JP4147058B2 - 精神***病診断剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、精神***病患者の末梢血中に高発現しているプレクストリン遺伝子を用いた精神***病の遺伝子診断、精神***病の診断剤及び診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物の遺伝情報は、細胞の核内に存在するＡ、Ｃ、ＧおよびＴの４種の塩基の配列(ＤＮＡ)として蓄積され、この遺伝情報は個々の生物の系統維持と個体発生のために保存されている。ヒトの場合、その塩基数は約３０億(３×１０9)といわれ、その中に５〜１０万の遺伝子があると推測されている。これらの遺伝情報は遺伝子(ＤＮＡ)からｍＲＮＡが転写され、次に蛋白質に翻訳されるという流れに沿い、調節蛋白質、構造蛋白質あるいは酵素が作られ、生命現象を維持している。上記遺伝子から蛋白質翻訳までの流れの異常は、細胞の増殖・分化などの生命維持システムの異常を惹起し、各種疾患の原因となるとされている。これまでの遺伝子解析の結果から、Ｇ蛋白結合受容体、インスリン受容体やＬＤＬ受容体、５−ＨＴ受容体、ドーパミン受容体などの各種受容体や細胞の増殖・分化に関わるもの；チロシンキナーゼ、ヒスチジンキナーゼ、アルギニンキナーゼ、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、スーパーオキシドディスムターゼ、ヒスチジンキナーゼ、ｐ４５０のような代謝酵素などの疾患の診断や医薬品開発にとって有用な化合物のスクリーニングのための素材となると思われる遺伝子が多く見つかっている。
【０００３】
特に精神***病、双極性／単極性障害などの神経性障害に係わる遺伝子として、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３(特開平１１−２５３１８３号)、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４(２０００−９３１８６号)、Ｗｎｔ−４(特開平１１−７５８７２号)、Ｗｎｔ−６(２０００−６０５７５号)などの遺伝子が近年見つかっている。 ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ−３は８ｐ１２−ｐ２１にマップされ、ほとんど脳および中枢神経系でのみ発現している。ケンデラー(Kendler, et al.,Am. J. Psychiatry.153(12):1534-1540, 1996))は、精神***病と２６５アイルランド人ファミリーの８ｐ２１との間に非常に顕著な関連を見出している。
【０００４】
しかしながら、ヒト遺伝子の解析とそれら解析された遺伝子の機能および解析遺伝子と各種疾患との係わりについての研究は、まだ始まったばかりであり、特に精神神経領域において特に不明な点が多く、更なるこの領域における新しい遺伝子の解析、それらの遺伝子の機能の解析、解析された遺伝子と疾患の係わりの研究、惹いては解析された遺伝子の利用による脳・神経領域の遺伝子診断、該遺伝子の脳・神経領域にかかる医薬用途への応用研究などが当業界で望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、精神***病に関連する遺伝子を利用した精神***病の検出および診断剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、現在GenBank（ACCESSION：X07743）に登録されているプレクストリン遺伝子が精神***病と密接な関係にあり、精神***病患者の血液中に高発現していること、そしてこれらの疾患の診断に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、該オリゴヌクレオチドと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも３０の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、該オリゴヌクレオチドと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【０００９】
本発明はまた、上記の精神***病患者体液又は組織の検出方法において、ＲＴ−ＰＣＲ法又は競合的ＰＣＲ法を用いることを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
さらに本発明は、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、該オリゴヌクレオチド・プライマーと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【００１０】
さらに本発明は、上記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・プライマーを含有する精神***病診断剤を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に結合する抗体又はその断片を用いて、該抗体又はその断片に結合する体液又は組織検体中の結合物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗体又はその断片を含有する精神***病診断剤を提供するものである。
【００１２】
さらに本発明は、上記の精神***病診断剤を含む精神***病診断用キットを提供するものである。
さらに本発明は、配列番号２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を含有することを特徴とする精神***病診断用キットを提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
配列番号２で示される塩基配列はプレクストリン遺伝子の塩基配列に相当する。プレクストリン遺伝子の産生する蛋白質は、分子量約４７キロダルトンの蛋白質でＰ４７と呼ばれ、血小板に多く存在し、血小板ＰＫＣ（蛋白質キナーゼＣ）の主要な基質で、活性化されると速やかにリン酸化される血小板の活性化マーカーとして知られている。単離されたヒトＰ４７クローンは、分子量が４０，０８７の蛋白質をコードする１０５０塩基対のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）からなり、Ｎ末端、Ｃ末端にそれぞれプレクストリンホモロジードメインを有する構造を有し、ノーザンブロット分析では、末梢血液、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄に発現することが報告されている（Tyers, M. et al, J. Cell. Biochem.,40,133-145(1989);Tyers, M. et al, Nature, 333, 470-473(1988)）。また、このポリペプチドは、Ｃａ2+活性化リン酸依存性蛋白質キナーゼの基質であると報告されている（Kawahara, Y., et al., B. B. R. C., 97, 309-317(1980)）。
【００１５】
本発明において、遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００１６】
本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、リーダ配列、コード領域、エキソン、イントロンを含む。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体、変異体を含む。変異体は、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および挿入された変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味する。
【００１７】
尚、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。上記ポリペプチドは、アレル体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％相同なものを含む。
また、共通に保存する構造的な特徴があり、本発明遺伝子発現産物は、生物活性、例えばプレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、プレクストリン活性、または脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を有している。なおポリペプチドの相同性は配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994)）において、或いはＳＷＩＳＳＰＬＯＴＳで解析することが出来る。
【００１８】
変異体ＤＮＡは、アミノ酸置換についてサイレントまたは保存変異体を意味し、塩基配列によってコードされるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異のことを表わす。
【００１９】
保存的なアミノ酸置換の数は以下に示されているとおりである：
【００２０】
【表１】
【００２１】
加えて、一般にシスティン残基をコードする1またはそれ以上のコドンは特定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与えるのでシステイン残基の欠失の結果、置換することが可能である。
置換基を選択することによって作られる機能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記載されたものより少し保存性が劣っている。例えば、
a）置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、
b）標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、
c）アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。
蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと一般的に期待される置換は、以下のものである：
a）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニンが疎水性残基例えば、ロイシル、イソロイシル、ファニルアラニル、ヴァリル、またはアラニイルに対して置換される、
b）システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に対して置換される、
c）電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジル、アルギニリル、ヒスタジルは電気的陰性残基、例えば、バルタアミルまたはアスパルチルによって置換されるが、
d）非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと置換できる。
【００２２】
以上のとおり、プレクストリン遺伝子の利用は、精神***病の解明、把握、診断、予防および治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、プレクストリン遺伝子は、上記精神***病の処置に利用されるプレクストリン遺伝子の発現の誘導を抑制する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は体液や組織におけるプレクストリン遺伝子の発現またはその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検出は、上記各精神***病の解明や診断において好適に利用できる。
【００２３】
プレクストリン遺伝子は、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２の塩基配列を含む遺伝子、または該配列番号２で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子であるが、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であることができる。前記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性は、例えば少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するものであり、これら相同物を含む。
【００２４】
プレクストリン遺伝子改変体については、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。
ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（プレクストリン蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されないが、好ましくは１から十数個、更に好ましくは１から数個程度が、プレクストリン蛋白と同様の機能を有するうえで好ましく例示される。
【００２５】
ここで「同様の機能」とは、精神***病の原因が脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン（５−ＨＴ）、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生、交感神経伝達物質受容体の受容体異常、これら神経伝達物質の伝達障害など様々原因により中脳−皮質・辺縁系に異常を来し、精神病の出現や精神機能異常を発症し、黒質−線条体系は錐体外路系の運動機能障害を、視床下部-下垂体系は内分泌系の障害を起こすとされていることから、これらのプレクストリン遺伝子の有する活性と同様の活性ということができる。
従って該プレクストリン遺伝子活性としては、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン（５−ＨＴ）、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性を例示できる。
かくしてプレクストリン遺伝子は精神***病関連神経系障害の強力な病因候補である。これらの特性を以後「プレクストリン活性」または「プレクストリンポリペプチド活性」または「プレクストリンの生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記プレクストリンポリペプチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号１のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドはプレクストリン遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。
【００２６】
また、上記改変されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードするプレクストリン遺伝子が検出できるものであってもよい。
さらに本発明のＤＮＡ分子としては、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するプレクストリン遺伝子を挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該プレクストリン遺伝子の相同物も包含される。
ここで「プレクストリン遺伝子の相同物」とは、プレクストリン遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性、および上記したようなその生物学的機能の類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、プレクストリン遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。
【００２７】
上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えばヒトプレクストリン遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。プレクストリン遺伝子（ヒトプレクストリン遺伝子）には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。
【００２８】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００２９】
プレクストリン遺伝子の具体的態様としては、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明で使用するプレクストリン遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００３０】
また、本発明におけるＤＮＡ分子は、前記のとおり、配列番号２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
上記相同性は、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することもできる。
【００３１】
プレクストリン遺伝子は、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。具体的には、プレクストリン遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、プレクストリン遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００３２】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、プレクストリン遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００３３】
プレクストリン遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００３４】
ここで用いられるプローブとしては、プレクストリン遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得されたプレクストリン遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、プレクストリン遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来る。
【００３５】
プレクストリン遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、プレクストリン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
また、上記で得られるプレクストリン遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００３６】
このようにして得られるプレクストリン遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織におけるプレクストリン遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、プレクストリン遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、プレクストリン遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有するプレクストリン遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００３７】
このように、本発明に使用される遺伝子には、プレクストリン遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
当該ＤＮＡ断片は、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００３８】
プレクストリン遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物（プレクストリン蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００３９】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するプレクストリン蛋白質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該プレクストリン蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記プレクストリン活性を有する蛋白質を挙げることができる。ここで前記プレクストリン活性とは、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性を例示できる。具体的には、前記プレクストリン遺伝子の相同物（アレル体を含むプレクストリン同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
