JP2001004632A - 糖鎖構造の変異した癌胎児性抗原類の検出方法 - Google Patents
糖鎖構造の変異した癌胎児性抗原類の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 容易に且つ簡便に糖鎖構造の変異したＣＥＡ
類を分別測定できる方法、この測定結果に基づき癌を鑑
別し得る方法並びに試薬の提供。 【解決手段】 癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略記す
る。）類の不変領域に特異的な抗体と、ＣＥＡ類の変異
した糖鎖構造を認識する蛋白質とを用いることを特徴と
する、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の検出方法、糖鎖構
造の変異したＣＥＡ類の量に基づいて判定を行う、癌の
判定方法、及びＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質
とを含有させて成る、糖鎖の変異したＣＥＡ類の検出用
キット。
類を分別測定できる方法、この測定結果に基づき癌を鑑
別し得る方法並びに試薬の提供。 【解決手段】 癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略記す
る。）類の不変領域に特異的な抗体と、ＣＥＡ類の変異
した糖鎖構造を認識する蛋白質とを用いることを特徴と
する、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の検出方法、糖鎖構
造の変異したＣＥＡ類の量に基づいて判定を行う、癌の
判定方法、及びＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質
とを含有させて成る、糖鎖の変異したＣＥＡ類の検出用
キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌胎児性抗原（ca
rcinoembryonic antigen、以下、「ＣＥＡ」と略記す
る。）の検出方法に関するものであり、特に糖鎖構造の
変異したＣＥＡ類の検出方法及びキットに関する。ま
た、本発明は、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の量を求
め、この量に基づいて判定を行う、癌の判定方法に関す
る。
rcinoembryonic antigen、以下、「ＣＥＡ」と略記す
る。）の検出方法に関するものであり、特に糖鎖構造の
変異したＣＥＡ類の検出方法及びキットに関する。ま
た、本発明は、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の量を求
め、この量に基づいて判定を行う、癌の判定方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＣＥＡは、癌細胞から産生される胎児性
抗原の一つであり、正常消化器粘膜細胞表面および腫瘍
組織から産生され、分子量２０万前後、糖含量が約５０
％の糖蛋白質の一種である。ＣＥＡは、正常ヒトの血中
には存在しないが、大腸癌、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌な
どの臓器癌になると、細胞中や血中の濃度が上昇するこ
とが知られている。そのため、ＣＥＡ量は広範囲の腫瘍
マーカーとして有用であり、血中のＣＥＡ量の測定は、
癌のスクリーニングや術後の経過観察、再発予防に広く
用いられている。しかしながら、血中のＣＥＡ量の測定
だけでは早期癌の鑑別は困難であった。そのため、腫瘍
組織の早期癌の鑑別には、Ｘ線診断、内視鏡的診断等が
おこなわれている。しかし、Ｘ線診断では早期癌を発見
するのは困難であり、内視鏡的診断では診断技術と知識
の程度によって診断が左右されるという問題がある。
抗原の一つであり、正常消化器粘膜細胞表面および腫瘍
組織から産生され、分子量２０万前後、糖含量が約５０
％の糖蛋白質の一種である。ＣＥＡは、正常ヒトの血中
には存在しないが、大腸癌、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌な
どの臓器癌になると、細胞中や血中の濃度が上昇するこ
とが知られている。そのため、ＣＥＡ量は広範囲の腫瘍
マーカーとして有用であり、血中のＣＥＡ量の測定は、
癌のスクリーニングや術後の経過観察、再発予防に広く
用いられている。しかしながら、血中のＣＥＡ量の測定
だけでは早期癌の鑑別は困難であった。そのため、腫瘍
組織の早期癌の鑑別には、Ｘ線診断、内視鏡的診断等が
おこなわれている。しかし、Ｘ線診断では早期癌を発見
するのは困難であり、内視鏡的診断では診断技術と知識
の程度によって診断が左右されるという問題がある。
【０００３】一方、ＣＥＡ類産生細胞である正常消化器
粘膜細胞および腫瘍細胞よりＣＥＡ類を夫々精製し、そ
の糖鎖構造を解析した結果、正常消化器粘膜細胞と腫瘍
細胞とでは結合している糖鎖の構造が違っていることが
判明し、癌の診断に有用ではないかと期待された（Kats
uko Yamashita,J.Biol.Chem.,264(30),17873-17881(198
9)、Katsuko Yamashita,Glycobiology,5(1),105-115(19
95))。しかしこの方法では、採取した細胞からＣＥＡ類
を精製したり、その糖鎖構造を解析しなければならない
ため、診断までに長時間を要するという問題があった。
粘膜細胞および腫瘍細胞よりＣＥＡ類を夫々精製し、そ
の糖鎖構造を解析した結果、正常消化器粘膜細胞と腫瘍
細胞とでは結合している糖鎖の構造が違っていることが
判明し、癌の診断に有用ではないかと期待された（Kats
uko Yamashita,J.Biol.Chem.,264(30),17873-17881(198
9)、Katsuko Yamashita,Glycobiology,5(1),105-115(19
95))。しかしこの方法では、採取した細胞からＣＥＡ類
を精製したり、その糖鎖構造を解析しなければならない
ため、診断までに長時間を要するという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のような状況か
ら、本発明が解決しようとする課題は、容易に且つ簡便
に生体由来試料中の各種ＣＥＡ類を検出できる方法、こ
の測定結果に基づき癌を鑑別し得る方法並びにそのため
に用いられる試薬の提供にある。
ら、本発明が解決しようとする課題は、容易に且つ簡便
に生体由来試料中の各種ＣＥＡ類を検出できる方法、こ
の測定結果に基づき癌を鑑別し得る方法並びにそのため
に用いられる試薬の提供にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような課
題を解決するために成されたものであり、（１）ＣＥＡ
類の不変領域に特異的な抗体（以下、「ＣＥＡ類結合抗
体」と略記する。）と、ＣＥＡ類の変異した糖鎖構造を
認識する蛋白質（以下、「特定糖鎖結合蛋白質」と略記
する。）とを用いることを特徴とする、糖鎖の変異した
ＣＥＡ類の検出方法、（２）糖鎖構造の変異したＣＥＡ
類の量に基づいて判定を行う、癌の判定方法、（３）Ｃ
ＥＡ類結合抗体と、特定糖鎖結合蛋白質を含有させて成
る、糖鎖の変異したＣＥＡ類の検出用キット、に関す
る。
題を解決するために成されたものであり、（１）ＣＥＡ
類の不変領域に特異的な抗体（以下、「ＣＥＡ類結合抗
体」と略記する。）と、ＣＥＡ類の変異した糖鎖構造を
認識する蛋白質（以下、「特定糖鎖結合蛋白質」と略記
する。）とを用いることを特徴とする、糖鎖の変異した
ＣＥＡ類の検出方法、（２）糖鎖構造の変異したＣＥＡ
類の量に基づいて判定を行う、癌の判定方法、（３）Ｃ
ＥＡ類結合抗体と、特定糖鎖結合蛋白質を含有させて成
る、糖鎖の変異したＣＥＡ類の検出用キット、に関す
る。
【０００６】即ち、本発明者らは、上記した如き課題を
解決するために鋭意研究した結果、ＣＥＡ類結合抗体
と、特定糖鎖結合蛋白質を夫々１以上用いることによ
り、生体試料中のＣＥＡ類の総量、特定の変異した糖鎖
構造を有するＣＥＡ類量又は／及びそれ以外の糖鎖構造
を有するＣＥＡ類量を測定し得ることを見出し、更に研
究を重ねた結果、特定の変異した糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類量又はそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類量、或
いは全ＣＥＡ類中の、特定の変異した糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類又はそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の割
合が、例えば大腸癌等の判別に有用であることを見出
し、本発明を完成するに到った。
解決するために鋭意研究した結果、ＣＥＡ類結合抗体
と、特定糖鎖結合蛋白質を夫々１以上用いることによ
り、生体試料中のＣＥＡ類の総量、特定の変異した糖鎖
構造を有するＣＥＡ類量又は／及びそれ以外の糖鎖構造
を有するＣＥＡ類量を測定し得ることを見出し、更に研
究を重ねた結果、特定の変異した糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類量又はそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類量、或
いは全ＣＥＡ類中の、特定の変異した糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類又はそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の割
合が、例えば大腸癌等の判別に有用であることを見出
し、本発明を完成するに到った。
【０００７】本発明に係るＣＥＡ類結合抗体としては、
ＣＥＡ類の不変領域に特異的な性質を有する抗体であれ
ば特に限定されず、常法、例えば［免疫実験学入門、第
２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981］等に
記載の方法に従って、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、ラ
ット、マウス等の動物に測定対象を免役して作製される
ポリクローナル性抗体でも、或いはまた常法、即ちケラ
ーとミルスタイン（Nature、256巻,495頁,1975）により
確立された細胞融合法に従って、例えばマウスの腫瘍ラ
インからの細胞と測定対象物で予め免役されたマウスの
脾臓細胞を融合させて得られるハイブリドーマが産出す
る単クローン性抗体でもよい。また、これらは単独で用
いても、適宜組み合わせて用いてもよい。尚、ＣＥＡ類
の不変領域とは、生体試料中の全てのＣＥＡ類に共通な
構造領域のことを指す（MASAHIDEKUROKI,HYBRIDOMA,4(1
1),391-407(1992))。
ＣＥＡ類の不変領域に特異的な性質を有する抗体であれ
ば特に限定されず、常法、例えば［免疫実験学入門、第
２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981］等に
記載の方法に従って、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、ラ
ット、マウス等の動物に測定対象を免役して作製される
ポリクローナル性抗体でも、或いはまた常法、即ちケラ
ーとミルスタイン（Nature、256巻,495頁,1975）により
確立された細胞融合法に従って、例えばマウスの腫瘍ラ
インからの細胞と測定対象物で予め免役されたマウスの
脾臓細胞を融合させて得られるハイブリドーマが産出す
る単クローン性抗体でもよい。また、これらは単独で用
いても、適宜組み合わせて用いてもよい。尚、ＣＥＡ類
の不変領域とは、生体試料中の全てのＣＥＡ類に共通な
構造領域のことを指す（MASAHIDEKUROKI,HYBRIDOMA,4(1
1),391-407(1992))。
【０００８】ＣＥＡ類結合抗体には、変異した糖鎖構造
を有するＣＥＡ類の当該変異した糖鎖構造に特異的に結
合する蛋白質（特定糖鎖結合蛋白質）が結合したＣＥＡ
類とは結合しない性質を有するＣＥＡ類結合抗体（以
下、「競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）や特定
糖鎖結合蛋白質の結合の有無に拘わらず、全てのＣＥＡ
類と結合し得る性質を有するＣＥＡ類結合抗体（以下、
「非競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）等が含ま
れる。
を有するＣＥＡ類の当該変異した糖鎖構造に特異的に結
合する蛋白質（特定糖鎖結合蛋白質）が結合したＣＥＡ
類とは結合しない性質を有するＣＥＡ類結合抗体（以
下、「競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）や特定
糖鎖結合蛋白質の結合の有無に拘わらず、全てのＣＥＡ
類と結合し得る性質を有するＣＥＡ類結合抗体（以下、
「非競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）等が含ま
れる。
【０００９】本発明に係る特定糖鎖結合蛋白質として
は、例えばＣＥＡ類の特定糖鎖構造に特異的に結合する
抗体、レクチンなどが挙げられる。具体的には、フコー
ス残基又は／及びシアル酸残基の存在を認識する抗体、
更に具体的には、例えばＬｅa,Ｌｅb,Ｌｅx,Ｌｅy等の
ルイス型糖鎖を認識する抗ルイス抗体，Ｓ−Ｌｅa,Ｓ―
ＬｅX等のシアリルルイス型糖鎖を認識する抗シアリル
ルイス抗体等の抗体類、例えばミヤコグサレクチン等の
Ｌ−フコース結合性レクチン、例えばピーナッツレクチ
ン，ダイズレクチン，ヒマレクチン，インゲンマメレク
チン等のＤ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミン結合性レクチン、例えばコンカナバリンＡ，
レンズマメレクチン，エンドウマメレクチン等のＤ−マ
ンノース結合性レクチン、例えば小麦胚芽レクチン，ダ
ツラレクチン等のＮ−アセチルグルコサミン結合性レク
チン、例えばカブトガニレクチン等のシアル酸結合性レ
クチン等のレクチン類が挙げられる。中でもＤ−ガラク
トース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レ
クチン、Ｄ−マンノース結合性レクチン等が好ましい。
また、これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用い
てもよい。
は、例えばＣＥＡ類の特定糖鎖構造に特異的に結合する
抗体、レクチンなどが挙げられる。具体的には、フコー
ス残基又は／及びシアル酸残基の存在を認識する抗体、
更に具体的には、例えばＬｅa,Ｌｅb,Ｌｅx,Ｌｅy等の
ルイス型糖鎖を認識する抗ルイス抗体，Ｓ−Ｌｅa,Ｓ―
ＬｅX等のシアリルルイス型糖鎖を認識する抗シアリル
ルイス抗体等の抗体類、例えばミヤコグサレクチン等の
Ｌ−フコース結合性レクチン、例えばピーナッツレクチ
ン，ダイズレクチン，ヒマレクチン，インゲンマメレク
チン等のＤ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミン結合性レクチン、例えばコンカナバリンＡ，
レンズマメレクチン，エンドウマメレクチン等のＤ−マ
