JPS5838862A - 自己遮断抗体の検知方法と該方法に用いられる試薬キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、自己遮断抗体を検知する方法と、該方法に用
いられる試薬キットに関する。

多（の通常の生物学的相互作用に際しては、生体内の各
種の物質がその結合サイト（結合部位）を介して互に結
合しなければならな（・。

時には、遮断抗体（いわゆる自己遮断抗体（ａｕｔｏ　
ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）　）を生成す
ることによって、個体の免疫システムが、それらの物質
の１つ（結合剤ないしはレセプタ蛋白質であることが多
い）に対する自己免疫を創り出す。この遮断抗体は、レ
セフリ上の相補結合サイトに競合的に吸引される。した
がって、レセプタが本来反応すべき相補物質（いわゆる
リガンド（ｌ　ｉｇａｎｄ　）で、これも蛋白質である
ことが多い）に対する結合サイトが減少することになる
。

生成され得る自己遮断抗体系としてよく知られた例の一
つは、内因性因子とコノくラミン（ビタミンＢ１２）と
の間の相互作用である。

内因性因子（１ｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　）と
は、胃腸管を介してビタミンＢ１２を吸収するのに寄与
する糖蛋白質である。注入後、ビタミンＢ１２は特定の
レセプタサイトを介して内因性因子と結合し、得られる
複合体は該複合体のレセプタを介して胃腸管に吸収され
る。

悪性貧血においては、内因性因子を作り且つ分易する能
力が次第に衰退し最後には消滅してしまう。悪性貧血と
自己免疫抗体（特に、内因性因子遮断抗体）の存在との
間には非常に密接な関係がある。

上述のような状況においては、遮断抗体、例えば、内因
７性因子遮断抗体（以下、Ｉ　Ｆｌ（１ｎｔｒｉｎｓｉ
ｃ　ｆａｃｔｏｒ　）遮断サイト抗体と称する）の存在
を少なくとも定性的に知ることができるときわめて有用
である・。（なお、内因枦性因子は、少なくとも２棟類
の結合サイトを含有すると考えられているが、そのうち
の１種類のみがビタミンＢＩ２と複合体を形成するのに
関与する。） 内因性因子−ビタミンＢＩ２の問題に関連して、従来技
術においては、ＩＦ遮断抗体の存在を検知するのに２ジ
オアツセイ（放射標識検定）法を用いることが提示され
ている。それらの従来技術はすべて溶解手段を用いるも
のである。すなわち、反応試薬を全て溶液状態にするか
、少なくとも、液状媒体中に自由に懸濁させるものであ
る。しかして、当然のことであるが、ＩＦ遮断抗体を利
用して、標識付けした（すなわち、放射性の）ビタミン
Ｂ１２が内因性因子に結合するのを妨げる手段を用いる
。一般的には、内因性因子（すなわち、内因性因子を含
有する胃液）を患者の生体液試料（例えば、血清）と混
合し、しかる後、該混合物に、標識付けしたビタミンＢ
１２を（過剰に）添加する。次いで、標識付けしたビタ
ミンＢ１２の遊離状態のものから、結合した標識付ビタ
ミンＢ１２を分離することが必要とな、る。そのような
分離手段として、透析、ゲル沢過、活性炭吸収、および
リン酸ジルコ煩雑で時間のかがる分離手段が必要である
ことの他に、溶解手段を基礎とするラジオアッセイ法は
、多くの患者の試料に内因性のビタミンＢ１２１合剤が
存在することによる困難を伴なう。すなわち、内因性ビ
タミンＢ１２結合剤を考慮した付加的な対照操作を行な
ったり、試料から内因性ビタミンＢＩ２結合剤を、除去
する操作が必要となる。

本発明の特定の実施態様に従えば、ＩＦ遮断サイト抗体
の存在を検知するのに従来技術のような溶解手段を用い
ることに伴なう問題が克服され、更に、他の自己遮断抗
体を検知するのに有用な一般的な手法が提供される。

