JP2001352985A - Ｇａｓｃ１遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】９ｐ２３−２４に増幅が認められ、ＰＸドメイ
ンおよびＰＨＤフィンガー・モチーフを有し、細胞の増
殖、分化、腫瘍形成に重要な役割を演じ、例えば悪性腫
瘍等の細胞の分化に関与する疾患の病態解明、診断、治
療などに有用な、新しい遺伝子等を提供。 【解決手段】（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配
列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列に対して少なく
とも９５％の相同性を有するポリヌクレオチドおよび
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対
する相補鎖であるポリヌクレオチドを含む遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な遺伝子、よ
り詳しくは、ヒト食道の扁平上皮細胞の染色体９ｐ２３
−２４の位置に存在しており、該細胞の癌化によって、
その増幅およびその遺伝子産物の過剰発現が認められる
新規な遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の増幅は、腫瘍細胞においてしば
しば観察される。この増幅は、腫瘍進展に影響する癌原
遺伝子の活性化メカニズムの一つである(Stark,G.R.,et
al.,Cell, 57,901-908 (1989))。増幅領域内に存在し
て増幅の対象となっている遺伝子を同定し、その特徴を
明らかにすることは、癌の発生と進展の分子機構を明ら
かにする上で重要な情報を提供する。

【０００３】食道癌は世界中において癌の死因の第６番
目になっている(Pisani, P., et al., Int. J. Cancer,
83, 18-29 (1999))。この組織において生じる腫瘍の２
つの主な組織病理学的な型は、扁平上皮癌と腺癌とであ
り、扁平上皮癌は、他の国と同じく、日本において最も
しばしば見られる型である(厚生白書99年版)。

【０００４】ＭＹＣ、ＥＧＦＲおよびＣＣＮＤ１の増幅
を含む、食道扁平上皮癌の発生、進展および／または転
移に関連する遺伝子変化の幾つかが確認されている(Lu,
S.,H., et al., Int. J. Cancer, 42, 502-505 (1988);
Jiang, W., et al., CancerRes., 52, 2980-2983 (199
2))。

【０００５】近年、ＣＧＨ(Comparative genomic hybri
dization)を用いた研究によって、食道扁平上皮癌にお
いて少なくとも新しく１０の増幅領域が確認されている
が(Pack, S.D.,Genes Chromosomes Cancer, 25, 160-16
8(1999); Shinomiya,T.,et al., Genes Chromosomes Ca
ncer, 24, 337-344 (1999);.DuPlessis, L.,et al.,Ca
ncer Res., 59, 1877-1883 (1999))、食道扁平上皮癌
に関連する遺伝子は、これらの検出された染色体上の増
幅領域からは未だ同定されていない。

【０００６】本発明者らは、２９の食道扁平上皮癌細胞
株について、ＤＮＡコピー数の異常を探索した結果、幾
つかの新規な増幅領域を検出し、それらの中に９ｐ２３
−２４領域の増幅を高頻度に確認した。

【０００７】該９ｐ２３−２４領域での増幅は、この領
域のゲノム変化が、非小細胞肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子
宮頸部癌、乳癌、骨肉腫並びに縦隔胸腺Ｂ細胞リンパ腫
を含む種々の悪性疾患に関わっていることが知られてい
る(Knuutila,S.,et al., Am.J. Pathol., 152, 1107-11
23 (1998))点より、特に興味がもたれた。このような報
告は、該９ｐ２３−２４領域には、組織の型に拘わら
ず、増幅により活性化された癌遺伝子として働き得る１
またはそれ以上の遺伝子が隠れている可能性を示唆して
いる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先にＣ
ＧＨにより幾つかの食道扁平上皮癌細胞株において増幅
を認めた領域を、分子細胞遺伝子学的に解析することに
より、９ｐ２３−２４領域の増幅を明らかにした。本発
明者らは、この９ｐ２３−２４増幅領域内に存在すると
推定される腫瘍関連遺伝子を同定するために、同領域内
に存在する遺伝子や未知の転写体をスクリーニングし、
その結果、ＰＨＤとＰＸドメイン（Aasland,R., et a
l., Trends. Biochem. Sci., 20, 56-59(1995); Lock,
P., et al., EMBO J., 17, 4346-4357 (1998)）を含む
蛋白をコードする新規な遺伝子の単離に成功し、これを
ＧＡＳＣ１(Gene Amplified in Squamous cell Carcino
ma 1)と命名した。本発明は、かかる知見を基礎として
完成されたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、以下の
要旨の発明が提供される。 (1) 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチ
ドを含む遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド （ｂ）配列番号：２で示される塩基配列に対して少なく
とも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド、 （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対
する相補鎖であるポリヌクレオチド。 (2) 配列番号：２で示される塩基配列である上記(1)に
記載の遺伝子。 (3) 配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである上記(1)に記載
の遺伝子。 (4) 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する遺伝
子発現産物。 (5) 上記(1)または(2)に記載の遺伝子を有する組換え体
発現ベクター。 (6) 上記(5)に記載の組換え体発現ベクターを保有する
宿主細胞。 (7) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも１５の塩基配列を有するヌクレオチド配列。 (8) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも３０の塩基配列を有する上記(7)に記載のヌクレ
オチド配列。 (9) 配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも１５の塩基配列を有するプローブ。 (10)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも３０の塩基配列を有する上記(9)に記載のプロー
ブ。 (11)上記(9)または(10)に記載のプローブを有効成分と
して含有する癌診断剤。 (12)上記(9)または(10)に記載のプローブを有効成分と
して含有する癌診断用キット。 (13)上記(1)に記載の遺伝子の発現産物に結合性を有す
る抗体またはその断片。 (14)検体に上記(13)に記載の抗体またはその断片を反応
させて、検体中の該抗体またはその断片の結合物を検出
する癌の診断方法。

【００１０】また本発明によれば、下記要旨の発明も提
供される。 (15)上記(4)に記載の遺伝子発現産物を発現するクロー
ン化されたｃＤＮＡ、その断片、それらの誘導体、例え
ば構造を一部改変したり、他のアミノ酸配列等を付加し
て得られる改変物、およびそれらの相同物。 (16)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも１５の塩基配列に対するアンチセンス・ヌクレオ
チド配列。 (17)配列番号：２で示される塩基配列中の連続する少な
くとも３０の塩基配列に対する上記(16)に記載のアンチ
センス・ヌクレオチド配列。 (18)上記(16)または(17)に記載のアンチセンス・ヌクレ
オチド配列を有効成分として含有する遺伝子治療剤。 (19)下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋
白質、（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もし
くは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ
ノ酸配列からなり且つＧＡＳＣ１活性を有する蛋白質。 (20)被検物質を含む培地中で上記(1)に記載の遺伝子ま
たはその発現産物を培養する工程、および上記(1)に記
載の遺伝子またはその発現産物の量を測定する工程を含
む、上記発現産物と相互作用する物質（アゴニストおよ
び／またはアンタゴニスト）のスクリーニング方法。 (21)上記(1)に記載の遺伝子の相同物であって、ヒト、
イヌ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジおよびネコからなる群
から選ばれる哺乳動物の遺伝子相同物。 (22)上記(13)に記載の抗体またはその断片を有効成分と
する癌治療剤。

【００１１】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
塩基配列、核酸（ヌクレオチド）などの略号による表示
は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ
酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」
（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うも
のとする。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明者らは、９ｐ２３−２４増
幅領域内にその存在が推定される腫瘍関連遺伝子を探究
するために、ＣＧＨ(Comparative genomic hybridizati
on:比較ゲノムハイブリダイゼーション)によって、２９
の食道扁平上皮癌細胞株を用いて研究した。その結果、
これら細胞株の染色体上に存在する新たな関連遺伝子の
探索についての研究結果として、本発明を完成するに至
った。

【００１３】即ち、２９の食道扁平上皮癌細胞株の染色
体９ｐ２３−２４の位置に、高頻度に増幅が起こってい
ることを、ＣＧＨによって確認した。この増幅領域は、
しばしば癌遺伝子および／または他の腫瘍関連遺伝子を
保持している。また、９ｐ２３−２４の増幅は、種々の
他の型の癌においても報告されている。

【００１４】これらのことから、本発明者らは９ｐ２３
−２４アンプリコン（増幅領域）の遺伝子地図を作製す
るために、ＹＡＣ（Yeast artificial chromosome）お
よびＰＡＣ（P1 artificial chromosome）をプローブと
して用いた蛍光in situハイブリダイゼーションとサザ
ンブロット分析を行った。

【００１５】また、本発明者らはノーザンブロット分析
によって、このアンプリコンの範囲内に存在する標的遺
伝子あるいは転写体をスクリーニングした。この方法に
よって、幾つかの食道扁平上皮癌細胞株において増幅お
よび過剰発現されている新規な遺伝子のクローニングに
成功し、かくして得られたクローンを「ＧＡＳＣ１」と
命名した。

【００１６】本発明のＧＡＳＣ１遺伝子は、外科的切除
した腫瘍から確立された食道扁平上皮癌細胞株(KYSEシ
リーズ)のＣＧＨによって、染色体９ｐ２３−２４の領
域において高いレベルの増幅が見られたものである。本
発明者らのノーザンブロットの結果によれば、ＩＭＡＧ
Ｅクローン１３１８６５（ＧＡＳＣ１の部分シークエン
スを含むｃＤＮＡクローン）のみが、９ｐ２３−２４上
で増幅を示した細胞株において、過剰発現を示した。

【００１７】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の配列は、胃癌細
胞株(HSC39)由来のＲＮＡから２つのｃＤＮＡライブラ
リーを構築し、ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５をプロ
ーブとして該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、陽性クローンを単離し、その塩基配列を決定するこ
とにより決定されたものである。

【００１８】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子は、配列番号：１
で示される１０５６アミノ酸をコードするオープンリー
ディングフレームを有する遺伝子として特定される。

【００１９】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子によりコードされ
るアミノ酸配列の計算された分子量は１２０．０ｋＤａ
である。

【００２０】従来の報告は、９ｐにおける遺伝的変化
が、食道扁平上皮癌を含む広い範囲のヒト癌において見
られている。食道扁平上皮癌の既に行われた分子遺伝的
研究の結果によれば、特に増殖中の細胞のＧ１／Ｓ移行
期を抑制的に調節するサイクリン依存性キナーゼ４／６
のインヒビターをコードするＭＴＳ１(p16/CDKN2A)を包
含している領域である９ｐ２１−２２が注目されていた
(Tanaka,H.,et al.,Int.J.Cancer, 70, 437-442 (199
7))。

【００２１】ＣＧＨ（Kallioniemi., et al., Science,
258, 818-821 (1992)）およびＦＩＳＨ(Inazawa, J.,
et al., Jpn. J. Cancer Res., 83, 1248-1252 (1992))
を用いる近年の研究は、９ｐ上に、特に９ｐ２３−２４
の位置で、ＤＮＡの増幅が、他の型の腫瘍と同じよう
に、食道扁平上皮癌にもしばしば起きていることを明ら
かにしている(Sonoda,G.,et al., Genes Chromosomes C
ancer,20, 320-328 (1997); Taguchi,T.,et al., Genes
Chromosomes Cancer, 20, 208-212 (1997); Giollant,
M.,et al.,Hum. Genet.,98, 265-270 (1996); Fischer,
U.,et al., Eur.J.Cancer, 30, 1124-1127 (1994); Sev
elyeva,L.,et al.,Cancer Res., 58, 863-866 (199
8))。

【００２２】上記９ｐ２３−２４の位置でのＤＮＡの増
幅およびそれに関連するであろう各種の報告には、例え
ば、以下の事項および文献の記載が包含される。

【００２３】ヒト卵巣癌のＣＧＨ分析は、９ｐ２１−ｐ
ｔｅｒがコピー数増加の起こりやすい部位の一つである
ことを明らかにし、９例のうちの１例が特異的に９ｐ２
４増幅を示し、そして更に、進行期の腫瘍でより高頻度
に生じる傾向が認められた(Sonoda,G.,et al., Genes C
hromosomes Cancer, 20, 320-328 (1997))。

【００２４】９ｐ２３−２４の増幅は、乳癌、肺癌、高
度の星状細胞腫および神経膠芽腫でも観察されている(T
aguchi,T.,et al.,Genes Chromosomes Cancer, 20, 208
-212(1997); Giollant,M.,et al.,Hum. Genet.,98, 265
-270 (1996); Fischer,U.,et al.,Eur.J.Cancer, 30, 1
124-1127 (1994); Sevelyeva,L.,et al.,Cancer Res.,5
8,863-866(1998))。

【００２５】乳癌細胞株のＣＯＬＯ８２４は、ｐ１６／
ＣＤＫＮ２Ａのさらに末端側にある９ｐ２３−２４で、
ＤＮＡコピー数は約１０倍の増加を示している(Sevelye
va,L.,et al.,Cancer Res., 58, 863-866 (1998))。加
えて、９ｐ２３−２４の重複とＢＲＣＡ２の変異が、乳
癌を持つ３人の兄弟で報告されている（Savelyeva, L.,
et al., Cancer Res., 58, 863-866 (1998)）。

【００２６】以上の報告等を総合すると、９ｐ２３−２
４は、複数の腫瘍型に関連しており、少なくとも一つの
腫瘍関連遺伝子を保持していることが示唆される。

【００２７】ＧＳＡＣ１は１つのＰＸドメインを、２つ
のＰＨＤフィンガーをもっている。該ＰＸドメインは多
種の蛋白において存在し、蛋白−蛋白間の相互作用に関
係しているかもしれないが、このモチーフの機能は、未
だよく特定されていない(Lock,P.,EMBO J., 17, 4346-
4357 (1998))。

【００２８】亜鉛フィンガー様配列の一つであるＰＨＤ
フィンガーは、ショウジョウバエ(Drosophila)のｔｒｌ
やｐｃｌ遺伝子産物のようなクロマチンによって介在さ
れた転写調節に関連した核蛋白において、広く見つけら
れている(Aasland,R.,et al.,Trends. Biochem.Sci.,2
0, 56-59 (1995))。転写のコアクチベーターＴＩＦ１(T
rnscriptional intermediary factor 1)、クロマチン関
連アセチラーゼＭＯＺ(monocytic leukemia zinc-fnger
protein)および皮膚筋炎特異的自己抗原Ｍｉ２を含む
幾つかのＰＨＤフィンガーを持つ蛋白が、近年同定され
ている(Venturini,L.,et al., 18, 1209-1217 (1999);
Borrow,J.,et al., Nat. Gene.,14, 33-41(1996); Zhan
g,Y.,Cell, 95, 279-289 (1998))。

【００２９】ＴＩＦ１ファミリー蛋白(α、β、γ)は、
細胞の分化、腫瘍形成、シグナル伝達において重要な役
割を演ずると思われる(Venturini,L., et al., 18, 120
9-1217 (1999))。一方、Ｍｉ２は、ヒストン脱アセチル
化活性およびヌクレオソーム再構築活性を保有する複合
物中に見出されており、クロマチンの再編成に関連して
いる。Ｍｉ２におけるＰＨＤフィンガーは、ヒストン脱
アセチル化酵素と直接の相互作用のために要求されてい
ると思われる(Zhang,Y., Cell, 95, 279-289 (1998))。

