JP3562834B2 - 便中daf分子の検査方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は便中DAF分子の検査方法に関する。さらに詳しくは、便中DAF分子の濃度を検査することにより、大腸癌存在有無の検出に有用な便中DAF分子の検査方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来一般検診においては、大腸癌の有無を調べるために、便潜血検査が実施されてきた。便に潜血が認められる場合には、さらに注腸造影検査、大腸ファイバー検査を実施することにより、大腸癌の発生有無が調べられてきた。しかし大腸癌患者の全てに便潜血が認められるものではなく、またたまたま便に潜血が無い場合もあった。このため、便潜血検査のみによる場合は、大腸癌が存在するに拘わらず、見逃される場合があった。
最近、DAF分子の発現が大腸癌組織で亢進していることが免疫組織学的に明らかとなった。DAF分子すなわち崩壊促進因子とは、C3およびC5コンバターゼ(convertase)分解を促進することにより、自己の補体の活性化を促進する糖蛋白質である。DAF分子は、正常な大腸粘膜上皮細胞では殆ど発現しないが、大腸癌細胞の特に癌腺管内腔側面に強く発現していることが明らかとなった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、大腸癌患者では、DAF分子は便中で増加しているものと推定した。そこで、本発明は便中DAF分子の濃度を検査する方法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗DAF抗体を便の上清液と反応させ、上清液中のDAF分子との抗原抗体反応によりDAF分子に結合した抗体の量を測定することからなる便中DAF分子の検査方法である。本発明方法を用いることによって、大腸癌の有無を容易に検出することが可能となる。
【0005】
以下本発明の検査方法について詳細に説明する。
便上清液の調製
一定量の便を緩衝液と混合し、撹拌後上清液を遠沈分離する。
抗DAF抗体の作成
ヒトDAF分子を赤血球膜から精製し、抗DAFモノクロナール抗体および抗DAFポリクロナール抗体を作成する。
便中DAF分子の測定
1) 抗DAFモノクロナール抗体または抗DAFポリクロナール抗体をマイクロタイタープレートまたはビーヅなどに固相化し、便上清液と反応させる。
2) 洗浄後、酵素または放射性物質標識抗DAFモノクロナール抗体または抗DAFポリクロナール抗体を上記反応物と反応させ、結合した酵素量または放射性物質の量を測定する。
あるいは、
2’) 上記1)の操作に引き続いて、洗浄後、抗DAFモノクロナール抗体または抗DAFポリクロナール抗体を反応させる。洗浄後、酵素または放射性物質標識抗モノクロナール免疫グロブリン抗体または抗ポリクロナール免疫グロブリン抗体と反応させ、結合した酵素量または放射性物質の量を測定する。
検量線の作成
既知量の精製DAFを用いて検量線を作成し、これにより試料中のDAF量を算出し、便1g中の量として表示した。
本発明の方法によれば、便1g中0.4ng以上の量を正確に測定することができる。
【0006】
本発明の方法により検出された大腸癌患者の便中DAFは、大腸癌細胞そのものに由来するか、あるいは癌から出血した中の赤血球に由来するものと推定される。しかし、便潜血陰性の大腸癌患者の便中でもDAFが検出されているので、癌細胞に由来している便中DAFを含むものと推定される。大腸疾患を有しない群(以下対照群という)では便中DAFは検出感度以下であり、正常大腸粘膜はDAFを分泌していないものと推定される。
便潜血による大腸癌スクリーニングにおいては、感度が鈍いこと、あるいは大腸癌には検出できる程の出血を伴わない場合があるという問題点がある。本発明の方法は、出血を伴わない大腸癌を便中DAFの検査により検出できる場合があるという利点を有している。
【0007】
