JP2002345465A - 核酸精製ユニット及び核酸精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 減圧及び加圧操作だけで核酸を含む試料
溶液から核酸を分離できる核酸精製ユニット及びそのユ
ニットを用いた核酸の精製方法を提供することにある。 【解決手段】 上記課題は、（ａ）核酸の吸着及び脱着
が可能な固相と、（ｂ）この核酸の吸着及び脱着が可能
な固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器
と、及び（ｃ）前記容器の一の開口に結合された圧力差
発生装置とを含む核酸精製ユニット、及びその精製ユニ
ットを用いた核酸精製方法によって達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学の分野
に関する。特に、本発明は核酸を精製するユニット及び
それを用いた核酸を精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸は、様々な分野で、種々の形態で使
用されている。例えば、組換え核酸技術の領域において
は、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核
酸の形状で用いることを要求する。

【０００３】診断分野においても、核酸は種々の方法で
用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原
体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に
核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食
品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は
遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現にお
よぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定
および単離において日常的に用いられている。

【０００４】多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手
できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要す
る。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損
失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカル
チャーから得られた試料の核酸の精製においては、コン
タミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険
性も加わる。

【０００５】従来一般的に行われている精製方法では、
遠心分離操作が含まれている。例えば特公平７−５１０
６５、特表平２０００−５０５２９５等に開示されてい
る方法では、シリカ粒子に代表される、核酸が結合可能
な固相に核酸を含む試料液を接触させて当該固相に核酸
を結合させ、次いで遠心分離により核酸が結合した固相
を分離している。

【０００６】しかし、遠心分離操作には大きな問題点が
ある。即ち、遠心分離機にかける必要があるため、精製
操作を連続的な工程に組み込むことができない。また、
通常試料を移し替えるので、試料が汚染される機会が増
える。

【０００７】また、クロマトグラフィ法を利用した精製
方法も公開されているが（特開２０００−９３１７
１）、この方法では、独立した液体吸引器具を使用し
て、液体の吸入及びカラムへの吐出操作が必要で、操作
が煩雑となる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遠心
分離操作を必要とせず、また操作が煩雑なクロマトグラ
フィ法と異なり、減圧及び加圧操作だけで核酸を含む試
料溶液から核酸を分離できる核酸精製ユニット及びその
ユニットを用いた核酸の精製方法を提供することであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、（ａ）
核酸の吸着及び脱着が可能な固相、（ｂ）この核酸の吸
着及び脱着が可能な固相を収容する、少なくとも２個の
開口を有する容器、及び（ｃ）前記容器の一の開口に結
合された、圧力差発生装置を含む核酸精製ユニット、及
びその精製ユニットを用い、減圧及び加圧操作による核
酸を含む試料溶液の吸引及び排出操作と、それに続く核
酸洗浄バッファ溶液の吸引及び排出操作と、それに続く
核酸の吸着及び脱着が可能な固相に吸着された核酸を脱
着せしめうる液の吸引及び排出操作を含む核酸精製方法
により達成された。ここで、本発明において「核酸」は
一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、また、分子量の制限
も無い。

【００１０】

【発明の実施の形態】核酸の吸着及び脱着が可能な固相
（以下、「固相」と記す）としては、シリカゲル、ガラ
ス、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジル
コニウム、金属酸化物及び／又は混合金属酸化物等から
なる多孔性又は非多孔性の無機材料が挙げられる。これ
らの中ではガラス、特にガラス繊維濾紙が好ましい。ガ
ラス繊維濾紙としては、ワットマン社製のＧＦ／Ａ、Ｇ
Ｆ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ、ＧＦ／Ｄ、あるいはアドバンテック
社の製品等が使用できる。この際、これらのガラス繊維
濾紙の密度、保留粒子径、ガラス繊維の太さ等には無関
係に使用可能である。

【００１１】この固相を収容する容器の材料に特別な限
定はなく、固相が収容でき、かつ少なくとも２個の開口
を設けることができればよいが、製造の容易性からプラ
スチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタ
アクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あ
るいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。

【００１２】以下、固相としてガラス繊維濾紙を使用し
た態様を例にして、本発明について詳細に説明する。

【００１３】容器は、通常、ガラス繊維濾紙を収容する
本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少な
くとも１個の開口が設けられている。一方は核酸を含有
する試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液及び核酸の吸着及
び脱着が可能な固相に吸着された核酸を脱着せしめうる
液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口と
して使用され、他方は容器内を減圧又は加圧状態にせし
めうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に
限定はないが、製造が容易で、試料溶液等がガラス繊維
濾紙の全面に拡散し易くするには、断面を円形にするこ
とが好ましい。断面を四角形にすることも、ガラス繊維
濾紙の裁断屑を発生させないために好ましい。

