CN110652589A - Gasc1抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GASC1抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用，利用本发明的方法能够抑制肝癌细胞和具有“干性”特征的肝癌细胞增殖、克隆及肿瘤的形成，促进肝癌细胞和肝癌干细胞对索拉菲尼的敏感性，降低肝癌干细胞对索拉菲尼的耐药性，同时还能增强索拉菲尼对肝癌细胞和肝癌干细胞的细胞凋亡，从源头上杀死“干性”特征的肝癌细胞，为彻底治愈肝癌带来新希望。

Description

GASC1抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及GASC1抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
肝癌(hepatocellular carcinomas，HCC)作为一个全球范围的恶性肿瘤，在亚洲尤其是中国发病率及死亡率极高，手术、放化疗等传统治疗方法难以彻底治愈；目前对肝癌的治疗缺乏有效的药物，究其原因是肝癌对治疗药物易产生耐药的特性。
肝癌具有高度异质性、预后不良和药物反应差的特征；肝癌的发生发展及转移与肿瘤微环境及胞内的多条信号通路异常活化等密切相关，如Notch,Ras/Raf/MAPK,WNT/β-catenin等信号通路。其中，Notch信号通路在调控肝癌发展及转移过程中扮演着重要的角色；研究发现Notch信号通路可促进肝癌干细胞的对称***，抑制非对称***，促进肝癌的自我更新及肿瘤的形成。Ras/Raf/MAPK是真核细胞中广泛存在的一条复杂的高度保守的细胞信号传导通路，在肝癌的发生发展、恶性转化及耐药过程中非常重要。而小分子靶向药物多美吉，又称索拉菲尼(sorafenib)，是第一个获得食品和药物管理局批准用于晚期HCC治疗的药物，是一种口服的多靶点激酶抑制剂，可以靶向作用于肿瘤细胞的丝氨酸/苏氨酸激酶及受体酪氨酸激酶及肿瘤血管上的生长因子。国内外研究报道，索拉非尼能够延缓肝癌的进展并且能够延长晚期患者生存期。目前，索拉非尼除了用于肝癌患者的治疗外，还在乳腺癌、肾癌等病人中使用，但是癌症患者在使用索拉非尼时易产生耐药特性。肿瘤干细胞理论学说认为，肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSCs)是肿瘤发生的“种子”，是肿瘤发生、演进、治疗抵抗、复发以及转移的根源。因此，亟待研究并开发出能够针对肿瘤干细胞的靶向药物，从源头杀死肿瘤干细胞，对于肝癌的发病机制以及临床开发针对性治疗策略具有重要的理论价值和实践意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供GASC1抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种治疗肝癌的复合物；本发明的目的之三在于提供所述的复合物在制备治疗肝癌药物中的应用；本发明的目的之四在于提供GASC1抑制剂在制备克服肝癌对索拉菲尼耐药性的药物中的应用；本发明的目的之五在于提供GASC1抑制剂在制备增强索拉菲尼对肝癌敏感性的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、GASC1抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
优选的，所述GASC1抑制剂为SD70或干扰GASC1表达的慢病毒或腺相关病毒。
优选的，所述干扰GASC1表达的慢病毒含有Lv-sh-GASC1质粒。
优选的，所述GASC1抑制剂在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞克隆形成、成球能力或成瘤能力的药物中的应用。
2、所述复合物含有GASC1抑制剂和索拉菲尼。
3、所述的复合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