また、プレクストリン蛋白質の相同物には、配列番号１に示されるアミノ酸配列のプレクストリン蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含される。
【００４０】
本発明の蛋白質は、プレクストリン遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
【００４１】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００４２】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００４３】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用される、かかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（GibcoBRL社）、ｐＡｃＧＨＬＴ(PharMingen社)、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００４４】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００４５】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ｐｇｋプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００４６】
尚、プレクストリン遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００４７】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグを例示できる。
【００４８】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４９】
かくして得られる本発明組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交感クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００５０】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号２に示されるプレクストリン遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
また、プレクストリン遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法により行うことができる。
【００５１】
本発明蛋白質は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００５２】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【００５３】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交感樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【００５４】
プレクストリン蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００５５】
かくして得られる抗体は、例えばプレクストリン蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。より具体的には、プレクストリン遺伝子の増幅および発現亢進が精神***病の患者血液サンプル中において確認されていることから、該抗体を用いて精神***病の診断叉は、精神***病の進行度の判定に利用することが出来る。
上記で得られたプレクストリン抗体は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。従って、本発明はプレクストリン抗体を有効成分とする医薬組成物をも提供するものである。
【００５６】
プレクストリン抗体の医薬としての有用性は上記したようにその精神***病患者の特異的ポリペプチドが有する交感神経刺激物質の過剰産生作用、交感神経伝達物質受容体の受容体異常刺激作用、および神経伝達物質の伝達障害作用により生じる障害を抑制または減少されせる活性作用を例示することができる。
【００５７】
これら抗体活性の確認は、通常の免疫学的抗原抗体反応試験によって確認することができる。
該医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートなどが例示される。
【００５８】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【００５９】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【００６０】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【００６１】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００６２】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【００６３】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００６４】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【００６５】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【００６６】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【００６７】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【００６８】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【００６９】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【００７０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【００７１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
【００７２】
また、後記実施例において示されるようにプレクストリン遺伝子は、精神***病患者の末梢血液中において高発現していることから、プレクストリン遺伝子の全部または一部のアンチセンス鎖を包含する任意の遺伝子発現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら組織において強制的に発現させることにより、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を引き起こす活性を抑制し、結果として精神***病患者の精神神経症状、運動機能や内分泌機能、など機能所見の改善または症状進行抑制することが可能な抗精神病活性または抗プレクストリン活性を有する遺伝子治療用組成物として、或いは遺伝子治療剤として利用できると考えられる。
【００７３】
従って、本発明は、プレクストリン遺伝子の全部または一部のアンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子のアンチセンス鎖を導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとするものである。
即ち、本発明によれば、配列番号２で示される塩基配列の全部または一部を含むプレクストリン遺伝子のアンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供される。
【００７４】
また、本発明によれば、配列番号２で示される塩基配列の全部または一部のアンチセンス鎖を含むプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞を精神***病症患者の脳内または患者の血管組織部位に投与することによって、これら組織における交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制し、あるいはこれら細胞におけるプレクストリン遺伝子の発現量を抑制することを特徴とする精神***病の治療およびプレクストリン活性抑制剤または抗精神病薬を提供することができる。
【００７５】
更にまた、本発明によれば、上記プレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特に、プレクストリン活性または交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制するための処置等に使用される当該医薬が提供される。
【００７６】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glover,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、アナンド(Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthrie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク(Fink,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記載されている。
【００７７】
本発明は、本発明プレクストリン遺伝子の発現する細胞において、細胞内のmＲＮＡに対して相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、プレクストリン遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の提供によるプレクストリン活性抑制または交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制の遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えばプレクストリン遺伝子を有するプレクストリン発現細胞本来のｍＲＮＡと結合させるか、あるいはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。そのためには遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
【００７８】
かかるプレクストリン遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞におけるプレクストリン活性を抑制することができる。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた抗精神***病の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをプレクストリン活性発現細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の抑制効果を得ることが出来る。
【００７９】
このようにプレクストリン遺伝子を有する細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してプレクストリン蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは対応するプレクストリン遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該プレクストリン遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
【００８０】
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したプレクストリン のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該アンチセンス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【００８１】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【００８２】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。***に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓においては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン遺伝子配列に対応する相補配列全部または一部）は、本発明のプレクストリン遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【００８３】
かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、プレクストリン でアンチセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態でプレクストリン活性を抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
遺伝子治療においては、上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の標的細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位にプレクストリン ｍＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【００８４】
本発明の遺伝子治療方法は、前述するアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の方法を包含する。
またプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
後述する、プレクストリンに対応する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクターによりヒトプレクストリンがアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に精神***病患者をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、精神***病患者以外にも 精神***病合併症の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
また、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、特に脳・神経組織、脳細胞、脳神経細胞の他、プレクストリン発現が認められる組織の細胞、心臓、胎盤、肺、肝臓、膵臓、脾臓、小腸、末梢血組織以外に、神経細胞、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
【００８５】
上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
ウイルス的導入方法としては、例えば、プレクストリンのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどが挙げられる。
【００８６】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al.,J.Biol.Chem.,266,22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87,9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al.,Science,247,1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechnol.,11,202 (1993); Miller,et al.,FASEB J.,9,190 (1995)〕などを使用することができる。
【００８７】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al.,J.Biol.Chem.,266,14338 (1991); Ferkol,et al.,FASEB J.,7,1081-1091 (1993)〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87,3410 (1990)〕などが含まれる。
【００８８】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノウイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【００８９】
以下、具体的な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法について述べる。
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン に対応する全アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージング・シグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【００９０】
所望のプレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat.,23,747 (1995)〕を採用することもできる。なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【００９１】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158,39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84,2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12,28-34 (1994)〕およびケナーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91,6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ちプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド、そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを包含する本発明ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３'側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【００９２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【００９３】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【００９４】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【００９５】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶと共に回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【００９６】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【００９７】
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res.,159,399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【００９８】
以下、該膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似またイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比)コレステロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【００９９】
また、別のリポソームを用いてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C.,196,1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１００】
プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）およびＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μｇの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１０１】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μｇ、リポソーム脂質量として３０nmolになるように包埋し、これを２μｌのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１０２】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義されている。しかしながら、本発明における遺伝子治療とは、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞にプレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチドのプレクストリン発現抑制アンチセンスＤＮＡとして特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することによって精神***病疾患の治療のみならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むものとする。
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１０３】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするプレクストリン をアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や動脈硬化症、癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適であると報告されている。
【０１０４】
第２法は、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の脳内や肺、肝臓、小腸組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するベクターを加える。 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、2500回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が-本発明のようにプレクストリン活性であればその活性の程度を測定することにより、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認する。活性の程度は前記プレクストリン活性すなわち、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性の程度を測定すればよい。
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０8細胞に対して１×１０3ｃｆｕから１×１０8ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１０５】
上記第１法の別法として、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、あるいは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際してアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１０６】
本発明遺伝子治療法において、特に精神***病や精神***病合併症を対象とする場合は、患者から例えば末梢血細胞(プレクストリン発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする末梢血細胞(プレクストリン発現細胞)に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施行し、患者末梢血や肺、肝臓、小腸組内または脳内に接種する精神***病およびその合併症治療法を一例として挙げることができる。
【０１０７】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド等）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１０８】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記したプレクストリン蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
一般には、医薬製剤としての所望アンチセンス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０3ｐｆｕから１×１０15ｐｆｕ程度とするのがよい。また所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０4細胞／bodyから１×１０15細胞／body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１０９】
本発明に従う遺伝子治療を精神***病の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の向精神薬療法、作業療法、などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１１０】
また本発明によれば、プレクストリン遺伝子の存在を検出するために、組織又は体液（例えば血液または血清）のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、プレクストリン遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。 該検出方法は、例えば、プレクストリンＤＮＡ断片を作成し、プレクストリン遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したプレクストリンの全部叉は一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずプレクストリンと同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該プレクストリン配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１１１】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、プレクストリン断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０１１２】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
また、本発明の測定方法は、試料中のプレクストリン遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０１１３】
故に本発明は上記プレクストリン ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするプレクストリン遺伝子の検出用試薬キットが提供される。
該試薬キットは、少なくとも配列番号２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０１１４】
更に本発明は、前記測定方法を用いる精神***病の診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０１１５】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたプレクストリン配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型プレクストリンと相同性の高い相同物である新たなプレクストリン遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のプレクストリン ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトプレクストリン遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０１１６】
また、本発明の配列番号１で示されるヒトプレクストリン遺伝子でコードされる蛋白質、または該配列番号１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはこれらの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する抗体を合成することによって、野生型プレクストリンおよび／または変異プレクストリンの測定が可能となる。
【０１１７】
従って、本発明は、野生型プレクストリンおよび／または変異プレクストリンの抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。該測定法によって精神***病の障害の程度、或いは精神***病の進行の度合を野生型プレクストリンポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるプレクストリン配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、プレクストリン蛋白質中の相違、またはプレクストリン蛋白質の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、プレクストリン抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からプレクストリン蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でプレクストリン蛋白質と反応することができる。また、プレクストリン抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のプレクストリン蛋白質を検出することができる。
抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
野生型プレクストリンまたはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０１１８】
また、本発明は、プレクストリン蛋白に対するプレクストリン結合活性を有する細胞膜画分または細胞表面上に存在するプレクストリンレセプターをも提供することが可能である。該プレクストリンレセプターの取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識したプレクストリン蛋白をコンジュゲートさせ、プレクストリン結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって達成され、該プレクストリンレセプター蛋白の取得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成できる。
【０１１９】
また本発明は、プレクストリンレセプター蛋白質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物(プレクストリンレセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、または抗体など言う)をスクリーニングすることに利用可能である。好ましくは、プレクストリンレセプターを利用する。かかるスクリーニング試験に用いるプレクストリンレセプターポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。
薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、プレクストリン蛋白質またはその断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用することができる。また遊離のまたは固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもできる。より具体的には、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測定し、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とプレクストリン蛋白質またはその断片との間の複合体の形成が試験する物質によって阻害される程度を検出することによって化合物をスクリーニングすることが可能である。
かくして、本発明は、当該分野で既知の方法によって、かかる物質とプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片との間の複合体の存在、またはプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とリガンドとの間の複合体の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、プレクストリンレセプター活性を測定して、かかる物質がプレクストリンレセプターを阻害でき、かくして上記定義されたプレクストリンの活性、例えばドーパミンなどの交感神経刺激作用、ドーパミンレセプターなどのレセプターの刺激作用、或いはノルアドレナリンなどの交感神経の伝達刺激作用などを調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節または複合体形成能の調節ができるかどうか判断する。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的には、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片を標識する。遊離のプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子のプレクストリンレセプターに対する結合またはプレクストリンレセプター：プレクストリン蛋白質結合の阻害の尺度となる。プレクストリン蛋白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分析し、プレクストリンレセプター阻害活性を有するものを測定できる(後記ｂ)。
【０１２０】
本発明において、薬剤スクリーニングのための他の方法は、プレクストリンレセプター蛋白質に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニング法であって、概略すると、多数の異なるペプチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合物をプレクストリンレセプター蛋白質と反応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合プレクストリンレセプター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたプレクストリンレセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、プレクストリンレセプター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とし、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片に対する結合性につき、プレクストリンレセプター蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によって、プレクストリンレセプター蛋白質の１またはそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
【０１２１】
また、本発明のプレクストリン活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法において、例えば、プレクストリン遺伝子発現産物またはプレクストリン蛋白質(以下、プレクストリン蛋白質と併せて称する)、またはそれらの断片に対する抗体と、被検液および標識化されたプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中のプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩を定量するスクリーニング方法も可能である(後記ｂ)。
また被検液と担体上に不溶化した前記抗体および標識化された別の異なるプレクストリン蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法も可能である。
さらに、プレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合とプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触させた場合における、プレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を測定して、比較することによってプレクストリン蛋白質またはその塩の活性（例、プレクストリン活性）を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングすることも可能である(後記d)。
【０１２２】
本発明によれば、プレクストリンポリペプチドまたはプレクストリン遺伝子発現産物の機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって、(a)候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定する方法、(b)候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識競合物質(プレクストリン抗体またはプレクストリンレセプター)の存在下で測定する方法、(c)候補化合物が該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、(d)候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドまたは遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および(e)候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法が提供される。
【０１２３】
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性プレクストリン遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が例えば、細胞の成長を調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節叉は複合体形成能の調節できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段として、プレクストリンレセプターの生物活性を測定することも可能である。
【０１２４】
また本発明によれば、より活性または安定した形態のプレクストリン蛋白質誘導体または例えば、イン・ビボ(in vivo)でプレクストリン蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナログ、例えばプレクストリンアゴニスト、プレクストリンアンタゴニスト、プレクストリンインヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばプレクストリンと他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたは、これらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
また上記より活性または安定した形態のプレクストリン蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なプレクストリン誘導体を設計することができる。
【０１２５】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
かくして、改善されたプレクストリン活性もしくは安定性またはプレクストリン活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０１２６】
また本発明によれば、プレクストリン遺伝子含有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することによってプレクストリン遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なプレクストリン活性に影響を与えるかどうか、即ちプレクストリン遺伝子産物、並びに改変プレクストリン遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989)）。
