JP2017532016A - 核酸精製カートリッジ - Google Patents
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Abstract
Description
シリカ表面(固相吸着)に対するDNAおよびRNAの親和性に基づく、原初の核酸精製方法は、Boom et al.によって説明された。シリカ表面に対する核酸誘因は、高濃度のカオトロピック塩(典型的には、グアニジンチオシアネートまたはグアニジン塩酸塩)によって助長される。Boom法は、カオトロピック塩溶液を使用して、生物学的サンプルを変性させ、それを遠心力を使用してフィルタを通させ、シリカ表面上へのDNAおよびRNA吸着を助長する。いったん核酸が、フィルタに結合されると、エタノール性緩衝剤を用いた1回またはそれを上回る洗浄が、核酸結合を保ちながら、カオトロピック塩および他の生物学不純物を取り除くために行われる(カオトロピック塩は、下流用途において、大部分の核酸に対して破壊的である)。最終ステップとして、エタノールを取り除いた後(高速スピンを用いて)、核酸は、溶出緩衝剤(水または低塩緩衝剤)を使用して、再水和される必要がある。再水和は、シリカ表面からのDNAおよびRNAの解離を助長し、最終スピンは、精製された核酸が再懸濁される溶液をもたらす。
本発明は、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するためのフィルタを含む封入チャンバを有する、マイクロ流体デバイスであって、該チャンバは、該フィルタに加え、第1の流路を介して、チャンバと減圧発生器の気体連通を可能にする、第1のポートと、第2の流路を介して、チャンバと1つまたはそれを上回るリザーバの液体連通を可能にする、第2のポートと、第3の流路を介して、チャンバと1つまたはそれを上回る受容容器および減圧発生器の両方の気体および液体連通を可能にする、第3のポートとを含む、複数のポートを格納し、第1および/または第2のポートを通してチャンバに進入し、第3のポートを通してチャンバから退出する流体が、フィルタを通して流動するように、フィルタが、第3のポートと第1のポートおよび第2のポートの両方との間に位置する、デバイスに関する。
精製は、原則として、クロマトグラフィにおいて広く知られた任意の効果(例えば、移動、親和性、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除、逆相、および順相)に基づくことができ、その選択肢は、主に、精製されるべき検体に依存する。しかしながら、サイズ排除は、恒久的結合が、本技法の場合、達成されることができないため、他の技法より好ましくない。後者のものに関しては、精製されるべき検体は、媒体に選択的に結合される一方、理想的には、サンプルの他の成分は、結合せずに、媒体を通して通過するという条件が見出され得る。
i)流路内の弁が、第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、第3のポートに対して閉鎖される間、チャンバと第3のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第3のリザーバ内に含有される溶出緩衝剤が、第2のポートを通してチャンバに進入することを可能にするステップ(圧力は、第1の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい)と、
ii)流路内の弁が、第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、第3のポートに対して閉鎖される間、溶出緩衝剤が、所定の時間の間、フィルタと接触することを可能にするステップ(本ステップは、所望の検体を解放するために、フィルタの十分な湿潤を可能にする)と、
iii)流路内の弁が、第1のポートに対して閉鎖され、第2のポートに対して大気圧に通気され、第3のポートに対して開放される間、該第2の受容容器とチャンバとの間に負圧差を印加することによって、溶出緩衝剤(解放された検体を含有する)が、フィルタを通して第2の受容容器の中に流動することを可能にするステップ(圧力は、第3の流路の減圧発生器によって発生されてもよい)と、
によって、詳細に実施されてもよい。
(i)流路内の弁が、第1のポートに対して閉鎖され、第2のポートに対して大気圧に通気され、第3のポートに対して開放される間、第3の流路とチャンバとの間に負圧を印加することによって、所定の時間の間、フィルタを清掃し、かつ乾燥させるステップ(該負圧差は、第3の流路内に位置する減圧発生器によって発生される)、および/または
(ii)流体経路内の弁が、第2のポートおよび第3のポートに対して開放され、第1のポートに対して閉鎖される間、該受容リザーバと該第2のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第2のリザーバ内に位置する洗浄緩衝剤が、第2のポートを通してチャンバに進入し、フィルタを通して受容容器の中に流動することを可能にするステップ(圧力は、第3の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい)、および/または
iii)流路内の弁が、第1のポートに対して閉鎖され、第2のポートに対して大気圧に通気され、第3のポートに対して開放される間、第3の流路とチャンバとの間に負圧を印加することによって、気体が、所定の時間の間、フィルタを通して流動することを可能にするステップ(気体は、液体を移動させ、フィルタを乾燥させ、圧力は、第3の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい)、
のうちの1つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
Claims (17)
- 生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するためのフィルタを含む封入チャンバを有する、マイクロ流体デバイスであって、前記チャンバは、前記フィルタに加え、
a.第1の流路を介して、前記チャンバと減圧発生器の気体連通を可能にする、第1のポートと、
b.第2の流路を介して、前記チャンバと1つまたはそれを上回るリザーバの液体連通を可能にする、第2のポートと、
c.第3の流路を介して、前記チャンバと1つまたはそれを上回る受容容器および減圧発生器の両方の気体および液体連通を可能にする、第3のポートと、
を含む、複数のポートを格納し、