すなわち、本発明の目的は、自己遮断抗体の存在を定性
的または定量的に検知する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、Ｉｆ”Ｊ断すイト抗体の存在を検
知する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、従来技術のように溶解法を用
いることによる問題を有しない、ＩＦ、６断すイト抗体
を検知する方法を提供することに存する。

本発明の別の目的は、患者の自己遮断抗体の存在を定量
的または定性的に検知するのに用いられる診断用試薬キ
ットを提供することにある。

本発明の更に別の目的は、患者のＩＦ遮断抗体の存在を
検知するのに用いられる診断用試薬キットを提供するこ
とにある。

本発明の更に別の目的は、患者のＩＦ遮断サイト抗体の
存在を知り、適うな検量体を含む診断用試薬キットを提
供することにある。

本発明のその他の目的は、以下の発明の詳細な説明から
明らかになるであろう。

本発明に従えば、独自の不動化レセプタを利用しラジオ
アッセイ法により、自己遮断抗体が検知される。

すなわち、本発明は、自己遮断抗体の存在を検知する方
法であって、 （ａ）　　自己遮断抗体を含有し一〇いると考えられる
生体液試料を、該抗体に対する選択的な結合サイトを有
し且つ熱中（ｉｎａ旧ｍａｔｅ　）担体上に不動化され
たレセプタと混合し；（ｂ）　　前記の工程（ａｌから
得られる混合物を、存在する前記抗体の実質的にすべて
が前記レセプタと結合するのに充分な条件下に培養する
ことにより、前記無学担体に前記遮断抗体が結合した固
体用と、前記遮断抗体を有しない前記生体液試料から成
る液体相とを生ぜしめ； （Ｃ）　　前記液体相から前記固体用を分離し；（ｄ）
　　その分離された固体用に、前記選択的結合サイト用
の標識化ワガンドから成る液体を混合し； （ｅ）　　前記レセプタの選択的結合サイトのうち前記
遮断抗体に結合しそいないサイトに前記標識化リガンド
が結合し得るに充分な条件下において、前記工程（ｄ）
によって得られた混合物を培養して、遮断抗体および標
識化リガンドのうち少なくとも一方が結合した前記熱中
担体から成る第２の固体相と、未結合の標識化リガンド
から成る第２の液体相とを生ぜしめ； （ｆ）　　前記第２の液体相から前記第２の固体相を分
離し；さらに、 （ｇ）　　前記第２の固体相および第２の液体相のうち
の少なくとも一方に存在する標識化リガンドの量を測定
することから成る方法に関するものである。

本発明の好ましい実施態様においては、レセプタは蛋白
質である。

本発明の他の好ましい実施態様においては、レセプタは
内因性因子であり、標識付けされたリガンドはビタミン
Ｂ１２である。

更に、本発明の別の好ましい実施態様においては、試験
操作に際して、陰性の検量用対照物および陽性の検量用
対照物が用いられる。

本発明の他の好ましい実施態様においては、熱中担体と
して用いられるガラスビードとレセプタを共有結合させ
る。

上述したように、本発明は、定性的または定量的に、自
己遮断抗体の存在を知るのに有用である。本発明は、Ｉ
１ｇ断サイす抗体を分析することを例にして説明されて
いるが、レセプタが物理的および（または）化学的に熱
中担体に固定され、また、標識付はリガンドが該支持体
に培養され得る限りは、他の自己遮断サイト抗体、例え
ば、グンービス氏病（甲伏線刺激ホルモン用の自己遮断
抗体の存在を知る）、アジソン氏病等における抗体を分
析するのにも等しく有用であると考えられる。また、本
発明は、上述のような分析を行なう方法のみならず、該
方法に用いられる試粟キットも提供するものであり、そ
の好ましい態様においては、２種類の検量体が含まれ、
また、所望に応じて、陽性の対照体が含まれている。

