CN1246146A - 化学修饰的酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供其中酶的至少一种氨基酸如精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丝氨酸被半胱氨酸残基置换并且硫醇氢用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换的修饰酶:a)-SR1R2,其中R1是烷基,而R2是带电的或极性组分;b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环已基;d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。而且,本发明提供制备修饰酶的方法以及去污剂、食品添加剂和处理纺织品的组合物。本发明还提供在有机合成中使用修饰酶的方法。此外,本发明提供具有改进活性、改变的pH模式和/或洗涤表现的修饰酶。
Description
发明背景
通过定点诱变来修饰酶的特性被限制在天然氨基酸的置换,但是最近已得到克服此限制的分子生物学策略[Cornish,V.W.等(1995)Angew.chem.,Int.Ed.Engl.34:621]。但是后一种方法一般不容易在大多数实验中应用。相反,酶的化学修饰提供了酶结构简单灵活修饰的广泛潜力,由此开辟了酶特异性可控制的调节的广泛可能性。
以往开发现了通过化学修饰来改变酶特性,1966年由Bender(Polger,L.等,1966,美国化学学会杂志,88:3153)和Koshland(Neet,K.E.等,1996,美国国家科学院院报,56:1606)组首次报道,他们通过将枯草杆菌蛋白酶BPN’的活性位点丝氨酸残基化学转化为光胱氨酸(CH2OH→CH2SH)创造出硫代枯草杆菌蛋白酶。化学合成人工酶的兴趣,包括一些具有合成潜力的,由Wu,Z.-P.等(1989)美国化学学会杂志,111:4514;Bell,I.M.等(1993)生物化学,32:3754和Peterson,E.B.等(1995)生物化学,34:6616,并且最近由Suckling,C.J.等(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:531重申。
酶是目前广泛接受的有机合成中的有用催化剂。然而不可能希望天然的野生型酶符合所有合成化学目的的结构,也不可能总是能将它们立体特异地转化为合成所需的目的对映体纯的物质。目前已经意识到这种酶合成应用能力的潜在限制,已经得到一些方法用于以可控制的方式使用蛋白工程的定点和随机诱变技术改变它们的特异性。然而通过蛋白工程修饰酶的特征只限于天然氨基酸置换,并且设计克服此限制的分子生物学方法不能容易地用于常规应用或大量合成。通过酶的化学修饰得到新特异性或活性在很多年来直至今天引起了化学家的兴趣。本发明人采用定点诱变-化学修饰联合的策略,因此它提供基本上无限制的在任何氨基酸位置产生新结构环境的可能性。
美国专利5,208,158描述了化学修饰的去垢酶,其中一个或多个甲硫氨酸已突变成半胱氨酸。随后半胱氨酸得到修饰以赋予酶针对氧化剂的更高稳定性。所述的化学修饰是用C1-6烷基置换硫醇氢。
尽管美国专利5,208,158已描述了酶氧化稳定性的改变,但仍然需要发展一种或多种具有改变的特性如活性、亲核特异性、底物特异性、立体选择性、热稳定性、pH活性模式和表面结合特性的酶以用于例如去污剂或有机合成。
发明概述
现存在一种需要,即得到具有改变特性的酶,如蛋白酶。因此,本发明提供有一个或多个氨基酸被半胱氨酸残基置换的修饰酶,半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换硫醇氢来修饰:
a)-SR1R2,其中R1是烷基,而R2是带电或极性组分;
b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;
c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环己基;和
d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。
在优选的实施方案中,上述硫醇侧链基团-SR3和-SR4进一步包含烷基R,将其置于R3或R4之前形成-SRR3或SRR4。R优选地是C1-10烷基。
有关硫醇侧链基团-SR1R2,R2可以是带正电或带负电的。优选地,R2是SO3 -、COO-或NH3 +。另外,R1优选地是C1-10烷基。
优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。而且,优选地,其中被半胱氨酸置换的氨基酸选自精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丝氨酸。更优选地,要置换的氨基酸位于蛋白酶的亚位点(subsite),优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166,位置数对应于来自解淀粉芽孢杆菌的天然存在的枯草杆菌蛋白酶或其它枯草杆菌蛋白酶中的相同氨基酸残基如迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。
在特别优选的实施方案中,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在最优选的实施方案中,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62,并且硫醇侧链基团选自:
-S1R2,其中R1是CH2,而R2是CH2SO3;
-SRR3,其中R是CH2,而R3是C6H5;
-SRR4,其中R是CH2,而R4是c-C6H11;
-SR5,其中R5是n-C10H21;或
被半胱氨酸置换的是L217,而硫醇侧链基团是
-SR5,其中R5是n-C10H21。