d.前記第1および/または第2のポートを通して前記チャンバに進入し、前記第3のポートを通して前記チャンバから退出する流体が、フィルタを通して流動するように、フィルタが、前記第3のポートと前記第1のポートおよび第2のポートの両方との間に位置する、デバイス。 - 前記デバイスは、マイクロ流体カートリッジであって、使い捨てまたは再使用可能のいずれかである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記精製されるべき検体は、核酸である、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記フィルタは、シリカ、好ましくは、シリカビーズまたはシリカコーティングされたビーズのいずれかを含む、シリカ膜または樹脂である、請求項1から3に記載のデバイス。
- 前記フィルタは、精製空洞内に統合され、固定リングによって固定される、請求項1から4に記載のデバイス。
- 前記精製空洞は、前記デバイス内に位置付けられ、それによって、前記フィルタを固定する、別個の部品である、請求項1から4に記載のデバイス。
- 前記減圧発生器は、シリンジポンプ、ダイヤフラムポンプ、またはそれらの組み合わせである、請求項1から6に記載のデバイス。
- 減圧は、同一減圧発生器を用いて、前記第1のポートおよび/または第3のポートに印加されることができる、請求項1から7に記載のデバイス。
- 圧力センサが、前記受容容器の上流の前記第3の流路内に位置する、請求項1から8に記載のデバイス。
- 別の圧力センサが、前記減圧発生器の下流の前記第1の流路内に位置する、請求項9に記載のデバイス。
- 前記ポートは、それらの流路内の1つまたはそれを上回るマルチポート弁を用いて、個々に、開放、閉鎖、または大気に通気されることができる、請求項1から10に記載のデバイス。
- その対応する弁と前記フィルタとの間に前記第3の流体経路によって封入される死容積は、1μL〜10mLである、請求項11に記載のデバイス。
- 請求項1から12に記載のマイクロ流体デバイスを使用して、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製する方法であって、
(a)前記流路内の弁が、前記第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、前記第3のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記第1のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、液体サンプルが、前記第2のポートを通して前記チャンバに進入することを可能にするステップと、
(b)前記流路内の弁が、前記第1のポートに対して閉鎖され、前記第2のポートに対して大気圧に通気され、前記第3のポートに対して開放される間、前記第1の受容容器と前記チャンバとの間に負圧差を印加することによって、前記サンプルが、前記フィルタを通して第1の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、
(c)前記流路内の弁が、前記第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、前記第3のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記受容容器のうちの1つとの間に負圧差を印加することによって、前記検体を前記フィルタから溶出するステップと、
を含む、方法。 - ステップcにおける溶出は、
i)前記流路内の弁が、前記第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、前記第3のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記第3のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第3のリザーバ内に含まれる溶出緩衝剤が、前記第2のポートを通して前記チャンバに進入することを可能にするステップと、
ii)前記流路内の弁が、前記第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、前記第3のポートに対して閉鎖される間、前記溶出緩衝剤が、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にするステップと、
iii)前記流路内の弁が、前記第1のポートに対して閉鎖され、前記第2のポートに対して大気圧に通気され、前記第3のポートに対して開放される間、前記第2の受容容器と前記チャンバとの間に負圧差を印加することによって、前記溶出緩衝剤が、前記フィルタを通して第2の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、
によって実施される、請求項13に記載の方法。 - ステップaとbとの間に、前記流路内の弁が、前記第1のポートおよび第2のポートに対して開放され、前記第3のポートに対して閉鎖される間、前記サンプルが、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にするステップをさらに含む、請求項13または14に記載の方法。
- ステップbとcとの間に、
(i)前記流路内の弁が、前記第1のポートに対して閉鎖され、前記第2のポートに対して大気圧に通気され、前記第3のポートに対して開放される間、前記第3の流路と前記チャンバとの間に負圧を印加することによって、所定の時間の間、前記フィルタを清掃し、かつ乾燥させるステップ、および/または
(ii)前記流路内の弁が、前記第2のポートおよび第3のポートに対して開放され、前記第1のポートに対して閉鎖される間、受容リザーバと第2のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第2のリザーバ内に位置する洗浄緩衝剤が、前記第2のポートを通して前記チャンバに進入し、前記フィルタを通して受容容器の中に流動することを可能にするステップ、および/または
iii)前記流路内の弁が、前記第1のポートに対して閉鎖され、前記第2のポートに対して大気圧に通気され、前記第3のポートに対して開放される間、前記第3の流路と前記チャンバとの間に負圧を印加することによって、気体が、所定の時間の間、前記フィルタを通して流動することを可能にするステップ、
のうちの1つまたはそれを上回るステップをさらに含む、請求項13から15に記載の方法。 - 前記弁のうちの1つまたはそれを上回るものは、前記圧力差によってトリガされる、請求項13から16に記載の方法。
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