JP2002069097A - 軟骨型プロテオグリカンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、有害な試薬を使用することなく簡
単で低コストの軟骨型プロテオグリカンの精製方法を提
供する。 【解決手段】粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用
いることを特徴とするプロテオグリカンの精製方法であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は軟骨型プロテオグリ
カンの新規な精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来技術】複合糖質としての軟骨型プロテオグリカン
分子１個は、図１に示すような構造を有し、分子量数万
から数十万のコアタンパク質と呼ばれる骨格のタンパク
質１本に、分子量数千から数十万の長大な糖鎖グリコサ
ミノグリカン（以下ＧＡＧ糖鎖という。）が数本から数
十本結合した生体高分子である。ＧＡＧ糖鎖は、その基
本骨格によりコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸など
数種類に分けられ、基本的にはアミノ糖とウロン酸の二
糖繰り返し構造からなる長鎖のヘテロ酸性多糖であり、
ヒアルロン酸以外のＧＡＧはコアタンパク質に結合して
プロテオグリカンを形成している。

【０００３】プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアル
ロン酸とともに、ほとんどすべての動物組織において、
細胞と細胞の間にある細胞外マトリックスの重要な構成
成分として普遍的に存在しており（図２）、組織構築の
重要な役割を担っているほか、細胞を取りまく物理的環
境を⊃くり、接着、増殖、分化といったさまざまな細胞
活動を制御している。細胞外マトリックスの各分子やＧ
ＡＧは、単独でも水分の保持と補充、解毒、鎮痛などの
機能をもつが、これらがお互いに結合し、巨大な構造に
なって相互作用したときには、より大きな効果を発揮す
る。

【０００４】本発明の対象としている軟骨型プロテオグ
リカンは、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧそれぞれ
のみの構造に比して巨大な分子量を持ち、かつ複雑な構
造であるため、プロテオグリカン単独でも他より高い水
分保持能力及び水分補充能力を持つとともに、そのＧＡ
Ｇ糖鎖部分の生物学的情報シグナル構造に依存した他の
機能をも期待できる。

【０００５】しかし、現時点でのプロテオグリカンの精
製方法は、主としてウシやクジラの軟骨を原材料とし
て、クロロホルム、メタノール、グアニジン塩酸塩など
のような毒性や有害性を有する試薬類を使用し、複雑な
工程を経て精製しているが、産業上利用できるレベルで
はなく、実験用試薬として極微量に精製されたものが、
１ｇあたり数千万円という価格で販売されている。

【０００６】本出願人らは、以前サケの鼻軟骨を原材料
とし、精製方法を簡略化し、産業上利用できるレベルの
量産精製方法を発明し特許出願した（平成１１年１１月
２２日出願 特願平１１−３３１３７５号）。この方法
は具体的にはサケの鼻軟骨を粉砕、脱脂処理、溶媒抽
出、透析等の手段を行うものであって、これにより大量
精製、低コストの精製方法は得られたが、脱脂処理、あ
るいは溶媒抽出にクロロホルム、メタノール、グアニジ
ン塩酸塩などの他にタンパク質分解酵素阻害剤等の有害
試薬も用いたため、人体内に摂取する医薬品の医薬材
料、健康補助食品の添加剤としての応用は難しく、医薬
部外品、化粧品材料としての用途に限られていた。ま
た、上記の試薬類の販売価格もかなり高額なため、精製
コストの低減も限界があった。

