JP2001512832A

JP2001512832A - 熱可塑材中に埋め込まれた抗原

Info

Publication number: JP2001512832A
Application number: JP2000506530A
Authority: JP
Inventors: ジョン・エー・マッキンタイヤー
Original assignee: ジョン・エー・マッキンタイヤー
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2001-08-28
Also published as: US20050042774A1; ES2268786T3; EP1715342A1; DE69835154T2; US6177282B1; EP1005652B1; EP1005652A1; DE69835154D1; DK1005652T3; CA2300381A1; AU8902298A; US6872576B1; WO1999008113A1; EP1005652A4; AU753093B2

Abstract

(57)【要約】本発明は免疫学的検定、結合検定、固体相基材（１２）および固体相基材（１２）中に埋め込まれた抗原または抗体またはリガンドまたはレセプター（１１）を有する他の装置に関する。抗原または抗体を溶けた熱可塑材と混合し固体相基材（１２）へと形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は固定された抗原の調製および免疫学的検定におけるその用法および他の
生物医学的な応用に関する。

【０００２】

【発明の背景】

免疫学的検定は十年来サンプル中の抗原と抗体の質的および量的存在について
検定する手段が用いられてきた。もっとも一般的な免疫学的検定技術には抗原か
抗体の何れかが結合した固体相マトリックスがある。抗原または抗体を固体相に
取り付けるための多くの方法が公知でありいくつかは幅広く使用されているが、
取り付け技術は免疫学的検定の調製において重要な工程を残している。確かに、
抗体または抗原の固体相への固定は通常免疫学的検定を調製する時の第１工程の
１つである。

【０００３】スワン（Swan）ら（ＢＳＩコーポレーション）の米国特許第5,414,075号は目的分子、例えばリン脂質をプラスチック支持体、例えばポリスチレンに多官能化
学カップリング剤を用いて化学的にカップリングすることを開示している。

【０００４】シャーマ（Sharma）の米国特許第4,360,358号は低分子試薬、例えば付着体を、固体ポリマーを形成する材料中に導入することによって免疫学的に活性な固体
相を形成すること開示している。このポリマーはそれ自身固体相上に塗布されて
いる。ベースの固体相はポリスチレンでもよい。固体ポリマーを形成する材料に
は多くのゲル等がある。

【０００５】ステルハン（Sterhan）ら（バイオスター・メディカル・プロダクト社）の国際特許第90／10227号はカルジオリピン、リン脂質および他の材料を固体支持体、例えばプラスチックウェルプレート（ここでプレートは事前にメチル化された
牛血清アルブミンで覆われている）上に吸着させることを開示している。

【０００６】シャーフ（Shah）ら（バクスター・ダイアグノスティック社）の国際特許第90
／10138号は、カルジオリピン、ホスファチジルコリン（phoshatidylcholine）および／またはコレステロールのポリスチレンプレートへのＥＬＩＳＡ（酵素結
合免疫ソルベント（sorbent）検定）の目的での非活性な吸着または化学的カップリングを開示している。すべての塗布およびカップリングはプラスチックプレ
ートが形成された後で生じると記されている。

【０００７】マツウラら（ヤマサ醤油株式会社）の米国特許第5,506,110号はいろいろなリン脂質をポリスチレンウェルプレート上にＥＬＩＳＡ目的で結合させることを開
示している。抗原は固体相上に非活性的に吸着している。いろいろな抗リン脂質
抗体間を識別する検定能力を記載している。

【０００８】ロスチア（Lostia）ら（スナム（Snam）・プロゲッティ・Ｓ．Ｐ．Ａ．）の米
国特許第4,031,201号は抗体または抗原を導入する繊維の調製を開示している。この繊維はいろいろな免疫学的検定における固体相を含む多くの目的のために使
用されている。活性な物質（付着材でもよい）をポリマーと混合し、ついで混合
物を凝固浴をとおして紡ぎ、繊維状の固体相を形成する。ポリマーはポリスチレ
ンでもよいと記載されている。繊維は多孔性で微細孔を有している。

【０００９】ピータース・ジュニア（Peters Jr．）ら（スミスクライン・ダイアグノスティック社）の米国特許第5,013,669号は抗原または付着材を固体材料を形成するポリマーに化学的にカップリングする免疫学的検定を開示している。この材料は
別の固体支持体上に塗布されている。ポリマーは可逆的に水溶性であり化学的に
抗原／付着材に結合されている。

【００１０】サットン（Sutton）（イーストマン・コダック社）の米国特許第5,234,841号は免疫学的検定に使用するために固体相、例えばポリスチレンの抗原／付着材で
の被覆を開示している。生物学的に活性な材料を溶剤に溶解して固体相上に塗布
する。

【００１１】ボナッカー（Bonacker）ら（ベーリングべルケ・アクチエンゲセルシャフト（
Behringwerke Aktiengesellshaft）の米国特許第4,118,349号は抗体または抗原
を固定した固体相を化学的にポリスチレン固体相に結合された免疫学的検定を開
示している。抗体または抗原は化学的カップリング化合物を通じてポリスチレン
キャリアーに化学的にカップリングされる。

【００１２】ヤブサキ（ハナ・バイオリジーズ社）の米国特許第4,459,362号は固定にリン脂質を用いて、いろいろなリン脂質にたいする抗体についての免疫学的検定を開
示している。

【００１３】ハートデゲン（Hartdegen）ら（W.R.グレイス（Grace）＆Co）の米国特許第4,
195,127号はポリウレタンフォーム生成物中に抗体または抗原を有する固定したプロテインを開示している。抗体または抗原をモノマーまたはプレポリマーと混
合し次いで反応させる。化学的に共役な抗原とプレポリマーを次に重合してポリ
ウレタンフォームを形成する。そしてこの固体相は多くの用途に使用することが
できる。抗体または抗原を化学的にポリマー分子にカップリングする。

【００１４】ノウィンスキー（Nowinski）ら（ジェネティック・システム社）の米国特許第
4,609,707号および4,752,638号は、抗体または抗原をモノマーに直接または間接
的に化学的に反応させてモノマー／抗体または抗原コンジュゲート−を形成し、
次いでモノマーを重合することによって、ポリマー−抗体またはポリマー−抗原
固体材料を形成することを開示している。そしてこの材料は免疫学的検定におい
て固体相として用いることができる。固体相はいかなる形態でもよい。

【００１５】ジョンソン（Johnson）ら（ミルズ（Miles）社）の米国特許第4,822,747号は、固体相上に付着材試薬を固定し免疫学的検定にこれを用いることを開示してい
る。この例は付着材がポリマーの外側表面上の反応部分に化学的にカップリング
されることを教えている。面白いことに、ジョンソンらは不特定に結合した付着
材を洗い流すまたはゆっくりと固体相からろ過除去してもよいので付着材を固体
相に化学的に結合さす必要性を強調している。

【００１６】ウォルター（Walter）（ミルズ（Miles）・ラボラトリーズ社）の米国特許第4
,390,343号は、抗体または抗原／付着材をゲル、例えばアガロース、ゼラチンま
たはＰＶＰ中に導入したディップスティックタイプの分析要素を開示している。

