JP2570408B2

JP2570408B2 - 抗原，抗体又は生理活性物質固定化用の担体

Info

Publication number: JP2570408B2
Application number: JP63301854A
Authority: JP
Inventors: 博石田; 孝浩竹山
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1988-11-29
Publication date: 1997-01-08
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: JPH02147861A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、免疫反応測定に用いる抗原，抗体又は生理
活性物質を固定化した担体に関し、詳しくは、免疫反応
を利用して例えば人体の体液中の微量物質を定量的かつ
選択的に測定する免疫学的診断方法に用いられる担体に
関するものである。

（発明の背景及び従来の技術）体液中の特に血清や尿に含まれる微量物質を検出した
りその濃度を測定する方法として、従来より免疫測定法
が広く用いられており、この免疫測定法における抗原と
抗体との反応は、極めて特異性が高くかつ極めて低濃度
でも起こる特徴があるものとして知られ、その特徴を生
かして抗原抗体反応を定量的に検出することにより、抗
原あるいは抗体の濃度を測定する方法として優れてい
る。

しかしながらこのような測定方法において、結合物で
あるＢ型と遊離物であるＦ型の分離（B/F分離）の操作
は一般に繁雑であり、迅速かつ正確な免疫測定を実施す
る上で大きな阻害要因となっている。

ここで本発明が適用される免疫測定法の概要を、ヘテ
ロジニアスサンドイッチ免疫測定法を代表例として以下
説明すると、このヘテロジニアスサンドイッチ免疫測定
法は、まず定量したい物質（以下「抗原」という）に対
する抗体を吸着又は化学結合により固定化させる（以下
この固定化された抗体を「固定化抗体」という）と共
に、この固定化抗体とは異なる抗原のエピトープを認識
する抗体にラジオアイソトープや酵素等による標識をし
た物（以下この標識された抗体を「標識抗体」という）
を準備する。

次にこれら固定化抗体及び標識抗体の二つを含む溶液
に、血清，尿などの被検液を加えて、この被検液に含ま
れる抗原と標識抗体を結合させた状態で固定化抗体に捕
捉させる。

ここで、担体に固定された標識抗体−抗原固定化抗体
の結合物の量は、被検液中に含まれる抗原の濃度に比例
するので、固定化担体を介して担体に捕捉された標識抗
体を、洗浄した後その標識の量を測定することで、目的
とする抗原濃度が測定できる。

以上がヘテロジニアスサンドイッチ免疫測定法の基本
的原理であり、現在ではこの基本的な原理を用いて更に
様々な測定方法が考案され広く利用されている。

ところで、このような基本的原理を用いて免疫測定を
行なう場合にも、優れた測定結果を得るために、免疫測
定の測定様式に合致した材料の選択に種々の条件がある
他、測定様式の如何に関係なく要求される条件もある。

例えば前者の測定様式に依存して要求される基材の条
件の一つとして、担体基材の素材，形態の選択がありこ
れは測定様式に左右される重要なものである。例えば多
項目の同時免疫測定を実施する特開昭61−219863号の方
法では、その実現のためにセルロース等のペーパーディ
スクが使用される。また特開昭61−228354号や特開昭59
−90056号には、抗体を結合させた毛細管含有多孔質担
体を用いて抗原の毛細管移行現象を利用する免疫測定方
法が開示されているが、この方法では、担体基材として
クロマト用紙，セルロースアセテート膜，マトリック
ス上に均一に埋封されたリシカ微粉が利用できるとされ
ている。また更に磁気感応性担体を用い振動磁界の作用
による撹拌を利用して感度を高める測定方法も知られ、
このような例として例えば特開昭61−167866号ではフェ
ライト等の磁気感応性粉体を熱可塑性樹脂の表面に担持
させ、その表面をポリマーで被覆させたものを開示して
いる。

このように、抗体の固定化に用いられる担体基材の選
択は、測定様式に依存して好適な素材，形態のものが決
まる場合が多い。

また、上記のような測定様式に依存して求められる条
件とは別に、抗体固定化用の担体の基材として一般的に
求められる条件もあり、このような条件として例えば次
の（１）〜（４）が例示される。

（１）抗体の固定化が可能であること（２）標識抗体等の非特異的吸着が低いこと（３）洗浄が容易に行なえること（４）化学的，物理的に安定であることこれらの条件は、言い換えると何等かの方法で抗体等
が固定化でき、また固定化操作中及び固定化後において
安定な物質であることが担体基材に要求されるというこ
とを意味している。

抗体固定化の方法として従来知らるものには種々のも
のがあり、例えば、クロマト用紙等のセルロース製シ
ート物はCNBrで活性化し、抗体と反応し得る活性基を導
入する方法が最も代表的な方法として知られている。ま
た、ガラスの担体基材に対して、ガラスのシラノール基
をシランカップリング剤で化学修飾し、さらにその感応
基を介して抗体を固定化する方法も知られている。