本发明进一步提供有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的修饰酶。半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链-SR6的取代基置换硫醇氢来修饰,其中R6是C1-6烷基并且被半胱氨酸残基置换的氨基酸残基是精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。最优选地,氨基酸位于蛋白酶的亚位点,优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166。优选地,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62或L217,并且硫醇侧链基团是-SR6,其中R6是CH2C(CH3)3或C5H11。
本发明提供制备修饰酶的方法,包括提供其中一个或多个氨基酸用半胱氨酸残基置换并且用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换半胱氨酸残基的硫醇氢的酶的方法:
a)-SR1R2,其中R1是烷基,而R2是带电或极性组分;
b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;
c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环己基;和
d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。
在优选的实施方案中,上述硫醇侧链基团-SR3和-SR4进一步包含烷基R,将其置于R3或R4之前形成-SRR3或SRR4。R优选地是C1-10烷基。
有关硫醇侧链基团-SR1R2,R2可以是带正电或带负电的。优选地,R2是SO3 -、COO-或NH3 +。另外,R1优选地是C1-10烷基。
优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。而且,优选地,其中被半胱氨酸置换的氨基酸选自精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丝氨酸。更优选地,要置换的氨基酸位于蛋白酶的亚位点(subsite),优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166,位置数对应于来自解淀粉芽孢杆菌的天然存在的枯草杆菌蛋白酶或其它枯草杆菌蛋白酶中的相同氨基酸残基如迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。
在特别优选的实施方案中,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在最优选的实施方案中,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62,并且硫醇侧链基团选自:
-S1R2,其中R1是CH2,而R2是CH2SO3 -;
-SRR3,其中R是CH2,而R3是C6H5;
-SRR4,其中R是CH2,而R4是c-C6H11;
-SR5,其中R5是n-C10H21;或
被半胱氨酸置换的是L217,而硫醇侧链基团是
-SR5,其中R5是n-C10H21。
本发明进一步提供有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的修饰酶。半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链-SR6的置换基置换硫醇氢来修饰,其中R6是C1-6烷基并且被半胱氨酸残基置换的氨基酸残基是精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。最优选地,氨基酸位于蛋白酶的亚位点,优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166。优选地,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62或L217,并且硫醇侧链基团是-SR6,其中R6是CH2C(CH3)3或C5H11。
本发明进一步提供包含修饰酶的去污剂添加剂。
本发明提供包含修饰酶的食品添加剂。
本发明提供在去污剂配方中使用修饰酶的方法。
本发明提供在处理污物时使用修饰酶的方法。
本发明提供在制备食品添加剂时使用修饰酶的方法。
本发明提供具有增加的活性的修饰酶。
本发明提供具有改变的PH模式的修饰酶。
本发明提供具有改进的洗涤表现的修饰酶。
本发明提供在有机合成时使用修饰酶的方法。
附图简述
图1是用硼抑制剂于pH8.6探测S156C突变体后得到的结果的柱形图。
图2是用硼抑制剂于PH8.6控测S166C突变体后得到的结果的柱形图。
图3是野生型迟缓芽孢杆菌(SBL-WT,方块)和修饰的N62C突变体(N62C-Scy;圆圈)的PH模式图,所有的点一式两份。
发明详述
在本发明的实施方案中,提供枯草杆菌蛋白酶的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的修饰酶和提供这种酶的方法。然后半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换硫醇氢来修饰:
a)-SR1R2,其中R1是烷基,而R2是带电或极性组分;
b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;
c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环己基;和
d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。
在优选的实施方案中,上述硫醇侧链基团-SR3和-SR4进一步包含烷基R,将其置于R3或R4之前形成-SRR3或SRR4。R优选地是C1-10烷基。