本発明の思想は、不動化したレセプタ（最も多くは、不
動化したレセプタ蛋白質）を用いることを基礎としてい
る。レセプタは、患者の生体液試料に存在している任意
の自己遮断抗体が吸引されるような結合サイトを有する
物質である。また、該レセプタは、生体内での生物学的
相互作用においてリガンドに結合するのが一般的である
ような物質であることもある。自己遮断抗体（これは、
患者によって生°成される）は、リガンドとレセプタと
の間において生体内で複合体が生成する（この生成はレ
セプターリガンド結合に用いられるのに適した結合サイ
トの少な（とも幾つかにレセプタが結合することによっ
て行なわれる）のを妨害する。

熱中担体に蛋白質や他のレセプタ物質を固定する技術は
、本明細書で詳述する必要がない程既に進歩している。

各種の無相粒子やビートや表面（例えば、合成（有機）
ポリマー、セラミック、無機粉末、天然ポリマー、セル
ロース、アガロース等）が使用され得るが、好ましい基
体はガラスであり、例えば、米国マサチューセッツ州メ
トフィルドのＣｏｒｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ　　ａｎｄ
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手でき多くのＩＭＭＯ
ＰＨＡＳＥ■分析法で用いられているようなガラス粒子
である。それらのガラスは、多くの場合、アミノシラン
によって処理され、その多孔度を調整し得るものでｋ）
る。

レセプタは、共有結合を介して基体に結合されるのが通
常であり、この際、当該技術分野においてよく知られて
いるように、存在する反応基に応じてスペーサ部分が用
いられたり用いられなかったりする。例えば、当該技術
分野において良（知られているようにアミノシラン結合
およびゲルタールアルデヒドを介して、多孔度が調整さ
れたガラス粒子に内因性因子を反応させることができる
（例えは、米国特許第３，６６９，８４１号参照）。適
していれば、熱中担体上にレセプタを不動化するに際し
て、単純な吸着において起こるような、イオン結合、疎
水相互作用、ファンデルワールス力等を利用してもよい
。

レセプタは、生物組織に見出されるものと本質的に同じ
ものであるか、または、天然に存在するレセプタに模凝
するようなものを選ぶべきである。時には、抽出や安定
化処理などに際して変性が生じるが、分析に必要な結合
サイトが変らない限りは許容できる。勿論、多くの場合
、レセプタは、人間から得られるものの代わりに、低級
動物から得られる類似物質である。更に、他の天然に存
在する物質を利用することもでき、また、必要な部分の
結合サイトが天然に存在するレセプタの結合サイトと同
じである限りにおいては、合成物質を用いることもでき
る。したがって、予想される自己遮断抗体が結合するこ
とができるような非蛋白質系の物質、例えば、イオン交
換樹脂、疎水性物質等をレセプタとすることもある。時
には、レセプタが蛋白質でありながら、結合は蛋白質の
非蛋白質部分（例えば、炭水化物、脂質および（または
）ペプチド部分）を介して生じることもある。また、生
体外の実験によれば、ガラス粒子には、蛋白質から成る
蛋白質表面に模凝するものも存することが示されている
。

本発明において次に重要な試薬は、標識付けされたリガ
ンドである。レセプタの場合と同様に、リガンドは、生
体組織に存するものが好ましいが、生体組織に存するも
のを変性させたものでもよく、更には、結合サイトがレ
セプタと選択的に結合するのに必要とされるようなもの
である限りは、生体組織内においては機能しないような
合成物質であってもよい。

テストに用いられる患者の試料は、抗体が存在すると考
えられる生体液である。血清や血漿が用いられるのが通
常であるが、試薬や抗体に応じて、背柱液、尿、胃液、
血液等の他の流体を用いることもできる。