【００３０】ＰＨＤモチーフは、幾つかの癌原遺伝子に
おいても保持されている。ｔｒｘのヒト相同物であるＨ
ＲＸ／ＡＬＬ１／ＭＬＬ(HRX:human trithorax; ALL: a
cutelymphoblastic leukemia; MLL: mixed lineage leu
kemia)は、子供の急性リンパ球性白血病において、しば
しば変異がみられる(Tkachuk,D.C., et al., Cell,71,
691-700 (1992))。

【００３１】さらにｔｒｘの別のヒト相同物であるＭＬ
Ｌ２の増幅は、種々の固形組織由来の細胞株において観
察されている(Huntsman,D.G., et al., Oncogene, 18,
7975-7984 (1999))。

【００３２】ＰＬＵ−１の発現は、乳癌においては恒常
的に認められるが、その発現は正常組織においては高度
に限定されている(Lu,P., et al., J. Biol.Chem., 27
4, 15633-15645 (1999))。

【００３３】ＡＩＲＥ遺伝子のＰＨＤフィンガー内の変
異が、ＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多内分泌症−カンジダ
症−外胚葉形成不全）のような自己免疫疾患を有する患
者からのＤＮＡにおいて発見されている(The Finnish-G
erman APECED Consortium. Nat. Genet., 17, 399-403
(1997))。

【００３４】ＭＯＺ遺伝子は、急性骨髄性白血病の一例
のケースにおいてＣＢＰ遺伝子[t(8;16)(p11;p14)]と融
合していることが見い出され（Borrow, J., et al., Na
t. Genet., 14, 33-41 (1996)）、そしてＲＥＴレセプ
ター・チロシン・キナーゼ遺伝子とＴｉｆ１の融合が小
児の乳頭状甲状腺癌のケースにおいて報告されている(K
lugbauer,S.,Rabes,H.M.,Oncogene, 18, 4388-4393 (19
99))。

【００３５】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子がコードするアミ
ノ酸配列は、２つのＰＨＤフィンガー・モチーフを持っ
ており、上記のようにＰＨＤフィンガー・モチーフは、
クロマチン介在性の転写領域において関連する核蛋白お
よび多数の癌原遺伝子において見出されることから、過
剰発現したＧＡＳＣ１は、食道扁平上皮癌を含む種々の
型の癌の発生および／または進展において重要な役割を
演ずる可能性がある。

【００３６】上記のとおり、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の
推定産物の基本構造は、２つのＰＨＤフィンガー・モチ
ーフと一つのＰＸドメインを含んでいる。

【００３７】前述したとおり、ＰＨＤモチーフは、多く
の癌原遺伝子において見出されること、食道扁平上皮癌
で９ｐ２３−２４領域の増幅がしばしば起きているこ
と、特に該９ｐ２３−２４領域の増幅は、進行期の腫瘍
に最も一般的な傾向があること、更に９ｐ２３−２４領
域の増幅は、乳癌、肺癌、進行した星状細胞腫および神
経膠芽腫でも観察されていることから、本発明ＧＡＳＣ
１遺伝子は、複数の腫瘍の発生、進展に重要な役割を演
じていると考えられる。

【００３８】故に、後述するように、ＧＡＳＣ１は、食
道癌などの扁平上皮癌に関して、癌遺伝子に属するもの
であると考えられる。

【００３９】本発明遺伝子の提供によれば、該遺伝子が
各細胞での細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を
調節する作用を有することに基づいて、これら作用に関
与する疾患、例えば悪性腫瘍などの病態解明や診断、治
療などが可能である。

【００４０】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の全部または一部
は、これらを利用する発現産物に結合する抗体またはそ
の断片の製造、並びにこれらを用いる診断に利用するこ
とができる。

【００４１】更に本発明遺伝子の提供によれば、遺伝子
配列のアンチセンス断片、これらの発現産物の利用によ
って、上記疾患の形成を抑制することもできる。

【００４２】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子の全部または一部
は、またプローブとして利用でき、該利用により、癌の
診断並びに診断用キットの作成が可能である。さらに腫
瘍においてＧＡＳＣ１遺伝子の遺伝子増幅・発現亢進
は、癌の診断ばかりでなく、癌の悪性度の判定にも利用
可能である。

【００４３】本発明ＧＡＳＣ１遺伝子またはその発現産
物は、またＧＡＳＣ１蛋白相互作用物のスクリーニング
にも利用することができる。

【００４４】尚、本発明によって提供されるＧＡＳＣ１
遺伝子の一例は、ヒト癌細胞起源のものであり、その利
用によれば、ヒトを含む各種哺乳動物の相同遺伝子も提
供できる。また、本発明遺伝子の利用によれば、本発明
遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のＣ末端側と結
合する遺伝子の同定を行うこともできる。

【００４５】以下、本発明遺伝子（ＤＮＡ分子)につき
詳述する。

【００４６】なお、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）と
は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖
およびアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する
趣旨であり、その長さに何ら制限されるものではない。
従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しな
い限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）並びに該センス
鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス
鎖）およびそれらの断片のいずれもが含まれる。

【００４７】本発明遺伝子の一具体例としては、後述す
る実施例に示されるクローンの有するＤＮＡ配列から演
繹されるものを挙げることができる。

【００４８】このクローンが有する遺伝子は、配列番
号：１に示される１０５６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードする３１６８ヌクレオチドのオープンリーディ
ングフレーム（配列番号：２に示される塩基配列）を有
する。陽性クローンからｃＤＮＡ配列の一方向配列から
上記３１６８ヌクレオチドの単一のオープン・リーディ
ング・フレームを含む４２３５ヌクレオチドの転写体を
確認した。転写の開始(「コザックのルール」)のための
コンセンサス配列がよく保存されていることから、転写
のための開始コドンは、ヌクレオチド番号の１４６−１
４８番目であると確認された。

【００４９】なお、全長ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番
号：３に示すとおり４２３５ヌクレオチドである。

【００５０】推定された遺伝子産物は、Ｃ末端側に２つ
のＰＨＤフィンガー・モチーフ(687-749残基および807-
867残基)と、１つのＰＸドメイン(950-1047残基)を含ん
でいる。

【００５１】本発明遺伝子には、上記配列番号：１に示
されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配
列を有するものが包含され、また当該遺伝子の相同物も
包含される。

【００５２】ここで「相同物」とは、本発明遺伝子（ま
たはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的
特徴、遺伝子発現パターンにおける共通性および上記し
たようなその生物学的機能の類似性により、ひとつの遺
伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味す
る。これにはＧＡＳＣ１遺伝子のアレル体（対立遺伝
子）も当然含まれる。

【００５３】上記相同物の具体例としては、配列番号：
１で示される特定のアミノ酸配列において、一定の改変
を有する蛋白質であって且つ該特定のアミノ酸配列を有
するＧＡＳＣ１蛋白質と同様の活性を有する蛋白質をコ
ードする遺伝子を挙げることができる。

【００５４】上記アミノ酸配列における相同性は、ＦＡ
ＳＴＡ或いはＢＬＡＳＴプログラムを使用した検索（Cl
ustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))に
おいて、通常、アミノ酸配列の全体で約４５％以上、好
ましくは約５０％以上であることができる。

【００５５】また、上記相同性は、ＰＸドメインおよび
／またはＰＨＤフィンガー・モチーフ領域におけるそれ
が約３５％以上、好ましくは約４５％以上のいずれか少
なくとも一つを満たしていることが望ましい。

【００５６】即ち、本発明遺伝子には、配列番号：１に
示されるアミノ酸配列において１または数個乃至複数の
アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ分子も
また包含される。

【００５７】ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付
加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白
質が、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋
白質（ＧＡＳＣ１蛋白）と同様の機能を有する同効物で
あれば特に制限されない。本発明において「ＧＡＳＣ１
活性」とは配列番号：１で示されるアミノ酸配列からな
る蛋白質が有する活性並びに機能を意味し、具体的に
は、各細胞での細胞の増殖、分化、腫瘍形成、転写活性
化を調節する作用を指す。

【００５８】上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、
天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などによ
り生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発
明のヒトＧＡＳＣ１またはヒトＧＡＳＣ１遺伝子）に基
づいて人為的に改変することもできる。本発明は、この
ような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記
特性を有する全ての改変アミノ酸配列をコードする遺伝
子（改変遺伝子）を包含する。

【００５９】上記の人為的手段としては、例えばサイト
スペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzym
ology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (198
3)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学
実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105
(1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステ
ル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am.
Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同91, 3350 (1969)；Sc
ience, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859
(1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方
法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成
は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による
化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴ
ヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断
片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニ
ーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共に
ＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによっ
て、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。

【００６０】本発明遺伝子の具体的態様としては、配列
番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示でき
る。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号：
１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコド
ンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、
かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミ
ノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基
配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法
に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻
度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res.,
9, 43 (1981)〕。

【００６１】また、本発明ＤＮＡ分子は、前記のとお
り、配列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を
有する塩基配列からなるものも包含する。

【００６２】上記相同性とは、配列番号：１で示される
アミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドまたは配列番号：２に示される塩基配列
と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９
０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一
性、更に最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有
することをいう。

【００６３】かかる相同性遺伝子には、例えば、０．１
％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％
ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな
条件下で配列番号：２に示される塩基配列中、２３８−
６３９の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする
塩基配列を有する遺伝子が包含される。

【００６４】本発明遺伝子は、本発明により開示された
本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、
一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得するこ
とができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring H
arbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子
研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参
照〕。

【００６５】具体的には、本発明遺伝子が発現される適
当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調
製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当
なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択すること
により実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 7
8, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。

【００６６】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに
由来する培養細胞などが例示される。また、これらから
の全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの
取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実
施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市
販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライ
ブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.In
c.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー
などを用いることもできる。

【００６７】本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーか
らスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の
方法に従うことができる。

【００６８】具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生
される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した
免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローン
を選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合する
プローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コ
ロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せな
どを例示できる。

【００６９】ここで用いられるプローブとしては、本発
明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合
成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得
された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。ま
た、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセン
ス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリー
ニング用プローブとして用いることもできる。

【００７０】前記プローブとして用いられるヌクレオチ
ド配列は、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチド配
列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好まし
くは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連
続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有
するものが含まれる。前記配列番号：２の配列を有する
陽性クローンそれ自体もまたかかるプローブとして用い
ることができる。

【００７１】本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法
〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ
増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全
長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法
〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12
(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohma
n, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998
(1988)〕などの採用が好適である。

【００７２】かかるＰＣＲ法の採用に際して使用される
プライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の
遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法
に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断
片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例
えばゲル電気泳動法などによればよい。

【００７３】また、上記で得られる本発明遺伝子或いは
各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサ
ム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499
(1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエン
スキットなどを用いて、その塩基配列を決定することが
できる。

【００７４】このようにして得られる本発明の遺伝子に
よれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を
利用することにより、個体もしくは各種組織における本
発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができ
る。

【００７５】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 2
1-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティ
ング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
b. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Re
s., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイ
ゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳ
ＢＡ法〔Nucleicacid sequence-based amplification,
Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法
を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる
検出法を挙げることができる。

【００７６】尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用い
られるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的
に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限
はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定する
ことができる。通常プライマーとして１０〜３５程度の
ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度
の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを
挙げることができる。

【００７７】このように、本発明の遺伝子には、本発明
にかかるＧＡＳＣ１遺伝子を検出するための特異プライ
マーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮ
Ａ断片もまた包含される。

【００７８】当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示され
る塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規
定することできる。ここで、ストリンジェントな条件と
しては、プライマーまたはプローブとして用いられる通
常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、
例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×
ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×
ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。

【００７９】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子工学的手法により、該遺伝子の発現産物（ＧＡＳＣ１
蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定し
て製造することができる。

【００８０】従って本発明は、本発明遺伝子によってコ
ードされる蛋白質を始め、該蛋白質の製造のための、例
えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによ
って形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して上
記本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するもので
ある。

【００８１】本発明蛋白質の具体的態様としては、配列
番号：１に示すアミノ酸配列を有するＧＡＳＣ１蛋白質
を挙げることができる。本発明蛋白質には、該ＧＡＳＣ
１蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同
物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、
置換または付加されたアミノ酸配列を有し且つ前記ＧＡ
ＳＣ１活性を有する蛋白質を挙げることができる。具体
的には、前記ＧＡＳＣ１遺伝子の相同物（アレル体を含
むＧＡＳＣ１同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることが
できる。

【００８２】また、本発明ＧＡＳＣ１蛋白質の相同物に
は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のＧＡＳＣ１
蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウ
マ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、
ウサギなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含される。

【００８３】本発明蛋白質は、本発明により提供される
ＧＡＳＣ１遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子
組換え技術〔例えばScience, 224, 1431 (1984) ; Bioc
hem.Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA., 80,5990 (1983)など参照〕に従
って調製することができる。

【００８４】該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望
の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組
換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞
に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで
得られる培養物から回収することにより行われる。

【００８５】上記宿主細胞としては、原核生物および真
核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の
宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いら
れるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含ま
れるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞に
は、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、
例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1
981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびその
ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad.
Sci., USA., 77:4216 (1980)〕などが、後者としては、
サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿
論、これらに限定される訳ではない。

【００８６】原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主
細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガー
ノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン
（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利
用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来の
プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵ
Ｃ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに
限定されず既知の各種のベクターを利用することができ
る。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクター
の市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham P
harmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ
２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２
１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（In
vitrogen社）等を例示できる。

【００８７】脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有する
ものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的に
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例
示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用
いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用さ
れるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦ
Ｐ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（I
nvitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitroge
n社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ
ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMi
ngen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈ
ｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen
社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。

【００８８】また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベ
クターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺
伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示で
きる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰ
ＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen
社）なとが包含される。

【００８９】プロモーターとしても特に限定なく、エッ
シェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトフ
ァン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを
好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合
は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモ
ーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモ
ーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモ
ーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適
に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ま
しいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメ
ガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを
例示できる。

【００９０】尚、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき
る。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現
させるためのｐＧＥＸ（Promega社）などを例示でき
る。

【００９１】所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿
主細胞への導入法およびこれによる形質転換法として
は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用すること
ができる。

【００９２】また得られる形質転換体は、常法に従い培
養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によ
りコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細
胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分
泌）される。

【００９３】該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００９４】かくして得られる本発明の組換え蛋白質
は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利
用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (198
6); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕に
より分離、精製できる。

【００９５】該方法としては、具体的には、通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本
発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを
利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示す
ることができる。

【００９６】尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝
子の設計に際しては、配列番号：２に示されるＧＡＳＣ
１遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該
遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを
適宜選択変更して利用することも可能である。また、Ｇ
ＡＳＣ１遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、
その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、
欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイト
スペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種
方法により行うことができる。

【００９７】本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示
すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製
造することができる。該方法には、通常の液相法および
固相法によるペプチド合成法が包含される。

【００９８】かかるペプチド合成法は、より詳しくは、
アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐
次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエ
ロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメン
トを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング
反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包
含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよ
い。

【００９９】上記ペプチド合成に採用される縮合法も、
常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水
物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰ
Ａ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物
（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法
などを例示できる。