ンノース結合性レクチン、例えば小麦胚芽レクチン，ダ
ツラレクチン等のＮ−アセチルグルコサミン結合性レク
チン、例えばカブトガニレクチン等のシアル酸結合性レ
クチン等のレクチン類が挙げられる。中でもＤ−ガラク
トース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レ
クチン、Ｄ−マンノース結合性レクチン等が好ましい。
また、これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用い
てもよい。
【００１０】尚、上記のレクチンの分類に於いて、結合
性とは、適当な糖鎖を結合させたアフィニティーカラム
に一旦結合させたレクチンがどのような糖で溶出され易
いかを示すもので、例えばＤ−ガラクトース又はＮ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチンとは、アフ
ィニティーカラムに一旦結合させた後、Ｄ−ガラクトー
ス若しくはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンにより溶
出されるレクチンのことを意味する。
性とは、適当な糖鎖を結合させたアフィニティーカラム
に一旦結合させたレクチンがどのような糖で溶出され易
いかを示すもので、例えばＤ−ガラクトース又はＮ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチンとは、アフ
ィニティーカラムに一旦結合させた後、Ｄ−ガラクトー
ス若しくはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンにより溶
出されるレクチンのことを意味する。
【００１１】また、変異した特定の糖鎖構造を特異的に
認識する抗体も、上記した如き常法に準じて調製された
ポリクローン性抗体でも単クローン性抗体でもよい。
認識する抗体も、上記した如き常法に準じて調製された
ポリクローン性抗体でも単クローン性抗体でもよい。
【００１２】本発明において、特定糖鎖構造とは、より
具体的には、上記した如きレクチンが結合し得る糖鎖
構造、例えば大腸癌細胞等の腫瘍細胞が産生するＣＥ
Ａ類が有する糖鎖構造、等であり、更に具体的には例え
ばYamamoto, K., Eur. J. Biochem.,143(1),133-144,19
84等の文献に記載された如き糖鎖構造である。
具体的には、上記した如きレクチンが結合し得る糖鎖
構造、例えば大腸癌細胞等の腫瘍細胞が産生するＣＥ
Ａ類が有する糖鎖構造、等であり、更に具体的には例え
ばYamamoto, K., Eur. J. Biochem.,143(1),133-144,19
84等の文献に記載された如き糖鎖構造である。
【００１３】本発明に係る糖鎖構造の変異したＣＥＡ類
の検出方法としては、ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合
蛋白質とを適宜組み合わせて、例えばＣＥＡ類とＣＥＡ
類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体の有無を測
定することにより行う。
の検出方法としては、ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合
蛋白質とを適宜組み合わせて、例えばＣＥＡ類とＣＥＡ
類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体の有無を測
定することにより行う。
【００１４】本発明に係る癌の判定方法は、例えば糖鎖
構造の変異したＣＥＡ類の量に基づいて判定を行う方法
であり、具体的には、上記方法により求めた、ＣＥＡ
類とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体
の量に基づいて判定を行う方法、ＣＥＡ類とＣＥＡ類
結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体（糖鎖構造の
変異したＣＥＡ類）の量と、ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗
体との複合体（それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類）
の量に基づいて判定を行う方法、又はＣＥＡ類とＣＥ
Ａ類結合抗体との複合体の量（それ以外の糖鎖構造を有
するＣＥＡ類）及びＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗体と特定
糖鎖結合蛋白質との複合体（糖鎖構造の変異したＣＥＡ
類）の量を夫々求め、これら複合体の総量に対する後者
の複合体の割合、換言すればＣＥＡ類結合抗体及び特定
糖鎖結合蛋白質と複合体を形成したＣＥＡ類（糖鎖構造
の変異したＣＥＡ類）の割合を求めて、この値に基づい
て判定を行う方法等が挙げられる。
構造の変異したＣＥＡ類の量に基づいて判定を行う方法
であり、具体的には、上記方法により求めた、ＣＥＡ
類とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体
の量に基づいて判定を行う方法、ＣＥＡ類とＣＥＡ類
結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体（糖鎖構造の
変異したＣＥＡ類）の量と、ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗
体との複合体（それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類）
の量に基づいて判定を行う方法、又はＣＥＡ類とＣＥ
Ａ類結合抗体との複合体の量（それ以外の糖鎖構造を有
するＣＥＡ類）及びＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗体と特定
糖鎖結合蛋白質との複合体（糖鎖構造の変異したＣＥＡ
類）の量を夫々求め、これら複合体の総量に対する後者
の複合体の割合、換言すればＣＥＡ類結合抗体及び特定
糖鎖結合蛋白質と複合体を形成したＣＥＡ類（糖鎖構造
の変異したＣＥＡ類）の割合を求めて、この値に基づい
て判定を行う方法等が挙げられる。
【００１５】即ち、その具体的な測定対象は、例えば総
ＣＥＡ類、変異した特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類及
びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類等である。尚、
ＣＥＡ類は、生体中で分解作用により、種々のフラグメ
ントになるが、このようなものであってもＣＥＡ類結合
抗体又は／及び特定糖鎖結合蛋白質が結合し得るもの
は、本発明の測定対象である。これら測定対象は、別々
に測定してもよいし、一度の測定で同時に測定してもよ
い。
ＣＥＡ類、変異した特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類及
びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類等である。尚、
ＣＥＡ類は、生体中で分解作用により、種々のフラグメ
ントになるが、このようなものであってもＣＥＡ類結合
抗体又は／及び特定糖鎖結合蛋白質が結合し得るもの
は、本発明の測定対象である。これら測定対象は、別々
に測定してもよいし、一度の測定で同時に測定してもよ
い。
【００１６】更に具体的に述べれば、例えばレクチン又
は抗ＣＥＡ抗体等の特定糖鎖結合蛋白質を用いて、総Ｃ
ＥＡ類中の、特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類又はそれ
以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の割合を求め、その値
を正常の試料を用いて得られた値と比較すれば、癌の判
別が可能となる。本方法は、本発明者らが初めて見出し
たものである。以下にＣＥＡ類の測定方法の具体例を述
べる。
は抗ＣＥＡ抗体等の特定糖鎖結合蛋白質を用いて、総Ｃ
ＥＡ類中の、特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類又はそれ
以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の割合を求め、その値
を正常の試料を用いて得られた値と比較すれば、癌の判
別が可能となる。本方法は、本発明者らが初めて見出し
たものである。以下にＣＥＡ類の測定方法の具体例を述
べる。
【００１７】Ｉ．測定対象を別々に測定する方法。 測定対象、即ち、例えば総ＣＥＡ類、変異した特定の糖
鎖構造を有するＣＥＡ類、それ以外の糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類等は、夫々例えば以下のようにして測定され
る。
鎖構造を有するＣＥＡ類、それ以外の糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類等は、夫々例えば以下のようにして測定され
る。
【００１８】Ｉ−１．総ＣＥＡ類の測定 ＣＥＡ類結合抗体を用いる自体公知の測定法により測定
すればよい。
すればよい。
【００１９】Ｉ―２．変異した特定の糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類の測定 Ｉ−２―１）ＣＥＡ類結合抗体固定化不溶性担体を用い
る方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、ＣＥＡ類結合抗体固定化
不溶性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形成
させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識物質が結合した特定糖鎖結合蛋
白質（以下、「標識特定糖鎖結合蛋白質」と略記す
る。）を反応させて、下記の固定化複合体を形成させ
る。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−標識特
定糖鎖結合蛋白質 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
特定糖鎖結合蛋白質を除去した後、当該固定化複合体中
の標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定
値を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類を含む標準液を用いて同様の方法により測定を行っ
て得られた、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との
関係を表す検量線等に当てはめる等することにより、試
料中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類量を求めることが
できる。
ＣＥＡ類の測定 Ｉ−２―１）ＣＥＡ類結合抗体固定化不溶性担体を用い
る方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、ＣＥＡ類結合抗体固定化
不溶性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形成
させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識物質が結合した特定糖鎖結合蛋
白質（以下、「標識特定糖鎖結合蛋白質」と略記す
る。）を反応させて、下記の固定化複合体を形成させ
る。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−標識特
定糖鎖結合蛋白質 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
特定糖鎖結合蛋白質を除去した後、当該固定化複合体中
の標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定
値を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類を含む標準液を用いて同様の方法により測定を行っ
て得られた、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との
関係を表す検量線等に当てはめる等することにより、試
料中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類量を求めることが
できる。
【００２０】Ｉ−２―２）特定糖鎖結合蛋白質固定化不
溶性担体を用いる方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白質固定
化不溶性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形
成させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識物質が結合したＣＥＡ類結合抗
体（以下、「標識ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）を
反応させて、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類−標識
ＣＥＡ類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合体中の
標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定値
を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ
類を含む標準液を用いて同様の方法により測定を行って
得られた、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関
係を表す検量線等に当てはめる等することにより、試料
中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類量を求めることがで
きる。
溶性担体を用いる方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白質固定
化不溶性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形
成させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識物質が結合したＣＥＡ類結合抗
体（以下、「標識ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）を
反応させて、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類−標識
ＣＥＡ類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合体中の
標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定値
を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ
類を含む標準液を用いて同様の方法により測定を行って
得られた、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関
係を表す検量線等に当てはめる等することにより、試料
中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類量を求めることがで
きる。
【００２１】Ｉ−２―３）標識特定糖鎖結合蛋白質と高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等とを用いる方
法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、標識特定糖鎖結合蛋白質
と非競合性ＣＥＡ類結合抗体とを反応させて、試料中に
下記の複合体を形成させる。 標識特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類−非競合性ＣＥＡ類
結合抗体 次いで、この複合体と遊離の標識特定糖鎖結合蛋白質と
を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等を
用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な方法に
より測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既知の
特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用いて同
様の方法により測定を行って得られた、標識物質量（測
定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に当ては
める等することにより、試料中の特定糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類量を求めることができる。
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等とを用いる方
法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
糞便、尿等の生体由来試料と、標識特定糖鎖結合蛋白質
と非競合性ＣＥＡ類結合抗体とを反応させて、試料中に
下記の複合体を形成させる。 標識特定糖鎖結合蛋白質−ＣＥＡ類−非競合性ＣＥＡ類
結合抗体 次いで、この複合体と遊離の標識特定糖鎖結合蛋白質と
を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等を
用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な方法に
より測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既知の
特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用いて同
様の方法により測定を行って得られた、標識物質量（測
定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に当ては
める等することにより、試料中の特定糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類量を求めることができる。
【００２２】Ｉ−３．特定の糖鎖構造以外の糖鎖構造を
有するＣＥＡ類の測定 Ｉ−３−１）遊離の特定糖鎖結合蛋白質を用いる方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、試料中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ
類と特定糖鎖結合蛋白質との複合体（以下、「糖鎖結合
ＣＥＡ類」と略記する場合がある。）を生成させる。次
いで、糖鎖結合ＣＥＡ類と、特定糖鎖結合蛋白質が結合
しなかったＣＥＡ類、言い換えれば、特定の糖鎖構造以
外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（以下、「非結合ＣＥＡ
類」と略記する場合がある。）とを、例えば、遠心分離
法、ゲル濾過法、分子分画膜法、電気泳動法等の自体公
知の分離方法を利用して試料から分離することにより非
結合ＣＥＡ類のみを含む試料を調製する。このようにし
て得られた、非結合ＣＥＡ類のみを含む試料中のＣＥＡ
類量を、ＣＥＡ類結合抗体を用いる自体公知の測定法に
より測定することにより、非結合ＣＥＡ類量を求めるこ
とができる。尚、非結合ＣＥＡ類のみを含有する試料
は、特定糖鎖結合蛋白質を固定化した担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーによって試料を処理するこ
とにより調製してもよい。
有するＣＥＡ類の測定 Ｉ−３−１）遊離の特定糖鎖結合蛋白質を用いる方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、試料中の特定糖鎖構造を有するＣＥＡ
類と特定糖鎖結合蛋白質との複合体（以下、「糖鎖結合
ＣＥＡ類」と略記する場合がある。）を生成させる。次
いで、糖鎖結合ＣＥＡ類と、特定糖鎖結合蛋白質が結合
しなかったＣＥＡ類、言い換えれば、特定の糖鎖構造以
外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（以下、「非結合ＣＥＡ
類」と略記する場合がある。）とを、例えば、遠心分離
法、ゲル濾過法、分子分画膜法、電気泳動法等の自体公
知の分離方法を利用して試料から分離することにより非
結合ＣＥＡ類のみを含む試料を調製する。このようにし
て得られた、非結合ＣＥＡ類のみを含む試料中のＣＥＡ
類量を、ＣＥＡ類結合抗体を用いる自体公知の測定法に
より測定することにより、非結合ＣＥＡ類量を求めるこ
とができる。尚、非結合ＣＥＡ類のみを含有する試料
は、特定糖鎖結合蛋白質を固定化した担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーによって試料を処理するこ
とにより調製してもよい。
【００２３】Ｉ−３−２）競合性ＣＥＡ類結合抗体を用
いる方法 先ず、ＣＥＡ類結合抗体を固定化した不溶性担体と、例
えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、糞
便、尿等の生体由来試料とを反応させ、下記の固定化複
合体を形成させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に特定糖鎖結合蛋白質を反応させ、更に適当
な標識物質を結合させた競合性ＣＥＡ類結合抗体（以
下、「標識競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）を
反応させて、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖
鎖結合蛋白質 ［不溶性担体］−CEA類結合抗体−CEA類−標識競合性CE
A類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
競合性ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合
体中の標識物質量を適当な方法により測定し、得られた
測定値を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造以外の糖
鎖構造を有するＣＥＡ類、即ち、非結合ＣＥＡ類を含む
標準液を用いて同様の方法により測定を行って得られ
た、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表
す検量線等に当てはめる等することにより、試料中の非
結合ＣＥＡ類量を求めることができる。
いる方法 先ず、ＣＥＡ類結合抗体を固定化した不溶性担体と、例
えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、糞
便、尿等の生体由来試料とを反応させ、下記の固定化複
合体を形成させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に特定糖鎖結合蛋白質を反応させ、更に適当
な標識物質を結合させた競合性ＣＥＡ類結合抗体（以
下、「標識競合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）を
反応させて、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖
鎖結合蛋白質 ［不溶性担体］−CEA類結合抗体−CEA類−標識競合性CE
A類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
競合性ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合
体中の標識物質量を適当な方法により測定し、得られた
測定値を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造以外の糖
鎖構造を有するＣＥＡ類、即ち、非結合ＣＥＡ類を含む
標準液を用いて同様の方法により測定を行って得られ
た、標識物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表
す検量線等に当てはめる等することにより、試料中の非
結合ＣＥＡ類量を求めることができる。
【００２４】Ｉ−３−３）競合性ＣＥＡ類結合抗体固定
化不溶性担体を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、試料中に糖鎖結合ＣＥＡ類を生成させ
る。次いで、この試料と、競合性ＣＥＡ類結合抗体固定
化不溶性担体とを反応させて下記の固定化複合体を生成
させる。 ［不溶性担体］−競合性ＣＥＡ類結合抗体−非結合ＣＥ
Ａ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に標識ＣＥＡ類結合抗体を反応させて、下記
の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−競合性CEA類結合抗体−非結合CEA類−
標識CEA類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合体中の
標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定値
を、例えば予め濃度既知の非結合ＣＥＡ類を含む標準液
を用いて同様の方法により測定を行って得られた、標識
物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線
等に当てはめる等することにより、試料中の非結合ＣＥ
Ａ類量を求めることができる。
化不溶性担体を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、試料中に糖鎖結合ＣＥＡ類を生成させ
る。次いで、この試料と、競合性ＣＥＡ類結合抗体固定
化不溶性担体とを反応させて下記の固定化複合体を生成
させる。 ［不溶性担体］−競合性ＣＥＡ類結合抗体−非結合ＣＥ
Ａ類 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に標識ＣＥＡ類結合抗体を反応させて、下記
の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−競合性CEA類結合抗体−非結合CEA類−
標識CEA類結合抗体 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
ＣＥＡ類結合抗体を除去した後、当該固定化複合体中の
標識物質量を適当な方法により測定し、得られた測定値
を、例えば予め濃度既知の非結合ＣＥＡ類を含む標準液
を用いて同様の方法により測定を行って得られた、標識
物質量（測定値）とＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線
等に当てはめる等することにより、試料中の非結合ＣＥ
Ａ類量を求めることができる。
【００２５】Ｉ−３−４）標識競合性ＣＥＡ類結合抗体
とＨＰＬＣ等を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、糖鎖結合ＣＥＡ類を生成させる。次い
で、この試料と、標識競合性ＣＥＡ類結合抗体とを反応
させて下記の複合体を生成させる。 非結合ＣＥＡ類−標識競合性ＣＥＡ類結合抗体 次いで、この複合体と遊離の標識競合性ＣＥＡ類結合抗
体とを、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法
等を用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な方
法により測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既
知の非結合ＣＥＡ類を含む標準液を用いて同様の方法に
より測定を行って得られた、標識物質量（測定値）とＣ
ＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に当てはめること等
により、試料中の非結合ＣＥＡ類量を求めることができ
る。尚、当然のことながら、特定糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類（糖鎖結合ＣＥＡ類）量は、総ＣＥＡ類量から特定
糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（非結合ＣＥ
Ａ類）量を差し引くことによっても求めることができる
し、特定糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（非
結合ＣＥＡ類）量は、総ＣＥＡ類量から特定糖鎖構造を
有するＣＥＡ類（糖鎖結合ＣＥＡ類）量を差し引くこと
によっても求めることができる。
とＨＰＬＣ等を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合蛋白
質とを反応させ、糖鎖結合ＣＥＡ類を生成させる。次い
で、この試料と、標識競合性ＣＥＡ類結合抗体とを反応
させて下記の複合体を生成させる。 非結合ＣＥＡ類−標識競合性ＣＥＡ類結合抗体 次いで、この複合体と遊離の標識競合性ＣＥＡ類結合抗
体とを、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法
等を用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な方
法により測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既
知の非結合ＣＥＡ類を含む標準液を用いて同様の方法に
より測定を行って得られた、標識物質量（測定値）とＣ
ＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に当てはめること等
により、試料中の非結合ＣＥＡ類量を求めることができ
る。尚、当然のことながら、特定糖鎖構造を有するＣＥ
Ａ類（糖鎖結合ＣＥＡ類）量は、総ＣＥＡ類量から特定
糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（非結合ＣＥ
