JP3961559B2 - ブロック化酵素プローブ複合体 - Google Patents
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Description
(1)分子量20,000〜4,000,000の2分子以上の担体が酵素を介して結合し、該担体に酵素が結合した複合体に、プローブ分子が結合したブロック化酵素プローブ複合体。
(2)担体と酵素分子とが、担体上の官能基と酵素分子内の糖鎖を酸化して得られるアルデヒド基により結合している、(1)に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(3)担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β−ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びDNAからなる群より選ばれる1種以上である、(1)または(2)に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(4)酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる群より選ばれる1種以上である、(1)または(2)に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(5)プローブが抗体分子もしくはその機能性断片、プロテインA、プロテインG、プロテインL、レクチン、レセプター、およびアビジン類からなる群より選ばれる1種以上である、(1)または(2)に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(6)2種類以上のプローブを結合させた(1)〜(5)のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(7)抗体分子もしくはその機能性断片が抗HCVコア抗原抗体、抗ガストリン放出ペプチド前駆体抗体およびそれらの機能性断片からなる群より選ばれる1種以上である、(5)または(6)に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(8)ブロック化酵素プローブ複合体の分子量が440,000以上である(1)〜(7)のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体。
(9)(1)〜(8)のいずれかに記載のブロック化酵素プローブ複合体を含む免疫測定用キットまたは核酸検出試薬。
(10)分子量20,000〜4,000,000の担体と酵素を結合させブロック体を形成するステップ、及びそのブロック体にプローブを結合させるステップからなる、(1)〜(8)に記載のブロック化プローブ複合体を製造する方法。
(11)担体と酵素分子の重量比が担体:酵素=1:0.1〜1:20で反応させてブロック体を形成させる(10)に記載の方法。
Dextran T2000(平均分子量2,000,000;アマシャム)0.3gを秤量し、0.1M燐酸緩衝液(pH7.0)6mlに溶解する。過ヨウ素酸ナトリウム溶液を3ml添加混合し、室温で2時間静置反応させ、ゲルろ過(Sephadex G25、アマシャム)をおこないボイド画分を分取し、ヒドラジン塩酸塩(和光純薬)を添加して、デキストランにヒドラジンを導入した。理論的には分子量2,000,000のデキストランには最大で22,000のヒドラジンが導入される。ペルオキシダーゼ(HRP、東洋紡)100mgを秤量し、0.1M炭酸水素ナトリウム溶液3mlに混合溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を1.5ml添加混合し、室温で2時間静置反応させた。ゲルろ過(Sephadex G25)により脱塩後、先に得られた約150mgのデキストランヒドラジドを添加混合して、室温で2時間反応させ、還元後、グリシンを0.1Mとなるよう添加し、4℃で4時間ずつ3回透析をおこない、ブロック化担体HRP結合物を得た。このとき結合しなかったHRPは10%以下であったことから、回収率も含めてDextran T2000(平均分子量2,000,000)1分子に約12−16個のHRPが結合したと考えられる。この結合物5mgに、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させたN−(6−Maleimidocaproyloxy)succinimide(EMCS,同仁化学)1mgを添加し室温で2時間反応させ、ゲルろ過(Sephadex G25)で過剰のEMCSを除去し、担体HRP結合物にマレイミドを導入させた。0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)中抗HCVコア抗原モノクローナル抗体3.5mg(c11−10F(ab’)2とc11−14F(ab’)2を等量混合)のF(ab’)2溶液に、0.1Mシステアミン塩酸塩を1/10容量添加し、37℃で90分間インキュベーションおこないFab’とした。