【０１００】これら各方法に利用できる溶媒も、この種
ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている
一般的なものから適宜選択することができる。その例と
しては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミ
ド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸
エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることが
できる。

【０１０１】尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応
に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシ
ル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエス
テル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低
級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メ
トキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル
などのアラルキルエステルなどとして保護することがで
きる。

【０１０２】また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例
えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル
基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基など
で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要
はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基
は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホ
ニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダ
マンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により
保護することができる。

【０１０３】上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドお
よび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護
基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還
元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭
化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メ
タンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施する
ことができる。

【０１０４】かくして得られる本発明蛋白質は、前記し
た各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグ
ラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などの
ペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精
製を行うことができる。

【０１０５】本発明ＧＡＳＣ１蛋白質およびそのフラグ
メントは、これらに対する特異抗体を作成するための免
疫抗原としても好適に利用でき、これらの抗原を利用す
ることにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）お
よびモノクローナル抗体を取得することができる。

【０１０６】該抗体の製造法自体は、当業者によく理解
されているところであり、本発明においてもこれら常法
に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫
生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。

【０１０７】かくして得られる抗体は、例えばＧＡＳＣ
１蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないし
は識別などに有利に利用することができる。より具体的
には、本発明遺伝子の増幅および発現亢進が癌細胞にお
いて確認されていることから、該抗体を用いて癌の診断
または、癌の悪性度の判定に利用することができる。更
に、ＧＡＳＣ１に結合する抗体を有効成分とする癌の治
療剤として利用することができる。

【０１０８】従って、本発明蛋白質に結合する抗体は、
これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有
用である。従って、本発明は本発明蛋白質を有効成分と
する医薬組成物をも提供するものである。

【０１０９】該医薬組成物において有効成分とする蛋白
質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。
かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、
例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、
マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性ア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩な
どが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当
な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も
包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩
酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸
塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリ
ン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−
トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マ
レイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スル
ホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビ
ン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートなど
が例示される。

【０１１０】上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成
分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体
ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。

【０１１１】上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる
医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用さ
れる、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示で
き、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜
選択使用される。

【０１１２】特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋
白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化
剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整
剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。

【０１１３】上記安定化剤としては、例えばヒト血清ア
ルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導
体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤な
どと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有
効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。

【０１１４】上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はな
く例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのい
ずれでもよい。

【０１１５】上記糖としても特に限定はなく、例えばグ
ルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖
類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの
糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖
類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コン
ドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよび
それらの誘導体などを使用できる。

【０１１６】界面活性剤としても特に限定はなく、イオ
ン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、
例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル
系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリ
ド系などを使用できる。

【０１１７】セルロース誘導体としても特に限定はな
く、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ
エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウムなどを使用できる。

【０１１８】上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り
約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜
１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤
の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ
程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程
度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの
添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度
以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲
とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当
り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。
また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当
り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０
０１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。

【０１１９】本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量
は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００
１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程
度の範囲とするのが適当である。

【０１２０】また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、
例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加する
ことができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン
酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミ
ン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれら
のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）な
どを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示でき
る。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウ
ム、クエン酸などを例示できる。

【０１２１】本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用で
きる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした
後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解
して適当な濃度に調製した後に使用することも可能であ
る。

【０１２２】本発明の医薬製剤の投与単位形態として
は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表
的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒
剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、
乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含ま
れ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、
経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類さ
れ、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製す
ることができる。

【０１２３】例えば、錠剤の形態に成形するに際して
は、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリ
ウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カ
オリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなど
の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロッ
プ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキ
シメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合
剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキ
シメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプ
ロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウ
ム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、
炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ス
テアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ス
テアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制
剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム
などの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸
塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤な
どを使用できる。

【０１２４】更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した
錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィ
ルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ない
しは多層錠とすることもできる。

【０１２５】丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、
硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビア
ゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結
合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用で
きる。

【０１２６】カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有
効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質
ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整さ
れる。

【０１２７】経口投与用液体投与形態は、慣用される不
活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶
液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなど
を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ま
せることができ、これらは常法に従い調製される。

【０１２８】非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌
水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調
製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イ
ソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを
使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレ
イン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の
溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存
剤、分散剤などを添加することもできる。

【０１２９】滅菌は、例えばバクテリア保留フィルター
を通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および
加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直
前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのでき
る滅菌固体組成物形態に調製することもできる。

【０１３０】坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際
しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコー
ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエス
テル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用
できる。

【０１３１】ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の
形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色
ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導
体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油
などを使用できる。

【０１３２】経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標
準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。

【０１３３】尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品な
どを含有させることもできる。

【０１３４】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、
液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投
与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸など
の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応
じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、
坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤
は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は
経皮的に局所投与される。

【０１３５】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的に
は、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約
０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ
〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１回また
は数回に分けて投与することができる。

【０１３６】また、本発明は、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子
の発現する細胞において、細胞内のｍＲＮＡに対して相
補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ＧＡ
ＳＣ１遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬
の提供による癌の遺伝子治療法を提供する。該治療法
は、例えばＧＡＳＣ１遺伝子を有する癌細胞本来のｍＲ
ＮＡと結合させるか、或いはＤＮＡ二重螺旋の間に入り
込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳
の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発
現を抑制する方法である。この方法は従って遺伝子のｍ
ＲＮＡと相補的なアンチセンス・ヌクレオチドを製造
し、該アンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に供給す
る方法としてとらえることができる。

【０１３７】かかるＧＡＳＣ１遺伝子の発現機能を抑制
する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞における新
生物の増殖を抑制することができる。当該アンチセンス
・ヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを
用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することが
できる。

【０１３８】上記アンチセンス・ヌクレオチドを用いた
癌遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイル
ス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・ヌクレオ
チドを組み込み、これを癌細胞に感染させてアンチセン
ス・ヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の
抗腫瘍効果を得ることができる。

【０１３９】このようにＧＡＳＣ１遺伝子を有する細胞
にアンチセンス・ヌクレオチドを導入してＧＡＳＣ１蛋
白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・ヌクレ
オチドは対応するＧＡＳＣ１遺伝子の全長に対応するも
のである必要はなく、例えば該ＧＡＳＣ１遺伝子の発現
機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限
りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機
能を保持した一部配列からなる遺伝子であってもよい。

【０１４０】かかる組換えおよび染色体外維持の双方の
ための、所望遺伝子を導入すべきベクターは、当該分野
において既に知られており、本発明ではかかる既知のベ
クターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレ
メントに連結したＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌ
クレオチドのコピーを含み且つ目的の細胞内で当該アン
チセンス・ヌクレオチド産物を発現できるウイルスベク
ターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。
かかるベクターとしては、通常前述した発現用ベクター
を利用することもでき、好適には、例えば起源ベクター
として、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣ
Ｔ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示された
ベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、
ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬ
など）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを
用いて調製されたベクターを用いることもできる。より
好ましいベクターとしては、後述する各種ウイルス・ベ
クターを挙げることができる。

【０１４１】なお、遺伝子導入治療において用いられる
ベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患
の治療対象となる患部組織に固有のものを好適なものと
して例示することができる。

【０１４２】その具体例としては、例えば、肝臓に対し
ては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アン
チトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンな
どを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒド
ラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示でき
る。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマ
ターゼ、サイトチトクロームＰ４５０、コレステロール
側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ
４５０などを例示できる。

【０１４３】前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１
−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを
例示できる。***に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−
Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質
などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウロ
グロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１
４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンな
どを例示できる。

【０１４４】脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、
成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白
質、チロシンヒドロキシラーゼ等を例示できる。膵臓に
対しては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島ア
ミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対し
ては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示でき
る。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシ
ン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓
に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォ
ターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、ア
ミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。

【０１４５】なおアンチセンス・ヌクレオチド導入用ベ
クターの製造において、導入されるアンチセンス・ヌク
レオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子配列に対応する相補配列全
部または一部）は、本発明のＧＡＳＣ１遺伝子の塩基配
列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手
法により容易に製造・取得することができる。

【０１４６】かかるアンチセンス・ヌクレオチド導入用
ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーシ
ョン、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入など
を始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野におい
て既に知られている各種の方法に従って行うことができ
る。なお、ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオ
チドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態で癌の
抑制ないしは癌転移の抑制のための医薬や、治療研究の
ためのモデル系として利用することも可能である。

【０１４７】遺伝子治療においては、上記のアンチセン
ス・ヌクレオチド導入用ベクターは、患者の腫瘍部位に
局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の
腫瘍細胞内に導入することができる。この際全身的投与
によれば、他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも
到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標
的腫瘍細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合に
は、該投与を定期的に繰り返すことによって達成でき
る。

【０１４８】本発明の遺伝子治療方法は、前述したアン
チセンス・ヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・
ヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するイ
ンビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とす
る細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、
該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両者を
包含する。

【０１４９】またＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌ
クレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する
活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能であ
る。

【０１５０】後述する、本発明ＧＡＳＣ１遺伝子に対応
する配列のアンチセンス・ヌクレオチド全部もしくはそ
の断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクタ
ーによりＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチ
ドが導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治
療剤は、特に癌をその利用対象とするものであるが、上
記の遺伝子治療（処置）は、癌以外にも遺伝性疾患、Ａ
ＩＤＳのようなウイルス疾患の治療、並びに遺伝子標識
をも目的として行うことができる。

【０１５１】また、アンチセンス・ヌクレオチドを導入
する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜
選択することができる。例えば、標的細胞として、癌細
胞や腫瘍組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、
造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。

【０１５２】上記遺伝子治療におけるアンチセンス・ヌ
クレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非
ウイルス的導入方法が含まれる。

【０１５３】ウイルス的導入方法としては、例えば、Ｇ
ＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドが正常細
胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクター
としてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げるこ
とができる。その他のウイルスベクターとしては、アデ
ノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency
virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡ
Ｖ，adeno-associatedvirus）、ヘルペスウイルスベク
ター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよび
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr v
irus）ベクターなどがあげられる。

【０１５４】非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、
リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソーム
と予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイ
ルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と
直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソ
ーム法〔Kato,K.,et al., J. Biol. Chem., 266, 22071
-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして
高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方
法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87, 9568-
9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓
器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wol
ff,J.A.,et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)〕；
多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入
するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあ
ゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみ
に遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするため
に、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリ
ガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−
ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechno
l., 11, 202 (1993); Miller,et al.,FASEB J., 9, 190
(1995)〕などを使用することができる。

【０１５５】上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例え
ば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲ
ットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法
〔Wu, et al.,J.Biol.Chem., 266, 14338 (1991); Ferk
ol,et al.,FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕や、腫瘍
細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプター
を標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる
方法〔Wagner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA.,
87, 3410 (1990)〕などが含まれる。

【０１５６】また本発明で用いられる遺伝子導入法は、
上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入
法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる
方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡを
アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン
抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれ
ば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合
し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させる
ことにより本発明アンチセンス・ヌクレオチドの導入を
行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカ
ップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結
合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。ま
た、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボに
て遺伝子導入を媒介できる。

【０１５７】以下、具体的な本発明のアンチセンス・ヌ
クレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的
細胞または標的組織へのアンチセンス・ヌクレオチド導
入法について述べる。

【０１５８】レトロウイルスベクター・システムは、ウ
イルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）
からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイル
スの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白
質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）な
どの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成
していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パ
ッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeat
s)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏ
ｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケー
ジングシグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタ
グとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクロ
ーニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・
ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子に対応する全アンチセ
ンス・ヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子
の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得
るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージング
シグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、
ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要で
ある。

【０１５９】所望のＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・
ヌクレオチドを組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細
胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っている
ウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッ
ケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組
換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染
した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ
が細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチ
センス遺伝子が発現する。

【０１６０】尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法
として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリ
ン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法
〔Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat., 23, 747 (1995)〕
を採用することもできる。

【０１６１】なお、上記レトロウイルスベクター・シス
テムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウ
スの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLa
chlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec.
Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができ
る。

【０１６２】アデノウイルスベクターを利用する方法に
つき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、
バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Imm
unol., 158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguch
i,Y.,et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、鐘カ江
裕美ら〔実験医学, 12, 28-34 (1994)〕およびケナーら
〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91, 6
186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。

【０１６３】例えば、非増殖性アデノウイルスベクター
を作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ
１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目
的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入ア
ンチセンス・ヌクレオチド、即ち本発明ＧＡＳＣ１遺伝
子のアンチセンス・ヌクレオチド、そのアンチセンス・
ヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写され
た遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびア
デノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベク
ターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、
例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。
この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単
位とＥ１とを置換することにより、所望のＧＡＳＣ１遺
伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを包含する本発明遺
伝子治療用ベクターである非増殖性アデノウイルスベク
ターを作成することができる。また、コスミドベクター
にアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白
質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成する
こともできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作
成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。

【０１６４】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの
製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養
系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。こ
れには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず
宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘ
ルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存
在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の
細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲ
ノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからな
り、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal
repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在してい
る。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマー
の役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや
宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必
須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの
左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調
節蛋白質のＲｅｐをコードしている。

【０１６５】組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、か
くして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この
方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の
両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセン
ス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１ アンチセンス・ヌクレ
オチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラス
ミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子
の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパー
プラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の
塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野
生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その
後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランス
フェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスと
してアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖
型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の
組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶ
は核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混
入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。
更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により
組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の
遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。

【０１６６】ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの
方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工
学, 14(3), 280-287 (1995)〕。

【０１６７】本発明のアンチセンス・ヌクレオチド導入
用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイル
ス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタ
イン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫
由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイ
ルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology,
2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-192
0〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性が
あるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、この
トランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなけれ
ばならない。これは次の如くして実施できる。

【０１６８】即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む
標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そ
こに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込
み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当
な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベ
クターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクト
する。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面
免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生
型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ
陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選
択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組
換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ること
ができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞に
ウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の
組換えウイルスベクターを産生することができる。

【０１６９】組換えウイルスベクターを用いることなく
所望のアンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に導入す
る、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソ
ームによる遺伝子導入法により実施することができる。
これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞
膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内
容物を直接細胞内に導入する方法である。

【０１７０】上記膜融合リポソームによるアンチセンス
・ヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって
行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Re
s., 159, 399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene
introduction into animal tissues.In Trends and Fut
ure Perspectives in Peptide and Protein Drug Deliv
ery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic P
ublishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。

【０１７１】以下、該膜融合リポソームによるアンチセ
ンス・ヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫
外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望の
アンチセンス・ヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子
物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この
膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、
外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑
似ウイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖
密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組
織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。
次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入
され、所望のアンチセンス・ヌクレオチドを標的細胞に
導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質と
しては、５０％(モル比）コレステロールとレシチンお
よび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１
枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。

【０１７２】また、別のリポソームを用いてアンチセン
ス・ヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、
カチオニック・リポソームによるアンチセンス・ヌクレ
オチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木ら
の方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C.,
196, 1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも
細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜
の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミド
の取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようと
するものである。ここで用いられるリポソームは正荷電
を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar la
rge vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜
リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や
小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicle
s: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製
し、所望のアンチセンス・ヌクレオチドを導入すること
も可能である。