以下本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。各例において%は特に断りの無い限り重量%を意味する。
実施例、比較例
便上清液の調製
1〜5gの便に同重量の緩衝液を加えて撹拌する。緩衝液としては、ウシの血清アルブミン1%、Tween20を0.05%およびフェニルメチルスルフォニルフルオライド1mMを含むリン酸緩衝液を用いた。撹拌後、20,000gで15分間遠沈分離した。上清液を採取し、−80℃で測定するまで凍結保存した。
【0008】
抗DAFマウスモノクロナール抗体の作成
1) ヒトDAF分子の精製
ヒト血液50mlから赤血球を分離し、EDTA1mM、フェニルメチルスルフォニルフルオライド0.1mMを含む5mMリン酸緩衝液400mlを加えて撹拌し、48,000gで遠沈し、沈澱となった赤血球基質を集めた。
1gの赤血球基質を5mMリン酸緩衝液で5mg/mlに希釈し、ブタノール80mlを加えて撹拌した後、12,000gで遠心分離し、上層のブタノールと下層の沈澱に挟まれた中央の水層を回収した。ついで、DEAE−セファセルカラムを用い、塩酸ナトリウムを0.04M、ノニオデットP−40を0.1%含有する0.02Mトリス緩衝液により、DAF分子粗分画を分離した。
さらに、DAF粗分画をフェニル−セファロースカラムを用い、塩酸ナトリウムを0.3M、ノニオデットP−40を0.1%含有する0.04Mリン酸緩衝液および塩酸ナトリウムを0.05M、ノニオデットP−40を1%含有する0.05Mリン酸緩衝液を用いて分離した。さらに、ハイドロキシアパタイトカラムで分離後、得られた分画を塩酸カルシウム0.7mM、塩酸マグネシウム0.7mM、塩酸マンガン0.7mM、塩酸ナトリウム0.2M含有する10mMトリス緩衝液で透析した後、レンチルレクチン−セファロースカラムを用いて、精製DAF分子を分離した。
【0009】
2) 抗DAFマウスモノクロナール抗体の作成
BALB/Cマウスを結核死菌含有フロユンドアジュバンドに懸濁した5μgの精製DAFにて1週毎に2回免疫した。3週間後、マウスより脾細胞を取り出し、ポリエチレングリコールを用いてNS−1マウスミエローマ細胞と融合した。作成されたハイブリドーマの培養上清を、精製DAFをブロッティングしたニトロセルロース膜と反応させ、結合したマウスモノクロナール抗体をVector Laboratories社製ABCキットを用いて検出することにより、スクリーニングし、4種類の抗DAFモノクロナール抗体産生ハイブリドーマを得た。
産生されたモノクロナール抗体はすべてIgG1カッパーであった。4種類のモノクロナール抗体のうち、本試験にはDAF分子の活性部分を認識する1C6モノクロナール抗体を用いた。1C6モノクロナール抗体産生ハイブリドーマをマウスの腹腔に注射し腹水を作成し採取した。
腹水から、硫酸アンモニウム沈澱法およびDEAEクロマトグラフィ(トーソー(株)製、“Toyopearl”)を用いて1C6抗DAFモノクロナール抗体IgGを分離精製した。
【0010】
家兎抗DAFポリクロナール抗体の作成
精製したDAFを37℃で1時間インキュベートすることにより、10mlの家兎赤血球に取り込ませた。この赤血球を洗浄後、溶解し、細胞膜を遠心分離により分離した。これを結核死菌含有フロユンドアジュバンドに懸濁し、この懸濁液を用いて赤血球を分離した家兎に免疫した。免疫した家兎から採血し、血清を分離し、硫酸アンモニウム沈澱法およびDEAEクロマトグラフィを用いて家兎IgGを分離精製した。
得られた抗体の特異性は免疫ブロット法により確認した。すなわち、ヒト赤血球基質の粗抽出物をSDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ニトロセルロース膜にブロットした後、家兎DAFポリクロナール抗体を反応させた。結合した家兎IgG抗体を、ECLウエスタンブロッティング検出システム(アマシャム・ジャパン(株))を用いて検出したところ、DAF分子の分子量70kDに相当する部位に単一のバンドが検出され、家兎抗ポリクロナール抗体の特異性が確認された。
【0011】
便中DAF分子の測定
