CN103992384B - 一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途，该胶原肽的氨基酸序列为Gly‑Phe‑Pro‑Gly‑Ser‑Phe‑Arg（SEQ ID No：1），ESI‑MS检测分子量823.92 Da（[M+H]+ 824.77 Da）。大黄鱼鱼骨经剁碎、脱除非胶原蛋白、脱钙和脱脂处理后，按照酸提和NaCl盐析法制备鱼骨胶原蛋白；将制备的鱼骨胶原蛋白按照料液比1 g:15~20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40℃保温5~10 min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入胃蛋白酶，酶解4~6 h；将酶解液温度调至40~50℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10 min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入碱性蛋白酶，酶解3~5 h；酶解液经高温灭酶、离心、超滤和层析，得到胶原肽。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易于控制，制备的鱼骨胶原肽具有抗氧化活性强和安全无毒副作用的优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类骨胶原肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的***（骨、软骨、皮肤、腱、韧等）中，对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白在酸、碱、热、酶的作用下水解，会产生胶原肽，与胶原蛋白相比，由于分子量的降低和水溶性的提高，使得胶原肽更易被人体吸收与利用而发挥功效，同时，水解胶原蛋白所产生的胶原肽，也较胶原蛋白具有了更多的生物活性，如抗氧化活性、降压活性、抗肿瘤活性、提高免疫力等。
随着国内水产加工业的发展，水产加工企业产生的下脚料如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼鳍等逐年增长。但是，水产加工下脚料的利用并不充分，造成资源浪费。因此，充分利用水产加工下脚料, 以提高综合经济效益，成为水产加工企业日益关注的问题。目前，已有资料证明水产加工下脚料鱼皮、鱼鳞、鱼骨等是提取胶原蛋白的优质原料，并已经成功利用鱼皮进行胶原蛋白或胶原肽开发。
但是，申请人研究发现，以大黄鱼鱼骨为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼骨胶原蛋白和胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以鱼骨胶原蛋白酶解产物为材料制备抗氧化活性胶原肽及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽，该胶原肽安全无毒副作用，并具有较强的抗氧化作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 823.92 Da（[M+H]+
824.77 Da）。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼骨剁碎后，按照料液比1 g:15~25 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后按照料液比1 g: 5~10 mL加入0.5mol/L EDTA溶液（pH7.4），于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼骨中的钙；脱钙鱼骨沥干后按照料液比1 g:15~20 mL加10%异丙醇溶液，于4℃下浸泡18~24 h，去除脂肪，干燥，得脱脂鱼骨。
2）将脱脂鱼骨按照料液比1 g:10~15 mL加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3~4天。于4℃、20000 r/min离心25~30 min，得上清液即为粗胶原蛋白；取适量粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0 mol/L，静置3~4 h至析出絮状沉淀，于4 ℃、12000 r/min离心15~20 min得沉淀物，冷冻干燥，即为盐析后的胶原蛋白。
3）将制备的胶原蛋白按照料液比1 g:15~20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40 ℃保温5~10 min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，酶解4~6 h；将酶解液温度调至40~50 ℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10 min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，酶解3~5 h；
4）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，9000~10000 r/min离心10~15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
作为优选，所述步骤3）中的第一种蛋白酶为胃蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g。
作为优选，所述步骤3）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.9×105 U/g。
作为改进，所述步骤4）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.12~0.15 MPa的工作压力和25~30 ℃的工作温度下采用先后5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量大于5 kDa组分，分子量小于5 kDa而大于1 kDa组分，分子量小于1 kDa组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用NaH2PO4-Na2HPO4（0.2mol/L，pH 7.0）缓冲液配成20~25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂柱层析分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据DPPH自由基清除率得1个高活性抗氧化肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）。
优选，所述阴离子交换树脂为SP-sephadex C25，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25。
再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量10~15 μL；色谱柱为Kromasil C18；柱温为25~30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~40 min乙腈浓度从0至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽的应用，其特征在于大黄鱼鱼骨胶原肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）具有抗氧化活性强和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用胃蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，使抗氧化胶原肽最大程度地释放出来；制备的抗氧化胶原肽是大黄鱼鱼骨胶原蛋白经酶水解制得，安全、无毒副作用，并且抗氧化作用显著，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
附图说明
图1是本发明的超滤组分的DPPH自由基清除活性图；
图2是本发明的阴离子交换树脂SP-sephadex C25层析图；
图3是本发明的阴离子交换树脂SP-sephadex C25层析所分离各组分的DPPH自由基清除活性图；
图4是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析图；
图5是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析所分离各组分的DPPH自由基清除活性图；
图6 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（F3-3-2）的RP-HPLC图；
图7是本发明的抗氧化胶原肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）的RP-HPLC图；