【０１７３】プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製
法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-
(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate
chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholin
e）およびＤＯＰＥ（dioleoylphosphatidylethanolamin
e）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホル
ム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総
量１μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリ
ーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄
膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去
し、乾燥させる。次いで２０μgの遺伝子導入用プラス
ミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩
液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間
ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセ
ンス・ヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニ
ックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。

【０１７４】上記で得られたプラスミド包埋カチオニッ
クＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、
例えば発現目的アンチセンス・ヌクレオチドを組み込ん
だ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量
として０．６μg、リポソーム脂質量として３０nmolに
なるように包埋し、これを２μlのリン酸緩衝生理食塩
液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組
織に対して隔日投与する方法が例示できる。

【０１７５】ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を
目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒト
の体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義さ
れている。しかしながら、本発明における遺伝子治療と
は、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞
にＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチドを癌
抑制アンチセンスＤＮＡとして導入することによって、
癌を始めとする各種疾患の治療のみならず、更に標識と
なる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒ
ト体内に導入することも含むものとする。

【０１７６】本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子
の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的に
は２種類の方法が含まれる。

【０１７７】その第１法は、治療対象とする患者から標
的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロ
イキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロ
ウイルスベクターに含まれる目的とするＧＡＳＣ１遺伝
子のアンチセンス・ヌクレオチドを導入した後、得られ
る細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法は
ＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝
子病や癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適である。

【０１７８】第２法は、目的アンチセンス・ヌクレオチ
ド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）
を直接患者の体内や腫瘍組織などの標的部位に注入する
遺伝子直接導入法(直接法)である。

【０１７９】上記遺伝子治療の第１法は、より詳しく
は、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から
採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取
し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地など
の適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチ
センス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセン
ス・ヌクレオチド）を含有するベクターを加える。アン
チセンス・ヌクレオチドの導入効率をあげるために、プ
ロタミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠
心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時
間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更に
ＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養
し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、ア
ンチセンス・ヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣ
Ｒや、例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の
程度を測定することにより、目的アンチセンス・ヌクレ
オチド導入効果を確認する。

【０１８０】また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイ
コプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの
安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測さ
れる効果用量のアンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ
１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）が導入された
培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例
えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝
子治療が施される。

【０１８１】ここでウイルスベクターの投与量は、導入
する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価
として、例えば標的細胞 １×１０⁸細胞に対して１×１
０³ｃｆｕから１×１０⁸ｃｆｕの範囲となる投与量を採
用することが好ましい。

【０１８２】上記第１法の別法として、目的アンチセン
ス・ヌクレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・
ヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含
有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養
して、目的とする細胞へアンチセンス・ヌクレオチド
（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）を
導入する方法を採用することもできる。

【０１８３】遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当
たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子
導入法によって、実際に目的アンチセンス・ヌクレオチ
ド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）
が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡの
ＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認す
るか、或いは目的アンチセンス・ヌクレオチド（ＧＡＳ
Ｃ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレオチド）の導入に基
づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞
の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。
また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロ
ウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活
性を測定するか、或は膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法で
モニターするなどにより、遺伝子治療に際してアンチセ
ンス・ヌクレオチド導入による安全性を確認することが
重要であることはいうまでもない。

【０１８４】本発明遺伝子治療法において、特に癌や悪
性腫瘍を対象とする場合は、患者から癌細胞を採取後、
酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレ
トロウイルスにて所望のアンチセンス・ヌクレオチドを
標的とする癌細胞に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリー
ニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo
測定)し、次いで放射線処理を施行し、患者腫瘍内また
は傍腫瘍に接種する癌治療法を一例として挙げることが
できる。

【０１８５】本発明はまた、本発明のアンチセンス・ヌ
クレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセンス・ヌ
クレオチド（ＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス・ヌクレ
オチド）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学
的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に
含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を
提供する。

【０１８６】本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用で
きる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使
用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例
示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて
適宜選択使用できる。

【０１８７】本発明医薬製剤の投与単位形態としては、
前記したＧＡＳＣ１蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙
げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜
選択することができる。

【０１８８】例えば、本発明のアンチセンス・ヌクレオ
チド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリ
ポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス
・ヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを
含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製
される。

【０１８９】これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ
７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合
した形態などに調製することもでき、またプロタミンな
どの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるよう
な形態に調製することもできる。

【０１９０】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。

【０１９１】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。

【０１９２】一般には、医薬製剤としての所望アンチセ
ンス・ヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与
量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルス
の力価として約１×１０³ｐｆｕから１×１０¹⁵ｐｆｕ
程度とするのがよい。

【０１９３】また所望の導入用アンチセンス・ヌクレオ
チドが導入された細胞の場合は、１×１０⁴細胞／body
から１×１０¹⁵細胞／body程度の範囲から選ばれるのが
適当である。

【０１９４】該製剤は１日に１回または数回に分けて投
与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与す
ることもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝
子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投
与することができる。

【０１９５】本発明に従う遺伝子治療を癌の治療に適用
する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせ
て行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子
治療に、従来の癌化学療法、放射線療法、免疫療法など
を組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治
療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参
考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advi
sory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (19
93)〕。

【０１９６】本発明によれば、細胞の腫瘍形成を促すＧ
ＡＳＣ１遺伝子の存在を検出するために、血液または血
清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽
出し、ＧＡＳＣ１の感受性遺伝子が存在する否かについ
て分析することが可能である。また、本発明によれば細
胞または組織における新生物、悪性の前駆障害への進
行、または予後指標としての存在を検出するためには、
障害を有する生物学的な試料を調製し、ＧＡＳＣ１の新
生物遺伝子が存在するか否かについて分析できる。この
方法を用いることにより細胞または組織における新生
物、悪性の前駆障害への進行、または予後指標としての
存在を検出することが可能となり、これらの診断、例え
ば癌の診断並びに癌治療効果の判定並びに予後の予測が
可能となる。

【０１９７】該検出方法は、例えば、予め腫瘍を有する
患者サンプルから得られたＧＡＳＣ１遺伝子に関する情
報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ＧＡＳＣ１遺伝子の
スクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるよ
うに設計される。より具体的には、例えばプラークハイ
ブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーショ
ン、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけ
るプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリ
メラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
より、増幅したＧＡＳＣ１の全部または一部のＤＮＡ断
片を得ることができるためのプローブとしての性質を有
するものを作成できる。そのためにはまずＧＡＳＣ１と
同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用
プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応
させることにより、当該ＧＡＳＣ１配列を有する遺伝子
の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配
列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消
化、電気泳動またはドットブロッティングで調製しても
よい。

【０１９８】前記スクリーニング方法としては、特にＰ
ＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、
ＧＡＳＣ１断片をプライマーとして用いる方法であれば
特に制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-
1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用され
るＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増
刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立
出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可
能である。

【０１９９】プライマーとして使用されるＤＮＡ断片
は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤ
ＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合
成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマ
シア社製)を使用して合成することができる。合成され
るプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプ
ライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好
ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプ
ローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識
であってもよく、直接的または間接的に標識したリガン
ドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標
識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、
本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレ
ーション、ランダム・プライミングまたはキナーゼ処理
のような、既知の方法によって取り込ませることができ
る放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵
素、抗体などがこれらの技術に包含される。

【０２００】検出のために用いるＰＣＲ法としては、例
えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いら
れる種々の変法を適応することができる。

【０２０１】また、本発明の測定方法は、試料中のＧＡ
ＳＣ１遺伝子の検出のための試薬キットを利用すること
によって、簡便に実施することができる。

【０２０２】故に本発明によれば上記ＧＡＳＣ１ ＤＮ
Ａ断片を含有することを特徴とするＧＡＳＣ１の検出用
試薬キットが提供される。

【０２０３】該試薬キットは、少なくとも配列番号：２
に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部
または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成
成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、Ｐ
ＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）
が含まれていてもよい。

【０２０４】標識剤としては、放射性同位元素または蛍
光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ
断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていても
よい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のた
めに適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反
応停止液などが含まれていてもよい。

【０２０５】更に本発明は、前記測定方法を用いる癌の
診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キッ
トをも提供するものである。

【０２０６】また、前記方法を用いることにより、被検
試料中から得られたＧＡＳＣ１配列を直接的若しくは間
接的に配列決定することにより、野生型ＧＡＳＣ１と相
同性の高い相同物である新たなＧＡＳＣ１遺伝子に関連
する関連遺伝子を見出すことができる。

【０２０７】従って、本発明はかかる測定と被検試料中
のＧＡＳＣ１ ＤＮＡの配列決定により、被検試料中の
ヒトＧＡＳＣ１遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリー
ニング方法をも提供するものである。

【０２０８】また、本発明の配列番号：１で示されるヒ
トＧＡＳＣ１遺伝子でコードされる蛋白質または該配列
番号：１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸
が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列またはこれ
らの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対す
る抗体を合成することによって、野生型ＧＡＳＣ１およ
び／または変異ＧＡＳＣ１の測定が可能となる。

【０２０９】従って、本発明は、野生型ＧＡＳＣ１およ
び／または変異ＧＡＳＣ１の抗体測定法、抗原測定法を
提供するものである。該測定法によって新生物状態の障
害の程度、或いは悪性腫瘍の悪性度を野生型ＧＡＳＣ１
ポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能であ
る。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によ
るＧＡＳＣ１配列分析によっても決定できるが、更に好
ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体)を用いて、ＧＡＳＣ１蛋白質中の相違、またはＧ
ＡＳＣ１蛋白質の有無を検出することができる。本発明
の測定法の具体的な例示としては、ＧＡＳＣ１抗体は、
血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶
液からＧＡＳＣ１蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリ
ルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロ
ット上でＧＡＳＣ１蛋白質と反応することができる。ま
た、ＧＡＳＣ１抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラ
フィンまたは凍結組織切片中のＧＡＳＣ１蛋白質を検出
することができる。抗体産生技術および精製する技術は
当該分野においてよく知られているので、これらの技術
を適宜選択することができる。

【０２１０】野生型ＧＡＳＣ１またはその突然変異体を
検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノ
クローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用
いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベント
アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免
疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)
が含まれる。

【０２１１】また、本発明は、ＧＡＳＣ１蛋白に対する
ＧＡＳＣ１結合活性を有する細胞膜画分または細胞表面
上に存在するＧＡＳＣ１レセプターをも提供することが
可能である。該ＧＡＳＣ１レセプターの取得は、細胞膜
画分を含む生体材料試料中において標識したＧＡＳＣ１
蛋白をコンジュゲートさせ、ＧＡＳＣ１結合反応物を抽
出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定するこ
とによって達成され、該ＧＡＳＣ１レセプター蛋白の取
得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成
できる。

【０２１２】また本発明は、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白
質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリ
ーニングする技術に用いることによって、化合物(ＧＡ
ＳＣ１レセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分
子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原または抗体な
ど言う)をスクリーニングすることに利用可能である。
好ましくは、ＧＡＳＣ１レセプターを利用する。かかる
スクリーニング試験に用いるＧＡＳＣ１レセプターポリ
ペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、
または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であって
もよい。

【０２１３】薬剤スクリーニングの一例としては、例え
ば、ＧＡＳＣ１蛋白質またはその断片を発現する組換え
蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核生物
の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて
利用することができる。また遊離のまたは固定した形態
のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもでき
る。より具体的には、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質また
はその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測
定し、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片とＧ
ＡＳＣ１蛋白質またはその断片との間の複合体の形成が
試験する物質によって阻害される程度を検出することに
よって化合物をスクリーニングすることが可能である。

【０２１４】かくして、本発明は、当該分野で既知の方
法によって、かかる物質とＧＡＳＣ１レセプター蛋白質
またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とＧＡＳ
Ｃ１レセプター蛋白質またはその断片との間の複合体の
存在またはＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片
とリガンドとの間の複合体の存在について測定すること
を特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供すること
ができる。さらに、ＧＡＳＣ１レセプター活性を測定し
て、かかる物質がＧＡＳＣ１レセプターを阻害でき、か
くして上記定義されたＧＡＳＣ１の活性、例えば細胞増
殖や分化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりす
ることで、結合蛋白の血中並びに組織中の濃度や移行を
調節したり、活性そのものを調節できるかどうか判断す
る。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的に
は、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断片を標識
する。遊離のＧＡＳＣ１レセプター蛋白質またはその断
片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離
し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験され
る因子のＧＡＳＣ１レセプターに対する結合またはＧＡ
ＳＣ１レセプター：ＧＡＳＣ１蛋白質結合の阻害の尺度
となる。ＧＡＳＣ１蛋白質の小さなペプチド(ペプチド
疑似体)をこのように分析し、ＧＡＳＣ１レセプター阻
害活性を有するものを測定できる。

【０２１５】本発明において、薬剤スクリーニングのた
めの他の方法は、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質に対して
適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニ
ング法であって、該略すると、多数の異なるペプチド試
験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面の
ごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合
物をＧＡＳＣ１レセプター蛋白質と反応させ、洗浄す
る。次いで既知の方法を用いて反応結合ＧＡＳＣ１レセ
プター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許
公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたＧＡ
ＳＣ１レセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング
技術で使用するプレート上に被覆することができる。し
かしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用い
て抗体を補足し、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質を固相上
に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤ス
クリーニングアッセイの使用をも目的とし、ＧＡＳＣ１
レセプター蛋白質またはその断片に対する結合性につ
き、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質に特異的に結合できる
中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競
合によって、ＧＡＳＣ１レセプター蛋白質の１またはそ
れ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在
をも検出することが可能である。

【０２１６】また、薬剤スクリーニングに関し、さらな
る方法としては、非機能性ＧＡＳＣ１遺伝子を含有する
宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細
胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間
増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化
合物が例えば、細胞増殖や分化を調節する蛋白質と結合
したり、解離したりすることで、結合蛋白の血中並びに
組織中の濃度や移行を調節したり、活性そのものを調節
できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段
として、ＧＡＳＣ１レセプターの生物活性を測定するこ
とも可能である。

【０２１７】また本発明によれば、より活性または安定
した形態のＧＡＳＣ１蛋白質誘導体または例えば、イン
・ビボ(in vivo)でＧＡＳＣ１蛋白質の機能を高めるか
もしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互
作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナ
ログ、例えばＧＡＳＣ１アゴニスト、ＧＡＳＣ１アンタ
ゴニスト、ＧＡＳＣ１インヒビターなどを作製すること
が可能である。前記構造アナログは例えばＧＡＳＣ１と
他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピ
ューター・モデリングまたはこれらの組み合わせた方法
によって決定することができる。また、構造アナログの
構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白
質のモデリングによって得ることも可能である。

【０２１８】また上記より活性または安定した形態のＧ
ＡＳＣ１蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラ
ニン・スキャンによって分析することが可能である。該
方法はアミノ酸残基をアラニンで置換し、ペプチドの活
性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミ
ノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安
定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によっ
て、より活性なまたは安定なＧＡＳＣ１誘導体を設計す
ることができる。

【０２１９】また機能性アッセイによって選択した標的
−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析する
ことも可能である。原則として、このアプローチによ
り、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmac
ore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗
−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学
的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプ
チドを同定したり単離したりすることが可能である。故
に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると
予測される。