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、本発明のヒト野生型プレクストリン遺伝子および変異プレクストリン遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたプレクストリン活性もしくは安定性またはプレクストリン活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明によれば、プレクストリンオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、該オリゴヌクレオチド・プローブと結合する検体中のプレクストリン 遺伝子または遺伝子産物を検出することによって、精神***病を検出する検出方法および検出用キットが提供される。
本発明によれば、プレクストリン遺伝子発現産物を抗原とする抗体を製造することが出来る。本発明によれば、該抗体による精神***病の診断および該抗体を有効成分とする精神***病に対する医薬組成物並びに医薬が提供される。
また、本発明によれば、プレクストリン遺伝子がコードするプレクストリン蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、プレクストリン蛋白質活性やプレクストリン蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
またプレクストリン蛋白質は、プレクストリン遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、精神***病、および精神***病合併症）の病態解明や診断、治療などに有用である。
本発明によれば、更にプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該プレクストリンアンチセンスセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
本発明によれば、プレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を用いる相互作用物のスクリーニング方法が提供される。
【０１２８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
＜ディファレンシャル ｍＲＮＡディスプレー法による遺伝子の単離＞
（１）アンカープライマーによるｐｏｌｙ（Ａ）−ｍＲＮＡの選択的逆転写
精神***病患者のうち投薬治療群（７例）と未投薬治療群（３例）および健常者（１１例）の末梢血単核球より常法により抽出したｍＲＮＡのそれぞれ１３μｌ（1μｇ）に、３'−アンカープライマーとして、ジエチルピロカーボネート処理水に溶かした２５ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマーＧ（Ｔ）１５ＭＡ（ＧＴ１５Ｍ−Ａ、−Ｃ、−Ｇ、−Ｔ；ＭはＡ、Ｃ及びＧのミックスである）（表２）を１μｌ加え、７２℃で２分間加熱処理した。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
次いで、この溶液に４μｌの５×ファースト・ストランド緩衝液（ＢＲＬ社製）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ社製）、１μｌの２５０μＭｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、１μｌのリボヌクレアーゼ・インヒビター（４０単位；ＴＯＹＯＢＯ社製）および１μｌのスーパースクリプトII逆転写酵素（２００単位；ＢＲＬ社製）を加え、４２℃で１時間反応させてｃＤＮＡを合成した。
【０１３１】
（２）アービタリープライマーを用いた第２鎖合成
合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、アービタリープライマー（表３）を用いた第２鎖合成を以下の条件で行った。
即ち、１μｌのｃＤＮＡに対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラ社製）、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、０．２５μｌのＥx ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍｌ：タカラ社製）、１μｌの〔γ−33Ｐ〕ＡＴＰで標識した２５pmolの３'−アンカードプライマーおよび１μｌの２５pmol５'−アービタリープライマー（表３）および１０．２５μｌの蒸留水を加えた。また、ＰＣＲ反応は以下の条件で行なった。即ち、９５℃で５分間の後、９５℃で３分間、４０℃で５分間および７２℃で５分間を１サイクルとして行ない、それから９５℃で０．５分間、４０℃で２分間および７２℃で１分間を２５サイクル行ない、最後に７２℃で５分間反応させた。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
（３）電気泳動による分離
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、熱変性させ1本鎖に解離した状態で６％アクリルアミド、７．５Ｍ ウレアシーケンシングゲルにアプライし、電気泳動を行った。泳動終了後ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。健常者では発現せず***病患者群（投薬群，未投薬群の両方）で発現した特異バンドを乾燥ゲルから切り出し、初回と同一の条件でのＰＣＲによる目的フラグメントの再増幅を行った。電気泳動後、同様にゲルから切り出したバンドからＰＣＲ産物を精製し、さらに３回目のＰＣＲを同一条件で行なった。このＰＣＲ産物をpUC系のベクターにサブクローニングし、オートシーケンサー（ABI377 auto-sequencer, Applied Biosystems）により、塩基配列を決定した。
【０１３４】
（４）ＲＴ−ＰＣＲによるスクリーニング
ＤＤ法により得られた遺伝子断片の各塩基配列より、プライマーを設計後、患者および健常者の末梢血単核球より抽出したｍＲＮＡを用い、RT-PCRで一次スクリーニングを行った。ここで発現量に差のある候補遺伝子を単離した。
【０１３５】
（５）ｃＤＮＡの全長単離
ＤＤ法により得られた遺伝子断片をプローブとして，遺伝子断片の塩基配列を基にプライマーを設計し，５'− RACE（Rapid Amplification of cDNA End）法によりｃＤＮＡの全長の単離を行った。また得られた配列を基にホモロジー検索を行った。
【０１３６】
実施例２
＜候補遺伝子のスクリーニング法（競合的 RT-PCR法）＞
競合的ＤＮＡ構築キット（Competitive DNA Construction Kit;タカラ社製）を用いてPleckstrinおよびGAPDH(ハウスキーピング遺伝子)のＤＮＡコンペティターを作製した。作製したＤＮＡコンペティターと、患者全ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを用いて競合的ＰＣＲを行った（健常者(n=21),精神***病患者(n=53),その他の疾患者(n=12)）。
（１）ＤＮＡコンペティターの作製
ＤＮＡコンペティターの作製には、競合的ＤＮＡ構築キット(Competitive DNAConstruction Kit:タカラ社製：TaKaRa)を用いて、λＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行ない、ＳＵＰＲＥＣ−２(タカラ社製)を用いてプレクストリンおよびＧＡＰＤＨ(ハウスキーピング遺伝子)のＤＮＡコンペティターをそれぞれ精製した。
即ち、ＤＮＡコンペティター作製には、２５μｌの２×プレミックス液(Premix solution)、０．５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、０．５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーおよび２４μｌの水を用いて、最終量５０μｌとした。プレクストリンＤＮＡコンペティター作製には、配列番号３で示されるＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、および配列番号４で示されるＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーを用いた。また、ＧＡＰＤＨのＤＮＡコンペティター作製には、配列番号５で示されるＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、および配列番号６で示されるＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーを用いた。ＰＣＲ反応は、それぞれ９４℃で０．５分、次いで６０℃で０．５分、７２℃で０．５分のサイクルを３０サイクル行った。
（２）ＤＮＡコンペティターのコピー数の計算
精製したＤＮＡコンペティターの吸光度(OD260)を測定し，下記の計算式よりコピー数を算出した。
【０１３７】
【数１】
【０１３８】
（３）競合的ＰＣＲによるプレクストリン遺伝子発現の定量
健常者(n=21), 精神***病患者(n=53), その他の疾患者(n=12)の末梢血単核球より全 RNAを抽出、精製し、精製した全 ＲＮＡ(1μｇ/μｌ)よりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと作製したＤＮＡコンペティターを混合して競合的ＰＣＲを行った。
即ち、ＩＳＯＧＥＮ（和光社製）を使用して健常者、精神***病患者、その他の精神病患者の末梢血単核球のそれぞれから、全ＲＮＡを単離した後、１０単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（ベーリンガー・マインハイム社製）で３０分間処理し、クロロフォルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。次いで精製して得られた全ＲＮＡ５μｇから一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄ（Ｔ）を使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（商標） ＲＮａｓｅＨ-逆転写酵素（ライフ・テクノロジー社製）によって合成し、得られた各ｃＤＮＡ産物を競合的ＰＣＲ増幅のために用いた。
検体からのｃＤＮＡと作製したＤＮＡコンペティターを混合して競合的ＰＣＲを行い、この際、標的とするプレクストリン遺伝子のコピー数を算出するための検量線を作成するため、コンペティターの濃度を振った。
ＰＣＲ反応に、２５μｌの最終容量からなる、２．５μｌの上記各検体からのｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのＤＮＡコンペティター(１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8コピー／２．５μｌ)、２．５μｌの１０×緩衝液(TOYOBO社製)、２．５μｌの２．５ｍＭ ｄＴＮＰｓ(TOYOBO社製)、０．５μｌの１０μＭ プレクストリン センス・プライマー(配列番号７)、０．５μｌの１０μＭ プレクストリンアンチセンス・プライマー(配列番号８)、０．２５μｌのピロコッカスＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼのＫＯＤｄａｓｈ(2.5単位/μｌ：TOYOBO社製)、および蒸留水（ニッポンジーン社製）の反応液を調製した。
ＰＣＲ反応は、９５℃で２分、続いて９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７５℃で０．５分を３０サイクルの条件で反応させた。
尚、対照として用いたＧＡＰＤＨに対しては、ＧＡＰＤＨセンス・プライマー(配列番号９)、およびＧＡＰＤＨアンチセンス・プライマー(配列番号１０)が用いられ、該ＧＡＰＤＨ対するＰＣＲ反応は、９５℃で２分、続いて９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７５℃で０．５分を３０サイクルの条件で反応させた。
かくして得られた各ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し，ゲルドライヤーを用いてろ紙上で乾燥させた。乾燥後イメージプレートに露光し、モレキュラー・イメージャーＧＳ−５２５(Molecular Imager GS-525：バイオ・ラド社製)を用いて画像データを取り込み、モレキュラー・アナリスト(Molecular Analyst:バイオ・ラド社製)を用いてデータ解析を行った。
発現量は単位ＧＡＰＤＨコピー数あたりの発現プレクストリンコピー数（発現量＝Pleckstrinコピー数/GAPDHコピー数）で算出した。その結果を図１に示す。図１に示されるように候補遺伝子プレクストリンが、健常者あるいは精神***病以外の精神病患者群に比べ有意に精神***病患者で有意に発現していた。
上記の結果から、プレクストリン遺伝子は、精神***病患者で特異的に高発現しており、精神***病患者の診断に有用であることがわかる。
【０１３９】
実施例３
＜ノーザンブロット解析および染色体の局在の決定＞
ノーザンブロット解析により発現量に差のあるｍＲＮＡに由来しているかの確認をおこなった。
組織におけるプレクストリンの発現プロファイルを調べるため、各種のヒト組織を用いたノーザンブロット分析を行った。
ノーザン・ブロツト分析には、ヒトＭＴＮ（Multiple-Tissue Northern）ブロットＩとII（クローンテック社製）を使用した。ｃＤＮＡ断片は、Ｔ３とＴ７プロモーター配列のプライマー・セットを用い、ＰＣＲによって〔γ−33Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識した上記実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物を含むメンブランをプレハイブリダイズ（条件は製品のプロトコールに従った）し、それから製品のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、洗浄した膜を−８０℃で２４時間オートラジオグラフに露光した。用いたヒト組織は、心臓（Heart）、脳（brain）、胎盤（Placenta）、肺（Lung）、肝臓（Liver）、骨格筋（S. muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓（Pancreas）、脾臓（Spleen）、胸腺（Thymus）、前立腺（Prostate）、精巣（Testis）、卵巣（Ovary）、小腸（Small intestine）、結腸（Colon）および末梢血白血球（Peripheral blood leukocyte; P.B.L.）である。
その結果、プレクストリンに相同する約３ｋｂの転写体が末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎、および骨髄に発現していたが、発現の強弱はそれほど認められなかった。
【０１４０】
遺伝子解析結果
ディファレンシャル ｍＲＮＡディスプレー法による解析の結果、精神***病患者群（投薬群，無投薬群）に発現が認められるバンドが多数検出できた。一次スクリーニングの結果、候補遺伝子を絞り込み、さらに２次スクリーニングとして定量的に競合的ＰＣＲ法により測定した。その結果、候補遺伝子プレクストリンが、健常者あるいは精神***病以外の精神病患者群に比べ有意に***病患者で発現していた（図１）。プレクストリンは、その塩基配列よりGenBankに登録されているプレクストリン（ACCESSION X07743）の遺伝子断片であった。分子量が約４７Ｋのタンパク質で血小板に多く存在し、血小板ＰＫＣの主要な基質で、活性化されるとすみやかにリン酸化される血小板の活性化マーカとして知られている。Ｎ，Ｃ末端にそれぞれプレクストリンホモロジードメインを有する構造である。
【０１４１】
臨床症状との関連性
精神***病患者（27例）の末梢血単核球中のプレクストリンの発現量と、採血時の患者の精神症状をPANSS(Positive and Negative Syndrome Scale: Kay, S.R., Schizophr. Bull, 13, 261-276(1987))による構成で比較することにより、精神症状とプレクストリン遺伝子発現の関連性を検討した。その結果、図2に示すように、構成のポイントとプレクストリンの発現量には相関関係（ｒ=0.52, P<0.01）があった。プレクストリン遺伝子は精神***病の精神症状を判断するのに有用である。
【０１４２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】健常者、精神***病患者及びその他の精神病患者におけるプレクストリン遺伝子発現量を示すグラフである。
【図２】プレクストリン遺伝子発現量と精神症状の関連性を示すグラフである。
【０００１】
本発明は、精神***病患者の末梢血中に高発現しているプレクストリン遺伝子を用いた精神***病の遺伝子診断、精神***病の診断剤及び診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物の遺伝情報は、細胞の核内に存在するＡ、Ｃ、ＧおよびＴの４種の塩基の配列(ＤＮＡ)として蓄積され、この遺伝情報は個々の生物の系統維持と個体発生のために保存されている。ヒトの場合、その塩基数は約３０億(３×１０9)といわれ、その中に５〜１０万の遺伝子があると推測されている。これらの遺伝情報は遺伝子(ＤＮＡ)からｍＲＮＡが転写され、次に蛋白質に翻訳されるという流れに沿い、調節蛋白質、構造蛋白質あるいは酵素が作られ、生命現象を維持している。上記遺伝子から蛋白質翻訳までの流れの異常は、細胞の増殖・分化などの生命維持システムの異常を惹起し、各種疾患の原因となるとされている。これまでの遺伝子解析の結果から、Ｇ蛋白結合受容体、インスリン受容体やＬＤＬ受容体、５−ＨＴ受容体、ドーパミン受容体などの各種受容体や細胞の増殖・分化に関わるもの；チロシンキナーゼ、ヒスチジンキナーゼ、アルギニンキナーゼ、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、スーパーオキシドディスムターゼ、ヒスチジンキナーゼ、ｐ４５０のような代謝酵素などの疾患の診断や医薬品開発にとって有用な化合物のスクリーニングのための素材となると思われる遺伝子が多く見つかっている。
【０００３】
特に精神***病、双極性／単極性障害などの神経性障害に係わる遺伝子として、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３(特開平１１−２５３１８３号)、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４(２０００−９３１８６号)、Ｗｎｔ−４(特開平１１−７５８７２号)、Ｗｎｔ−６(２０００−６０５７５号)などの遺伝子が近年見つかっている。 ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ−３は８ｐ１２−ｐ２１にマップされ、ほとんど脳および中枢神経系でのみ発現している。ケンデラー(Kendler, et al.,Am. J. Psychiatry.153(12):1534-1540, 1996))は、精神***病と２６５アイルランド人ファミリーの８ｐ２１との間に非常に顕著な関連を見出している。
【０００４】
しかしながら、ヒト遺伝子の解析とそれら解析された遺伝子の機能および解析遺伝子と各種疾患との係わりについての研究は、まだ始まったばかりであり、特に精神神経領域において特に不明な点が多く、更なるこの領域における新しい遺伝子の解析、それらの遺伝子の機能の解析、解析された遺伝子と疾患の係わりの研究、惹いては解析された遺伝子の利用による脳・神経領域の遺伝子診断、該遺伝子の脳・神経領域にかかる医薬用途への応用研究などが当業界で望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、精神***病に関連する遺伝子を利用した精神***病の検出および診断剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、現在GenBank（ACCESSION：X07743）に登録されているプレクストリン遺伝子が精神***病と密接な関係にあり、精神***病患者の血液中に高発現していること、そしてこれらの疾患の診断に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、該オリゴヌクレオチドと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも３０の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、該オリゴヌクレオチドと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【０００９】