有关硫醇侧链基团-SR1R2,R2可以是带正电或带负电的。优选地,R2是SO3-、COO-或NH3 +。另外,R1优选地是C1-10烷基。
优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。而且,优选地,其中被半胱氨酸置换的氨基酸选自精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丝氨酸。更优选地,要置换的氨基酸位于蛋白酶的亚位点(subsite),优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166,位置数对应于来自解淀粉芽孢杆菌的天然存在的枯草杆菌蛋白酶或其它枯草杆菌蛋白酶中的相同氨基酸残基如迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。
在特别优选的实施方案中,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。在最优选的实施方案中,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62,并且硫醇侧链基团选自:
-S1R2,其中R1是CH2,而R2是CH2SO3;
-SRR3,其中R是CH2,而R3是C6H5;
-SRR4,其中R是CH2,而R4是c-C6H11;
-SR5,其中R5是n-C10H21;或
被半胱氨酸置换的是L217,而硫醇侧链基团是
-SR5,其中R5是n-C10H21。
本发明进一步提供有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的修饰酶。半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链-SR6的置换基置换硫醇氢来修饰,其中R6是C1-6烷基并且被半胱氨酸残基置换的氨基酸残基是精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。优选地,酶是蛋白酶。更优选地,酶是枯草杆菌蛋白酶。最优选地,氨基酸位于蛋白酶的亚位点,优选地S1,S1’或S2亚位点。最优选地,要置换的氨基酸是N62,L217,M222,S156和S166。优选地,酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,被半胱氨酸置换的氨基酸是N62或L217,并且硫醇侧链基团是-SR6,其中R6是CH2C(CH3)3或C5H11。
“修饰酶”是通过用半胱氨酸残基置换氨基酸残基如精氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸并且用提供硫醇侧链的取代基即诸如C1-6烷基或C10-15烷基或包含苯基、环己基或带电或极性组分的基团替换硫醇氢来改变的酶。修饰后,酶的特性即活性或底物特异性可能变化。优选地,酶的活性增加。
术语“酶”包括能催化其它物质中化学变化而自身不改变的蛋白。酶可以是野生型酶或变体酶。本发明范围内酶包括支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和异构酶、脂肪酶、氧化酶和还原酶。酶可以是野生型或突变体蛋白酶。野生型蛋白酶可以从例如迟缓芽孢杆菌或解淀酶芽孢杆菌(也称为BPN’)分离。突变体蛋白酶可以根据例如PCT公开号WO 95/10615和WO 91/06637的说明制备。
几种组分可用于替换半胱氨酸残基的硫醇氢。它们包括-SR1R2,-SR3,-SR4,-SR5或SR6。R和R1分别定义为取代的或非取代的C1-10烷基。R2是带电或极性基团。R3是取代的或非取代的苯基。R4是取代的或非取代的环己基。R5是C10-15烷基。R6是C1-6烷基。R1,R5或R6可以是取代的或非取代的和/或直链或支链。带电基团是共同形成带电分子的一个或多个原子即SO3 -,COO-或NH3 +。
术语“硫醇侧链基团”、“提供硫醇侧链的取代基”、“含硫醇基团”和“硫醇侧链”是可以互相交换使用的术语,包括用于置换在枯草杆菌蛋白酶中用于置换一个氨基酸的半胱氨酸的硫醇氢的基团。一般地,硫醇侧链包含硫,硫通过上面定义Rx基团与半胱氨酸的硫醇硫结合。
术语“取代的”是指其中基团的氢已用另一原子或分子置换。例如可以例如用甲基、氟原子或羟基取代。在本发明中,烷基、环己基和苯基可以被取代,即已用另一原子或分子取代一个或多个氢原子。
酶的结合位点包括越过酶表面的一系列亚位点。对应于亚位点的底物残基标上P,而亚位点标上S。常规上,亚位点标上S1,S2,S3,S4,S1’和S2’。亚位点的讨论可以在Siezen等,1991,蛋白工程,4:719-737和Fersht,A.E.,酶结构和机理,第二版,Freeman(New York),第29-30页中找到。优选的亚位点是S1,S1’和S2。
本发明的氨基酸残基可以通过定点诱变或其它本领域已知方法(见,例如PCT公开号WO 95/10615)用半胱氨酸替换。修饰半胱氨酸残基的硫醇氢的方法可以在下面实施例4中找到。
在本发明的一方面,修饰的蛋白酶与前体蛋白酶相比已改变了蛋白水解活性。因为这样的活性的增加(数字上更大)使得能更有效地使用酶作用于目的底物。而且与前体相比,具有改变的活性、亲核特异性、底物特异性、立体选择性、热稳定性、pH活性模式和表面结合活性的修饰酶也是需要的。
令人惊奇地,本发明的修饰的蛋白酶可以有改变的pKas,并且因此在不改变蛋白酶分子表面电荷的情况下改变了前体蛋白酶的pH模式(见实施例7)。
本发明的修饰酶可以按重量比约0.01至约5%(优选地0.1%-0.5%)的水平配制成pH6.5-12.0的粉状和液体去污剂。这些去污清洁组合物或添加剂也可以包含其它酶如已知的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶或糖苷内切酶以及增效剂和稳定剂。