Ａ類）量を差し引くことによっても求めることができる
し、特定糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類（非
結合ＣＥＡ類）量は、総ＣＥＡ類量から特定糖鎖構造を
有するＣＥＡ類（糖鎖結合ＣＥＡ類）量を差し引くこと
によっても求めることができる。
【００２６】ＩＩ．測定対象を一度の測定操作で測定す
る方法。 ＩＩ−１．標識ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質
を用いる方法 特開平7-191027号公報に開示された方法に準じて以下の
如く行えばよい。即ち、例えば血漿、血清、髄液、各種
生体組織の成分抽出液、糞便、尿等の生体由来試料と、
標識ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応
させて、以下の複合体を形成させる。 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識ＣＥＡ類結合抗
体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等
を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を適
当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予め
濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／及び
それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用
いて同様の方法により測定を行って得られた、標識物質
量（測定値）と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線
等に当てはめる等することにより、試料中の特定糖鎖構
造を有するＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣ
ＥＡ類、並びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥＡ類
を一度の測定で求めることができる。尚、複合体並びに
遊離の標識ＣＥＡ類結合抗体を分離する方法としては、
操作性や繰り返し使用できること等を考慮するとＨＰＬ
Ｃを用いる方法が好ましい。また、使用するＣＥＡ類結
合抗体は、非競合性のものが好ましい。
る方法。 ＩＩ−１．標識ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質
を用いる方法 特開平7-191027号公報に開示された方法に準じて以下の
如く行えばよい。即ち、例えば血漿、血清、髄液、各種
生体組織の成分抽出液、糞便、尿等の生体由来試料と、
標識ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応
させて、以下の複合体を形成させる。 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識ＣＥＡ類結合抗
体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等
を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を適
当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予め
濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／及び
それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用
いて同様の方法により測定を行って得られた、標識物質
量（測定値）と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線
等に当てはめる等することにより、試料中の特定糖鎖構
造を有するＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣ
ＥＡ類、並びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥＡ類
を一度の測定で求めることができる。尚、複合体並びに
遊離の標識ＣＥＡ類結合抗体を分離する方法としては、
操作性や繰り返し使用できること等を考慮するとＨＰＬ
Ｃを用いる方法が好ましい。また、使用するＣＥＡ類結
合抗体は、非競合性のものが好ましい。
【００２７】ＩＩ−２．非競合性ＣＥＡ類結合抗体、競
合性ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを用い
る方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、適当な標識物質が
結合した非競合性ＣＥＡ類結合抗体（以下、「標識非競
合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）、競合性ＣＥＡ
類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応させて、以
下の複合体を形成させる。 標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−競合性ＣＥ
Ａ類結合抗体 標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結
合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識非競合性ＣＥＡ
類結合抗体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気
泳動法等を用いて分離し、夫々の複合体中の標識物質量
を適当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば
予め濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／
及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液
を用いて同様の方法により測定を行って得られた、標識
物質量（測定値）と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検
量線等に当てはめる等することにより、試料中の特定糖
鎖構造を有するＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有す
るＣＥＡ類、並びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥ
Ａ類を一度の測定で求めることができる。尚、複合体並
びに遊離の標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体を分離する方
法としては、操作性や繰り返し使用できること等を考慮
するとＨＰＬＣを用いる方法が好ましい。
合性ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを用い
る方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、糞便、尿等の生体由来試料と、適当な標識物質が
結合した非競合性ＣＥＡ類結合抗体（以下、「標識非競
合性ＣＥＡ類結合抗体」と略記する。）、競合性ＣＥＡ
類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応させて、以
下の複合体を形成させる。 標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−競合性ＣＥ
Ａ類結合抗体 標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結
合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識非競合性ＣＥＡ
類結合抗体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気
泳動法等を用いて分離し、夫々の複合体中の標識物質量
を適当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば
予め濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／
及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液
を用いて同様の方法により測定を行って得られた、標識
物質量（測定値）と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検
量線等に当てはめる等することにより、試料中の特定糖
鎖構造を有するＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有す
るＣＥＡ類、並びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥ
Ａ類を一度の測定で求めることができる。尚、複合体並
びに遊離の標識非競合性ＣＥＡ類結合抗体を分離する方
法としては、操作性や繰り返し使用できること等を考慮
するとＨＰＬＣを用いる方法が好ましい。
【００２８】ＩＩ−３．標識ＣＥＡ類結合抗体、競合性
ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質を用いる方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分
抽出液、糞便、尿等の生体由来試料と、標識ＣＥＡ類結
合抗体を反応させた後、当該反応液にさらに特定糖鎖結
合蛋白質及び競合性ＣＥＡ類結合抗体を反応させて、以
下の複合体を形成させる。 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−競合性ＣＥＡ類結合
抗体 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識ＣＥＡ類結合抗
体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等
を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を適
当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予め
濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／及び
それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用
いて同様の方法により測定を行って得られた、標識物質
の測定値と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に
当てはめることにより、試料中の特定糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類、並
びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥＡ類を一度の測
定で求めることができる。さらに標識ＣＥＡ類結合抗体
の反応後に、標識ＣＥＡ類結合抗体とエピト−プの違う
ＣＥＡ類結合抗体を反応させることにより、複合体と、
測定に影響する血清成分との性質の違いを大きくするこ
とができるので、血清成分の影響が少なくなり、測定精
度が向上するため好ましい。尚、複合体並びに遊離の標
識ＣＥＡ類結合抗体を分離する方法としては、操作性や
繰り返し使用できること等を考慮するとＨＰＬＣを用い
る方法が好ましい。
ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結合蛋白質を用いる方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分
抽出液、糞便、尿等の生体由来試料と、標識ＣＥＡ類結
合抗体を反応させた後、当該反応液にさらに特定糖鎖結
合蛋白質及び競合性ＣＥＡ類結合抗体を反応させて、以
下の複合体を形成させる。 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−競合性ＣＥＡ類結合
抗体 標識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合蛋白質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識ＣＥＡ類結合抗
体を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法等
を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を適
当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予め
濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＣＥＡ類又は／及び
それ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類を含む標準液を用
いて同様の方法により測定を行って得られた、標識物質
の測定値と各種ＣＥＡ類濃度との関係を表す検量線等に
当てはめることにより、試料中の特定糖鎖構造を有する
ＣＥＡ類及びそれ以外の糖鎖構造を有するＣＥＡ類、並
びにこれらＣＥＡ類の合計、即ち総ＣＥＡ類を一度の測
定で求めることができる。さらに標識ＣＥＡ類結合抗体
の反応後に、標識ＣＥＡ類結合抗体とエピト−プの違う
ＣＥＡ類結合抗体を反応させることにより、複合体と、
測定に影響する血清成分との性質の違いを大きくするこ
とができるので、血清成分の影響が少なくなり、測定精
度が向上するため好ましい。尚、複合体並びに遊離の標
識ＣＥＡ類結合抗体を分離する方法としては、操作性や
繰り返し使用できること等を考慮するとＨＰＬＣを用い
る方法が好ましい。
【００２９】ＣＥＡ類結合抗体を用いる自体公知のＣＥ
Ａ類測定法は、例えばＣＥＡ類結合抗体として抗ＣＥＡ
類抗体を用いて、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放
射免疫測定法（RIA）、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法（F
IA）、ＨＰＬＣを用いる測定方法（特開平9-301995号公
報等）等の免疫学的測定法に準じて行えばよい。また、
その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等
のいずれにてもよい。種々のＣＥＡ類結合抗体や特定糖
鎖結合蛋白質を固定化するために用いられる不溶性担体
としては、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用
いられるものでよく、例えば金属、ガラス、セラミッ
ク、シリコンラバー、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビ
