JP2001046072A

JP2001046072A - Ａｃｅ類似遺伝子

Info

Publication number: JP2001046072A
Application number: JP11223892A
Authority: JP
Inventors: Sumio Sugano; 菅野純夫; Takami Komatsu; 小松孝美
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2001-02-20

Abstract

(57)【要約】【課題】ＡＣＥに関連する新たな遺伝子、該遺伝子発
現産物、高血圧症治療剤等を提供する。【解決手段】 (a)配列番号：１のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチド、(b)配列番号：１で示される
アミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して少なくとも９５％の相同性を持つポリヌク
レオチドまたは(c)上記(a)または(b)のポリヌクレオチ
ドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む遺伝子；該
遺伝子の発現産物；該遺伝子を有する組換え体発現ベク
ター、宿主細胞；該遺伝子の断片（オリゴヌクレオチ
ド、センス鎖、アンチセンス鎖、プローブ）；該断片を
含むベクター；該ベクターを含む遺伝子治療剤等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血圧の調節に関係
するレニン−アンジオテンシン系でアンジオテンシンＩ
を活性化型のアンジオテンシンIIに変換する酵素(アン
ジオテンシン変換酵素：Angiotensin Converting Enzy
me)の遺伝子(ACE遺伝子)に類似性を有する新規な遺伝子
に関する。より詳しくは、特に腎臓、精巣、小腸におい
てその発現が高く、公知のヒトを含む哺乳動物のＡＣＥ
遺伝子と約４０％前後の類似性を有する遺伝子に関す
る。

【０００２】また、本発明は、かかる遺伝子によってコ
ードされる新規な蛋白質（遺伝子発現産物）、その製造
のための発現ベクター、宿主細胞、該蛋白質に対する特
異抗体、これらを用いる高血圧症などの疾患の診断方法
や診断剤、上記遺伝子のｃＤＮＡ断片（アンチセンス
鎖、センス鎖、プローブ等）、これらを有効成分とする
医薬組成物にも関する。

【０００３】

【従来の技術】アンジオテンシン変換酵素(ACE)は、カ
ルボキシペプチダーゼのひとつであり、血圧および水・
電解質調節に関連するレニン−アンジオテンシン系酵素
に属する。これはまた、アンジオテンシンノーゲンから
レニンによって生成される１０個のアミノ酸残基を持つ
不活性ペプチドであるアンジオテンシンＩを、アミノ酸
残基８個の生理活性ペプチドであるアンジオテンシンII
に変換する作用を有するものとして広く知られている(G
riendling, K. K.,et al., Circulation, 87, 1816-182
8 (1993) : Tamura, K., et al., Hypertens Res.,18,
7-18 (1995))。

【０００４】また、ＡＣＥは、キニナーゼIIとも呼ば
れ、降圧ペプチドであるブラジキニンの不活性化作用を
有している。

【０００５】該ＡＣＥは、全長４．３ｋｂでアミノ酸残
基１３０６個からなる。このうち、Ｎ末端アミノ酸残基
２９個はシグナルペプチドであり、一次配列で相同的構
造を有する２つのドメインからなり、それらドメインが
非依存的に亜鉛依存的活性部位を有し、全体配列の１７
箇所に糖鎖付着部位があり、１３個所にシステイン残基
がある。該ＡＣＥには、２つのアイソザイムがあり、一
つは肺や腎臓などの体細胞で生成される大きい分子量(1
50kDa)の体細胞型ＡＣＥであり、もう一つは分子量(92k
Da)の小さい精巣型ＡＣＥである。

【０００６】体細胞型ＡＣＥは、ＮドメインとＣドメイ
ンの２つのドメインを有し、精巣型ＡＣＥは、Ｃ末端側
ドメインのみからなっている。体細胞型ＡＣＥと精巣型
ＡＣＥの２つのｍＲＮＡは、同一の遺伝子から、オルタ
ナティブ・イニシェーションとオルタナティブ・スプラ
イシングによって一部重複した構造を有する２種類の異
なった転写ユニットから転写されるとされている(Howar
d, T.,et al., Mol. Cell Biol. 13, 4294-4302 (199
0): Thekkumara, T.J. et al., Nucleic AcidsRes., 2
0, 683-687 (1992): Howard, T.,et al., Mol. Cell Bi
ol., 13, 18-27(1993): 田村功一, 医学のあゆみ, 169,
437-442 (1994))。

【０００７】上記体細胞型ＡＣＥは、血管内膜に多く存
在し、特に肺血管床に多く、その他、腎尿細管上皮、消
化管絨毛上皮、脳内神経上皮、Ｔ細胞、マクロファージ
に存在する膜結合型ＡＣＥである。循環血液中には、可
溶型ＡＣＥが多く存在している。睾丸の***細胞では、
精巣型ＡＣＥが膜結合型として存在として存在してい
る。近年、ＡＣＥ阻害作用に基づく高血圧治療剤が開
発され、広く臨床に提供されている。また、ＡＣＥは高
血圧のみならず、心肥大、動脈硬化、腎障害などの高血
圧合併症の発症・進展に関与することも明らかになって
きている。

【０００８】このように、ＡＣＥと高血圧症との関係は
広く研究され、ＡＣＥ阻害剤が既に上市されるなかで、
ＡＣＥ遺伝子と血圧調節の関係を調べるために、ＡＣＥ
の機能を欠損させたＡＣＥ遺伝子欠損マウスが作製され
(Krege, J.H., et al., Nature, 375, 146-148 (199
6))、前記関係について実験がなされたが、ＡＣＥの持
つ生理的な役割については尚十分な研究成果が得られて
いない現状にある。

【０００９】ＡＣＥに関連する新たな遺伝子が単離でき
れば、それに続いて該遺伝子発現産物と血圧調節との関
連を研究することが可能となり、これによってＡＣＥと
高血圧症との関係の研究も充分に行うことが可能とな
り、その結果を利用したさらなるＡＣＥ阻害作用を有す
る高血圧症治療剤等の開発も可能となると考えられる。
従って、当業界ではかかる新規なＡＣＥ関連遺伝子乃至
類似遺伝子の単離が所望されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記Ａ
ＣＥ、特にヒト精巣型ＡＣＥ、ヒト体細胞型ＡＣＥ、マ
ウス精巣型ＡＣＥ、マウス体細胞型ＡＣＥ、ラット精巣
型ＡＣＥ、ラット体細胞型、ニワトリＡＣＥ、ウサギ精
巣型ＡＣＥ、ウサギ体細胞型ＡＣＥと相同性を有する新
規なヒト蛋白質相同物をコードする遺伝子を提供するこ
とを目的とする。

【００１１】本発明者らは、上記目的より、各種ヒト組
織由来の遺伝子について検索を重ねた結果、目的に合致
する新しい遺伝子の単離、同定に成功し、ここに本発明
を完成するに至った。

【００１２】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、以下の
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含む
遺伝子を提供する。（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：
１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の相同性を
持つポリヌクレオチド、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）
のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチ
ド。

【００１３】また、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供する。（ａ）配列番号：２で示される塩基配列、（ｂ）上記
（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド。

【００１４】また、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チド、（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もし
くは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ
ノ酸配列からなり且つＡＣＥ活性またはブラジキニン不
活性化活性を有するポリペプチド。

【００１５】また、本発明は、上記のアミノ酸配列を有
する遺伝子発現産物；上記各遺伝子を有する組換え体発
現ベクターおよび該組換え体発現ベクターを有する宿主
細胞を提供する。

【００１６】また、本発明は、配列番号：２で示される
塩基配列中の少なくとも１５の、より好ましくは少なく
とも３０の、連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌ
クレオチドを提供する。

【００１７】更に、本発明によれば、以下のアンチセン
ス鎖、これを含むベクター、之等の医薬用途、センス鎖
（プローブ）、蛋白質、降圧剤、化合物のスクリーニン
グ方法、これによって得られる活性物、高血圧症の診断
方法、診断剤等が提供される。 (1)配列番号：２の塩基配列に対するアンチセンス鎖オ
リゴヌクレオチド； (2)少なくとも１５の、より好ましくは少なくとも３０
の、連続するヌクレオチド配列を含む上記アンチセンス
鎖オリゴヌクレオチド； (3)上記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドのいずれか
を含むベクター； (4)上記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドまたはこれ
を含むベクターを有効成分として含有する遺伝子治療
剤；特にＡＣＥ阻害剤またはブラジキニン活性化剤； (5)上記アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドまたはこれ
を含むベクターを有効成分として含有する降圧剤； (6)配列番号：２で示される塩基配列に対するセンス鎖
オリゴヌクレオチド； (7)配列番号：２で示される塩基配列中の少なくとも１
５の、好ましくは少なくとも３０の、連続するヌクレオ
チド配列を含むオリゴヌクレオチド・プローブ； (8)以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の蛋白質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配
列からなり且つＡＣＥ活性またはブラジキニン不活性化
活性を有する蛋白質； (9)上記蛋白質を有効成分とする降圧剤； (10)本発明遺伝子、特に配列番号：１のアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチドからなる遺伝子または配列
番号：２で示される塩基配列のポリヌクレオチド或いは
之等遺伝子の発現産物を有効成分とする降圧剤； (11)本発明遺伝子またはその発現産物を、被検物質を含
む培地中で培養し、次いで細胞のＡＣＥ活性またはブラ
ジキニン活性を測定する、ＡＣＥ阻害物またはブラジキ
ニン活性化物をスクリーニングする方法； (12)上記スクリーニングによって得られるＡＣＥ阻害物
またはブラジキニン活性化物； (13)上記スクリーニングによって得られるＡＣＥ阻害物
またはブラジキニン活性化物を有効成分とする降圧剤； (14)検体中の本発明遺伝子またはその発現産物の量を測
定する高血圧症の遺伝子診断方法； (15)本発明遺伝子またはその発現産物を有効成分とする
高血圧症の遺伝子診断剤； (16)本発明遺伝子の相同物であって、ヒト以外のイヌ、
サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、ラット、マウスおよ
びモルモットから選ばれる哺乳動物の遺伝子相同物； (17)本発明遺伝子発現産物に結合性を有する抗体および
その断片； (18)上記抗体およびその断片を利用する高血圧診断方法
または診断剤； (19)上記抗体およびその断片を有効成分とする降圧剤。

【００１８】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biologi
calNomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (198
4)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作
成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野に
おける慣用記号に従うものとする。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明遺伝子の一具体例として
は、後述する実施例に示される「ｋａｉｓ７」と名付け
られたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から演繹されるものを挙
げることができる。その塩基配列は、配列番号：２に示
されるとおりであり、２４１５塩基のオープン・リーデ
ィング・フレーム(ＯＲＦ)を有している。

【００２０】また、該遺伝子は、上記ＯＲＦの塩基配列
によりコードされる配列番号：１に示される８０５アミ
ノ酸配列の新規なアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）
に類似する蛋白質（「ＡＣＥ類似蛋白質」という）をコ
ードするヒトｃＤＮＡであり、全長２５９９塩基からな
っている。

【００２１】本発明遺伝子ｋａｉｓ７がコードするＡＣ
Ｅ類似蛋白質は、ＢＬＡＳＴＰプログラム（Altschu ,
S.F., et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1
997)を利用したＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデーターベー
スの検索の結果、血圧調節に影響を与えるヒト、マウ
ス、ラット、ニワトリ、ウサギなどの哺乳動物のＡＣＥ
活性を有する酵素（ＡＣＥ蛋白質、前記文献参照）と相
同性を有することが確認された。

【００２２】しかして、上記ＡＣＥは、血圧を調節する
作用、特に昇圧作用を有することが知られている。この
ことから、本発明遺伝子は血圧を調節する因子として機
能し、高血圧の発生因子として働くものと考えられる
（前記文献参照）。

【００２３】本発明遺伝子は、正常腎臓、精巣および小
腸組織にその発現が高いことから、公知のＡＣＥと同様
に血圧調節作用(昇圧作用)またはブラジキニン不活性化
作用を有すると考えられる。

【００２４】本発明ｋａｉｓ７遺伝子の全部または一部
を発現させて得られる発現産物は、ＡＣＥに結合する抗
体の製造並びに該抗体を用いたＡＣＥ関連疾患の診断に
利用することができる。