图8是本发明的Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）的质谱（ESI-MS）图和结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下：大黄鱼鱼骨"脱非胶原蛋白、脱钙、脱脂"提取胶原蛋白"双酶酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"胶原肽。
实施例1：
1）大黄鱼鱼骨剁碎后，按照料液比1 g:15 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后按照料液比1 g:10 mL加入0.5 mol/L EDTA溶液（pH7.4），于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼骨中的钙；脱钙鱼骨沥干后按照料液比1 g:15 mL加10%异丙醇溶液，于4℃下浸泡24 h，去除脂肪，干燥，得脱脂鱼骨。
2）将脱脂鱼骨按照料液比1 g:15 mL加入0.5 mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡4天，于4℃、20000 r/min离心25 min，得上清液即为粗胶原蛋白；取适量粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.9 mol/L，静置3 h至析出絮状沉淀，于4 ℃、12000 r/min离心20 min得沉淀物，冷冻干燥，即为盐析后的胶原蛋白。
3）将制备的胶原蛋白按照料液比1 g:20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2，于37 ℃保温10 min，按照胶原蛋白质量的1.0 %加入胃蛋白酶（酶活力≥1.5×105 U/g），酶解4 h；将酶解液温度调至45 ℃，pH调至9.5，保温5 min，按照胶原蛋白量的1.5%加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.9×105 U/g），酶解5 h；
4）将酶解液加热到90 ℃灭活10 min，10000 r/min离心10 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
①超滤：将上清液调至pH 7.0，于0.15 MPa的工作压力和25 ℃的工作温度下采用5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量大于5 kDa组分，分子量小于5 kDa而大于1 kDa组分，分子量小于1 kDa组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为超滤酶解液（F3）（图1）；
②SP-sephadex C25阴离子交换层析：将上述超滤酶解液（F3）用NaH2PO4-Na2HPO4（0.2mol/L，pH 7.0）缓冲液配成20 mg/mL的溶液，经过SP-sephadex C25阴离子交换树脂柱层析分离，用双蒸水、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液（F3-3）（图2）；
③凝胶层析：将上述离子交换层析酶解液（F3-3）用双蒸水配成15 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物（F3-3-2）（图3）
④高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物（F3-3-2）用双蒸水配成40 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量15 μL；色谱柱为Kromasil C18；柱温30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~40 min乙腈浓度从0至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm（见图4）。
⑤结构检测：收集DPPH自由基清除活性最高的1个抗氧化肽经检测为单一峰（图5），利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 823.92 Da（[M+H]+
824.77 Da）（图6）。
将上述制得的大黄鱼鱼骨胶原肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明：Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）对DPPH 自由基 (EC50
0.29 mg/mL)、羟基自由基（EC50 0.36 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50
0.51 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途
<130> 2014
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Phe Pro
Gly Ser Phe Arg
1 5
Claims (4)
1.一种大黄鱼鱼骨胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg，分子量为m/z 823.92 Da。
2.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼骨剁碎后，按照料液比1 g:15~25 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后按照料液比1 g:5~10 mL加入0.5mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼骨中的钙；脱钙鱼骨沥干后按照料液比1 g:15~20 mL加10%异丙醇溶液，于4℃下浸泡18~24 h，以去除脂肪，干燥，得脱脂鱼骨；
2）将脱脂鱼骨按照料液比1 g:10~15 mL加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3~4天；于4℃、20000 r/min离心25~30 min，得上清液即为粗胶原蛋白；取适量粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0 mol/L，静置3~4 h至析出絮状沉淀，于4 ℃、12000 r/min离心15~20 min得沉淀物，冷冻干燥，即为盐析后的胶原蛋白；
3）将制备的胶原蛋白按照料液比1 g:15~20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40 ℃保温5~10 min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，酶解4~6 h；将酶解液温度调至40~50 ℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10 min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，酶解3~5 h；
4）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，9000~10000 r/min离心10~15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽；
所述步骤3）中的第一种蛋白酶为胃蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g；
所述步骤3）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.12~0.15 MPa的工作压力和25~30 ℃的工作温度下采用5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量大于5 kDa组分，分子量小于5 kDa而大于1 kDa组分，分子量小于1 kDa组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液配成20~25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂柱层析分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据DPPH自由基清除率得1个高活性抗氧化肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为SP-sephadex C25，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量10~15 μL；色谱柱为Kromasil C18；柱温为25~30 ℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水和B乙腈；梯度洗脱：0~40 min乙腈浓度从0至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。
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