ニル，ポリプロピレン，アクリル，ポリメチルメタクリ
レート等の合成高分子等で調製された、ビーズ、チュー
ブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マ
イクロタイタープレート等が挙げられ、固定化方法とし
ても、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いら
れる、例えば物理的吸着法、化学的結合法等が挙げられ
る。
Ａ類測定法は、例えばＣＥＡ類結合抗体として抗ＣＥＡ
類抗体を用いて、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放
射免疫測定法（RIA）、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法（F
IA）、ＨＰＬＣを用いる測定方法（特開平9-301995号公
報等）等の免疫学的測定法に準じて行えばよい。また、
その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等
のいずれにてもよい。種々のＣＥＡ類結合抗体や特定糖
鎖結合蛋白質を固定化するために用いられる不溶性担体
としては、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用
いられるものでよく、例えば金属、ガラス、セラミッ
ク、シリコンラバー、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビ
ニル，ポリプロピレン，アクリル，ポリメチルメタクリ
レート等の合成高分子等で調製された、ビーズ、チュー
ブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マ
イクロタイタープレート等が挙げられ、固定化方法とし
ても、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用いら
れる、例えば物理的吸着法、化学的結合法等が挙げられ
る。
【００３０】本発明に係るＣＥＡ類結合抗体や特定糖鎖
結合蛋白質に結合させる標識物質としては、例えばＥＩ
Ａに於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガ
ラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイク
ロペルオキシダーゼ， グルコースオキシダーゼ，グル
コース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラ
ーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素
類、例えばＲＩＡで用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，
14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いら
れるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，ク
マリン，ユーロピウム，ナフチルアミン或はこれらの誘
導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノ
ール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オ
キザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフト
ール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸
収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチ
ルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメ
チルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t- ブチル-α-(3,
5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イ
リデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合
物に代表されるスピンラベル化剤 としての性質を有す
る物質等が挙げられる。
結合蛋白質に結合させる標識物質としては、例えばＥＩ
Ａに於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガ
ラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイク
ロペルオキシダーゼ， グルコースオキシダーゼ，グル
コース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラ
ーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素
類、例えばＲＩＡで用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，
14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いら
れるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，ク
マリン，ユーロピウム，ナフチルアミン或はこれらの誘
導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノ
ール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オ
キザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフト
ール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸
収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチ
ルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメ
チルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t- ブチル-α-(3,
5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イ
リデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合
物に代表されるスピンラベル化剤 としての性質を有す
る物質等が挙げられる。
【００３１】また、上記した如き標識物質を、ＣＥＡ類
結合抗体や特定糖鎖結合蛋白質に結合させる（標識す
る）方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩ
Ａ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法に
準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン
（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用し
た常法を利用しても良い。
結合抗体や特定糖鎖結合蛋白質に結合させる（標識す
る）方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩ
Ａ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法に
準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン
（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用し
た常法を利用しても良い。
【００３２】本発明のＨＰＬＣを利用する測定法に於い
て用いられるＨＰＬＣ用装置も、通常この分野で用いら
れるものであればよい。本発明のＨＰＬＣを利用する測
定法に於いては、複合体と遊離の標識ＣＥＡ類結合抗体
（或いは標識特定糖鎖結合蛋白質）とをより明確に分離
するために、例えば特開平７−１９１０２７号公報、特
開平9-301995号公報等に開示された、これらの分離を向
上させるための物質（以下、「分離向上物質」と略記す
る。）を結合させた、ＣＥＡ類結合抗体や特定糖鎖結合
蛋白質等を用いてもよい。
て用いられるＨＰＬＣ用装置も、通常この分野で用いら
れるものであればよい。本発明のＨＰＬＣを利用する測
定法に於いては、複合体と遊離の標識ＣＥＡ類結合抗体
（或いは標識特定糖鎖結合蛋白質）とをより明確に分離
するために、例えば特開平７−１９１０２７号公報、特
開平9-301995号公報等に開示された、これらの分離を向
上させるための物質（以下、「分離向上物質」と略記す
る。）を結合させた、ＣＥＡ類結合抗体や特定糖鎖結合
蛋白質等を用いてもよい。
【００３３】このような目的に用いられる分離向上物質
としては、例えばα−キモトリプシノーゲン，β−ガラ
クトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，トリプシ
ンインヒビター等の蛋白質、例えばフェニルアラニン，
プロリン，アルギニン，リジン，アスパラギン酸，グル
タミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例えば臭素，塩
素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチレングリコ
ール等の合成高分子、例えばポリグルタミン酸，ポリア
スパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェ
ニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、炭素数
３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン酸，オレイン
酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-(ε-マレイミド
カプロイルオキシ)スクシンイミド［N-(ε-maleimidoca
proyloxy)succinimide］(EMCS),N-スクシンイミヂル-6-
マレイミドヘキサノエイト（N-Succinimidyl-6-maleimi
dohexanoate），ビスマレイミドヘ キサン（Bismaleimi
dohexane）(BMH)，オクチルアミン等のＣＥＡ類結合抗
体や特定糖鎖結合蛋白質に結合し得る反応基を有し且つ
疎水性若しくはイオン性を有する化学物質、例えば特開
平9-301995号公報に記載された4-(p-マレイミドフェニ
ル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))5、4-(p-マレイミドフェ
ニル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8等の強酸残基含有ペプ
チド等が好ましく挙げられる。尚、分離向上物質は、測
定対象であるＣＥＡ類、ＣＥＡ類結合抗体、特定糖鎖結
合蛋白質の性質（例えばｐＨ安定性，疎水度，水溶液へ
の溶解度，等電点等）を考慮した上で適宜選択して用い
ればよい。
としては、例えばα−キモトリプシノーゲン，β−ガラ
クトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，トリプシ
ンインヒビター等の蛋白質、例えばフェニルアラニン，
プロリン，アルギニン，リジン，アスパラギン酸，グル
タミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例えば臭素，塩
素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチレングリコ
ール等の合成高分子、例えばポリグルタミン酸，ポリア
スパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポリフェ
ニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、炭素数
３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン酸，オレイン
酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-(ε-マレイミド
カプロイルオキシ)スクシンイミド［N-(ε-maleimidoca
proyloxy)succinimide］(EMCS),N-スクシンイミヂル-6-
マレイミドヘキサノエイト（N-Succinimidyl-6-maleimi
dohexanoate），ビスマレイミドヘ キサン（Bismaleimi
dohexane）(BMH)，オクチルアミン等のＣＥＡ類結合抗
体や特定糖鎖結合蛋白質に結合し得る反応基を有し且つ
疎水性若しくはイオン性を有する化学物質、例えば特開
平9-301995号公報に記載された4-(p-マレイミドフェニ
ル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))5、4-(p-マレイミドフェ
ニル）ブチリルAla-(Tyr(SO3H))8等の強酸残基含有ペプ
チド等が好ましく挙げられる。尚、分離向上物質は、測
定対象であるＣＥＡ類、ＣＥＡ類結合抗体、特定糖鎖結
合蛋白質の性質（例えばｐＨ安定性，疎水度，水溶液へ
の溶解度，等電点等）を考慮した上で適宜選択して用い
ればよい。
【００３４】分離向上物質と、ＣＥＡ類結合抗体又は／
及び特定糖鎖結合蛋白質との結合方法も、（１）自体公
知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等において一般に行わ
れている自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例え
ば、医学実験口座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中
山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、
(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川
栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、
等）、（２）自体公知の物質の修飾および結合方法（例
えば、蛋白質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村
憲助、中村道徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版セ
ンター、1981；ポリエチレングリコール修飾蛋白質、稲
田祐二他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー1362、
（社）日本生化学会、1990；DNA PROBES, George H.K.