【００１７】梅毒を検出するための免疫学的検定は十年来幅広く用いられてきた。血液と何
れかの性的伝染病を有する疑いのある患者のすべての組み合わせを梅毒用に免疫
学的検定によって繰り返し検査にかける。梅毒に対する抗体のための血液を検査
する技術にはＶＤＲＬ（性病検査研究所）、ＲＰＲ(高速プラズマレアギン、補足補体結合、トレポネーマの固定／粘着、ＦＴＡ（蛍光性のトレポネーマの抗体
）、ＥＬＩＳＡがあり、多くの他の免疫学的検定フォーマットも可能である。リ
ン脂質（ＰＬ）のための初期の免疫学的検定は補足補体結合検定であるワッサー
マン（Wassermann）反応（ca．1905）である。

【００１８】クリリス（Krilis）とマックネイル（McNeil）「血栓症調査(Thrombosis Rese
arch)」vol．52，p641〜648（1988）および米国特許第5，344，758号は、先の第1
0段落、38〜65行目にクリリスの方法では架橋剤をセットとして添加する前に（これらは過硫酸アンモニウムまたはリボフラビンのような架橋剤である。）リン
脂質が存在するまたはこれをアクリルアミドに添加することを記載していた。こ
の場合、リン脂質は架橋する化学物質のアクリルアミドゲルと競い合う、なぜな
らこれらは同様の反応基、すなわちＣ＝ＯおよびＮＨ_２を有するからである。ゆ
えに、クリリスの結合剤、リン脂質およびゲルまたはマトリックスの間には架橋
が存在する。クリリスの実施例１はイオン交換クロマトグラフィーカラムを、脂
質／アクリルアミド混合物を激しく混合し過硫酸アンモニウムと重合させること
によって形成する方法を記載している。ゲルはその後均一になりガラスカラム中
に詰める(第10段落44〜56行目参照)。従ってクリリスの脂質成分は重合されポリ
アクリルアミドゲルに結合する。アクリルアミドの化学構造(プロテインのゲル電気泳動（Gel Electrophoresis of Proteins） B.D.ハームス（Hames）と D.リ
ックウッド（Rickwood）編集)およびリン脂質、カルジオリピンおよびホスファチジル−セリンの構造がクリリスの特許と血栓症調査の公報に開示されている。
ヂアシルホスファチドはすべてのリン脂質（先頭基）のための骨格分子である。
活性部位（ＮＨ_２（アミノ）基に沿った）である二重結合Ｃ＝Ｏは重要である。

【００１９】故に、クリリスらでは、結合剤は結合剤の結合部位を有効にできる固体相材料
と相互作用する。

【００２０】本発明によれば、ポリマー材料を完全に形成し架橋した後に結合剤を添加する
ので固体材料の結合剤との架橋には適さない。

【００２１】すべての免疫学的検定方法は抗原に結合する抗体に依存する。梅毒血清学のた
めの抗原は歴史的にコレステロールと混合した牛の心臓からのアルコール抽出物
である。抗原（カルジオリピン）は典型的に固体相としての炭素粒子上へと吸着
される。抗原は完全ではないが、血液供給を保護する際のその効果を示している
。

【００２２】多くの他の病気も同様のＰＬ抗原にたいするまたはリン脂質結合プロテインに
対する抗体を検出することによって関連付けられまた確認されている。例には全
身のエリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者および抗リン脂質症候群を有する
と考えられる少数の患者がいる。臨床の調査結果には、頻発する静脈血栓症、頻
発する動脈血栓症、頻発する自然流産、血小板減少、舞踏病、てんかん、青色皮
斑、特発の肺の高血圧、痴呆、健忘症、偏頭痛、およびへこみ血栓症がある。レ
ビン（Levine）Ｓ．Ｒ．、およびブレイ（Brey）Ｒ．Ｌ．、（Lupus）vol．５、
ｐ３４７（１９６６）参照。他のリュウマチのようなおよびコラーゲン性の病気
も患者の血清中のＰＬに対する特徴的な抗体として存在する。人間の器官移植の
分野では、器官の主な無機能も抗リン脂質抗体（ａＰＡ）の存在に関連して現れ
るのかもしれない。ワーゲンニッヒ（Wargenknecht）ら「人間免疫学（Human Imm
unology）」４９，ｐ２７（１９９６）。従って、ａＰＡのための標準化された免
疫学的検定には多大な必要性と多くの用途がある。

【００２３】ＥＬＩＳＡは約２５年間、少量の抗原性物質を検出するのに使用されてきた。
今日，多くのＥＬＩＳＡシステムは適合および／または改良されて抗体が生成さ
れる抗原性物質の最善の結合を提供するプラスチック（ポリスチレン）９６ウェ
ルプレート（ミクロ滴定（Microtiter）プレート）を使用している。１９８０年
代からは，ＥＬＩＳＡはＰＬおよび／またはＰＬ結合プラズマプロテインからな
る抗原に対する抗体の検出のための使用に選ばれた。

【００２４】「抗リン脂質抗体」（ａＰＡ）という用語は、ＰＬに対する多くの抗体は実質
的にリン脂質に結合するプラズマプロテインに対する抗体であるという従来の用
語の用法を表している。それでもなお、ＰＬは抗原と考えられている。いかなる
理論に縛られるのも望ましくないが、プラスチックコンテナを、ある種のリン脂
質結合プロテインの結合を増加させる放射線照射されたプラスチック表面のよう
に特別に処理しないならば、リン脂質結合プロテインは別の成分，例えばＰＬな
しではａＰＡと結合しないと信じている。マックインタイラー（McIntyre）ら「
再生免疫学のアメリカ雑誌」（American Journal of Reproductive Immunology ）３７：ｐ１０１〜１１０（１９９７）「抗リン脂質抗体」という用語は、混同
するかもしれないが，この分野ではよく理解されている。

【００２５】その発端以来，患者の血液中の抗リン脂質抗体（ａＰＡ）の検出のために用い
られる免疫学的検定は再生能力、感度、および満足度に関する問題に悩まされて
きた。特にａＰＡの定量の研究室間の比較は一致しない。ワーゲンニッヒら「臨
床免疫学ニュースレター（Clinical Immunology Newsletter）」１５（２／３）：２８〜３８（１９９５）（主題における評論記事）参照。す
べてのＥＬＩＳＡシステム，特にａＰＡＥＬＩＳＡのもつ主な問題は検定での
重要な最初の２段階：１、抗原性材料をプラスチック表面のミクロ滴定プレート
ウェルに「塗布する」および２、プロテイン性の物質、しばしば牛の血清アルブ
ミンで「ブロックする」ことを含んでいる。ブロッキング工程はＰＬをプレート
から取り除いてもよく、なぜなら血清アルブミンや他のプロテインはＰＬと結合
でき、故にこれらはＰＬ結合のためのＰＬ塗付されたプラスチックプレートと競
い合うからである。更に、この損失がなければブロッキング工程を制御するのは
困難である。

【００２６】ａＰＡＥＬＩＳＡではＰＬ、例えばカルジオリピン、ホスファチジルセリン
、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチ
ジルジグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、お
よびホスファチジン酸をプレートのウェルを被覆するのに用いる。この被覆工程
はしばしば有機溶剤、例えばクロロホルムの存在中で行われ、その能力として溶
液中に脂質を保持できることが望ましい。有機溶剤はしかし、プラスチックを腐
食ことができ、故にプレートコンテンツを不透明度、すなわち色における変化について測定したときに不都合な光反射を生じるため望ましくない。また、６４％
以上のリン脂質抗原をプラスチック表面から検定の過程中で取り除くことが報告
されている。スモラルスキー（Smolarsky）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Journal of Immunological Methods）３８：ｐ８５〜９３（１９
８０）参照。有機溶剤はその結合特性を変性するおよび不活性化するかもしれな
いある種のプロテイン性の物質には適さない。