【０００７】他方、本出願人らは低価格のプロテオグリ
カンを発表したため、化粧品業界のみならず、加工食
品、健康補助食品、医薬品業界からもプロテオグリカン
応用商品の開発ニーズが高まった。しかし、プロテオグ
リカンを加工食品、健康補助食品、医薬品などへ応用す
るためには、プロテオグリカンの精製方法に特段の注意
が必要である。プロテオグリカンの精製においてグアニ
ジン塩酸塩を使用するというのが一般的であるが、その
グアニジン塩酸塩は無論のこと、クロロホルム、メタノ
ール、タンパク質分解酵素阻害剤等の有毒、有害な試薬
を一切使用しないこと、及びより簡便でより低コストな
精製方法を得ることを強く求められた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
上述のような状況に対応してプロテオグリカンの精製過
程において有毒、有害な試薬を一切使用しないこと、及
びより簡単でより低コストな精製方法について種々検討
した結果、本発明を完成したもので、本発明の目的は、
有害な試薬を使用することなく簡単で低コストの軟骨型
プロテオグリカンの精製方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本願の請求項１の発明
は、粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用いること
を特徴とするプロテオグリカンの精製方法であり、請求
項２の発明は、粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を
用い、得られた溶出液を濾過後遠心分離し、上澄み液に
食塩飽和エタノールを加えて再度遠心分離して粗プロテ
オグリカンを濃縮させたことを特徴とするプロテオグリ
カンの精製方法である。そして、請求項３の発明は、粗
プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用い、得られた溶
出液を濾過後遠心分離し、上澄み液に食塩飽和エタノー
ルを加えて遠心分離することにより得られた粗プロテオ
グリカンを含む半固形沈殿物を酢酸に溶解し、次いで透
析することにより、粗プロテオグリカンの純度をさらに
向上させることを特徴としたプロテオグリカンの精製方
法である。

【００１０】即ち、本発明では、クロロホルム、メタノ
ール、グアニジン塩酸塩、タンバク質分解酵素阻害剤等
の有毒、有害な試薬に替えて、プロテオグリカンの全精
製過程を通して酢酸、食塩及び未変性エタノールだけを
使用することとした。これらの試薬はいずれも一般の加
工食品に利用されているものばかりである。またより簡
便な精製方法を得るために、前記の特許出願において用
いていた尿素による置換、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ
法による分離精製課程を省略することとした。

【００１１】

【発明の実施の形態】次に本発明の実施の形態を具体的
に説明する。本発明のプロテオグリカンの原材料として
は、ウシやクジラの軟骨を使用してもよいが、入手の容
易性、及びコストの面等から見てサケの鼻軟骨が好まし
く、特に、青森県沿岸で漁獲されたシロサケを缶詰等の
食料品に加工処理した際に排出される頭部を使用するこ
とが好ましい。使用する酢酸としては食品用、工業用品
等何れでもよいが、その得られるプロテオグリカンの使
用目的によって適宜選択する。その濃度は後述の試験よ
り４％のものが好ましいが、この濃度に限定されるもの
ではない。

【００１２】

【実施例】実施例１ 原料として青森県沿岸で漁獲されたシロサケを缶詰等の
食料品に加工処理した際に排出される頭部を使用し、こ
れを一旦−３０℃にて保存する。上記の保存した上記原
料を４℃で２０時間解凍後、包丁を用いてサケ頭部から
鼻軟骨を採取して出発材料とした。このサケ鼻軟骨から
ピンセットを用いて固形脂肪を可及的に除去し、生理的
食塩水で洗浄した。次いで、手回し式肉挽き器で細かく
粉砕し、サケ鼻軟骨のミンチを得た。このミンチの一部
を１０倍容量（Ｗ／Ｖ）の業務用醸造酢（食酢中の酢酸
とほぼ同濃度の４％に希釈して使用する。以後４％酢酸
と記す。）中に４℃で０，６，１２，２４，４８，７
２，１２０，１６８時間浸し、撹拌して、粗プロテオグ
リカンの溶出状態をカルバゾール・硫酸法によるウロン
酸量として経時的に観察した。その結果を図３に示す。
図３より粗プロテオグリカンの溶出は２４時間までに著
しく増加し、その後の増加量は顕著でなかった。この結
果により、４％酢酸に対する粗プロテオグリカンの溶出
時間は、４８時間が最も効率よいことが判明した。上記
の結果に基づいて、サケ鼻軟骨のミンチ５０ｇを４％酢
酸に、４℃で４８時間浸し、撹拌して粗プロテオグリカ
ンの溶出を行い、プロテオグリカンを得た（請求項１の
発明）。