and Mark M.M. STOCKTON PRESS,1989 、等）等に準じて
行えばよい。
及び特定糖鎖結合蛋白質との結合方法も、（１）自体公
知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等において一般に行わ
れている自体公知の標識物質と抗体との結合方法（例え
ば、医学実験口座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中
山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、
(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川
栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、1982、
等）、（２）自体公知の物質の修飾および結合方法（例
えば、蛋白質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、志村
憲助、中村道徳、船津勝編集、第１版、(株)学会出版セ
ンター、1981；ポリエチレングリコール修飾蛋白質、稲
田祐二他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー1362、
（社）日本生化学会、1990；DNA PROBES, George H.K.
and Mark M.M. STOCKTON PRESS,1989 、等）等に準じて
行えばよい。
【００３５】本発明の測定方法により得られた、総ＣＥ
Ａ類、特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類、それ以外の糖
鎖構造を有するＣＥＡ類等の値を適宜組み合わせること
により癌の判定を行うことが可能である。また、種々の
異なる特定糖鎖結合蛋白質を用いて測定を行い、その結
果を解析することにより、癌の種類（癌の存在部位）を
判別することも可能となる。
Ａ類、特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類、それ以外の糖
鎖構造を有するＣＥＡ類等の値を適宜組み合わせること
により癌の判定を行うことが可能である。また、種々の
異なる特定糖鎖結合蛋白質を用いて測定を行い、その結
果を解析することにより、癌の種類（癌の存在部位）を
判別することも可能となる。
【００３６】本発明のＣＥＡ類の検出用キットは、上記
した本発明の測定法に用いられるものであって、ＣＥＡ
類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質を含有してなるもので
あり、その構成要素の好ましい態様と具体例は上で述べ
たとおりである。
した本発明の測定法に用いられるものであって、ＣＥＡ
類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質を含有してなるもので
あり、その構成要素の好ましい態様と具体例は上で述べ
たとおりである。
【００３７】当該キットには、通常この分野で用いられ
る試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、蛋白質、
塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共
存する試薬等の安定性を阻害したり、ＣＥＡ類と、ＣＥ
Ａ類結合抗体又は／及び特定糖鎖結合蛋白質との反応を
阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度
も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選
択すればよい。
る試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、蛋白質、
塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共
存する試薬等の安定性を阻害したり、ＣＥＡ類と、ＣＥ
Ａ類結合抗体又は／及び特定糖鎖結合蛋白質との反応を
阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度
も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選
択すればよい。
【００３８】また、マグネシウム等の金属イオンがレク
チン活性や安定性に影響を与えることはよく知られてお
り、これらを含んでいてもよい。
チン活性や安定性に影響を与えることはよく知られてお
り、これらを含んでいてもよい。
【００３９】本発明の試薬に於いて用いることのできる
緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、
ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常
免疫比濁法、免疫比ろう法、ＲＩＡ、ＥＩＡに用いられ
ている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとして
は抗原抗体反応やＣＥＡ類とレクチン等との反応を抑制
しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０
である。
緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、
ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常
免疫比濁法、免疫比ろう法、ＲＩＡ、ＥＩＡに用いられ
ている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとして
は抗原抗体反応やＣＥＡ類とレクチン等との反応を抑制
しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０
である。
【００４０】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限され
るものではない。
説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限され
るものではない。
【００４１】
【実施例】実施例１ ＨＰＬＣによるＣＥＡ類糖鎖分別
測定法 （ＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体）抗ＣＥＡ抗体（和光純
薬工業(株)製）をＣＥＡ類結合抗体として用い、これを
常法によりＦab'とし、このＦab'とＰＯＤとを常法によ
り結合させてＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体とした。 （試料）ＣＥＡ（COSMO-Bio社製）を50mMリン酸緩衝液
(pH6.5、0.9％NaCl,１% BSA含有)に溶解して1000ng／ml
としたものを用いた。 （ＣＥＡ類の糖鎖分別測定用分析機器類及び試薬）以下
の機器及び試薬を用いた。 （ＨＰＬＣ条件） 分析機器：高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−９Ａ
(株)島津製作所製） 分析カラム：Diol-300(φ8.0mm×300mm、和光純薬工業
(株))、ゲルろ過分画分子量 22,000〜660,000 分析用溶離液：50mM PBS pH7.5 分析用基質液：25mM アセトアミドフェノール（15mMク
エン酸緩衝液、pH5.5） 流速：溶離液１ml／min、基質液0.1ml／min 検出：Ex 328nm、Em 432nm （分析方法） ＣＥＡ類結合抗体の溶出位置の確認 精製水30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul
（抗体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間インキ
ュベーションした後、30μlをゲルろ過カラムに注入
し、分離しながら、溶出液にオンラインで分析用基質液
を添加し、60℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出
した。 総ＣＥＡ類の溶出位置の確認 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul（抗
体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応させた
後、反応液の30μlをゲルろ過カラムに注入し、分離し
ながら、溶出液にオンラインで分析用基質液を添加、60
℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出した。 糖鎖変異ＣＥＡ類の溶出位置の確認 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul（抗
体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応させ
た。次いで特定糖鎖結合抗体であるＬｅbに対する抗体
（Signet社製）含有50mMリン酸緩衝液(pH6.5,0.9％NaC
l,１% BSA含有、抗体濃度：１×10ー 7M）30μlを反応液
に加え、30℃で30分間反応させた。 反応後、反応液の3
0μlをゲルろ過カラムに注入し、分離しながら、溶出液
にオンラインで分析用基質液を添加し、60℃、30秒反応
により生成する蛍光量を検出した。
測定法 （ＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体）抗ＣＥＡ抗体（和光純
薬工業(株)製）をＣＥＡ類結合抗体として用い、これを
常法によりＦab'とし、このＦab'とＰＯＤとを常法によ
り結合させてＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体とした。 （試料）ＣＥＡ（COSMO-Bio社製）を50mMリン酸緩衝液
(pH6.5、0.9％NaCl,１% BSA含有)に溶解して1000ng／ml
としたものを用いた。 （ＣＥＡ類の糖鎖分別測定用分析機器類及び試薬）以下
の機器及び試薬を用いた。 （ＨＰＬＣ条件） 分析機器：高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−９Ａ
(株)島津製作所製） 分析カラム：Diol-300(φ8.0mm×300mm、和光純薬工業
(株))、ゲルろ過分画分子量 22,000〜660,000 分析用溶離液：50mM PBS pH7.5 分析用基質液：25mM アセトアミドフェノール（15mMク
エン酸緩衝液、pH5.5） 流速：溶離液１ml／min、基質液0.1ml／min 検出：Ex 328nm、Em 432nm （分析方法） ＣＥＡ類結合抗体の溶出位置の確認 精製水30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul
（抗体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間インキ
ュベーションした後、30μlをゲルろ過カラムに注入
し、分離しながら、溶出液にオンラインで分析用基質液
を添加し、60℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出
した。 総ＣＥＡ類の溶出位置の確認 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul（抗
体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応させた