本発明はまた、上記の精神***病患者体液又は組織の検出方法において、ＲＴ−ＰＣＲ法又は競合的ＰＣＲ法を用いることを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
さらに本発明は、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、該オリゴヌクレオチド・プライマーと結合する体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
【００１０】
さらに本発明は、上記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・プライマーを含有する精神***病診断剤を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に結合する抗体又はその断片を用いて、該抗体又はその断片に結合する体液又は組織検体中の結合物を検出することを特徴とする精神***病患者体液又は組織の検出方法を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗体又はその断片を含有する精神***病診断剤を提供するものである。
【００１２】
さらに本発明は、上記の精神***病診断剤を含む精神***病診断用キットを提供するものである。
さらに本発明は、配列番号２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を含有することを特徴とする精神***病診断用キットを提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
配列番号２で示される塩基配列はプレクストリン遺伝子の塩基配列に相当する。プレクストリン遺伝子の産生する蛋白質は、分子量約４７キロダルトンの蛋白質でＰ４７と呼ばれ、血小板に多く存在し、血小板ＰＫＣ（蛋白質キナーゼＣ）の主要な基質で、活性化されると速やかにリン酸化される血小板の活性化マーカーとして知られている。単離されたヒトＰ４７クローンは、分子量が４０，０８７の蛋白質をコードする１０５０塩基対のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）からなり、Ｎ末端、Ｃ末端にそれぞれプレクストリンホモロジードメインを有する構造を有し、ノーザンブロット分析では、末梢血液、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄に発現することが報告されている（Tyers, M. et al, J. Cell. Biochem.,40,133-145(1989);Tyers, M. et al, Nature, 333, 470-473(1988)）。また、このポリペプチドは、Ｃａ2+活性化リン酸依存性蛋白質キナーゼの基質であると報告されている（Kawahara, Y., et al., B. B. R. C., 97, 309-317(1980)）。
【００１５】
本発明において、遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明において遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００１６】
本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、リーダ配列、コード領域、エキソン、イントロンを含む。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体、変異体を含む。変異体は、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および挿入された変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味する。
【００１７】
尚、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。上記ポリペプチドは、アレル体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％相同なものを含む。
また、共通に保存する構造的な特徴があり、本発明遺伝子発現産物は、生物活性、例えばプレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、プレクストリン活性、または脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を有している。なおポリペプチドの相同性は配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994)）において、或いはＳＷＩＳＳＰＬＯＴＳで解析することが出来る。
【００１８】
変異体ＤＮＡは、アミノ酸置換についてサイレントまたは保存変異体を意味し、塩基配列によってコードされるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異のことを表わす。
【００１９】
保存的なアミノ酸置換の数は以下に示されているとおりである：
【００２０】
【表１】
加えて、一般にシスティン残基をコードする1またはそれ以上のコドンは特定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与えるのでシステイン残基の欠失の結果、置換することが可能である。
置換基を選択することによって作られる機能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記載されたものより少し保存性が劣っている。例えば、
a）置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、
b）標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、
c）アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。
蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと一般的に期待される置換は、以下のものである：
a）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニンが疎水性残基例えば、ロイシル、イソロイシル、ファニルアラニル、ヴァリル、またはアラニイルに対して置換される、
b）システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に対して置換される、
c）電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジル、アルギニリル、ヒスタジルは電気的陰性残基、例えば、バルタアミルまたはアスパルチルによって置換されるが、
d）非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと置換できる。
【００２２】
以上のとおり、プレクストリン遺伝子の利用は、精神***病の解明、把握、診断、予防および治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、プレクストリン遺伝子は、上記精神***病の処置に利用されるプレクストリン遺伝子の発現の誘導を抑制する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は体液や組織におけるプレクストリン遺伝子の発現またはその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検出は、上記各精神***病の解明や診断において好適に利用できる。
【００２３】
プレクストリン遺伝子は、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２の塩基配列を含む遺伝子、または該配列番号２で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子であるが、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であることができる。前記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性は、例えば少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するものであり、これら相同物を含む。
【００２４】
プレクストリン遺伝子改変体については、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。
ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（プレクストリン蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されないが、好ましくは１から十数個、更に好ましくは１から数個程度が、プレクストリン蛋白と同様の機能を有するうえで好ましく例示される。
【００２５】
ここで「同様の機能」とは、精神***病の原因が脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン（５−ＨＴ）、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生、交感神経伝達物質受容体の受容体異常、これら神経伝達物質の伝達障害など様々原因により中脳−皮質・辺縁系に異常を来し、精神病の出現や精神機能異常を発症し、黒質−線条体系は錐体外路系の運動機能障害を、視床下部-下垂体系は内分泌系の障害を起こすとされていることから、これらのプレクストリン遺伝子の有する活性と同様の活性ということができる。
従って該プレクストリン遺伝子活性としては、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン（５−ＨＴ）、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性を例示できる。
かくしてプレクストリン遺伝子は精神***病関連神経系障害の強力な病因候補である。これらの特性を以後「プレクストリン活性」または「プレクストリンポリペプチド活性」または「プレクストリンの生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記プレクストリンポリペプチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号１のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドはプレクストリン遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。
【００２６】
また、上記改変されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードするプレクストリン遺伝子が検出できるものであってもよい。
さらに本発明のＤＮＡ分子としては、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するプレクストリン遺伝子を挙げることができるが、特にこれに限定されることなく、当該プレクストリン遺伝子の相同物も包含される。
ここで「プレクストリン遺伝子の相同物」とは、プレクストリン遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性、および上記したようなその生物学的機能の類似性によりひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、プレクストリン遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。
【００２７】
上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えばヒトプレクストリン遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。プレクストリン遺伝子（ヒトプレクストリン遺伝子）には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。
【００２８】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００２９】
プレクストリン遺伝子の具体的態様としては、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明で使用するプレクストリン遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００３０】
また、本発明におけるＤＮＡ分子は、前記のとおり、配列番号２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
上記相同性は、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することもできる。
【００３１】
プレクストリン遺伝子は、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。具体的には、プレクストリン遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、プレクストリン遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００３２】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、プレクストリン遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００３３】
プレクストリン遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００３４】
ここで用いられるプローブとしては、プレクストリン遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得されたプレクストリン遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、プレクストリン遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来る。
【００３５】
プレクストリン遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、プレクストリン遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
また、上記で得られるプレクストリン遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００３６】
このようにして得られるプレクストリン遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織におけるプレクストリン遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、プレクストリン遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、プレクストリン遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有するプレクストリン遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００３７】
このように、本発明に使用される遺伝子には、プレクストリン遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
当該ＤＮＡ断片は、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができる。
【００３８】
プレクストリン遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物（プレクストリン蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００３９】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するプレクストリン蛋白質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該プレクストリン蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記プレクストリン活性を有する蛋白質を挙げることができる。ここで前記プレクストリン活性とは、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性を例示できる。具体的には、前記プレクストリン遺伝子の相同物（アレル体を含むプレクストリン同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
また、プレクストリン蛋白質の相同物には、配列番号１に示されるアミノ酸配列のプレクストリン蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどのげっ歯類動物の蛋白質も包含される。
【００４０】
本発明の蛋白質は、プレクストリン遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
【００４１】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株に含まれるものを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００４２】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００４３】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用される、かかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（GibcoBRL社）、ｐＡｃＧＨＬＴ(PharMingen社)、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００４４】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００４５】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ｐｇｋプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００４６】
尚、プレクストリン遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００４７】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグを例示できる。
【００４８】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４９】
かくして得られる本発明組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交感クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００５０】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号２に示されるプレクストリン遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
また、プレクストリン遺伝子でコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしはアミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法により行うことができる。
【００５１】
本発明蛋白質は、また、配列番号１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００５２】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【００５３】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交感樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【００５４】
プレクストリン蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００５５】