2μg/ml濃度の1C6抗DAFマウスモノクロナール抗体をマイクロタイタープレートの1ウエルあたり100μl加え、4℃で12時間反応後、ウシの血清アルブミン1%を含むリン酸緩衝液を加えて4℃で1晩静置した。洗浄後、便の上清液を1ウエル当たり100μl加え、4℃で1晩インキュベートした。洗浄後、ウエルに濃度4μg/mlの家兎抗DAFポリクロナール抗体IgGを100μl加え、室温で2時間反応後洗浄した。ついでパーオキシダーゼ標識山羊F(ab)’2抗家兎IgG(TAGO社製、米国)を100μl加え、室温で2時間反応後、洗浄し、2,2’−アジノ−ジ−3−エチルベンゾ−チアゾリン−6−スルホン酸を用いて発色させた。オートマチックELISAプレートリーダーを用いて、415nmの吸光度を測定した。
【0012】
検量線の作成
1ウエル当たり0.1ngから10ngの量の精製DAFを加えて反応させ、検量線を作成し、これにより試料中のDAF量を算出し、便1g中の量として表示した。
【0013】
便潜血の検査方法
グアヤック法:塩野義(株)製便潜血スライドを用いて検査した。
免疫法:栄研(株)製OC−ヘモディア−栄研を用いて検査した。
上記した便中DAF検査法および便潜血検査法を用いて、大腸癌患者29例および明らかに大腸疾患を有しない対照群20例について、本発明の検査法の有用性を検討した。結果を図1〜図2および表1〜表4に示す。
【0014】
図1は、29例の大腸癌患者と20例の大腸疾患を有しない対照群の便中DAF分子の濃度を示す。対照群中15例では便中DAF分子は検出感度以下であり、5例では便1g中1ng以下であった。これに対し大腸癌患者では、29例中15例が便1g中1ng以上であり、2例では0.4〜1ngの範囲にあり、残り12例は検出感度以下であった。大腸癌患者と対照群の便中DAF分子濃度には、統計学的に有意(p=0.006)な差が認められる。また便中DAF分子1ng/gを境界とすると大腸癌患者群と対照群との区別が可能であり、1ng/g以上の便中DAF分子濃度を有する例を陽性とすると、大腸癌患者の陽性率は52%(15例/29例)であり、対照群の0%に比して有意の差が認められた(p=0.0001)。
【0015】
図2は、便中DAF分子の存在が認められた大腸癌患者5例についての手術前と手術後の便中DAF分子の濃度の相違を示す。5例中4例では手術後検出感度以下に減少し、残り1例では8.6ng/gから1.4ng/gに減少していることを示す。
表1は便中DAF分子の検出率と大腸癌の大きさとの関連を調べた結果を示す。
【0016】
【0017】
表2は便中DAF分子の検出率と大腸癌の部位との関連を調べた結果を示す。
【0018】
表3は便中DAF分子の検出率とDukesステージとの関連を調べた結果を示す。
【0019】
表4は便中DAF分子の検出率と便潜血反応との関連を調べた結果を示す。
大腸癌患者29例の便潜血は、グアヤック法で16例55%、免疫法で23例79%に陽性であった。便中DAF分子は、グアヤック法で陰性の13例中5例、免疫法で陰性の6例中4例で検出された。なお対照群のうち2例は便潜血反応陽性であったが、便中DAF分子は陰性であった。
【0020】
【発明の効果】
本発明の便中DAFの検査方法によれば、大腸疾患を有しない対照群の便中DAFに比して大腸癌患者の便中DAFを有意の差で検出できる検査方法が提供される。さらの本発明の検査方法によれば、便潜血陰性の大腸癌患者からも便中DAFを検出できる検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】大腸癌患者と大腸疾患を有しない対照群における便中DAF濃度を示すグラフである。
【図2】大腸癌手術前後の便中DAF濃度の変化を示すグラフである。
Claims (1)
- 抗DAF抗体を便の上清液と反応させ、上清液中のDAF分子との抗原抗体反応によりDAF分子に結合した抗体の量を測定することからなる便中DAF分子の検査方法。
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