【００２５】本発明のｋａｉｓ７遺伝子発現産物の発現
量、活性、ポリモルフィズム（遺伝子多型）などを調べ
ることにより、本発明遺伝子またはその発現産物は、高
血圧、その他の疾患に関する遺伝子診断を含めた各種診
断の標的分子となり得る。

【００２６】また、本発明はｋａｉｓ７遺伝子配列また
はアンチセンス配列およびそれらを含むベクターを有効
成分とする遺伝子治療剤を提供することができる。

【００２７】更に、本発明遺伝子の提供によれば、該遺
伝子配列のセンス断片、これらの発現産物が血圧調節作
用因子として利用することもできる。

【００２８】本発明ｋａｉｓ７遺伝子の全部または一部
は、これをプローブとして利用でき、該利用により、高
血圧症やその他関連する疾患の診断が行い得る。即ち、
これらは上記診断用キットの一部として利用することが
できる。

【００２９】本発明ｋａｉｓ７遺伝子またはその発現産
物は、ｋａｉｓ７蛋白（ＡＣＥ類似蛋白）のアゴニス
ト、アンタゴニスト、インヒビターのスクリーニングに
利用することもできる。本発明は、かかるスクリーニン
グされた高血圧症治療剤をも提供することができる。

【００３０】本明細書において、「遺伝子」とは、２本
鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびア
ンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で
用いられる。その長さに何ら制限されるものではない。
従って、本発明の遺伝子(DNA）には、特に言及しない限
り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）並びに該センス鎖と
相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）
およびそれらの断片のいずれもが含まれる。

【００３１】本発明遺伝子(DNA）は、またリーダ配列、
コード領域、エキソン、イントロンを含むことができ
る。ポリヌクレオチドには、ＲＮＡおよびＤＮＡが包含
される。該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成
ＤＮＡが含まれる。ポリペプチドには、その断片、同族
体(ホモログ)、誘導体、変異体が包含される。上記変異
体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しな
い変異体、欠失、置換、付加および挿入によって改変さ
れたアミノ酸配列を有する変異体、実質的に同じ機能を
有する保存的アミノ酸置換により改変されたアミノ酸配
列を有する変異体が包含される。

【００３２】尚、これらアミノ酸配列の改変（変異な
ど）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾
などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例
えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを
行うこともできる。

【００３３】上記変異体は、変異のないポリペプチドと
少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは
９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものである
ことができる。

【００３４】また、上記ポリペプチドは、変異体、ホモ
ログなどを含めて、いずれも共通に保存する構造的特徴
があり、本発明遺伝子発現産物の生物活性、例えば血圧
調節活性、特に昇圧活性またはブラジキニン不活性化活
性を有しているものであることができる。なお、ポリペ
プチドの相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばＦＡ
ＳＴＡプログラムを使用した方法（Clustal,V., Method
s Mol. Biol., 25, 307-318 (1994))で解析することが
できる。

【００３５】上記変異体をコードする遺伝子は、アミノ
酸置換についてサイレントまたは保存さている。即ち、
塩基配列によってコードされるアミノ酸配列残基は変ら
ない。

【００３６】保存的な置換アミノ酸残基、即ち、元のア
ミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換しても、元のアミ
ノ酸残基を有するポリペプチドの活性が保存されている
であろう置換可能なアミノ酸残基は、各アミノ酸残基
（元のアミノ酸残基）に対して以下に示されるとおりで
ある。元のアミノ酸残基保存的な置換アミノ酸残基 Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn またはGln Ile Leu またはVal Leu Ile またはVal Lys Arg, Aln, または Glu Met Leu またはIle Phe Met, LeuまたはTyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp またはPhe Val Ile またはLeu システィン残基(Cys)は、これを他のアミノ酸残基、例
えばアラニン残基(Ala)、バリン残基(Val)などに置換す
ることが可能である。これによれば、一般に特定ポリペ
プチドのジスフィド結合に影響を与えることができる。

【００３７】所望のポリペプチドの特性に好ましい変化
を与えると一般に考えられる置換は、例えば以下のもの
である。 a)親水性残基、例えばSerまたはThrの疎水性残基、例え
ばLeu、Ile、Phe、ValまたはAlaに対して置換される、 b) CysまたはProは、他の各種アミノ酸残基へ置換され
る、 c)電気的陽性側鎖を有しているアミノ酸残基、例えばLy
s、Arg、Hisの電気的陰性残基、例えばValまたはAspへ
の置換、 d)大きな側鎖を有する残基、例えばPheのGlyのような側
鎖を有しないアミノ酸残基への置換。

【００３８】以上のとおり、本発明遺伝子ｋａｉｓ７及
びその遺伝子産物の提供は、高血圧症などの各種疾患の
解明、把握、診断、予防及び治療等に極めて有用な情報
乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記高血圧
症の降圧作用に利用される本発明遺伝子の発現を抑制ま
たは拮抗する新規薬剤の開発の上でも好適に利用でき
る。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現ま
たはその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や
点変異）乃至発現異常の検出は、上記疾患の解明や診断
において好適に利用できる。

【００３９】本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１
で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号：２の塩
基配列を含む遺伝子、例えば配列番号：３で示される塩
基配列を有する遺伝子(ｋａｉｓ７遺伝子)または該配列
番号：２で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を
含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として示される
が、特にこれらに限定されない。例えば、本発明遺伝子
は、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有す
るアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定のアミ
ノ酸配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコード
する遺伝子や、これら遺伝子の塩基配列と一定の相同性
を有する塩基配列の遺伝子であることができる。上記特
定のアミノ酸配列や塩基配列に対して、一定の相同性
は、例えば少なくとも７０％以上、好ましくは９０％以
上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％
以上の相同性を有するものであることができる。本発明
はかかる相同性を有する相同物(遺伝子相同物および蛋
白相同物)を包含する。

【００４０】本発明遺伝子には、また「配列番号：１に
示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ
酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（改変さ
れたアミノ酸配列）からなるポリペプチドをコードする
遺伝子」も包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、置
換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変
されたアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号：１で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｋａｉｓ
７蛋白）と同様の生物学的機能を有する同効物であれば
特に制限されず、好ましくは保存的なアミノ酸残基の置
換もしくは十数個のアミノ酸残基の改変、より好ましく
は数個のアミノ酸残基の改変であるのがよい。ここで
「同様の機能」としては、ＡＣＥ活性、特には昇圧活性
またはブラジキニン不活性化活性を例示できる。また、
上記改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコ
ードする遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸
配列のポリペプチドをコードする本発明ｋａｉｓ７遺伝
子が検出できるものであってもよい。

【００４１】本発明のｋａｉｓ７遺伝子の相同物(およ
び該遺伝子産物の相同物)とは、本発明ｋａｉｓ７遺伝
子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、構造
的特徴、遺伝子発現パターンにおける共通性、上記した
ようなその生物学的機能の類似性により、ひとつの遺伝
子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子(およびそ
の発現産物)を意味する。これには本発明ｋａｉｓ７遺
伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。

【００４２】前記アミノ酸配列の改変（変異）のための
人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミ
ュータゲネシス〔Methods in Enzymology,154, 350, 36
7-382 (1987)；同100, 468 (1983)；Nucleic Acids Re
s., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研
究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝
子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイ
ト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc.,89, 4801
(1967)；同91, 3350 (1969)；Science,150, 178(196
8)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)；同24, 245
(1983)〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。よ
り具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法
またはトリエステル法による化学合成によることもで
き、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上
で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、
適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるかまたは
適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い
相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成
物から得ることもできる。

【００４３】本発明遺伝子の具体的態様としては、配列
番号：３に示される塩基配列を有する遺伝子を例示でき
る。この塩基配列中のコーディング領域(配列番号：２
に示す配列)は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列
の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示し
ている。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有
する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコ
ドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能で
ある。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば
利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することがで
きる〔Ncleic Acids Res.,9, 43 (1981)〕。

【００４４】また、本発明遺伝子は、前記のとおり、配
列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する
塩基配列からなるものも包含される。

【００４５】上記相同性は、配列番号：２に示される塩
基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なく
とも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％
の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポ
リヌクレオチドを言う。

【００４６】かかる相同性を有する遺伝子としては、例
えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃ま
たは０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリ
ンジェントな条件下で配列番号：２に示される塩基配列
のＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子
を例示することもできる。

【００４７】本発明遺伝子は、本発明により開示された
本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、
一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得するこ
とができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring H
arbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子
研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参
照〕。

【００４８】具体的には、本発明遺伝子が発現される適
当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調
製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当
なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択すること
により実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 7
8, 6613 (1981)；Science,222, 778 (1983)など〕。

【００４９】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに
由来する培養細胞などが例示される。また、これらから
の全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの
取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実
施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市
販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライ
ブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.In
c.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー
などを用いることもできる。

【００５０】本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーか
らスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の
方法に従うことができる。

【００５１】具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生
される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した
免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローン
を選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合する
プローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コ
ロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せな
どを例示できる。

【００５２】ここで用いられるプローブとしては、本発
明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成
されたＤＮＡなどが一般的に使用でき、既に取得された
本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本
発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プ
ライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング
用プローブとして用いることもできる。

【００５３】前記プローブとして用いられるヌクレオチ
ド配列には、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチド
配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ま
しくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の
連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を
有するものが含まれる。また前記配列を有する陽性クロ
ーンそれ自体もプローブとして用いることができる。

【００５４】本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法
〔Science,230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増
幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長
のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法
〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12
(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohma
n,etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA.,8, 8998 (198
8)〕などの採用が好適である。

【００５５】かかるＰＣＲ法の採用に際して使用される
プライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺
伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に
従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片
の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例え
ばゲル電気泳動法などによればよい。

【００５６】また、上記で得られる本発明遺伝子或いは
各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサ
ム−ギルバート法〔Methods in Enzymology,65, 499 (1
980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンス
キットなどを用いて、その塩基配列を決定することがで
きる。

【００５７】本発明遺伝子の取得についてより具体的に
例示すると、例えば、ヒト組織より、ＲＮＡを単離し、
ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを得た後、オリゴキャッピンプ法(Szuk
i, Y., and Sugano, S., et al.,Gene,200, 149-156(19
97))により完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した後、
ライブラリー中のクローンを市販の自動シーケンサーを
用いて５’ランダムシーケンスによる５’ＥＳＴ(Expre
ssed Sequence tag)解析によって所望の配列を有するク
ローンを特定のプログラム(`PSORT` program,PROTEINS:
Structure, Function, and Genetics,11, 95-110 (199
1) )を使用するコンピュータで選別し、得られたクロー
ンについて全長解析をすることにより成し遂げられる。

【００５８】このようにして得られる本発明遺伝子によ
れば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利
用することにより、個体もしくは各種組織における本発
明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができ
る。

【００５９】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 2
1-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティ
ング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
b. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Re
s., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situハイブリダイゼ
ーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢ
Ａ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, N
ature,350, 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法を挙
げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出
法を挙げることができる。

【００６０】尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用い
られるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的
に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限
はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定する
ことができる。通常プライマーとして１０〜３５程度の
ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度
の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを
挙げることができる。

【００６１】このように、本発明の遺伝子には、本発明
にかかるｋａｉｓ７遺伝子を検出するための特異プライ
マーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮ
Ａ断片もまた包含される。

【００６２】当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示され
る塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとして規定
することできる。ここで、ストリンジェントな条件とし
ては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常
の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例
えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×Ｓ
ＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×Ｓ
ＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。

【００６３】本発明のｋａｉｓ７遺伝子によれば、通常
の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物
（ｋａｉｓ７蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大
量に、安定して製造することができる。

【００６４】従って本発明は、本発明遺伝子によってコ
ードされるアミノ酸配列のポリペプチド(本発明遺伝子
の発現産物)をも提供するものであり、また該ポリペプ
チドの製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベ
クター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、
該宿主細胞を培養して本発明ポリペプチドを製造する方
法などをも提供するものである。

【００６５】本発明ポリペプチドの具体的態様として
は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチ
ド(ｋａｉｓ７蛋白質)を挙げることができるが、本発明
ポリペプチドには該ｋａｉｓ７蛋白質のみならず、その
相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番
号：１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配
列からなり且つｋａｉｓ７蛋白質と同様の機能を有する
ポリペプチド、好ましくは保存的なアミノ酸残基の置換
もしくは十数個のアミノ酸の改変、より好ましくは数個
のアミノ酸の改変されたポリペプチドを挙げることがで
きる。具体的には、ｋａｉｓ７遺伝子の相同物（アレル
体を含むｋａｉｓ７同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げる
ことができる。