しかし前者の方法では使用するCNBrが猛毒性であると
いう問題がある。また後者の方法は、工程が複雑である
と共に、ガラス繊維紙のようなもろい基材には適用で
きないという問題がある。

抗体固定化の方法として更に別に知られるものに、吸
着による方法があり、例えばポリスチレンが抗体吸着性
の高いものとして知られている。しかしながらこのポリ
スチレンは、加工可能な形状が限定され、例えば紙状
やスポンジ状のものをポリスチレンで作製することは実
際的でない。

以上のように、免疫測定用の担体は、測定の実施に重
要な係わりをもつものであるが、測定様式等や条件に依
存して作用できる担体基材が限定されるなど、その素
材，形態等についてかなり限定されたものが使用されて
いるのが現状である。

（発明が解決しようとする課題）本発明は、上記のような問題点を解決するためになさ
れたものであり、その目的の一つは、抗原，抗体又は生
理活性物質を固定化して免疫反応に用いられる用途に優
れた性質を有する抗体等の固相化用の担体を提供すると
ことにある。

また本発明の別の目的は、製造が容易で、容易かつ安
価に提供できる抗体等の固定化用の担体を提供するとこ
ろにある。

（課題を解決するための手段）上記目的を実現するためになされた本発明の特徴は、
抗原，抗体又は生理活性物質（以下「抗体等」という）
の固定化用表面に、ポリパラキシリレン又はその誘導体
（以下これらを総称して「ポリパラキシリレン等」とい
う）からなる被覆層を設けて、抗体等の固定化表面を提
供するところにある。

以下本発明を具体的に説明する。

上記構成におけるポリパラキシリレン等としては、下
記の一般式を有するものが使用でき、（ただし上式において、ｎは平均500以上、R₁,R₂はそれ
ぞれ水素又はハロゲンを示し、同じであっても異なって
いてもよい。）、具体的には以下のものを例示できる。
すなわち担体基材表面のポリパラキシリレン等による被覆は、
例えば（J.Polum Sci.,22巻,475〜491頁）に記載の方法
を用いることができる。具体的には例えば、上記文献に
記載の「パリレン蒸着装置モデル1010」（ユニオン・カ
ーバイド社製）の装置を使用して、まず基材、及びポリ
パラキシリレン等の原材料としての二量体とを当該装置
に封入して減圧し、装置内部の気圧が所定の減圧状態
（例えば0.1 torr）に達した時点で二量体を加熱して昇
華させ、さらに昇華した二量体分子が担体基材表面に達
する前に700℃程度まで熱することで熱分解，開裂させ
て活性な単量体を生成させる。この活性な単量体分子を
目的の担体基材の表面で蒸着重合させることで、重合度
500以上のポリマーで該基材表面を被覆させることがで
きる。この場合の担体基材には上記減圧条件に耐久性の
あるものが使用される。

担体基材の表面を被覆するポリパラキシリレン等の膜
の厚みは、基材の材質，性状，形態等に応じて適宜その
最適値を決めればよいが、例えば担体がビーズ等である
場合には基材同志の摩擦，衝撃で破損しない強度であれ
ばよく、一般的には0.1μｍ〜50μｍ、好ましくは１μ
ｍ〜20μｍ程度の範囲とすることが望ましい。また担体
基材がクロマト用紙やガラス繊維紙である場合には
その空隙を塞がないように注意する必要があり、上記ポ
リパラキシリレン等の膜厚としては0.1μｍ〜１μｍ程
度の範囲とすることが適当である場合が多く、他方金属
製担体基材のように強い衝撃が加わるような使用形態で
用いられるものの場合には、それに見合う強度の膜厚が
必要で例えば４μｍ〜20μｍ程度の範囲とするのが好ま
しい場合が多い。

本発明における抗体等を固定化した担体には更に、非
特異的吸着を抑えるためにBSA（牛血清アルブミン），
牛血清，カゼイン，スキムミルク等で処理してから免疫
測定に用いることが良い。

上記担体の骨格を構成する熱可塑性樹脂としては、例
えば0.1〜20mmの平均粒径をもつポリスチレン、ポリプ
ロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ナイロン、
ポリエチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩
化ビニル及びこれらを主成分とする共重合体、若しくは
混合物の少なくとも一種を好ましく使用することができ
る。