【００１４】上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内
部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されて
いる必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法
は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込
み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙
げられる。

【００１５】容器の内容積は処理すべき試料溶液の量の
みによって決められるが、通常、収容するガラス繊維濾
紙の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍで直径が約２ｍ
ｍ〜２０ｍｍのガラス繊維濾紙を１枚〜６枚程度収容す
る大きさとすることが好ましい。

【００１６】ガラス繊維濾紙の端面は、試料溶液等が通
過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ま
しい。

【００１７】試料溶液等の入り口に使用される開口に対
向するガラス繊維濾紙の下は、容器の内壁に密着させず
に空間を設け、試料溶液等がガラス繊維濾紙の全面にで
きるだけ均等に拡散する構造にする。

【００１８】他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合
される開口に対向するガラス繊維濾紙の上には、ほぼ中
央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材
は、ガラス繊維濾紙を押さえると共に、試料溶液等を効
率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴
に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する
形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角
度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量やガラス繊
維濾紙を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が
適宜定めることができる。この部材と当該開口の間に
は、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発
生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けるこ
とが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択す
ることができる。なお、核酸を効率良く集めるために
は、ガラス繊維濾紙の全体が浸る以上の量の核酸を含む
試料溶液を吸引することが好ましい。

【００１９】また、吸引している開口の真下の部分にの
み試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等がガ
ラス繊維濾紙内を比較的均一に通過できるようにするた
め、ガラス繊維濾紙とこの部材の間にも空間を設けるこ
とが好ましい。このためには、当該部材からガラス繊維
濾紙に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突
起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができる
が、空間を保持しながらガラス繊維濾紙の開口面積をで
きる限り大きく保つことが好ましい。

【００２０】なお、容器に３以上の開口を設けた場合に
は、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能に
すべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があること
はいうまでもない。

【００２１】圧力差発生装置は、まずガラス繊維濾紙を
収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引
する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あ
るいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポ
ンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器
が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタ
は片手操作が容易にできるという利点を有する。

【００２２】次に、上記核酸精製ユニットを使用した、
核酸の精製方法について説明する。本発明において使用
できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断
分野においては、検体として採取された全血、血漿、血
清、尿、便、***、唾液等の体液等から調製された溶液
が対照となる。

【００２３】最初にこれらの検体を核酸溶解バッファ溶
液で処理する。本発明で使用する核酸溶解バッファは主
剤、緩衝剤、必要に応じて界面活性剤、及びプロテアー
ゼＫ等の細胞膜を溶解する試薬を含む水溶液である。主
剤としては塩化グアニジン、イソチオシアン酸グアニジ
ン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、沃
化ナトリウム等が使用でき、緩衝剤としては、Ｔｒｉ
ｓ、ＥＤＴＡが、界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００等が使用できる。これらの内では、塩化グアニジ
ン及びＴｒｉｓが好ましい。緩衝剤の好ましい濃度は１
０〜１００ｍＭ、界面活性剤の好ましい濃度は０．１〜
１０％である。

【００２４】このように調製された核酸を含む試料溶液
中に、上記の、本発明に係る核酸精製ユニットの一の開
口を挿入する。次いで他の一の開口に接続された圧力差
発生装置を用いて精製ユニットの内部を減圧にして試料
溶液を容器内に吸入する。この操作により、試料溶液が
固相と接触して試料溶液中にある核酸が固相に吸着す
る。この際に、固相のほぼ全体と接触する量の試料溶液
を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引
すると装置を汚染するので、適量に調整する。

【００２５】適量の試料溶液を吸引後、圧力差発生装置
を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排
出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引
後直ちに排出してもよい。

【００２６】次に、上記と同様の減圧−加圧操作で核酸
洗浄バッファ溶液を容器内に吸引し、これから排出して
容器内部を洗浄する。この溶液は容器内に残留する試料
溶液を洗い流すと共に、核酸と一緒にガラス繊維濾紙に
吸着した試料溶液中の不純物も洗い流す機能を有する。
従って、ガラス繊維濾紙から核酸は脱着させないが不純
物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッ
ファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤
を含む水溶液からなり、主剤としてはメチルアルコー
ル、エチルアルコール、ブチルアルコール、アセトン等
の約１０〜９０％（好ましくは約５０〜９０％）の水溶
液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及
び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エチルア
ルコール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む
溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び
０．１〜１０％である。

【００２７】次に、ガラス繊維濾紙に吸着した核酸を脱
着せしめうる溶液を、上記と同様の減圧−加圧操作によ
って容器内部に導入し、容器から排出する。この排出液
には目的とする核酸が含まれているので、これを回収
し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）による核酸の増幅に提供する。