ゲルろ過(Sephadex G25)を行い、ボイド画分を分取しFab’を得た。このFab’とマレイミド基を導入した担体HRP結合物を一晩4℃で反応させ、ゲルろ過(Superdex 200pg,1.6×60cm、アマシャム)をおこない遊離のFab’を除去する。このとき、本発明のHRP−Fab複合体はほぼボイド画分近傍に出現する。このとき遊離のFab’は、10%以下であったことから、回収率も含めてDextran T2000(平均分子量2,000,000)1分子あたり約6−10個のFab’が結合したと考えられる。この分取されたフラクションに牛血清アルブミン(BSA)を0.5%になるように添加し4℃で保存した。このようにして調製されたHRP−Fab複合体の403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から複合体のHRP濃度を求めた。
Dextran T70(平均分子量70,000;アマシャム)0.3gを秤量し、実施例1と同様にHRP−Fab複合体を得、403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から複合体中のHRP濃度を求めた。
Dextran T500(平均分子量500,000;アマシャム)0.3gを秤量し、実施例1と同様の担体(150mg):酵素(100mg)の重量比(0.66)、担体100mgに対して酵素量を3倍量(300mg)の重量比(2.00)および5倍量(500mg)の重量比(3.33)で担体−酵素結合物を調製し、その後実施例1と同様に抗HCVコア抗原モノクローナル抗体を結合させた。403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から複合体中のHRP濃度を求めた。
Dextran T500(平均分子量500,000;アマシャム)0.3gを秤量し、実施例1と同様に担体HRP結合物を得た。この結合物5mgに、DMFに溶解させたEMCS 1mgを添加し室温で2時間反応させた。ゲルろ過(Sephadex G25)で過剰のEMCSを除去し、担体HRP結合物にマレイミドを導入させた。0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)中抗ProGRPモノクローナル抗体(2B10)のF(ab’)2溶液に、0.1Mシステアミン塩酸塩を1/10容量添加し、37℃で90分間インキュベーションをおこないFab’とした。ゲルろ過(Sephadex G25)を行い、ボイド画分を分取しFab’を得た。このFab’とマレイミドを導入した担体HRP結合物を一晩4℃で反応させ、ゲルろ過(Superdex 200pg,1.6×60cm)をおこないボイド近傍の画分を分取し、牛血清アルブミン(BSA)を0.5%になるように添加し4℃で保存した。このようにして調製されたHRP−Fab複合体の403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から複合体中のHRP濃度を求めた。
従来法を用いた酵素抗HCVコア抗原モノクローナル抗体の調製
石川らによって報告された標識抗体の調製法は、一般の診断薬に広く応用されている。この方法(超高感度酵素免疫測定法、石川榮治、1993年、学会出版センター)を従来法として用いた。HRP 4mgを秤量し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)0.6mlに溶解した。DMFに溶解させたEMCS 1mgを添加し室温で2時間反応させた。ゲルろ過(Sephadex G25)で過剰のEMCSを除去し、HRPのアミノ基にマレイミドを導入させた。0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)中抗HCVコア抗原モノクローナル抗体(c11−10およびc11−14)の各々のF(ab’)2溶液に、0.1Mシステアミン塩酸塩を1/10容量添加し、37℃で90分間インキュベーションおこないFab’とした。ゲルろ過(Sephadex G25)を行い、ボイド画分を分取しFab’を得た。このFab’とマレイミドを導入したHRP結合物を一晩4℃で反応させ、ゲルろ過(Superdex 200pg,1.6×60cm)をおこないHRP−Fabの画分を分取し、BSAを0.5%になるように添加し4℃で保存した。このようにして調製されたHRP−Fab結合物の403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から結合物中のHRP濃度を求めた。
従来法を用いた酵素抗ProGRPモノクローナル抗体の調製