优选的，所述的复合物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞克隆形成、成球能力、成瘤能力的药物中的应用。
优选的，所述的复合物在制备促进肝癌细胞或肝癌干细胞凋亡的药物中的应用。
4、GASC1抑制剂在制备克服肝癌对索拉菲尼耐药性的药物中的应用。
5、GASC1抑制剂在制备增强索拉菲尼对肝癌敏感性的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了GASC1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药物中的应用，利用GASC1抑制剂干扰或抑制GASC1表达抑制肝癌干细胞的增殖、克隆和肿瘤的形成，同时提高肝癌干细胞对索拉菲尼敏感性和增强索拉菲尼对肝癌干细胞的凋亡，利用本发明的方法还能降低肝癌干细胞对索拉菲尼的耐药性，杀死肝癌干细胞，为彻底根除肝癌带来新希望。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为数据库分析GASC1在临床肝癌组织中的表达及临床预后的情况(A：cBioPortal数据库分析GASC1在不同肿瘤组织中的表达情况；B：三种GSE数据库(GSE14323，GSE25097和GSE6764)分析GASC1在临床肝癌组织样品中的表达；C：Kaplan-Meier方法分析TCGA数据库中GASC1的表达与肝癌患者预后的关系)。
图2为GASC1抑制剂SD70对肝癌细胞及肝癌干细胞克隆形成、肿瘤形成及细胞凋亡的影响(A：GASC1抑制剂SD70处理后，检测其对细胞克隆形成力的影响；B：GASC1抑制剂SD70处理后，检测其对肿瘤形成能力的影响；C：GASC1抑制剂SD70处理后，检测其对细胞凋亡情况的影响)。
图3为抑制GASC1表达可显著降低肝癌干细胞自我更新及肿瘤的形成(A：干扰GASC1后可显著降低肝癌干细胞的克隆及成球能力；B：干扰GASC1后可显著降低肝癌干细胞的成瘤能力)。
图4为GASC1抑制剂SD70处理或抑制GASC1的表达联合索拉菲尼处理对细胞凋亡的影响(A：SD70联合索拉非尼对肝癌细胞及肝癌干细胞凋亡情况的影响；B：敲除GASC1联合索拉非尼对肝癌细胞凋亡情况的影响)。
图5为肝癌干细胞中GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼处理移植瘤对细胞克隆和移植瘤体积的影响(A：克隆形成率；B：成瘤能力)。
图6为肝癌干细胞中GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼处理对移植瘤Ki-67表达和凋亡情况的影响(A：Hep3B；B：PLC/PRF/5)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明使用的肝癌细胞系PLC/PRF/5、Huh7、HepG2和Hep3B及HEK293T细胞由本实验室保存；Lv-NT-shRNA质粒和Lv-shGASC1质粒由本实验室构建，具体见(Liu etal.Cancer Research 2018,78(4):938-949)；细胞转染试剂盒采购自美国QIAGEN公司；CRISPR/Cas9对照质粒及GASC1CRISPR/Cas9敲除质粒采购自美国Santa CruzBiotechnology公司。
本发明使用的EnvisionTM和DAB显色液购自丹麦DAKO公司；EDTA(pH 8.0)抗原修复液购自福州迈新生物技术开发公司。索拉菲尼(sorafenib)片剂购自德国Bayer Scheringpharma AG公司；SD70购自美国Xcessbio Biosciences Inc公司；细胞凋亡检测抗体试剂盒购自美国Cell Signaling Technology公司；
Figure BDA0002231027290000031
3/7分析试剂盒购自美国Promega公司。
实施例1、数据库分析GASC1在临床肝癌组织中的表达及临床预后的情况