【００２７】ＰＬをウェルに注いだ後、第２の問題は脂肪酸を含有するＰＬの酸化かもしれ
ない。不飽和脂肪酸の酸化は悪臭を生じおよび／または架橋を生じる。酸化によ
る架橋は塗料やニスの「乾燥」の際に起こる基本的理論である。酸化はいくつか
のＰＬの抗原の特性を変えてしまうことを示す。この問題を取り除くために、ａ
ＰＡＥＬＩＳＡプレートをしばしば窒素下で乾燥し封止したコンテナ中に保存
する。

【００２８】第３の問題はブロッキング剤とＥＬＩＳＡの過程で必要な多くの洗浄工程によ
る塗布した抗原の損失である。歴史的には、ａＰＡＥＬＩＳＡプレート調製に
おける複数の工程は別の問題と浪費、例えば、作業者の集中力を要する作業処置
のコストを生じる。これらの検定を行う研究者間でのプレートのＰＬ塗布につい
ての疎通の欠落により、訓練されていない研究室外と研究室内の再生能力が一貫
した問題である。

【００２９】同様の問題がプラスチック表面への他の抗原および抗体の固定について存在す
る。他の結合検定および他の表面は同様の問題を有する。抗原（または抗体）、プロテイン、リン脂質、炭化水素（例えば血液群の抗原）、または核酸に関係なく、プラスチック表面上に固定する際にその結合特性を少しも保持しないと言う
ある種の本体的な問題をすべてが有している。

【００３０】多くの未処理のプラスチックは疎水性である。固定された結合剤が疎水性部分
を有する場合には、水溶性のキャリアー溶質を用いれば、この部分はプラスチッ
ク表面に付着する傾向にある。使用する溶質と表面に依存して、結合剤の補足部
分はプラスチック表面に付着する傾向にある。免疫学的検定では、抗体−抗原結
合は各分子の特定の部分上でしか起こらない。同様のことが他のレセプター／リ
ガンド結合検定についていえる。この部分がプラスチック表面によって隠されて
いる場合には、結合は起こらない。これは再生不可能な本来の濃度より低い、一
様に間違った負の結果を招く。

【００３１】同様の問題が結合検定、親和性結合またはクロマトグラフィーシステム、酵素
固定化において、および受容体により適応させた医療器具の塗膜のためのリガン
ドまたはレセプターの何れかの固定で存在する。

【００３２】生物学的サンプル中の抗体、抗原またはリガンドの存在またはレベルは多くの
状態を表しており診療的に重要である。例えば、血清中のＰＬに対する抗体は、
伝染病が残っているかまたは自己免疫病状態の疑いがあるかを示すことができる
。例えば、処理された梅毒伝染病を有し、現在活性な伝染病を有さないような抗
原に過去さらされたことをも検出されるかもしれないが、抗体滴定濃度は最終的
には時間の経過とともに特にＩｇＭおよびＩｇＡ滴定濃度は低くなるであろう。
同様に、高レベルのａＰＡはＳＬＥを有する患者において更に血栓症の発生と関
連する。血液中の抗体のレベルを定量するために、固体支持体上の抗原分子の数
とサンプルの適用から得られた結合した抗体分子の数の間には関連があるので、
再生可能な標準的検定を持たねばならない。

【００３３】

【発明の要旨】

本発明は、固体相結合検定の作業者による注意深い使用に頼ることなく大きい
スケールで簡単に再生される結合パートナーの標準的で安定した調製を提供する
。

【００３４】本発明はサンプルの液体中で結合パ−トナーに結合しこれを不溶性にすること
ができる均一で固定された結合剤を提供する。

【００３５】本発明は固体材料全体に一様に結合剤を分布させて表面上の結合剤の分布が事
前に決められた量にする。

【００３６】本発明は、固体相から濾し出るまたは溶離することのない固定された結合剤を
調製する。

【００３７】本発明は、結合した結合パートナーを剥がし取ってもよく固体相を同様のまた
は別の目的に再利用してもよい固定された結合剤を調製する。

【００３８】本発明は、サンプルから所望の事前に決められた結合パートナーを分離するた
めの変***換クロマトグラフィー用の固定された結合剤を調製する。

【００３９】本発明は、結合パートナーの固定された結合剤への結合を含む免疫学的検定を
調製し使用する。

【００４０】本発明は、固体相中に埋め込まれた再利用可能な固定された抗体または酵素を
調製し使用する。

【００４１】本発明は、医療用品（例えば血管プロテーゼ）を作る埋め込まれた結合剤を含
む、より生物学的に受容体ホストに適合した、ホストまたはホスト流動体と接触
する器具または他の医療装置を提供する。

【００４２】本発明は、２つの結合物質の１つと、後に固体相へと固化される流動性プラス
チック材料とを混合する。結合剤は固体相中に埋め込まれ、結合パートナーは最
初は流動体中で自由である。そして全体に埋め込まれた結合剤を有する固体相は
、結合剤が固体相中に埋め込まれているいかなる従来の免疫学的検定フォーマッ
トにおいても使用できる。

【００４３】プラスチック表面をＰＬ抗体で被覆する従来の方法は十分満足行くものではな
いが、本発明は塗布、表面上の安定性および矛盾した結果についてばらつきを招
く塗布工程を除去している。前述したような抗原の損失は抗原が固体相マトリッ
クス中に埋め込まれているので、除かれる。本発明は溶けた状態に加熱された熱
可塑性材料と抗原を混合する。次いで混合物は従来の注射およびブローモールデ
ィングに使用されて固体相を形成する。この方法はプラスチック材料中のＰＬ抗
原の一様な分布と一定の濃度を提供する。

【００４４】

【好ましい実施態様の説明】

本発明の第１の実施態様は結合剤の固体相基材、特にプラスチック材料中への
導入、これによって生成される生成物(例えば、チューブ、ビーズ、および複数ウェルプレート)、およびこれらの生成物を用いた結合検定に関する。いくつかの特定の例はＥＬＩＳＡを含むが、本発明は、リガンド、レセプター、抗体、抗
原または付着体の少なくとも１つが免疫学的検定中に固体相内に埋め込まれてい
るかぎり、いかなる特別の免疫学的検定フォーマットにも限定されるものではな
い。確かに、本発明は他の結合検定、以下に例示するもののいくつかのために使
用してもよい。

【００４５】結合剤をプラスチック材料中に導入して、検定に使用するための結合剤を埋め
込んだ固体相を調製する。固体相基材１２中に、結合剤１１を均一に全体に分布
し固体相基材１２中に埋め込む。固体相基材１２はコンテナの形状でもよい。結
合パートナー１４を含む液体サンプル１３をコンテナに添加し結合パートナーは
結合剤に結合する。図２に描いたように、結合パートナーは簡単に視覚化するた
めに拡大した抗原分子である。次に液体サンプルをデカントまたは吸引し、洗浄
する。ラベリング剤１５を次に結合パートナー１４に結合したコンテナに添加す
る。再度コンテナをデカントまたは吸引し、洗浄してすべての結合していないラ
ベリング剤を除去する。ラベル１６を次に特定のラベルに適した方法で検出する
。蛍光性ラベルを使用する場合には、ラベルの存在は、適当な波長の光にこれを
露光し蛍光性ラベルに対応する別の波長の放射線を観察することによって、直接
観察してもよい。ラベルは、固体相基材に結合しているか結合しないラベリング
剤を含有する除去された液体中にあるかのいずれかであり、これは定量的に検出
できまたは定量的に測定できる。