比較例1と同様に、HRPのアミノ基にマレイミドを導入させた。0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)中抗ProGRPモノクローナル抗体(2B10)のF(ab’)2溶液に、0.1Mシステアミン塩酸塩を1/10容量添加し、37℃で90分間インキュベーションおこないFab’とした。ゲルろ過(Sephadex G25)にてボイド画分を分取し、Fab’を得た。このFab’とマレイミドを導入したHRP結合物を一晩4℃で反応させ、ゲルろ過(Superdex 200pg,1.6x60cm)をおこないHRP−Fabの画分を分取し、BSAを0.5%になるように添加し4℃で保存した。このようにして調製されたHRP−Fab結合物の403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から結合物中のHRP濃度を求めた。
実施例1で調製した酵素抗HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体をSephacryl S−500 Superfine(アマシャム)(1.6×60)カラムを用いてゲルろ過をおこなった。このSephacryl S−500 Superfineカラムは、主に大分子量の分子やsmall particleを分離するために使用される。ファルマシアGel filtration theory and practiceによれば、このカラム分画範囲は、多糖類で4×104〜2×107である。キャリアにはPBSを用い、1ml/minの流速でゲルろ過を行なった。4ml/2minずつ各フラクションを分取し、403nmの吸光度を測定しHRPの分子吸光係数よりHRP濃度(μg/ml)を求め、その後、各フラクションの反応性をHRP濃度換算で1μg/mlに希釈し検討した。検定方法は以下のとおりである。
実施例3で調製した酵素抗HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体を用いて、それらの反応性を酵素濃度換算で2μg/mlに希釈し検討した。検定方法は以下のとおりである。
96穴マイクロプレートに抗HCVコア抗原モノクローナル抗体(c11−3&c11−7等量混合)を4μg/mlの濃度で200μlを加え、4℃で一晩インキュベートした。10mMリン酸緩衝液pH7.3(PBS)で洗浄後、0.5%カゼインを350μl加え2時間インキュベートした。吸引して0.5%カゼインを除去後、組換え体HCVコア抗原(c11)を21870fmol/Lから3倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、攪拌しながら室温で60分間インキュベートした。洗浄液で6回洗浄を行ない、2次抗体として、実施例1および2で調製した酵素−抗HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素抗体をいずれもHRP濃度で換算して、2.5μg/mlの濃度で200μlを加え30分間インキュベートした。さらに洗浄液で6回洗浄し、基質溶液(10mgオルトフェニレンジアミン、過酸化水素)200μlを加え30分間インキュベートした。5N硫酸を50μlを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(コロナMTP32)で492nm(リファレンス波長630nm)の吸光度を測定した。図2にその結果を示した。0fmol/LとOD0.030の差を検出限界と仮定すると、従来法の酵素抗体では約263fmol/L、実施例2の酵素抗体複合体では約75fmol/L、そして実施例1の酵素抗体複合体では約10fmol/L(0.2pg/ml)が検出可能となった。つまり従来法と比較して3.5〜26.3倍感度が上昇した。感度上昇によって、さらにHCV感染の有無の判断やウイルス定量の幅がひろがり、有用性が高くなった。
実施例1または2では、2種類の抗HCVコア抗原モノクローナル抗体{c11−10F(ab’)2とc11−14F(ab’)2}を一緒にブロック化担体酵素と反応させた。また、これら2種類のモノクローナル抗体を別々にブロック化担体酵素と反応させ、酵素抗HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体を調製した。2種類のモノクローナル抗体を一緒に結合させたものと、c11−10およびc11−14モノクローナル抗体単独で結合させたものは1μg/mlの濃度で、またc11−10およびc11−14モノクローナル抗体単独で結合させたものを各々0.5μg/mlずつ混合したもの(計1μg/ml)の反応性を検討した(図3)。
HRPのアミノ基は非常に少なく、石川らがHRPにアミノ基を利用してマレイミド基を導入するために検討した結果、1個からせいぜい3個以内である〔石川栄治 著;生物化学実験法27、酵素標識法、学会出版センター〕。そのHRPの少ないアミノ基を2−methylmaleic anhydrideを用いてブロックした後、実施例3との同様な方法で、担体としてDextran T500を用い担体:酵素の重量比0.66で担体−酵素結合物を調製した後、抗HCVコア抗原モノクローナル抗体を結合させた。403nmの吸光度を測定し、HRPの403nmの分子吸光係数から複合体中のHRP濃度を求めた。
