じる遺伝子配列及び／又はアミノ酸配列の変化をいう。変異には、野生型タンパ
ク質配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換及び付加が含まれる。
じる遺伝子配列及び／又はアミノ酸配列の変化をいう。変異には、野生型タンパ
ク質配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換及び付加が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「親型」は、本明細書のプロテアーゼ抱合体
を形成するために更なる修飾に利用されるタンパク質（野生型又は変異型）をい
う。
を形成するために更なる修飾に利用されるタンパク質（野生型又は変異型）をい
う。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、タンパク質、例えば、天然に
存在する生物によって生成されるプロテアーゼ又はその他の酵素をいう。
存在する生物によって生成されるプロテアーゼ又はその他の酵素をいう。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「変異型」は、相当する野生型タンパク質の
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、ポリマーの分子量はすべて、重量平均分子量とし
て表現される。
て表現される。
【００２８】
本明細書で引用されるように、本発明の抱合体は、サブチリシンＢＰＮ’を含
むもの及びその変異型に限定されないが、アミノ酸番号はすべて配列番号１番（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で表されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に関す
る。サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、ウエルズ（Wells）らによって「
核酸研究」(Nucleic Acids Research)の第II巻、７９１１〜７９２５ページ（１
９８３年）でさらに記載されており、参考として本明細書に組み入れる。
むもの及びその変異型に限定されないが、アミノ酸番号はすべて配列番号１番（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で表されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に関す
る。サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、ウエルズ（Wells）らによって「
核酸研究」(Nucleic Acids Research)の第II巻、７９１１〜７９２５ページ（１
９８３年）でさらに記載されており、参考として本明細書に組み入れる。
【００２９】
本発明のプロテアーゼ抱合体
本発明のプロテアーゼ抱合体は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの
付加部分を含み、該プロテアーゼ部分及び付加部分は、共有連結（すなわち、共
有結合）を介して接続される化合物である。
付加部分を含み、該プロテアーゼ部分及び付加部分は、共有連結（すなわち、共
有結合）を介して接続される化合物である。
【００３０】プロテアーゼ部分
本明細書のプロテアーゼ部分は、サブチリシン様のプロテアーゼであり、野生
型又はその変異型のいずれかである。本明細書で使用されるとき、用語「サブチ
リシン様のプロテアーゼ」は、少なくとも５０％、及び好ましくは８０％、サブ
チリシンＢＰＮ’の配列とのアミノ酸配列の同一性を有するプロテアーゼを意味
する。野生型サブチリシン様のプロテアーゼは、例えば、Bacillus alcalophilu
s、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus amylossacchricus、Bacillus liche
niformis、Bacillus lentus、及びBacillus subtilisの微生物によって産生され
る。サブチリシン様のセリンプロテアーゼ及びその類縁体に関する議論は、シー
ゼン（Siezen）らの、「サブチラーゼの相同性モデル及びタンパク質工学戦略、
サブチリシン様セリンプロテアーゼファミリー（Homology Modelling and Prote
in Engineering Strategy of Subtilases、the Family of Subtilisin−Like Se
rine Proteases）」、（プロテインエンジニアリング（Protein Engineering）
の第４巻、７号の７１９〜７３７ページ（１９９１年））によって見い出されて
もよい。
型又はその変異型のいずれかである。本明細書で使用されるとき、用語「サブチ
リシン様のプロテアーゼ」は、少なくとも５０％、及び好ましくは８０％、サブ
チリシンＢＰＮ’の配列とのアミノ酸配列の同一性を有するプロテアーゼを意味
する。野生型サブチリシン様のプロテアーゼは、例えば、Bacillus alcalophilu
s、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus amylossacchricus、Bacillus liche
niformis、Bacillus lentus、及びBacillus subtilisの微生物によって産生され
る。サブチリシン様のセリンプロテアーゼ及びその類縁体に関する議論は、シー
ゼン（Siezen）らの、「サブチラーゼの相同性モデル及びタンパク質工学戦略、
サブチリシン様セリンプロテアーゼファミリー（Homology Modelling and Prote
in Engineering Strategy of Subtilases、the Family of Subtilisin−Like Se
rine Proteases）」、（プロテインエンジニアリング（Protein Engineering）
の第４巻、７号の７１９〜７３７ページ（１９９１年））によって見い出されて
もよい。
【００３１】
本明細書で使用するのに好ましいプロテアーゼ部分には、例えば、Bacillus a
myloliquefaciens、Bacillus licheniformis、及びBacillus subtilisから得ら
れるもの、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールス
バーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、及びサー
ミターゼが挙げられ、Ａ／Ｓ アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）（デンマ
ークのコペンハーゲン、ノボ・インダストリーズから商業的に入手可能）、エス
ペラーゼ（Esperase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ）、サビナーゼ（
Savinase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ）、マクサターゼ（Maxatase
）（登録商標）（ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor Internation
al Inc．）から商業的に入手可能）、マクサカール（Maxacal）（登録商標）（
ジェネンコア・インターナショナル社）、マクサペム（Maxapem）１５（登録商
標）（ジェネンコア・インターナショナル社）、及び前述の変異型も含まれる。
本明細書での使用に特に好ましいプロテアーゼ部分には、Bacillus amyloliquef
aciensから得られるもの及びその変異型が挙げられる。本明細書の最も好ましい
プロテアーゼ部分は、サブチリシンＢＰＮ’及びその変異型である。
myloliquefaciens、Bacillus licheniformis、及びBacillus subtilisから得ら
れるもの、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールス
バーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、及びサー
ミターゼが挙げられ、Ａ／Ｓ アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）（デンマ
ークのコペンハーゲン、ノボ・インダストリーズから商業的に入手可能）、エス
ペラーゼ（Esperase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ）、サビナーゼ（
Savinase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ）、マクサターゼ（Maxatase
）（登録商標）（ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor Internation
al Inc．）から商業的に入手可能）、マクサカール（Maxacal）（登録商標）（
ジェネンコア・インターナショナル社）、マクサペム（Maxapem）１５（登録商
標）（ジェネンコア・インターナショナル社）、及び前述の変異型も含まれる。
本明細書での使用に特に好ましいプロテアーゼ部分には、Bacillus amyloliquef
aciensから得られるもの及びその変異型が挙げられる。本明細書の最も好ましい
プロテアーゼ部分は、サブチリシンＢＰＮ’及びその変異型である。
【００３２】
本明細書で使用するのに特に好ましいサブチリシンＢＰＮ’の変異型は、以後
「プロテアーゼＡ」と呼ぶが、米国特許第５，０３０，３７８号（ベネガス（Ve
negas）、１９９１年７月９日発行）に開示されており、以下の変異を伴うサブ
チリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列を特徴としている：
「プロテアーゼＡ」と呼ぶが、米国特許第５，０３０，３７８号（ベネガス（Ve
negas）、１９９１年７月９日発行）に開示されており、以下の変異を伴うサブ
チリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列を特徴としている：
【００３３】
（ａ）１６６位置におけるＧｌｙが、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ及びＧｌｕから選択されるアミノ酸残基で置換されており；
１６９位置のＧｌｙが、Ｓｅｒで置換されており；及び２２２位置のＭｅｔが、
Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＴｈｒから選択されるア
ミノ酸残基で置換されている；又は
ｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ及びＧｌｕから選択されるアミノ酸残基で置換されており；
１６９位置のＧｌｙが、Ｓｅｒで置換されており；及び２２２位置のＭｅｔが、
Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＴｈｒから選択されるア
ミノ酸残基で置換されている；又は
【００３４】
（ｂ）１６０位置のＧｌｙが、Ａｌａで置換されており、且つ、２２２位置の
Ｍｅｔが、Ａｌａで置換されている。
Ｍｅｔが、Ａｌａで置換されている。
【００３５】
本明細書で使用するのにさらに好ましいサブチリシンＢＰＮ’の変異型は、以
後「プロテアーゼＢ」と呼ぶが、ジェネンコア・インターナショナル社に譲渡さ
れた欧州特許第２５１，４４６号（１９８８年１月７日公開）に開示されており
、以下の位置で１又はそれより多くの変異を伴う野生型サブチリシンＢＰＮ’の
アミノ酸配列を特徴としている：Ｔｙｒ２１、Ｔｈｒ２２、Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ
３６、Ａｌａ４５、Ａｌａ４８、Ｓｅｒ４９、Ｍｅｔ５０、Ｈｉｓ６７、Ｓｅｒ
８７、Ｌｙｓ９４、Ｖａｌ９５、Ｇｌｙ９７、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｇ
ｌｙ１０３、Ｉｌｅ１０７、Ｇｌｙ１１０、Ｍｅｔ１２４、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌ
ｙ１２８、Ｐｒｏ１２９、Ｌｅｕ１３５、Ｌｙｓ１７０、Ｔｙｒ１７１、Ｐｒｏ
１７２、Ａｓｐ１９７、Ｍｅｔ１９９、Ｓｅｒ２０４、Ｌｙｓ２１３、Ｔｙｒ２
１４、Ｇｌｙ２１５、及びＳｅｒ２２１；又はＡｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ
１０４、Ａｌａ１５２、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１
６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２から選択される位置にお
ける１又はそれより多くの変異と組み合わせられた上記に一覧された２またはそ
れより多くの位置。
後「プロテアーゼＢ」と呼ぶが、ジェネンコア・インターナショナル社に譲渡さ
れた欧州特許第２５１，４４６号（１９８８年１月７日公開）に開示されており
、以下の位置で１又はそれより多くの変異を伴う野生型サブチリシンＢＰＮ’の
アミノ酸配列を特徴としている：Ｔｙｒ２１、Ｔｈｒ２２、Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ
３６、Ａｌａ４５、Ａｌａ４８、Ｓｅｒ４９、Ｍｅｔ５０、Ｈｉｓ６７、Ｓｅｒ
８７、Ｌｙｓ９４、Ｖａｌ９５、Ｇｌｙ９７、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｇ
ｌｙ１０３、Ｉｌｅ１０７、Ｇｌｙ１１０、Ｍｅｔ１２４、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌ
ｙ１２８、Ｐｒｏ１２９、Ｌｅｕ１３５、Ｌｙｓ１７０、Ｔｙｒ１７１、Ｐｒｏ
１７２、Ａｓｐ１９７、Ｍｅｔ１９９、Ｓｅｒ２０４、Ｌｙｓ２１３、Ｔｙｒ２
１４、Ｇｌｙ２１５、及びＳｅｒ２２１；又はＡｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ
１０４、Ａｌａ１５２、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１
６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２から選択される位置にお
ける１又はそれより多くの変異と組み合わせられた上記に一覧された２またはそ
れより多くの位置。
【００３６】
本明細書で使用するのに好ましいその他のサブチリシンＢＰＮ’変異型は、以
後「プロテアーゼＣ」と呼ぶが、ジェネンコア・インターナショナル社に譲渡さ
れたＷＯ第９５／１０６１５号（１９９５年４月２０日公開）に記載されており
、Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｎ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｉ
ｌｅ１０７、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、Ｌｅｕ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌ
ｙ１２８、Ｌｅｕ１３５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｕ１９５、Ａｓｐ
１９７、Ｓｅｒ２０４、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２１０、Ａｌａ２１６、Ｔｙｒ２
１７、Ａｓｎ２１８、Ｍｅｔ２２２、Ｓｅｒ２６０、Ｌｙｓ２６５、及びＡｌａ
２７４から選択される１又はそれより多くのその他の位置における変異と組み合
わせたＡｓｎ７６位置に対する変異を伴った野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ
酸配列を特徴とする。
後「プロテアーゼＣ」と呼ぶが、ジェネンコア・インターナショナル社に譲渡さ
れたＷＯ第９５／１０６１５号（１９９５年４月２０日公開）に記載されており
、Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｎ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｉ
ｌｅ１０７、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、Ｌｅｕ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌ
ｙ１２８、Ｌｅｕ１３５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｕ１９５、Ａｓｐ
１９７、Ｓｅｒ２０４、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２１０、Ａｌａ２１６、Ｔｙｒ２
１７、Ａｓｎ２１８、Ｍｅｔ２２２、Ｓｅｒ２６０、Ｌｙｓ２６５、及びＡｌａ
２７４から選択される１又はそれより多くのその他の位置における変異と組み合
わせたＡｓｎ７６位置に対する変異を伴った野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ
酸配列を特徴とする。
【００３７】
本明細書で使用するのに好ましいその他のサブチリシンＢＰＮ’の変異型は、
以後「プロテアーゼＤ」と呼ぶが、米国特許第４，７６０，０２５号（エステル
（Estell）ら、１９８８年７月２６日発行）に記載されており、Ａｓｐ３２、Ｓ
ｅｒ３３、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１
６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２から成る
群から選択される１又はそれより多くのアミノ酸位置に対する変異を伴う野生型
サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする。
以後「プロテアーゼＤ」と呼ぶが、米国特許第４，７６０，０２５号（エステル
（Estell）ら、１９８８年７月２６日発行）に記載されており、Ａｓｐ３２、Ｓ
ｅｒ３３、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１
６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２から成る
群から選択される１又はそれより多くのアミノ酸位置に対する変異を伴う野生型
サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする。
【００３８】
本明細書でさらに好ましいプロテアーゼ部分は、アルカラーゼ（Alcalase）（
登録商標）、サブチリシンＢＰＮ’、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテ
アーゼＣ、及びプロテアーゼＤから成る群から選択され、プロテアーゼＤが最も
好ましい。
登録商標）、サブチリシンＢＰＮ’、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテ
アーゼＣ、及びプロテアーゼＤから成る群から選択され、プロテアーゼＤが最も
好ましい。
【００３９】
理論によって限定されることを意図しないが、本明細書のプロテアーゼ部分は
、少なくとも２つの当初の「クリップ部位」、又は生体内の加水分解に特に感受