【００４６】コンテナ型の固体相基材１２はプラスチックであるとして描かれているが、他
の材料を使用してもよいことは認められている。同様に、結合剤１１は単に点書
きしてしめし、その固体相基材全体への分布を描いている。実際には、結合剤は
ドットで示すよりずっと小さい分子であるかもしれない。同様に、結合パートナ
ー用に使用された抗体分子およびラベリング剤は実際には分子であり、事実より
はるかに大きく示されている。また更に、ラベリング剤は星印で示したよりもビ
ーズの例では大きく、放射線活性原子の例ではちいさいかもしれない。

【００４７】抗体、抗原、付着剤、リガンドおよびレセプターと言う用語は例示する特定の
用途に応じてこの明細書全体にわたって相互変換可能に使用する。これらすべて
は結合物質と考えられる。「結合剤」および「結合パートナー」という用語はこ
れらの成分のいずれをも含むように使用する。説明を簡単にするために、「結合
剤」という用語は固体相に埋め込まれた成分を表し、「結合パートナー」と言う
用語は液体中で自由で事前に埋め込まれた結合剤に結合して不溶化する成分を表
す。好ましい実施態様では、本発明の結合剤は脂質、リン脂質、プロテイン、炭化水
素、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物から選択される。

【００４８】もの全体が本発明の固体相組成物からできている必要はなく、むしろ液体サン
プルと接触する固体相部分のみがこのような材料でできている必要がある。例え
ば、複数ウェルプレートの１または複数のウェルが本発明の組成物からできてい
てもよく、複数ウェルプレートの残りはいかなる従来のプラスチックまたは金属でできていてもよい。この装置は更なる分析のために個々のウェルを取り除くこ
とを可能にする。また、本発明の組成物は結合剤を除く固体相材料よりはるかに
高価であるので、有益な経営は、サンプルを含有した液体と接触するある部分を
形成する組み合わせ体を用いることから生じる。

【００４９】含まれる物理的な工程には結合剤を固体相または基材となる材料と混合するこ
とがある。材料が熱可塑性の場合には、埋め込まれる結合剤を小さいプラスチックペレットストックと混合し溶けるまで加熱する、または結合剤を溶解したプラ
スチック自身と混合してもよい。結合剤とプラスチックペレット混合中の均一性
を、混合中に生じた静電気により高めてプラスチックペレット上へのより一様な
塗布と混合物全体の一様な分布を生じさせる。溶けたプラスチックを次に何れか
所望の形のプラスチック基材へと整形する。結合剤はプラスチック基材全体に分
布している。化学反応がプラスチック基材と結合剤間で起こる必要はなく、化学
反応が特に望ましくもない。好ましい熱可塑性ポリマーの例としては、ポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル（例えば、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ）、ポリウレタン、ポリ
オレフィン、ポリビニルアルコール、ＰＶＰ、および組織または生物学的な流動体
との接触に使用される他のポリマーがある。

【００５０】他のプラスチック材料、例えば熱硬化ポリマーを用いてもよい。本発明の他の実施態様では、結合剤をモノマーまたはオリゴマーと混合しこれを次いで加熱し
て組成物を重合または架橋し、これによって結合剤を固定する。結合剤は架橋重
合反応に参加しないように選択される。好ましい実施態様では、結合剤は重合結
合反応に参加しないように処理される。

【００５１】プラスチック基材も化学物質、紫外線または他の非熱重合方法等によって形成してもよい。多くの硬化剤、澄まし剤および可塑剤を添加して基材にその所望の
物理的特性を与えてもよい。このような状況で、結合剤を基材形成材料（例えば、
モノマー）と混合した後、または同時に硬化剤または重合剤を添加する。例としては、エポキシ類および熱可塑性ポリマーで先に挙げたものと同じポリマーのい
くつかがある。

【００５２】「プラスチック」という用語は通常本発明ではある物理的特性を有する有機ポ
リマーを示す。本発明では、結合剤を混合前に流動体であり、後に固体材料を形
成するいかなる材料も該当する。故に、「プラスチック基材」という用語は従来プラスチックと呼ばれていたものからのみでできている必要はなく、固体材料が結合検定用に認められる固体相へと形成されるならば、泡、ゴム、ゲル等を含んで
もよい。他の例としてはカルシウムアルギネート、カリウムカラギーン、硬化されたゼラチン／コラーゲン、天然ゴム、等がある。特に後で乾燥して水または他の
溶剤を除去する場合には、非ポリマー、例えば、ワックス、合金、セラミック、低融
点のガラス、エマルジョンを使用してもよい。また、固体材料を抗原および溶剤
と混合し、次いで溶剤を蒸発させて固体中に埋め込まれた抗原を残してもよい。
エマルジョンにおいて良好な油相と同様に好ましい溶剤はボラチルシリコン（即
ち、シクロメチコン）である。実用的でない例、例えば冷却されて氷を形成する
水でも、凝固点以下の温度を保持すれば使用してもよい。

【００５３】結合剤含有固体相は従来の結合検定において他の不溶化された成分以上の明ら
かな優位性を有する。本発明では、検定が完了したとき、結合した結合パートナ
ーを、希薄酸を用いて変性させまたは結合剤が単に固体相に吸着しているだけな
らば使用することができないむしろ困難な技術を用いて剥離してもよい。これは
同じ固体相を再利用することを可能にし、このことは時間を節約し新しい固体相
を基準化する効果がある。本発明による固体相中に結合剤を埋め込むことの面白
い特性は結合剤をむしろ望ましくない化学物質および／または物理的条件にさら
すことができることである。

【００５４】結合剤、プラスチックおよび型または形成手段の特性に依存して、結合剤は形
成されたプラスチック基材の表面に自然に集まってもよい。また、結合剤が異な
った特性を有する異なった部分を有する場合には、結合剤を特別な配置に優先し
て保持してもよい。例えば、疎水性のプラスチック、例えば、ポリスチレン、親
水性と疎水性の部分の両方を有する結合基材、例えば、プロテインセル膜結合レ
セプターでは、親水性部分はプラスチック基材の表面によりさらされる傾向にあ
る。この傾向はより親水性の型またはプラスチック基材を接触させる親水性の冷
却流動体を用いることによって強めてもよい。

【００５５】結合剤は結合部分のほかに付加的成分を含んでもよい。本発明の別の実施態様
では、結合剤をまず固体相基材を形成する材料に簡単に適合する他の化学物質と
化学的にカップリングさせてもよい。例えば、疎水性基材と非常に親水性の結合
剤前駆体を用いた場合、まず疎水性部分を結合剤前駆体に化学的に反応させ結合
剤全体の一部分が簡単に疎水性基材と混合するようにすることが有効であっても
よい。場合によっては、界面活性剤または他の組成物を材料に添加して粘着性、
分散性および固体相基材中の結合剤の埋め込みを補った固体相としてもよい。ま
た、後に結合剤と反応し結合する疎水性化合物を単に埋め込んでもよい。例えば
、プロテインＧを溶解した材料と混合してもよくこれはチューブへと形作られ冷
却される。抗体をチューブに添加しプロテインＧを結合させ、次いで流動体をデ
カントしチューブを洗浄する。抗体−プロテインＧ複合体を次に免疫学的検定用
のまたは抗原のための親和性浄化用の結合剤とする。