上記熱可塑性樹脂に担持される磁気感応性粉体として
は、所謂ソフトフェライトの例えば0.01〜10μｍの粉体
を好ましく用いることができる。

磁気感応性粉体は上記熱可塑性樹脂からなるビーズの
作製時に混合して内部に含有させるかあるいは表面に担
持させればよく、表面に担持させる方法としては、吸着
による方法、熱融着による方法等を用いることができ
る。

磁気感応性粉体のビーズへの含有の程度は、担体流動
のために作用させる磁界の強度、担体の流動性の程度等
により異なり必ずしも一律に決められないが、一般的に
はビーズ質量の１％〜80％、好ましくは５％〜40％程度
とすることがよい。

また単なる鉄やステンレスのボールのようなものを核
として用いることもできる。

（作用及び効果）本発明の上記担体は、抗体等を吸着固定化する能力の
非常に高いポリパラキシリレン等による表面の被覆層を
有するという上記構成をなすことによって、ポリパラキ
シリレン等の蛋白質を吸着固定化する優れた性質を利用
できると共に、他の化学的処理を行なうことなく抗原又
は抗体の固定化が容易にでき、また免疫測定を行なう場
合に表面の抗体未吸着領域をBSA等で塞ぐこと（以下
「ブロッキング」という）により担体への非特異的吸着
を十分に抑えることができる。

また本発明のポリパラキシリレン等を被覆させる対象
物は、該被覆処理の際の耐圧性等を満足すれば特にその
形状等に制限されるものがないため、現在汎用されてい
るポリスチレンと同等の非特異的吸着能力を有する担体
を、簡単かつ広範囲に提供できるという効果もあり、し
かも当該ポリパラキシリレン等を、基材自体の加熱を伴
なわない処理によって被覆することで、担体基材の機械
的強度も向上されるため、機械的強度が低い、もろい、
あるいは熱に対して不安定である等の性質のため、現在
にところ上記担体基材としての利用が制限されている種
々の素材の利用の途を開くという効果もある。

更にまた磁気感応性のビーズ等の免疫測定用担体を本
発明により容易かつ好適に作製できるという効果もあ
る。すなわち、磁気感応性粉体を含有する熱可塑性樹脂
を構造部分とする担体は、その形状に格別の制約を受け
ることはなく、ポリパラキシリレン等の表面被覆を行な
うことができ、そこに抗体等を吸着させることで設計通
りの抗原，抗体又は生理活性物質の固定化用の担体を作
製できる。

このような磁気感応性のビーズ等は、磁気感応性粉体
を内部に担持させた熱可塑性樹脂等からなるビーズを準
備し、この表面をポリパラキシリレン等で被覆し、更に
表面に抗体等を吸着させることで上記担体を製造でき
る。

上記磁気感応性ビーズ等に抗原，抗体又は生理活性物
質を固定化することによって、マグネチックスターラ等
で撹拌しながら抗原抗体反応を促進させて測定系の感度
を高めることができると共に、効率のよいB/F分離を行
なうことが実現でき、免疫測定の迅速かつ定量的な操作
に有益である。

（実施例）以下本発明を図面に示す実施例に基づいて説明する
が、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものでは
ない。

実施例１抗体固定化用担体の製造平均粒径1.5mmのエチレン−酢酸ビニル共重合体粒子1
00gと、平均粒径0.3μｍのMnF₂0₄,ZnFe₂0₄を成分とする
ソフトフェライト20gとを混合し、110℃で30分間、撹拌
しながら加熱して磁気感応性粉体含有のビーズを製造し
た。ビーズの粒径は1.5mmであった。

次にこの磁気感応性粉体含有のビーズ50gに、真空蒸
着装置を用いてジモノクロロパラキシリレン（ユニオン
カーバイド社製）10gを蒸着被覆して本例の抗体固定化
用担体を作製した。蒸着被覆の操作は、蒸発（昇華）温
度175℃、熱分解温度680℃、真空度0.1torrの条件で、
上述したJ.Polum Sci.,22巻,475〜491頁に記載のP.クラ
マーらの方法に準拠して作製されたパラキシリレン蒸着
装置により行なった。ポリパラキシリレンの膜厚は２μ
ｍであった。

なお蒸着処理を通してビーズの回転撹拌を行なった。

このようにしてポリモノクロロパラキシリレン被覆層
を有する担体を用いて以下の実験を行なった。

担体への抗体の固定化磁気感応性粉体含有の上記担体2000個を、4mlの0.1M
炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に懸濁し、抗TSH（甲状腺刺
激ホルモン）モノクローナル抗体を250μｇ加え、室温
で16時間振盪した。リン酸・生理食塩水で５回洗浄した
後、0.5％牛血清アルブミン,0.1リン酸緩衝液pH7.5中に
室温で３時間懸濁し、担体表面に吸着部位のブロッキン
グを行なった。