【００２８】以下、実施例により本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２９】

【実施例】実施例１ 核酸精製ユニット 図１は、本発明に係る核酸精製ユニットの断面図であ
る。但し圧力差発生装置は図示していない。固相を収容
する容器１は、本体１０と蓋２０から成り、透明なポリ
スチレンで形成されている。本体１０はガラス繊維濾紙
３０としてＧＦ／Ｄ（ワットマン社製）を６枚収容して
いる。また、試料溶液等を吸引する開口１０１を有す
る。開口から続いている底面１０２は漏斗状に形成さ
れ、ガラス繊維濾紙３０との間に空間１２１が設けられ
ている。ガラス繊維濾紙３０を支えて空間１２１を保つ
ために、底面１０２と一体となった枠１０３が設けられ
ている。

【００３０】本体は、内径が２０．１ｍｍ、深さが５．
９ｍｍ、底面１０２から開口１０１までの長さは約７０
ｍｍである。また、内蔵されているガラス繊維濾紙３０
の直径は２０．０ｍｍ、一枚の厚さは０．９１ｍｍであ
る。

【００３１】図１において、ガラス繊維濾紙の上部には
漏斗状の押さえ部材１３が設けられている。押さえ部材
１３の中央には穴１３１があり、かつ下方に一群の突起
１３２が設けられ、ガラス繊維濾紙３０との間に空間１
２２が設けられている。ガラス繊維濾紙３０と本体１０
の壁１０４の間から試料溶液等が漏れにくい様に、壁１
０４の上部の直径はガラス繊維濾紙の直径より大きく作
成され、段差１０５の上に押さえ部材１３の端が乗って
いる。

【００３２】蓋２０は本体１０と超音波加熱により接合
されている。蓋２０のほぼ中央部には、圧力差発生装置
を結合する開口２１が設けられている。蓋２０と押さえ
部材１３の間には、穴１３１から流出する試料溶液等を
保持する空間１２３が設けられている。空間１２３の容
積は約０．１ｍｌである。

【００３３】実施例２ 実施例１の核酸精製ユニットを
使用した核酸の精製 市販の採血管を用いて、ヒト全血を２ｍｌ採血した。こ
の全血に、表１の組成を有する核酸溶解バッファ溶液２
ｍｌを添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。

【００３４】 表１ 核酸溶解バッファ溶液の組成 塩化グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＩＣＮ社製） １０ｇ プロテアーゼＫ ２０μｌ ２回蒸留水 １０００ｍｌ

【００３５】インキュベート後、実施例１に記載した核
酸精製ユニットの開口１０１を液中に挿入し、開口２１
に、テルモ社製の５ｍｌの注射器を接続して（図示せ
ず）吸引した。この際、吸引速度に限定は不要なので、
液が注射器内に流入しないように目視で調節した。つい
で、開口２１に接続されたままの注射器を用いて加圧
し、液を排出した。後述する通り、この操作により、ガ
ラス繊維濾紙に核酸が吸着された。

【００３６】排出後直ちに、表２の組成を有する核酸洗
浄バッファ溶液中に開口１０１を挿入し、同様の減圧−
加圧操作によってユニット内部を洗浄した。

【００３７】表２ 核酸洗浄バッファ溶液の組成 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ７０％ エタノール

【００３８】この洗浄は、ガラス繊維濾紙に吸着した不
純物及び容器内部の核酸を含む試料溶液の残留物を洗浄
するための操作であり、ガラス繊維濾紙に吸着された核
酸にはなんら影響を与えない。

【００３９】洗浄液の排出後直ちに、２ｍｌの精製蒸留
水を用いて同様の吸引−排出操作を行い、この排出液を
回収した。この操作により、ガラス繊維濾紙に吸着した
核酸が精製蒸留水中に脱着し、回収された。

【００４０】実施例３ 核酸の回収量の定量 実施例２で回収した液の吸光度を測定することにより、
液中に含まれる核酸の量と純度を定量した。当業者に公
知の方法に従い、波長２６０ｎｍにおける吸光度により
核酸の量を定量し、波長２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにお
ける吸光度の比率から純度を決定した。なお、この比率
が１．８以上であれば純度は良好であると判断される。
測定結果を表３に示す。

【００４１】 表３ 吸光度の測定 試料番号 核 酸 量 吸光度の比率 （２６０ｎｍ／２８０ｎｍ） １ １２１μｇ １．８６５ ２ １０８μｇ １．９３２ ３（バッフィーコート） ２９１μｇ １．８９９