【００５６】固体相中に存在する結合剤の量は幅広く変化してもよく、例えば、固体相を形
成する材料１０００重量部に対して約０．０００００００１〜約５００重量部で
もよい。好ましい実施態様では、結合剤は１．０ミクログラム／ｍｌ〜１００ｍ
ｇ／ｍｌの範囲である。

【００５７】すべての結合剤がある温度および化学的制限を有するが、プラスチック基材を
形成する材料はこれらの温度および化学的制限に配慮して注意深く選択するまた
は改良してもよい。プロテイン、例えば、抗体および抗原は非常な温度ではその
生物学的特性を変性し失うことは公知である。しかし、同じプロテインは固体相
基材に埋め込むことにより、本発明では変性する温度に一度さらされても生物学
的特性を残すことができる。他の結合剤、例えば、ＰＬおよびＤＮＡは熱にあま
り敏感ででない。故に、使用する結合剤に依存して、固体基材となる材料および
固化するのに必要な条件を注意深く選択しなければならない。

【００５８】例えば、あるポリスチレンは比較的低い温度で溶ける。これらの温度はポリヌ
クレオチド、多くのプロテイン、脂質および大部分有機化合物でできている結合
剤との相性がよい。確かに、あるポリスチレンはポリアクリルアミドゲル中で加
工する前の抗原の調製中、特に熱変性工程に使用される温度の２倍の温度で溶け
る。熱可塑性ポリスチレンが溶ける温度は更にいろいろな化学物質の添加によっ
て低下する。プラスチック材料の物理的光学的特性の改良はそれ自体公知である
。添加される結合剤の重量はプラスチックの重量に比べて取るに足りないほど小
さく、従ってその特性に重大に影響する可能性はない。同じことは他の基材材料
を使用する際にも言える。

【００５９】結合剤をまず、固体相に埋め込んだ後結合パートナーを添加するならば、従来
の結合検定フォーマットのいずれを用いてもよい。特許文書は免疫学的検定、核
酸交雑検定および生物学特有の結合検定分野においての多くの異なった結合フォ
ーマットで満たされている。一般的な結合フォーマットには図２〜３に示される
サンドイッチ検定がある。競争的な結合検定（ここでは第２の結合パートナーを
結合パートナーを添加する前、最中、または後に添加してこれらが結合剤に結合
する競争をするようにする）を用いてもよい。場合によってはラベリング剤を用
いて、結合剤との競争の中で結合パートナーに結合してもよい。通常結合パート
ナーか第２の結合パートナーのいずれかがラベリング剤によって結合したまたは
結合していないラベルを簡単に検出するために直接または間接的にラベルされる
。

【００６０】サンプルはいずれかの源からの結合パートナー含有組成物を示す。サンプル中
の結合パートナー、およびおそらく他の成分を流動体中に溶解した後、本発明に
よる結合検定に使用する。サンプルは好ましくは生物学的サンプル、より好まし
くは生物学的流動体である。

【００６１】結合物質の１つは、酵素活性またはその存在に単に基づく同様のものまたは結
合パートナーに結合する結合剤によって高められるまたは抑制されるその活性に
よって直接測定されてもよい。例えば、結合剤が酵素であり結合パートナーが抑
制剤(逆もまた同じ)であれば、添加されたサンプル中の結合パートナーの存在を
直接測定してもよい。同様に、結合物質の１つが基材、エネルギー源、共同因子
、補酵素または活性用ビタミンの必要な酵素である場合には、サンプル中の結合
物質としてのこれらの何れかの存在を酵素活性のために測定することによって検
出してもよい。酵素の存在についての逆検定を使用してもよい。

【００６２】結合剤と結合パートナーは、サンプル洗浄によって簡単に結合が切れることの
ない方法で互いに結合する限り、幅広い化学構造を有してもよい。結合は好まし
くは特別の結合であるが、より一般的な性質のものでもよい。静電的(例えば、ファンデアワールス力)、化学的（共有結合）および物理的（寸法的によく適合する）力を含んでもよく結合特性を構成してもよい。

【００６３】結合親和力およびアビジティーはそれぞれの用途で求められるニーズに応じて
変化してもよい。例えば、いくつかの検定について、高度な特別な結合が本質的
であってもよい。他の技術について、より一般的な結合特性が必要とされるすべ
てであってもよい。故に、複数の埋め込まれた物質が望まれてもよい。

【００６４】これらの結合可能な成分はプロテイン（これにはリポプロテイン、グリコプロ
テイン、メタロプロテイン、フラグメントおよびサブユニットがある）、より好
ましくは抗体またはそのフラグメント（ＦａｂＦｃＦａｂ２等）、抗原、酵
素、ホルモン、細胞、レセプター、微生物またはウイルス粒である。他の化学構
造、例えば、脂質、ポリサッカリド（特にバクテリア抗原、大小の血液群抗原）
、ビタミン、酵素基材、補酵素、共同因子、結合金属イオン、ポリヌクレオチド
、および他の有機化合物（例えば、メタボライト、シクロデキストリン、モノサ
ッカリド、またはキレート剤）を結合剤と結合パートナーの一方または両方とし
て用いてもよい。結合剤および／または結合パートナーは結合特性を残していれ
ば分子の断片でもよい。

【００６５】多くの結合検定フォーマットについて、ラベリング剤が結合剤と結合パートナ
ーに加えて２つの結合物質が実際に互いに結合するかどうかを決定するのに必要
とされる。ラベリング剤は組成物、通常２つの特性を有する共役化学化合物であ
る。第１に、ラベリング剤はラベルを有さねばならない；第２に、ラベリング剤
は物理的または化学的に結合パートナーまたは結合剤に結合しなければならない
。典型的に、これら２つの特性はラベリング剤の異なった部分に属し、この２つ
の部分は化学的に共にカップリングされている。

【００６６】好適なラベルの例としては：放射線活性部分、酵素またはその部分、酵素基材
、蛍光部分、化学ルミネセンス部分、抑制剤、光または他の電磁波を反射するま
たは吸収する部分、磁性、常磁性、強磁性粒子、核磁気共鳴によって検出可能な
化学物質、固体または多孔性粒子またはシートまたは直接的に容易に検出可能な
または他の物質（例えば、別の化学部分、重合開始剤等）と作用して検出可能な
変化を生じるいずれかの部分がある。

【００６７】結合パートナーに結合するラベリング剤の部分の例としては：抗体、抗原付着
剤、プロテインＡまたはＧ、ＤＮＡ、結合パートナーまたは結合剤の吸収剤、ビ
オチン、アビジン／ストレプアビジン、および結合パートナーまたは結合剤と化
学的に反応する部分がある。

【００６８】検出剤は複数の部分、例えば、酵素グルコースオキシダーゼでラベルされ別の
溶液中で別々にフリーであるウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、酵素基材グルコース、
第２の酵素パーオキシダーゼおよび色原体として３，３’，５，５’テトラメチ
ルベンジジン中にあってもよい。