【０２２０】かくして、改善されたＧＡＳＣ１活性もし
くは安定性またはＧＡＳＣ１活性のインヒビター、アゴ
ニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤
を設計・開発することができる。

【０２２１】クローン化ＧＡＳＣ１配列によって、十分
な量のＧＡＳＣ１蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学のよう
な分析研究をも行うことができる。さらに、本発明の配
列番号：１に示されるアミノ酸配列よりなるＧＡＳＣ１
蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるかまたはこれ
に加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能で
ある。

【０２２２】また本発明によれば、ＧＡＳＣ１遺伝子含
有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することに
よってＧＡＳＣ１遺伝子配列のどの部位が生体内で上記
したような多様なＧＡＳＣ１活性に影響を与えるかどう
か、即ちＧＡＳＣ１遺伝子産物、並びに改変ＧＡＳＣ１
遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認
することができる。

【０２２３】該方法は、遺伝子の相同組換えを利用し
て、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マ
ウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる
（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (198
9))。

【０２２４】尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野
の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術
(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土
社)に、本発明のヒト野生型ＧＡＳＣ１遺伝子および変
異ＧＡＳＣ１遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製
し得る。従って前記技術の適応により、改善されたＧＡ
ＳＣ１活性もしくは安定性またはＧＡＳＣ１活性のイン
ヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作
用を有する薬剤を設計・開発することができる。

【０２２５】

【発明の効果】本発明によれば、各細胞での細胞の増
殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用を有す
る新規なＧＡＳＣ１遺伝子が提供され、該作用に関与す
る疾患、例えば悪性腫瘍などの病態解明や診断、治療な
どが可能である。

【０２２６】本発明遺伝子がコードするアミノ酸配列の
ペプチドのＣ末端側には、公知の癌遺伝子がコードして
いる２つのＰＨＤフィンガー・モチーフおよび１つのＰ
Ｘドメインが存在しており、また本発明遺伝子が位置し
ている染色体９ｐ２３−２４の増幅は多くの癌において
観察されているため、本発明遺伝子乃至その関連遺伝子
の解析によれば、それらの機能と各種疾患との係わりに
ついての研究を実施でき、これら各種疾患の遺伝子診断
並びに該遺伝子の発現産物に対する抗体やアンチセンス
による医薬用途への応用研究が可能である。本発明遺伝
子の利用によれば、各種組織での該遺伝子の発現状況が
調べられ、生体内におけるその機能を解析することが可
能となる。

【０２２７】また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコー
ドする蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することがで
き、該蛋白質の提供によれば、ＧＡＳＣ１蛋白質活性や
ＧＡＳＣ１蛋白質の結合活性などの機能を調べることも
できる。

【０２２８】またＧＡＳＣ１蛋白質は、ＧＡＳＣ１遺伝
子およびその産物が関与する疾患（例えば、細胞の増
殖、分化、腫瘍形成、転写活性化を調節する作用に関連
する各種疾患など、特に癌）の病態解明や診断、治療な
どに有用である。

【０２２９】本発明によれば、更にＧＡＳＣ１遺伝子の
アンチセンス・ヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有
用な遺伝子導入用ベクター、該ＧＡＳＣ１遺伝子のアン
チセンス・ヌクレオチドを導入された細胞および該ベク
ターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びに
その利用による遺伝子治療法などが提供される。

【０２３０】本発明によれば、更に各種癌細胞の成長抑
制作用を有し、該作用による各種癌の疾患および病態の
処置などに使用されるＧＡＳＣ１遺伝子のアンチセンス
・ヌクレオチドまたはＧＡＳＣ１蛋白質に結合性を有す
る抗体を有効成分とする医薬も提供できる。

【０２３１】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。

【０２３２】

【実施例１】１．材料および方法 １）食道扁平上皮癌細胞株と***中期スライドの作成 試験に用いた２９の食道扁平上皮癌細胞株(KYSEシリー
ズ)は、外科的に切除した腫瘍から確立されたものであ
る(Shimada,Y.,et al., Cancer, 69, 277-284 (199
2))。これらの細胞株の全てのコピー数異常は、先に本
発明者らによって確認されている。***中期のクロモゾ
ーム・スライドは、シノミヤらの方法(Shinomiya,T.,et
al., Genes Chromosomes Cancer, 24, 337-344 (1999))
に順じて作製し、ＦＩＳＨ試験に用いた。 ２）プローブとしてＹＡＣとＰＡＣを使用するＦＩＳＨ
試験 ＹＡＣの所定領域内の位置は、ホワイトヘッド研究所/
ＭＩＴゲノム・センター(Whitehead Institute/MIT Gen
ome Center)(http://www-genome.Wi.Mit.Edu/)およびヒ
ト分子細胞遺伝学財団(Resources for Human Molecular
Cytogenetics)(http://bioserver.uniba.it/fish/rocc
hi/welcom.html)の情報から集めた。

【０２３３】ヒト９ｐ２３−２４領域をカバーする複数
のＹＡＣクローンを、セントレ・エツデ・ドゥ・ポリモ
ルフィズム・ヒューメイン（the Centre d'Etude du Po
lymorphisme Humain：ＣＥＰＨ)のＹＡＣライブラリー
から単離し、そのＦＩＳＨプローブを前記シノミヤらの
方法に順じて、Ａｌｕ配列を用いたＰＣＲにより調製し
た。

【０２３４】このＰＣＲは次の通り実施した。即ち、Ｙ
ＡＣ ＤＮＡ１μｇ（１μｌ）、配列番号：４に示す塩
基配列のプライマー２４８４（３０μＭ）１μｌ、配列
番号：５に示す塩基配列のプライマーＰＤＪ３４（１０
μＭ）１μｌ、１０×ＰＣＲバッファー（ExTaq buffe
r,タカラ社製）１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（タカ
ラ社製）５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ０．５μｌお
よび水８１．５μｌの計１００μｌを混合し、９５℃−
４分間（最初の変性処理１回）に続いて、９５℃−４
分、５５℃−１分及び７２℃−４分を１サイクルとして
計３０サイクル反応させ、最後に７２℃−７分（１回）
の処理を行なった。上記全反応は、パーキンエルマー社
製GeneAmp PCRシステム9700を用いて実施した。

【０２３５】９ｐ２４領域にマップされた既知遺伝子、
januaキナーゼ２(JAK2, GenBank Accession No.NM-0049
72)を含む一つのＰＡＣクローン（Peter Marynen博士よ
り供与を受けた）をプローブとして使用した。

【０２３６】上記プローブを、ビオチン１６−ｄＵＴＰ
またはジゴキシン１１−ｄＵＴＰ(ベーリンガー・マイ
ンハイム社製)を用い、ニックトランスレーションによ
って、標識した。染色体のハイブリダゼーション・シグ
ナルの蛍光検出は、前記シノミヤらの方法に順じて実施
した。

【０２３７】洗浄後、スライドは、ＣＣＤ(cooled char
ge-coupled device)カメラ(KAF1400;フォトメトリック
ス:Photometrics社製)を使用し、染色像と蛍光を同時に
イメージ化した。

【０２３８】ＤＮＡ配列のコピー数の相対的な変化を、
ＩＰラボ・スペクトラム・ソフトウェア(IP Lab Spectr
um Software:シグナル・アナリティクス・コーポレーシ
ョン社製:Signal Analytics Corp.)を用いて分析した。
必要な領域のコピー数は***中期および静止期の染色体
の両者において観察されたハイブリダゼーション・パタ
ーンに従い評価した。 蛍光比が１．５を超えたとき、
その染色体領域が高いレベルの増幅があると判定した。

【０２３９】その結果、本発明者らの先のＣＧＨ分析に
おいて９ｐ上におけるコピー数の増加が検討した２９の
食道扁平上皮癌細胞株のうち５つにおいて検出されてい
る(17.2%)。更に、高レベルの増幅が、それらのうちの
一つに現れていた。このＣＧＨの結果を基に、本発明者
らは、９ｐ２３−２４のアンプリコンの遺伝子地図を作
り出すために、プローブとして８つのＹＡＣおよび１つ
のＰＡＣを用いて、ＫＹＳＥ１５０においてＦＩＳＨ分
析を実施した。 ３）結果 その結果を図１にＡおよびＢとして示す。

【０２４０】図１中、Ａは本発明遺伝子を含む９ｐ２３
−２４領域の遺伝子地図であり、図中、"STSs(Genes/ES
Ts)"は、配列認識部位（遺伝子／発現配列タグ）を、"T
el"はテロメア側を、"Cen"はセントロメア側を、また"Y
ACs/PAC"はＦＩＳＨに用いられた各プローブをそれぞれ
示す。

【０２４１】図１Ａにおいて、染色体を示す線上には、
既知の遺伝子や括弧内に示した発現配列タグ（EST, Exp
ression Sequence Tag）で表わされる未知の転写体が示
されており、これらはサザンブロッティングにおいてプ
ローブとして使用された。

【０２４２】またＦＩＳＨに使用された複数のＹＡＣと
一つのＰＡＣが、水平横線の黒と中抜き横線によってそ
れぞれ染色体を示す線の下に記述されている。横線内の
丸印は、それぞれＹＡＣまたはＰＡＣ上のマーカーの定
着点を指し示している。尚、この図は模式的に示したも
のであり、ＹＡＣおよびＰＡＣのサイズおよびマーカー
の距離は実際のものを反映していない。

【０２４３】図１のＢは、サザンブロット分析によって
特定した５つの食道扁平上皮癌細胞株（図中、KYSE70、
KYSE450、KYSE890、KYSE1170およびKYSE150と表示す
る）の各々における９ｐ２３アンプリコンを模式的に示
す図である。図中、重複の最も小さい領域(SRO)は、サ
ザンブロット分析の結果と共にＦＩＳＨによって特定さ
れた。図中の記号は次のものを示す。

【０２４４】図２は、上記一つの食道扁平上皮癌細胞Ｋ
ＹＳＥ１５０におけるＦＩＳＨ分析の典型的な結果を示
す図面代用写真である。

【０２４５】該図は、上からＰＡＣＰＪ２Ｂ、ＹＡＣ７
９９Ｄ２およびＹＡＣ８３０Ｅ１クローンを用いてＦＩ
ＳＨ法を行なって得られた結果を示しており、各写真中
の蛍光の数がＤＮＡコピー数を表わしている。尚、写真
に示される略号ＰＪ２Ｂ、７９９Ｄ２および８３０Ｅ１
は、図１のＡに示されるそれと同じものを示す。

【０２４６】該図２より、ＹＡＣ７９９Ｄ２は、２つの
マーカー染色体上に均一領域(HSRs:Homogeneouslyh Sta
ining Regions)として強度のシグナルを産生することが
明らかであり、これは高度の増幅がＹＡＣ７９９Ｄ２の
含まれる領域で生じていることを示している。尚、図に
は示していないが、同様にして行なった８０７Ｂ４の場
合も、同じ結果が得られている。

【０２４７】上記ＹＡＣ７９９Ｄ２の両側に存在するＹ
ＡＣ９５３Ａ７、８７１Ｆ１、８５３Ｆ４および９３３
Ｆ６（図１のＡ参照）でのＦＩＳＨシグナルの数は、４
から９に及んでいたが、これらはＹＡＣ７９９Ｄ２や８
０７Ｂ４と比べるとはるかに少ないものであった。また
ＰＡＣ ＰＪ２ＢおよびＹＡＣ８３０Ｅ１のシグナル数
はわずか２から３であった。

【０２４８】９ｐ２３−２４で増幅の最も小さな共通領
域を特定するために、先のＣＧＨ分析において９ｐ上に
おいてコピー数の上昇が認められた他の4つの細胞株(KY
SE70、450、890および1170)でもＦＩＳＨ分析を実施し
た。

【０２４９】その結果、ＫＹＳＥ８９０および１１７０
では、ＹＡＣ７９９Ｄ２および８０７Ｂ４のハイブリダ
ゼーションシグナルは、小さなＨＳＲパターンとして検
出された。一方、ＫＹＳＥ７０および４５０では、シグ
ナルの数が、６から９程度であった。しかし、これらの
細胞株では、ＫＹＳＥ１５０において検出された増幅領
域より広い領域が増幅していたため、ＫＹＳＥ１５０で
決定されたアプリコンの大きさを狭めることはできなか
った。

【０２５０】このように、９ｐ２３−２４のアンプリコ
ンにおける所望の遺伝子は、ＹＡＣ７９９Ｄ２および８
０７Ｂ４によってカバーされた比較的狭い領域内にある
と思われた。 ２． サザンブロットおよびノーザンブロット分析 ゲノム研究データーベースについてホワイトヘッド研究
所から選択した９ｐ２３−２４領域の８つのＥＳＴクロ
ーン（(1)ＧＹＧ２、(2)ＧＬＤＣ、(3)ＩＭＡＧＥクロ
ーン１３１８６５(GenBank Accession No.Ｒ２４５４
２)、(4)ＳＬＣ１Ａ１、(5)ＣＳＮＫ１Ｇ２、(6)ＪＡＫ
２、(7)ＩＭＡＧＥクローン６５０４９５(GenBank Acce
ssion No.ＡＡ２１９３６０)及び(8)ＩＭＡＧＥクロー
ン３０３５４（GenBank Accession No.Ｒ１８５６７、
上記(1)、(2)および(4)−(6)は既知遺伝子の一部であ
り、(3)、(7)および(8)は転写体の一部である）を、リ
サーチ・ジェネティクス社(Research Genetics)から購入
し、サザンブロットおよびノーザンブロット分析のため
に、プローブとして使用した。

【０２５１】腫瘍のＤＮＡは、標準方法(文献：Sambroo
k, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Man
nual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1989)によって培養した食道扁平上皮癌細胞株から抽
出した。

【０２５２】サザンブロット分析のために、各細胞株ま
たは正常リンパ球から抽出し、ＥｃｏＲＩ消化した１０
μgのＤＮＡを０．８％アガロースゲルにて電気泳動に
かけて、ナイロン膜(BIODYNE B,日本パル社製(Nihon Pa
ll))に転写した。また、ノーザンブロット分析のため
に、各細胞株から抽出した２０μｇの全ＲＮＡを１．０
％アガロース／０．６７Ｍホルムアルデヒド・ゲルにて
電気泳動にかけて、ナイロン膜上(Hybond-N+,アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製(Amersham Pharmaci
a Biotech))に転写した。

【０２５３】各転写膜は、適当な条件下に［α³²Ｐ］ｄ
ＣＴＰ標識した各ＥＳＴプローブでハイブリダイズし、
洗浄した後、前記シノミヤらの方法に順じてコダックＸ
−ＯＭＡＴフィルムに対して、露光させた。

【０２５４】異なったヒト正常組織における発現パター
ンを比較するために、１２の異なる組織から抽出したＲ
ＮＡを用いて作成されたノーザンブロット(MTN-ヒト１
２レーン:クロンテック社製)を［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識
したＩＭＡＧＥクローン１３１８６５(GenBank accessi
on number:R24542)でハイブリダイズした。