【００６６】また、本発明ｋａｉｓ７蛋白質の相同物に
は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチ
ドと同一活性を有する、哺乳動物、例えばウマ、ヒツ
ジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、マウス、
ウサギ、モルモットなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含
される。

【００６７】本発明ポリペプチドは、本発明により提供
される遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換
え技術〔例えばScience,224, 1431 (1984); Biochem. B
iophys. Res. Comm.,130, 692 (1985); Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って
調製することができる。

【００６８】該ポリペプチドの製造は、より詳細には、
該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現で
きる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿
主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、
次いで得られる培養物から回収することにより行われ
る。

【００６９】上記宿主細胞としては、原核生物及び真核
生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の
宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いら
れるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含ま
れるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞に
は、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、
例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1
981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、
サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿
論、これらに限定される訳ではない。

【００７０】原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主
細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガー
ノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン
（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利
用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来の
プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵ
Ｃ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに
限定されず既知の各種のベクターを利用することができ
る。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクター
の市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham P
harmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ
２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２
１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（In
vitrogen社）等を例示できる。

【００７１】脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有する
ものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的に
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２ｄｈｆｒ〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等
が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクター
を用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利
用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥ
ＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮ
Ｄ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invi
trogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢ
ａｃＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（Ph
arMingen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５
−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitr
ogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。

【００７２】また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベ
クターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺
伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示で
きる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰ
ＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen
社）なとが包含される。

【００７３】プロモーターとしても特に限定なく、エッ
シェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトフ
ァン(ｔｒｐ)プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａ
ｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプ
ロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス
属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プ
ロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵
母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐ
Ｈ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロ
モーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用でき
る。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモ
ーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示でき
る。

【００７４】尚、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき
る。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現
させるためのｐＧＥＸ（Promega社）などを例示でき
る。

【００７５】また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿
主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌ
クレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示
でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に
使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒス
チジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(H
A)・タグを例示できる。

【００７６】所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿
主細胞への導入法およびこれによる形質転換法として
は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用すること
ができる。

【００７７】また得られる形質転換体は、常法に従い培
養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によ
りコードされる本発明の目的ポリペプチドが、形質転換
体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄
積、分泌）される。

【００７８】該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００７９】かくして得られる本発明の組換え蛋白質
は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利
用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (198
6); Eur. J. Biochem.,163, 313 (1987)など参照〕によ
り分離、精製できる。

【００８０】該方法としては、具体的には、通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本
発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカ
ラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを
例示することができる。

【００８１】尚、本発明ポリペプチドをコードする所望
の遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるｋ
ａｉｓ７遺伝子の塩基配列を良好に利用することができ
る。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコ
ドンを適宜選択変更して利用することも可能である。

【００８２】また、ｋａｉｓ７遺伝子でコードされるア
ミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしは
アミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場
合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシ
スなどの前記した各種方法によりこれを行うことができ
る。

【００８３】本発明ポリペプチドは、また、配列番号：
１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法に
より製造することができる。該方法には、通常の液相法
および固相法によるペプチド合成法が包含される。

【００８４】かかるペプチド合成法は、より詳しくは、
アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐
次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエ
ロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメン
トを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング
反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包
含し、本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによっ
てもよい。

【００８５】上記ペプチド合成に採用される縮合法も、
常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水
物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰ
Ａ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物
（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法
などを例示できる。

【００８６】これら各方法に利用できる溶媒も、この種
ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている
一般的なものから適宜選択することができる。その例と
しては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミ
ド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸
エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることが
できる。

【００８７】尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応
に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシ
ル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエス
テル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低
級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メ
トキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル
などのアラルキルエステルなどとして保護することがで
きる。

【００８８】また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例
えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル
基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基など
で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要
はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基
は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホ
ニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダ
マンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により
保護することができる。

【００８９】上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドお
よび最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれ
ら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば
接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水
素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻
酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実
施することができる。

【００９０】かくして得られる本発明ポリペプチドは、
前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロ
マトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法
などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、
適宜精製を行うことができる。

【００９１】本発明ポリペプチドは、その特異抗体を作
成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗
原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナ
ル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することがで
きる。

【００９２】該抗体の製造法自体は、当業者によく理解
されているところであり、本発明においてもこれら常法
に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫
生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。

【００９３】かくして得られる抗体（本発明抗体）は、
例えばｋａｉｓ７蛋白質の精製およびその免疫学的手法
による測定ないしは識別などに有利に利用することがで
きる。より具体的には、本発明遺伝子（ポリヌクレオチ
ド）によりコードされるアミノ酸配列と相同性を有する
公知のＡＣＥについては、実験的高血圧ラットにおいて
大動脈壁ＡＣＥｍＲＮＡレベルが上昇すること(Shiota,
N. et al., Hypertension, 20, 168-174 (1992))およ
び圧負荷肥大心において左心室壁ＡＣＥｍＲＮＡが増加
していること(Schunkert, H., et al., J. Clin. Inves
t., 86, 1913-1920(1990))の報告から、上記抗体の利用
によれば、高血圧症や心肥大の診断ないし高血圧症や心
肥大の悪性度の判定を行うことができる。

【００９４】上記で得られる本発明抗体は、また、これ
を有効成分とする医薬品として医薬分野において有用で
ある。従って、本発明は本発明ｋａｉｓ７ポリペプチド
またはその断片に対する抗体または抗体断片を有効成分
とする医薬組成物をも提供するものである。

【００９５】本発明抗体の有用性は、上記したように本
発明遺伝子が腎臓、精巣、小腸において高発現を示すた
め、これに対する特異抗体が、腎臓、精巣、小腸組織お
よびその周囲の血管において、ＡＣＥ活性を抑制する
か、該活性に拮抗するか、または血圧調節に降圧的に働
きかけていることが考えられる。

【００９６】更に、配列番号：１で示されるアミノ酸配
列のポリペプチド(ｋａｉｓ７蛋白質)の配列相同物、即
ち、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において１も
しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたア
ミノ酸配列からなるものであって、ｋａｉｓ７蛋白質と
同様の機能を有しないポリペプチドは、ｋａｉｓ７蛋白
質に拮抗または相反する機能を有するポリペプチドとし
て、上記特異抗体または抗体断片と同様に、ＡＣＥの活
性を抑制するか、該活性に拮抗するか、または血圧調節
に降圧的に働きかける機能を有すると考えられる。

【００９７】従って、本発明は、本発明抗体を有効成分
とする医薬組成物と共に、前記ＡＣＥの活性を抑制する
か、該活性に拮抗するか、または血圧調節に降圧的に働
きかける機能を有するポリペプチドまたはその断片を有
効成分とする医薬組成物をも提供するものである。該医
薬組成物は、降圧剤、心肥大抑制剤として有用である。

【００９８】上記活性は、例えばクシュマンらの方法に
準じて確認することができる（D.W.Cushman, et al., B
iochem. Pharmacol., 20(7), 1637-1648(1971)）。

【００９９】本発明医薬組成物において、有効成分とす
るポリペプチドには、その医薬的に許容される塩もまた
包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により
調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、
カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムな
どの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アン
モニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明
ポリペプチドと適当な有機酸ないし無機酸との反応によ
る無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩
としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸
塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オ
レイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸
塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレー
ト）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク
酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレ
イン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩お
よびナプシレートなどが例示される。

【０１００】上記医薬組成物は、本発明ポリペプチドを
有効成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医
薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。

【０１０１】上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる
医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用さ
れる、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示で
き、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜
選択使用される。

【０１０２】特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋
白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化
剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整
剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。

【０１０３】上記安定化剤としては、例えばヒト血清ア
ルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導
体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤な
どと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有
効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。

【０１０４】上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はな
く例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのい
ずれでもよい。

【０１０５】上記糖としても特に限定はなく、例えばグ
ルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖
類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの
糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖
類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コン
ドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類など及びそ
れらの誘導体などを使用できる。

【０１０６】界面活性剤としても特に限定はなく、イオ
ン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、
例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル
系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリ
ド系などを使用できる。

【０１０７】セルロース誘導体としても特に限定はな
く、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ
エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウムなどを使用できる。

【０１０８】上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り
約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜
１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤
の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ
程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程
度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの
添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度
以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲
とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当
り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。
また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当
り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０
０１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。

【０１０９】本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量
は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００
１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程
度の範囲とするのが適当である。

【０１１０】また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、
例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加する
ことができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン
酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミ
ン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれら
のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）な
どを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示でき
る。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウ
ム、クエン酸などを例示できる。

【０１１１】本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用で
きる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした
後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解
して適当な濃度に調製した後に使用することも可能であ
る。

【０１１２】本発明の医薬製剤の投与単位形態として
は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表
的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒
剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、
乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含ま
れ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、
経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類さ
れ、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製す
ることができる。

【０１１３】例えば、錠剤の形態に成形するに際して
は、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリ
ウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カ
オリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなど
の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロッ
プ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキ
シメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合
剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキ
シメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプ
ロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウ
ム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、
炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ス
テアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ス
テアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制
剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム
などの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸
塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤な
どを使用できる。

【０１１４】更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した
錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィ
ルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ない
しは多層錠とすることもできる。

【０１１５】丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、
硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビア
ゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結
合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用で
きる。

【０１１６】カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有
効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質
ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整さ
れる。

【０１１７】経口投与用液体投与形態は、慣用される不
活性希釈剤、例えば水を含む医薬的に許容される溶液、
エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包
含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませる
ことができ、これらは常法に従い調製される。

【０１１８】非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌
水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調
製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イ
ソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを
使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレ
イン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の
溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存
剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例え
ばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺
菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施で
きる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可
能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調
製することもできる。

【０１１９】坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際
しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコー
ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエス
テル類、ゼラチン及び半合成グリセライドなどを使用で
きる。

【０１２０】ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の
形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色
ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導
体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油
などを使用できる。

【０１２１】経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標
準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。

【０１２２】尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品な
どを含有させることもできる。

【０１２３】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、
液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投
与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸など
の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応
じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、
坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤
は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は
経皮的に局所投与される。

【０１２４】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的に
は、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約
０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ
〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回
に分けて投与することができる。

【０１２５】また、後記実施例において示されるように
本発明遺伝子は、腎臓、精巣および小腸組織において高
発現していることから、本発明ｋａｉｓ７遺伝子の全部
または一部のアンチセンス鎖を包含する任意の遺伝子発
現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら組織にお
いて強制的に発現させれば、血圧調節における昇圧作用
を抑制し、結果として高血圧症や心肥大、動脈硬化症な
どの高血圧合併症の進展を抑制することが可能となると
考えられる。本発明はかかる抗ＡＣＥ活性または抗ブラ
ジキニン不活性化活性を有する遺伝子治療用組成物或い
は遺伝子治療剤、これらのための遺伝子治療用ベクター
および遺伝子治療用細胞をも提供する。

【０１２６】本発明に係わる上記遺伝子治療用組成物或
いは遺伝子治療剤は、本発明遺伝子のアンチセンス鎖を
含有する遺伝子導入用ベクター、または該ベクターによ
り本発明遺伝子のアンチセンス鎖を導入された細胞を有
効成分とする。

【０１２７】本発明遺伝子治療用組成物或いは遺伝子治
療剤は、例えば高血圧症患者の腎臓、精巣および小腸細
胞または患者の血管組織部位にこれを投与することによ
って、これら組織におけるＡＣＥ活性またはブラジキニ
ン不活性化活性を抑制し、あるいはこれら細胞における
ｋａｉｓ７遺伝子の発現量を抑制することができ、かく
して高血圧症の治療を行い得る。

【０１２８】以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。
尚、以下の遺伝子治療法においては、特記しないかぎ
り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝
学および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。
それらの例としては、例えばマニアティス(Maniatis,
T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual
(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r, New York (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et
al.,Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd E
d. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et
al., Current Protocols in Molecular Biology,John W
iley and Sons, New York, New York,(1992))、グロー
バー(Glover,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)
(1985))、アナンド(Anand,Techniquesfor the Analysis
of Complex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリ
ー(Guthrie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology, (Academic Press)(1991))および
フィンク(Fink,et al., Hum. Gene Ther.,3, 11-19(199
2))の記載を挙げることができる。