性の高いプロテアーゼ部分の領域を有する。生体内の加水分解に最も感受性の高
い領域は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する位置も含めてアミノ酸１６０〜１６
５位置である。生体内の加水分解に感受性の高いもう１つの領域は、サブチリシ
ンＢＰＮ’に相当するアミノ酸１９と２０位置である。本発明者らは、サブチリ
シンＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、８
４、８５、８８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、
１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、
２６０、２６１、２６２、及び２７４位置から選択される位置においてプロテア
ーゼ部分のアミノ酸に１又はそれより多くの付加部分を共有結合させることによ
ってこれらのクリップ部位が加水分解、すなわちエピトープの暴露から保護され
ることを見い出した。かかる位置を以後まとめて「クリップ部位保護位置」とい
う。
、少なくとも２つの当初の「クリップ部位」、又は生体内の加水分解に特に感受
性の高いプロテアーゼ部分の領域を有する。生体内の加水分解に最も感受性の高
い領域は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する位置も含めてアミノ酸１６０〜１６
５位置である。生体内の加水分解に感受性の高いもう１つの領域は、サブチリシ
ンＢＰＮ’に相当するアミノ酸１９と２０位置である。本発明者らは、サブチリ
シンＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、８
４、８５、８８、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、
１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、
２６０、２６１、２６２、及び２７４位置から選択される位置においてプロテア
ーゼ部分のアミノ酸に１又はそれより多くの付加部分を共有結合させることによ
ってこれらのクリップ部位が加水分解、すなわちエピトープの暴露から保護され
ることを見い出した。かかる位置を以後まとめて「クリップ部位保護位置」とい
う。
【００４０】
好ましくは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１３、１４、１５、
１６、１８、１９、２０、２１、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１
６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１
９６、２５９、２６０、２６１、及び２６２位置から選択される。さらに好まし
くは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１４、１５、１６、１８、１
９、２０、２１、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、
１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、
２６０、２６１、及び２６２位置から選択される。一層さらに好ましくは、該位
置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１８、１９、２０、２１、１５８、１５
９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９
１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２６１、及び２６２位
置から選択される。尚さらに好ましくは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相
当する１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１
７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２
６１、及び２６２位置から選択される。この群の範囲内で、該位置はさらに好ま
しくは、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１５８、１５９、１６０、１６１、１
６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１９１、１９２、１９３、１９４、２
６１、及び２６２位置から選択される。さらに好ましくは、該位置はサブチリシ
ンＢＰＮ’に相当する１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１９２、１９３、１９４、２６１、及び２６２位置から選択される。最も好
ましくは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１６０、１６１、１６２
、１６３、及び２６１位置から選択される。
１６、１８、１９、２０、２１、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１
６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１
９６、２５９、２６０、２６１、及び２６２位置から選択される。さらに好まし
くは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１４、１５、１６、１８、１
９、２０、２１、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、
１６５、１７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、
２６０、２６１、及び２６２位置から選択される。一層さらに好ましくは、該位
置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１８、１９、２０、２１、１５８、１５
９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６、１９
１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２６１、及び２６２位
置から選択される。尚さらに好ましくは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相
当する１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１
７０、１８６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２
６１、及び２６２位置から選択される。この群の範囲内で、該位置はさらに好ま
しくは、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１５８、１５９、１６０、１６１、１
６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１９１、１９２、１９３、１９４、２
６１、及び２６２位置から選択される。さらに好ましくは、該位置はサブチリシ
ンＢＰＮ’に相当する１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１９２、１９３、１９４、２６１、及び２６２位置から選択される。最も好
ましくは、該位置は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する１６０、１６１、１６２
、１６３、及び２６１位置から選択される。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様では、プロテアーゼ部分は親型アミノ酸配列の修飾
された配列を含む。親型アミノ酸配列は、上述した上記プロテアーゼのいずれで
もよく、上述と同じ好ましい限定を伴う。本実施態様では、親型アミノ酸配列は
、置換アミノ酸により１又はそれより多くの親型アミノ酸残基にて置換されて、
１又はそれより多くの本付加部分と結合するのに好適なプロテアーゼ部分を生じ
る。本発明に基づいて、置換は、１又はそれより多くのクリップ部位保護位置に
て１又はそれより多くの位置で行われるべきである。クリップ部位保護位置、及
び好ましいその限定は上記で記載されている。
された配列を含む。親型アミノ酸配列は、上述した上記プロテアーゼのいずれで
もよく、上述と同じ好ましい限定を伴う。本実施態様では、親型アミノ酸配列は
、置換アミノ酸により１又はそれより多くの親型アミノ酸残基にて置換されて、
１又はそれより多くの本付加部分と結合するのに好適なプロテアーゼ部分を生じ
る。本発明に基づいて、置換は、１又はそれより多くのクリップ部位保護位置に
て１又はそれより多くの位置で行われるべきである。クリップ部位保護位置、及
び好ましいその限定は上記で記載されている。
【００４２】
１又はそれより多くの付加部分の１又はそれより多くのクリップ部位保護位置
におけるプロテアーゼ部分への選択的な結合を最もうまく達成するために、置換
は親型アミノ酸配列では存在しない（稀な）置換アミノ酸を用いるべきである。
この点で、親型アミノ酸配列に稀であるいかなる置換アミノ酸を利用してもよい
。例えば、システイン残基は、サブチリシンＢＰＮ’の野生型アミノ酸配列には
存在しないので、１又はそれより多くのクリップ部位保護位置における１又はそ
れより多くのシステイン残基によるサブチリシンＢＰＮ’の置換は、本発明に好
適である。システイン残基が親型アミノ酸配列のクリップ部位保護位置以外の位
置に存在する場合、クリップ部位保護位置において１又はそれより多くの付加部
分を選択的に結合可能にするために、それらの位置のそれぞれについて他のアミ
ノ酸残基を置換することが好ましい。システインは、１又はそれより多くのクリ
ップ部位保護位置での置換に最も好ましい置換アミノ酸である。
におけるプロテアーゼ部分への選択的な結合を最もうまく達成するために、置換
は親型アミノ酸配列では存在しない（稀な）置換アミノ酸を用いるべきである。
この点で、親型アミノ酸配列に稀であるいかなる置換アミノ酸を利用してもよい
。例えば、システイン残基は、サブチリシンＢＰＮ’の野生型アミノ酸配列には
存在しないので、１又はそれより多くのクリップ部位保護位置における１又はそ
れより多くのシステイン残基によるサブチリシンＢＰＮ’の置換は、本発明に好
適である。システイン残基が親型アミノ酸配列のクリップ部位保護位置以外の位
置に存在する場合、クリップ部位保護位置において１又はそれより多くの付加部
分を選択的に結合可能にするために、それらの位置のそれぞれについて他のアミ
ノ酸残基を置換することが好ましい。システインは、１又はそれより多くのクリ
ップ部位保護位置での置換に最も好ましい置換アミノ酸である。
【００４３】
他の好ましい置換アミノ酸にはリジンが挙げられる。置換アミノ酸がリジンで
ある場合、クリップ部位保護位置における１又はそれより多くのリジン残基の機
能化が選択的であるように、親型アミノ酸配列のクリップ部位保護位置以外に存
在するリジン残基を他のアミノ酸残基に変異することが好ましい。例えば、リジ
ン残基は、本明細書で定義するようなクリップ部位保護位置であるサブチリシン
ＢＰＮ’の１７０位置に存在する。サブチリシンＢＰＮ’配列で存在するその他
すべてのリジン残基の部位選択的変異誘発を行い、付加部分を伴った１７０位置
においてリジン残基の選択的機能化をおこなってもよい。別の方法として、幾つ
かのクリップ部位保護位置におけるアミノ酸残基をリジン（例えば）に変異誘発
し、付加部分によるこれらの位置での選択的機能化をおこなってもよい。
ある場合、クリップ部位保護位置における１又はそれより多くのリジン残基の機
能化が選択的であるように、親型アミノ酸配列のクリップ部位保護位置以外に存
在するリジン残基を他のアミノ酸残基に変異することが好ましい。例えば、リジ
ン残基は、本明細書で定義するようなクリップ部位保護位置であるサブチリシン
ＢＰＮ’の１７０位置に存在する。サブチリシンＢＰＮ’配列で存在するその他
すべてのリジン残基の部位選択的変異誘発を行い、付加部分を伴った１７０位置
においてリジン残基の選択的機能化をおこなってもよい。別の方法として、幾つ
かのクリップ部位保護位置におけるアミノ酸残基をリジン（例えば）に変異誘発
し、付加部分によるこれらの位置での選択的機能化をおこなってもよい。
【００４４】付加部分
本発明のプロテアーゼ抱合体は、１又はそれより多くの付加部分を含み、該付
加部分はそれぞれ、本明細書で記載されるようなクリップ部位保護位置にてアミ
ノ酸残基の１つと共有結合する。付加部分はいかなる化学構造であってもよい。
好ましくは、付加部分は、結合されたクリップ部位保護位置又は本明細書で定義
されるそのほかのいかなるクリップ部位保護位置も立体的に妨害する。付加部分
の非限定例には、約１６００未満、好ましくは約８００未満、さらに好ましくは
約４００未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子；ポリペ
プチド；及びポリマーを含む有機分子が挙げられるが、これに限定されない。本
明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸残基を含
む分子を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー」は、２以上の
同一の（好ましくは５以上の同一の）モノマー単位を含むいかなる分子も意味す
る。 好ましくは、付加部分は以下の構造を有する：
加部分はそれぞれ、本明細書で記載されるようなクリップ部位保護位置にてアミ
ノ酸残基の１つと共有結合する。付加部分はいかなる化学構造であってもよい。
好ましくは、付加部分は、結合されたクリップ部位保護位置又は本明細書で定義
されるそのほかのいかなるクリップ部位保護位置も立体的に妨害する。付加部分
の非限定例には、約１６００未満、好ましくは約８００未満、さらに好ましくは
約４００未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子；ポリペ
プチド；及びポリマーを含む有機分子が挙げられるが、これに限定されない。本
明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸残基を含
む分子を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー」は、２以上の
同一の（好ましくは５以上の同一の）モノマー単位を含むいかなる分子も意味す
る。 好ましくは、付加部分は以下の構造を有する：
【００４５】
【化３】
【００４６】
（式中、Ｘは不在及び連結部分から選択され；Ｒ1は、不在、第１のポリペプチ
ド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ2は、不在、第２のポ
リペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され、少なくともＸ、Ｒ1
、及びＲ2の１つは不在ではない）。
ド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ2は、不在、第２のポ
リペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され、少なくともＸ、Ｒ1
、及びＲ2の１つは不在ではない）。
【００４７】
好ましくは、プロテアーゼ抱合体は、１〜約１５、さらに好ましくは約２〜約
１０、及び最も好ましくは約１〜約５の付加部分を含む。
１０、及び最も好ましくは約１〜約５の付加部分を含む。
【００４８】
式中Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立してポリペプチド部分又はポリマー部分である
場合、Ｒ1及びＲ2は同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、式中Ｒ1
がポリペプチド部分である場合、Ｒ2は不在及びポリペプチド部分から選択され
、最も好ましくは不在である。最も好ましくは、Ｒ1がポリペプチド部分である
場合、Ｒ2は不在及び同一ポリペプチド部分から選択され、最も好ましくは不在
である。好ましくは、Ｒ1がポリマー部分である場合、Ｒ2は不在及びポリマー部
分から選択される。最も好ましくは、Ｒ1がポリマー部分である場合、Ｒ2は不在
及び同一ポリマー部分から選択される。少なくともＲ1及びＲ2の１つがそれぞれ
、第１のポリマー及び第２のポリマーである場合、その時Ｘは好ましくは不在で
はない。
場合、Ｒ1及びＲ2は同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、式中Ｒ1
がポリペプチド部分である場合、Ｒ2は不在及びポリペプチド部分から選択され
、最も好ましくは不在である。最も好ましくは、Ｒ1がポリペプチド部分である
場合、Ｒ2は不在及び同一ポリペプチド部分から選択され、最も好ましくは不在
である。好ましくは、Ｒ1がポリマー部分である場合、Ｒ2は不在及びポリマー部
分から選択される。最も好ましくは、Ｒ1がポリマー部分である場合、Ｒ2は不在
及び同一ポリマー部分から選択される。少なくともＲ1及びＲ2の１つがそれぞれ
、第１のポリマー及び第２のポリマーである場合、その時Ｘは好ましくは不在で
はない。
【００４９】ポリペプチド部分
本明細書で記載されるポリペプチド部分には、２以上のアミノ酸残基を含むよ
うなものが挙げられる。好ましいポリペプチド部分は、酵素を含むタンパク質か
ら選択される。好ましい酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミ
ラーゼ、ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラ
ナーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナ
ーゼ、レダクターゼ（例えば、ＮＡＤＨレダクターゼを含む）、オキシダーゼ、
フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タ
ンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ｂ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ
、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、
イソメラーゼ（例えば、グルコースイソメラーゼ及びキシロースイソメラーゼを
含む）、リアーゼ、リガーゼ、シンセターゼ、及び果実系酵素（例えば、パパイ
ンを含む）が挙げられる。ポリペプチド部分として使用するのにさらに好ましい
酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及び果実系酵素
が挙げられ、プロテアーゼが一層さらに好ましい。
うなものが挙げられる。好ましいポリペプチド部分は、酵素を含むタンパク質か
ら選択される。好ましい酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミ
ラーゼ、ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラ
ナーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナ
ーゼ、レダクターゼ（例えば、ＮＡＤＨレダクターゼを含む）、オキシダーゼ、
フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タ
ンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ｂ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ
、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、
イソメラーゼ（例えば、グルコースイソメラーゼ及びキシロースイソメラーゼを
含む）、リアーゼ、リガーゼ、シンセターゼ、及び果実系酵素（例えば、パパイ
ンを含む）が挙げられる。ポリペプチド部分として使用するのにさらに好ましい
酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及び果実系酵素
が挙げられ、プロテアーゼが一層さらに好ましい。
【００５０】
ポリペプチド部分として使用するためのリパーゼの例には、以下の微生物：
Humicola、Pseudonomas、Fusarium、Mucor、Chromobacterium、Aspergillus、Ca
ndida、Geotricum、Penicillum、Rhizopus 及び Bacillusに由来するものが挙げ
られる。
ndida、Geotricum、Penicillum、Rhizopus 及び Bacillusに由来するものが挙げ
られる。
【００５１】
市販のリパーゼの例には、リポラーゼ（Lipolase）（登録商標）、リポラーゼ
・ウルトラ（Lipolase Ultra）（登録商標）、リポザイム（Lipozyme）（登録商
標）、ポラターゼ（Palatase）（登録商標）、ノボザイム（Novozym）４３５（
登録商標）、及びレシターゼ（Lecitase）（登録商標）（すべてデンマーク・コ
ペンハーゲンのノボノルディスク（Novo Nordisk）から商業的に入手可能である
）、ルマファスト（Lumafast）（登録商標）（ニューヨーク州、ロチェスターの
ジェネンコア（Genencor,Int.）から商業的に入手可能）、及びリポマックス（L
ipomax）（登録商標）（ジェネンコア社）が挙げられる。
・ウルトラ（Lipolase Ultra）（登録商標）、リポザイム（Lipozyme）（登録商
標）、ポラターゼ（Palatase）（登録商標）、ノボザイム（Novozym）４３５（
登録商標）、及びレシターゼ（Lecitase）（登録商標）（すべてデンマーク・コ
ペンハーゲンのノボノルディスク（Novo Nordisk）から商業的に入手可能である
）、ルマファスト（Lumafast）（登録商標）（ニューヨーク州、ロチェスターの
ジェネンコア（Genencor,Int.）から商業的に入手可能）、及びリポマックス（L
ipomax）（登録商標）（ジェネンコア社）が挙げられる。
【００５２】
ポリペプチド部分として使用するためのプロテアーゼの例には、セリンプロテ
アーゼ、キモトリプシン、及びエラスターゼ型酵素が挙げられる。ポリペプチド
部分として使用するための最も好ましいプロテアーゼには、「プロテアーゼ部分
」の議論にて本明細書上記で定義されたようなセリンプロテアーゼが挙げられる
。
アーゼ、キモトリプシン、及びエラスターゼ型酵素が挙げられる。ポリペプチド
部分として使用するための最も好ましいプロテアーゼには、「プロテアーゼ部分
」の議論にて本明細書上記で定義されたようなセリンプロテアーゼが挙げられる
。
【００５３】
最も好ましくは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペ
プチド部分は、独立して本明細書上記で記載されたようなプロテアーゼ部分の定
義を持つ。好ましくは上記で記載されたように、ポリペプチド部分は親型アミノ
酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有し、修飾は、本明細書上記で記載したよう
に（親型アミノ酸配列が「第２の」親型アミノ酸配列と呼ばれてもよい）１はそ
れより多くのクリップ部位保護位置にある。この例では、連結部分の１つ（その
際、連結部分は不在ではない）又はプロテアーゼ部分（その際、連結部分は不在
である）が、ポリペプチド部分のクリップ部位保護位置の１つに存在する置換ア
ミノ酸を介して、ポリペプチド部分に共有結合する。ポリペプチド部分がセリン
プロテアーゼである場合、同一の好ましい、さらに好ましい、及び最も好ましい
クリップ部位保護位置の群が、本明細書上記で記載したようにプロテアーゼ部分
及びその相当する親型アミノ酸配列に適用される。
プチド部分は、独立して本明細書上記で記載されたようなプロテアーゼ部分の定
義を持つ。好ましくは上記で記載されたように、ポリペプチド部分は親型アミノ
酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有し、修飾は、本明細書上記で記載したよう
に（親型アミノ酸配列が「第２の」親型アミノ酸配列と呼ばれてもよい）１はそ
れより多くのクリップ部位保護位置にある。この例では、連結部分の１つ（その
際、連結部分は不在ではない）又はプロテアーゼ部分（その際、連結部分は不在
である）が、ポリペプチド部分のクリップ部位保護位置の１つに存在する置換ア
ミノ酸を介して、ポリペプチド部分に共有結合する。ポリペプチド部分がセリン
プロテアーゼである場合、同一の好ましい、さらに好ましい、及び最も好ましい
クリップ部位保護位置の群が、本明細書上記で記載したようにプロテアーゼ部分
及びその相当する親型アミノ酸配列に適用される。
【００５４】
最も好ましくは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペ
プチド部分及びプロテアーゼ部分は、同等の部分である。この例では、ポリペプ
チド部分及びプロテアーゼ部分は、最も好ましくはジスルフィド結合を介して結
合し、式中Ｘは不在であり、最も好ましくはＲ2が不在である。
プチド部分及びプロテアーゼ部分は、同等の部分である。この例では、ポリペプ
チド部分及びプロテアーゼ部分は、最も好ましくはジスルフィド結合を介して結
合し、式中Ｘは不在であり、最も好ましくはＲ2が不在である。
【００５５】ポリマー部分
本明細書の付加部分は、ポリマー部分を含んでもよい。本明細書で使用される
とき、用語、ポリマー部分は、２以上の同一の（好ましくは５以上の同一の）モ
ノマー単位を含む何れかの分子を意味する。好適なポリマー部分の例には、ポリ
アルキレンオキシド、ポリアルコール、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシ
レート、ポリビニルピロリドン、セルロース、デキストラン、スターチ、グリコ
ーゲン、アガロース、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラ
ゲーナン、ペクチン、アルギン酸ヒドロシレート、及びキトサンのヒドロシレー
トが挙げられる。好ましいポリアルキレンオキシドには、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールが挙げら
れる。好ましいデキストランには、カルボキシメチルデキストランが挙げられる
。好ましいセルロースには、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、
エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース
、及びヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。好ましいスターチには、ヒ
ドロキシエチルスターチ及びヒドロキシプロピルスターチが挙げられる。さらに
好ましいポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。最も好ましいポリマー部
分は、ポリエチレングリコールである。
とき、用語、ポリマー部分は、２以上の同一の（好ましくは５以上の同一の）モ
ノマー単位を含む何れかの分子を意味する。好適なポリマー部分の例には、ポリ
アルキレンオキシド、ポリアルコール、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシ
レート、ポリビニルピロリドン、セルロース、デキストラン、スターチ、グリコ
ーゲン、アガロース、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラ
ゲーナン、ペクチン、アルギン酸ヒドロシレート、及びキトサンのヒドロシレー
トが挙げられる。好ましいポリアルキレンオキシドには、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールが挙げら
れる。好ましいデキストランには、カルボキシメチルデキストランが挙げられる
。好ましいセルロースには、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、
エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース
、及びヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。好ましいスターチには、ヒ
ドロキシエチルスターチ及びヒドロキシプロピルスターチが挙げられる。さらに
好ましいポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。最も好ましいポリマー部
分は、ポリエチレングリコールである。
【００５６】
式中Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して、ポリマー部分である場合、Ｒ1及びＲ2は
好ましくは、約０．２ｋＤ（キロダルトン）〜約４０ｋＤ、さらに好ましくは約
０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及
び最も好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの全体的な分子量（すなわち、Ｒ1の分
子量とＲ2の分子量とを足す）を有する。
好ましくは、約０．２ｋＤ（キロダルトン）〜約４０ｋＤ、さらに好ましくは約
０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及
び最も好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの全体的な分子量（すなわち、Ｒ1の分
子量とＲ2の分子量とを足す）を有する。
【００５７】
式中Ｒ1及びＲ2がそれぞれポリマー部分である場合、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独
立して好ましくは、約０．１ｋＤ〜約２０ｋＤ、さらに好ましくは約０．２５ｋ
Ｄ〜約２０ｋＤ、一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約１０ｋＤ、及び最も好
ましくは約０．５ｋＤ〜約５ｋＤの分子量を有する。
立して好ましくは、約０．１ｋＤ〜約２０ｋＤ、さらに好ましくは約０．２５ｋ
Ｄ〜約２０ｋＤ、一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約１０ｋＤ、及び最も好
ましくは約０．５ｋＤ〜約５ｋＤの分子量を有する。
【００５８】
式中Ｒ1及びＲ2がそれぞれポリマー部分である場合、Ｒ1対Ｒ2の分子量の比は
、好ましくは、約１：１０〜約１０：１、さらに好ましくは約１：５〜約５：１
、及び最も好ましくは約１：３〜約３：１の範囲である。
、好ましくは、約１：１０〜約１０：１、さらに好ましくは約１：５〜約５：１
、及び最も好ましくは約１：３〜約３：１の範囲である。
【００５９】
式中Ｒ1がポリマー部分であり、且つＲ2が不在である場合、Ｒ1は、好ましく
は、約０．１ｋＤ〜約４０ｋＤ、さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、
一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及び最も好ましくは約１ｋＤ
〜約１０ｋＤの分子量を有する。
は、約０．１ｋＤ〜約４０ｋＤ、さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、
一層さらに好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及び最も好ましくは約１ｋＤ
〜約１０ｋＤの分子量を有する。
【００６０】連結部分
本明細書で使用されるとき、Ｘは、不在又は連結部分であってもよく、連結部
分は任意で、１又はそれより多くのポリペプチド部分又は１又はそれより多くの
ポリマー部分、又は双方と共有結合し、また、プロテアーゼ部分のクリップ部位
保護位置の１つにてアミノ酸残基に共有結合する。連結部分は一般にいかなる小
型分子、すなわち、約１６００未満の、好ましくは約８００未満、さらに好まし
くは約４００未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子であ
ってもよい。最も好ましい連結部分には、システイン残基又はリジン残基、最も
好ましくはシステイン残基に共有結合することができるようなものが挙げられる
。
分は任意で、１又はそれより多くのポリペプチド部分又は１又はそれより多くの
ポリマー部分、又は双方と共有結合し、また、プロテアーゼ部分のクリップ部位
保護位置の１つにてアミノ酸残基に共有結合する。連結部分は一般にいかなる小
型分子、すなわち、約１６００未満の、好ましくは約８００未満、さらに好まし
くは約４００未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子であ
ってもよい。最も好ましい連結部分には、システイン残基又はリジン残基、最も
好ましくはシステイン残基に共有結合することができるようなものが挙げられる
。
【００６１】
連結部分及び関連する化学反応は、米国特許第５，４４６，０９０号（ハリス
（Harris）ら、１９９５年８月２９日発行）；米国特許第５，１７１，２６４号
（メリル（Merrill）、１９９２年１２月１５日発行）；米国特許第５，１６２
，４３０号（リー（Rhee）ら、１９９２年１１月１０日発行）；米国特許第５，
１５３，２６５号（シャドル（Shadle）ら、１９９２年１０月６日発行）；米国
特許第５，１２２，６１４号（ザリプスキー（Zalipsky）、１９９２年６月１６
日発行）；グッドソン（Goodson）らの「グリコシル化部位における組換えイン
ターロイキン−２の部位特異的ペグ化」（Biotechnology、第８巻、４号の３４
３〜３４６ページ（１９９０年））；コーガン（Kogan）の「選択的タンパク質
修飾に好適な置換メトキシ−ポリ（エチレングリコール）誘導体の合成」（Synt
hetic Communications、第２２巻の２４１７〜２４２４ページ（１９９２年）；
及びイシイ（Ishii）らの「スクシンイミド環の状態の蛍光に対する影響及びピ
レンマレイミド標識ａａ−トロポミオシンの構造特性」（Biophysical Journal
、第５０巻の７５〜８０ページ（１９８６年））に開示されている。最も好まし
い連結部分は、置換（例えば、アルキル）又は非置換のスクシンイミドである。
（Harris）ら、１９９５年８月２９日発行）；米国特許第５，１７１，２６４号
（メリル（Merrill）、１９９２年１２月１５日発行）；米国特許第５，１６２
，４３０号（リー（Rhee）ら、１９９２年１１月１０日発行）；米国特許第５，
１５３，２６５号（シャドル（Shadle）ら、１９９２年１０月６日発行）；米国
特許第５，１２２，６１４号（ザリプスキー（Zalipsky）、１９９２年６月１６
日発行）；グッドソン（Goodson）らの「グリコシル化部位における組換えイン
ターロイキン−２の部位特異的ペグ化」（Biotechnology、第８巻、４号の３４
３〜３４６ページ（１９９０年））；コーガン（Kogan）の「選択的タンパク質
修飾に好適な置換メトキシ−ポリ（エチレングリコール）誘導体の合成」（Synt
hetic Communications、第２２巻の２４１７〜２４２４ページ（１９９２年）；
及びイシイ（Ishii）らの「スクシンイミド環の状態の蛍光に対する影響及びピ
レンマレイミド標識ａａ−トロポミオシンの構造特性」（Biophysical Journal
、第５０巻の７５〜８０ページ（１９８６年））に開示されている。最も好まし
い連結部分は、置換（例えば、アルキル）又は非置換のスクシンイミドである。
【００６２】
更なる例として、以下の非限定的試薬を利用して連結部分を形成してもよい：
Ｎ−［アルファ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル；Ｎ−５−ア
ジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド；ビスマレイミドヘキサン；
Ｎ−［ベータ−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル；ビス［２
−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）−エチル］スルホン；ビス［ス
ルホスクシンイミジル］スベレート；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン；ジメチルアジピメート・２ＨＣｌ；ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ
；ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ；ジスクシンイミジルグルタレート；ジス
クシンイミジルスベレート；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸；
Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘ
キサノエート；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオネー
ト；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート
；スクシンイミジル−６−［（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノ
エート］；ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシカルボニロキシ）−エチ
ル］スルホン；Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリロキシ］スルホスクシンイミド
エステル；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート；
Ｎ−［カッパ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステ
ル；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル
；スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］ヘキサノエート；スル
ホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート；スルホ
スクシンイミジル６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノ
エート；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−アジドフェニル］ブチレート；スル
ホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート；スルホスクシ
ンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト；及びスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート
。このような試薬はそれぞれ、イリノイ州ロックフォードのピアースケミカル社
（Pierce Chemical Co.）から商業的に入手可能である。
Ｎ−［アルファ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル；Ｎ−５−ア
ジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド；ビスマレイミドヘキサン；
Ｎ−［ベータ−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル；ビス［２
−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）−エチル］スルホン；ビス［ス
ルホスクシンイミジル］スベレート；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン；ジメチルアジピメート・２ＨＣｌ；ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ
；ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ；ジスクシンイミジルグルタレート；ジス
クシンイミジルスベレート；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸；
Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘ
キサノエート；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオネー
ト；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート
；スクシンイミジル−６−［（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノ
エート］；ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシカルボニロキシ）−エチ
ル］スルホン；Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリロキシ］スルホスクシンイミド
エステル；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート；
Ｎ−［カッパ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステ
ル；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル
；スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］ヘキサノエート；スル
ホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート；スルホ
スクシンイミジル６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノ
エート；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−アジドフェニル］ブチレート；スル
ホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート；スルホスクシ
ンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト；及びスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート
。このような試薬はそれぞれ、イリノイ州ロックフォードのピアースケミカル社
（Pierce Chemical Co.）から商業的に入手可能である。
【００６３】任意の部分
プロテアーゼ抱合体はさらに、本明細書では例示されていないか、それと同等
のプロテアーゼの他の残基に、付加部分とは関係のないクリップ部位保護位置で
結合する（例えば）１又はそれより多くの小型分子、ポリペプチド、及び／又は
ポリマーを含む１又はそれより多くの他の化学構造を含有してもよい（ここでは
「補足部分」という）。補足部分には、本明細書の上記で記載されたようなポリ
ペプチド部分、ポリマー部分、及び連結部分が挙げられてもよい。さらに、例え
ば、約１００ Ｄａ〜約 ５０００ Ｄａ、好ましくは約１００ Ｄａ〜約２０００ Ｄａ、さらに好ましくは約１００ Ｄａ〜約１０００ Ｄａ、一層さらに好まし
くは約１００ Ｄａ〜約７５０ Ｄａ、及び最も好ましくは約３００ Ｄａの分子
量を有する１又はそれより多くのポリマー（最も好ましくはポリエチレングリコ
ール）が、本明細書で例示されるもの以外の残基にて本明細書のプロテアーゼ部
分に共有結合されてもよい。かかるポリマー部分は、本明細書で記載されるよう
な技術及び当業界で公知の技術を用いて（本明細書で記載されるような連結部分
を介することを含めて）プロテアーゼ部分のいかなる位置にても本明細書のプロ
テアーゼ部分に直接結合してもよい。この任意型のポリマーの抱合の非限定例は
、ＷＯ第９９／００８４９号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月７日公開
、ノボノルディスクＡ／Ｓ）に述べられている。
のプロテアーゼの他の残基に、付加部分とは関係のないクリップ部位保護位置で
結合する（例えば）１又はそれより多くの小型分子、ポリペプチド、及び／又は
ポリマーを含む１又はそれより多くの他の化学構造を含有してもよい（ここでは
「補足部分」という）。補足部分には、本明細書の上記で記載されたようなポリ
ペプチド部分、ポリマー部分、及び連結部分が挙げられてもよい。さらに、例え
ば、約１００ Ｄａ〜約 ５０００ Ｄａ、好ましくは約１００ Ｄａ〜約２０００ Ｄａ、さらに好ましくは約１００ Ｄａ〜約１０００ Ｄａ、一層さらに好まし
くは約１００ Ｄａ〜約７５０ Ｄａ、及び最も好ましくは約３００ Ｄａの分子
量を有する１又はそれより多くのポリマー（最も好ましくはポリエチレングリコ
ール）が、本明細書で例示されるもの以外の残基にて本明細書のプロテアーゼ部
分に共有結合されてもよい。かかるポリマー部分は、本明細書で記載されるよう
な技術及び当業界で公知の技術を用いて（本明細書で記載されるような連結部分
を介することを含めて）プロテアーゼ部分のいかなる位置にても本明細書のプロ
テアーゼ部分に直接結合してもよい。この任意型のポリマーの抱合の非限定例は
、ＷＯ第９９／００８４９号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月７日公開
、ノボノルディスクＡ／Ｓ）に述べられている。
【００６４】
製造方法
クリップ部位保護位置（又は該部分のいかなる他の位置）の１又はそれより多
くで置換を有するプロテアーゼ部分は、親型アミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列に変異することによって調製される。かかる方法は当業者に周知であり
；かかる方法の１つの非限定例を以下に述べる：
くで置換を有するプロテアーゼ部分は、親型アミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列に変異することによって調製される。かかる方法は当業者に周知であり
；かかる方法の１つの非限定例を以下に述べる：
【００６５】
野生型サブチリシンＢＰＮ’遺伝子を含有するファージミド（プラスミドベク
ター）（ｐＳＳ−５）［Ｃ・ミッチソン（Mitchison,C.）及びＪ・Ａ・ウエルズ
（J.A. Wells）の「サブチリシンＢＰＮ’におけるジスルフィド結合のタンパク
質工学（Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN'）」、
バイオケミストリー（Biochemistry）第２８巻の４８０７〜４８１５ページ（１
９８９年）］を、大腸菌ｄｕｔ−ｕｎｇ株ＣＪ２３６において形質転換させ、Ｖ
ＣＳＭヘルパーファージを用いて１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型を作成する［ク
ンケル（Kunkel）らの「迅速且つ有効な表現型選択なしでの部位特異的変異誘発
（Rapid and Efficient Site−Specific Mutagenesis Without Phenotypic Sele
ction）」、Methods in Enzymolog、第１５４巻の３６７〜３８２ページ（１９
８７年）で、ユッケンバーグ（Yuckenberg）らにより「ウラシル含有ＤＮＡとフ
ァージミドベクターを用いた部位特異的in vitro変異誘発（Site−Directed in
vitro Mutagenesis Using Uracil−Containing DNA and Phagemid Vectors）」
（Directed Mutagenesis-A Practical Approachの２７〜４８ページ、Ｍ．Ｊ．
マクファーソン（McPherson,M. J.）編、１９９１年）で改変された］。Ｍ．Ｊ
．ゾラー（Zoller,M.J.）及びＭ．スミス（M.Smith）の「オリゴヌクレオチド−
Ｍ１３由来のベクターを用いた部位特異的変異誘発：いかなるＤＮＡ断片におい
ても点変異を誘発する有効且つ一般的な方法（Oligonucleotide−Directed Muta
genesis Using M１３−Derived Vectors： An Efficient and General Procedur
e for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA）」（核酸
リサーチ（Nucleic Acids Research）の第１０巻、６４８７〜６５００ページ（
１９８２年））の方法から改変されたプライマーによる部位特異的変異誘発を用
いて、すべての変異体を作成する（本質的には上記ユッケンバーグ（Yuckenberg
）らの著により提示されたように）。
ター）（ｐＳＳ−５）［Ｃ・ミッチソン（Mitchison,C.）及びＪ・Ａ・ウエルズ
（J.A. Wells）の「サブチリシンＢＰＮ’におけるジスルフィド結合のタンパク
質工学（Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN'）」、
バイオケミストリー（Biochemistry）第２８巻の４８０７〜４８１５ページ（１
９８９年）］を、大腸菌ｄｕｔ−ｕｎｇ株ＣＪ２３６において形質転換させ、Ｖ
ＣＳＭヘルパーファージを用いて１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型を作成する［ク
ンケル（Kunkel）らの「迅速且つ有効な表現型選択なしでの部位特異的変異誘発
（Rapid and Efficient Site−Specific Mutagenesis Without Phenotypic Sele
ction）」、Methods in Enzymolog、第１５４巻の３６７〜３８２ページ（１９
８７年）で、ユッケンバーグ（Yuckenberg）らにより「ウラシル含有ＤＮＡとフ
ァージミドベクターを用いた部位特異的in vitro変異誘発（Site−Directed in
vitro Mutagenesis Using Uracil−Containing DNA and Phagemid Vectors）」
（Directed Mutagenesis-A Practical Approachの２７〜４８ページ、Ｍ．Ｊ．
マクファーソン（McPherson,M. J.）編、１９９１年）で改変された］。Ｍ．Ｊ
．ゾラー（Zoller,M.J.）及びＭ．スミス（M.Smith）の「オリゴヌクレオチド−
Ｍ１３由来のベクターを用いた部位特異的変異誘発：いかなるＤＮＡ断片におい
ても点変異を誘発する有効且つ一般的な方法（Oligonucleotide−Directed Muta
genesis Using M１３−Derived Vectors： An Efficient and General Procedur
e for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA）」（核酸
リサーチ（Nucleic Acids Research）の第１０巻、６４８７〜６５００ページ（
１９８２年））の方法から改変されたプライマーによる部位特異的変異誘発を用
いて、すべての変異体を作成する（本質的には上記ユッケンバーグ（Yuckenberg
）らの著により提示されたように）。
【００６６】
３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社（Applied B
iosystems Inc.））を用いてオリゴヌクレオチドを作成する。変異誘発反応産物
を、大腸菌株ＭＭ２９４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）大腸菌３３６２５）中に形質転換させる。変
異体はすべてＤＮＡ配列決定により確認し、単離したＤＮＡを、バチルス サブ
チリス（Bacillus subtilis）の発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（サウンダ
ーズ（Saunders）らの「ヒト副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のバチルス
サブチリス（Bacillus subtilis）からの分泌のためのシグナル配列開裂部位の
最適化（Optimization of the Signal−Sequence Cleavage Site for Secretion
from Bacillus subtilis of a ３４−amino acid Fragment of Human Parathyr
oid Hormone）」、遺伝子（Gene）第１０２巻の２７７〜２８２ページ（１９９
１年）及びヤン（Yang）らの「バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）の
ニュートラルプロテアーゼ遺伝子のクローニング及びin vitro誘導欠失変異を創
るためのクローニングした遺伝子の使用（Cloning of the Neutral Protease Ge
ne of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create an in v
itro−Derived Deletion Mutation）」、Journal of Bacteriology、第１６０巻
の１５〜２１ページ（１９８４年））。
iosystems Inc.））を用いてオリゴヌクレオチドを作成する。変異誘発反応産物
を、大腸菌株ＭＭ２９４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）大腸菌３３６２５）中に形質転換させる。変
異体はすべてＤＮＡ配列決定により確認し、単離したＤＮＡを、バチルス サブ
チリス（Bacillus subtilis）の発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（サウンダ
ーズ（Saunders）らの「ヒト副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のバチルス
サブチリス（Bacillus subtilis）からの分泌のためのシグナル配列開裂部位の
最適化（Optimization of the Signal−Sequence Cleavage Site for Secretion
from Bacillus subtilis of a ３４−amino acid Fragment of Human Parathyr
oid Hormone）」、遺伝子（Gene）第１０２巻の２７７〜２８２ページ（１９９
１年）及びヤン（Yang）らの「バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）の
ニュートラルプロテアーゼ遺伝子のクローニング及びin vitro誘導欠失変異を創
るためのクローニングした遺伝子の使用（Cloning of the Neutral Protease Ge
ne of Bacillus subtilis and the Use of the Cloned Gene to Create an in v
itro−Derived Deletion Mutation）」、Journal of Bacteriology、第１６０巻
の１５〜２１ページ（１９８４年））。
【００６７】
発酵培養は以下のとおりである。対象のプロテアーゼを含有するバチルス サ
ブチリス（Bacillus subtilis）細胞（ＰＧ６３２）を、１０ｇ／Ｌのグルコー
スを含有するＬＢブロス培地１リットル中で、中期対数増殖期まで増殖させ、総
容量９リットルのバイオスタットＣ発酵培養槽（ペンシルベニア州、アレンタウ
ンのブラウンバイオテック社（Braun Biotech、Inc.））に接種する。発酵培地
は、酵母抽出物、カゼイン加水分解物、可溶性−部分加水分解スターチ（マーチ
ン(Maltrin)Ｍ−２５０）、発泡抑制剤、緩衝液、及び微量ミネラル（「桿菌の
生物学：産業への応用（Biology of Bacilli： Applications to Industry）」
、Ｒ・Ｈ・ドイ（Doi,R.H.）及びＭ・マックグロウリン（M. McGloughlin）編、
（１９９２年）を参照のこと）を含有する。発酵培養が行われている間、ブロス
培地はｐＨ７．５を一定に保つ。変異誘発したプラスミドの抗生物質選抜のため
にカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加える。３７℃にてＡ600が約６０になる
まで１８時間、細胞を増殖させ生成物を回収する。
ブチリス（Bacillus subtilis）細胞（ＰＧ６３２）を、１０ｇ／Ｌのグルコー
スを含有するＬＢブロス培地１リットル中で、中期対数増殖期まで増殖させ、総
容量９リットルのバイオスタットＣ発酵培養槽（ペンシルベニア州、アレンタウ
ンのブラウンバイオテック社（Braun Biotech、Inc.））に接種する。発酵培地
は、酵母抽出物、カゼイン加水分解物、可溶性−部分加水分解スターチ（マーチ
ン(Maltrin)Ｍ−２５０）、発泡抑制剤、緩衝液、及び微量ミネラル（「桿菌の
生物学：産業への応用（Biology of Bacilli： Applications to Industry）」
、Ｒ・Ｈ・ドイ（Doi,R.H.）及びＭ・マックグロウリン（M. McGloughlin）編、
（１９９２年）を参照のこと）を含有する。発酵培養が行われている間、ブロス
培地はｐＨ７．５を一定に保つ。変異誘発したプラスミドの抗生物質選抜のため
にカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加える。３７℃にてＡ600が約６０になる
まで１８時間、細胞を増殖させ生成物を回収する。
【００６８】
以下の工程を介して発酵培養ブロスを回収し、純粋なプロテアーゼを得る。ブ
ロスは、０．１６μｍ膜に対する接線フロー（tangential flow）によってバチ
ルス サブチリス（Bacillus subtilis）細胞を除く。８０００の分子量を除く
膜による限外ろ過によって細胞のないブロスを濃縮する。濃縮ＭＥＳ緩衝液（２
−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）によってｐＨを５．５に調整する。
ＳセファロースによるＮａＣｌ勾配溶出の陽イオン交換クロマトグラフィーによ
ってプロテアーゼをさらに精製する。スコープス（Scopes、R.K.）の「タンパク
質精製の原理と実践（Protein Purification Principles and Practice）」［Sp