かくして得られる抗体は、例えばプレクストリン蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。より具体的には、プレクストリン遺伝子の増幅および発現亢進が精神***病の患者血液サンプル中において確認されていることから、該抗体を用いて精神***病の診断叉は、精神***病の進行度の判定に利用することが出来る。
上記で得られたプレクストリン抗体は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。従って、本発明はプレクストリン抗体を有効成分とする医薬組成物をも提供するものである。
【００５６】
プレクストリン抗体の医薬としての有用性は上記したようにその精神***病患者の特異的ポリペプチドが有する交感神経刺激物質の過剰産生作用、交感神経伝達物質受容体の受容体異常刺激作用、および神経伝達物質の伝達障害作用により生じる障害を抑制または減少されせる活性作用を例示することができる。
【００５７】
これら抗体活性の確認は、通常の免疫学的抗原抗体反応試験によって確認することができる。
該医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートなどが例示される。
【００５８】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【００５９】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【００６０】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【００６１】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００６２】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【００６３】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００６４】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【００６５】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【００６６】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【００６７】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【００６８】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【００６９】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【００７０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【００７１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
【００７２】
また、後記実施例において示されるようにプレクストリン遺伝子は、精神***病患者の末梢血液中において高発現していることから、プレクストリン遺伝子の全部または一部のアンチセンス鎖を包含する任意の遺伝子発現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら組織において強制的に発現させることにより、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を引き起こす活性を抑制し、結果として精神***病患者の精神神経症状、運動機能や内分泌機能、など機能所見の改善または症状進行抑制することが可能な抗精神病活性または抗プレクストリン活性を有する遺伝子治療用組成物として、或いは遺伝子治療剤として利用できると考えられる。
【００７３】
従って、本発明は、プレクストリン遺伝子の全部または一部のアンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子のアンチセンス鎖を導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとするものである。
即ち、本発明によれば、配列番号２で示される塩基配列の全部または一部を含むプレクストリン遺伝子のアンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供される。
【００７４】
また、本発明によれば、配列番号２で示される塩基配列の全部または一部のアンチセンス鎖を含むプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりプレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を導入した細胞を精神***病症患者の脳内または患者の血管組織部位に投与することによって、これら組織における交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制し、あるいはこれら細胞におけるプレクストリン遺伝子の発現量を抑制することを特徴とする精神***病の治療およびプレクストリン活性抑制剤または抗精神病薬を提供することができる。
【００７５】
更にまた、本発明によれば、上記プレクストリン遺伝子アンチセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特に、プレクストリン活性または交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制するための処置等に使用される当該医薬が提供される。
【００７６】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glover,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、アナンド(Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthrie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク(Fink,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記載されている。
【００７７】
本発明は、本発明プレクストリン遺伝子の発現する細胞において、細胞内のmＲＮＡに対して相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、プレクストリン遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の提供によるプレクストリン活性抑制または交感神経刺激物質の過剰産生活性作用、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性作用、或いはこれら神経伝達物質の伝達障害活性作用を抑制の遺伝子治療法を提供する。該治療法は、例えばプレクストリン遺伝子を有するプレクストリン発現細胞本来のｍＲＮＡと結合させるか、あるいはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。そのためには遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
【００７８】
かかるプレクストリン遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞におけるプレクストリン活性を抑制することができる。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた抗精神***病の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをプレクストリン活性発現細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の抑制効果を得ることが出来る。
【００７９】
このようにプレクストリン遺伝子を有する細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してプレクストリン蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは対応するプレクストリン遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該プレクストリン遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
【００８０】
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したプレクストリン のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該アンチセンス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【００８１】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【００８２】
その具体例としては、例えば、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。***に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓においては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。
なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン遺伝子配列に対応する相補配列全部または一部）は、本発明のプレクストリン遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【００８３】
かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、プレクストリン でアンチセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態でプレクストリン活性を抑制のための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
遺伝子治療においては、上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の標的細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位にプレクストリン ｍＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返すことによって達成できる。
【００８４】
本発明の遺伝子治療方法は、前述するアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の方法を包含する。
またプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
後述する、プレクストリンに対応する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクターによりヒトプレクストリンがアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に精神***病患者をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、精神***病患者以外にも 精神***病合併症の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
また、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、特に脳・神経組織、脳細胞、脳神経細胞の他、プレクストリン発現が認められる組織の細胞、心臓、胎盤、肺、肝臓、膵臓、脾臓、小腸、末梢血組織以外に、神経細胞、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げることができる。
【００８５】
上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
ウイルス的導入方法としては、例えば、プレクストリンのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどが挙げられる。
【００８６】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al.,J.Biol.Chem.,266,22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87,9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al.,Science,247,1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechnol.,11,202 (1993); Miller,et al.,FASEB J.,9,190 (1995)〕などを使用することができる。
【００８７】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al.,J.Biol.Chem.,266,14338 (1991); Ferkol,et al.,FASEB J.,7,1081-1091 (1993)〕や、腫瘍細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87,3410 (1990)〕などが含まれる。
【００８８】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノウイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【００８９】
以下、具体的な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法について述べる。
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン に対応する全アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージング・シグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【００９０】
所望のプレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
尚、所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat.,23,747 (1995)〕を採用することもできる。なお、上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【００９１】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158,39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84,2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12,28-34 (1994)〕およびケナーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91,6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ちプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド、そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを包含する本発明ベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３'側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【００９２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【００９３】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【００９４】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【００９５】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶと共に回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【００９６】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【００９７】
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res.,159,399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【００９８】
以下、該膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似またイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比)コレステロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【００９９】
また、別のリポソームを用いてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C.,196,1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１００】
プラスミド包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）およびＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として１ｍＭ）を調製する。次いで総量１μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで２０μｇの遺伝子導入用プラスミドを含む０．５mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１０１】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として０．６μｇ、リポソーム脂質量として３０nmolになるように包埋し、これを２μｌのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１０２】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義されている。しかしながら、本発明における遺伝子治療とは、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞にプレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチドのプレクストリン発現抑制アンチセンスＤＮＡとして特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することによって精神***病疾患の治療のみならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むものとする。
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１０３】
その第１法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするプレクストリン をアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や動脈硬化症、癌、ＡＩＤＳなどの治療に好適であると報告されている。
【０１０４】
第２法は、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の脳内や肺、肝臓、小腸組織などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
上記遺伝子治療の第１法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などの適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリン アンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するベクターを加える。 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に３２℃で１時間、2500回転にて遠心分離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、例えば所望の対象が-本発明のようにプレクストリン活性であればその活性の程度を測定することにより、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認する。活性の程度は前記プレクストリン活性すなわち、プレクストリン遺伝子の過剰発現に基づく、脳内ドーパミン１、ドーパミン２、ノルアドレナリン、セロトニン(5-HT)、アセチルコリンなどの交感神経刺激物質の過剰産生活性、交感神経伝達物質受容体の受容体刺激活性、これら神経伝達物質の伝達障害活性を引き起こす活性の程度を測定すればよい。