【００１３】次に、その溶出液をステンレススチールメ
ッシュ（１５０μｍ）で濾過し不溶物を除去した。次
に、粗プロテオグリカンを含む溶液を遠心分離機で（４
℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間）遠心分離した。得
られた上澄み液に３倍量の食塩飽和エタノールを加えて
撹拌した後、再度遠心分離機で（４℃、１０，０００ｒ
ｐｍ、２０分間）遠心分離し、濃縮された半固形状のプ
ロテオグリカンを得た（請求項２の発明）。

【００１４】この半固形状のプロテオグリカンを再び４
％酢酸に浸して溶解し、溶液を排除限界分子量１００万
のセルロースエステルメンブラン透析チューブで十分に
透析し、純度の高い液状のプロテオグリカンを得た（請
求項３の発明）。

【００１５】プロテオグリカンは、凍結乾燥して、粉末
状で保存することが好ましい。本実施例では透析内液を
凍結乾燥して、粉末のプロテオグリカン標品２４０ｍｇ
を得た。

【００１６】請求項３の発明の方法により得られたプロ
テオグリカンについて、次に述べる方法により性状を調
べた。まず、化学分析の結果を表1に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】表１においてウロン酸及び硫酸はヘキソサ
ミンを１．００としたときのモル比で、その値はそれぞ
れ０．９９と０．６７であり、構成成分としてのこれら
三者は、ほぼ当量づつ存在することが知られた。また、
コアタンパク質は６．９９％（ｗ／ｗ）であり、ウロン
酸との比（コアタンパク質／ウロン酸）は０．２３（ｗ
／ｗ）であった。 この比率はプロテオグリカンの純度
を示すひとつの値であり、その理論値０．２に近似して
いた。

【００１９】この標品のタンパク質を構成するアミノ酸
組成の分析では、試薬として販売されているウシ鼻軟骨
プロテオグリカンの文献記載と同様に、グリシン、セリ
ン、グルタミン酸が特に多く、サケ鼻軟骨プロテオグリ
カンの全アミノ酸１０００残基中におけるグリシン、セ
リン、グルタミン酸三者の総計は３８６残基を占めてい
る。一方、ヒドロキシプロリンについては僅か２残基で
あった。ヒドロキシプロリンはコラーゲンタンパク質に
特徴的なアミノ酸であり、このサケ鼻軟骨プロテオグリ
カン標品へのコラーゲンの混入は認められるが、その量
は非常に少なく、有意量とは言えない。従って、得られ
たサケ鼻軟骨プロテオグリカンの純度は非常に高いと言
える。

【００２０】次にサケ鼻軟骨プロテオグリカンの分子サ
イズに関する情報を得るために、ＳＢ８０５ＨＱカラム
（８×３００ｍｍ）を用いて高速液体クロマトグラフィ
ーを行い、そのピークの溶出位置は２１５ｎｍの紫外吸
収によって確認した。この際には、試薬として販売され
ているウシ鼻軟骨プロテオグリカンのそれと比較した。
その結果ＳＢ８０５ＨＱカラムからの対称ピークとして
の溶出位置（Ｋ_AV）はサケ鼻軟骨プロテオグリカンで
０．２８、ウシ鼻軟骨プロテオグリカンで０．１７が示
され、サケ鼻軟骨プロテオグリカンの分子サイズはウシ
鼻軟骨プロテオグリカンのそれに比して小さいことが示
された。

【００２１】更に、サケ鼻軟骨プロテオグリカンのコア
タンパク質部分をプロナーゼ消化し、残ったＧＡＧ糖鎖
部分の試料を、標準品としてのコンドロイチン６−硫酸
（Ｃｈ６Ｓ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）及びヒアルロン
酸（ＨＡ）とともにセルロースアセテート膜上で電気泳
動にかけた。その結果、標準品のコンドロイチン６−硫
酸（Ｃｈ６Ｓ）に一致する単一バンドが示され、サケ鼻
軟骨プロテオグリカンのＧＡＧのほとんどはコンドロイ
チン硫酸であることが知られた。