ringer−Verlag、New York １９８４年］を参照のこと。
ロスは、０．１６μｍ膜に対する接線フロー（tangential flow）によってバチ
ルス サブチリス（Bacillus subtilis）細胞を除く。８０００の分子量を除く
膜による限外ろ過によって細胞のないブロスを濃縮する。濃縮ＭＥＳ緩衝液（２
−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）によってｐＨを５．５に調整する。
ＳセファロースによるＮａＣｌ勾配溶出の陽イオン交換クロマトグラフィーによ
ってプロテアーゼをさらに精製する。スコープス（Scopes、R.K.）の「タンパク
質精製の原理と実践（Protein Purification Principles and Practice）」［Sp
ringer−Verlag、New York １９８４年］を参照のこと。
【００６９】
ｐＮＡアッセイ（デルマー（DelMar）らによるAnalytical Biochemistryの第
９９、巻３１６〜３２０ページ（１９７９年））を用いて、勾配溶出の間に回収
された分画について活性のあるプロテアーゼ濃度を測定する。このアッセイは、
プロテアーゼが可溶性合成基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリ
ン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリン（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解
するとき、ｐ−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応から
の黄色の生成物の率を分光光度計４１０ｎｍで測定し、活性のあるプロテアーゼ
部分の濃度に比例させる。さらに、２８０ｎｍの吸光度測定を用いて、総タンパ
ク質濃度を決定する。活性のあるプロテアーゼ／総タンパク質の比によってプロ
テアーゼの純度が判り、それを用いて分画を同定してストック溶液のためにプー
ルする。
９９、巻３１６〜３２０ページ（１９７９年））を用いて、勾配溶出の間に回収
された分画について活性のあるプロテアーゼ濃度を測定する。このアッセイは、
プロテアーゼが可溶性合成基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリ
ン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリン（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解
するとき、ｐ−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応から
の黄色の生成物の率を分光光度計４１０ｎｍで測定し、活性のあるプロテアーゼ
部分の濃度に比例させる。さらに、２８０ｎｍの吸光度測定を用いて、総タンパ
ク質濃度を決定する。活性のあるプロテアーゼ／総タンパク質の比によってプロ
テアーゼの純度が判り、それを用いて分画を同定してストック溶液のためにプー
ルする。
【００７０】
保存中のプロテアーゼの自己融解を避けるために、クロマトグラフィーカラム
から得たプールした分画に等質量のプロピレングリコールを加える。精製手順の
終了時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動）によってストックのプロテアーゼの純度をチェックし、トリプシン阻
害剤II型−Ｔ（七面鳥の卵白（ミズーリ州、セントルイスのシグマケミカル社）
を用いて活性部位滴定法により絶対的な酵素濃度を測定する。
から得たプールした分画に等質量のプロピレングリコールを加える。精製手順の
終了時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動）によってストックのプロテアーゼの純度をチェックし、トリプシン阻
害剤II型−Ｔ（七面鳥の卵白（ミズーリ州、セントルイスのシグマケミカル社）
を用いて活性部位滴定法により絶対的な酵素濃度を測定する。
【００７１】
使用のための調製では、セファデックス−Ｇ２５（ニュージャージー州、ピス
カタウエイのファルマシア）サイズ除外カラムからプロテアーゼストック溶液を
溶出してプロピレングリコールを除き、緩衝液を交換する。酵素ストック溶液中
のＭＥＳ緩衝液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ５．５）に交換する。
カタウエイのファルマシア）サイズ除外カラムからプロテアーゼストック溶液を
溶出してプロピレングリコールを除き、緩衝液を交換する。酵素ストック溶液中
のＭＥＳ緩衝液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ５．５）に交換する。
【００７２】
プロテアーゼ抱合体を製造するために、調製されたプロテアーゼとともに、１
又はそれより多くの付加部分による機能化にそれを利用してもよい。付加部分に
対する前駆体（付加部分に対する前駆体は、プロテアーゼ部分に対する前駆体と
反応して、付加部分及びプロテアーゼ部分を含むプロテアーゼ抱合体を形成する
）は好ましくは、活性化されてプロテアーゼ部分に対する前駆体との反応性を高
める。かかる活性化は、当業界で周知である。プロテアーゼ抱合体の調製方法の
非限定例を以下に提供する。
又はそれより多くの付加部分による機能化にそれを利用してもよい。付加部分に
対する前駆体（付加部分に対する前駆体は、プロテアーゼ部分に対する前駆体と
反応して、付加部分及びプロテアーゼ部分を含むプロテアーゼ抱合体を形成する
）は好ましくは、活性化されてプロテアーゼ部分に対する前駆体との反応性を高
める。かかる活性化は、当業界で周知である。プロテアーゼ抱合体の調製方法の
非限定例を以下に提供する。
【００７３】
実施例１
【００７４】
【化４】
【００７５】
以下の方法を用いて上記の図に従って、クリップ部位保護位置の１つにてシス
テイン残基を含むプロテアーゼをポリマー部分に結合する（その際、「Ｐ」は、
システイン置換から生じる、チオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、ｎは
ポリエチレングリコールの繰り返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）であ
る）。
テイン残基を含むプロテアーゼをポリマー部分に結合する（その際、「Ｐ」は、
システイン置換から生じる、チオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、ｎは
ポリエチレングリコールの繰り返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）であ
る）。
【００７６】
２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び１６１位置のセリンに対す
るシステインの置換をもつサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。リン酸緩
衝液（ｐＨ５．５）中にて変異型の濃度をおよそ２ｍｇ／ｍＬとする。希水酸化
ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型に対して２５：
１の過剰量で、変異型をモノメチルポリエチレングリコールマレイミドと混合す
る。室温にて１時間混合した後、希リン酸で混合物のｐＨを５．５に調整し、分
子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く。濃縮物は精
製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。
るシステインの置換をもつサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。リン酸緩
衝液（ｐＨ５．５）中にて変異型の濃度をおよそ２ｍｇ／ｍＬとする。希水酸化
ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型に対して２５：
１の過剰量で、変異型をモノメチルポリエチレングリコールマレイミドと混合す
る。室温にて１時間混合した後、希リン酸で混合物のｐＨを５．５に調整し、分
子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く。濃縮物は精
製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。
【００７７】
実施例２
【００７８】
【化５】
【００７９】
以下の方法を用いて上記の図に従って、クリップ部位保護位置の１つにてシス
テイン残基を含むプロテアーゼをポリマー部分に結合する（その際、「Ｐ」は、
システイン置換から生じる、チオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、ｎは
各ポリエチレングリコールの繰り返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）で
ある）。
テイン残基を含むプロテアーゼをポリマー部分に結合する（その際、「Ｐ」は、
システイン置換から生じる、チオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、ｎは
各ポリエチレングリコールの繰り返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）で
ある）。
【００８０】
２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び２６１位置のフェニルアラ
ニンに対するシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する
。リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中にて変異型の濃度をおよそ２ｍｇ／ｍＬとする
。希水酸化ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型に対
して２５：１の過剰量で、変異型をジメチルポリエチレングリコールマレイミド
と混合する。室温にて１時間混合した後、希リン酸で混合物のｐＨを５．５に調
整し、分子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く。濃
縮物は精製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。
ニンに対するシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する
。リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中にて変異型の濃度をおよそ２ｍｇ／ｍＬとする
。希水酸化ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型に対
して２５：１の過剰量で、変異型をジメチルポリエチレングリコールマレイミド
と混合する。室温にて１時間混合した後、希リン酸で混合物のｐＨを５．５に調
整し、分子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く。濃
縮物は精製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。
【００８１】
実施例３
スクシンイミドで保護されたポリマーを１又はそれより多くのクリップ部位保
護位置において選択的にリジンに結合する（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、リジ
ンアミン基を除いたプロテアーゼ部分を表す）：
護位置において選択的にリジンに結合する（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、リジ
ンアミン基を除いたプロテアーゼ部分を表す）：
【００８２】
【化６】
【００８３】
実施例４
カルボジイミドで保護されたポリマーを１又はそれより多くのクリップ部位保
護位置において選択的にリジンに結合する（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、リジ
ンアミン基を除いたプロテアーゼ部分を表し、及びＸ並びにＸ’は、カルボジイ
ミド部分、例えば、アルキルを含む側鎖である）：
護位置において選択的にリジンに結合する（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、リジ
ンアミン基を除いたプロテアーゼ部分を表し、及びＸ並びにＸ’は、カルボジイ
ミド部分、例えば、アルキルを含む側鎖である）：
【００８４】
【化７】
【００８５】
実施例５
【００８６】
【化８】
【００８７】
クリップ部位保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼ部分を以
下の方法を用いてアルキルマレイミドと結合する（その際、「Ｐ」は、システイ
ン置換から生じるチオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、「Ｒ」はアルキ
ル基である）。この実施例では、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ不在であり、連結部分は
アルキルマレイミドに由来する。
下の方法を用いてアルキルマレイミドと結合する（その際、「Ｐ」は、システイ
ン置換から生じるチオール基を除いたプロテアーゼ部分を表し、「Ｒ」はアルキ
ル基である）。この実施例では、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ不在であり、連結部分は
アルキルマレイミドに由来する。
【００８８】
２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び１６３位置のセリンに対す
るシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬ
の変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）中で約１ｍｇ／ｍＬの
濃度にて調製する。この溶液に対して、１．５当量のアルキルマレイミド（例え
ば、メチルマレイミド）を溶液に加える。室温にて約１時間、溶液を穏かに混合
する。生じたプロテアーゼ抱合体を常法にて溶液から得る。
るシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬ
の変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）中で約１ｍｇ／ｍＬの
濃度にて調製する。この溶液に対して、１．５当量のアルキルマレイミド（例え
ば、メチルマレイミド）を溶液に加える。室温にて約１時間、溶液を穏かに混合
する。生じたプロテアーゼ抱合体を常法にて溶液から得る。
【００８９】
実施例６
【００９０】
【化９】
【００９１】
クリップ部位保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼ部分が以
下の方法を用いてダイマーを形成する（その際、「Ｐ」は、システイン置換から
生じるチオール基を除いたプロテアーゼ部分を表す）。この実施例では、プロテ
アーゼ部分及びポリペプチド部分は同等である（及びＸは不在である）。
下の方法を用いてダイマーを形成する（その際、「Ｐ」は、システイン置換から
生じるチオール基を除いたプロテアーゼ部分を表す）。この実施例では、プロテ
アーゼ部分及びポリペプチド部分は同等である（及びＸは不在である）。
【００９２】
２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び１６３位置のセリンに対す
るシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬ
の変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．６）中で約１ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度にて調製する。室温にて約１時間、溶液中に酸素を穏かに泡立てて通気
し、所望のプロテアーゼ抱合体ダイマーを形成する。生じたプロテアーゼ抱合体
を常法にて溶液から得る。
るシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬ
の変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ８．６）中で約１ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度にて調製する。室温にて約１時間、溶液中に酸素を穏かに泡立てて通気
し、所望のプロテアーゼ抱合体ダイマーを形成する。生じたプロテアーゼ抱合体
を常法にて溶液から得る。
【００９３】
分析方法
酵素活性及び免疫原性反応について、双方とも当業者には既知の以下の方法を
用いて、本プロテアーゼ抱合体を調べてもよい。別の方法として当業界でよく知
られているその他の方法を用いてもよい。
用いて、本プロテアーゼ抱合体を調べてもよい。別の方法として当業界でよく知
られているその他の方法を用いてもよい。
【００９４】
プロテアーゼ抱合体の活性
当業界でよく知られている方法によって本発明のプロテアーゼ抱合体のプロテ
アーゼ活性をアッセイしてもよい。本明細書では２つのかかる方法を以下に述べ
る：
アーゼ活性をアッセイしてもよい。本明細書では２つのかかる方法を以下に述べ
る：
【００９５】皮膚薄片活性法
スコッチ（登録商標）＃３７５０Ｇテープを用いて、被験者の脚からヒトの皮
膚薄片を、テープが薄片で実質的に不透明になるまで剥ぎ取る。次いで１インチ
と１インチの四角にテープを切断し、取り除けて置く。１０ｍｍ×３５ｍｍのペ
トリ皿にて、２ｍＬの０．７５ｍｇ／ｍＬの対照酵素（例えば、サブチリシンＢ
ＰＮ’）又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝
液（ｐＨ５．５）に加える。１ｍＬの２．５％ラウリン酸ナトリウム（ｐＨ８．
６）をこの溶液に加える。平板振盪器上にて溶液を緩やかに混合する。緩やかに
混合しながら１０分間、予め調製した四角のテープを溶液中に浸す（薄片面を上
）。次いで水道水にて１５秒間、四角のテープを緩やかにすすぐ。ステベネル(S
tevenel)・ブルー染色（３ｍＬ、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co．、ミ
ズーリ州セントルイス）から商業的に入手可能）をきれいなペトリ皿にピペット
で載せる。緩やかに混合しながら、すすいだ四角のテープを染色液中に３分間置
く（薄片面を上）。四角のテープを染色液から出し、３００ｍＬの蒸留水の２つ
のビーカーにて、すすぎ当り１５秒間すすぐ。四角のテープを風乾させる。対照
酵素から得られた四角のテープとプロテアーゼ抱合体から得られた四角のテープ
との間の色強度を肉眼又は色度計で比較する。対照酵素の四角テープに比して、
低い色強度を示すプロテアーゼ抱合体の四角テープが、より高い活性を有するプ
ロテアーゼ抱合体であることを示す。
膚薄片を、テープが薄片で実質的に不透明になるまで剥ぎ取る。次いで１インチ
と１インチの四角にテープを切断し、取り除けて置く。１０ｍｍ×３５ｍｍのペ
トリ皿にて、２ｍＬの０．７５ｍｇ／ｍＬの対照酵素（例えば、サブチリシンＢ
ＰＮ’）又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を０．０１ＭのＫＨ2ＰＯ4緩衝
液（ｐＨ５．５）に加える。１ｍＬの２．５％ラウリン酸ナトリウム（ｐＨ８．