【００６９】本発明の他の実施態様では、結合剤含有固体相をクロマトグラフィー分離にお
ける固体相として使用してもよい。このようなシステムでは、固体相は異なった
形の固体相を使用することを除けば結合検定についてと同じ方法で調製できる。
クロマトグラフィーカラムのパッキングについて、多くの小さい粒子が好ましい
固体相である。結合剤は流動体中の物質と活性原理相互作用を構成して分離され
浄化される。このようなシステムは特に親和性クロマトグラフィーで有効である
が、他のタイプのクロマトグラフィーに使用してもよい。カラムパッキングは固
体相カラムパッキングを再塗布することなく同じまたは別の用途に経済的に再利
用できることを記載しておく。

【００７０】結合剤含有固体相をクロマトグラフィーの分離のない吸着剤として使用しても
よい。この状況では、結合パートナーを液体サンプルから除去することが望まし
い、なぜならこれは毒性があるさもなければ不都合であるからである。このよう
な吸着のために、液体サンプルを結合が許される条件下で結合剤含有固体相と接
触させ，次いで固体と液体を分離する。例は、赤血球、血小板、細胞、または細
胞系、またはその凍結乾燥されたものを結合剤として用いて、検定の妨げとなる
かもしれない不特定の結合物質に結合または吸着することを含む。結合剤含有固
体相を次に、極端なｐＨイオン条件および一様にざらざらした化学物質および／
または条件を用いて結合した結合パートナーを剥ぎ取ることによって再生しても
よい。

【００７１】本発明の他の実施態様は、酵素自体を固体相中に結合剤を導入したときと同じ
方法で導入することによって酵素を固体相に固定することである。場合によって
は、酵素結合組成物を固体相に導入してもよい。酵素結合組成物の例としては、
酵素に対する抗体、酵素吸着剤、酵素基材、抑制剤、補酵素、ビタミンおよび共
同因子がある。例には、アビジン／ストレプアビジンに結合するためのビオチン
、ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈがある。酵素を固体相に結合した
酵素結合組成物に分離反応による化学反応によって固定してもよい。固定された
酵素はそれ自身公知のいずれの従来の固定酵素の用途に用いてもよい。

【００７２】本発明の他の実施態様では、固体相に埋め込まれた結合剤を大きい粒子の検出
または分離に使用してもよい。固体相は結合剤用のラベリング手段として作用し
てもよい。例えば、血液サンプル中のＴ−リンパ球のいろいろなサブセットの数
を数えるには、結合剤としてＣＤシリーズの単クローン性の抗体の１つを使用し
てもよい。固体相を、小さいワックス粒子（ビーズワックス、カスターワックス
、脂肪アルコール、シリコンワックス等）、フルオレセイン、ＣＤ単クローン性
の抗体および溶剤を緩やかな加熱下で溶解し混合した後液体を冷えた流動体（例
えば、空気）中にスプレイして固体相として使用される小さい固体粒子を形成す
ることによって調製してもよい。これらの粒子を血液サンプルと混合する場合、
抗体はＴ−リンパ球の対応するサブセットに結合ししてもよく、これは自動光学
システム、例えば、蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣＳ）によって簡単に検出およ
びカウントできる。

【００７３】同様の方法では、結合剤を含有する小さい固体粒子を粘着検定においてサンプ
ル中の結合パートナー用に使用してもよい。しかし、このような検定では、結合
パートナーは２以上の結合部位と結合できること、または別の試薬が２以上の結
合パートナーと結合できることが望ましく、またはサンプル中に結合パートナー
があるかないかによって結合剤を添加して粒子の明らかな粘着を引き起こしても
よい。

【００７４】また、本発明の他の実施態様は多くのポリヌクレオチド交雑検定およびサンプ
ル中の目的物のポリヌクレオチドを検出しまたは配列するための技術を包含して
いる。このシステムでは、固体相は結合剤としてポリヌクレオチドを含有してい
る。結合パートナーは、結合剤との交雑により結合してもよい結合パートナーと
しての目的物ポリヌクレオチドである。検出工程はそれ自身DNA交雑検定の分野で公知である。

【００７５】本発明の他の実施態様では、固体相基材をホスト組織または流動体と接触する
医療器具または他の医療装置へと形成してもよい。基材は結合検定での使用と同
様の方法で物質を植え付けることによってホスト組織または流動体とより適合さ
せてもよい。物質の選択は、従来どおり同じ目的で医療器具および装置を被覆す
るために使用される場合と同じである。埋め込まれた物質は単に塗布されたもの
より固い結合を示すことが期待できるので、医療器具および装置はより優れたお
そらくより製造において経済的でありうる。

【００７６】好ましい医療器具の例はダクロンポリエステルを固体相として含み、その内部
に埋め込まれたリン脂質を有する動脈プロテーゼである。コレステロール、ヘパ
リン／ヘパラン、グルコスアミノグリカン、補助的に不活性にするプロテインお
よび他の成分をも埋め込んでよい。同様に、ポリウレタンを、特に他のタイプの
医療プロテーゼにおいて、ダクロンに置き換えてもよい。他の医療装置、チュー
ブ、血液容器、血液バッグ等は同様に帰化する物質で取り囲み、装置をより適合
させてもよい。好ましい実施態様では、人工装具は脂質、プロテイン、炭化水素
、およびその混合物からなる群から選択される結合剤を埋め込んでなる心室アシ
スト装置である。人工装具はディップキャスティングによって形成してもよい。

【００７７】プラスチック基材を構成する固体相はいずれの形状、例えば、粒子、ビーズ、
チューブ、複数ウェルプレート等に形作ってもよい。固体相は潜在的な結合パー
トナーおよび結合するために存在する結合剤および結合パートナーの量に依存し
てモノリジックでも多孔性でもよい。固体相は好ましくはおよび有効的には光学
的に透明である。

【００７８】

【発明に関する利益】

抗原で良好に飽和したプラスチック製品の能力はＥＬＩＳＡ技術における多く
の有効性だけでなく他の生物学的用途、診断および診療の両方での有効性も引き
出すことができる。ＰＬ抗原に関して、プラスチック工程での飽和は：（１）プレートウェル中の抗原の一様な分布と一定の濃度を提供し、（２）洗浄工程中の抗原の損失を取り除き、（３）試験の時間を短縮し技術労働者の量を減らし（４）研究室内外の一貫性と標準化における改良を提供し、（５）さらなる試験および／または操作のためのプラスチック製品の再利用を可
能にすることによってＥＬＩＳＡを改良することができる。この技術の他の利益は、特定
の抗原およびＰＬ結合プラズマプロテインまたはレセプターの親和性浄化のため
の抗原で飽和したプラスチックビーズの製造である。医療装置、例えば、人造バ
ルブおよび管の移植組織片のためにプラスチック中にＰＬを含有するものを使用
することは、体の流動体との接触のため、より自然で生物学的な表面、即ちより
少ないトロンボゲンを提供する。

【００７９】

【実施例】

（実施例１）５ポンドのポリスチレンビーズと５００ｍｇの凍結乾燥されたカルジオリピン
をスチールロッドでステンレススチールボール中で混合した。この混合は静電気
によって促進されカルジオリピンはポリスチレンペレットストック全体に一様に
分布した。混合物を加熱オーガー中で成形した（ここでは、ポリスチレンを溶か
し５０ｃｃの円錐形のチューブの型に注入した）。