【０１２９】本発明遺伝子治療法は、例えばｋａｉｓ７
遺伝子が発現する細胞内に、該細胞のｍＲＮＡに対して
相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ｋ
ａｉｓ７遺伝子の発現を抑制することができる前記アン
チセンス医薬組成物を導入して、ＡＣＥ活性を抑制する
かまたはブラジキニン不活性化活性を抑制することによ
り、実施できる。即ち、該治療法によれば、例えばｋａ
ｉｓ７遺伝子を有するＡＣＥ発現細胞本来のｍＲＮＡと
上記アンチセンス医薬組成物を結合させるかあるいはＤ
ＮＡ二重螺旋の間に上記組成物を入り込ませて三重鎖を
形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害
させ、かくして標的とする遺伝子の発現を抑制すること
ができる。そのためには、遺伝子のｍＲＮＡと相補的な
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチ
センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する。か
かるｋａｉｓ７遺伝子の発現機能を抑制する作用を細胞
に供給すれば、受容細胞／標的細胞におけるＡＣＥ活性
またはブラジキニン不活性化活性を抑制することができ
る。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの標的細胞
への供給は、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含
有するベクターまたはプラスミドを、目的細胞の染色体
外に維持することにより実施できる。

【０１３０】上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを
用いた高血圧症の遺伝子治療によれば、レトロウイル
ス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチ
センス・オリゴヌクレオチドを組込み、これをＡＣＥ活
性発現細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオ
チドを過剰発現させることにより、所望の降圧効果を得
ることができる。

【０１３１】このようにｋａｉｓ７遺伝子を有する細胞
にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してｋａｉ
ｓ７蛋白質の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス
・オリゴヌクレオチドは、対応するｋａｉｓ７遺伝子の
全長に対応するものである必要はなく、例えば該ｋａｉ
ｓ７遺伝子の発現機能を抑制する機能を保持する限りに
おいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を
保持した一部配列からなるものであってもよい。

【０１３２】かかる組換えおよび染色体外維持の双方の
ための、所望遺伝子を導入すべきベクターは、当該分野
において既に知られており、本発明ではかかる既知のベ
クターのいずれも使用できる。該ベクターとしては、例
えば発現制御エレメントに連結したｋａｉｓ７遺伝子の
アンチセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み且つ
目的細胞内で当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを
発現できる、ウイルスベクターまたはプラスミドベクタ
ーを挙げることができる。かかるベクターは、前述した
本発明遺伝子の発現用ベクターそのものであってもよ
く、また、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２
５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０
７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７
Ａ、ｐＷＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ
−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／
ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて調製されたベク
ターであってもよく、後者が好適である。より好ましい
ベクターとしては、後述する各種ウイルス・ベクターを
挙げることができる。

【０１３３】なお、遺伝子導入治療において用いられる
ベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患
の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用す
ることができる。その具体例は、次の通りである。

【０１３４】即ち、例えば、肝臓に対しては、アルブミ
ン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、
トランスフェリン、トランススチレンなどを例示でき
る。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カ
ルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮およ
び胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイト
クロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、
１７α−ヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス
遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。
***に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カ
ゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示で
きる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンな
どを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチ
ン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示で
きる。脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟ア
ストロサイト特異蛋白質、ミエリン、チロシンヒドロキ
シラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島
アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対
しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示でき
る。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシ
ン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓
に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォ
ターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、ア
ミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。

【０１３５】なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導
入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス
・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子配列に対応す
る相補配列全部または一部）は、本発明のｋａｉｓ７遺
伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺
伝子工学的手法により容易に製造・取得することができ
る。

【０１３６】かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド
導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポ
レーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導
入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野
において既に知られている各種の方法に従って行うこと
ができる。なお、ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単
離状態でＡＣＥ活性またはブラジキニン不活性化活性を
抑制するための医薬品としてや、治療研究のためのモデ
ル系として利用することも可能である。

【０１３７】遺伝子治療において、上記アンチセンス・
オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とす
る組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与すること
により標的細胞内に導入することができる。この際全身
的投与によれば、ＡＣＥｍＲＮＡが発現し得るいずれの
細胞にも上記ベクターを到達させることができる。形質
導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取
り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すこと
ができる。

【０１３８】本発明の遺伝子治療法は、前述するアンチ
センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを直接体内
に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より
一旦標的とする細胞を取り出し、体外で上記遺伝子（ベ
クター）を導入し、その後、該細胞を体内に戻すエクス
ビボ（ex vivo）法の両者を包含する。またｋａｉｓ７
のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導
入して、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイム
による遺伝子治療も可能である。

【０１３９】後述する、本発明ｋａｉｓ７遺伝子に対応
する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部もし
くはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該
ベクターによりヒトｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・
オリゴヌクレオチドが導入された細胞を有効成分とする
本発明遺伝子治療剤は、特に高血圧症をその利用対象と
するものであるが、該高血圧症以外にも、例えば心肥
大、心筋梗塞、動脈硬化症のような高血圧合併症の治療
や、遺伝子標識をも目的として行うことができる。

【０１４０】また、アンチセンス・オリゴヌクレオチド
を導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象によ
り適宜選択することができる。その例としては、標的細
胞としてＡＣＥ発現が認められる細胞、特に腎細胞、腎
臓、精巣、小腸組織以外に、例えばリンパ球、線維芽細
胞、肝細胞、造血幹細胞などの如き細胞を挙げることが
できる。

【０１４１】上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オ
リゴヌクレオチドの導入方法には、ウイルス的導入方法
および非ウイルス的導入方法が含まれる。

【０１４２】ウイルス的導入方法としては、ｋａｉｓ７
遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞
に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターと
してレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げること
ができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノ
ウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiencyvi
rus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡ
Ｖ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベク
ター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよび
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr v
irus）ベクターなどが挙げられる。

【０１４３】非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、
リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソーム
と予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイ
ルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と
直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソ
ーム法〔Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 220
71-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートし
て高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する
方法〔Yang, N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接イン
ビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮ
Ａ法〔Wolff, J. A., et al., Science,247, 1465-1467
(1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子
を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国
夫, 医学のあゆみ, Vol.175, No.9,635-637 (1995)〕；
特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないよ
うにするために、目的とする細胞に発現するレセプター
に結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与す
るリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis, et al.,Trend
s Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller, et al., FAS
EB J., 9, 190 (1995)〕などを使用することができる。

【０１４４】上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例え
ば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲ
ットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法
〔Wu, et al., J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991); F
erkol, et al., FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕や、
腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプ
ターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用
いる方法〔Wagner etal., Proc. Natl. Acad. Sci., US
A.,87,3410 (1990)〕などが含まれる。

【０１４５】また本発明で用いられる遺伝子導入法は、
上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入
法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる
方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡを
アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン
抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれ
ば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合
し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させる
ことにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの
導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクタ
ーにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的
な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。
また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボ
にて遺伝子導入を媒介できる。

【０１４６】以下、具体的な本発明のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並び
に標的細胞または標的組織へのアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド導入法について述べる。

【０１４７】レトロウイルスベクター・システムは、ウ
イルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）
からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイル
スの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白
質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）な
どの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成
していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パ
ッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeat
s)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏ
ｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケー
ジング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際に
タグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とク
ローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス
・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７に対応する全アンチ
センス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイル
ス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス
粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケ
ージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとる
ことと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすること
が重要である。

【０１４８】所望のｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・
オリゴヌクレオチドを組込んだベクターＤＮＡをヘルパ
ー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作って
いるウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡが
パッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌され
る。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞
に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写された
ＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入された
アンチセンス遺伝子が発現する。

【０１４９】尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法
として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリ
ン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法
〔Hanenberg, H., et al., Exp. Hemat., 23, 747 (199
5)〕を採用することもできる。上記レトロウイルスベク
ター・システムにおいて用いられるベクターとしては、
例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイ
ルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. R
es. Molec. Biol.,38, 91-135 (1990)〕を例示すること
ができる。

【０１５０】アデノウイルスベクターを利用する方法に
つき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、
バークネル〔Berkner, K.L., Curr. Topics Microbiol.
Immunol.,158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setog
uchi, Y., et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、
鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12, 28-34 (1994)〕及びケナ
ーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,9
1,6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができ
る。

【０１５１】例えば、非増殖性アデノウイルスベクター
を作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ
１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目
的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入用
アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ち本発明ｋａｉ
ｓ７遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、その
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプ
ロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリ
Ａから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部
を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを
含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトラン
スフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こ
させて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することによ
り、所望のｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチドを包含する本発明ベクターである非増殖性ア
デノウイルスベクターを作成することができる。また、
コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み
込んで、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベ
クターを作成することもできる。更に組換えアデノウイ
ルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能で
ある。

【０１５２】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの
製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養
系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。こ
れには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず
宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘ
ルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存
在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の
細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲ
ノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからな
り、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal
repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在してい
る。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマー
の役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや
宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必
須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの
左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調
節蛋白質のＲｅｐをコードしている。

【０１５３】組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、か
くして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この
方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の
両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７アンチセンス・オ
リゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベク
タープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウ
イルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別
のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間
には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換
えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要が
ある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へ
のトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパー
ウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場
合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖
性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組
換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して
回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失
活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠
心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のように
して所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることがで
きる。

【０１５４】ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの
方法に準じて行うことができる〔清水則夫、細胞工学,
14(3), 280-287 (1995)〕。

【０１５５】本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢ
ウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエ
プスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リ
ンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属す
るウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Vir
ology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.188
9-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活
性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、
このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しな
ければならない。これは次の如くして実施できる。

【０１５６】即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む
標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そ
こに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込
み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当
な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベ
クターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクト
する。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面
免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生
型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ
陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選
択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組
換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ること
ができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞に
ウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の
組換えウイルスベクターを産生することができる。

【０１５７】組換えウイルスベクターを用いることなく
所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に
導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合
リポソームによる遺伝子導入法により実施することがで
きる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）
に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソー
ムの内容物を直接細胞内に導入する方法である。

【０１５８】上記膜融合リポソームによるアンチセンス
・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法に
よって行うことができる〔Nakanishi, M., et al., Ex
p. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M.,
et al., Gene introductioninto animal tissues. In
Trends and Future Perspectives in Peptide and Prot
ein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harw
ood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.
337-349〕。

【０１５９】以下、該膜融合リポソームによるアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドの導入につき概略する。即
ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと
所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質
などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合
させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由
来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパ
イクがある疑似またイルスともよばれる構造を有してい
る。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培
養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃
で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容
物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌク
レオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームと
して用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレス
テロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質
で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用
するのが好ましい。

【０１６０】また、別のリポソームを用いてアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法とし
ては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・
オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方
法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi, K., et
al., B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕。この方法
は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目し
て、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気
によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互
作用を高めようとするものである。ここで用いられるリ
ポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム
（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であ
るが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar ve
sicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small un
ilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドと
の複合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレ
オチドを導入することも可能である。

【０１６１】プラスミト包埋カチオニックＭＬＶの調製
法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-
(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate
chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholin
e）およびＤＯＰＥ（dioleoylphosphatidylethanolamin
e）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホル
ム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総
量１μモルの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリ
ーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄
膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去
し、乾燥させる。次いで２０μgの遺伝子導入用プラス
ミドを含む０．５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食
塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分
間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチ
センス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋
カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。

【０１６２】上記で得られたプラスミド包埋カチオニッ
クＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、
例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組
み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤ
ＮＡ量として０．６μg、リポソーム脂質量として３０
ナノモルになるように包埋し、これを２μlのリン酸緩
衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞ま
たは患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。

【０１６３】ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を
目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒト
の体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義さ
れている。しかしながら、本発明における遺伝子治療と
は、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞
にｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドをＡＣＥ発現抑制アンチセンスＤＮＡとして導入する
ことによって、高血圧症を始めとする各種疾患の治療の
みならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝
子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むもの
とする。

【０１６４】本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子
の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的に
は２種類の方法が含まれる。

【０１６５】その第１法は、治療対象とする患者から標
的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロ
イキン−２(ＩＬ−２)などを添加して培養し、レトロウ
イルスベクターに含まれる目的とするｋａｉｓ７遺伝子
のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入した後、得
られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方
法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する
遺伝子病や動脈硬化症、癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適
とされている。