本发明的修饰酶,尤其是枯草杆菌蛋白酶在配制各种去污组合物中有用。许多已知的化合物是包含本发明的修饰酶的组合物中有用的适当表面活性剂。这些包括非离子、阴离子、阳离子或两性离子去污剂,如授予Barry J.Anderson的美国专利US 4,404,128和授予Jiri Flora等的美国专利4,261,868中公开的。适当的去污剂配方是在美国专利5,204,015的实施例7中描述的配方。本领域熟悉可用作清洁组合物的不同配方。除了典型的清洁组合物,很容易理解的是本发明的修饰酶可用于天然或野生型酶所用的任何目的。因此,这些修饰酶可用于例如棒状或液体皂用途、洗碗配方、隐形眼睛清洁溶液或产品、肽合成、食品用途如食品添加剂或食品添加剂的制品、废物处理、纺织品用途如织物处理、蛋白生产中的融合切割酶等。本发明的修饰酶可以包括与前体相比在去污剂组合物中改进的洗涤表现。如此处所用的,去污剂中改进的洗涤表现定义为如通过标准洗涤循环后光反射系数评估所测定的,增加某些酶敏感的污点如草或血的清洗。
将本发明的修饰酶加入传统清洁组合物不产生任何特殊的使用限制。换言之,只要pH在上述范围内并且温度在所述修饰酶变性温度下,任何适于去污剂的温度和pH也适于本发明。另外,本发明的修饰酶可以单独或与增效剂和稳定剂结合用于无去污剂的清洁组合物。
在本发明的另一方面,修饰酶用于动物饲料如以谷类为基础的饲料的制备。谷类可以是小麦、大麦、玉米、高梁、燕麦、黑麦、黑小麦和水稻中的至少一种。尽管以谷类为基础的饲料的谷类成分构成了蛋白来源,但通常需要在饲料中包含额外的蛋白来源如来自鱼粉、肉粉或蔬菜的那些蛋白。蔬菜蛋白的来源包括全脂大豆、油菜、canola、豆粉、油菜籽粉和canola粉。
本发明的修饰酶包含在动物饲料中可以使饲料的粗蛋白值和/或消化性和/或氨基酸含量和/或消化系数增加,这使得以前是动物饲料的必需成分的选择性蛋白来源和/或氨基酸添加剂的量减少。
本发明提供的饲料也可以包含其它酶添加剂如一种或多种β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶、脂肪酶、α-***呋喃糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、酯酶、氧化酶、氧化还原酶和果胶酶。特别优选地包含木聚糖酶作为其它酶,例如来自芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶。这样的木聚糖在例如PCT专利公开WO97/20920中详细描述。
本发明的一方面是纺织品处理的组合物,包括MP。组合物可以用于处理例如丝或羊毛,如公开文献RD216,034;EP 134,267;US 4,533,359和EP 344,259中所述。
本发明的修饰酶可以用于有机合成以例如催化所需的反应和/或有助于某些立体选择性。见例如Noritomi等,Biotech.Bioeng.,51:95(1996);Dabulis等,Biotech.Bioeng.,41:566-571(1993);Fitzpatrick等,美国化学学会杂志,113:3166-3171(1991)。
下面通过实施例的方法介绍,并且不应解释为权利要求范围的限制。实施例1制备Cys突变体
将来自迟缓芽杆菌的枯草杆菌蛋白酶(SBL)基因克隆入噬菌体M13mp19载体用于诱变(美国专利5,185,258)。按zoller等(1983)酶学方法,100:1468-500中所述进行指定寡核苷酸的诱变。克隆、切割突变的序列并重新导入枯草杆菌宿主中的表达载体GG274。加入PEG(50%)作为稳定剂。首先通过使用pH5.2缓冲液(20mM乙酸钠,5mM CaCl2)流过SephadexTM G-25去盐基质纯化所得的粗蛋白浓缩物以除去小分子量污染物。然后将合并的去盐柱组分上样到乙酸钠缓冲液(上述)中的强阳离子交换柱(SP SepharoseTMFF)上,并用0-200mM CaCl乙酸缓冲液(pH5.2)的梯度洗脱SBL。在逆着Millipone纯水透析并随后冷冻干燥后得到无盐酶粉末。已通过与0.1M HCl2于0℃温育30分钟变性的突变体和野生型酶的纯度通过使用来自Pharmacia(Uppsala,Sweden)的PhastTM***在均一胶上通过SDS-PAGE确定。SBL的浓度使用基于Bradford(1976)分析生物化学,72:248-254的方法的Bio-Rad(Hercules,CA)染料试剂盒测定。酶的特异活性在pH8.6缓冲液中使用下述方法测定。实施例2某些组分的制备3-甲基丁基甲硫磺酸盐
将无水DMF(5ml)中的1-溴-3-甲基丁烷(1.7520g,0.0116mol)和甲硫磺酸钠(1.554g,0.0116mol)于50℃加热2小时。在室温下加入水(15ml)并用***(3×30ml)抽提反应混合物。合并的***抽提物用盐水洗2次、干燥、浓缩并将残基在硅胶上用EtOAc-己烷(1∶4)进行快速柱层析。得到的产物为无色液体(1.4777g,70%)。IR(film):3030(w),3011(w),2958(st),2932(st),2873(st),1468(m),1420(w),1388(w),1367(w),1319(st),1136(st),955(st),748cm-1(st);1H NMR(200MHz,CDCl3):δ3.33(s,3H,CH3SO2S);3.19(t,J=7.1Hz,2H,SCH2CH2),1.70-1.58(m,3H,SCH2CH2CHMe2),0.95(d,5.3Hz,6H,CHMe2);13C NMR(50MHz,CDCl3):δ 50.60,38.19,34.59,27.40,22.06。新戊基甲硫磺酸盐