後、反応液の30μlをゲルろ過カラムに注入し、分離し
ながら、溶出液にオンラインで分析用基質液を添加、60
℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出した。 糖鎖変異ＣＥＡ類の溶出位置の確認 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul（抗
体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応させ
た。次いで特定糖鎖結合抗体であるＬｅbに対する抗体
（Signet社製）含有50mMリン酸緩衝液(pH6.5,0.9％NaC
l,１% BSA含有、抗体濃度：１×10ー 7M）30μlを反応液
に加え、30℃で30分間反応させた。 反応後、反応液の3
0μlをゲルろ過カラムに注入し、分離しながら、溶出液
にオンラインで分析用基質液を添加し、60℃、30秒反応
により生成する蛍光量を検出した。
【００４２】（結果）得られた高速液体クロマトグラフ
ィー分析パターンを図１に示す。図１(a)の結果から、
遊離のＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体は保持時間約11分の
位置に溶出することが判る。これに対し、ＰＯＤ標識Ｃ
ＥＡ類結合抗体と試料とを反応させた場合、ＣＥＡ類―
ＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体の免疫複合体のピーク１
が、保持時間約8.5分の位置に出現し（図1(b))、更に特
定糖鎖結合抗体を添加すると、ピーク１以外に、ＰＯＤ
標識ＣＥＡ類結合抗体-ＣＥＡ類-特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体のピーク２が保持時間約7.5分の位置に出現す
ることが判る(図1(c))。また、抗Ｌｅb抗体の代わりに
抗Ｌｅy抗体を用いて同様の実験を行っても、ＰＯＤ標
識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体（ピーク２）が出現することが確認できた。
ィー分析パターンを図１に示す。図１(a)の結果から、
遊離のＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体は保持時間約11分の
位置に溶出することが判る。これに対し、ＰＯＤ標識Ｃ
ＥＡ類結合抗体と試料とを反応させた場合、ＣＥＡ類―
ＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体の免疫複合体のピーク１
が、保持時間約8.5分の位置に出現し（図1(b))、更に特
定糖鎖結合抗体を添加すると、ピーク１以外に、ＰＯＤ
標識ＣＥＡ類結合抗体-ＣＥＡ類-特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体のピーク２が保持時間約7.5分の位置に出現す
ることが判る(図1(c))。また、抗Ｌｅb抗体の代わりに
抗Ｌｅy抗体を用いて同様の実験を行っても、ＰＯＤ標
識ＣＥＡ類結合抗体−ＣＥＡ類−特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体（ピーク２）が出現することが確認できた。
【００４３】以上のことより、ＣＥＡ類結合抗体及び特
定糖鎖結合蛋白質を用いる本発明の方法に依れば、特定
の変異した糖鎖構造を有するＣＥＡ類とそれ以外の糖鎖
構造を有するＣＥＡ類を分別測定できることが判る。
定糖鎖結合蛋白質を用いる本発明の方法に依れば、特定
の変異した糖鎖構造を有するＣＥＡ類とそれ以外の糖鎖
構造を有するＣＥＡ類を分別測定できることが判る。
【００４４】実施例２ 本発明方法による癌の判別 （ＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体）実施例１と同様にして
調製した。 （試料）癌患者由来血清９例、健常人由来血清4例を試
料として用いた。 （各種ＣＥＡ類の分別測定）実施例１と同じ機器、試薬
を用い、以下のようにして行った。尚、ＨＰＬＣ条件
も、実施例１と同様にして行った。 （分析方法） 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul
（抗体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応さ
せた。次いで抗糖鎖抗体であるS-Lea,S-Lex,Lea,Le yの
いずれかに対する抗体（抗S-Lea抗体及び抗S-Lex抗体は
和光純薬工業(株)製、抗Lea抗体及び抗Ley抗体はSignet
社製）含有50mMリン酸緩衝液(pH6.5,0.9％NaCl,１% BSA
含有、抗体濃度：１×10ー 7M）30μlを反応液に加え、更
に30℃で30分間反応させた。 反応後、反応液の30μlをゲルろ過カラムに注入し、
分離しながら、溶出液にオンラインで分析用基質液を添
加、60℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出し、各
ピーク面積を測定した。 （CEA濃度・計算方法）上記方法に従って得られた結果
を下記の式に代入して、試料中の、総ＣＥＡ類量に対す
る特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の量比（％）を算出
した。尚、ピーク１はＣＥＡ類ーＰＯＤ標識ＣＥＡ類結
合抗体の免疫複合体のピークであり、ピーク２はＰＯＤ
標識ＣＥＡ類結合抗体-ＣＥＡ類-特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体のピークである。 試料中の総CEA類量に対する、特定の糖鎖構造を有するC
EA類の量比（％）＝[ピーク２の面積／（ピーク１の面
積＋ピーク２の面積）]×１００ 得られた結果を表１に示す。
調製した。 （試料）癌患者由来血清９例、健常人由来血清4例を試
料として用いた。 （各種ＣＥＡ類の分別測定）実施例１と同じ機器、試薬
を用い、以下のようにして行った。尚、ＨＰＬＣ条件
も、実施例１と同様にして行った。 （分析方法） 試料30μlにＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体溶液30ul
（抗体濃度：１×10ー 8M）を加え、30℃で30分間反応さ
せた。次いで抗糖鎖抗体であるS-Lea,S-Lex,Lea,Le yの
いずれかに対する抗体（抗S-Lea抗体及び抗S-Lex抗体は
和光純薬工業(株)製、抗Lea抗体及び抗Ley抗体はSignet
社製）含有50mMリン酸緩衝液(pH6.5,0.9％NaCl,１% BSA
含有、抗体濃度：１×10ー 7M）30μlを反応液に加え、更
に30℃で30分間反応させた。 反応後、反応液の30μlをゲルろ過カラムに注入し、
分離しながら、溶出液にオンラインで分析用基質液を添
加、60℃、30秒反応により生成する蛍光量を検出し、各
ピーク面積を測定した。 （CEA濃度・計算方法）上記方法に従って得られた結果
を下記の式に代入して、試料中の、総ＣＥＡ類量に対す
る特定の糖鎖構造を有するＣＥＡ類の量比（％）を算出
した。尚、ピーク１はＣＥＡ類ーＰＯＤ標識ＣＥＡ類結
合抗体の免疫複合体のピークであり、ピーク２はＰＯＤ
標識ＣＥＡ類結合抗体-ＣＥＡ類-特定糖鎖結合抗体の免
疫複合体のピークである。 試料中の総CEA類量に対する、特定の糖鎖構造を有するC
EA類の量比（％）＝[ピーク２の面積／（ピーク１の面
積＋ピーク２の面積）]×１００ 得られた結果を表１に示す。
【００４５】表１ ―：検出されず
【００４６】表１から明らかな如く、健常人の血清中か
らは、変異した糖鎖構造を持つＣＥＡ類は検出されなか
った。一方、癌患者の血清中からは各種変異した糖鎖構
造を持つＣＥＡ類が検出され、癌の症例により糖鎖構造
の変異が異なることが確認された。例えば、直腸癌では
S-LeaとLeaが観察され、結腸癌ではLeyが、肺癌ではS-L
ea,S-Lex,Leaが、肝癌及び中咽頭癌ではS-Leaが、乳癌
ではS-LexとLeyが、子宮頸癌ではS-Lea,S-Lexが、骨髄
リンパ節転移ではS-Lexが、それぞれ観察され、癌の種
類によって、糖鎖構造の変異の様子が異なることが判
る。以上のことから、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の分
別測定は、癌の判定に用いることができ、また、癌の種
類を鑑別するのにも非常に有用であることが示唆され
た。
らは、変異した糖鎖構造を持つＣＥＡ類は検出されなか
った。一方、癌患者の血清中からは各種変異した糖鎖構
造を持つＣＥＡ類が検出され、癌の症例により糖鎖構造
の変異が異なることが確認された。例えば、直腸癌では
S-LeaとLeaが観察され、結腸癌ではLeyが、肺癌ではS-L
ea,S-Lex,Leaが、肝癌及び中咽頭癌ではS-Leaが、乳癌
ではS-LexとLeyが、子宮頸癌ではS-Lea,S-Lexが、骨髄
リンパ節転移ではS-Lexが、それぞれ観察され、癌の種
類によって、糖鎖構造の変異の様子が異なることが判
る。以上のことから、糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の分
別測定は、癌の判定に用いることができ、また、癌の種
類を鑑別するのにも非常に有用であることが示唆され
た。
【００４７】
【発明の効果】本発明は、容易に且つ簡便に糖鎖構造の
変異したＣＥＡ類を分別測定できる方法及びこの測定結
果に基づき癌を鑑別し得る方法並びに試薬を提供するも
のであり、本発明の測定方法により得られた各種ＣＥＡ
類の測定値を適宜組み合わせて用いることにより、癌の
判別をすることができる。
変異したＣＥＡ類を分別測定できる方法及びこの測定結
果に基づき癌を鑑別し得る方法並びに試薬を提供するも
のであり、本発明の測定方法により得られた各種ＣＥＡ
類の測定値を適宜組み合わせて用いることにより、癌の
判別をすることができる。
【００４８】
【図１】実施例１で得られた高速液体クロマトグラフィ
ー分析パターンを示し、図１(a)はペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）標識癌胎児性抗原（ＣＥＡ）類結合抗体の溶
出パターン、図１(b)はＣＥＡ類とＰＯＤ標識ＣＥＡ類
結合抗体（ピーク１）の免疫複合体の溶出パターン、図
１(c)はＣＥＡ類とＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体の免疫
複合体（ピーク１）及びＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体と
ＣＥＡ類と特定糖鎖結合抗体との免疫複合体（ピーク
２）の溶出パターンを夫々示す。
ー分析パターンを示し、図１(a)はペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）標識癌胎児性抗原（ＣＥＡ）類結合抗体の溶
出パターン、図１(b)はＣＥＡ類とＰＯＤ標識ＣＥＡ類
結合抗体（ピーク１）の免疫複合体の溶出パターン、図
１(c)はＣＥＡ類とＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体の免疫
複合体（ピーク１）及びＰＯＤ標識ＣＥＡ類結合抗体と
ＣＥＡ類と特定糖鎖結合抗体との免疫複合体（ピーク
２）の溶出パターンを夫々示す。
１：ピーク１ ２：ピーク２
Claims (30)
- 【請求項１】癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと略記す
る。）類の不変領域に特異的な抗体（以下、ＣＥＡ類結