【０１６６】第２法は、目的とするアンチセンス・オリ
ゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド）を直接患者の体内や腎臓、精巣、小
腸組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直
接法)である。

【０１６７】上記遺伝子治療の第１法は、より詳しく
は、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から
採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取
し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地など
の適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチ
センス・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアン
チセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するベクターを
加える。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入効率
をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、
２５００回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸
ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回
繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地な
どで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細
胞数を算定し、アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入
効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が、本
発明のようにＡＣＥ活性やブラジキニン不活性化活性で
あれば、その活性の程度を測定することにより、目的ア
ンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認する。

【０１６８】また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイ
コプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの
安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測さ
れる効果用量のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ｋ
ａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）
が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。か
かる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返するこ
とにより遺伝子治療が施される。

【０１６９】ここでウイルスベクターの投与量は、導入
する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価
として、例えば標的細胞１×１０⁸細胞に対して１×１
０³ｃｆｕから１×１０⁸ｃｆｕの範囲となる投与量を採
用することが好ましい。

【０１７０】上記第１法の別法として、目的アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルス
ベクターを含有するウイルス産生細胞と、例えば患者の
細胞とを共培養して、目的とする細胞にアンチセンス・
オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス
・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を採用すること
もできる。

【０１７１】遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当
たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子
導入法によって、実際に目的アンチセンス・オリゴヌク
レオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝
子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法に
よって確認するか、あるいは目的アンチセンス・オリゴ
ヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセンス・オリ
ゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である
特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制など
を確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを
用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣ
Ｒ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは
膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどによ
り、遺伝子治療に際してアンチセンス・オリゴヌクレオ
チド導入による安全性を確認することが重要であること
はいうまでもない。

【０１７２】本発明遺伝子治療法において、特に高血圧
症や高血圧合併症を対象とする場合は、患者から例えば
腎細胞(ＡＣＥ発現細胞)を採取後、酵素処理などを施し
て培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所
望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする腎
細胞(ＡＣＥ発現細胞)に導入し、Ｇ４１８細胞にてスク
リーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in
vivo)し、次いで放射線処理を施行し、患者腎臓、精
巣、小腸内または傍腎臓、精巣、小腸にアンチセンス・
オリゴヌクレオチド導入細胞を接種する高血圧症および
その合併症治療法を一例として挙げることができる。

【０１７３】本発明はまた、本発明のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ｋａｉｓ７遺伝子のアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドど）が導入された細胞を活性
成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体
ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製
剤（遺伝子治療剤）を提供する。

【０１７４】本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用で
きる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使
用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例
示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて
適宜選択使用できる。

【０１７５】本発明医薬製剤の投与単位形態としては、
前記したｋａｉｓ７蛋白質抗体製剤の製剤例で例示した
ものと同様のものを挙げることができ、治療目的に応じ
て各種の形態から適宜選択することができる。

【０１７６】例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクタ
ーをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチ
センス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイル
スベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞
の形態に調製される。

【０１７７】これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ
７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合
した形態などに調製することもでき、またプロタミンな
どの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるよう
な形態に調製することもできる。

【０１７８】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。

【０１７９】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。

【０１８０】一般には、医薬製剤としての所望アンチセ
ンス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクター
の投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウ
イルスの力価として約１×１０³ｐｆｕから１×１０¹⁵
ｐｆｕ程度とするのがよい。

【０１８１】また所望の導入用アンチセンス・オリゴヌ
クレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０⁴細胞
／bodyから１×１０¹⁵細胞／body程度の範囲から選ばれ
るのが適当である。

【０１８２】該製剤は１日に１回または数回に分けて投
与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与す
ることもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝
子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投
与することができる。

【０１８３】本発明に従う遺伝子治療を高血圧症の治療
に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組
合せて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺
伝子治療に、従来の降圧療法、食事療法などを組合せて
行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安
全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施
することができる〔Recombinant DNA Advisory Committ
ee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。

【０１８４】本発明によれば、細胞のＡＣＥ活性を促す
ｋａｉｓ７遺伝子の存在を検出するために、血液または
血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を
抽出し、ｋａｉｓ７の感受性遺伝子が存在する否かにつ
いて分析することが可能である。また、本発明によれば
細胞または組織におけるＡＣＥ活性レベル、ＡＣＥｍＲ
ＮＡの発現レベル、血圧調節機能障害への進行または予
後指標としての存在を検出するために、血圧調節障害を
有する生物学的な試料を調製し、ｋａｉｓ７遺伝子が存
在するか否かあるいはそのｍＲＮＡの量について分析で
きる。この方法を用いることにより細胞または組織にお
けるＡＣＥ活性のレベル、ＡＣＥｍＲＮＡの発現レベ
ル、血圧調節機能障害への進行または予後指標としての
存在を検出することが可能となり、これらの診断、例え
ば高血圧症の診断並びに高血圧症治療効果の判定並びに
予後の予測が可能となる。

【０１８５】該検出方法は、例えば、予めＡＣＥ活性を
有する患者サンプルから得られたｋａｉｓ７遺伝子に関
する情報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ｋａｉｓ７遺
伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いら
れるように設計される。より具体的には、例えばプラー
クハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼー
ション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などに
おけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列を
ポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により、増幅したｋａｉｓ７の全部または一部のＤ
ＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性
質を有するものを作成できる。そのためにはまずｋａｉ
ｓ７と同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニ
ング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）
と反応させることにより、当該ｋａｉｓ７配列を有する
遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、
標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、
制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製
してもよい。

【０１８６】前記スクリーニング方法としては、特にＰ
ＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、
ｋａｉｓ７断片をプライマーとして用いる方法であれば
とくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 135
0-1354 (1985))や新たに開発された、或いは将来使用さ
れるＰＣＲ変法(榊佳之、ほか編、羊土社、実験医学、
増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共
立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが
可能である。

【０１８７】プライマーとして使用されるＤＮＡ断片
は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤ
ＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合
成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus:ファルマシ
ア社製)を使用して合成することができる。合成される
プライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプラ
イマー)の長さは約１０〜５０ヌクレオチド程度が好ま
しく、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度が例
示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブ
は、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であっ
てもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの
特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並び
にプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の
技術分野で知られており、ニック・トランスレーショ
ン、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のよ
うな、既知の方法によって取り込ませることができる放
射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗
体などがこれらの技術に包含される。

【０１８８】検出のために用いるＰＣＲ法としては、例
えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いら
れる種々の変法を適応することができる。

【０１８９】また、本発明の測定方法は、試料中のｋａ
ｉｓ７遺伝子の検出のための試薬キットを利用すること
によって、簡便に実施することができる。

【０１９０】故に本発明は上記ｋａｉｓ７ＤＮＡ断片を
含有することを特徴とするｋａｉｓ７の検出用試薬キッ
トが提供される。

【０１９１】該試薬キットは、少なくとも配列番号：２
に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部
または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成
成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、Ｐ
ＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）
が含まれていてもよい。

【０１９２】標識剤としては、放射性同位元素または蛍
光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ
断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていても
よい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のた
めに適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反
応停止液などが含まれていてもよい。

【０１９３】更に本発明は、前記測定方法を用いる癌の
診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キッ
トをも提供するものである。

【０１９４】また、前記方法を用いることにより、被検
試料中から得られたｋａｉｓ７配列を直接的若しくは間
接的に配列決定することにより、野生型ｋａｉｓ７と相
同性の高い相同物である新たなｋａｉｓ７遺伝子に関連
する関連遺伝子を見出すことができる。

【０１９５】従って、本発明はかかる測定と被検試料中
のｋａｉｓ７ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒ
トｋａｉｓ７遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニ
ング方法をも提供するものである。

【０１９６】また、本発明の配列番号：１で示されるヒ
トｋａｉｓ７遺伝子でコードされるポリペプチドまたは
該配列番号：１において、１もしくは数個及至複数のア
ミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、ま
たはこれらの断片からポリペプチドを合成し、もしくは
該ポリペプチドに対する抗体を合成することによって、
野生型ｋａｉｓ７および／または変異ｋａｉｓ７の測定
が可能となる。

【０１９７】従って、本発明は、野生型ｋａｉｓ７およ
び／または変異ｋａｉｓ７の抗体測定法、抗原測定法を
提供するものである。該測定法によってＡＣＥ活性の程
度、血圧調節障害の程度、あるいは高血圧症の重症度、
心肥大などの高血圧合併症の程度を野生型ｋａｉｓ７ポ
リペプチドの変化に基づいて検出することも可能であ
る。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によ
るｋａｉｓ７配列分析によっても決定できるが、更に好
ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル
抗体)を用いて、ｋａｉｓ７ポリペプチド中の相違また
はｋａｉｓ７ポリペプチドの有無を検出することができ
る。本発明の測定法の具体的な例示としては、ｋａｉｓ
７抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料
試料含有溶液からｋａｉｓ７蛋白質を免疫沈降し、かつ
ポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたは
イムノブロット上でｋａｉｓ７ポリペプチドと反応する
ことができる。また、ｋａｉｓ７抗体は免疫組織化学的
技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のｋａｉ
ｓ７ポリペプチドを検出することができる。抗体産生技
術および精製する技術は当該分野においてよく知られて
いるので、これらの技術を適宜選択することができる。

【０１９８】野生型ｋａｉｓ７またはその突然変異体を
検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノ
クローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用
いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベント
アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免
疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)
が含まれる。

【０１９９】また、本発明は、ｋａｉｓ７ポリペプチド
に対するｋａｉｓ７結合活性を有する細胞膜画分または
細胞表面上に存在するｋａｉｓ７レセプターをも提供す
ることが可能である。該ｋａｉｓ７レセプターの取得
は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識した
ｋａｉｓ７蛋白をコンジュゲートさせ、ｋａｉｓ７結合
反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を
特定することによって達成され、該ｋａｉｓ７レセプタ
ー・ポリペプチド蛋白の取得並びに配列決定は、この分
野の当業者には容易に達成できる。

【０２００】また本発明は、ｋａｉｓ７レセプター・ポ
リペプチドまたはその結合断片を種々の薬剤のいずれか
をスクリーニングする技術に用いることによって、化合
物(ｋａｉｓ７レセプター反応物：化合物は低分子化合
物、高分子化合物、蛋白質(ポリペプチド)、蛋白質(ポ
リペプチド)部分断片、抗原または抗体など言う)をスク
リーニングすることに利用可能である。好ましくは、ｋ
ａｉｓ７レセプターを利用する。かかるスクリーニング
試験に用いるｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチドまた
はその断片は、固体支持体に付着するかまたは細胞表面
に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。

【０２０１】薬剤スクリーニングの一例としては、例え
ば、ｋａｉｓ７ポリペプチドまたはその断片を発現する
組換えポリペプチドで安定して形質転換した原核生物ま
たは真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッ
セイにおいて利用することができる。また遊離のまたは
固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いる
こともできる。より具体的には、ｋａｉｓ７レセプター
・ポリペプチドまたはその断片と、試験する物質との間
の複合体の形成を測定し、ｋａｉｓ７レセプター・ポリ
ペプチドまたはその断片とｋａｉｓ７ポリペプチドまた
はその断片との間の複合体の形成が試験する物質によっ
て阻害される程度を検出することによって化合物をスク
リーニングすることが可能である。

【０２０２】かくして、本発明は、当該分野で既知の方
法によって、かかる物質とｋａｉｓ７レセプター・ポリ
ペプチドまたはその断片とを接触させ、次いで、該物質
とｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチドまたはその断片
との間の複合体の存在、またはｋａｉｓ７レセプター・
ポリペプチドまたはその断片とリガンドとの間の複合体
の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリ
ーニング方法を提供することができる。さらに、ｋａｉ
ｓ７レセプター活性を測定して、かかる物質がｋａｉｓ
７レセプターを阻害でき、かくして上記定義されたｋａ
ｉｓ７の活性、例えばＡＣＥ活性またはブラジキニン不
活性化活性を調節できるかどうか或いはＡＣＥｍＲＮＡ
の発現量の調節またはモデル動物の血圧の調節ができる
かどうかを判断する。かかる競合結合アッセイにおい
て、より具体的には、ｋａｉｓ７レセプター・ポリペプ
チドまたはその断片を標識する。遊離のｋａｉｓ７レセ
プター・ポリペプチドまたはその断片を、蛋白質：蛋白
質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形
成）標識の量は、各々、試験される因子のｋａｉｓ７レ
セプターに対する結合またはｋａｉｓ７レセプター：ｋ
ａｉｓ７蛋白質結合の阻害の尺度となる。ｋａｉｓ７蛋
白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分
析し、ｋａｉｓ７レセプター阻害活性を有するものを測
定できる。