将新戊基磺化物(3.054g,0.0154mol)、甲硫磺酸钠(2.272g,0.0170mol)和无水DMF(4ml)于90℃加热90分钟。因为磺化物对阳光,敏感,所以用铝箔包住反应瓶以避免对反应混合物直接的阳光照射。加热时,反应混合物为红棕色。在室温下加入水(15ml)并用***(3×30ml)抽提反应混合物。合并的***抽提物用盐水洗2次、干燥、浓缩并将残基在硅胶上用EtOAc-己烷(1∶2)进行柱层析以提供缓慢固化的无色油(1.2395g,44%)。产物从95%乙醇重结晶。mp:28.5-29.0℃;IR(CH2Cl2cast):3021(m),2956(m),2868(m),1467(m),1433(m),1321(st),1310(st),1125(st),951(m),757(m)和724cm-1;1H NMR(200MHz,CDCl3):δ 3.32(s,3H,CH3SO2S),3.13(s,2H,SCH2C),1.05(s,9H,CMe3);13C NMR(50MHz,CDCl3);δ 50.23,50.09,32.14,28.79,MS(EI):182(M+),57(基锋,CMe3 +)。己基甲硫磺酸盐
将1-溴己烷(1.046g,0.00635mol)、甲硫磺酸钠(0.850g,0.00635mol)和无水DMF(6ml)于60℃加热2小时。在室温下加入水(15ml)并用***(3×30ml)抽提所得混合物。抽提物用盐水洗2次、干燥、浓缩并将残基在硅胶上用EtOAc-己烷(1∶4)进行快速柱层析以提供无色液体(2.057g,82%)。IR(CDCl3 cast):3030(w),3010(w),2955(st),2930(st),2860(st),1460(m),1320(st),1133(st),955(st),747cm-1(st);1H NMR(200MHz,CDCl3);δ 3.339(s,3H,CH3SO2S),3.18(t,J=7.4Hz,2H,SCH2CH2),1.77(pseudo p,J=7.2Hz,2H,SCH2CH2),1.50-1.20(m,6H,CH2CH2CH2CH3),0.90(m,3H,CH2CH3);;13C NMR(50MHz,CDCl3);δ50.64,36.50,31.13,29.46,28.26,22.44,13.96。环己基甲基甲硫磺酸盐
将溴甲基环己烷(1.560g,0.00881mol)、甲硫磺酸钠(1.180g,0.00881mol)和无水DMF(6ml)于50℃加热24小时。在室温下加入水(15ml)并用***(3×30ml)抽提反应混合物。抽提物用盐水洗2次、干燥、浓缩并将残基在硅胶上用EtOAc-己烷(1∶1)进行快速柱层析以提供无色油(1.5033g,82%)。IR(CDCl3 cast):3030(w),3012(w),2926(st),2853(st),1446(m),1410(m),1320(st),1134(st),955(st),746cm-1(st);1H NMR(200MHz,CDCl3);δ 3.32(s,3H,CH3SO2S),3.07(d,J=6.9Hz,2H,SCH2CH),1.95-1.55(m,6H),1.40-0.90(m,5H);13C NMR(50MHz,CDCl3):δ50.42,43.30,37.83,32.43,26.02,25.82。癸基甲硫磺酸盐
将1-溴癸烷(2.09g,0.00947mol)、甲硫磺酸钠和无水DMF(6ml)于60℃加热2小时。在室温下加入水(15ml)并用***(3×30ml)抽提反应混合物。***抽提物用盐水洗2次、干燥、浓缩并将残基在硅胶上用EtOAc-己烷(1∶4)进行快速柱层析以提供白色固体(2.063g,94%)。产物从95%乙醇重结晶。mp:28.0-29.5℃.IR(CDCl3 cast):2954(m),2921(st),2852(st),1469(m),1305(st),1128(st),965(m),758(m)和720cm-1(m);1H NMR(200 MHz,CDCl3):δ 3.32(s,3H,CH3SO2S),3.17(t,J=7.4Hz,2H,SCH2CH2),1.77(m,2H,SCH2CH2),1.50-1.20(m,14H,-(CH2)7-),0.88(m,3H,CH2CH3);13C NMR(50MHz,CDCl3);δ50.64,36.49,31.84,29.45(2个碳原子),29.37,29.23,28.94,28.57,22.64,14.08。甲硫磺酸钠
于80℃将磺酰氟(46.6ml,0.602mol)逐滴加入Na2S·9H2O(142.2g,0.592mol)水溶液(150ml)。加入后,回流加热反应混合物,反应混合物在15小时内从淡黄变成黄色。在此过程中,也形成了一些黄色沉淀。将反应混合物冷却至室温并蒸发掉水分。用研钵和杵研磨固体残留物并于50℃和1托进一步干燥粉末。使用无水乙醇(700ml)将粉末研制成4部分,使乙醇溶液浓缩并用冰浴冷却以得到沉淀,通过真空过滤收集沉淀。使滤液进一步浓缩以得到第二次沉淀产物。重复浓缩和过滤(4×)后,滤液的终体积是约10ml。室温下将合并的沉淀重新溶解于无水乙醇中并过滤以除去痕量氯化钠和硫化钠。浓缩滤液并冷冻并通过真空过滤收集固体。浓缩、冷却和过滤过程再重复三次以得到白色薄片晶体,于1托进一步干燥过夜。(24.51g,31%)IR(KBr):3004,2916,1420,1326,1203,1095,980,772cm-1。1H NMR(200 MHz,D2O):δ2.23(s).13C NMR(50 MHz,D2O,DMSO-d6作为内部标准):δ39.72ppm。苯甲基甲硫磺酸盐
将苯甲基溴(9.07g,0.053mol)缓慢加入甲硫磺酸钠(7.10g,0.0530mol)在无水乙醇中的悬液液中并且回流加热反应混合物过夜。反应混合物用冰浴冷却并滤去固体(溴化钠和甲硫磺酸钠)。使滤液浓缩以得到主要为所需产物的粗产品。通过用EtOAc-己烷(1∶6)在硅胶上快速层析得到纯的产物(7.92g,74%)。通过从无水乙醇重结晶进一步纯化产物。mp 39.5-40.2℃(lit.40-42.5℃)IR(KBr):3089,3068,3017,3000,2981,2936,2918,1602,1582,1496,1305,1131,960,771,741,702cm-1. 1H NMR(200MHz,CDCl3):δ7.38(m,5H,苯基),4.38(s,2H,SCH2),2.91(s,3H,CH3SO2).13C NMR(50 MHz,CDCl3):δ135.12,129.14,129.03,128.26,51.09,40.79.