已有的研究表明，GASC1(赖氨酸去甲基化酶4C)在调控肿瘤的增殖、侵袭转移、肿瘤形成和抑制细胞凋亡等过程扮演着重要的作用，尤其在***癌和白血病中。GASC1可调控肿瘤细胞的氨基酸代谢促进肿瘤的发生发展。然而GASC1在肝癌中的作用还有待进一步阐明。基于此，本发明通过cBioPortal数据库分析GASC1在不同肿瘤组织中的表达情况，发现GASC1在不同的肿瘤中均出现不同程度的基因扩增。进一步分析三种肝癌GSE数据库(GSE14323，GSE25097和GSE6764)分析GASC1在临床肝癌组织样品中的表达，结果如图1所示。结果发现GASC1在肝癌组织中异常高表达，与癌旁组织相比较。而Kaplan-Meier方法分析TCGA数据库中GASC1的表达与肝癌患者预后的关系，发现GASC1高表达的肝癌患者预后较差，而GASC1低表达的肝癌患者预后较好。上述分析结果提示，GASC1可能在肝癌发生发展过程中扮演着重要的癌基因的作用，为靶向GASC1治疗肝癌提供了数据支撑。
实施例2、GASC1抑制剂SD70对肝癌细胞及肝癌干细胞克隆形成、肿瘤形成及细胞凋亡的影响
GASC1抑制剂SD70溶液的配置：用体积分数为1％的DMSO配置成100mg/mL的储存液，使用时用完全培养基配置成所需的浓度。
细胞凋亡检测试剂盒抗体稀释：按体积比为1:1000稀释。
为阐明GASC1在肝癌发生发展中的生物学功能，采用GASC1的小分子抑制剂SD70处理GASC1高表达的肝癌细胞系Hep3B和肝癌细胞系SMMC-97H，同时检测通过流式从肝癌细胞系PLC/PRF/5和肝癌细胞系Huh7分选出的具有“干性”特征的细胞亚群，分别记为PLC/PRF/5CSC和Huh7CSC。结果表明，不同浓度的GASC1抑制剂SD70(0-2.5μM)处理肝癌细胞及肝癌干细胞可显著抑制细胞克隆形成能力，并具有剂量依赖性(图2，A)。进一步采用SD70预处理的肝癌细胞进行NOD/SCID小鼠皮下移植瘤实验，进一步证实SD70预处理的肝癌细胞皮下成瘤能力显著下降(图2，B)，体外采用不同浓度或同一浓度不同时间处理肝癌细胞，检测凋亡因子表达情况，发现SD70处理后可显著促进肝癌细胞的凋亡，且具有时间和剂量依赖性(图2，C)。以上研究证实GASC1酶活性在肝癌增殖、成瘤及抑制细胞凋亡过程中具有重要的作用。
实施例3、抑制GASC1表达可显著抑制肝癌干细胞自我更新及肿瘤的形成能力
1、慢病毒Lv-sh-GASC1和Lv-NT-shRNA的包装，收集和纯化
(1)慢病毒Lv-sh-GASC1和Lv-NT-shRNA的包装
在10cm的培养皿中铺5×106个293T细胞(最好是20代之前的，细胞的状态必必须良好，生长速度较快，否则对病毒产量影响很大)，培养液含10％FBS的DMEM(v/v)，待细胞汇合至80％时，换新鲜的含10％FBS的DMEM(v/v)培养液，3-4h后用于转染。
取15-20μg的Lv-sh-GASC1和Lv-NT-shRNA慢病毒表达质粒，分别加入pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G，再分别加入无菌水至总体积450μL，混匀，向混合液中分别滴加50μL2.5M的CaCl2，混匀后加入500μL 2×HBS缓冲液(2×HBS缓冲液使用前于涡旋振荡器上震荡)，然后置于涡旋振荡器上震荡10s以上，滴加结束后，继续震荡，室温放置5分钟后，将液体加入培养的293T中，加完后前后左右晃动混匀，加入后6-12小时换新鲜的10％FBS的DMEM(v/v)培养液。
(2)慢病毒Lv-sh-GASC1和Lv-NT-shRNA的收集和纯化
自转染开始后48小时、72小时各收集一次细胞培液，48小时收集后，再补充15mL的培液，将收集的病毒在1,000rpm条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤，滤液转移入Millopore的浓缩柱，在5,000rpm离心至上层凹槽内的液体体积浓缩至1mL(可分多次加入)。将浓缩液分装，置于-80℃低温冰箱保存，以用于后续实验。