TSHの酵素免疫測定抗TSHモノクローナル抗体を固定化した担体の12個づ
つを、直径10mm、高さ20mmのポリプロピレン製カップに
入れた。これに、上記担体に固定化した抗体とは異なる
エピトープを認識する抗TSHモノクローナル抗体−アル
カリ性フォスファターゼ結合体を牛血清で希釈した溶液
50μと、既知濃度のTSHを含む標準ヒト血清100μを
分注し、マグネチックスターラを用いて37℃で40分間担
体を撹拌させながら反応させた。

0.1％ツイーン20（Tween20）・リン酸緩衝液で５回洗
浄したあと、1mMの４メチルウンベリフェリルリン酸溶
液pH10.0を100μを加え、37度で10分間振盪した。次
いで、1MのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を含む0.14
Mのリン酸緩衝液を500μ加えて反応を停止させた。

反応を停止させた液を、励起波長360nm、蛍光波長450
nmで蛍光強度を測定し、その結果を第１図に示した。

この結果から、ポリパラキシリレン処理した磁性ビー
ズを用いて感度の高い免疫測定を実施できることが分
る。ちなみに実施例２においてｙ切片とその2SDから計
算されるTSHの最小検出感度は0.003μIUであった。

また実施例中におけるビーズの抗体の固定化及び免疫
側測定中において、フェライトのビーズからの剥離は全
く認められなかった。

実施例２（各種紙による免疫測定）セルロース製紙（ワットマン社製、ET31）と、ガラ
ス繊維紙（ワットマン社製、GF−Ｂ）をジモノクロロ
パラキシリレンで0.5μｍの膜厚に被覆した。被覆の条
件等は実施例１と同じである。

前記の操作においてはセルロース製紙を加熱するこ
となく、ジモノクロロパラキシリレンの被膜を形成でき
る。

上記ポリパラキシリレン被覆紙を直径6mmに打抜い
たものを、抗プロゲステロン抗体を含む0.1Mリン酸緩衝
液pH8.0に５時間浮遊させた。打抜き片（以下「ディス
ク」という）１個あたりの抗体量は10μｇであった。つ
いで抗体溶液を捨ててから0.5％BSAを含む0.1Mリン酸緩
衝液pH8.0に浮遊させ一晩放置した。

比較のためにポリパラキシリレンで被覆されていない
紙を同様に処理した。

上記各ディスク１枚づつを試験管に入れ、プロゲステ
ロン−アルカリ性フォスファターゼを含む0.5％BSA・0.
1Mリン酸緩衝液pH8.0、500μを加え、室温で１時間反
応させた。0.1％ツイーン20（Tween20）リン酸緩衝液で
３回洗浄した後、10mMパラニトロフェニルリン酸溶液pH
10.0を0.5ml加えて37℃で30分間放置した。ついで、1M
のEDTAを含むリン酸緩衝液を2ml加えて反応を停止さ
せ、溶液の405nmの吸光度を測定した。

その結果を下記表１に示す。

グループ１と２の比較で、グループ１の方が高い吸光
度であることは、ポリパラキシリレン被覆紙が高い抗
体の固定化能力をもつことを示している。また、グルー
プ３はポリパラキシリレン処理した紙に抗体を結合さ
せないでブロッキングしグループ1,2と同様に測定した
ものであり、ポリパラキシリレン被覆紙の非特異的吸
着が極めて低いことを示している。

この結果は、ポリパラキシリレン被覆紙に抗体を吸
着させたものが免疫測定用の担体として好適に利用でき
ることを示す。

【図面の簡単な説明】

図面第１図は本発明を適用して構成した抗TSHモノクロ
ーナル抗体固定化担体を用いてTSHの酵素免疫測定を行
なったときのTSHと蛍光強度の関係を示した図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原，抗体又は生理活性物質の固定化用表
面にポリパラキシリレン又はその誘導体からなる被覆層
を設けたことを特徴とする抗原，抗体又は生理活性物質
固定化用の担体。
【請求項２】ポリパラキシリレンが、下記の一般式で表
わされるものであることを特徴とする請求項１に記載し
た抗原，抗体又は生理活性物質固定化用の担体（ただし上式において、ｎは平均500以上、R₁,R₂はそれ
ぞれ水素又はハロゲンを示し、同じであっても異なって
いてもよい。）
【請求項３】担体を構成する基材が、熱可塑性樹脂を用
いてビーズ状あるいはプレート状の所定の形状に成形さ
れたものであることを特徴とする請求項１または請求項
２に記載した抗原，抗体又は生理活性物質固定化用の担
体。
【請求項４】担体を構成する基材が、磁性体を含有する
ものであることを特徴とする請求項１または２に記載し
た抗原，抗体又は生理活性物質固定化用の担体。