【０２５５】サザンブロット分析は、以下の条件で行な
った。 1)プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ション緩衝液：変性サケ***ＤＮＡ（200mg/ml）および
ヒト胎盤ＤＮＡ（200mg/ml）を含むPEG/SDS溶液（7% PE
G8000, 10% SDS） 2)プレハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６５
℃で１２−１６時間 3)ハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６５℃で
１２−１６時間 4)洗浄： 連続攪拌下に洗浄溶液１（２×ＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳ）にて、５５℃、１５分間、連続攪拌下に洗
浄溶液２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５
５℃、１５分間、２×ＳＳＣにてすすぐ。

【０２５６】また、ノーザンブロット分析は、以下の条
件で行なった。 1)プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ション緩衝液：ExpressHyb（クローンテック社）を使用 2)プレハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６８
℃で３０分間 3)ハイブリダイゼーション条件：連続攪拌下に６８℃で
１時間 4)洗浄：連続攪拌下に洗浄溶液１（２×ＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳ）にて、５５℃、３０分間、連続攪拌下に洗浄
溶液２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）にて、５５
℃、１５分間を２回、２×ＳＳＣにてすすぐ。

【０２５７】以上の結果、ＹＡＣ７９９Ｄ２上に局在し
ているグリコゲニン２(GYG2: Glycogenin2)、グリシン
デヒドロゲナーゼ(GLDC: Glycine dehydrogenease)およ
びＩＭＡＧＥクローン１３１８６５(GenBank Accession
No.R24542)の３つのＥＳＴプローブを用いた食道扁平
上皮癌細胞株のサザンブロット分析は、ＣＧＨおよびＦ
ＩＳＨ試験において９ｐでコピー数の増加を示した５つ
の細胞株全てで増幅パターンを示した。

【０２５８】対照的に、領域外の遺伝子または未知の転
写体に対するプローブである、溶質担体ファミリー(sol
ute-carrier family)の一つであるＳＬＣ１Ａ１、ＪＡ
Ｋ２、カゼイン・キナーゼ１γ２(CSNK1G2)、ＩＭＡＧ
Ｅクローン６５０４９５(GenBank Accession No. AA219
360)およびＩＭＡＧＥクローン３５０３５４(GenBankAc
cession No. R18567)は、ＫＹＳＥ１５０において、増
幅が見られないことが明らかになった(図１のＢ参照)。

【０２５９】食道扁平上皮癌細胞株ＤＮＡと正常ＤＮＡ
のハイブリダゼーション・シグナルの比較に基づく、増
幅の程度の大まかな評価によると、最初の３つのプロー
ブ(GYG2, GLDC, IMEGEクローン131865)ではＫＹＳＥ１５０
においては、１２倍以上の増幅が明らかとなり、他の４
つの細胞株において、およそ３から６倍の増幅が確認さ
れた(図３のＡ参照)。

【０２６０】尚、図３のＡは、食道扁平上皮癌細胞株に
おけるＧＡＳＣ１の増幅を示す図である。この図は、前
述の方法のようにプローブとしてＩＭＡＧＥクローン１
３１８６５を使用するサザンブロットにより求められ
た。

【０２６１】該図より、健常人末梢血リンパ球由来のＤ
ＮＡ（Ｎ）上のシグナルは、８つの食道扁平上皮癌細胞
株のうち、ＫＹＳＥ７０，１５０，４５０，８９０およ
び１１７０より弱く、１２５０および１２６０より強
く、そして１１０と同程度であることが判る。このこと
から、ＫＹＳＥ７０，１５０，４５０，８９０および１
１７０においてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５が増幅
していることを示している。

【０２６２】また、図３のＢは、図３のＡで用いたのと
同じ８つの食道扁平上皮癌細胞株からの全ＲＮＡを対象
にプローブとしてＩＭＡＧＥクローン１３１８６５或い
はコントロール・プローブ(GAPDH)でハイブリダイズし
たノーザンプロット分析結果を示す図である。

【０２６３】該図より、図３のＡで増幅があった５つの
食道扁平上皮癌細胞株(KYSE-70, KYSE-150, KYSE-450,
KYSE-890, KYSE-1170)において、ＧＡＳＣ１遺伝子が過
剰発現していることが明らかである。

【０２６４】更に、図４は、正常ヒト組織における本発
明遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。

【０２６５】この図は、１２の異なる組織から抽出され
たＲＮＡを用いて作成したノーザンプロットに対して、
［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＩＭＡＧＥクローン１３１
８６５をハイブリダイズして作成された結果を示す図で
ある。尚、ハイブリダイズ操作は図３のＢと同様とし
た。

【０２６６】３つの未知の転写体（IMAGEクローン13186
5, 650495, 30354）の発現レベルを分析するために実施
したノーザンブロットの結果は、ＩＭＡＧＥクローン１
３１８６５のみが、９ｐ２３−２４上で増幅を示した細
胞株において過剰発現を示した(図３のＢ参照)。

【０２６７】この結果は、ＩＭＡＧＥクローン１３１８
６５が、このアンプリコン内に存在する増幅の標的遺伝
子の候補の一部であることを示しており、このため、こ
のクローンを用いて全長の遺伝子をクローニングし、そ
の配列を決定することとした。

【０２６８】ＩＭＡＧＥクローン１３１８６５とハイブ
リダイズした複数のひと正常組織のＲＮＡを用いたノー
ザンプロットは、４．５Ｋｂの１つのシグナルの転写体
が全ての組織で発現していることを示した(図４参照)。 ３．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＤＮＡ配
列決定 オリゴキャップ法(Maruyama,Ｋ.,et al., Gene, 138, 1
71-174 (1994))およびＺＡＰ−ｃＤＮＡギガパックIII
ゴールドクローニングキット(ZAP-cDNA Gigapack III G
old cloning Kit:ストラタジーン社製)によって、胃癌
細胞株(HSC39)のＲＮＡから２つのｃＤＮＡライブラリ
ー構築した。

【０２６９】各ライブラリーは、プローブとしてＩＭＡ
ＧＥクローン１３１８６５（その配列の一部が既知であ
り、その配列に対してGenBank accession No.R24542が
与えられている）を用いてスクリーニングした。

【０２７０】該スクリーニングにより、６つの重複して
いるｃＤＮＡクローンが単離され、それらのＤＮＡ配列
を３７７ＡＢＩ自動シーケンサー(ＰＥバイオシステム
ズ:PEBiosystems社製)を用いて決定した。この方法によ
って、４２３５塩基の転写体を見出した。

【０２７１】該転写体は、ノーザンブロット分析によっ
て示されたものとサイズが良く対応していたので、この
ｃＤＮＡは、全長ｃＤＮＡであると考えられた。

【０２７２】核酸配列分析は、転写開始のためのコンセ
ンサス配列(コザックのルール)が良く保存されているの
で転写が１４７番目で始まっていると考えられた。２つ
のＡＡＴＡＡポリアデニーレーション・シグナルがポリ
(Ａ)伸長によって続いた３’末端で見つかった。故に、
推定された蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号：１に示
されるように１０５６のアミノ酸配列を含むものと同定
された。

【０２７３】また、ＧＡＳＣ１のＤＮＡ配列（配列番
号：２に示す）の１０番目から３１４０番目は、ＫＩＡ
Ａ０７８０(GenBank Accession No. AB018323)のｃＤＮ
Ａ配列の部分に対して著しい相同性を示した。

【０２７４】更に、単離されたクローンの配列を確認す
るために、鋳型として過剰発現を示した５つの食道扁平
上皮癌細胞株（KYSE-70, KYSE-150, KYSE-450, KYSE-89
0およびKYSE-1170）由来のＲＮＡと 、クローン１３１
８６５をスクリーニングすることによって単離したクロ
ーンから決定した配列を基に作製した下記２組のプライ
マーを使用する逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)分析を実施した。

【０２７５】これらＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの
配列は、配列番号：６から配列番号：９に示される。

【０２７６】プライマーＷ１ｆ： 配列番号：６ プライマーＷ１ｒ： 配列番号：７ プライマーＷ２ｆ： 配列番号：８ プライマーＷ２ｒ： 配列番号：９ ＲＴ（逆転写）反応は、１μｇのＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）プライマー０．５μｇと混合し（全量１０μｌ）、
７０℃、１０分間変性させた後、５×逆転写バッファー
（GIBCO社）４μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター（TOYOBO
社）１μｌおよび２．５ｍＭｄＮＴＰ（TAKARA社）４μ
ｌを加え（全量１９μｌ）、更にSuperscript II (GIBC
O社）１μｌを加えて、４２℃で４５分間インキュベー
トすることにより実施した。

【０２７７】ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシ
ステム９７００(パーキン−エルマー社製)を利用して行
った。該反応は、１μｌのＲＴ産物に１０×ＥｘＴａｑ
バッファー（TAKARA社）２μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ
（TAKARA社）１．０μｌ、１０μＭ各プライマー０．５
μｌおよびＥｘＴａｑ（TAKARA社）０．５Ｕを加えて全
量を２０μｌとして実施した。条件としては、９４℃で
２分間の最初の変性、引続く、９４℃で３０秒、５８℃
で３０秒および７２℃で３０秒を１サイクルとする２５
サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応の追加と
した。

【０２７８】その結果、配列決定した配列が正しいこと
を確認できる予測されたサイズの単一のバンド産物が生
み出されていた。加えて、プライマーとして上記Ｗ２ｆ
とＷ２ｒとを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、作成したＤＮ
Ａの配列２３８番−６３８番よりなるＤＮＡ断片を〔α
³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識して、ＩＭＡＧＥクローン(R2454
2)を含んでいるＹＡＣ７９９Ｄ２をスポットしたナイロ
ン膜（BIODYNEB, 日本パル社製(Nihon Pall)）にハイブ
リダイズした所、シグナルが検出され、また５つの９ｐ
２３−２４に増幅を示す５つの腫瘍細胞株（KYSE70, KY
SE150, KYSE450, KYSE890およびKYSE1170）の全てでサ
ザンブロット上に増幅シグナルを示した。

【０２７９】推定されたアミノ酸配列の分析は、遺伝子
産物が、２つのＰＨＤフィンガーと１つのＰＸドメイン
を含んでいることを示唆した(配列番号：１で示される
アミノ酸配列中、６８７〜７４９番目および８０６〜８
６７番目の配列がＰＨＤフィンガー配列であり、９８０
〜１０４７番目のアミノ酸配列がＰＸドメインの配列で
ある)。

【０２８０】ＰＳＯＲＴIIプログラム(文献：http://ps
ort.nibb.ac.jp/form2.html)を用いるその細胞内局在の
コンピュータ予測によって、ＧＡＳＣ１蛋白質には、一
つの典型的二連の核局在シグナルが、９７９−９９６番
目のアミノ酸に検出されたことから、核に局在している
ことが推測された。

【０２８１】上記で得られた結果から、「癌遺伝子」の
候補であることを示すモチーフのＰＨＤフィンガー・モ
チーフおよびＰＸドメインを含んでいるＧＡＳＣ１遺伝
子は、様々な腫瘍の発生や進展に重要な役割を演じてい
ると推定され、染色体９ｐ２３−２４領域でのＧＡＳＣ
１転写物の発現増加が、同様に食道扁平上皮癌を含む種
々の型の腫瘍の発生および／または進展に関連した腫瘍
関連遺伝子(癌遺伝子の候補遺伝子を含む)であることを
強く示唆している。