2、抑制GASC1表达后检测其对肝癌干细胞自我更新及肿瘤形成能力的影响
将肝癌细胞系PLC/PRF/5和肝癌细胞系Huh7中具有“干性”特征的细胞富集出来，采用慢病毒感染的方式抑制GASC1表达并经嘌呤霉素筛选72小时后，流式细胞仪分选铺板进行细胞克隆、成球和成瘤能力的检测。研究结果表明，细胞克隆和成球经14天培养并做统计分析，发现抑制GASC1的表达可显著降低肝癌干细胞克隆及成球能力，与对照组相比较(图3，A)；采用NOD/SCID小鼠皮下注射干扰GASC1表达的细胞及相对应的细胞，每天观测肿瘤的大小，观测发现对照组小鼠的皮下成瘤能力比干扰GASC1表达组显著增强，连续处理28天后处死小鼠，剥出肿瘤，测量肿瘤体积以及肿瘤重量(图3，B)。以上结果进一步表明GASC1在肝癌干细胞自我更新及肿瘤形成中具有重要的作用，可能是靶向治疗肝癌的理想靶点。
实施例4、GASC1抑制剂SD70处理或抑制GASC1的表达联合索拉菲尼处理对细胞凋亡的影响
索拉菲尼(sorafenib)溶液的配置：先将索拉菲尼片剂碾磨成粉末，接着用体积分数为1％的DMSO配置成100mg/mL的储存液，使用时用完全培养基配置成所需的浓度。
采用CRISPR/Cas9技术构建敲除GASC1的肝癌细胞系Hep3B和肝癌干细胞PLC/PRF/5CSC：CRISPR/Cas9对照质粒及GASC1CRISPR/Cas9敲除质粒采购自美国Santa CruzBiotechnology公司；细胞转染试剂盒采购自美国QIAGEN公司。
高表达GASC1的肝癌细胞系Hep3B细胞经转染GASC1CRISPR/Cas9(sgGASC1)质粒72小时后，经流式细胞仪分选出GFP+的肝癌细胞入96孔板中进行单克隆筛选，14-21天后分别取单克隆入6孔板中进行扩大培养，然后去部分细胞收取蛋白进行western blotting验证敲除效率，选取敲除效率高的细胞进行后续实验。
采用GASC1敲除的细胞或用GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼处理后，检测细胞凋亡的情况：采用构建好的敲除GASC1的细胞及对应的对照组细胞，分别设为对照组细胞、敲除GASC1组及敲除GASC1组加入索拉菲尼组，处理48小时后，通过caspase3/7活性检测试剂盒，经酶标仪检测发现敲除GASC1的细胞caspase3/7活力显著增强，与对照组相比较；而与敲除GASC1组相比较，敲除GASC1组联合索拉菲尼组处理的细胞caspase3/7活力显著增强(图4，A)。结果提示GASC1的高表达可能是肝癌对索拉菲尼治疗不敏感的根源。
为进一步验证抑制GASC1表达联合索拉非尼对肝癌细胞凋亡的影响，采用GASC1抑制剂SD70抑制GASC1活性。分别设为对照组细胞、SD70组以及SD70组联合索拉菲尼组，处理48小时后，通过caspase3/7活性检测试剂盒，经酶标仪检测发现GASC1抑制剂SD70处理的细胞caspase3/7活力显著增强，与对照组相比较；而与SD70组相比较，SD70组联合索拉菲尼组处理的细胞caspase3/7活力显著增强(图4，B)。以上结果说明，抑制GASC1表达或酶活性可显著促进索拉非尼对肝癌细胞及肝癌干细胞的细胞凋亡，抑制肝癌的发生发展。
实施例5、肝癌干细胞中GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼处理移植瘤对细胞克隆和移植瘤体积的影响。
将肝癌细胞用流式细胞仪分选计数铺板种植在24孔板内，200个细胞每孔，每个样品3个重复，次日分别加0μM与2.5μM浓度的索拉菲尼，以及联合GASC1抑制剂SD70。每隔3天吸出培养液，再加相同的浓度，连续处理4次，即14天后用质量分数为4％的多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察并计数每孔细胞的克隆形成率，结果如图5中A所示。由图5中A可知，使用浓度为2.5μM的索拉菲尼对肝癌细胞和肝癌干细胞克隆形成能力没有影响，差异不显著，可能是长期使用索拉菲尼后肝癌细胞和肝癌干细胞对索拉菲尼产生了耐药性，而0.5μM的索拉菲尼联合SD70处理后可显著抑制细胞克隆的形成。提示，降低GASC1的表达量能够降低肝癌患者对索拉菲尼的耐受性。