【００２２】このＧＡＧ糖鎖の二糖単位異性体について
も調べた。プロテオグリカンをプロナーゼで消化した
後、コントロイチナーゼＡＢＣで消化し、その際に生成
する不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｏｌ
ｙａｍｉｎ−IIカラム）で分析した。その結果を表２に
示す。表２より大部分は二糖一硫酸構造であった。

【００２３】

【表２】

【００２４】以上のように、サケ鼻軟骨を原材料とする
プロテオグリカンが、食品添加物としてリストに収載さ
れている試薬（例えば、谷村顕雄・他監修「食品中の食
品添加物分析法解説書、第III部 化学的合成品以外の
食品添加物」（１９９２年講談社発行）、あるいは食品
の保存や調味料の原材料として使用される試薬（栗飯原
景昭・他監修「総合食品安全事典」（１９９５年産業調
査会事典出版センター発行）参照）のみで得られたこと
は画期的な発明である。さらに尿素による置換、ＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ法による分離精製等時間と手数の
掛かる工程を不要にできたことも画期的な発明であり、
より簡便でより低コストな精製方法を得るという課題を
一挙に解決できたことになる。

【００２５】以上の結果から、本発明に基づき得られた
サケ鼻軟骨プロテオグリカンは、経口的に摂取可能で、
かつ、従来の方法によるものとほぼ同等の純度であるこ
とが確認された。

【００２６】

【発明の効果】現在、ヒアルロン酸は、バクテリアから
安全でかつ大量に得られるようになり、医薬品に応用さ
れている。一方、プロテオグリカンは高度の水分保持能
力、水分補充能力、解毒、鎮痛などの作用を持つことが
知られており、さらにＧＡＧ糖鎖部分に依存した他の機
能も期待されているが、これまでの精製方法により得ら
れたプロテオグリカンでは、ヒトに用いてその有用性を
調べることは不可能であった。また、サケ鼻軟骨由来の
複合糖質プロテオグリカンの単離は、本出願人らが前述
の特許出願による方法を用いるまでは行われたことが無
く、またその利用も全くされていなかった。しかし、本
発明により、優れた作用を有するプロテオグリカンを安
全な方法で、かつ低コストで大量に精製することができ
ることになったので、プロテオグリカンに対するニーズ
はさらに高くなり、その使用範囲も広がるものと期待さ
れる。

【００２７】また、これまでサケ頭部から固形脂肪分を
除去するために使用されていたクロロホルム−メタノー
ル、アセトン等の有機溶剤も使用しないのでその廃液処
理も不要となり、環境汚染の問題も生じないこととなっ
た。そして、本発明の精製方法は、簡便でかつ効率的で
あり、しかもその工程によって得られたプロテオグリカ
ンは、安全性が高く、経口的に摂取可能であり、化粧
品、医薬部外品のみならず、医薬品、医療材料、加工食
品、健康補助食品、人工臓器等極めて広範囲な分野で新
しい応用製品の開発が可能となり、人類の健康、医学の
分野において大きな貢献が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】プロテオグリカンの構造模型図

【図２】細胞外マトリックスの模式図

【図３】４％酢酸処理による溶出プロテオグリカンの経
時的変化グラフ

【符号の説明】

１ コアタンバク質、 ２ グリコサミノグリカン糖
鎖、３ ヒアルロン酸、 ４コラーゲン、 ５ プ
ロテオグリカン、

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用
   いることを特徴とするプロテオグリカンの精製方法。
2. 【請求項２】粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用
   い、得られた溶出液を濾過後遠心分離し、上澄み液に食
   塩飽和エタノールを加えて再度遠心分離して粗プロテオ
   グリカンを濃縮させたことを特徴とするプロテオグリカ
   ンの精製方法。
3. 【請求項３】粗プロテオグリカンの溶出溶媒に酢酸を用
   い、得られた溶出液を濾過後遠心分離し、上澄み液に食
   塩飽和エタノールを加えて遠心分離することにより得ら
   れた粗プロテオグリカンを含む半固形沈殿物を酢酸に溶
   解し、次いで透析することにより、粗プロテオグリカン
   の純度をさらに向上させることを特徴としたプロテオグ
   リカンの精製方法。