【０２８２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> GASC1 gene <130> BB00JP <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1056 <212> PRT <213> <400> 1 Met Glu Val Ala Glu Val Glu Ser Pro Leu Asn Pro Ser Cys Lys Ile 1 5 10 15 Met Thr Phe Arg Pro Ser Met Glu Glu Phe Arg Glu Phe Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Tyr Met Glu Ser Lys Gly Ala His Arg Ala Gly Leu Ala Lys 35 40 45 Val Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro Arg Gln Cys Tyr Asp Asp Ile 50 55 60 Asp Asn Leu Leu Ile Pro Ala Pro Ile Gln Gln Met Val Thr Gly Gln 65 70 75 80 Ser Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile Gln Lys Lys Ala Met Thr Val 85 90 95 Lys Glu Phe Arg Gln Leu Ala Asn Ser Gly Lys Tyr Cys Thr Pro Arg 100 105 110 Tyr Leu Asp Tyr Glu Asp Leu Glu Arg Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr 115 120 125 Phe Val Ala Pro Ile Tyr Gly Ala Asp Ile Asn Gly Ser Ile Tyr Asp 130 135 140 Glu Gly Val Asp Glu Trp Asn Ile Ala Arg Ile Asn Thr Val Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Glu Glu Glu Cys Gly Ile Ser Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro 165 170 175 Tyr Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr Thr Phe Ala Trp His Thr Glu 180 185 190 Asp Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His Phe Gly Glu Pro Lys 195 200 205 Ser Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu 210 215 220 Ala Gln Gly Phe Phe Pro Ser Ser Ser Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu 225 230 235 240 Arg His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro Ser Val Leu Lys Lys Tyr Gly 245 250 255 Ile Pro Phe Asp Lys Ile Thr Gln Glu Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr 260 265 270 Phe Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Cys Ala 275 280 285 Glu Ser Thr Asn Phe Ala Thr Val Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val 290 295 300 Ala Lys Leu Cys Thr Cys Arg Lys Asp Met Val Lys Ile Ser Met Asp 305 310 315 320 Ile Phe Val Arg Lys Phe Gln Pro Asp Arg Tyr Gln Leu Trp Lys Gln 325 330 335 Gly Lys Asp Ile Tyr Thr Ile Asp His Thr Lys Pro Thr Pro Ala Ser 340 345 350 Thr Pro Glu Val Lys Ala Trp Leu Gln Arg Arg Arg Lys Val Arg Lys 355 360 365 Ala Ser Arg Ser Phe Gln Cys Ala Arg Ser Thr Ser Lys Arg Pro Lys 370 375 380 Ala Asp Glu Glu Glu Glu Val Ser Asp Glu Val Asp Gly Ala Glu Val 385 390 395 400 Pro Asn Pro Asp Ser Val Thr Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Lys Ser 405 410 415 Glu Ala Ala Val Lys Leu Arg Asn Thr Glu Ala Ser Ser Glu Glu Glu 420 425 430 Ser Ser Ala Ser Arg Met Gln Val Glu Gln Asn Leu Ser Asp His Ile 435 440 445 Lys Leu Ser Gly Asn Ser Cys Leu Ser Thr Ser Val Thr Glu Asp Ile 450 455 460 Lys Thr Glu Asp Asp Lys Ala Tyr Ala Tyr Arg Ser Val Pro Ser Ile 465 470 475 480 Ser Ser Glu Ala Asp Asp Ser Ile Pro Leu Ser Thr Gly Tyr Glu Lys 485 490 495 Pro Glu Lys Ser Asp Pro Ser Glu Leu Ser Trp Pro Lys Ser Pro Glu 500 505 510 Ser Cys Ser Ser Val Ala Glu Ser Asn Gly Val Leu Thr Glu Gly Glu 515 520 525 Glu Ser Asp Val Glu Ser His Gly Asn Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ile 530 535 540 Pro Ala Val Pro Ser Gly Glu Arg Asn Ser Phe Lys Val Pro Ser Ile 545 550 555 560 Ala Glu Gly Glu Asn Lys Thr Ser Lys Ser Trp Arg His Pro Leu Ser 565 570 575 Arg Pro Pro Ala Arg Ser Pro Met Thr Leu Val Lys Gln Gln Ala Pro 580 585 590 Ser Asp Glu Glu Leu Pro Glu Val Leu Ser Ile Glu Glu Glu Val Glu 595 600 605 Glu Thr Glu Ser Trp Ala Lys Pro Leu Ile His Leu Trp Gln Thr Lys 610 615 620 Ser Pro Asn Phe Ala Ala Glu Gln Glu Tyr Asn Ala Thr Val Ala Arg 625 630 635 640 Met Lys Pro His Cys Ala Ile Cys Thr Leu Leu Met Pro Tyr His Lys 645 650 655 Pro Asp Ser Ser Asn Glu Glu Asn Asp Ala Arg Trp Glu Thr Lys Leu 660 665 670 Asp Glu Val Val Thr Ser Glu Gly Lys Thr Lys Pro Leu Ile Pro Glu 675 680 685 Met Cys Phe Ile Tyr Ser Glu Glu Asn Ile Glu Tyr Ser Pro Pro Asn 690 695 700 Ala Phe Leu Glu Glu Asp Gly Thr Ser Leu Leu Ile Ser Cys Ala Lys 705 710 715 720 Cys Cys Val Arg Val His Ala Ser Cys Tyr Gly Ile Pro Ser His Glu 725 730 735 Ile Cys Asp Gly Trp Leu Cys Ala Arg Cys Lys Arg Asn Ala Trp Thr 740 745 750 Ala Glu Cys Cys Leu Cys Asn Leu Arg Gly Gly Ala Leu Lys Gln Thr 755 760 765 Lys Asn Asn Arg Trp Ala His Val Met Cys Ala Val Ala Val Pro Glu 770 775 780 Val Arg Phe Thr Asn Val Pro Glu Arg Thr Gln Ile Asp Val Gly Arg 785 790 795 800 Ile Pro Leu Gln Arg Leu Lys Leu Lys Cys Ile Phe Cys Arg His Arg 805 810 815 Val Lys Arg Val Ser Gly Ala Cys Ile Gln Cys Ser Tyr Gly Arg Cys 820 825 830 Pro Ala Ser Phe His Val Thr Cys Ala His Ala Ala Gly Val Leu Met 835 840 845 Glu Pro Asp Asp Trp Pro Tyr Val Val Asn Ile Thr Cys Phe Arg His 850 855 860 Lys Val Asn Pro Asn Val Lys Ser Lys Ala Cys Glu Lys Val Ile Ser 865 870 875 880 Val Gly Gln Thr Val Ile Thr Lys His Arg Asn Thr Arg Tyr Tyr Ser 885 890 895 Cys Arg Val Met Ala Val Thr Ser Gln Thr Phe Tyr Glu Val Met Phe 900 905 910 Asp Asp Gly Ser Phe Ser Arg Asp Thr Phe Pro Glu Asp Ile Val Ser 915 920 925 Arg Asp Cys Leu Lys Leu Gly Pro Pro Ala Glu Gly Glu Val Val Gln 930 935 940 Val Lys Trp Pro Asp Gly Lys Leu Tyr Gly Ala Lys Tyr Phe Gly Ser 945 950 955 960 Asn Ile Ala His Met Tyr Gln Val Glu Phe Glu Asp Gly Ser Gln Ile 965 970 975 Ala Met Lys Arg Glu Asp Ile Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Leu Pro Lys 980 985 990 Arg Val Lys Ala Arg Phe Ser Thr Ala Ser Asp Met Arg Phe Glu Asp 995 1000 1005 Thr Phe Tyr Gly Ala Asp Ile Ile Gln Gly Glu Arg Lys Arg Gln Arg 1010 1015 1020 Val Leu Ser Ser Arg Phe Lys Asn Glu Tyr Val Ala Asp Pro Val Tyr 1025 1030 1035 1040 Arg Thr Phe Leu Lys Ser Ser Phe Gln Lys Lys Cys Gln Lys Arg Gln 1045 1050 1055 <210> 2 <211> 3168 <212> DNA <213> Human cells of squamous cell carcinomas(KYSE) <400> 2 atggaggtgg ccgaggtgga aagtcctctg aaccccagct gtaagataat gaccttcaga 60 ccctccatgg aggagttccg ggagttcaac aaataccttg catacatgga gtctaaagga 120 gcccatcgtg cgggtcttgc aaaggtgatt cctcctaagg agtggaagcc aagacagtgc 180 tatgatgaca ttgataattt gctcattcca gcaccaattc agcagatggt cacagggcag 240 tcaggactgt tcactcagta caacatccag aaaaaagcga tgactgtgaa ggagttcagg 300 cagctggcca acagtggcaa atattgtact ccaagatact tggattacga agatttggag 360 cgcaagtact ggaagaactt aacttttgtg gcacctatct atggtgcaga tattaatggg 420 agcatatatg atgagggtgt ggatgaatgg aacatagctc gcatcaatac agtcttggat 480 gtggttgaag aagagtgtgg catttctatt gagggtgtaa ataccccata tctctatttt 540 ggcatgtgga agaccacgtt tgcatggcac accgaagaca tggacctcta tagcattaat 600 tatctccact ttggagagcc caagtcttgg tatgctatac ctccggagca tggaaaacga 660 cttgaaagac tagctcaagg ttttttccca agcagctccc aagggtgtga tgcatttctt 720 cgccacaaga tgacattgat ttctccatca gtattgaaga aatatggtat tccctttgac 780 aagataaccc aggaggctgg agaattcatg atcactttcc catatggcta ccatgctggt 840 tttaatcatg gtttcaactg tgcagaatct acaaattttg ctactgtcag atggattgac 900 tatggaaaag ttgccaaatt gtgcacttgc aggaaagaca tggtgaagat ttcaatggat 960 atctttgtga ggaaatttca gccagacaga tatcagcttt ggaaacaagg aaaggatata 1020 tacaccattg atcacacgaa gcctactcca gcatccaccc ctgaagtaaa agcatggctg 1080 cagaggagga ggaaagtaag aaaagcatcc cgaagcttcc agtgtgctag gtctacctct 1140 aaaaggccta aggctgatga ggaagaggaa gtgtcagatg aagtcgatgg ggcagaggtc 1200 cctaaccccg actcagtcac agatgacctc aaggtcagtg aaaagtcaga agcagcagtg 1260 aagctgagga acacagaagc atcttcagaa gaagagtcat ctgctagcag gatgcaggtg 1320 gagcagaatt tatcagatca tatcaaactc tcaggaaaca gctgcttaag tacatctgta 1380 acagaagaca taaaaactga ggatgacaaa gcttatgcat atagaagtgt accttctata 1440 tccagtgagg ctgatgattc cattccattg tctactggct atgagaagcc cgagaaatca 1500 gacccatccg agctttcatg gccaaagtca cctgagtcat gctcatcagt ggcagagagt 1560 aatggtgtgt taacagaggg agaagagagt gatgtggaga gccatgggaa tggccttgaa 1620 cctggggaaa tcccagcggt ccccagtgga gagagaaata gcttcaaagt ccccagtata 1680 gcagagggag agaacaaaac ctctaagagt tggcgccatc cacttagcag gcctccagca 1740 agatctccga tgactcttgt gaagcagcag gcgccaagtg atgaagaatt gcctgaggtt 1800 ctgtccattg aggaggaagt ggaagaaaca gagtcttggg cgaaacctct catccacctt 1860 tggcagacga agtcccctaa cttcgcagct gagcaagagt ataatgcaac agtggccagg 1920 atgaagccac actgtgccat ctgcactctg ctcatgccgt accacaagcc agatagcagc 1980 aatgaagaaa atgatgctag atgggagaca aaattagatg aagtcgttac atcggaggga 2040 aagactaagc ccctcatacc agagatgtgt tttatttata gtgaagaaaa tatagaatat 2100 tctccaccca atgccttcct tgaagaggat ggaacaagtc tccttatttc ctgtgcaaag 2160 tgctgcgtac gggttcatgc aagttgttat ggtattcctt ctcatgagat ctgtgatgga 2220 tggctgtgtg cccggtgcaa aagaaatgcg tggacagcag aatgctgtct ctgcaatttg 2280 agaggaggtg ctcttaagca aacgaagaac aataggtggg cccatgtcat gtgcgccgtt 2340 gcggtcccag aagttcgatt cactaatgtc ccagaaagga cacaaataga tgtaggcaga 2400 atacctttac agaggttaaa attgaaatgc atcttctgca gacaccgggt taagagggtc 2460 tctggagcct gcatccagtg ttcctacggt cgctgcccgg cctccttcca tgtcacttgt 2520 gcccatgctg ctggggtact gatggagcct gatgattggc cttatgtggt gaacattaca 2580 tgctttcgac ataaggtcaa ccccaacgtg aagtccaagg cttgcgagaa ggtcatttcc 2640 gtgggtcaaa cggtcatcac gaagcatcgg aacacccggt attacagttg cagagtgatg 2700 gctgtgacat cgcagacctt ctatgaggtc atgtttgatg atggctcctt tagcagagac 2760 acatttcctg aggatatcgt gagccgagac tgtctgaagc tgggcccacc tgctgaggga 2820 gaagtcgtcc aagtcaagtg gcccgatggc aaactctatg gagcaaaata ttttggatca 2880 aatattgccc acatgtacca ggttgagttt gaagatggat cccagatagc aatgaagaga 2940 gaggacatct acactttaga tgaagagtta cccaagagag tgaaagctcg attttccaca 3000 gcctctgaca tgcgatttga agacacgttt tatggagcag acattatcca aggggagaga 3060 aagagacaaa gagtgctgag ctccaggttt aagaatgaat atgtggccga ccctgtatac 3120 cgcacttttt tgaagagctc tttccagaag aagtgccaga agagacag 3168 <210> 3 <211> 4235 <212> DNA <213> Human cells of squamous cell carcinomas(KYSE) <220> <221> CDS <222> (147)..(3314) <400> 3 cggcacgaga acagctgtca cctagtgcgg aacaagtctc ccaaatttcc caaatctccc 60 tgggccggag gccactgtct tctcttcctc ctccaccgag tcgtgctctc gccccaaccc 120 gcgcgccaga cactgcccta accatc atg gag gtg gcc gag gtg gaa agt cct 173 Met Glu Val Ala Glu Val Glu Ser Pro 1 5 ctg aac ccc agc tgt aag ata atg acc ttc aga ccc tcc atg gag gag 221 Leu Asn Pro Ser Cys Lys Ile Met Thr Phe Arg Pro Ser Met Glu Glu 10 15 20 25 ttc cgg gag ttc aac aaa tac ctt gca tac atg gag tct aaa gga gcc 269 Phe Arg Glu Phe Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Met Glu Ser Lys Gly Ala 30 35 40 cat cgt gcg ggt ctt gca aag gtg att cct cct aag gag tgg aag cca 317 His Arg Ala Gly Leu Ala Lys Val Ile Pro Pro Lys Glu Trp Lys Pro 45 50 55 aga cag tgc tat gat gac att gat aat ttg ctc att cca gca cca att 365 Arg Gln Cys Tyr Asp Asp Ile Asp Asn Leu Leu Ile Pro Ala Pro Ile 60 65 70 cag cag atg gtc aca ggg cag tca gga ctg ttc act cag tac aac atc 413 Gln Gln Met Val Thr Gly Gln Ser Gly Leu Phe Thr Gln Tyr Asn Ile 75 80 85 cag aaa aaa gcg atg act gtg aag gag ttc agg cag ctg gcc aac agt 461 Gln Lys Lys Ala Met Thr Val Lys Glu Phe Arg Gln Leu Ala Asn Ser 90 95 100 105 ggc aaa tat tgt act cca aga tac ttg gat tac gaa gat ttg gag cgc 509 Gly Lys Tyr Cys Thr Pro Arg Tyr Leu Asp Tyr Glu Asp Leu Glu Arg 110 115 120 aag tac tgg aag aac tta act ttt gtg gca cct atc tat ggt gca gat 557 Lys Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Phe Val Ala Pro Ile Tyr Gly Ala Asp 125 130 135 att aat ggg agc ata tat gat gag ggt gtg gat gaa tgg aac ata gct 605 Ile Asn Gly Ser Ile Tyr Asp Glu Gly Val Asp Glu Trp Asn Ile Ala 140 145 150 cgc atc aat aca gtc ttg gat gtg gtt gaa gaa gag tgt ggc att tct 653 Arg Ile Asn Thr Val Leu Asp Val Val Glu Glu Glu Cys Gly Ile Ser 155 160 165 att gag ggt gta aat acc cca tat ctc tat ttt ggc atg tgg aag acc 701 Ile Glu Gly Val Asn Thr Pro Tyr Leu Tyr Phe Gly Met Trp Lys Thr 170 175 180 185 acg ttt gca tgg cac acc gaa gac atg gac ctc tat agc att aat tat 749 Thr Phe Ala Trp His Thr Glu Asp Met Asp Leu Tyr Ser Ile Asn Tyr 190 195 200 ctc cac ttt gga gag ccc aag tct tgg tat gct ata cct ccg gag cat 797 Leu His Phe Gly Glu Pro Lys Ser Trp Tyr Ala Ile Pro Pro Glu His 205 210 215 gga aaa cga ctt gaa aga cta gct caa ggt ttt ttc cca agc agc tcc 845 Gly Lys Arg Leu Glu Arg Leu Ala Gln Gly Phe Phe Pro Ser Ser Ser 220 225 230 caa ggg tgt gat gca ttt ctt cgc cac aag atg aca ttg att tct cca 893 Gln Gly Cys Asp Ala Phe Leu Arg His Lys Met Thr Leu Ile Ser Pro 235 240 245 tca gta ttg aag aaa tat ggt att ccc ttt gac aag ata acc cag gag 941 Ser Val Leu Lys Lys Tyr Gly Ile Pro Phe Asp Lys Ile Thr Gln Glu 250 255 260 265 gct gga gaa ttc atg atc act ttc cca tat ggc tac cat gct ggt ttt 989 Ala Gly Glu Phe Met Ile Thr Phe Pro Tyr Gly Tyr His Ala Gly Phe 270 275 280 aat cat ggt ttc aac tgt gca gaa tct aca aat ttt gct act gtc aga 1037 Asn His Gly Phe Asn Cys Ala Glu Ser Thr Asn Phe Ala Thr Val Arg 285 290 295 tgg att gac tat gga aaa gtt gcc aaa ttg tgc act tgc agg aaa gac 1085 Trp Ile Asp Tyr Gly Lys Val Ala Lys Leu Cys Thr Cys Arg Lys Asp 300 305 310 atg gtg aag att tca atg gat atc ttt gtg agg aaa ttt cag cca gac 1133 Met Val Lys Ile Ser Met Asp Ile Phe Val Arg Lys Phe Gln Pro Asp 315 320 325 aga tat cag ctt tgg aaa caa gga aag gat ata tac acc att gat cac 1181 Arg Tyr Gln Leu Trp Lys Gln Gly Lys Asp Ile Tyr Thr Ile Asp His 330 335 340 345 acg aag cct act cca gca tcc acc cct gaa gta aaa gca tgg ctg cag 1229 Thr Lys Pro Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Trp Leu Gln 350 355 360 agg agg agg aaa gta aga aaa gca tcc cga agc ttc cag tgt gct agg 1277 Arg Arg Arg Lys Val Arg Lys Ala Ser Arg Ser Phe Gln Cys Ala Arg 365 370 375 tct acc tct aaa agg cct aag gct gat gag gaa gag gaa gtg tca gat 1325 Ser Thr Ser Lys Arg Pro Lys Ala Asp Glu Glu Glu Glu Val Ser Asp 380 385 390 gaa gtc gat ggg gca gag gtc cct aac ccc gac tca gtc aca gat gac 1373 Glu Val Asp Gly Ala Glu Val Pro Asn Pro Asp Ser Val Thr Asp Asp 395 400 405 ctc aag gtc agt gaa aag tca gaa gca gca gtg aag ctg agg aac aca 1421 Leu Lys Val Ser Glu Lys Ser Glu Ala Ala Val Lys Leu Arg Asn Thr 410 415 420 425 gaa gca tct tca gaa gaa gag tca tct gct agc agg atg cag gtg gag 1469 Glu Ala Ser Ser Glu Glu Glu Ser Ser Ala Ser Arg Met Gln Val Glu 430 435 440 cag aat tta tca gat cat atc aaa ctc tca gga aac agc tgc tta agt 1517 Gln Asn Leu Ser Asp His Ile Lys Leu Ser Gly Asn Ser Cys Leu Ser 445 450 455 aca tct gta aca gaa gac ata aaa act gag gat gac aaa gct tat gca 1565 Thr Ser Val Thr Glu Asp Ile Lys Thr Glu Asp Asp Lys Ala Tyr Ala 460 465 470 tat aga agt gta cct tct ata tcc agt gag gct gat gat tcc att cca 1613 Tyr Arg Ser Val Pro Ser Ile Ser Ser Glu Ala Asp Asp Ser Ile Pro 475 480 485 ttg tct act ggc tat gag aag ccc gag aaa tca gac cca tcc gag ctt 1661 Leu Ser Thr Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Lys Ser Asp Pro Ser Glu Leu 490 495 500 505 tca tgg cca aag tca cct gag tca tgc tca tca gtg gca gag agt aat 1709 Ser Trp Pro Lys Ser Pro Glu Ser Cys Ser Ser Val Ala Glu Ser Asn 510 515 520 ggt gtg tta aca gag gga gaa gag agt gat gtg gag agc cat ggg aat 1757 Gly Val Leu Thr Glu Gly Glu Glu Ser Asp Val Glu Ser His Gly Asn 525 530 535 ggc ctt gaa cct ggg gaa atc cca gcg gtc ccc agt gga gag aga aat 1805 Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ile Pro Ala Val Pro Ser Gly Glu Arg Asn 540 545 550 agc ttc aaa gtc ccc agt ata gca gag gga gag aac aaa acc tct aag 1853 Ser Phe Lys Val Pro Ser Ile Ala Glu Gly Glu Asn Lys Thr Ser Lys 555 560 565 agt tgg cgc cat cca ctt agc agg cct cca gca aga tct ccg atg act 1901 Ser Trp Arg His Pro Leu Ser Arg Pro Pro Ala Arg Ser Pro Met Thr 570 575 580 585 ctt gtg aag cag cag gcg cca agt gat gaa gaa ttg cct gag gtt ctg 1949 Leu Val Lys Gln Gln Ala Pro Ser Asp Glu Glu Leu Pro Glu Val Leu 590 595 600 tcc att gag gag gaa gtg gaa gaa aca gag tct tgg gcg aaa cct ctc 1997 Ser Ile Glu Glu Glu Val Glu Glu Thr Glu Ser Trp Ala Lys Pro Leu 605 610 615 atc cac ctt tgg cag acg aag tcc cct aac ttc gca gct gag caa gag 2045 Ile His Leu Trp Gln Thr Lys Ser Pro Asn Phe Ala Ala Glu Gln Glu 620 625 630 tat aat gca aca gtg gcc agg atg aag cca cac tgt gcc atc tgc act 2093 Tyr Asn Ala Thr Val Ala Arg Met Lys Pro His Cys Ala Ile Cys Thr 635 640 645 ctg ctc atg ccg tac cac aag cca gat agc agc aat gaa gaa aat gat 2141 Leu Leu Met Pro Tyr His Lys Pro Asp Ser Ser Asn Glu Glu Asn Asp 650 655 660 665 gct aga tgg gag aca aaa tta gat gaa gtc gtt aca tcg gag gga aag 2189 Ala Arg Trp Glu Thr Lys Leu Asp Glu Val Val Thr Ser Glu Gly Lys 670 675 680 act aag ccc ctc ata cca gag atg tgt ttt att tat agt gaa gaa aat 2237 Thr Lys Pro Leu Ile Pro Glu Met Cys Phe Ile Tyr Ser Glu Glu Asn 685 690 695 ata gaa tat tct cca ccc aat gcc ttc ctt gaa gag gat gga aca agt 2285 Ile Glu Tyr Ser Pro Pro Asn Ala Phe Leu Glu Glu Asp Gly Thr Ser 700 705 710 ctc ctt att tcc tgt gca aag tgc tgc gta cgg gtt cat gca agt tgt 2333 Leu Leu Ile Ser Cys Ala Lys Cys Cys Val Arg Val His Ala Ser Cys 715 720 725 tat ggt att cct tct cat gag atc tgt gat gga tgg ctg tgt gcc cgg 2381 Tyr Gly Ile Pro Ser His Glu Ile Cys Asp Gly Trp Leu Cys Ala Arg 730 735 740 745 tgc aaa aga aat gcg tgg aca gca gaa tgc tgt ctc tgc aat ttg aga 2429 Cys Lys Arg Asn Ala Trp Thr Ala Glu Cys Cys Leu Cys Asn Leu Arg 750 755 760 gga ggt gct ctt aag caa acg aag aac aat agg tgg gcc cat gtc atg 2477 Gly Gly Ala Leu Lys Gln Thr Lys Asn Asn Arg Trp Ala His Val Met 765 770 775 tgc gcc gtt gcg gtc cca gaa gtt cga ttc act aat gtc cca gaa agg 2525 Cys Ala Val Ala Val Pro Glu Val Arg Phe Thr Asn Val Pro Glu Arg 780 785 790 aca caa ata gat gta ggc aga ata cct tta cag agg tta aaa ttg aaa 2573 Thr Gln Ile Asp Val Gly Arg Ile Pro Leu Gln Arg Leu Lys Leu Lys 795 800 805 tgc atc ttc tgc aga cac cgg gtt aag agg gtc tct gga gcc tgc atc 2621 Cys Ile Phe Cys Arg His Arg Val Lys Arg Val Ser Gly Ala Cys Ile 810 815 820 825 cag tgt tcc tac ggt cgc tgc ccg gcc tcc ttc cat gtc act tgt gcc 2669 Gln Cys Ser Tyr Gly Arg Cys Pro Ala Ser Phe His Val Thr Cys Ala 830 835 840 cat gct gct ggg gta ctg atg gag cct gat gat tgg cct tat gtg gtg 2717 His Ala Ala Gly Val Leu Met Glu Pro Asp Asp Trp Pro Tyr Val Val 845 850 855 aac att aca tgc ttt cga cat aag gtc aac ccc aac gtg aag tcc aag 2765 Asn Ile Thr Cys Phe Arg His Lys Val Asn Pro Asn Val Lys Ser Lys 860 865 870 gct tgc gag aag gtc att tcc gtg ggt caa acg gtc atc acg aag cat 2813 Ala Cys Glu Lys Val Ile Ser Val Gly Gln Thr Val Ile Thr Lys His 875 880 885 cgg aac acc cgg tat tac agt tgc aga gtg atg gct gtg aca tcg cag 2861 Arg Asn Thr Arg Tyr Tyr Ser Cys Arg Val Met Ala Val Thr Ser Gln 890 895 900 905 acc ttc tat gag gtc atg ttt gat gat ggc tcc ttt agc aga gac aca 2909 Thr Phe Tyr Glu Val Met Phe Asp Asp Gly Ser Phe Ser Arg Asp Thr 910 915 920 ttt cct gag gat atc gtg agc cga gac tgt ctg aag ctg ggc cca cct 2957 Phe Pro Glu Asp Ile Val Ser Arg Asp Cys Leu Lys Leu Gly Pro Pro 925 930 935 gct gag gga gaa gtc gtc caa gtc aag tgg ccc gat ggc aaa ctc tat 3005 Ala Glu Gly Glu Val Val Gln Val Lys Trp Pro Asp Gly Lys Leu Tyr 940 945 950 gga gca aaa tat ttt gga tca aat att gcc cac atg tac cag gtt gag 3053 Gly Ala Lys Tyr Phe Gly Ser Asn Ile Ala His Met Tyr Gln Val Glu 955 960 965 ttt gaa gat gga tcc cag ata gca atg aag aga gag gac atc tac act 3101 Phe Glu Asp Gly Ser Gln Ile Ala Met Lys Arg Glu Asp Ile Tyr Thr 970 975 980 985 tta gat gaa gag tta ccc aag aga gtg aaa gct cga ttt tcc aca gcc 3149 Leu Asp Glu Glu Leu Pro Lys Arg Val Lys Ala Arg Phe Ser Thr Ala 990 995 1000 tct gac atg cga ttt gaa gac acg ttt tat gga gca gac att atc caa 3197 Ser Asp Met Arg Phe Glu Asp Thr Phe Tyr Gly Ala Asp Ile Ile Gln 1005 1010 1015 ggg gag aga aag aga caa aga gtg ctg agc tcc agg ttt aag aat gaa 3245 Gly Glu Arg Lys Arg Gln Arg Val Leu Ser Ser Arg Phe Lys Asn Glu 1020 1025 1030 tat gtg gcc gac cct gta tac cgc act ttt ttg aag agc tct ttc cag 3293 Tyr Val Ala Asp Pro Val Tyr Arg Thr Phe Leu Lys Ser Ser Phe Gln 1035 1040 1045 aag aag tgc cag aag aga cag tagtctgcat acatcgctgc aggccacaga 3344 Lys Lys Cys Gln Lys Arg Gln 1050 1055 gcagcttggg ttggaaaaga gaagatgaag ggacatcctt ggggctgtgc cgtgagattt 3404 gctggcatag gtgacagggt gtgtctctga cagtggtaaa tcgggtttcc agagtttggt 3464 caccaaaaat acaaaataca cacaatgaat tggacgcagc aatctgaaat catctctagt 3524 cttgctttca cttgtgagca gttgtcttct atgatcccaa agaagttttc taagtgaaag 3584 gaaatactag tgaatcaccc acaaggaaaa gccactgcca cagaggaggc gggtcccctt 3644 gtgcggctta gggccctgtc aggaaacaca cggggacctc tctctctagc tccagcaggt 3704 ggcacctcgg tacccagcgg gtagggcgat aatttatata ttttccacag tcagggaagg 3764 actctcactt atttgtttca aattgcagtt tttataaaac atttttaaaa cacaaatggc 3824 atgtatgcta atgagattta cccgtgtgct atctgtattt cccttgtaca gaacttttac 3884 atttttgaat attcctatta cttttgattg tgtctgatgg gaactgagtt gttggccttt 3944 gtgaaatgaa atttttggct cttgagaaag aattcttatg aattgttatg cgaattttat 4004 atatttaaag agggagatct ggggctgtta tttttaaaca ctttttttca taatacatat 4064 tccgagtaga tatttataaa atatatgttt ctttcattat gtgtttgtaa aattagagtt 4124 taaataaata tgctttgatg catagttttg aactaatgta acatgatttt tcttttttaa 4184 aacagcctga aaatgtacta gtgtttaaaa ataaagattt ccattttctc caaaaaaaaa 4244 aaaaaaaaa 4253 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <223> Primer 2484 <400> 4 aggagtgagc caccgcaccc agcc 24 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <223> Primer PDJ34 <400> 5 tgagcyrwga tyryrccayt gcactccagc ctggg 35 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <223> Primer W1f <400> 6 cgggttaaga gggtctctg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <223> Primer W1r <400> 7 ggatgtccct tcatcttctc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <223> Primer W2f <400> 8 aataccttgc atacatggag tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <223> Primer W2r <400> 9 cttcttcaac cacatccaag ac 22