【００４２】実施例４ ＰＣＲによる増幅 実施例２で回収した液を用いて、ＰＣＲによる核酸の増
幅を実施した。先ず、表４に示す組成の液を調製した。

【００４３】 表４ 液組成 回収液 ２μｌ 精製水 ３６．５μｌ ＰＣＲバッファ１０倍希釈液 ５μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ Ｔａｑ ＦＰ ０．５μｌ ブライマー ２μｌ (Ｐ５３エクソン６を増幅するように設計)

【００４４】この液を９４℃で３０秒間変性した後、６
５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長反
応を行った。この工程を３０回繰り返した。こうして得
られた液と、ポジティブコントロールとしてクロンテッ
ク社製のHuman DNAと、及びネガティブコントロールと
して精製水を用い、１．５％アガロースゲルにて１時
間、定法に従って電気泳動を実施した。結果を図２に示
す。図２において、最上段はマーカーの、二段目はポジ
ティブコントロールの、三段目はサンプル１の、そして
四段目はサンプル２の電気泳動の結果である。また、何
も現れていない最下段はネガティブコントロールの結果
である。

【００４５】実施例３及び実施例４の結果から、実施例
２で得た回収液中には実用的な量及び純度の核酸が含ま
れていたことが判る。

【００４６】

【発明の効果】本発明の核酸精製ユニット及び核酸精製
方法により、圧力差を利用した試料溶液等の吸引及び排
出という簡単な操作で、血液等から実用的な量及び純度
の核酸を得ることができる。本発明の方法は、特に連続
工程中に容易に組み込むことができるという利点を有す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明になる核酸精製ユニットの一
例である。但し、開口２１に結合されるべき圧力差発生
装置は図示していない。

【図２】 図２は、本発明の核酸精製ユニットを使用
し、本発明の核酸精製方法によって回収した核酸をＰＣ
Ｒによって増幅した試料の、電気泳動の結果である。

【符号の説明】

１…容器 １０…本体 １０１…開口 １０２…底面 １０３…枠 １０４…壁 １０５…段差 １２１…空間 １２２…空間 １２３…空間 １３…押さえ部材 １３１…穴 １３２…突起 ２０…蓋 ２１…開口 ３０…ガラス繊維濾紙

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (ａ) 核酸の吸着及び脱着が可能な固
   相、 (ｂ) 前記核酸の吸着及び脱着が可能な固相を収容す
   る、少なくとも２個の開口を有する容器、及び (ｃ) 前記容器の一の開口に結合された、圧力差発生装
   置、を含む核酸精製ユニット。
2. 【請求項２】 前記核酸の吸着及び脱着が可能な固相が
   ガラス繊維濾紙である請求項１に記載の核酸精製ユニッ
   ト。
3. 【請求項３】 前記圧力差発生装置が、前記容器の一の
   開口に着脱可能に結合されている、請求項１又は請求項
   ２に記載の核酸精製ユニット。
4. 【請求項４】 前記圧力差発生装置が注射器である請求
   項１に記載の核酸精製ユニット。
5. 【請求項５】 前記圧力差発生装置がピペッタである請
   求項１に記載の核酸精製ユニット。
6. 【請求項６】 前記圧力差発生装置がペリスタポンプで
   ある請求項１に記載の核酸精製ユニット。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の核酸精製ユニットを用
   いる以下の工程を含む核酸精製方法。 (ａ) 前記核酸精製ユニットの一の開口を核酸を含む試
   料溶液中に挿入する工程、 (ｂ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を減圧状態にして
   前記核酸を含む試料溶液を吸引し、前記核酸の吸着及び
   脱着が可能な固相に接触させる工程、 (ｃ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された核酸を含む試料溶液を前記容器外に排出
   する工程、 (ｄ) 前記核酸精製ユニットの一の開口を核酸洗浄バッ
   ファ溶液中に挿入する工程、 (ｅ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を減圧状態にして
   前記核酸洗浄バッファ溶液を吸引し、前記核酸の吸着及
   び脱着が可能な固相に接触させる工程、 (ｆ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された核酸洗浄バッファ溶液を前記容器外に排
   出する工程、 (ｇ) 前記核酸精製ユニットの一の開口を、前記核酸の
   吸着及び脱着が可能な固相に吸着された核酸を脱着せし
   めうる液中に挿入する工程、 (ｈ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を減圧状態にし
   て、前記核酸の吸着及び脱着が可能な固相に吸着された
   核酸を脱着せしめうる液を吸引し、前記核酸の吸着及び
   脱着が可能な固相に接触させる工程、及び (ｉ) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された核酸の吸着及び脱着が可能な固相に吸着
   された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工
   程。