【０２０３】本発明において、薬剤スクリーニングのた
めの他の方法は、ｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチド
に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのス
クリーニング法であって、該略すると、多数の異なるペ
プチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質
の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド
試験化合物をｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチドと反
応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合
ｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチドを検出する方法も
例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６
４号）。精製されたｋａｉｓ７レセプターは、直接、前
記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被
覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対
する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、ｋａｉｓ７レ
セプター・ポリペプチドを固相上に固定することができ
る。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイ
の使用をも目的とし、ｋａｉｓ７レセプター・ポリペプ
チドまたはその断片に対する結合性につき、ｋａｉｓ７
レセプター・ポリペプチドに特異的に結合できる中和抗
体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によ
って、ｋａｉｓ７レセプター・ポリペプチドの１または
それ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存
在をも検出することが可能である。

【０２０４】また、薬剤スクリーニングに関し、さらな
る方法としては、非機能性ｋａｉｓ７遺伝子を含有する
宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細
胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間
増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化
合物が例えば、ＡＣＥ活性またはブラジキニンの不活性
化を調節する蛋白質と結合したり、解離したりすること
で、結合蛋白の血中並びに組織中の移行を調節したり、
前記の活性そのものを調節できるかどうかを確認する。
増殖速度を測定する１手段として、ｋａｉｓ７レセプタ
ーの生物活性を測定することも可能である。

【０２０５】また本発明によれば、より活性または安定
した形態のｋａｉｓ７ポリペプチド誘導体または例え
ば、イン・ビボ(in vivo)でｋａｉｓ７ポリペプチドの
機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するため
に、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なポリ
ペプチドまたは構造アナログ、例えばｋａｉｓ７アゴニ
スト、ｋａｉｓ７アンタゴニスト、ｋａｉｓ７インヒビ
ターなどを作製することが可能である。前記構造アナロ
グは例えばｋａｉｓ７と他の蛋白質の複合体の三次元構
造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたは、
これらの組み合わせた方法によって決定することができ
る。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性
蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得る
ことも可能である。

【０２０６】また上記より活性または安定した形態のｋ
ａｉｓ７ポリペプチド誘導体を得る方法としては、例え
ばアラニン・スキャンによって分析することが可能であ
る。該方法はアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの
活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各ア
ミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や
安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によ
って、より活性な、または安定なｋａｉｓ７ポリペプチ
ド誘導体を設計することができる。

【０２０７】また機能性アッセイによって選択した標的
−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析する
ことも可能である。原則として、このアプローチによ
り、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmac
ore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗
−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学
的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプ
チドを同定したり単離したりすることが可能である。故
に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると
予測される。

【０２０８】かくして、改善されたｋａｉｓ７活性もし
くは安定性またはｋａｉｓ７活性のインヒビター、アゴ
ニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤
を設計・開発することができる。

【０２０９】クローン化ｋａｉｓ７遺伝子の利用によっ
て、十分な量のｋａｉｓ７ポリペプチドを入手して、Ｘ
線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さら
に、本発明の配列番号：１に示されるアミノ酸配列より
なるｋａｉｓ７ポリペプチドの提供により、Ｘ線結晶学
に代えるかまたはこれに加えてコンピューターモデリン
グ技術に適応可能である。

【０２１０】また本発明によれば、ｋａｉｓ７遺伝子含
有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することに
よってｋａｉｓ７遺伝子配列のどの部位が生体内で上記
したような多様なｋａｉｓ７活性に影響を与えるかどう
か、即ちｋａｉｓ７遺伝子産物、並びに改変ｋａｉｓ７
遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認
することができる。

【０２１１】該方法は、遺伝子の相同組換えを利用し
て、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マ
ウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる
（Capeccchi, M. R., Science,244, 1288-1292 (198
9))。

【０２１２】尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野
の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術
(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土
社)に、ヒト野性型ｋａｉｓ７遺伝子および変異ｋａｉ
ｓ７遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。
従って前記技術の適応により、改善されたｋａｉｓ７活
性もしくは安定性またはｋａｉｓ７活性のインヒビタ
ー、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有
する薬剤を設計・開発することができる。

【０２１３】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト精巣型ＡＣＥ、ヒ
ト体細胞型ＡＣＥ、マウス精巣型ＡＣＥ、マウス体細胞
型ＡＣＥ、ラット精巣型ＡＣＥ、ラット体細胞型、ニワ
トリＡＣＥ、ウサギ精巣型ＡＣＥ、ウサギ体細胞型と相
同性を有する新規なヒト蛋白質相同物をコードするＡＣ
Ｅ類似遺伝子が提供される。

【０２１４】本発明遺伝子は腎臓、精巣、小腸において
その発現が高く、これら組織およびその周辺組織におけ
るＡＣＥ活性またはブラジキニン不活性化活性を促進す
ると考えられることから、血圧調節に対して昇圧的に作
用すると考えられ、本発明ｋａｉｓ７遺伝子の発現量や
ＡＣＥ活性などを解析することにより、関連遺伝子の機
能と各種疾患との係わりについての研究に利用でき、特
に高血圧症患者への遺伝子診断並びに該遺伝子の発現産
物に対する抗体やアンチセンスによる医薬用途への応用
研究に用いることが可能である。

【０２１５】また、本発明遺伝子の利用によれば、各種
組織での該遺伝子の発現状況が調べられ、生体内におけ
るその機能を解析することが可能となる。

【０２１６】また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコー
ドするｋａｉｓ７ポリペプチドを遺伝子工学的に大量に
製造することができ、該ポリペプチドの提供によれば、
ｋａｉｓ７ポリペプチド活性やｋａｉｓ７ポリペプチド
の結合活性などの機能を調べることもできる。

【０２１７】またｋａｉｓ７ポリペプチドは、ｋａｉｓ
７遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、ＡＣ
Ｅ活性またはブラジキニン不活性化活性に関連する疾患
または血圧調節に関連する疾患など、特に高血圧症や心
肥大などの高血圧合併症）の病態解明や診断、治療など
に有用である。

【０２１８】本発明によれば、更にｋａｉｓ７アンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用
な遺伝子導入用ベクター、該ｋａｉｓ７がアンチセンス
・オリゴヌクレオチド導入された細胞および該ベクター
または細胞を有効成分とする遺伝子治療剤並びにその利
用による遺伝子治療法などが提供される。

【０２１９】本発明によれば、更に各種細胞におけるＡ
ＣＥｍＲＮＡの発現の抑制作用を有し、該作用による高
血圧症および高血圧合併症などの疾患および病態の処置
などに使用されるｋａｉｓ７をアンチセンス・オリゴヌ
クレオチドまたはｋａｉｓ７に結合性を有する抗体また
はその断片を有効成分とする医薬も提供することができ
る。

【０２２０】

【実施例】以下の本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。本発明はこれに限定されるものではない。

【０２２１】

【実施例１】(1-1) ヒト正常回腸完全長ｃＤＮＡライブ
ラリーからクローンの単離ヒト正常回腸組織２ｇから、アイソジェン(Isogen:日本
ジーン社製)を用いて全ＲＮＡ２ｍｇを単離し、オリゴ
テックス−ｄＴ３０スーパー(oligotex-dT30 super:第
一薬品社製)を用いてポリ(Ａ)⁺ＲＮＡ−ｄＴ３０を精製
した。５０μｇのポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを用いてオリゴキャ
ッピング法（Szuki Y, and Sugano S, etal., Gene,200
(1997) 149-156）により完全長ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。

【０２２２】即ち、ヒト正常回腸組織２ｇから、アイソ
ジェンを用いて全ＲＮＡ２ｍｇを単離し、オリゴテック
ス−ｄＴ３０スーパーを用いてポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを精製
した。

【０２２３】オリゴ−キャッピィングは、丸山と菅野の
方法(Maruyama,K. and Sugano, S.,Gene,138, 171-174
(1994))をいくらか修飾して実施した。即ち、ポリ(Ａ)⁺
ＲＮＡの５０μｇを、全量１００μｌの１００ｍＭトリ
ス−塩酸(pH8.0、100単位のRNasin(プロメガ社製)、５
ｍＭの２−メルカプトエタノール、１．２単位のアルカ
リ・フォスファターゼ(BAP:タカラ社製))にて３７℃で
４０分間処理した。

【０２２４】フェノール：クロロホルム(１：１)で２回
抽出した後、エタノールで沈殿させた。１００μｌの５
０ｍＭ酢酸ナトリウム(ｐＨ５．５)中に１ｍＭＥＤＴ
Ａ、１００単位のＲＮａｓｉｎ、５ｍＭの２−メルカプ
トエタノール、２０単位のタバコ酸性ピロホスファター
ゼ(ＴＡＰ)(Maruyama,K. and Sugano, S., Gene, 138,1
71-174(1994))で、３７℃、４０分間処理した。

【０２２５】フェノール：クロロホルム(１：１)で抽
出、エタノールで沈殿させた後、２〜４μｇのＢＡＰ−
ＴＡＰ処理したポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを１００μｌの５０ｍ
Ｍトリス−塩酸(ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭ
２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＡＴＰ、１００
単位のＲＮａｓｉｎと２５％ＰＥＧ８０００を含む)
中、２５０単位のＲＮＡリガーゼ(タカラ社製)、０．４
μｇの５’−オリゴヌクレオチド（配列番号：４に示す
塩基配列を有するもの、自動合成機により合成）で、２
０℃、３時間ライゲートした。

【０２２６】次いで、未反応の５’−オリゴヌクレオチ
ド（配列番号：４）を取り除いた後、ｃＤＮＡをＲＮａ
ｓｅＨフリー逆転写酵素(Superscript II,ギブコBRL社
製)で合成した。１０ピコモルのｄＴアダプター−プラ
イマー(配列番号：５に示す塩基配列、自動合成機によ
り合成)を、２０μｇのオリゴ -キャプドポリ(Ａ)⁺ＲＮ
Ａに対して使用した。反応条件は、４２℃で１時間のイ
ンキュベーションとした。

【０２２７】一本鎖ＤＮＡの合成の後、インキュベーシ
ョンにより、６５℃で１時間、１５ｍＭＮａＯＨ処理す
ることによりＲＮＡを分解させた。１μｇのオリゴ -キ
ャップドポリ(Ａ)⁺ＲＮＡから作られたｃＤＮＡを、１
６ピコモルの５’−ＰＣＲプライマー（配列番号：６に
示す塩基配列、自動合成機により合成）および３’−Ｐ
ＣＲプライマー（配列番号：７に示す塩基配列、自動合
成機により合成）を持つＸＬＰＣＲキット(パーキン・エ
ルマー社製)を使用し、１００μｌの容量において増幅
させた。

【０２２８】ｄＴアダプター・プライマー・プライムド
ｃＤＮＡに対して、増幅サイクルは、９４℃で１分間、
５８℃で１分間、７２℃で１０分間、１０サイクル行な
った。

【０２２９】ＰＣＲ産物は、フェノール：クロロホルム
(１：１)、エタノール沈殿で抽出し、Ｓｆｔｌで消化
し、Ｓｆｔｌ消化したＰＣＲ産物は、アガロースゲル電
気泳動で分離し、２０００塩基より長い産物を単離し、
上記で作製したＤｒａIII−消化したｐＭＥ１８−ＦＬ
３(Genebank accession No. ABoo9864)の中にｃＤＮＡ
をクローニングした(Sced,B. and Aruffo, A., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,84, 3365-3369 (1987))。

【０２３０】次いで、上記で得られたプラスミドＤＮＡ
をＰＩ−１００ロボットを用いて単離した(クラボウ社
製)。

【０２３１】このようにして得られたｃＤＮＡライブラ
リーのサイズは、全長エンリッチドｃＤＮＡライブラリ
ーに対して約２００００クローン／μｇのポリ(Ａ)⁺Ｒ
ＮＡであった。