试剂CH3SO2-SCH2CH2SO3 -Na+和CH3SO2-SCH2NH3 +Br-购自TorontoResearch Chemicals(Tornoto,Ontario).实施例3Cys突变体的修饰
下面是用于修饰Cys突变体即N62C的典型方法。M222C的修饰
向在聚丙烯试管中已用聚乙二醇10,000(0.1重量/体积)水溶液预先覆盖的缓冲液(250ml;70mM CHES,5mM MES,2mM CaCl2,pH9.5)中的迟缓芽孢杆菌Cys突变体M222C(25.1mg,0.94μmol)溶液中向入实施例2中所述的95%乙醇中的甲基甲硫磺酸溶液(100μl,92.4μmol)。振荡溶液并于室温(22℃)在端至端旋转器中缓慢旋转。平行进行一个含有乙醇的空白代替试剂溶液。修饰后接着对10μl回收样品进行活性测定并根据上述方法确定。反应在2.5小时后终止,当另一份试剂加入反应时不改变蛋白酶活性。溶液(2.5ml)在一次性去盐柱(PharmaciaBiotech PD-100TM,SephadexTM G-25M)上纯化。用缓冲液(25ml;5mM MES,2mM CaCl2,pH6.5)平衡柱并将样品上样到顶部。丢弃最初收集的2.5ml。用MES缓冲液(3.5ml)洗脱蛋白并收集在三个组分中。在凝胶(SDS-PAGE,Pharmacia Phast-SystemTM)上检查时,所有组分表现为单一条带,并且不能与跑作对照的Cys突变体或野生型区分开。合并三个组分并于0℃逆着去离子水(3×1升)透析,接着冷冻干燥过夜得到修饰的突变体(1.43g)。与Cys突变体(47.1U/mg)相比,特异活性是64.3U/mg。测定修饰的蛋白酶的活性
使用Bonnean,P.等(1991)美国化学学会杂志,113(3):1030中所述的方法,测定对于合成肽底物琥珀酰-L-ALa-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺的水解活性,包括动力学参数Kcat,Km和Kcat/Km。简要地说,将一小分枯草杆菌蛋白酶变体贮备液加入含有底物的1cm试管中,并于25℃保温。底物溶于含有0.5M NaCl和1%DMSO的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)或相似地含有0.05%TweenTM 80和1%DMSO的0.1M Tris缓冲液(pH8.6)中。反应进程后,通过使用Perkin Elmerλ2分光光度计检测410mm处反应产物对硝基苯胺的吸光度进行分光光度分析(Δε4108800m-1cm-1)。通过测定0.25mM-4.0mM(8个浓度)的底物浓度的起始斜率并将此数据用于Michaelis-Menten方程式得到动力学参数。
表1表示某些硫磺酸盐的缩写,表2表示修饰的迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(SBL)和前体枯草杆菌蛋白酶(SBL-WT)于pH7.5时的动力学参数。如上述在定点诱变将目的氨基酸用半胱氨酸替换后制备修饰酶。按上述测定pH7.5时的动力学参数。前体蛋白酶是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(SBL-WT)。
表1
缩写 | 结构 |
-SBn | -SCH2C6H5 |
-Siso butyl | -SCH2CH(CH3)2 |
-Sneo-pentyl | -SCH2C(CH3)3 |
-SCH2cyclohexy l | -SCH2-c-C6H11 |
-Sdecyl | -S-n-C10H21 |
表2
实施例4改变迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的特异性
酶 | KM(mM) | kcat(s-1) | kcat/KM |
SBL-WT | 0.55 | 48 | 87 |
N62C | 1.49 | 61 | 41 |
N62C-SCH2CH2NH3 + | 1.2 | 63 | 52 |
N62C-SCH2CH2SO3 - | 0.83 | 66 | 86 |
N62C-Siso-butyl | 0.84 | 76 | 90 |
N62C-SBn | 0.37 | 70 | 189 |
N62C-Sneo-pentyl | 0.78 | 96 | 123 |
N62C-S-hexyl | 0.54 | 136 | 252 |
N62C-SCH2cyclohexyl | 0.48 | 135 | 281 |
N62C-Sdecyl | 0.35 | 69 | 197 |
L217C | 0.9 | 16.1 | 18 |
L217C-SCH2CH2NH3 + | 0.71 | 12.4 | 17 |
L217C-SCH2CH2SO3 - | 0.77 | 20.6 | 27 |
L217C-Siso-butyl | 0.53 | 37 | 70 |
L217C-SBn | 0.65 | 31.6 | 49 |
L217C-Sneo-pentyl | 0.47 | 40 | 85 |
L217C-Shexyl | 0.45 | 61 | 136 |
L217C-SCH2cyclohexyl | 0.51 | 29.8 | 58 |
L217C-Sdecyl | 0.55 | 77 | 140 |
M222C | 0.77 | 17.3 | 22 |
M222C-SCH2CH2NH3 + | 0.61 | 1.06 | 1.7 |
M222C-SCH2CH2SO3 - | 0.55 | 1.64 | 3 |
M22C-SBn | 0.67 | 6.9 | 10 |
S156C | 0.65 | 43 | 66 |
S156C-SCH2CH2NH3 + | 0.86 | 39 | 45 |
S156C-SCH2CH2SO3 - | 0.78 | 31.6 | 40 |
S156C-Siso-butyl | 0.60 | 24.2 | 40 |
S156C-SBn | 0.54 | 21.8 | 40 |
S166C | 0.51 | 14.2 | 28 |
S166C-SCH2CH2NH3 + | 0.60 | 16.3 | 27 |
