JP7295572B2 - プロテオグリカンの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)pH5.5以下の酸性溶液中、その全量に対して1質量%以下のプロテアーゼの存在または非存在下で、動物の軟骨組織からプロテオグリカンを抽出して、プロテオグリカンを含む粗抽出液を得る工程と、この粗抽出液から、脂質と、分子量5万以下(より好ましくは分子量10万以下)の物質とを除去してプロテオグリカンを精製する工程と、を含む、プロテオグリカンの製造方法。
(2)軟骨組織が、サケ頭部の鼻軟骨組織である(1)に記載のプロテオグリカンの製造方法。
(3)プロテアーゼが、酸性プロテアーゼであり、酸性溶液中における含有量が、0.001質量%~0.5質量%である(1)または(2)に記載のプロテオグリカンの製造方法。
(4)酸性溶液が、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種を含む水溶液である(1)~(3)の何れかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
(5)酸性溶液が、酸性電解水若しくは炭酸水またはこれらに酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種を添加した水溶液である(1)~(3)の何れかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
(6)酸性溶液中の酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種の濃度が、0.1質量%~1質量%である(1)~(5)の何れかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
(7)プロテオグリカンが、質量平均分子量40万~100万のアグリカンである(1)~(6)の何れかに記載のプロテオグリカンの製造方法。
-30℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を400g用意し、出発原料とした。0.4質量%の酢酸水溶液2000gに出発原料およびプロテアーゼM(アマノ)SDを2g投入し、抽出温度50℃で24時間抽出した。
上記製造例1で用いた酢酸水溶液の濃度を4質量%に変更した以外は製造例1と同様の条件で抽出、精製をおこない、約7.7gのプロテオグリカンを得た。
製造例1および2で得た凍結乾燥品約1gを精密に量り、リン酸緩衝液(pH6.8)を加えて正確に10 mLとしたものを試料溶液とした。各試料を0.45 μmメンブレンフィルターを通した後、以下の操作条件でHPLCを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。なお、検量線の作成は、プロテオグリカン標準品(サケ鼻軟骨由来、和光純薬工業製)を、室温減圧デシケーター(シリカゲル)で3時間乾燥してから採取したものを精密に量り取り、試料と同じリン酸緩衝液に溶解して検量線作成用標準液を調製した。また、分子量マーカーとして、Shodex STANDARD P-82(昭和電工社製)を用いて作成した検量線からピークトップの分子量を求めた。
分析計 :HPLC分析装置
検出器 :示差屈折率検出器(RID-10A 島津製作所製)
カラム :ゲルろ過カラム(東ソー株式会社製TSKgel G5000PWXL)
カラム温度:40℃
試料注入量:50 μL
移動相 :リン酸緩衝液(pH6.8)
流量 :0.5 mL/min
製造例1と同様のサケ鼻軟骨をスライス処理したもの約40gと、表1に示した各種抽出液とを250ml容器に入れ密封した。これを37℃の水浴中でゆっくりと攪拌しながら72時間インキュベートした。抽出終了以後、各抽出液を100メッシュのふるいでろ過し、油吸着マットで処理し、さらにKCフロックろ過したろ液を凍結乾燥した。回収された凍結乾燥粉末の質量と、製造例1と同様の方法で定量したPG量を測定し、PGの収率および平均分子量を求めた。その結果を表1に示す。なお、抽出液として用いた電解水は、ORPウォーター酸性イオン水(バイバイバクテリア、ヤマシタキカク社製)を、炭酸水は、伊賀の天然水 炭酸水(日本サンガリア社製)を用いた。
製造例1で得られたプロテオグリカンについてのコラーゲンゲル収縮の効果の有無を評価した。当該効果の有無は、標準品が発揮する効果と比較して表した。本試験例1では、標準品として、鮭鼻軟骨由来プロテオグリカン(富士フイルム和光純薬会社(商品コード:162-22131、168-22133))を用いた。
・試料2の群:最終濃度1mg/mlとなるように、製造例1で得られたプロテオグリカンを投与。
・試料3の群:最終濃度0.5mg/mlとなるように、製造例1で得られたプロテオグリカンを投与。
・試料4の群:最終濃度1mg/mlとなるように、標準品を投与。
・試料5の群:最終濃度0.5mg/mlとなるように、標準品を投与。
製造例1で得られたプロテオグリカンについてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。
5%FBS(Thermo Trace製)を含むDMEM培地が各ウェルに存在した96ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞(クラボウ)を、各ウェルに4×103個/wellの細胞数となるように、当該準備した96ウェルプレートに播種した。この播種後、37℃、5%CO2の環境下で、24時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、5%FBS(Thermo Trace製)を含むDMEM培地から0.25%FBSを含むDMEM培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、37℃、5%CO2の環境下で、3日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。3日間の培養後、Cell Counting Kit-8(DOJINDO)を用いて、各群(試料1から試料5の群)の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定した。当該測定は、各群(試料1から試料5の群)において10サンプルずつ行った。以下表3では、各群において10サンプルの平均値を算出した結果を用いての以下相対値を示す。
・試料2の群:最終濃度0.5mg/mlとなるように、製造例1で得られたプロテオグリカンを投与。
・試料3の群:最終濃度0.1mg/mlとなるように、製造例1で得られたプロテオグリカンを投与。
・試料4の群:最終濃度0.5mg/mlとなるように、試験例1と同じ標準品を投与。
・試料5の群:最終濃度0.1mg/mlとなるように、試験例1と同じ標準品を投与。
Claims (7)
- pH5.5以下の酸性溶液中、その全量に対して1質量%以下のプロテアーゼの存在下で、動物の軟骨組織からプロテオグリカンを抽出して、当該プロテオグリカンを含む粗抽出液を得る工程と、
前記粗抽出液から、脂質と、分子量5万以下の物質とを除去して前記プロテオグリカン を精製する工程と、を含み、
当該プロテオグリカンが、質量平均分子量40万以上のアグリカンである、
プロテオグリカンの製造方法。 - 前記軟骨組織が、サケ頭部の鼻軟骨組織である請求項1に記載のプロテオグリカンの製造方法。
- 前記プロテアーゼが、酸性プロテアーゼであり、前記酸性溶液中における含有量が、0.001質量%~0.5質量%である請求項1または2に記載のプロテオグリカンの製造方法。
- 前記酸性溶液が、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種を含む水溶液である請求項1~3の何れか一項に記載のプロテオグリカンの製造方法。
- 前記酸性溶液が、酸性電解水若しくは炭酸水またはこれらに酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種を添加した水溶液である請求項1~3の何れか一項に記載のプロテオグリカンの製造方法。
- 前記酸性溶液中の酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種の濃度が、0.1質量%~1質量%である請求項1~5の何れか一項に記載のプロテオグリカンの製造方法。
- 前記プロテオグリカンが、質量平均分子量40万~100万のアグリカンである請求項1~6の何れか一項に記載のプロテオグリカンの製造方法。
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