本発明は、また、不動化されたレセプタと標識付けされ
たリガンドを含有する試薬キットにも係り、該試薬キッ
トは、患者の生体液を不動化されたレセプタに混合し、
次いで、標識付はリガンドを添加することから成る方法
に用いられる。不動化レセプタと結合する標識付けされ
たリガンドの相対量を求めることにより、問題となる特
定の自己遮断抗体の存在を定性的または定量的に評価す
る。

リガンドは、放射性ラベル、酵素ラベル、螢光性ラベル
等を用いることによる任意の方法に従って標識付けされ
ることができる。

好ましくは、少なくとも、問題となる特定の自己遮断抗
体を全く含有していないことがわかっている陰性の検量
体を試薬キットに含ませておく。しかしながら、陰性検
量体および陽性検量体の双方を含ませて、患者の試料と
共に処理することが一層好ましい。陽性検量体とは、テ
ストの感度に応じて陽性反応を与え始めるように予め定
められた量の自己遮断抗体を含有する試薬である。すな
わち、ある試料が陽性検量体の「陽性」側に存するとき
は、該試料に自己遮断抗体が存在することが「陽性（貢
定的）」であり、また、ある試料が「陽性」検量体と「
陰性」検量体との中間に存するときは「灰色」（すなわ
ち、抗体が存在することが明確でない）領域に存するこ
とになる一後者の場合、テストの感度に応じて陽性にな
ったり陰性になったりするであろう。所望ならば、強い
陽性の対照体についても操作を行ない、強い陽性結果を
示しく抗体の存在を確実に知り）、他の試薬に対するダ
ブルチェックを行なってもよい。更に、リガンドに用い
るラベル（標識）の種類に応じて（特に放射性リガンド
を用いる場合には）、バックグランドの対照操作を行な
うこともできる。

実施例 次の６成分を有する試薬キットを用いて、ＩＦ［断サイ
ト抗体のラジオアッセイを行なう。

Ａ、内因性因子（不動化レセプタ蛋白質）内因性因子（
精製した豚の内因性因子）をガラス粒子に共有結合させ
たものを、保存剤として０．２％のアジ化ナトリウムを
含有する０１０３Ｍのリン酸塩系緩衝液（０，１５Ｍ、
ｐＨ７，４）に懸濁させたもの。

Ｂ、　　［Ｃｏ）ビタミンＢ１２（放射性リガンド）（
Ｃｏ）ビタミンＢ１２を、０．００１％シアン化カリウ
ム、ピペット助剤としてアマランス赤色染料（２μｊ！
／ｍｌ）、および、保存剤として０．２％のアジ化ナト
リウムを含有する０、　１　Ｍのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ
９，３）に溶解させたもの。

Ｃ，ジチオスレイトール（非選択性結合を向上させるた
めの任意成分） 分析に適するような濃度に調整した１、０ｍｌのジチオ
スレイトールを含有するバイアルＯ Ｄ、陰性検量体 繊維素除去した人間の血漿から成る。この物質は、凍結
乾燥し、使用する際に再調製され得るようになっている
。

Ｅ、陽性検量体 内因性因子に対する遮断抗体を含有する稀薄な人間の血
漿を、抗体陰性と抗体陽性の境界点（ｃｕｔｏｆｆ　ｐ
ａｉｎｔ　）を定める濃度にしたもの。該血漿の稀薄液
は、内因性因子に対する遮断抗体を含有しない繊維素除
去した人間の血漿から分離したものである。

この物質は、凍結乾燥されることができて、使用に際し
て再調製され得る。打ち切り点は、抗体を有しない正常
な試料約８００と、遮断抗体を有する試料約１００とを
評価することによって求められる。正常な試料の平均か
らの標準偏差が３となる点における応答を打ち切り点と
する。陽性試料はこの境界には含まれない。