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の１に示すＦＩＳＨ試験の結果を示す
図であり、図中、Ａは本発明遺伝子の周囲の９ｐ２３−
２４の遺伝子地図を、Ｂはサザンブロット分析によって
特定した５つの食道扁平上皮癌細胞株の各々における９
ｐ２３アンプリコンのサイズまたは長さを模式的に示す
図である。

【図２】実施例１の１に示す食道扁平上皮癌細胞である
ＫＹＳＥ−１５０におけるＦＩＳＨ分析の典型的な結果
を示す図面代用写真である。

【図３】実施例１の２に示す試験の結果を示す図であ
り、Ａはサザンプロット分析により、食道扁平上皮癌細
胞株におけるＧＡＳＣ１の増幅を示す図、Ｂは種々の食
道扁平上皮癌細胞株からのＲＮＡを用いたノーザンブロ
ット分析の結果であって、ＧＡＳＣ１の過剰発現を示す
図である。

【図４】実施例１の２に示す試験の結果を示す図であ
り、様々な正常ヒト組織における本発明遺伝子の発現パ
ターンを調べた結果を示す図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 16/32 ４Ｃ０８５ 16/32 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA44 BA80 CA04 CA09 HA12 4B063 QA07 QQ08 QQ43 QQ58 QR32 QR55 QS25 QS32 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA14 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA30 CA25 CA46 4C084 AA13 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 4H045 AA10 AA11 BA10 CA41 DA86 DA89 EA51 FA74

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌ
   クレオチドを含む遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
   チドをコードするポリヌクレオチド （ｂ）配列番号：２で示される塩基配列に対して少なく
   とも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド、 （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対
   する相補鎖であるポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】配列番号：２で示される塩基配列である請
   求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポ
   リペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項
   １に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有
   する遺伝子発現産物。
5. 【請求項５】請求項１または２に記載の遺伝子を有する
   組換え体発現ベクター。
6. 【請求項６】請求項５に記載の組換え体発現ベクターを
   保有する宿主細胞。
7. 【請求項７】配列番号：２で示される塩基配列中の連続
   する少なくとも１５の塩基配列を有するヌクレオチド配
   列。
8. 【請求項８】配列番号：２で示される塩基配列中の連続
   する少なくとも３０の塩基配列を有する請求項７に記載
   のヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】配列番号：２で示される塩基配列中の連続
   する少なくとも１５の塩基配列を有するプローブ。
10. 【請求項１０】配列番号：２で示される塩基配列中の連
    続する少なくとも３０の塩基配列を有する請求項９に記
    載のプローブ。
11. 【請求項１１】請求項９または１０に記載のプローブを
    有効成分として含有する癌診断剤。
12. 【請求項１２】請求項９または１０に記載のプローブを
    有効成分として含有する癌診断用キット。
13. 【請求項１３】請求項１に記載の遺伝子の発現産物に結
    合性を有する抗体またはその断片。
14. 【請求項１４】検体に請求項１３に記載の抗体またはそ
    の断片を反応させて、検体中の該抗体またはその断片の
    結合物を検出する癌の診断方法。