６）をこの溶液に加える。平板振盪器上にて溶液を緩やかに混合する。緩やかに
混合しながら１０分間、予め調製した四角のテープを溶液中に浸す（薄片面を上
）。次いで水道水にて１５秒間、四角のテープを緩やかにすすぐ。ステベネル(S
tevenel)・ブルー染色（３ｍＬ、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co．、ミ
ズーリ州セントルイス）から商業的に入手可能）をきれいなペトリ皿にピペット
で載せる。緩やかに混合しながら、すすいだ四角のテープを染色液中に３分間置
く（薄片面を上）。四角のテープを染色液から出し、３００ｍＬの蒸留水の２つ
のビーカーにて、すすぎ当り１５秒間すすぐ。四角のテープを風乾させる。対照
酵素から得られた四角のテープとプロテアーゼ抱合体から得られた四角のテープ
との間の色強度を肉眼又は色度計で比較する。対照酵素の四角テープに比して、
低い色強度を示すプロテアーゼ抱合体の四角テープが、より高い活性を有するプ
ロテアーゼ抱合体であることを示す。
【００９６】染色コラーゲン活性法
ｐＨを８．６にするために０．０１ＭのＣａＣｌ2を含有する５０ｍＬの０．
１Ｍトリス緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）と、０．５ｇの
アゾコール（アゾ染料を含浸したコラーゲン、ミズーリ州、セントルイスのシグ
マケミカル社から商業的に入手可能）とを混合する。平板振盪器で緩やかに混合
しながら２５℃にてこの混合物をインキュベートする。０．２ミクロンのシリン
ジ型フィルターで２ｍＬの混合物をろ過し、分光光度計の５２０ｎｍ〜０にて混
合物の吸収を読み取る。１ｐｐｍの対照酵素（例えば、サブチリシンＢＰＮ’）
又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を、残りの４８ｍＬのトリス／アゾコー
ル混合物に加える。２分ごとに１０分間、対照／プロテアーゼ抱合体を含有する
２ｍＬの溶液を０．２ミクロンのシリンジ型フィルターでろ過する。各ろ過され
た試料について、５２０ｎｍでの吸収を即座に読み取る。結果を時間に対してプ
ロットする。対照及び試験抱合体の傾きが、試料の相対的活性を示す。傾きが高
ければ高い活性を示す。試験プロテアーゼ抱合体の活性（傾き）を対照活性（傾
き）のパーセントとして表してもよい。
１Ｍトリス緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）と、０．５ｇの
アゾコール（アゾ染料を含浸したコラーゲン、ミズーリ州、セントルイスのシグ
マケミカル社から商業的に入手可能）とを混合する。平板振盪器で緩やかに混合
しながら２５℃にてこの混合物をインキュベートする。０．２ミクロンのシリン
ジ型フィルターで２ｍＬの混合物をろ過し、分光光度計の５２０ｎｍ〜０にて混
合物の吸収を読み取る。１ｐｐｍの対照酵素（例えば、サブチリシンＢＰＮ’）
又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を、残りの４８ｍＬのトリス／アゾコー
ル混合物に加える。２分ごとに１０分間、対照／プロテアーゼ抱合体を含有する
２ｍＬの溶液を０．２ミクロンのシリンジ型フィルターでろ過する。各ろ過され
た試料について、５２０ｎｍでの吸収を即座に読み取る。結果を時間に対してプ
ロットする。対照及び試験抱合体の傾きが、試料の相対的活性を示す。傾きが高
ければ高い活性を示す。試験プロテアーゼ抱合体の活性（傾き）を対照活性（傾
き）のパーセントとして表してもよい。
【００９７】
免疫原性に関するマウスの鼻内試験
当業界で公知の方法又は本明細書の以下で示す免疫原性に関するマウスの鼻内
試験を用いて、本発明のプロテアーゼ抱合体の免疫原性の可能性を測定してもよ
い。この試験はロビンソン（Robinson）らの「マウスにおけるサブチリシン・カ
ールスバーグ（アルカラーゼ）に対する特異的抗体反応：鼻内暴露モデルの開発
（Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg（Alcalase）in Mice
：Development of an Intranasal Exposure Model）」（Fundamental and Appri
ed Toxicologyの第３４巻，１５〜２４ページ（１９９６年））及びロビンソン
（Robinson）らの「界面活性酵素に対するアレルギーの可能性を測定するための
マウス鼻内試験（ＭＩＮＴ）の使用：モルモットの気管内試験（ＧＰＩＴ）との
比較（Use of the Mouse Intranasal Test（MINT）to Determine the Allergeni
c Potency of Detergent Enzymes：Comparison to the Guinea Pig Intratrache
al（GPIT）Test）」（Toxicological Scienceの第４３巻、３９〜４６ページ（
１９９８年））で記載されたアッセイに類似しており、双方のアッセイとも本明
細書で以下に述べる試験に代えて利用されてもよい。
試験を用いて、本発明のプロテアーゼ抱合体の免疫原性の可能性を測定してもよ
い。この試験はロビンソン（Robinson）らの「マウスにおけるサブチリシン・カ
ールスバーグ（アルカラーゼ）に対する特異的抗体反応：鼻内暴露モデルの開発
（Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg（Alcalase）in Mice
：Development of an Intranasal Exposure Model）」（Fundamental and Appri
ed Toxicologyの第３４巻，１５〜２４ページ（１９９６年））及びロビンソン
（Robinson）らの「界面活性酵素に対するアレルギーの可能性を測定するための
マウス鼻内試験（ＭＩＮＴ）の使用：モルモットの気管内試験（ＧＰＩＴ）との
比較（Use of the Mouse Intranasal Test（MINT）to Determine the Allergeni
c Potency of Detergent Enzymes：Comparison to the Guinea Pig Intratrache
al（GPIT）Test）」（Toxicological Scienceの第４３巻、３９〜４６ページ（
１９９８年））で記載されたアッセイに類似しており、双方のアッセイとも本明
細書で以下に述べる試験に代えて利用されてもよい。
【００９８】
体重約１８〜約２０グラムのメスＢＤＦ１マウス（ミシガン州、ポーテージ、
チャールズリバーラボラトリーズ）を試験に利用する。投与の１週間前にマウス
を検疫する。湿度（３０〜７０％）、温度（６７〜７７°Ｆ（１９．４〜２５．
０℃））及び１２時間の明暗サイクルを制御した飼育室で木製チップを入れたケ
ージにてマウスを飼育する。マウスにはプリナ(Purina)（登録商標）マウス用餌
（インディアナ州、リッチモンド、プリナミル）及び水を自由摂取させる。
チャールズリバーラボラトリーズ）を試験に利用する。投与の１週間前にマウス
を検疫する。湿度（３０〜７０％）、温度（６７〜７７°Ｆ（１９．４〜２５．
０℃））及び１２時間の明暗サイクルを制御した飼育室で木製チップを入れたケ
ージにてマウスを飼育する。マウスにはプリナ(Purina)（登録商標）マウス用餌
（インディアナ州、リッチモンド、プリナミル）及び水を自由摂取させる。
【００９９】
調べるべき可能性のある抗原（陽性対照としてのサブチリシンＢＰＮ’又は本
発明のプロテアーゼ抱合体のいずれか）を、５匹１群のマウスに投与する。投与
に先だって、ケタセット(Ketaset)（８８．８ｍｇ／ｋｇ）及びロンプン(Rompun
)（６．６７ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内（i.p.）注射することによりマウス
を麻酔する。麻酔した動物を手のひらで保持し、裏返して、緩衝液（０．０１Ｍ
のＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ５．５）中の５ｍＬのプロテアーゼを鼻内に投与する。各群
は同一投与量を与えられるが、種々の投与量を試してもよい。投与溶液は、各鼻
孔の外に穏かに置きマウスに（自発的に）吸入させる。３、１０、１７、及び２
４日目に投与を繰り返す。
発明のプロテアーゼ抱合体のいずれか）を、５匹１群のマウスに投与する。投与
に先だって、ケタセット(Ketaset)（８８．８ｍｇ／ｋｇ）及びロンプン(Rompun
)（６．６７ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内（i.p.）注射することによりマウス
を麻酔する。麻酔した動物を手のひらで保持し、裏返して、緩衝液（０．０１Ｍ
のＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ５．５）中の５ｍＬのプロテアーゼを鼻内に投与する。各群
は同一投与量を与えられるが、種々の投与量を試してもよい。投与溶液は、各鼻
孔の外に穏かに置きマウスに（自発的に）吸入させる。３、１０、１７、及び２
４日目に投与を繰り返す。
【０１００】
２９日目に血清試料を採取する。抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によってマウスの血清
における酵素特異的ＩｇＧ１を測定する。標準ＥＤ50値を用いて、プロテアーゼ
抱合体の免疫原性をサブチリシンＢＰＮ’のそれと比較してもよい。
における酵素特異的ＩｇＧ１を測定する。標準ＥＤ50値を用いて、プロテアーゼ
抱合体の免疫原性をサブチリシンＢＰＮ’のそれと比較してもよい。
【０１０１】
本発明の組成物
本明細書のプロテアーゼ抱合体は、それぞれの親型プロテアーゼに好適ないか
なる適用においても用いることができる。かかる例の１つには洗浄組成物が挙げ
られる。本プロテアーゼ抱合体は免疫原性特性が望ましく低下したために、プロ
テアーゼを使用することで、今まで最低限の恩恵しか受けていなかった適用にお
いて使用してもよい。かかる適用の例には、プロテアーゼ抱合体が必然的に哺乳
類の皮膚（特にヒトの皮膚）に接触するようになるもの、例えば、パーソナルケ
ア組成物の使用によるものが挙げられる。
なる適用においても用いることができる。かかる例の１つには洗浄組成物が挙げ
られる。本プロテアーゼ抱合体は免疫原性特性が望ましく低下したために、プロ
テアーゼを使用することで、今まで最低限の恩恵しか受けていなかった適用にお
いて使用してもよい。かかる適用の例には、プロテアーゼ抱合体が必然的に哺乳
類の皮膚（特にヒトの皮膚）に接触するようになるもの、例えば、パーソナルケ
ア組成物の使用によるものが挙げられる。
【０１０２】
洗浄用組成物
プロテアーゼ抱合体は、洗濯用組成物、硬質面洗浄用組成物、食器洗浄用組成
物を含む軽質洗浄用組成物、及び自動食器洗浄洗剤組成物を含むが、これに限定
されない洗浄用組成物で利用されてもよい。
物を含む軽質洗浄用組成物、及び自動食器洗浄洗剤組成物を含むが、これに限定
されない洗浄用組成物で利用されてもよい。
【０１０３】
本明細書の洗浄用組成物は、本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合
体の有効量及び洗浄用組成物用キャリアを含む。
体の有効量及び洗浄用組成物用キャリアを含む。
【０１０４】
本明細書で使用されるとき、「プロテアーゼ抱合体の有効量」などは、具体的
な洗浄用組成物で必要なタンパク質分解活性を達成するのに必要なプロテアーゼ
抱合体の量をいう。かかる有効量は、当業者によって容易に突き止められ、使用
される特定のプロテアーゼ抱合体、洗浄用適用、洗浄用組成物の具体的な組成、
及び液状又は乾燥した（例えば、顆粒、棒状）組成物が必要かどうかなどのよう
な多数の要因に基づく。好ましくは、洗浄用組成物は、約０．０００１％〜約１
０％、さらに好ましくは約０．００１％〜約１％、及び最も好ましくは約０．０
１％〜約０．１％の本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。
プロテアーゼ抱合体が用いられてもよい種々の洗浄用組成物の数例を以下でさら
に詳細に説明する。
な洗浄用組成物で必要なタンパク質分解活性を達成するのに必要なプロテアーゼ
抱合体の量をいう。かかる有効量は、当業者によって容易に突き止められ、使用
される特定のプロテアーゼ抱合体、洗浄用適用、洗浄用組成物の具体的な組成、
及び液状又は乾燥した（例えば、顆粒、棒状）組成物が必要かどうかなどのよう
な多数の要因に基づく。好ましくは、洗浄用組成物は、約０．０００１％〜約１
０％、さらに好ましくは約０．００１％〜約１％、及び最も好ましくは約０．０
１％〜約０．１％の本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。
プロテアーゼ抱合体が用いられてもよい種々の洗浄用組成物の数例を以下でさら
に詳細に説明する。
【０１０５】
本プロテアーゼ抱合体に加えて、本洗浄用組成物はさらに、プロテアーゼ抱合
体に適合する１又はそれより多くの洗浄用組成物材料を含む洗浄用組成物用キャ
リアを含む。用語「洗浄用組成物材料」は、本明細書で使用されるとき、所望の
洗浄用組成物の特定の型及び製品の形状（例えば、液状、顆粒、棒状、スプレー
、スティック、ペースト、ジェル）から選択されるいかなる材料も意味し、材料
は組成物で使用されるプロテアーゼ抱合体にも適合する。洗浄用組成物材料の具
体的な選択は、洗浄されるべき表面素材、使用中の洗浄条件（例えば、洗浄洗剤
の使用を介して）に対する組成物の所望の形態を考慮して、容易に行われる。用
語「適合する」は、本明細書で使用されるとき、洗浄用組成物材料が、通常の使
用状況で所望のようにプロテアーゼが有効でない、そのような程度までプロテア
ーゼ抱合体のタンパク質分解活性を低下させないことを意味する。具体的な洗浄
用組成物材料は、以下に詳細に例示する。
体に適合する１又はそれより多くの洗浄用組成物材料を含む洗浄用組成物用キャ
リアを含む。用語「洗浄用組成物材料」は、本明細書で使用されるとき、所望の
洗浄用組成物の特定の型及び製品の形状（例えば、液状、顆粒、棒状、スプレー
、スティック、ペースト、ジェル）から選択されるいかなる材料も意味し、材料
は組成物で使用されるプロテアーゼ抱合体にも適合する。洗浄用組成物材料の具
体的な選択は、洗浄されるべき表面素材、使用中の洗浄条件（例えば、洗浄洗剤
の使用を介して）に対する組成物の所望の形態を考慮して、容易に行われる。用
語「適合する」は、本明細書で使用されるとき、洗浄用組成物材料が、通常の使
用状況で所望のようにプロテアーゼが有効でない、そのような程度までプロテア
ーゼ抱合体のタンパク質分解活性を低下させないことを意味する。具体的な洗浄
用組成物材料は、以下に詳細に例示する。
【０１０６】
本発明のプロテアーゼ抱合体は、高い泡立ち及び良好な洗浄活性が所望である
種々の洗剤組成物で使用されてもよい。従って、プロテアーゼ抱合体は種々の従
来の成分と共に使用されて、完全に処方された硬質面クリーナー、食器洗浄組成
物、織物洗濯用組成物などを提供することができる。かかる組成物は、液状、顆
粒状、棒状などの形態であってもよい。約３０質量％〜約６０質量％もの界面活
性剤を含有する「濃縮」洗剤としてもかかる組成物を処方することができる。
種々の洗剤組成物で使用されてもよい。従って、プロテアーゼ抱合体は種々の従
来の成分と共に使用されて、完全に処方された硬質面クリーナー、食器洗浄組成
物、織物洗濯用組成物などを提供することができる。かかる組成物は、液状、顆
粒状、棒状などの形態であってもよい。約３０質量％〜約６０質量％もの界面活
性剤を含有する「濃縮」洗剤としてもかかる組成物を処方することができる。
【０１０７】
本明細書の洗浄用組成物は、任意で、及び好ましくは種々の界面活性剤（例え
ば、アニオン系、非イオン系、又は双極性イオン系界面活性剤）を含有してもよ
い。かかる界面活性剤は、典型的には組成物の約５％〜約３５％のレベルで存在
する。
ば、アニオン系、非イオン系、又は双極性イオン系界面活性剤）を含有してもよ
い。かかる界面活性剤は、典型的には組成物の約５％〜約３５％のレベルで存在
する。
【０１０８】
本明細書で有用な界面活性剤の非限定例には、従来のＣ11〜Ｃ18のアルキルベ
ンゼンスルホネート及び第１級並びに無作為アルキルサルフェート、Ｃ10〜Ｃ18 の第２級（２,３）アルキルサルフェートで式が、ＣＨ3(ＣＨ2)x(ＣＨＯＳＯ3)- Ｍ+)ＣＨ3及びＣＨ3(ＣＨ2)y(ＣＨＯＳＯ3 -Ｍ+)ＣＨ2ＣＨ3のもので、その際ｘ
及び（ｙ＋１）が少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、且
つＭが水溶性カチオン、特にはナトリウムであるもの、Ｃ10〜Ｃ18のアルキルア
ルコキシサルフェート（特にＥＯ１〜５のエトキシサルフェート）、Ｃ10〜Ｃ18 のアルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１〜５のエトキシカルボキシ
レート）、Ｃ10〜Ｃ18アルキルポリグリコシド類、及びそれに相当する硫酸ポリ
グリコシド類、Ｃ12〜Ｃ18のスルホン化脂肪酸エステル、Ｃ12〜Ｃ18のアルキル
及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合エトキ
シ／プロポキシ）、Ｃ12〜Ｃ18のベタイン及びスルホベタイン類（「スルタイン
類」）、Ｃ10〜Ｃ18アミンオキシドなどが挙げられる。アルキルアルコキシサル
フェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）が本明
細書で好ましい。処方者の好みによって、アミンオキシド及び／又はベタイン又
はスルタイン界面活性剤との組合せでかかる界面活性剤を使用することも好まし
い。その他の従来の有用な界面活性剤は、標準テキストに一覧されている。特に
有用な界面活性剤には、コナー（Connor）らに付与された米国特許第５，１９４
，６３９号（１９９３年３月１６日発行）で開示されているＣ10〜Ｃ18Ｎ−メチ
ルグルカミドが挙げられる。
ンゼンスルホネート及び第１級並びに無作為アルキルサルフェート、Ｃ10〜Ｃ18 の第２級（２,３）アルキルサルフェートで式が、ＣＨ3(ＣＨ2)x(ＣＨＯＳＯ3)- Ｍ+)ＣＨ3及びＣＨ3(ＣＨ2)y(ＣＨＯＳＯ3 -Ｍ+)ＣＨ2ＣＨ3のもので、その際ｘ
及び（ｙ＋１）が少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、且
つＭが水溶性カチオン、特にはナトリウムであるもの、Ｃ10〜Ｃ18のアルキルア
ルコキシサルフェート（特にＥＯ１〜５のエトキシサルフェート）、Ｃ10〜Ｃ18 のアルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１〜５のエトキシカルボキシ
レート）、Ｃ10〜Ｃ18アルキルポリグリコシド類、及びそれに相当する硫酸ポリ
グリコシド類、Ｃ12〜Ｃ18のスルホン化脂肪酸エステル、Ｃ12〜Ｃ18のアルキル
及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合エトキ
シ／プロポキシ）、Ｃ12〜Ｃ18のベタイン及びスルホベタイン類（「スルタイン
類」）、Ｃ10〜Ｃ18アミンオキシドなどが挙げられる。アルキルアルコキシサル
フェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）が本明
細書で好ましい。処方者の好みによって、アミンオキシド及び／又はベタイン又
はスルタイン界面活性剤との組合せでかかる界面活性剤を使用することも好まし
い。その他の従来の有用な界面活性剤は、標準テキストに一覧されている。特に
有用な界面活性剤には、コナー（Connor）らに付与された米国特許第５，１９４
，６３９号（１９９３年３月１６日発行）で開示されているＣ10〜Ｃ18Ｎ−メチ
ルグルカミドが挙げられる。
【０１０９】
洗剤洗浄用組成物で有用な多種多様なその他の成分は、例えば、その他の有効