Ｆ、陽性対照体 この陽性対照体は、陽性検量体と同じ物質から製される
ものである。但し、添加する遮断抗体の量を多くして、
分析に際して陽性応答の感度を高める。

上述の各試薬を貯蔵、再調製または取扱うために、当業
者にとって既知の各種の手法が用いられる。それらの試
薬は、使用時には室温下にある。

検定法（分析法） 機械のバックグランド、陰性検量体（１００μｌ）およ
び陽性検量体（１００μｌ）については４回の操作を行
ない、他の試料（各、１００μｌ）については２回の操
作を行なうことが好ましい。しかして、それぞれの試料
の平均値を用いて以下に記すような計算を行なう。

上述の好ましい態様を考慮して、次のようなテストの準
備を行なう。

１〜４　　　　空（バックグランドのノイズ用）５〜８
　陰性検量体 ９〜１２　　陽性検量体 １３〜１４　　陽性対照体 １５〜１６　　　患者の血清試料 すなわち、分析を始めるに当って、％１００μｌの試薬
りを含有する管５〜８、各１００μｌの試薬Ｅを含有す
る管９〜１２、各１００　ｔｔｌの試薬Ｆを含有する管
１３〜１４、および、各１００μｌの生体液試料を含有
する管１５〜１６を用意する。

次に、既知蛍（０，５ｍ１）の不動化した内因性因子（
試薬Ａ）を、管５〜１６に添加する。

斜管を攪拌し、しかる後、内因性因子と抗体との間で複
合体が形成する温度において培養（例えば、室温下で約
２時間）する。次いで、容管を遠心分離しデカントする
。血清中に存在する内因性ビタミンＢ１２結合性蛋白質
は、この工程においてデカンテーションにより除去され
ることになる。既知ｉ（ｔｏｍｌ）の放射性リガンド（
試薬Ｂ）を管５〜１６に添加し、更に培養（例えば、室
温下において約１時間）に供する。再び遠心分離を行な
い、次いでデカンテーションを行なう。斜管の放射能を
測定する。

もしも患者にビタミンＢ１２が投与されていれば、分析
中に患者の試料を処理して（例えば試薬ＡにビタミンＢ
１２結合剤を予め混合してお（）存在する遊離のビタミ
ンＢ１２を除去することもできる。代わりに、不動化さ
れた内因性因子を添加する前に、管１５〜１６にビタミ
ンＢ１２を添加してもよい。一般的に言えば、２，００
０　ｐ、９　／　ｍｌまでのビタミンＢ１２を含む血清
試料であれば、分析を妨害する程度の遊離ビタミンＢ１
２を含有してはいない。

ジチオスレイトールを用いる場合には、放射性ビタミン
Ｂ１２溶液の１成分として放射性リガンドを添加する際
に試料に該ジチオスレイトールを添加する。この成分の
使用は、非選択的な結合を向上させるための任意的なも
のである。

用いる数値は全て、平均値からバックグランド用の管の
平均のカウント数を減じたものである。このテスト法は
定性的なものであるから計算は簡単である。陰性検量体
かｒ）イ！７られる１分当りの正味のカウント数を１−
件検量体から得られる１分当りの正味のカウント数で除
すると、１．００よりも大きな値（Ａ）が得られる。次
いで、未知試料の各々から得られる正味のカウント数を
、陰性検量体の値で除することによって、各未知試料に
ついての数値が得られる。経験上、分析が有効であるた
めには、（５）は１．１５か１．１５よりも太き（なげ
ればならない。しかして、未知試料についての上記の値
が（５）よりも小さいか（Ａ）に等しいならば、該未知
試料は抗体に関して陰性であると推定される。他方、未
知試料についての値が（５）よりも大きいならば、該未
知試料は抗体に関して陽性である。勿削、（Ａ）と１．
００との間には「灰色（不確定）」鎖酸が存する。

当業者にとっては、上述の本発明を変更することは明ら
かであろう。例えば、培養の条件は広範囲に変更し得る
ものであり、所望に応じて洗滌工程を用いることもでき
、また、分離操作は遠心分離とデカンテーションに限ら
れず、上述と異なる手法で計算を行なうこともでき、更
に、不動化担体に結合しなかったリガンドについて得ら
れた値を用いて陰性および陽性の応答を計算することも
できる。