S166C-SCH2CH2SO3 - | 0.70 | 3.8 | 5.4 |
S166C-Siso-butyl | 0.91 | 29 | 32 |
S166C-SBn | 0.74 | 6.9 | 9 |
底物特异性,特别是S1亚位点特异性的改变可以通过使用各种硼酸作为竞争抑制剂来证明。使用硼酸抑制剂评估上述四种修饰的S156突变体和三种修饰的S166C突变体。修饰的突变体是S156C-SMe,S156C-SBn,S156C-SCH2CH2SO3 -,S156C-SCH2CH2NH3 +,S166C-SCH2CH2SO3 -,S166C-SCH2CH2NH3 +和S166C-SBn。
按以前在Seufer-WasserthaL等(1994)生物有机化学和医学化学,2:35-48中所述的,制备硼酸并测定pH8.6时它们的抑制常数(Waley,1982,生物化学杂志,205:631-337)。结果在图1和图2中表示。实施例5洗涤表现测试
通过测定污渍从EMPA116(棉布上的血/牛奶/碳黑)布样(Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030)的清除来评价前面实施例中所述的几种修饰酶的洗涤表现。布料已经以下列方式预漂白:在4升玻璃杯中,将1.9g过硼酸盐四水合物、1.4g过硼酸盐单水合物和1gTAED(四乙酰乙二胺)于60℃搅拌1分钟溶于3升去离子水。加入36个EMPA 116布样并搅拌3分钟。立即用冷去离子水冲洗布样10分钟。布样平放在吸水纸布上干燥过夜。
5块预漂白的EMPA116布样放入装有100ml水,3gpg硬度(Ca++:MG++∷3∶1∷重量∶重量)和0.67g含有适当漂白剂和酶的去污剂的7243 S型Tergotometer(United States Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ)的每一个盆中。去污剂基础是来自wfk-Testgewebe GmbH,Adlerstrasse42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,德国的WFK1去污剂,
向此基础去污剂,进行下列添加:
去污剂基础成分 | 最后配方中的百分数 |
Zeolite A | 25% |
硫酸钠 | 25% |
碱灰 | 10% |
线型烷基苯磺酸盐 | 8.8% |
醇乙氧基化合物(7-8 EO) | 4.5% |
钠皂 | 3% |
硅酸钠(SiO2∶Na2O∷3.3∶1) | 3% |
漂白成分 | 最后配方中的百分数 |
过硼酸钠单水合物 | 7% |
过硼酸钠四水合物 | 9.2% |
TAED | 4.5% |
过硼酸钠单水合物和过硼酸钠四水合物来自Degussa Corporation,Ridgefield Park,NJ 07660。TAED(四乙酰乙二胺)来自WarwickInternational,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,England。
预漂白的EMPA 116布样在含0.1ppm酶的去污剂中于20℃洗20分钟并随后在1000ml水中洗5分钟两次。干燥并烫平布样,使用在MinoltaChroma Meter,Model CR-200(Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07446)实验读数上的L值测定布样的反射系数。表现表达为污渍清除百分数和相对于天然迟缓芽孢杆菌蛋白酶的污渍清除百分率。污渍清除百分数使用如下方程式计算:
表3
实施例7改变前体枯草杆菌蛋白酶的PH模式
酶 | 污渍清除百分数 | 污渍清除相对百分数 |
SBL-WT | 8.1 | 100 |
N62C-SCH2CH2SO3 - | 13.4 | 165 |
S166C-SCH2CH2SO3 - | 12.8 | 158 |
L217C-SCH2CH2SO3 - | 13.2 | 163 |
为检测化学修饰对SBL的PH模式的影响,如上述制备7种修饰的N62C突变体。离子强度0.05M(用KCl调节)的0.02M乙二胺缓冲液与1.25×104琥珀酰-AAPF-pNA底物一起使用,并如上述进行Kcat/Km测定。Kca/Km反映的游离酶中SBL催化三联体部分His的PKa并且不受非反应性结合模式的影响[Fersht,A.E.,1985,酶结构和机制,第二版,Freeman(New York)]。PKa使用Graphlt(McGeary & Associates,Middletown CT)计算。PKa的变化反应了SBL的PH模式的改变。SBLN62C-Scylcohexyl(N62C-Scy)和SBL-WT的典型PH模式在图3中表示(25℃时,[E]=1×10-7-1×10-8M)。所有的点一式两份。
表4表示His64的pKa,野生型(WT)迟缓芽孢杆菌的PKa和7种修饰的N62C SBL突变体的Kcat/Km。
表4
SBL酶 | His64的pKa | ΔpKa | Kcat/KM(s-1mM-1) |
WT | 6.91 | - | 87 |
N62C | 6.7 | 0.21 | 49 |
N62C-SMe | 6.7 | 0.21 | 66 |
N62C-SCH2CH2NH3 + | 6.62 | 0.29 | 52 |
N62C-SCH2CH2SO3 - | 7 | 0.09 | 86 |
N62C-Scyclohexyl | 6.4 | 0.51 | 281 |
N62C-SBn | 6.71 | 0.20 | 189 |
N62C-Sdecyl | 6.19 | 0.72 | 197 |
如表4中所示,与野生型相比,N62C-Scyclohexyl修饰的SBL观察到His64的pKa下降了非常明显的0.5单位。因此,有可能在不改变表面电荷的情况下加工改变的PH模式。
尽管本发明结合特异的实施方案进行描述,但是应当理解本发明能进一步得到修饰,并且此申请预期包括总的遵照本发明原理的本发明的变化或改进,并包括如本发明涉及并因此可应用于前述基本特征的领域内已知的或常规实践中带来的背离本公开的本发明的变化或改进,并且这一些符合附后的权利要求书的范围。
在上述说明书中提及的所有公开文献和专利或申请在此引用作为参考。