成分、キャリア、屈水性誘発物質（hydrotrope）、加工助剤、染料又は色素、及
び液状処方のための溶媒が挙げられ、それらを本発明組成物中に含むことができ
る。泡立ちにおける追加的増加が所望の場合は、Ｃ10〜Ｃ16のアルコルアミドの
ような泡立ち促進剤を、典型的には約１％〜約１０％のレベルで組成物に組み入
れることができる。Ｃ10〜Ｃ14のモノエタノール及びジエタノールアミドはかか
る泡立ち促進剤の典型的な部類を例示する。上述のようなアミンオキシド類、ベ
タイン類及びスルタイン類のような高い泡立ち添加界面活性剤と共にかかる泡立
ち促進剤を使用することも有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4な
どのような可溶性マグネシウム塩も、典型的には約０．１％〜約２％で加えて、
追加の泡立ちを提供することができる。
成分、キャリア、屈水性誘発物質（hydrotrope）、加工助剤、染料又は色素、及
び液状処方のための溶媒が挙げられ、それらを本発明組成物中に含むことができ
る。泡立ちにおける追加的増加が所望の場合は、Ｃ10〜Ｃ16のアルコルアミドの
ような泡立ち促進剤を、典型的には約１％〜約１０％のレベルで組成物に組み入
れることができる。Ｃ10〜Ｃ14のモノエタノール及びジエタノールアミドはかか
る泡立ち促進剤の典型的な部類を例示する。上述のようなアミンオキシド類、ベ
タイン類及びスルタイン類のような高い泡立ち添加界面活性剤と共にかかる泡立
ち促進剤を使用することも有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4な
どのような可溶性マグネシウム塩も、典型的には約０．１％〜約２％で加えて、
追加の泡立ちを提供することができる。
【０１１０】
本明細書における液状洗剤組成物は、キャリアとして水及びその他の溶媒を含
有してもよい。メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノール
で例示される低分子量の第１級又は第２級アルコールは好適である。界面活性剤
を可溶化するには一価アルコール類が好ましいが、約２〜約６の炭素原子及び約
２〜約６のヒドロキシ基を含むもののような（例えば、１，３−プロパンジオー
ル、エチレングリコール、グリセリン、及び１，２−プロパンジオール）ポリオ
ールを使用することもできる。組成物は、約５％〜約９０％、典型的には約１０
％〜約５０％のかかるキャリアを含有してもよい。
有してもよい。メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノール
で例示される低分子量の第１級又は第２級アルコールは好適である。界面活性剤
を可溶化するには一価アルコール類が好ましいが、約２〜約６の炭素原子及び約
２〜約６のヒドロキシ基を含むもののような（例えば、１，３−プロパンジオー
ル、エチレングリコール、グリセリン、及び１，２−プロパンジオール）ポリオ
ールを使用することもできる。組成物は、約５％〜約９０％、典型的には約１０
％〜約５０％のかかるキャリアを含有してもよい。
【０１１１】
本明細書における洗剤組成物は、好ましくは水性洗浄操作で使用中、洗浄水が
約６．８と約１１の間のｐＨを有するように処方される。従って最終製品は典型
的にはこの範囲で処方される。推奨される使用レベルでｐＨを制御する技法には
、例えば、緩衝液、アルカリ、及び酸の使用が挙げられる。かかる技法は当業者
には周知である。
約６．８と約１１の間のｐＨを有するように処方される。従って最終製品は典型
的にはこの範囲で処方される。推奨される使用レベルでｐＨを制御する技法には
、例えば、緩衝液、アルカリ、及び酸の使用が挙げられる。かかる技法は当業者
には周知である。
【０１１２】
本発明の硬質面洗浄用組成物及び織物洗浄用組成物を処方する場合、処方者は
、約５質量％〜約５０質量％のレベルで種々のビルダーを使用することを望んで
もよい。典型的には、ビルダーには、１〜１０ミクロンのゼオライト、クエン酸
塩及びオキシジコハク酸塩のようなポリカルボキシレート、層状珪酸塩、リン酸
塩などが含まれる。その他の従来のビルダーは標準処方に一覧される。
、約５質量％〜約５０質量％のレベルで種々のビルダーを使用することを望んで
もよい。典型的には、ビルダーには、１〜１０ミクロンのゼオライト、クエン酸
塩及びオキシジコハク酸塩のようなポリカルボキシレート、層状珪酸塩、リン酸
塩などが含まれる。その他の従来のビルダーは標準処方に一覧される。
【０１１３】
同様に、処方者は、かかる組成物の中でセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及
びプロテアーゼのような追加の種々の酵素を典型的には約０．００１質量％〜約
１質量％のレベルで使用することを望んでもよい。洗濯用洗剤技術分野では、種
々の洗剤用酵素及び織物を扱う酵素が周知である。
びプロテアーゼのような追加の種々の酵素を典型的には約０．００１質量％〜約
１質量％のレベルで使用することを望んでもよい。洗濯用洗剤技術分野では、種
々の洗剤用酵素及び織物を扱う酵素が周知である。
【０１１４】
過炭酸塩、過ホウ酸塩等のような種々の漂白化合物を典型的には、約１質量％
〜約１５質量％のレベルでかかる組成物の中で使用してもよい。所望であれば、
かかる組成物は、公知のテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ
ンゼンスルホネート等のような漂白活性化剤も含有することができる。使用レベ
ルは典型的には約１質量％〜約１０質量％の範囲である。
〜約１５質量％のレベルでかかる組成物の中で使用してもよい。所望であれば、
かかる組成物は、公知のテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ
ンゼンスルホネート等のような漂白活性化剤も含有することができる。使用レベ
ルは典型的には約１質量％〜約１０質量％の範囲である。
【０１１５】
特に、アニオン系オリゴエステル型の汚れ放出剤、キレート化剤、特に、アミ
ノホスホネート及びエチレンジアミンジスクシネート、粘土質汚れ除去剤、特に
、エトキシル化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレート及び
ポリアスパラテート、光沢剤、特にアニオン系光沢剤、泡立ち抑制剤、特に、シ
リコーン及び第２級アルコール、織物柔軟剤、特に、スメクタイト粘土などはす
べて、約１質量％〜約３５質量％の範囲のレベルにてかかる組成物で使用するこ
とができる。標準処方及び公開された特許は、かかる従来の材料の複数の詳細な
記載を含有する。
ノホスホネート及びエチレンジアミンジスクシネート、粘土質汚れ除去剤、特に
、エトキシル化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレート及び
ポリアスパラテート、光沢剤、特にアニオン系光沢剤、泡立ち抑制剤、特に、シ
リコーン及び第２級アルコール、織物柔軟剤、特に、スメクタイト粘土などはす
べて、約１質量％〜約３５質量％の範囲のレベルにてかかる組成物で使用するこ
とができる。標準処方及び公開された特許は、かかる従来の材料の複数の詳細な
記載を含有する。
【０１１６】
酵素安定化剤も洗浄用組成物で使用してもよい。かかる酵素安定化剤には、プ
ロピレングリコール（好ましくは約１％〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好まし
くは約０．１％〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは約０．１％〜約１％
）が含まれる。
ロピレングリコール（好ましくは約１％〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好まし
くは約０．１％〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは約０．１％〜約１％
）が含まれる。
【０１１７】
本変異体は、硬質面洗浄用組成物で有用である。本明細書で使用されるとき「
硬質面洗浄用組成物」は、床、壁、寝室のタイルなどのような硬質面を洗浄する
ための液状及び顆粒状洗剤組成物をいう。本発明の硬質面洗浄用組成物は、１又
はそれより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは、組成物の
約０．００１質量％〜約１０質量％、さらに好ましくは約０．０１質量％〜約５
質量％、及びさらに好ましくは尚約０．０５質量％〜約１質量％のプロテアーゼ
抱合体を含む。１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含むことに加えて、
硬質面洗浄用組成物は典型的には、界面活性剤及び水溶性の金属イオン封鎖ビル
ダーを含む。しかしながら、スプレー式窓クリーナのようなある種の特別な製品
では、界面活性剤は、ガラス表面に膜状及び／又はムラのある残分を作る可能性
があるので、使用されないこともある。
硬質面洗浄用組成物」は、床、壁、寝室のタイルなどのような硬質面を洗浄する
ための液状及び顆粒状洗剤組成物をいう。本発明の硬質面洗浄用組成物は、１又
はそれより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは、組成物の
約０．００１質量％〜約１０質量％、さらに好ましくは約０．０１質量％〜約５
質量％、及びさらに好ましくは尚約０．０５質量％〜約１質量％のプロテアーゼ
抱合体を含む。１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含むことに加えて、
硬質面洗浄用組成物は典型的には、界面活性剤及び水溶性の金属イオン封鎖ビル
ダーを含む。しかしながら、スプレー式窓クリーナのようなある種の特別な製品
では、界面活性剤は、ガラス表面に膜状及び／又はムラのある残分を作る可能性
があるので、使用されないこともある。
【０１１８】
界面活性剤成分は存在する場合、本明細書における組成物の０．１％くらい少
なく含まれてもよいが、典型的には組成物は、約０．２５％〜約１０％、さらに
好ましくは約１％〜約５％の界面活性剤を含有する。
なく含まれてもよいが、典型的には組成物は、約０．２５％〜約１０％、さらに
好ましくは約１％〜約５％の界面活性剤を含有する。
【０１１９】
典型的には、組成物は、約０．５％〜約５０％の洗浄用ビルダー、好ましくは
約１％〜約１０％を含有してもよい。
約１％〜約１０％を含有してもよい。
【０１２０】
好ましくは、ｐＨは約７〜１２の範囲にあるべきである。調整が必要である場
合、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸のような従来のｐＨ調整剤を使
用することができる。
合、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸のような従来のｐＨ調整剤を使
用することができる。
【０１２１】
組成物に溶媒が包含されてもよい。有用な溶媒には、ジエチレングリコールモ
ノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリ
コールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピ
レングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテ
ルのようなグリコールエーテル、及び２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタ
ンジオール並びに２−エチル−１，３−ヘキサンジオールのようなジオールが挙
げられるが、これに限定されない。使用する場合、かかる溶媒は典型的には約０
．５％〜約１５％、さらに好ましくは約３％〜約１１％のレベルで存在する。
ノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリ
コールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピ
レングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテ
ルのようなグリコールエーテル、及び２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタ
ンジオール並びに２−エチル−１，３−ヘキサンジオールのようなジオールが挙
げられるが、これに限定されない。使用する場合、かかる溶媒は典型的には約０
．５％〜約１５％、さらに好ましくは約３％〜約１１％のレベルで存在する。
【０１２２】
表面への組成物の「力いっぱい」の適用の後、表面をすすがない場合、組成物
の表面からのさらに早い蒸発を促進するためにさらに、イソプロパノール又はエ
タノールのような揮発性の高い溶媒を本組成物で使用することができる。使用す
る場合、揮発性溶媒は典型的には、組成物中に約２％〜約１２％のレベルで存在
する。
の表面からのさらに早い蒸発を促進するためにさらに、イソプロパノール又はエ
タノールのような揮発性の高い溶媒を本組成物で使用することができる。使用す
る場合、揮発性溶媒は典型的には、組成物中に約２％〜約１２％のレベルで存在
する。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
本発明のもう１つの実施態様では、食器洗浄用組成物は、本発明の１又はそれ
より多くの変異体を含む。本明細書で使用されるとき、「食器洗浄用組成物」は
、顆粒状及び液状形態を含むが、これに限定されないあらゆる形態の食器洗浄用
の組成物をいう。
より多くの変異体を含む。本明細書で使用されるとき、「食器洗浄用組成物」は
、顆粒状及び液状形態を含むが、これに限定されないあらゆる形態の食器洗浄用
の組成物をいう。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
【表４】
【０１２７】パーソナルケア組成物
本発明のプロテアーゼ抱合体は特に、例えば、リーブオンの及びリンスオフの
ヘアコンディショナー、シャンプー、リーブオンの及びリンスオフのニキビ用組
成物、顔面乳液及びコンディショナー、シャワージェル、石鹸、泡立ち及び泡な
し洗顔料、化粧品、手、顔面並びに身体用ローション、保湿剤、貼付剤並びに被
覆剤、リーブオンの顔面保湿剤、化粧用並びに洗浄用拭き取り組成物、口内ケア
組成物、生理用品及びコンタクトレンズケア組成物のようなパーソナルケア組成
物での使用に好適である。本パーソナルケア組成物は、１又はそれより多くの本
発明のプロテアーゼ抱合体及びパーソナルケア用キャリアを含む。
ヘアコンディショナー、シャンプー、リーブオンの及びリンスオフのニキビ用組
成物、顔面乳液及びコンディショナー、シャワージェル、石鹸、泡立ち及び泡な
し洗顔料、化粧品、手、顔面並びに身体用ローション、保湿剤、貼付剤並びに被
覆剤、リーブオンの顔面保湿剤、化粧用並びに洗浄用拭き取り組成物、口内ケア
組成物、生理用品及びコンタクトレンズケア組成物のようなパーソナルケア組成
物での使用に好適である。本パーソナルケア組成物は、１又はそれより多くの本
発明のプロテアーゼ抱合体及びパーソナルケア用キャリアを含む。
【０１２８】
例えば、本発明プロテアーゼ抱合体は、以下の参考文献に記載される組成物に
包含されるのに好適である：米国特許第５，６４１，４７９号（１９９７年６月
２４日発行、リナレス（Linares）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５９９，
５４９号（１９９７年２月４日発行、ウイベル（Wivell）ら皮膚洗浄剤）；米国
特許第５，５８５，１０４号（１９９６年１２月１７日発行、ハー（Ha）ら、皮
膚洗浄剤）；米国特許第５，５４０，８５２号（１９９６年７月３０日発行、ケ
ファバー（Kefauver）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５１０，０５０号（１
９９６年４月２３日、ダンバー（Dunbar）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，６
１２，３２４（１９９７年３月１８日発行、ガング リン（Guang Lin）ら、抗ニ
キビ調製物）；米国特許第５，５８７，１７６号（１９９６年１２月２４日発行
、ワレン（Warren）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，５４９，８８８号（
１９９６年８月２７日発行、ベンカテスワラン（Venkateswaran）、抗ニキビ調
製物）；米国特許第５，４７０，８８４号（１９９５年１１月２８日発行、コー
レス（Corless）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，６５０，３８４号（１
９９７年７月２２日発行、ゴードン（Gordon）ら、シャワージェル）；米国特許
第５，６０７，６７８号（１９９７年３月４日発行、モーア（Moore）ら、シャ
ワージェル）；米国特許第５，６２４，６６６号（１９９７年４月２９日発行、
コフィンダファー（Coffindaffer）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャン
プー）；米国特許第５，６１８，５２４号（１９９７年４月８日発行、ボリック
（Bolich）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，
６１２，３０１号（１９９７年３月１８日発行、インマン（Inman）、ヘアコン
ディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，５７３，７０９号（１９
９６年１１月１２日発行、ウエルズ（Wells）、ヘアコンディショナー及び／又
はシャンプー）；米国特許第５，４８２，７０３号（１９９６年１月９日発行、
ピングズ（Pings）、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国再発
行特許第３４，５８４号（１９９４年４月１２日再発行、グロート（Grote）ら
、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，６４１，４９
３号（１９９７年６月２４日発行、デイト（Date）ら、化粧品）；米国特許第５
，６０５，８９４号（１９９７年２月２５日発行、ブランク（Blank）ら、化粧
品）；米国特許第５，５８５，０９０号（１９９６年１２月１７日発行、ヨシオ
カ（Yoshioka）ら、化粧品）；米国特許第４，９３９，１７９号（１９９０年７
月３日発行、チェニー（Cheney）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローション）
；米国特許第５，６０７，９８０号（１９９７年３月４日発行、マッカティ（Mc
Atee）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローション）；米国特許第４，０４５，
３６４号（１９７７年８月３０日発行、リクター（Richter）ら、化粧用及び洗
浄用拭き取り用品）；欧州特許出願ＥＰ第０６１９０７４号（１９９４年１０月
１２日公開、トウシェット（Touchet）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品）；
米国特許第４，９７５，２１７号（１９９０年１２月４日発行、ブラウン−スク
ロボット（Brown−Skrobot）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品）；米国特許第
５，０９６，７００号（１９９２年３月１７日発行、セイベル（Seibel）、口内
洗浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１４号（１９９１年７月２日発行、
サンパスクマール（Sampathkumar）、口内洗浄用組成物）；米国特許第５，０２