96穴マイクロプレートに抗ProGRPモノクローナル抗体(2B10)を5μg/mlの濃度で200μlを加え、4℃で一晩インキュベートした。10mMリン酸緩衝液pH7.3(PBS)で2回洗浄後、0.5%カゼインを350μl加え2時間インキュベートした。吸引によって0.5%カゼインを除去後、組換え体ProGRP(31−98)を8000pg/mlから3倍ずつの希釈系列を調製しサンプルとして添加し、37℃で60分間インキュベートした。洗浄液で5回洗浄を行ない、2次抗体として、実施例4で調製した酵素−抗ProGRPモノクローナル抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素抗体をいずれもHRP濃度で換算して、1.5μg/mlの濃度で200μlを加え30分間インキュベートした。さらに洗浄液で6回洗浄し、基質溶液(10mgオルトフェニレンジアミン、過酸化水素)200μlを加え30分間インキュベートした。5N硫酸を50μlを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(コロナMTP32)で492nm(リファレンス波長630nm)の吸光度を測定した。図5にその結果を示した。横軸はProGRPの濃度、縦軸は492nmの吸光度を示すものである。実施例4で調製した酵素抗体複合体が従来法で調製した酵素標識抗体と比較して著しくシグナルが高いことがわかった。0pg/mlとOD0.020の差を検出限界と仮定すると、従来法の酵素抗体では約115pg/ml、実施例3の酵素抗体複合体では約7pg/mlが検出可能で、つまり従来法と比較して16.4倍感度が上昇した。健常人血清中ProGRP濃度は約14pg/ml、カットオフ値は50pg/ml前後である(Jpn.J.Cancer Res.1995 86,698−705)ことから、従来法では健常人検体や、肺小細胞がん患者検体の一部でProGRPを検出できないこととなる。本発明により、このように従来法では検出できなかった患者や健常人の検体中のProGRPも検出が可能となり、その有用性が確認された。
Claims (11)
- 分子量20,000〜4,000,000の2分子以上の担体が酵素を介して結合し、該担体に酵素が結合した複合体に、プローブ分子が結合したブロック化酵素プローブ複合体。
- 担体と酵素分子とが、担体上の官能基と酵素分子内の糖鎖を酸化して得られるアルデヒド基により結合している、請求項1に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- 担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β−ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びDNAからなる群より選ばれる1種以上である、請求項1または2のいずれか1項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- 酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびルシフェラーゼからなる群より選ばれる1種以上である、請求項1または2のいずれか1項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- プローブが抗体分子もしくはその機能性断片、プロテインA、プロテインG、プロテインL、レクチン、レセプター、およびアビジン類からなる群より選ばれる1種以上である、請求項1または2のいずれか1項に記載の酵素プローブ複合体。
- 2種類以上のプローブを結合させた請求項1から5のいずれか1項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- 抗体分子もしくはその機能性断片が抗HCVコア抗原抗体、抗ガストリン放出ペプチド前駆体抗体およびそれらの機能性断片からなる群より選ばれる1種以上である、請求項5または6に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- ブロック化酵素プローブ複合体の分子量が440,000以上である請求項1から7のいずれか1項に記載のブロック化酵素プローブ複合体。
- 請求項1から8のいずれかに1項に記載のブロック化酵素プローブ複合体を含む免疫測定用キットまたは核酸検出試薬。
- 分子量20,000〜4,000,000の担体と酵素を結合させブロック体を形成するステップ、及びそのブロック体にプローブを結合させるステップからなる、請求項1から8のいずれか1項に記載のブロック化プローブ複合体を製造する方法。
- 担体と酵素分子の重量比が担体:酵素=1:0.1〜1:20で反応させてブロック体を形成させる請求項10に記載の方法。
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