第１頁の続き ０発　明　者　ルイス・ジエイ・ライスバーブアメリカ
合衆国マサチューセッ ツ州ニーダム・イブリン・ロー ド７３

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　自己遮断抗体の存在を検知する方法であって
   、 （ａ）　　自己遮断抗体を含有していると考えられる生
   体液試料を、該抗体に対する選択的な結合サイトを有し
   且つ無生担体上に不動化されたレセプタと混合し； （ｂ）　　前記の工程（ａ）により得た混合物を、存在
   する前記遮断抗体の実質的にすべてが前記レセプタに結
   合することができるのに充分な条件下に培養することに
   より、゛１断抗体が結合した前記無生担体から成る固体
   用と、前記遮断抗体を有しない前記生体液試料から成る
   液体相とを得； （Ｃ）　　前記液体相から前記固体用を分離し；（ｄ）
   　　前記選択的結合サイトに対する標識付けされたリガ
   ンドから成る液体相を、前記分離された固体用と混合し
   ； （ｅ）　　前記工程（ｄ）により得た混合物を、前記レ
   セプタの選択的結合サイトのうち前記遮断抗体と結合し
   ていないサイトに前記標識付リガンドが結合し得るに充
   分な条件下に培養することにより、遮断抗体および標識
   付リガンドの少なくとも一方が結合した前記無生担体か
   ら成る第２の固体用と、未結合の標識付リガンドから成
   る第２の液体相とを得； （ｆ）　　前記第２の液体相から前記第２の固体用を分
   離し；さらに （ｇ）　　前記第２の固体用および前記第２の液体相の
   少なくとも一方に存在する標識付リガンドの量を測定す
   ること、 から成ることを特徴とする前記方法。
2. （２）　　レセプタが蛋白質である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. （３）　　対照用に、既知の陰性検量体および既知の陽
   性検量体について操作が行なわれる特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
4. （４）　　レセプタが内因性因子であり、リガンドがビ
   タミンＢｌｚである特許請求の範囲第２項または第３項
   記載の方法。
5. （５）　　レセプタが内因性因子であり、リガンドがビ
   タミンＢ１２であり、陰性検量体が人間の血漿から調゛
   製され、また、陽性検量体が前記自己遮断抗体を含有す
   る人間の血漿から調製される特許請求の範囲第３項記載
   の方法。
6. （６）　　無生担体がガラス粒子である特許請求の範囲
   第１項、第２項、第３項または第４項記載の方法。
7. （７）　　レセプタが、前記ガラスに共有結合する特許
   請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）標識付けが、放射性物質、螢光性物質または酵素
   を介して行なわれる特許請求の範囲第１項、第２項また
   は第３項記載の方法。
9. （９）　　自己遮断抗体の存在を検知するのに用いられ
   る試薬キットであって、前記抗体に対する選択的結合サ
   イトを有し且つ無生担体上に不動化されたレセプタと、
   該レセプタに対する標識付けされたリガンドとから成る
   前記試薬キット。 ００）　　レセプタが蛋白質または内因性因子であり、
   リガンドがビタミンＢ１２であり、人間の血漿から調製
   された陰性検量体と、自己遮断抗体を含有する人間の血
   漿から調製された陽性検量体を含む特許請求の範囲第９
   項記載の試薬キット。 （１υ　前記陽性検量体よりも多量の前記自己遮断抗体
   を含有する人間の血漿から調製された陽性対照体を含む
   特許請求の範囲第１０項記載の試薬キット。 θ′ＩＪ　　無生担体がガラス粒子であり、レセプタが
   該ガラスに共有結合する特許請求の範囲第９項、第１０
   項または第１１項記載の試薬キット。