８，４１５号（１９９１年７月２日発行、ベネディクト（Benedict）ら、口内洗
浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１５号（１９９１年７月２日発行、ベ
ネディクト（Benedict）ら、口内洗浄用組成物）；米国特許第４，８６３，６２
７号（１９８９年９月５日発行、デイビス（Davies）ら、コンタクトレンズ洗浄
用液）；米国再発行特許第３２，６７２号（１９８８年５月２４日再発行、フー
ト（Huth）、コンタクトレンズ洗浄用液）；及び米国特許第４，６０９，４９３
号（１９８６年９月２日発行、シェーファー（Schafer）、コンタクトレンズ洗
浄用液）。
包含されるのに好適である：米国特許第５，６４１，４７９号（１９９７年６月
２４日発行、リナレス（Linares）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５９９，
５４９号（１９９７年２月４日発行、ウイベル（Wivell）ら皮膚洗浄剤）；米国
特許第５，５８５，１０４号（１９９６年１２月１７日発行、ハー（Ha）ら、皮
膚洗浄剤）；米国特許第５，５４０，８５２号（１９９６年７月３０日発行、ケ
ファバー（Kefauver）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５１０，０５０号（１
９９６年４月２３日、ダンバー（Dunbar）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，６
１２，３２４（１９９７年３月１８日発行、ガング リン（Guang Lin）ら、抗ニ
キビ調製物）；米国特許第５，５８７，１７６号（１９９６年１２月２４日発行
、ワレン（Warren）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，５４９，８８８号（
１９９６年８月２７日発行、ベンカテスワラン（Venkateswaran）、抗ニキビ調
製物）；米国特許第５，４７０，８８４号（１９９５年１１月２８日発行、コー
レス（Corless）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，６５０，３８４号（１
９９７年７月２２日発行、ゴードン（Gordon）ら、シャワージェル）；米国特許
第５，６０７，６７８号（１９９７年３月４日発行、モーア（Moore）ら、シャ
ワージェル）；米国特許第５，６２４，６６６号（１９９７年４月２９日発行、
コフィンダファー（Coffindaffer）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャン
プー）；米国特許第５，６１８，５２４号（１９９７年４月８日発行、ボリック
（Bolich）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，
６１２，３０１号（１９９７年３月１８日発行、インマン（Inman）、ヘアコン
ディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，５７３，７０９号（１９
９６年１１月１２日発行、ウエルズ（Wells）、ヘアコンディショナー及び／又
はシャンプー）；米国特許第５，４８２，７０３号（１９９６年１月９日発行、
ピングズ（Pings）、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国再発
行特許第３４，５８４号（１９９４年４月１２日再発行、グロート（Grote）ら
、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，６４１，４９
３号（１９９７年６月２４日発行、デイト（Date）ら、化粧品）；米国特許第５
，６０５，８９４号（１９９７年２月２５日発行、ブランク（Blank）ら、化粧
品）；米国特許第５，５８５，０９０号（１９９６年１２月１７日発行、ヨシオ
カ（Yoshioka）ら、化粧品）；米国特許第４，９３９，１７９号（１９９０年７
月３日発行、チェニー（Cheney）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローション）
；米国特許第５，６０７，９８０号（１９９７年３月４日発行、マッカティ（Mc
Atee）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローション）；米国特許第４，０４５，
３６４号（１９７７年８月３０日発行、リクター（Richter）ら、化粧用及び洗
浄用拭き取り用品）；欧州特許出願ＥＰ第０６１９０７４号（１９９４年１０月
１２日公開、トウシェット（Touchet）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品）；
米国特許第４，９７５，２１７号（１９９０年１２月４日発行、ブラウン−スク
ロボット（Brown−Skrobot）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品）；米国特許第
５，０９６，７００号（１９９２年３月１７日発行、セイベル（Seibel）、口内
洗浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１４号（１９９１年７月２日発行、
サンパスクマール（Sampathkumar）、口内洗浄用組成物）；米国特許第５，０２
８，４１５号（１９９１年７月２日発行、ベネディクト（Benedict）ら、口内洗
浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１５号（１９９１年７月２日発行、ベ
ネディクト（Benedict）ら、口内洗浄用組成物）；米国特許第４，８６３，６２
７号（１９８９年９月５日発行、デイビス（Davies）ら、コンタクトレンズ洗浄
用液）；米国再発行特許第３２，６７２号（１９８８年５月２４日再発行、フー
ト（Huth）、コンタクトレンズ洗浄用液）；及び米国特許第４，６０９，４９３
号（１９８６年９月２日発行、シェーファー（Schafer）、コンタクトレンズ洗
浄用液）。
【０１２９】
本発明の口内洗浄用組成物をさらに例示すると、薬学上許容可能な量の本発明
の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体が、歯又は入れ歯からタンパク質様
の汚れを除くのに有用な組成物に包含される。本明細書で使用されるとき、「口
内洗浄用組成物」は、歯みがき、練り歯みがき、歯みがき用ジェル、歯みがき粉
、口内洗浄液、口内スプレー、口内ジェル、チューインガム、トローチ剤、サッ
シュ（小袋）、錠剤、バイオジェル、予防用ペースト、歯の治療液などをいう。
好ましくは、口内洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１質量％〜約２０質量
％、さらに好ましくは約０．００１質量％〜約１０質量％、さらに好ましくは尚
、約０．０１質量％〜約５質量％の１又はそれより多くの本発明のプロテアーゼ
抱合体、及び薬学上許容可能なキャリアを含む。本明細書で使用されるとき、「
薬学上許容可能な」は、用語が説明する薬剤、医薬品又は不活性成分が、過度の
毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び動
物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比と釣り合
っていることを意味する。
の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体が、歯又は入れ歯からタンパク質様
の汚れを除くのに有用な組成物に包含される。本明細書で使用されるとき、「口
内洗浄用組成物」は、歯みがき、練り歯みがき、歯みがき用ジェル、歯みがき粉
、口内洗浄液、口内スプレー、口内ジェル、チューインガム、トローチ剤、サッ
シュ（小袋）、錠剤、バイオジェル、予防用ペースト、歯の治療液などをいう。
好ましくは、口内洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１質量％〜約２０質量
％、さらに好ましくは約０．００１質量％〜約１０質量％、さらに好ましくは尚
、約０．０１質量％〜約５質量％の１又はそれより多くの本発明のプロテアーゼ
抱合体、及び薬学上許容可能なキャリアを含む。本明細書で使用されるとき、「
薬学上許容可能な」は、用語が説明する薬剤、医薬品又は不活性成分が、過度の
毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び動
物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比と釣り合
っていることを意味する。
【０１３０】
典型的には、口内洗浄用組成物の口内洗浄用成分の薬学上許容可能な口内洗浄
用キャリア成分は一般に、組成物の約５０質量％〜約９９．９９質量％、好まし
くは約６５質量％〜約９９．９９質量％、さらに好ましくは約６５質量％〜約９
９質量％含まれる。
用キャリア成分は一般に、組成物の約５０質量％〜約９９．９９質量％、好まし
くは約６５質量％〜約９９．９９質量％、さらに好ましくは約６５質量％〜約９
９質量％含まれる。
【０１３１】
本発明の口内洗浄用組成物に包含される薬学上許容可能なキャリア成分及び任
意成分は当業者に周知である。口内洗浄用組成物で有用な多種多様な組成物型、
キャリア成分及び任意成分が、本明細書上記で引用された文献で開示されている
。
意成分は当業者に周知である。口内洗浄用組成物で有用な多種多様な組成物型、
キャリア成分及び任意成分が、本明細書上記で引用された文献で開示されている
。
【０１３２】
本発明のもう１つの実施態様では、口腔の入れ歯の外側を洗浄するための入れ
歯洗浄用組成物は、本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。
かかる入れ歯洗浄用組成物は、好ましくは組成物の約０．０００１質量％〜約５
０質量％、さらに好ましくは約０．００１質量％〜約３５質量％、さらに好まし
くは尚約０．０１質量％〜約２０質量％の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱
合体の有効量、及び入れ歯洗浄用キャリアを含む。発泡性錠剤などのような種々
の入れ歯洗浄用組成物の形式が当業者に周知であり（例えば、米国特許第５，０
５５，３０５号、ヤング（Young）を参照のこと）、入れ歯からタンパク質様の
汚れを除くには、一般に１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を組み入れる
のに適している。
歯洗浄用組成物は、本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。
かかる入れ歯洗浄用組成物は、好ましくは組成物の約０．０００１質量％〜約５
０質量％、さらに好ましくは約０．００１質量％〜約３５質量％、さらに好まし
くは尚約０．０１質量％〜約２０質量％の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱
合体の有効量、及び入れ歯洗浄用キャリアを含む。発泡性錠剤などのような種々
の入れ歯洗浄用組成物の形式が当業者に周知であり（例えば、米国特許第５，０
５５，３０５号、ヤング（Young）を参照のこと）、入れ歯からタンパク質様の
汚れを除くには、一般に１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を組み入れる
のに適している。
【０１３３】
本発明のもう１つの実施態様では、コンタクトレンズ洗浄用組成物が、１又は
それより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を含む。かかるコンタクトレンズ洗
浄用組成物は、１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは
組成物の約０．０１質量％〜約５０質量％、さらに好ましくは約０．０１質量％
〜約２０質量％、さらに好ましくは尚、約１質量％〜約５質量％の１又はそれよ
り多くのプロテアーゼ抱合体、及びコンタクトレンズ洗浄用キャリアを含む。錠
剤、液体などのような種々のコンタクトレンズ洗浄用組成物の形式が当業者に周
知であり、コンタクトレンズからタンパク質様の汚れを除くには、一般に１又は
それより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を組み入れるのに適している。
それより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を含む。かかるコンタクトレンズ洗
浄用組成物は、１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは
組成物の約０．０１質量％〜約５０質量％、さらに好ましくは約０．０１質量％
〜約２０質量％、さらに好ましくは尚、約１質量％〜約５質量％の１又はそれよ
り多くのプロテアーゼ抱合体、及びコンタクトレンズ洗浄用キャリアを含む。錠
剤、液体などのような種々のコンタクトレンズ洗浄用組成物の形式が当業者に周
知であり、コンタクトレンズからタンパク質様の汚れを除くには、一般に１又は
それより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を組み入れるのに適している。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
【表９】
【０１３９】
上記組成物は、セルロース及び／又はポリエステルから構成される織物吸収シ
ートに織物吸収シートの約２５０重量％で含浸される。
ートに織物吸収シートの約２５０重量％で含浸される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ワイスガーバー，デイヴィッド ジョン
アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、
フェアヒル 2632
(72)発明者 ルビング，ドン ネルトン
アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、
シード、ロード 8224
(72)発明者 コリア，ポール エリオット
アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、
ドライ、リッジ、ロード 5755
Ｆターム(参考） 4B050 CC03 CC04 CC05 CC07 DD01
DD02 LL04
4H003 AB03 AB05 AB31 AC04 AC13
DA01 DA02 DA05 EA12 EB02
EB05 EB08 EB09 EB16 EC02
ED02 FA47
Claims (13)
- 【請求項１】 プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含む
プロテアーゼ抱合体であって、各付加部分が、サブチリシンＢＰＮ’ に相当す
る１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、８４、８５、８８、１５
８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１８
６、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２６１、２６
２、及び２７４位置から成る群から選択されるクリップ部位保護位置にてプロテ
アーゼ部分のアミノ酸に共有結合することを特徴とするプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項２】 各付加部分がそれぞれ独立して以下の構造を有する請求項１
に記載のプロテアーゼ抱合体： 【化１】 （式中、Ｘは不在及び連結部分から成る群から選択され；Ｒ1は、不在、第１の
ポリペプチド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ2は、不在
、第２のポリペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され；少なくと
もＸ、Ｒ1、及びＲ2の１つは不在ではない）。 - 【請求項３】 プロテアーゼ部分が、親型アミノ酸配列の修飾されたアミノ
酸配列を有し、該修飾されたアミノ酸配列は、サブチリシンＢＰＮ’に相当する
１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、８４、８５、８８、１５８
、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１７０、１８６
、１９１、１９２、１９３、１９４、１９６、２５９、２６０、２６１、２６２
、及び２７４位置から成る群から選択される１又はそれより多くのクリップ部位
保護位置における置換アミノ酸による置換を含み、且つ、各付加部分が置換アミ
ノ酸の１つに共有結合する請求項２に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項４】 置換アミノ酸がシステインである請求項３に記載のプロテア
ーゼ抱合体。 - 【請求項５】 親型アミノ酸配列が、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン
カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、
サーミターゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、並びにプロ
テアーゼＤ、及びそれらの変異型から成る群から選択される請求項１〜４のいず
れか１項に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項６】 Ｒ1及びＲ2がそれぞれ不在である請求項１〜５のいずれか１
項に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項７】 Ｒ1が第１のポリペプチドである請求項１〜６のいずれか１
項に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項８】 第１のポリペプチドが、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシ
ンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ
、サーミターゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、並びにプ
ロテアーゼＤ、及びそれらの変異型から成る群から選択される請求項７に記載の
プロテアーゼ抱合体。 - 【請求項９】 Ｘが不在であり、プロテアーゼ部分と第１のポリペプチドが
、ジスルフィド結合を介して共有結合する請求項８に記載のプロテアーゼ抱合体
。 - 【請求項１０】 Ｒ1が第１のポリマーであり、且つＲ2が不在及び第２のポ
リマーから成る群から選択される請求項２に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項１１】 Ｒ2が不在であり、且つ第１のポリマーがポリエチレング
リコールである請求項１０に記載のプロテアーゼ抱合体。 - 【請求項１２】 請求項１に記載のプロテアーゼ抱合体及び洗浄用組成物用
キャリアを含むことを特徴とする洗浄用組成物。 - 【請求項１３】 請求項１に記載のプロテアーゼ抱合体及びパーソナルケア
組成物用キャリアを含むことを特徴とするパーソナルケア組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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