【００８０】溶けた材料を冷却して固化した。できあがった円錐形のチューブを次に型から
剥がし、いかなる抗原の塗布を追加することなくすぐ使用できた。

【００８１】（実施例２）実施例１で生成したチューブを次に、チューブ中に牛の血清アルブミン溶液を
１時間室温で保持することによってブロックした。ブロックされたチューブを試
験してカルジオリピンがその抗原性およびプラズマプロテイン結合特性を残して
いるかおよびＥＬＩＳＡに好適な条件下で正常に機能するかを確かめた。ａＰＡ
を有することが知られている液体血清サンプルおよびａＰＡを有さないことが知
られている液体血清サンプルを１：２０、１：５０、１：１００および１：４０
０に希釈し異なったチューブに添加し条件を抗体−抗原結合を４０、８０および
１２０分可能にするよう調整した。液体をチューブからデカントし、チューブの
内側をやさしく４回洗浄していかなる未結合の抗体も除去した。酵素（アルカリ
ホスファターゼまたはホルセラディッシュパーオキシダーゼ）ラベルされた人の
ＩｇＧ、ＡまたはＭに向けられたやぎまたは単クローン性のマウス抗体をチュー
ブに添加し１時間存在する人抗体に結合させた。ラベルされた抗体を次に、チュ
ーブからデカントしチューブの内側をやさしく４回洗浄していかなる未結合のラ
ベルされた抗体も除去した。各酵素に適当な基材を有する検定剤をチューブに添
加した。酵素との反応後、基材は分光光度計で検出可能な生成物を直接または間
接的に形成した。ａＰＡを含まないサンプルについて、背景のみが分光光度計で
検出可能であった。データは図４〜７にグラフで示した。

【００８２】（実施例３）カルジオリピン抗原を含有する５０ｃｃのポリプロピレンチューブを、ポリス
チレンをポリプロピレンに置き換えたこと以外は実施例１と同様の方法で調製し
た。ポリプロピレン含有チューブを次に実施例２と同じ技術および試薬を用いて
ＥＬＩＳＡに使用した。結果はポリスチレンを用いたものより劣るが、検定は血
清サンプル中のａＰＡの質的および量的検出に成功した。

【００８３】（実施例４）実施例２または３の免疫学的検定を行った後、チューブの抗体コンテンツを２
．５ｐＨ緩衝剤中で洗浄することによって剥がした。カルジオリピンで飽和した
チューブを次に再利用したが結果は本質的に同じだった。３回使用した後でさえ
、変化は新しいチューブを使用して得られたデータから５％以下であった。故に
、ＰＬの抗原特性はプラスチック製品の製造および次の抗体の剥離に影響されな
かった。

【００８４】（実施例５）実施例１および２の方法を、５００μｇの凍結乾燥されたカルジオリピンとａ
ＰＡのところ、1グラムの凍結乾燥されたトランスフェリンと抗−トランスフェリン抗体を用いて繰り返した。検定方法は、７５分間ブロッキングし、４ｍｌの
０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０／ＴＢＳで各回４回洗浄し、以下の抗体
（０．５ｍｌの１％希釈のＢＳＡ）を、第１の抗体には６５分間、第２の抗体（
１：１０００希釈）には６０分間用い、５ｍｌの基材を３７℃で６０、１２０お
よび１８０分保持した後、０．０５ｍｌを０．０７５ｍｌの３ＭのＮａＯＨを含
有するミクロ滴定ウェルに移たことが異なっている以外は、同様であった。以下
の抗体を用いた：ダコ（Ｄａｋｏ）ウサギ抗−人トランスフェリン、抗−ウサギ
コンジュゲート、ＵＳＢヤギ抗−マウストランスフェリン１２４１および抗−ヤ
ギコンジュゲート。抗−トランスフェリン抗体が量的に検出できることを示す比
較可能な結果が得られた。このデータを図８に示す。

【００８５】（実施例６）５ポンドのポリスチレンストックペレットを５０ｎｇの凍結乾燥された約１．
０ｋｂ以上の平均長さを有するポリ−Ｔ尾部を備えたオリゴヌクレオチドと、ス
チールロッドでステンレススチールボール中で実施例１と同様の方法で混合し、
オリゴヌクレオチドをポリスチレンペレット全体に一様に分布させた。混合物を
、加熱オーガー中で成形した（ここでは、ポリスチレンを溶かし５０ｃｃの円錐
形のチューブの型に混合物を注入した）。

【００８６】溶けた材料を冷却して固化した。できあがった円錐形のチューブを次に型から
剥がし、いかなるポリヌクレオチドの塗布を追加することなくすぐ使用できた。

【００８７】（実施例７）実施例６で生成したチューブを次に約６００ｂｐの平均長さを有する０．５ｎ
ｇのサンプルＤＮＡとプラスチック中に埋め込まれたオリゴヌクレオチドを補足
するシーケンスとを含有する交雑緩衝剤で満たした。サンプルＤＮＡはサンプル
ＤＮＡシーケンス中の約１０％のＴＴＰ’ｓ上にジゴキシゲネンを導入した。比
較例のチューブはサンプルＤＮＡの添加を削除した。チューブを沸騰水浴中にお
き、交雑緩衝剤の温度を約９０℃で２分間保った。チューブを取り出しオリゴヌ
クレオチドにとっての最適交雑温度に冷却しその温度を６０分間保った。液体を
チューブからデカントし一連の高塩緩衝剤で洗浄した。チューブを１０％の牛血
清アルブミンブロック剤で約３０分間室温でブロックした。ブロッキング剤をデ
カントした後、アルカリンホスフェターゼラベルされたジゴキシゲネンに対する
抗体を含有する緩衝剤を添加し室温で６０分間保持した。チューブを３回サリン
緩衝剤で洗浄した。ジエタノールアミン中のパラニトロ−フェニルホスフェート
緩衝剤を添加しチューブを暗所で６０分間保持した。色の発生量を分光光度計で
決定しサンプルＤＮＡを添加しない比較例チューブと比べアルカリンホスフェタ
ーゼの存在を確定した。このことはＤＮＡを導入したチューブはＤＮＡ結合検定
のための固体相として効果的に役立っていることを示している。

【００８８】有効なことに、結合剤が固体材料全体に一様に分散してなる結合剤含有固体相
基材を形成する方法は高い融点、好ましくは１００℃以上の温度で行うことがで
きる。例えば、本発明の工程はポリスチレンに対しては２２６℃、ポリプロピレ
ンに対しては２３２℃およびポリカーボネートに対しては２４６℃で行ってもよ
い。結合剤含有固体相基材を形成する方法は好ましくは注射モルディング法であ
り、好ましくは注射モルディング工程は実質的に水なしで行う。

【００８９】特定の実施態様の前述の記載は本発明の一般的性質を明らかにしたものである
から、他者は現在の知識を適用して簡単にいろいろな用途のためにこのような特
定の実施態様を本来の概念から逸脱することなく改良および／または付加するこ
とができる。故にこのような付加および改良は開示された実施態様と同じ方法お
よび範囲内に含まれるものと認められる。ここで使用した用語および用法は説明
の目的であって限定するものではないと理解される。

【００９０】先に示したすべての参照文献はその全部について参照文献によって導入される
。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は結合剤が全体に分散されてなるテストチューブの部分図であ
る。