【０２３２】このライブラリーから、４０００クローン
についてＡＢＩ３７７自動シーケンサー（ABI社）を用
いて５’ランダムシーケンスを行った。 (1-2) クローンの選別上記(1-1)で得られたデータからＰＳＯＲＴプログラム
（PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 11,
95-110 (1991) , K. Nakai & M. Kanehisa, Genomics1
4, 897-911 (1992) ,K. Nakai & M. Kanehisa, http://
psort.nibb.ac.jp:8800/)を用いて、分泌タンパクシグ
ナルを持つと予測されるクローンを１８クローン選別し
た。 (1-3) ｋａｉｓ７の単離上記(1-2)で選別した１８クローンすべてについて、Ａ
ＢＩ３７７自動シーケンサー（ABI社）を用いてインサ
ートの全長シーケンスを行った。そのひとつに、分泌タ
ンパクシグナルを持つインサートを含むクローンを確認
し、これをkａｉｓ７と命名した。

【０２３３】このものは、配列番号：３に示す塩基配列
の２５９９ヌクレオチドからなり、そのオープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号：２に示される
塩基配列の２４１５ヌクレオチドからなり、該塩基配列
によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１に
示す８０５のアミノ酸残基からなっていた。ＦＡＳＴＡ
プログラム(Person W. R., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 85, 2444-2448 (1988))を使用するＧｅｎ
Ｂａｎｋ／ＥＭＢＬデータ・ベース中のＤＮＡ配列とこ
のヌクレオチドのデータとの比較より、この遺伝子が他
の如何なる公知のＤＮＡ配列とも相同性を有しないこと
が明らかとなった。

【０２３４】一次配列からこの遺伝子の産物（ＡＣＥ類
似蛋白質）は、Ｎ末端１残基目から１７残基までにはシ
グナルペプチド様の配列があり、分泌蛋白であることが
明らかとなった。

【０２３５】上記ｋａｉｓ７遺伝子は、血圧調節作用を
有することが知られているヒト、ラット等の哺乳類のＡ
ＣＥと、それぞれ約４２％のホモロジーを有していた。
更に、配列番号：１に示される塩基配列の７４３から７
５９番目において、膜通過部位を有し、ＡＣＥ活性の中
心配列(亜鉛プロテアーゼ・モチーフ：Zinc Proteasemo
tief)が塩基配列の３７１から３８０番目に認められ
た。

【０２３６】

【実施例２】組織における発現組織におけるｋａｉｓ７の発現プロファイルを調べるた
め、各種のヒト組織を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析を行っ
た。

【０２３７】ＲＴ−ＰＣＲ分析には、すでにｃＤＮＡま
で作製されているヒトＭＴｃＤＮＡパネルＩ（Human Mu
ltile Tissue cDNA Panel I）およびヒトＭＴｃＤＮＡ
パネルII（Human Multile Tissue cDNA Panel II）（い
ずれもクローンテック社製）を用いて解析した。

【０２３８】ＰＣＲ反応は０．４μｇのｃＤＮＡ、１０
μＭ各プライマー、０．８ｍＭｄＮＴＰ及び２．５Ｕの
TａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）を含む５０
μｌ溶液中で行なった。

【０２３９】配列番号：８および配列番号：９として示
す塩基配列のプライマーＰ１およびＰ２を、３０サイク
ルのＰＣＲ増幅のために使用した。

【０２４０】ＰＣＲ産物は、エチジウム・ブロマイト染
色した２．０％アガロースゲル中に溶解させた。

【０２４１】その結果、ｋａｉｓ７に相同する転写体が
腎臓(kidney）、精巣(Testis)及び小腸（Small intesti
ne）において特に強く発現することが確認された。

【０２４２】尚、用いたヒト組織は、心臓（Heart）、
脳（brain）、胎盤（Placenta）、肺（Lung）、肝臓（L
iver）、骨格筋（S. muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓
（Pancreas）、脾臓（Spleen）、胸腺（Thymus）、前立
腺（Prostate）、精巣（Testis）、卵巣（Ovary）、小
腸（Small intestine）、結腸（Colon）及び末梢血白血
球（Peripheral blood leukocyte; P.B.L.）である。

【０２４３】

【実施例３】ＦＩＳＨ染色体の整列のためのＦＩＳＨは、公知の方法(Hirai
M., et al., Genomics,34, pp263-265 (1996))に従っ
て、全長を含んだｃＤＮＡ０．０１μｇをプローブとし
て使用して実施した。

【０２４４】ＦＩＳＨはプロビア１００フィルム（フジ
社製、ＩＳＯ１００）を用いて蛍光顕微鏡BX（オリンパ
ス社）によって捕えられた。

【０２４５】その結果、１００の典型的なＲ−バンド分
裂中期の細胞を試験したシグナルは、Ｘ染色体のｐ２
２．１に局在していた。従って、ｋａｉｓ７の染色体の
局在部位は、Ｘｐ２２．１と同定できた。

【０２４６】上記結果から、ｋａｉｓ７遺伝子は血圧調
節作用を有するＡＣＥと類似的に働く可能性があり、血
圧調節の上昇因子として機能することがこの分野の当業
者であれば予期できる。

【０２４７】

【実施例４】Ｋａｉｓ７遺伝子発現産物の取得（１）オリゴキャッピング法で作製した完全長クローンは、pM
E18発現ベクターに組み込まれているので、これを細胞
に導入することにより簡便にＫａｉｓ７遺伝子発現産物
を得ることができる。

【０２４８】pME18発現ベクター組み込まれたにｋａｉ
ｓ７の全長を含む遺伝子を、リポフェクチン(Lifetechn
ology社）などを使ってＨｅＬａ細胞などのヒト由来細
胞株に対してリポフェクションを行い、ｋａｉｓ７蛋白
質を一過性発現させる。

【０２４９】リポフェクションを行った後、ガラスホモ
ゲナイザーで細胞を破砕する。この、細胞抽出液にはＫ
ａｉｓ７遺伝子発現産物が含まれることが予想される。

【０２５０】

【実施例５】Ｋａｉｓ７遺伝子発現産物の取得（２）１）ＧＳＴ融合Ｋａｉｓ７発現ベクターの作成実施例１で得られたＫａｉｓ７のＤＮＡ配列情報を基に
２つのプライマー(Ｑ１：BamHIサイトを含むようなセン
スプライマーおよびＱ２：EcoRIサイトを含むようなア
ンチセンスプライマー)を作成する。それらの塩基配列
は、配列番号：１０及び１１に示すとおりである。

【０２５１】上記２つのプライマーを使用して、実施例
１に使用された全長シーケンスを含むクローンをテンプ
レートとしてＰＣＲを行う。増幅させたｃＤＮＡをエタ
ノール沈殿させた後、該ｃＤＮＡを制限酵素BamHIとEco
RIとにより切断し、切断された産物をフェノール抽出
し、再度エタノール沈殿させ、原核生物遺伝子融合ベク
ターｐＧＥＸ−２ＴＫベクター(アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製)のBamHI−EcoRI部位に挿入し、
サブ・クローニングする。該融合ベクターは、BamHIとE
coRI切断部位を有し、かくして目的の遺伝子産物と分子
量26000のＧＳＴドメイン(S.japonicum由来)との融合蛋
白を発現する発現ベクターを作成できる。２）Ｋａｉｓ７遺伝子発現産物の取得および精製上記ｐＧＥＸ−２ＴＫベクターを含む大腸菌Ｋ１２株を
一晩培養したものを１／１０の濃度に希釈してアンピシ
リン添加ＬＢ培地中で２時間培養する。そしてこの時点
において発現誘導剤ＩＰＴＧ(イソプロピル-β-チオ・
ガラクトピラノシド)を加えて発現させる。そのうちの
陽性クローンを選択し、挿入される位置が適切であり且
つ配列がクローニングで得られた配列と同一であること
が確認できる。発現誘導した培地を更に５時間培養し、
洗浄のために遠心分離の後、遠心分離した産物をＰＢＳ
(-)で洗浄し、洗浄したペレットを緩衝液に再懸濁さ
せ、氷上で１５分間超音波分解する。細胞分解物を遠心
分離によりペレット化し、上清を取り、アフィニィティ
ー精製のためにグルタチオン-セファロースカラム(アマ
シャム・ファルマシア・バイオテク社製)に供し、該カ
ラムを20-カラム-容量ＰＢＳ(-)にて洗浄する。上記洗
浄カラムをトロンビンで処理し、ゲル濾過をセファクリ
ル-２００カラム(アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製)にかけて、融合蛋白質から目的蛋白質を切り離
して得られた産物を回収し、濃縮されたフラクションを
集める。尚、各組換え蛋白質の発現は、ＧＳＴエピトー
プを認識する抗体を含むキット(アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製)を用いて確認することができ
る。

【０２５２】かくして精製された蛋白質は抗体の精製、
後記実施例５に示すＫａｉｓ７によるＡＣＥ活性測定系
の作成および実施例６に示すＫａｉｓ７に対するリガン
ド、アゴニストまたはアンタゴニストなどをスクリーニ
ングするための試薬としてそれぞれ用いることができ
る。

【０２５３】

【実施例５】Ｋａｉｓ７遺伝子発現産物 (Kais7蛋白
質)のＡＣＥ活性の測定実施例４で得られるＫａｉｓ７遺伝子発現産物(Ｋａｉ
ｓ７蛋白質)のＡＣＥ活性(Ｋａｉｓ７活性)の測定は、
分光光度計を用いて、クシュマンらの方法(Cushman, D.
W. and Cheung,H.S., Biochemical Pharmacology, 20,
1637-1648 (1971))を用いて、次のとおり実施すること
ができる。

【０２５４】即ち、実施例４で得られたＫａｉｓ７蛋白
質の１０ｇを１００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液(pH8.3)に溶解し、４万回転で４０分間遠心分離す
る。このサンプルを、最終濃度１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液、３００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの基質
hippuryl-L-histidyl-L-leucine（バッケム社）（以下
ＨＨＬと略す）からなる０．２５ｍｌの測定混合液に添
加し、３７℃で約３０分間インキュベートする。酵素反
応の終了は０．２５ｍｌの1Ｎの塩酸の添加によって行
う。ＨＨＬから生成された馬尿酸を１．５ｍｌの酢酸エ
チルを加え１５秒間撹拌混合にすることによって抽出す
る。遠心分離の後、酢酸エチル層の１．０ｍｌを別のチ
ューブにとり、１２０℃で３０分間、加熱することによ
って脱水させる。

【０２５５】これを１．０ｍｌの水に再度溶解し、馬尿
酸の生成された量２２８μｍにおけるその吸光度から決
定する。

【０２５６】吸光光度測定のためのＡＣＥ(Ｋａｉｓ７)
の定義とＡＣＥ活性(Ｋａｉｓ７活性)の計算は、1単位
のＡＣＥ活性(Ｋａｉｓ７活性)に対して、標準アッセイ
条件下の３７℃１分におけるＨＨＬからの１μモルの馬
尿酸の生成を触媒している量として定義される。

【０２５７】

【実施例６】ＡＣＥ活性(Ｋａｉｓ７活性)に影響を与
える物質のスクリーニング方法実施例３で作成されたＫａｉｓ７蛋白質を利用するＡＣ
Ｅ活性(Ｋａｉｓ７活性)の測定系は、ＡＣＥ活性(Ｋａ
ｉｓ７活性)に影響を与える化合物(ペプチドまたはペプ
チド化合物融合物)をスクリーニングするためのスクリ
ーニング方法に利用することができる。

【０２５８】該スクリーニング方法については、以下の
通りである。まず、公知の種々の作用メカニズムを有す
る標準酵素抑制剤を任意の濃度範囲(０．１〜１０００
μＭ：０．１、１、１０、１００、１０００)からなる
被検物をプレインキュベーションなしに添加して、実施
例５の測定系において試験する。各被検物は、任意の
(所望の)濃度になるように調製して、Ｋａｉｓ７蛋白質
とプレインキュベーションすることなしに実施例５の測
定系に添加し、２２８μｍにおけるその吸光度を測定す
ることによって得られる。

【０２５９】インキュベーションは、１５０μｇのＫａ
ｉｓ７蛋白質／測定と示された最終濃度の被検物と６０
分間反応させる。被検物を加えないときの値を１００％
として、被検物添加による活性抑制％を測定する。かく
して、コントロールに対して、特定の濃度で抑制を示す
被検物を、本発明Ｋａｉｓ７に対するインヒビターとし
て、特定できる。一方、本測定系においてコントロール
に対して、特定の濃度で高い活性を示す被検物を、本発
明Ｋａｉｓ７に対するアゴニストとして、特定できる。