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。
ここでウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞１×１０8細胞に対して１×１０3ｃｆｕから１×１０8ｃｆｕの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１０５】
上記第１法の別法として、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞へアンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を採用することもできる。
遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、あるいは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニターするなどにより、遺伝子治療に際してアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１０６】
本発明遺伝子治療法において、特に精神***病や精神***病合併症を対象とする場合は、患者から例えば末梢血細胞(プレクストリン発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする末梢血細胞(プレクストリン発現細胞)に導入し、Ｇ４１８細胞にてスクリーニングした後、ＩＬ−１２などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施行し、患者末梢血や肺、肝臓、小腸組内または脳内に接種する精神***病およびその合併症治療法を一例として挙げることができる。
【０１０７】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（プレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチド等）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１０８】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記したプレクストリン蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
一般には、医薬製剤としての所望アンチセンス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルスの力価として約１×１０3ｐｆｕから１×１０15ｐｆｕ程度とするのがよい。また所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、１×１０4細胞／bodyから１×１０15細胞／body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１０９】
本発明に従う遺伝子治療を精神***病の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来の向精神薬療法、作業療法、などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１１０】
また本発明によれば、プレクストリン遺伝子の存在を検出するために、組織又は体液（例えば血液または血清）のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、プレクストリン遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。 該検出方法は、例えば、プレクストリンＤＮＡ断片を作成し、プレクストリン遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したプレクストリンの全部叉は一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずプレクストリンと同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該プレクストリン配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１１１】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、プレクストリン断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０１１２】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
また、本発明の測定方法は、試料中のプレクストリン遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０１１３】
故に本発明は上記プレクストリン ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするプレクストリン遺伝子の検出用試薬キットが提供される。
該試薬キットは、少なくとも配列番号２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０１１４】
更に本発明は、前記測定方法を用いる精神***病の診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０１１５】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたプレクストリン配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型プレクストリンと相同性の高い相同物である新たなプレクストリン遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のプレクストリン ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトプレクストリン遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０１１６】
また、本発明の配列番号１で示されるヒトプレクストリン遺伝子でコードされる蛋白質、または該配列番号１において、１もしくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはこれらの断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する抗体を合成することによって、野生型プレクストリンおよび／または変異プレクストリンの測定が可能となる。
【０１１７】
従って、本発明は、野生型プレクストリンおよび／または変異プレクストリンの抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。該測定法によって精神***病の障害の程度、或いは精神***病の進行の度合を野生型プレクストリンポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるプレクストリン配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、プレクストリン蛋白質中の相違、またはプレクストリン蛋白質の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、プレクストリン抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からプレクストリン蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でプレクストリン蛋白質と反応することができる。また、プレクストリン抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のプレクストリン蛋白質を検出することができる。
抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
野生型プレクストリンまたはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０１１８】
また、本発明は、プレクストリン蛋白に対するプレクストリン結合活性を有する細胞膜画分または細胞表面上に存在するプレクストリンレセプターをも提供することが可能である。該プレクストリンレセプターの取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識したプレクストリン蛋白をコンジュゲートさせ、プレクストリン結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物のアミノ酸配列を特定することによって達成され、該プレクストリンレセプター蛋白の取得並びに配列決定は、この分野の当業者には容易に達成できる。
【０１１９】
また本発明は、プレクストリンレセプター蛋白質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物(プレクストリンレセプター反応物：化合物は低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、または抗体など言う)をスクリーニングすることに利用可能である。好ましくは、プレクストリンレセプターを利用する。かかるスクリーニング試験に用いるプレクストリンレセプターポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。
薬剤スクリーニングの一例としては、例えば、プレクストリン蛋白質またはその断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用することができる。また遊離のまたは固定した形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもできる。より具体的には、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片と、試験する物質との間の複合体の形成を測定し、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とプレクストリン蛋白質またはその断片との間の複合体の形成が試験する物質によって阻害される程度を検出することによって化合物をスクリーニングすることが可能である。
かくして、本発明は、当該分野で既知の方法によって、かかる物質とプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片との間の複合体の存在、またはプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片とリガンドとの間の複合体の存在について測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、プレクストリンレセプター活性を測定して、かかる物質がプレクストリンレセプターを阻害でき、かくして上記定義されたプレクストリンの活性、例えばドーパミンなどの交感神経刺激作用、ドーパミンレセプターなどのレセプターの刺激作用、或いはノルアドレナリンなどの交感神経の伝達刺激作用などを調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節または複合体形成能の調節ができるかどうか判断する。かかる競合結合アッセイにおいて、より具体的には、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片を標識する。遊離のプレクストリンレセプター蛋白質またはその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子のプレクストリンレセプターに対する結合またはプレクストリンレセプター：プレクストリン蛋白質結合の阻害の尺度となる。プレクストリン蛋白質の小さなペプチド(ペプチド疑似体)をこのように分析し、プレクストリンレセプター阻害活性を有するものを測定できる(後記ｂ)。
【０１２０】
本発明において、薬剤スクリーニングのための他の方法は、プレクストリンレセプター蛋白質に対して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリーニング法であって、概略すると、多数の異なるペプチド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験化合物をプレクストリンレセプター蛋白質と反応させ、洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合プレクストリンレセプター蛋白質を検出する方法も例示できる（ＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精製されたプレクストリンレセプターは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を補足し、プレクストリンレセプター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも目的とし、プレクストリンレセプター蛋白質またはその断片に対する結合性につき、プレクストリンレセプター蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競合させる。抗体による該競合によって、プレクストリンレセプター蛋白質の１またはそれ以上の抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可能である。
【０１２１】
また、本発明のプレクストリン活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法において、例えば、プレクストリン遺伝子発現産物またはプレクストリン蛋白質(以下、プレクストリン蛋白質と併せて称する)、またはそれらの断片に対する抗体と、被検液および標識化されたプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中のプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩を定量するスクリーニング方法も可能である(後記ｂ)。
また被検液と担体上に不溶化した前記抗体および標識化された別の異なるプレクストリン蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法も可能である。
さらに、プレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた場合とプレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触させた場合における、プレクストリン蛋白質、プレクストリン蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を測定して、比較することによってプレクストリン蛋白質またはその塩の活性（例、プレクストリン活性）を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングすることも可能である(後記d)。
【０１２２】
本発明によれば、プレクストリンポリペプチドまたはプレクストリン遺伝子発現産物の機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって、(a)候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接または間接的に結合させた標識により測定する方法、(b)候補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識競合物質(プレクストリン抗体またはプレクストリンレセプター)の存在下で測定する方法、(c)候補化合物が該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性化または抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、(d)候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドまたは遺伝子発現産物を含有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性を測定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、および(e)候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法が提供される。
【０１２３】
また、薬剤スクリーニングに関し、さらなる方法としては、非機能性プレクストリン遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が例えば、細胞の成長を調節できるかどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節叉は複合体形成能の調節できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段として、プレクストリンレセプターの生物活性を測定することも可能である。
【０１２４】
また本発明によれば、より活性または安定した形態のプレクストリン蛋白質誘導体または例えば、イン・ビボ(in vivo)でプレクストリン蛋白質の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナログ、例えばプレクストリンアゴニスト、プレクストリンアンタゴニスト、プレクストリンインヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは例えばプレクストリンと他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたは、これらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
また上記より活性または安定した形態のプレクストリン蛋白質誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析することが可能である。該方法はアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なプレクストリン誘導体を設計することができる。
【０１２５】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
かくして、改善されたプレクストリン活性もしくは安定性またはプレクストリン活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０１２６】
また本発明によれば、プレクストリン遺伝子含有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することによってプレクストリン遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なプレクストリン活性に影響を与えるかどうか、即ちプレクストリン遺伝子産物、並びに改変プレクストリン遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989)）。
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、本発明のヒト野生型プレクストリン遺伝子および変異プレクストリン遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたプレクストリン活性もしくは安定性またはプレクストリン活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明によれば、プレクストリンオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、該オリゴヌクレオチド・プローブと結合する検体中のプレクストリン 遺伝子または遺伝子産物を検出することによって、精神***病を検出する検出方法および検出用キットが提供される。
本発明によれば、プレクストリン遺伝子発現産物を抗原とする抗体を製造することが出来る。本発明によれば、該抗体による精神***病の診断および該抗体を有効成分とする精神***病に対する医薬組成物並びに医薬が提供される。