【図２】図２は結合パートナーを有するサンプル液体を添加し結合剤パート
ナーにとって十分な時間結合剤に結合させた後の同じ時テストチューブである。

【図３】図３は洗浄し、テストチューブ上で溶解しない結合パートナーに結
合するラベリング剤(ラベルされた抗体またはプロテインＧ)を添加した後の図２
と同じテストチューブである。

【図４】図４はＰＬが埋め込まれてなるチューブを用いたてａＰＡを検出し
た時のデータを示すグラフである。

【図５】図５はＰＬが埋め込まれてなるチューブを用いたてａＰＡを検出し
た時のデータを示すグラフである。

【図６】図６はＰＬが埋め込まれてなるチューブを用いたてａＰＡを検出し
た時のデータを示すグラフである。

【図７】図７はＰＬが埋め込まれてなるチューブを用いたてａＰＡを検出し
た時のデータを示すグラフである。

【図８】図８はＰＬが埋め込まれてなるチューブを用いたてａＰＡを検出し
た時のデータを示すグラフである。図面は発明のある特徴を例示するために書いたものであり、他の要素についての
大きさを書いたのではない。さらに、ある要素を機構的に書いたのでありこの際
多くの異なったデザインや検定フォーマットが発明の実施の間に可能である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１０日（２０００．２．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４０】検定が、全身のエリテマトーデス、静脈血栓症、頻発する動脈
血栓症、頻発する自然流産、血小板減少、舞踏病、てんかん、青色皮斑、特発の
肺の高血圧、リュウマチのような状態およびコラーゲン性の病気からなる群から
選択される状態に関連付けられるリン脂質抗原又はリン脂質結合プロテインの検
出により行われる請求項３５による結合検定。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１日（２０００．１２．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固体材料全体に一様に分散された結合剤を有する結合剤含有固体
相基材。
【請求項２】固体材料がプラスチック材料である請求項１による結合剤含有固
体相基材。
【請求項３】基材がビーズ、チューブまたはウェルの形状である請求項１によ
る結合剤含有固体相基材。
【請求項４】請求項１の結合剤含有固体相基材を含有する親和性分離材料。
【請求項５】結合剤が脂質またはリン脂質である請求項１による結合剤含有固
体相基材。
【請求項６】結合剤がプロテインまたは炭化水素である請求項１による結合剤
含有固体相基材。
【請求項７】結合剤がプラスチック材料に化学的にカップリングしない請求項
２による結合剤含有固体相基材。
【請求項８】結合剤が流動性材料内に一様に分布するように結合剤を固体相基
材になる流動性材料と混合して混合物を形成し、混合物を所望の形の結合剤含有固体相基材に整形し固化する（ここで結合剤は混
合物を固化する反応に参加しない）ことを包含する結合剤含有固体相基材調製方
法。
【請求項９】固体相基材がプラスチックである請求項８による方法。
【請求項１０】プラスチックが加熱時に流動性材料となる熱可塑性材料である
請求項９による方法。
【請求項１１】流動性材料が重合または架橋時に固体相基材を形成するモノマ
ーまたはオリゴマーを含有する請求項８による方法。
【請求項１２】モノマーまたはオリゴマーを熱または化学物質の添加によって
重合または架橋する請求項１１による方法。
【請求項１３】結合物質が抗原または付着剤である請求項８による方法。
【請求項１４】結合物質がプロテイン、脂質または炭化水素である請求項８に
よる方法。
【請求項１５】結合剤が固体相基材に化学的にカップリングしない請求項８に
よる方法。
【請求項１６】結合パートナーを含むと思われるサンプルを固体相基材全体に
一様に結合剤が分散されてなる結合剤含有固体相基材に接触させ（ここで、前記
結合パートナーは結合剤と結合可能であり、十分な時間十分な条件下で結合パー
トナーが結合剤に結合することが許されている）、結合パートナーの結合剤への結合の有無を検出することを包含する結合パート
ナーの存在を検出する結合検出。
【請求項１７】さらに前記結合パートナーが結合剤に結合する前または後にラ
ベリング剤を結合パートナーまたは結合剤と接触させることを包含する請求項１
６による結合検定。
【請求項１８】前記固体相基材がプラスチックである請求項１６による結合検
定。
【請求項１９】前記プラスチックが熱可塑性である請求項１８による結合検定
。
【請求項２０】前記結合剤がプロテイン、脂質または炭化水素である請求項１
６による結合検定。
【請求項２１】前記結合剤がリン脂質である請求項２０による結合検定。
【請求項２２】前記結合剤が抗原またはリガンドである請求項１６による結合
検定。
【請求項２３】前記結合剤含有固体相基材が少なくともサンプルを保持するた
めに設計されたコンテナの一部を有する請求項１６による結合検定。
【請求項２４】結合パートナーと結合剤との結合を壊し結合パートナーを固体
相基材から自由に剥がせるように試薬を添加するまたは物理的条件を変える（こ
こで、前記結合剤は固体相材料全体に結合剤が一様に分散されてなる固体相基材
中に埋め込まれ、前記結合パートナーは特別に結合剤と結合可能である）ことを
包含する不溶化した結合剤に結合した結合パートナーを剥がす方法。
【請求項２５】結合パートナーが酸、塩またはケイオトロピック（chaotropic
）剤によって剥離される請求項２４による方法。
【請求項２６】酵素結合剤が流動性材料中内に一様に分布し埋め込まれるよう
に、酵素結合剤を固体相基材となる流動性材料と混合して混合物を形成し、混合物を所望の形に形成し、混合物を固化して、酵素結合剤含固体相基材を形成し、基材を、酵素を含む液体に接触させ、酵素を埋め込まれた酵素結合剤に結合させることを包含する酵素結合剤を固定する方法。
【請求項２７】固体相基材がプラスチックである請求項２６による方法。
【請求項２８】固体相基材全体に結合剤が一様に分散されてなる固体相基材を
有する医療装置。
【請求項２９】固体相基材がプラスチックである請求項２８による医療装置。
【請求項３０】結合剤がリン脂質またはグルコスアミノグリカンである請求項
２８による医療装置。
【請求項３１】結合剤が凍結乾燥されている請求項１による結合剤含有固体相
基材。
【請求項３２】結合剤が脂質、リン脂質、プロテイン、炭化水素、ＤＮＡおよ
びRNAからなる群から選択される請求項１による結合剤含有固体相基材。
【請求項３３】検定が抗体、リン脂質抗原、またはリン脂質結合プロテインの
検出により行われる請求項１６による結合検定。
【請求項３４】サンプルを保持するために設計されているコンテナの少なくと
も一部は自動検出可能な光学系システムで使用されるコンテナである請求項１６
による結合検定。
【請求項３５】固体材料全体に一様に分散された結合剤を有する結合剤含有固
体相基材であって、結合剤は固体材料に化学的にカップリングせず、結合剤は脂
質またはリン脂質を含有する結合剤含有固体相基材。
【請求項３６】検定が、全身のエリテマトーデス、静脈血栓症、頻発する動脈
血栓症、頻発する自然流産、血小板減少、舞踏病、てんかん、青色皮斑、特発の
肺の高血圧、痴呆、健忘症、偏頭痛、へこみ血栓症、リュウマチのような状態お
よびコラーゲン性の病気からなる群から選択される状態に関連付けられる抗体、
リン脂質抗原、またはリン脂質結合プロテインの検出により行われる請求項３５
による結合検定。