【０２６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> ACE-like gene (kais7) <130> 1709JP <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 805 <212> PRT <213> Unknown <400> 1 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val 740 745 750 Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg 755 760 765 Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile 770 775 780 Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp 785 790 795 800 Val Gln Thr Ser Phe 805 <210> 2 <211> 2415 <212> DNA <213> Unknown <400> 2 atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60 attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120 tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180 aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240 caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300 cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360 aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420 tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480 aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540 gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600 gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660 cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720 catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780 tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840 ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900 gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960 cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020 aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080 tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140 tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200 catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260 attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320 aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380 tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440 aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500 gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560 taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620 aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680 ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740 gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800 aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860 aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920 tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980 cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040 tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100 gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160 agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220 atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280 atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340 tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400 gttcagacct ccttt 2415 <210> 3 <211> 2599 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> CDS <222> (55)..(2469) <400> 3 tttttagtct agggaaagtc attcagtgga tgtgatcttg gctcacaggg gacg atg 57 Met 1 tca agc tct tcc tgg ctc ctt ctc agc ctt gtt gct gta act gct gct 105 Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala Ala 5 10 15 cag tcc acc att gag gaa cag gcc aag aca ttt ttg gac aag ttt aac 153 Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn 20 25 30 cac gaa gcc gaa gac ctg ttc tat caa agt tca ctt gct tct tgg aat 201 His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn 35 40 45 tat aac acc aat att act gaa gag aat gtc caa aac atg aat aat gct 249 Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala 50 55 60 65 ggg gac aaa tgg tct gcc ttt tta aag gaa cag tcc aca ctt gcc caa 297 Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln 70 75 80 atg tat cca cta caa gaa att cag aat ctc aca gtc aag ctt cag ctg 345 Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu 85 90 95 cag gct ctt cag caa aat ggg tct tca gtg ctc tca gaa gac aag agc 393 Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser 100 105 110 aaa cgg ttg aac aca att cta aat aca atg agc acc atc tac agt act 441 Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr 115 120 125 gga aaa gtt tgt aac cca gat aat cca caa gaa tgc tta tta ctt gaa 489 Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu 130 135 140 145 cca ggt ttg aat gaa ata atg gca aac agt tta gac tac aat gag agg 537 Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg 150 155 160 ctc tgg gct tgg gaa agc tgg aga tct gag gtc ggc aag cag ctg agg 585 Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg 165 170 175 cca tta tat gaa gag tat gtg gtc ttg aaa aat gag atg gca aga gca 633 Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala 180 185 190 aat cat tat gag gac tat ggg gat tat tgg aga gga gac tat gaa gta 681 Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val 195 200 205 aat ggg gta gat ggc tat gac tac agc cgc ggc cag ttg att gaa gat 729 Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp 210 215 220 225 gtg gaa cat acc ttt gaa gag att aaa cca tta tat gaa cat ctt cat 777 Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His 230 235 240 gcc tat gtg agg gca aag ttg atg aat gcc tat cct tcc tat atc agt 825 Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser 245 250 255 cca att gga tgc ctc cct gct cat ttg ctt ggt gat atg tgg ggt aga 873 Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg 260 265 270 ttt tgg aca aat ctg tac tct ttg aca gtt ccc ttt gga cag aaa cca 921 Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro 275 280 285 aac ata gat gtt act gat gca atg gtg gac cag gcc tgg gat gca cag 969 Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln 290 295 300 305 aga ata ttc aag gag gcc gag aag ttc ttt gta tct gtt ggt ctt cct 1017 Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro 310 315 320 aat atg act caa gga ttc tgg gaa aat tcc atg cta acg gac cca gga 1065 Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly 325 330 335 aat gtt cag aaa gca gtc tgc cat ccc aca gct tgg gac ctg ggg aag 1113 Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys 340 345 350 ggc gac ttc agg atc ctt atg tgc aca aag gtg aca atg gac gac ttc 1161 Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe 355 360 365 ctg aca gct cat cat gag atg ggg cat atc cag tat gat atg gca tat 1209 Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr 370 375 380 385 gct gca caa cct ttt ctg cta aga aat gga gct aat gaa gga ttc cat 1257 Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His 390 395 400 gaa gct gtt ggg gaa atc atg tca ctt tct gca gcc aca cct aag cat 1305 Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His 405 410 415 tta aaa tcc att ggt ctt ctg tca ccc gat ttt caa gaa gac aat gaa 1353 Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu 420 425 430 aca gaa ata aac ttc ctg ctc aaa caa gca ctc acg att gtt ggg act 1401 Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr 435 440 445 ctg cca ttt act tac atg tta gag aag tgg agg tgg atg gtc ttt aaa 1449 Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys 450 455 460 465 ggg gaa att ccc aaa gac cag tgg atg aaa aag tgg tgg gag atg aag 1497 Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys 470 475 480 cga gag ata gtt ggg gtg gtg gaa cct gtg ccc cat gat gaa aca tac 1545 Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr 485 490 495 tgt gac ccc gca tct ctg ttc cat gtt tct aat gat tac tca ttc att 1593 Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile 500 505 510 cga tat tac aca agg acc ctt tac caa ttc cag ttt caa gaa gca ctt 1641 Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu 515 520 525 tgt caa gca gct aaa cat gaa ggc cct ctg cac aaa tgt gac atc tca 1689 Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser 530 535 540 545 aac tct aca gaa gct gga cag aaa ctg ttc aat atg ctg agg ctt gga 1737 Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly 550 555 560 aaa tca gaa ccc tgg acc cta gca ttg gaa aat gtt gta gga gca aag 1785 Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys 565 570 575 aac atg aat gta agg cca ctg ctc aac tac ttt gag ccc tta ttt acc 1833 Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr 580 585 590 tgg ctg aaa gac cag aac aag aat tct ttt gtg gga tgg agt acc gac 1881 Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp 595 600 605 tgg agt cca tat gca gac caa agc atc aaa gtg agg ata agc cta aaa 1929 Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys 610 615 620 625 tca gct ctt gga gat aaa gca tat gaa tgg aac gac aat gaa atg tac 1977 Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr 630 635 640 ctg ttc cga tca tct gtt gca tat gct atg agg cag tac ttt tta aaa 2025 Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys 645 650 655 gta aaa aat cag atg att ctt ttt ggg gag gag gat gtg cga gtg gct 2073 Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala 660 665 670 aat ttg aaa cca aga atc tcc ttt aat ttc ttt gtc act gca cct aaa 2121 Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys 675 680 685 aat gtg tct gat atc att cct aga act gaa gtt gaa aag gcc atc agg 2169 Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg 690 695 700 705 atg tcc cgg agc cgt atc aat gat gct ttc cgt ctg aat gac aac agc 2217 Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser 710 715 720 cta gag ttt ctg ggg ata cag cca aca ctt gga cct cct aac cag ccc 2265 Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro 725 730 735 cct gtt tcc ata tgg ctg att gtt ttt gga gtt gtg atg gga gtg ata 2313 Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val Ile 740 745 750 gtg gtt ggc att gtc atc ctg atc ttc act ggg atc aga gat cgg aag 2361 Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg Lys 755 760 765 aag aaa aat aaa gca aga agt gga gaa aat cct tat gcc tcc atc gat 2409 Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile Asp 770 775 780 785 att agc aaa gga gaa aat aat cca gga ttc caa aac act gat gat gtt 2457 Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp Val 790 795 800 cag acc tcc ttt tagaaaaatc tatgtttttc ctcttgaggt gattttgttg 2509 Gln Thr Ser Phe 805 tatgtaaatg ttaatttcat ggtatagaaa atataagatg ataaaagtat cattaaatgt 2569 caaaactatg actctgttca gaaaaaaaaa 2599 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence (5'-oligo primer) <400> 4 agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg 30 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence (dT adaptor primer) <400> 5 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> 5'-PCR primer <400> 6 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> 3'-PCR Primer <400> 7 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Primer P1 <400> 8 ggcttggaaa atcagaaccc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Primer P2 <400> 9 gccaaccact atcactccca 20 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Primer Q1 <400> 10 caggatccat gtcaagctct tcctggctcc tt 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Primer Q2 <400> 11 cagaattcct aaaaggaggt ctgaacatca tc 32

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ４Ｃ０８６ 48/00 ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 9/12 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 9/12 16/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/08 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 37/64 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 BA41 BA61 BA80 CA04 CA11 DA03 DA06 EA04 FA18 GA13 GA18 GA19 HA15 HA17 4B063 QA01 QA07 QA08 QA18 QA19 QQ79 QQ95 QR16 QR24 QR48 QR57 QS05 QX01 4B065 AA26X AA90Y AA93X AB01 AC15 BA05 BD35 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA44 DA39 ZA422 ZC162 ZC172 ZC202 4C085 AA13 AA14 BB22 DD61 DD88 GG01 GG08 GG10 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 ZA42 ZC16 ZC17 ZC20 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA23 EA50 FA74 GA15 GA22 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリ
ヌクレオチドを含む遺伝子：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：
１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の相同性を
持つポリヌクレオチド、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）
のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチ
ド。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオ
チドからなる遺伝子：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列、（ｂ）上記
（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド。
【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド
をコードする遺伝子：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チド、（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もし
くは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ
ノ酸配列からなり且つＡＣＥ活性またはブラジキニン不
活性化活性を有するポリペプチド。
【請求項４】配列番号：２で示される塩基配列である請
求項２に記載の遺伝子。
【請求項５】配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポ
リペプチドをコードする遺伝子。
【請求項６】請求項１または３に記載のアミノ酸配列を
有する遺伝子発現産物。
【請求項７】請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子
を有する組換え体発現ベクター。
【請求項８】請求項７に記載の組換え体発現ベクターを
有する宿主細胞。
【請求項９】配列番号：２で示される塩基配列中の少な
くとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌ
クレオチド。
【請求項１０】配列番号：２で示される塩基配列中の少
なくとも３０の連続するヌクレオチド配列を含む請求項
９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】配列番号：２に記載の塩基配列に対する
アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】少なくとも１５の連続するヌクレオチド
配列を含む請求項１１に記載のアンチセンス鎖オリゴヌ
クレオチド。
【請求項１３】少なくとも３０の連続するヌクレオチド
配列を含む請求項１１に記載のアンチセンス鎖オリゴヌ
クレオチド。
【請求項１４】請求項１１から請求項１３のいずれかに
記載のアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを含むベクタ
ー。
【請求項１５】請求項１１から請求項１３のいずれかに
記載のアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドまたは請求項
１４に記載のアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを含む
ベクターを有効成分として含有する遺伝子治療剤。
【請求項１６】請求項１５に記載のアンチセンス鎖オリ
ゴヌクレオチドまたはアンチセンス鎖オリゴヌクレオチ
ドを含むベクターを有効成分として含有するＡＣＥ阻害
剤またはブラジキニン活性化剤。
【請求項１７】請求項１５に記載のアンチセンス鎖オリ
ゴヌクレオチドまたはアンチセンス鎖オリゴヌクレオチ
ドを含むベクターを有効成分として含有する降圧剤。
【請求項１８】配列番号：２に記載の塩基配列に対する
センス鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】配列番号：２で示される塩基配列中の少
なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴ
ヌクレオチド・プローブ。
【請求項２０】配列番号：２で示される塩基配列中の少
なくとも３０の連続するヌクレオチド配列を含む請求項
１９に記載のオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項２１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列の蛋白質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配
列からなり且つＡＣＥ活性又はブラジキニン不活性化活
性を有する蛋白質。
【請求項２２】請求項２１に記載の蛋白質を有効成分と
する降圧剤。
【請求項２３】請求項１から３のいずれかに記載の遺伝
子または請求項６に記載の遺伝子発現産物を有効成分と
する降圧剤。
【請求項２４】検体中の請求項１から３のいずれかに記
載の遺伝子の量または請求項６に記載の遺伝子発現産物
の量を測定する高血圧症の遺伝子診断方法。
【請求項２５】請求項１から３のいずれに記載の遺伝子
の相同物であって、イヌ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、
ネコ、マウス、ラットおよびモルモットから選ばれる哺
乳動物の相同物。
【請求項２６】請求項６に記載の遺伝子の発現産物に結
合性を有する抗体およびその断片。
【請求項２７】請求項２６に記載の抗体およびその断片
を用いる高血圧診断方法。
【請求項２８】請求項２６に記載の抗体およびその断片
を有効成分とする降圧剤。