Claims (42)
1.一种修饰酶,其中有一个或多个氨基酸被半胱氨酸残基置换,其中半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换硫醇氢来修饰:
a)-SR1R2其中,R1是烷基,而R2是带电或极性组分;
b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;
c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环己基;和
d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。
2.权利要求1的修饰酶,其中R1是C1-10烷基。
3.权利要求1的修饰酶,其中R2是带正电荷的。
4.权利要求3的修饰酶,其中R2是NH3 +。
5.权利要求1的修饰酶,其中R2是带负电荷的。
6.权利要求5的修饰酶,其中R2是SO3 -。
7.权利要求1的修饰酶,其中酶是蛋白酶。
8.权利要求7的修饰酶,其中蛋白酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。
9.权利要求7的修饰的蛋白酶,其中用半胱氨酸置换的氨基酸选自精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸。
10.权利要求9的修饰的蛋白酶,其中精氨酸是蛋白酶的亚位点。
11.权利要求10的修饰的蛋白酶,其中亚位点是S2。
12.权利要求11的修饰的蛋白酶,其中精氨酸在62位。
13.权利要求1的修饰酶,在R3或R4之前进一步包含烷基R以形成-SRR3或-SRR4。
14.权利要求13的修饰酶,其中R是C1-10烷基。
15.一种修饰酶,其中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基置换,其中半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链-SR6的取代基置换硫醇氢来修饰,其中R6是C1-6烷基并且其中氨基酸残基选自精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。
16.一种制备修饰酶的方法,包括
(a)提供其中一个或多个氨基酸被半胱氨酸残基置换的酶;并且
(b)用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换硫醇氢:
a)-SR1R2,其中R1是烷基,而R2是带电或极性组分;
b)-SR3,其中R3是取代的或非取代的苯基;
c)-SR4,其中R4是取代的或非取代的环己基;和
d)-SR5,其中R5是C10-C15烷基。
17.权利要求16的方法,其中R1是C1-10烷基。
18.权利要求16的方法,其中R2是带正电荷的。
19.权利要求18的方法,其中R2是NH3 +。
20.权利要求16的方法,其中R2是带正电荷的。
21.权利要求20的方法,其中R2是SO3 -。
22.权利要求16的方法,其中酶是蛋白酶。
23.权利要求22的方法,其中蛋白酶是迟缓芽孢杆菌蛋白酶。
24.权利要求16的方法的蛋白酶,其中用半胱氨酸置换的氨基酸选自精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸。
25.权利要求23的方法,其中精氨酸是蛋白酶的亚位点。
26.权利要求25的方法,其中亚位点是S2。
27.权利要求26的方法,其中精氨酸在62位。
28.权利要求16的方法,在R3或R4之前进一步包含烷基R以形成-SRR3或-SRR4。
29.权利要求28的方法,其中R是C1-10烷基。
30.一种制备修饰酶的方法,包括
(a)提供其中一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸残基置换的酶,其中氨基酸选自精氨酸、亮氨酸和丝氨酸;并且
(b)用提供硫醇侧链-SR6的取代基置换硫醇氢,其中R6是C1-6烷基。
31.包含权利要求1或15的修饰酶的去污剂添加剂。
32.包含权利要求1或15的修饰酶的食品添加剂。
33.包含权利要求1或15的修饰酶的处理纺织品的组合物。
34.权利要求1的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SR1R2,其中R1是CH2CH2,R2是SO3
35.权利要求1的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SRR3,其中R是CH2,R3是C6H5。
36.权利要求1的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SR1R4,其中R是CH2,R4是c-C6H11。
37.权利要求1的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SR5,其中R5是n-C10H21。
38.权利要求1的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是L217,并且硫醇侧链是-SR5,其中R5是n-C10H21。
39.权利要求15的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SR6,其中R6是CH2C(CH3)3。
40.权利要求15的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是N62,并且硫醇侧链是-SR6,其中R6是C5H11。
41.权利要求15的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是L217,并且硫醇侧链是-SR6,其中R6是CH2C(CH3)3。
42.权利要求15的修饰酶,其中酶是迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶,氨基酸是L217,并且硫醇侧链是-SR6,其中R6是C5H11。
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