合抗体と略記する。）と、ＣＥＡ類の変異した糖鎖構造
を認識する蛋白質（以下、特定糖鎖結合蛋白質と略記す
る。）とを用いることを特徴とする、糖鎖構造の変異し
たＣＥＡ類の検出方法。 - 【請求項２】ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結
合蛋白質との複合体の有無を測定することを特徴とす
る、請求項１に記載の検出方法。 - 【請求項３】試料と、ＣＥＡ類結合抗体及び特定糖鎖結
合蛋白質とを反応させ、生成したＣＥＡ類とＣＥＡ類結
合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体の有無を測定す
る、請求項１に記載の検出方法。 - 【請求項４】特定糖鎖結合蛋白質が抗体又はレクチンで
ある、請求項１〜３の何れかに記載の検出方法。 - 【請求項５】抗体がフコース残基又は／及びシアル酸残
基の存在を認識する抗体である、請求項４に記載の検出
方法。 - 【請求項６】抗体が抗ルイス抗体又は抗シアリルルイス
抗体である、請求項４に記載の検出方法。 - 【請求項７】抗ルイス抗体が抗Ｌｅa抗体、抗Ｌｅb抗
体、抗Ｌｅx抗体又は抗Ｌｅy抗体である、請求項６に記
載の検出方法。 - 【請求項８】抗シアリルルイス抗体が抗Ｓ-Ｌｅa抗体又
は抗Ｓ−Ｌｅx抗体である、請求項６に記載の検出方
法。 - 【請求項９】レクチンがＬ−フコース結合性レクチン、
Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミ
ン結合性レクチン、Ｄ−マンノース結合性レクチン、Ｎ
−アセチルグルコサミン結合性レクチン又はシアル酸結
合性レクチンである、請求項４に記載の検出方法。 - 【請求項１０】レクチンがコンカナバリンＡ、ヒマレク
チン、レンズマメレクチン又はインゲンマメレクチンで
ある、請求項４に記載の検出方法。 - 【請求項１１】糖鎖構造の変異したＣＥＡ類の量に基づ
いて判定を行う、癌の判定方法。 - 【請求項１２】ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖
結合蛋白質との複合体の量を測定し、この値に基づいて
判定を行う請求項１１に記載の癌の判定方法。 - 【請求項１３】ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖
結合蛋白質との複合体の量と、ＣＥＡ類とＣＥＡ類結合
抗体との複合体の量とを測定し、これらの値に基づいて
判定を行う請求項１１に記載の判定方法。 - 【請求項１４】ＣＥＡ類を含む試料と、ＣＥＡ類結合抗
体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応させ、生成したＣＥ
Ａ類とＣＥＡ類結合抗体との複合体の量及びＣＥＡ類と
ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体の量
とを測定し、これらの値に基づいて判定を行う請求項１
１に記載の判定方法。 - 【請求項１５】ＣＥＡ類を含む試料と、ＣＥＡ類結合抗
体及び特定糖鎖結合蛋白質とを反応させ、生成したＣＥ
Ａ類とＣＥＡ類結合抗体との複合体の量、及びＣＥＡ類
とＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質との複合体の
量を夫々測定し、これら複合体の総量に対する後者の複
合体の割合を求め、この値に基づいて判定を行う請求項
１１に記載の判定方法。 - 【請求項１６】特定糖鎖結合蛋白質が抗体又はレクチン
である、請求項１２〜１５の何れかに記載の判定方法。 - 【請求項１７】抗体がフコース残基又は／及びシアル酸
残基の存在を認識する抗体である、請求項１６に記載の
判定方法。 - 【請求項１８】抗体が抗ルイス抗体又は抗シアリルルイ
ス抗体である、請求抗１６に記載の判定方法。 - 【請求項１９】抗ルイス抗体が抗Ｌｅa抗体、抗Ｌｅb抗
体、抗Ｌｅx抗体又は抗Ｌｅy抗体である、請求項１８に
記載の判定方法。 - 【請求項２０】抗シアリルルイス抗体が抗Ｓ-Ｌｅa抗体
又は抗Ｓ−Ｌｅx抗体である、請求項１８に記載の判定
方法。 - 【請求項２１】レクチンがＬ−フコース結合性レクチ
ン、Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミン結合性レクチン、Ｄ−マンノース結合性レクチ
ン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合性レクチン又はシア
ル酸結合性レクチンである、請求項１６に記載の判定方
法。 - 【請求項２２】レクチンがコンカナバリンＡ、ヒマレク
チン、レンズマメレクチン又はインゲンマメレクチンで
ある、請求項１６に記載の判定方法。 - 【請求項２３】ＣＥＡ類結合抗体と特定糖鎖結合蛋白質
とを含有させて成る、糖鎖の変異したＣＥＡ類の検出用
キット。 - 【請求項２４】特定糖鎖結合蛋白質が抗体又はレクチン
である、請求項２３に記載のキット。 - 【請求項２５】抗体がフコース残基又は／及びシアル酸
残基の存在を認識する抗体である、請求項２４に記載の
キット。 - 【請求項２６】抗体が抗ルイス抗体又は抗シアリルルイ
ス抗体である、請求抗２４に記載のキット。 - 【請求項２７】抗ルイス抗体が抗Ｌｅa抗体、抗Ｌｅb抗
体、抗Ｌｅx抗体又は抗Ｌｅy抗体である、請求項２６に
記載のキット。 - 【請求項２８】抗シアリルルイス抗体が抗Ｓ-Ｌｅa抗体
又は抗Ｓ−Ｌｅx抗体である、請求項２６に記載のキッ
ト。 - 【請求項２９】レクチンがＬ−フコース結合性レクチ
ン、Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミン結合性レクチン、Ｄ−マンノース結合性レクチ
ン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合性レクチン又はシア
ル酸結合性レクチンである、請求項２４に記載のキッ
ト。 - 【請求項３０】レクチンがコンカナバリンＡ、ヒマレク
チン、レンズマメレクチン又はインゲンマメレクチンで
ある、請求項２４に記載のキット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11172485A JP2001004632A (ja) | 1999-06-18 | 1999-06-18 | 糖鎖構造の変異した癌胎児性抗原類の検出方法 |
| EP00112207A EP1061370A3 (en) | 1999-06-18 | 2000-06-07 | A method for detection of carcinoembryonic antigens having a modified sugar chain structure |
| CA002311702A CA2311702A1 (en) | 1999-06-18 | 2000-06-15 | A method for detection of carcinoembryonic antigens having a modified sugar chain structure |
| US10/767,718 US20040185512A1 (en) | 1999-06-18 | 2004-01-30 | Method for detection of carcinoembryonic antigens having a modified sugar chain structure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11172485A JP2001004632A (ja) | 1999-06-18 | 1999-06-18 | 糖鎖構造の変異した癌胎児性抗原類の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001004632A true JP2001004632A (ja) | 2001-01-12 |
Family
ID=15942870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11172485A Pending JP2001004632A (ja) | 1999-06-18 | 1999-06-18 | 糖鎖構造の変異した癌胎児性抗原類の検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040185512A1 (ja) |
| EP (1) | EP1061370A3 (ja) |
| JP (1) | JP2001004632A (ja) |
| CA (1) | CA2311702A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2009110517A1 (ja) * | 2008-03-04 | 2011-07-14 | 味の素株式会社 | 癌種の評価方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4214779B2 (ja) | 2001-04-04 | 2009-01-28 | 和光純薬工業株式会社 | 電気泳動法 |
| CA2515850A1 (en) * | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Caliper Life Sciences, Inc. | Reduction of migration shift assay interference |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0373852A (ja) * | 1989-05-24 | 1991-03-28 | Eiji Ishikawa | 特異的糖鎖を有する物質の測定法 |
| JPH07126299A (ja) * | 1993-10-29 | 1995-05-16 | Morinaga & Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗体 |
-
1999
- 1999-06-18 JP JP11172485A patent/JP2001004632A/ja active Pending
-
2000
- 2000-06-07 EP EP00112207A patent/EP1061370A3/en not_active Withdrawn
- 2000-06-15 CA CA002311702A patent/CA2311702A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-01-30 US US10/767,718 patent/US20040185512A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2009110517A1 (ja) * | 2008-03-04 | 2011-07-14 | 味の素株式会社 | 癌種の評価方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1061370A3 (en) | 2001-05-30 |
| US20040185512A1 (en) | 2004-09-23 |
| CA2311702A1 (en) | 2000-12-18 |
| EP1061370A2 (en) | 2000-12-20 |
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| A02 | Decision of refusal |
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