根据体外细胞克隆的实验，干扰GASC1表达或GASC1抑制剂联合索拉菲尼能显著降低肝癌细胞或具有“干性”特征的肝癌细胞的克隆形成能力。为进一步验证上述结论，在NOD/SCID小鼠体内验证在GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼能显著降低肝癌干细胞的克隆形成能力，具体方法为：注射细胞数量为1×106或5×106，待皮下肿瘤长至50mm3时，将实验NOD/SCID鼠分为4个组：(1)空白对照组，不做处理；(2)索拉菲尼组，按100mg/Kg灌胃索拉菲尼；(3)GASC1抑制剂SD70组，采用腹腔注射的方式；(4)索拉菲尼联合GASC1抑制剂SD70组，按100mg/Kg灌胃索拉菲尼并同时腹腔注射GASC1抑制剂SD70，连续处理10-16天后处死小鼠，剥出肿瘤，测量肿瘤体积(结果如图5中B所示)。由图5中B可知，与对照组相比较，SD70组能够降低移植瘤的体积；而索拉非尼组可抑制肝癌细胞的成瘤能力，但对肿瘤干细胞的成瘤能力没有显著的抑制作用；SD70组联合索拉非尼组可显著抑制小鼠的皮下移植瘤的生长。以上结果提示，抑制GASC1表达后降低了肝癌干细胞对索拉非尼耐药性，最终达到杀伤肿瘤细胞抑制肿瘤进程的作用。
实施例6、肝癌干细胞中GASC1抑制剂SD70联合索拉菲尼处理对移植瘤Ki-67表达和凋亡情况的影响
移植瘤免疫组化及统计分析：将实施例5中的剥出肿瘤用质量分数为4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋，4～5μm连续切片，经H&E染色后在显微镜下观察移植瘤病理学形态，再用EnvisionTM免疫组化技术检测Ki-67和cleaved-caspase3的表达，镜下观察并拍照，结果如图6所示。由图6可知，H&E染色结果表明，与对照组相比，GASC1抑制剂SD70联合索拉非尼处理组的移植瘤，其肿瘤细胞形态未发生改变；免疫组化检测发现Ki-67在抑制GASC1联合索拉非尼处理组的移植瘤与SD70组和索拉非尼组相比显著下降；而cleaved-caspase3的表达却显著升高。上述研究结果进一步证实了GASC1与肝癌干细胞的对索拉非尼耐药机制有关。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.GASC1抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GASC1抑制剂为SD70或干扰GASC1表达的慢病毒或腺相关病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干扰GASC1表达的慢病毒含有Lv-sh-GASC1质粒。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GASC1抑制剂在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞克隆形成、成球能力或成瘤能力的药物中的应用。
5.一种治疗肝癌的复合物，其特征在于：所述复合物含有GASC1抑制剂和索拉菲尼。
6.权利要求5所述的复合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的复合物在制备抑制肝癌细胞或肝癌干细胞克隆形成、成球能力、成瘤能力的药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的复合物在制备促进肝癌细胞或肝癌干细胞凋亡的药物中的应用。
9.GASC1抑制剂在制备克服肝癌对索拉菲尼耐药性的药物中的应用。
10.GASC1抑制剂在制备增强索拉菲尼对肝癌敏感性的药物中的应用。
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