また、本発明によれば、プレクストリン遺伝子がコードするプレクストリン蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、プレクストリン蛋白質活性やプレクストリン蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
またプレクストリン蛋白質は、プレクストリン遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、精神***病、および精神***病合併症）の病態解明や診断、治療などに有用である。
本発明によれば、更にプレクストリンアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該プレクストリンアンチセンスセンス・オリゴヌクレオチド導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
本発明によれば、プレクストリン遺伝子または遺伝子発現産物を用いる相互作用物のスクリーニング方法が提供される。
【０１２８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
＜ディファレンシャル ｍＲＮＡディスプレー法による遺伝子の単離＞
（１）アンカープライマーによるｐｏｌｙ（Ａ）−ｍＲＮＡの選択的逆転写
精神***病患者のうち投薬治療群（７例）と未投薬治療群（３例）および健常者（１１例）の末梢血単核球より常法により抽出したｍＲＮＡのそれぞれ１３μｌ（1μｇ）に、３'−アンカープライマーとして、ジエチルピロカーボネート処理水に溶かした２５ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマーＧ（Ｔ）１５ＭＡ（ＧＴ１５Ｍ−Ａ、−Ｃ、−Ｇ、−Ｔ；ＭはＡ、Ｃ及びＧのミックスである）（表２）を１μｌ加え、７２℃で２分間加熱処理した。
【０１２９】
【表２】
次いで、この溶液に４μｌの５×ファースト・ストランド緩衝液（ＢＲＬ社製）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ社製）、１μｌの２５０μＭｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、１μｌのリボヌクレアーゼ・インヒビター（４０単位；ＴＯＹＯＢＯ社製）および１μｌのスーパースクリプトII逆転写酵素（２００単位；ＢＲＬ社製）を加え、４２℃で１時間反応させてｃＤＮＡを合成した。
【０１３１】
（２）アービタリープライマーを用いた第２鎖合成
合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、アービタリープライマー（表３）を用いた第２鎖合成を以下の条件で行った。
即ち、１μｌのｃＤＮＡに対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラ社製）、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（ＢＲＬ社製）、０．２５μｌのＥx ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍｌ：タカラ社製）、１μｌの〔γ−33Ｐ〕ＡＴＰで標識した２５pmolの３'−アンカードプライマーおよび１μｌの２５pmol５'−アービタリープライマー（表３）および１０．２５μｌの蒸留水を加えた。また、ＰＣＲ反応は以下の条件で行なった。即ち、９５℃で５分間の後、９５℃で３分間、４０℃で５分間および７２℃で５分間を１サイクルとして行ない、それから９５℃で０．５分間、４０℃で２分間および７２℃で１分間を２５サイクル行ない、最後に７２℃で５分間反応させた。
【０１３２】
【表３】
（３）電気泳動による分離
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、熱変性させ1本鎖に解離した状態で６％アクリルアミド、７．５Ｍ ウレアシーケンシングゲルにアプライし、電気泳動を行った。泳動終了後ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。健常者では発現せず***病患者群（投薬群，未投薬群の両方）で発現した特異バンドを乾燥ゲルから切り出し、初回と同一の条件でのＰＣＲによる目的フラグメントの再増幅を行った。電気泳動後、同様にゲルから切り出したバンドからＰＣＲ産物を精製し、さらに３回目のＰＣＲを同一条件で行なった。このＰＣＲ産物をpUC系のベクターにサブクローニングし、オートシーケンサー（ABI377 auto-sequencer, Applied Biosystems）により、塩基配列を決定した。
【０１３４】
（４）ＲＴ−ＰＣＲによるスクリーニング
ＤＤ法により得られた遺伝子断片の各塩基配列より、プライマーを設計後、患者および健常者の末梢血単核球より抽出したｍＲＮＡを用い、RT-PCRで一次スクリーニングを行った。ここで発現量に差のある候補遺伝子を単離した。
【０１３５】
（５）ｃＤＮＡの全長単離
ＤＤ法により得られた遺伝子断片をプローブとして，遺伝子断片の塩基配列を基にプライマーを設計し，５'− RACE（Rapid Amplification of cDNA End）法によりｃＤＮＡの全長の単離を行った。また得られた配列を基にホモロジー検索を行った。
【０１３６】
実施例２
＜候補遺伝子のスクリーニング法（競合的 RT-PCR法）＞
競合的ＤＮＡ構築キット（Competitive DNA Construction Kit;タカラ社製）を用いてPleckstrinおよびGAPDH(ハウスキーピング遺伝子)のＤＮＡコンペティターを作製した。作製したＤＮＡコンペティターと、患者全ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを用いて競合的ＰＣＲを行った（健常者(n=21),精神***病患者(n=53),その他の疾患者(n=12)）。
（１）ＤＮＡコンペティターの作製
ＤＮＡコンペティターの作製には、競合的ＤＮＡ構築キット(Competitive DNAConstruction Kit:タカラ社製：TaKaRa)を用いて、λＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行ない、ＳＵＰＲＥＣ−２(タカラ社製)を用いてプレクストリンおよびＧＡＰＤＨ(ハウスキーピング遺伝子)のＤＮＡコンペティターをそれぞれ精製した。
即ち、ＤＮＡコンペティター作製には、２５μｌの２×プレミックス液(Premix solution)、０．５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、０．５μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーおよび２４μｌの水を用いて、最終量５０μｌとした。プレクストリンＤＮＡコンペティター作製には、配列番号３で示されるＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、および配列番号４で示されるＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーを用いた。また、ＧＡＰＤＨのＤＮＡコンペティター作製には、配列番号５で示されるＤＮＡコンペティター作製用センス・プライマー、および配列番号６で示されるＤＮＡコンペティター作製用アンチセンス・プライマーを用いた。ＰＣＲ反応は、それぞれ９４℃で０．５分、次いで６０℃で０．５分、７２℃で０．５分のサイクルを３０サイクル行った。
（２）ＤＮＡコンペティターのコピー数の計算
精製したＤＮＡコンペティターの吸光度(OD260)を測定し，下記の計算式よりコピー数を算出した。
【０１３７】
【数１】
（３）競合的ＰＣＲによるプレクストリン遺伝子発現の定量
健常者(n=21), 精神***病患者(n=53), その他の疾患者(n=12)の末梢血単核球より全 RNAを抽出、精製し、精製した全 ＲＮＡ(1μｇ/μｌ)よりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと作製したＤＮＡコンペティターを混合して競合的ＰＣＲを行った。
即ち、ＩＳＯＧＥＮ（和光社製）を使用して健常者、精神***病患者、その他の精神病患者の末梢血単核球のそれぞれから、全ＲＮＡを単離した後、１０単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（ベーリンガー・マインハイム社製）で３０分間処理し、クロロフォルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。次いで精製して得られた全ＲＮＡ５μｇから一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄ（Ｔ）を使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（商標） ＲＮａｓｅＨ-逆転写酵素（ライフ・テクノロジー社製）によって合成し、得られた各ｃＤＮＡ産物を競合的ＰＣＲ増幅のために用いた。
検体からのｃＤＮＡと作製したＤＮＡコンペティターを混合して競合的ＰＣＲを行い、この際、標的とするプレクストリン遺伝子のコピー数を算出するための検量線を作成するため、コンペティターの濃度を振った。
ＰＣＲ反応に、２５μｌの最終容量からなる、２．５μｌの上記各検体からのｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのＤＮＡコンペティター(１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8コピー／２．５μｌ)、２．５μｌの１０×緩衝液(TOYOBO社製)、２．５μｌの２．５ｍＭ ｄＴＮＰｓ(TOYOBO社製)、０．５μｌの１０μＭ プレクストリン センス・プライマー(配列番号７)、０．５μｌの１０μＭ プレクストリンアンチセンス・プライマー(配列番号８)、０．２５μｌのピロコッカスＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラーゼのＫＯＤｄａｓｈ(2.5単位/μｌ：TOYOBO社製)、および蒸留水（ニッポンジーン社製）の反応液を調製した。
ＰＣＲ反応は、９５℃で２分、続いて９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７５℃で０．５分を３０サイクルの条件で反応させた。
尚、対照として用いたＧＡＰＤＨに対しては、ＧＡＰＤＨセンス・プライマー(配列番号９)、およびＧＡＰＤＨアンチセンス・プライマー(配列番号１０)が用いられ、該ＧＡＰＤＨ対するＰＣＲ反応は、９５℃で２分、続いて９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７５℃で０．５分を３０サイクルの条件で反応させた。
かくして得られた各ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し，ゲルドライヤーを用いてろ紙上で乾燥させた。乾燥後イメージプレートに露光し、モレキュラー・イメージャーＧＳ−５２５(Molecular Imager GS-525：バイオ・ラド社製)を用いて画像データを取り込み、モレキュラー・アナリスト(Molecular Analyst:バイオ・ラド社製)を用いてデータ解析を行った。
発現量は単位ＧＡＰＤＨコピー数あたりの発現プレクストリンコピー数（発現量＝Pleckstrinコピー数/GAPDHコピー数）で算出した。その結果を図１に示す。図１に示されるように候補遺伝子プレクストリンが、健常者あるいは精神***病以外の精神病患者群に比べ有意に精神***病患者で有意に発現していた。
上記の結果から、プレクストリン遺伝子は、精神***病患者で特異的に高発現しており、精神***病患者の診断に有用であることがわかる。
【０１３９】
実施例３
＜ノーザンブロット解析および染色体の局在の決定＞
ノーザンブロット解析により発現量に差のあるｍＲＮＡに由来しているかの確認をおこなった。
組織におけるプレクストリンの発現プロファイルを調べるため、各種のヒト組織を用いたノーザンブロット分析を行った。
ノーザン・ブロツト分析には、ヒトＭＴＮ（Multiple-Tissue Northern）ブロットＩとII（クローンテック社製）を使用した。ｃＤＮＡ断片は、Ｔ３とＴ７プロモーター配列のプライマー・セットを用い、ＰＣＲによって〔γ−33Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識した上記実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物を含むメンブランをプレハイブリダイズ（条件は製品のプロトコールに従った）し、それから製品のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、洗浄した膜を−８０℃で２４時間オートラジオグラフに露光した。用いたヒト組織は、心臓（Heart）、脳（brain）、胎盤（Placenta）、肺（Lung）、肝臓（Liver）、骨格筋（S. muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓（Pancreas）、脾臓（Spleen）、胸腺（Thymus）、前立腺（Prostate）、精巣（Testis）、卵巣（Ovary）、小腸（Small intestine）、結腸（Colon）および末梢血白血球（Peripheral blood leukocyte; P.B.L.）である。
その結果、プレクストリンに相同する約３ｋｂの転写体が末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎、および骨髄に発現していたが、発現の強弱はそれほど認められなかった。
【０１４０】
遺伝子解析結果
ディファレンシャル ｍＲＮＡディスプレー法による解析の結果、精神***病患者群（投薬群，無投薬群）に発現が認められるバンドが多数検出できた。一次スクリーニングの結果、候補遺伝子を絞り込み、さらに２次スクリーニングとして定量的に競合的ＰＣＲ法により測定した。その結果、候補遺伝子プレクストリンが、健常者あるいは精神***病以外の精神病患者群に比べ有意に***病患者で発現していた（図１）。プレクストリンは、その塩基配列よりGenBankに登録されているプレクストリン（ACCESSION X07743）の遺伝子断片であった。分子量が約４７Ｋのタンパク質で血小板に多く存在し、血小板ＰＫＣの主要な基質で、活性化されるとすみやかにリン酸化される血小板の活性化マーカとして知られている。Ｎ，Ｃ末端にそれぞれプレクストリンホモロジードメインを有する構造である。
【０１４１】
臨床症状との関連性
精神***病患者（27例）の末梢血単核球中のプレクストリンの発現量と、採血時の患者の精神症状をPANSS(Positive and Negative Syndrome Scale: Kay, S.R., Schizophr. Bull, 13, 261-276(1987))による構成で比較することにより、精神症状とプレクストリン遺伝子発現の関連性を検討した。その結果、図2に示すように、構成のポイントとプレクストリンの発現量には相関関係（ｒ=0.52, P<0.01）があった。プレクストリン遺伝子は精神***病の精神症状を判断するのに有用である。
【０１４２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】健常者、精神***病患者及びその他の精神病患者におけるプレクストリン遺伝子発現量を示すグラフである。
【図２】プレクストリン遺伝子発現量と精神症状の関連性を示すグラフである。
Claims (16)
- 配列番号２で示される塩基配列にハイブリダイズし、プレクストリン遺伝子を特異的に検出することができるオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを用いて、末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄からなる群より選択される体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子の発現量を定量的に測定し、該プレクストリン遺伝子の発現量が、健常者又は精神***病以外の精神病患者群と比べて高い場合に、当該体液又は組織検体が精神***病患者由来であると判断することを含む、精神***病患者由来の体液又は組織検体の検出方法。
- ＲＴ−ＰＣＲ法又は競合的ＰＣＲ法を用いることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブが、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーである、請求項１又は２記載の検出方法。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるプレクストリン蛋白質に結合する抗体又はその断片を用いて、該抗体又はその断片に結合する末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄からなる群より選択される体液又は組織検体中のプレクストリン蛋白質を定量的に測定し、該プレクストリン蛋白質の測定量が、健常者又は精神***病以外の精神病患者群と比べて高い場合に、当該検体が精神***病患者由来であると判断することを含む、精神***病患者由来の体液又は組織検体の検出方法。
- 配列番号２で示される塩基配列にハイブリダイズし、プレクストリン遺伝子を特異的に検出することができるオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを含有する精神***病診断剤。
- 前記オリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブが、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーである、請求項５記載の精神***病診断剤。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるプレクストリン蛋白質に結合する抗体又はその断片を含有する精神***病診断剤。
- 請求項５〜７のいずれか１項記載の精神***病診断剤を含む精神***病診断用キット。
- 配列番号２で示される塩基配列にハイブリダイズし、プレクストリン遺伝子を特異的に検出することができるオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを用いて、精神***病患者由来の末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄からなる群より選択される体液又は組織検体中のプレクストリン遺伝子の発現量を定量的に測定し、該プレクストリン遺伝子の発現量が高い場合に、精神***病患者におけるＰＡＮＳＳの精神症状の構成のポイントが高いと判断することを含む、精神***病患者の精神症状の検出方法。
- ＲＴ−ＰＣＲ法又は競合的ＰＣＲ法を用いることを特徴とする請求項９記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブが、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーである、請求項９又は１０記載の検出方法。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるプレクストリン蛋白質に結合する抗体又はその断片を用いて、該抗体又はその断片に結合する精神***病患者由来の末梢血白血球、脾臓、リンパ節、副腎及び骨髄からなる群より選択される体液又は組織検体中のプレクストリン蛋白質を定量的に測定し、該プレクストリン蛋白質の測定量が高い場合に、精神***病患者におけるＰＡＮＳＳの精神症状の構成のポイントが高いと判断することを含む、精神***病患者の精神症状の検出方法。
- 配列番号２で示される塩基配列にハイブリダイズし、プレクストリン遺伝子を特異的に検出することができるオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを含有する精神***病患者の精神症状の診断剤。
- 前記オリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブが、配列番号３及び４、或は配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド・プライマーである、請求項１３記載の精神***病患者の精神症状の診断剤。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるプレクストリン蛋白質に結合する抗体又はその断片を含有する精神***病の精神症状の診断剤。
- 請求項１３〜１５いずれか１項記載の診断剤を含む精神***病の精神症状の診断用キット。
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