JP3667434B2 - 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット - Google Patents
免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP3667434B2 JP3667434B2 JP12078996A JP12078996A JP3667434B2 JP 3667434 B2 JP3667434 B2 JP 3667434B2 JP 12078996 A JP12078996 A JP 12078996A JP 12078996 A JP12078996 A JP 12078996A JP 3667434 B2 JP3667434 B2 JP 3667434B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- reaction
- nonspecific reaction
- nonspecific
- specific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は標識抗体を使用する免疫測定法において用いる、微量物質を正確に検出、定量するための障害となる非特異反応を抑制するための非特異反応抑制剤、これを用いる非特異反応抑制方法及びこれを含む免疫測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く利用されている。免疫測定法には一元放射免疫拡散法、比濁法、比ろう法、凝集法（血球やラテックスを担体として用いた方法）、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等の種類があるが、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法は測定感度も高く、特に極微量成分の検出あるいは定量に多用されている。
【０００３】
放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を抗体に結合した標識抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。
【０００４】
ところで、これらの免疫測定法においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応により、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。この現象は、検体中に含まれる抗原以外の成分が標識抗体と反応することによって引き起こされる。
【０００５】
モノクローナル抗体を用いた測定系においても非特異反応が認められており、せっかく優れた特異性を持つモノクローナル抗体を得ることができたとしても、それを実際の測定系において使用する段階で、その性能を十分生かすことができないことが大きな問題となっている。
【０００６】
従来より、非特異反応を抑制し正しい測定値を得るために色々な試みが行われてきた。例えば、測定すべき検体を加熱や適当な試薬により前処理したり、各種動物血清、免疫グロブリン画分、アルブミン、スキムミルク、ゼラチン、界面活性剤等を測定系に添加することが一般的に行われてきた。リュウマチ因子のように抗体のＦｃ部位に結合することにより引き起こされる非特異反応を回避するためには、ＦａｂやＦ（ａｂ’）2 等の抗体断片を特異反応に使用することも行われている。また、測定系に使用するモノクローナル抗体とは反応特異性が異なりかつ測定系に係わる反応を阻害しないモノクローナル抗体を測定系に添加することも行われている。
【０００７】
特開平１−２５４８６９号公報には、測定対象に対し非特異性で、モノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体の使用が提案されている。この凝集体は該抗体のホモポリマーであっても、抗体断片あるいはアルブミンのような蛋白質やデキストランのような多糖類の巨大分子とのヘテロポリマーであってもよい。
【０００８】
特開平２−１５２９９９号公報では、非特異反応の抑制のために、特異反応に使用するモノクローナル抗体を加熱処理などすることにより調製した、本来の抗体の特異活性は失っているが、非特異反応抑制活性は保持しているモノクローナル抗体由来物質が開示されている。
【０００９】
しかし、これらの方法は非特異反応の抑制にある程度の効果はあるものの、一部の検体ではその効果はまだ不十分であり、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、標識抗体を用いる免疫測定法において、測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、検体中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するための非特異反応抑制剤とその使用方法を提供することが本発明の目的である。
また、非特異反応を防止するための有用な非特異反応抑制剤を含有する測定キットを提供することが本発明のもう一つの目的である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記した問題点を解決すべく非特異反応について鋭意検討した結果、本発明に至った。すなわち、本発明は、
（１）標識抗体を用いる免疫測定法において使用する非特異反応抑制剤であって、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片を用いて得られる結合体からなり、抗体本来の特異反応活性を完全にもしくは実質的に喪失しているが非特異反応抑制活性は実質的に保持している非特異反応抑制剤、
（２）結合体が、共有結合させることにより製造されたものである上記（１）に記載の非特異反応抑制剤、
（３）結合体が、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片とそれ以外の高分子物質とを用いて得られたものである上記（１），（２）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（４）抗体がモノクローナル抗体である上記（１）から（３）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（５）加熱処理、分解処理またはそれらの組み合わせによって抗体本来の特異反応活性が喪失させられた上記（１）から（４）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（６）検体中の抗原を標識抗体を用いて免疫測定する際に、上記（１）から（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を使用することを特徴とする非特異反応抑制方法、
（７）特異的な免疫反応工程を行う前に、検体と非特異反応抑制剤との間に反応を行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（８）非特異反応抑制剤の共存下に、検体を測定するための特異的な免疫反応工程を行うことを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（９）免疫測定がサンドイッチ法による測定であり、特異的な免疫反応工程の一つ以上の工程を非特異反応抑制剤の共存下で行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（１０）標識抗体及び上記（１）〜（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含む免疫測定キット、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において標識抗体は、代表的には、酵素、放射性物質、蛍光物質等の何らかの手段により定量可能なシグナルを出す物質を結合した抗体で、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものを指すが、シグナルを出す物質を直接抗体に結合していなくても、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体や放射活性あるいは蛍光活性を有する金属イオン等と錯化合物を形成する能力のある化合物を結合した抗体で可溶性のものも含まれる。
【００１３】
これらの標識抗体を用いる免疫測定法は、固相法であろうと液相法であろうと方法は問わない。固相法には正サンドイッチ法、逆サンドイッチ法、１段階サンドイッチ法等のサンドイッチ法や競合法が含まれる。液相法には、特公平７−７２７３１号公報に開示されるような、酵素標識抗体を用いて抗原抗体反応を行わせ、標識抗体と抗原の会合の結果生じる酵素活性の変化により抗原量を測定する測定法が含まれる。また、標識物質が抗体に直接結合されていなくても、抗原抗体反応に続く反応工程で標識物質を結合するような測定法、例えば、ビオチニル化抗体を用いたサンドイッチ法による免疫反応工程の後に、アビジン−酵素複合体を反応させるような測定法も含まれる。
【００１４】
本発明における非特異反応抑制剤は標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片（以下「同一抗体の抗体（断片）」という）より製造される。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えば家兎、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。
【００１５】
標識抗体に使用される抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）2 やＦａｂ’等のような抗体断片があるが、本発明の非特異反応抑制剤の製造に用いる抗体の形態は、抗体が標識抗体と同一であれば、標識抗体に使用した抗体の形態と同一の形態である必要はない。形態は特に限定されず、特異的結合部位を持たないＦｃ断片であってもよい。なお、非特異反応は検体中に存在する測定対象以外の何らかの物質が標識抗体に反応して起こることを考慮すると、標識抗体に用いた抗体断片部位を含む同一抗体の抗体（断片）を用いるのが好ましい。
【００１６】
抗体断片の作製は例えばパパイン、ペプシン、トリプシン等の酵素による消化又は還元剤によるＳ−Ｓ結合の切断又はこれらを組み合わせた公知の方法で行える。例えば完全抗体をパパインで消化するとＦａｂとＦｃ断片に切断できる。ペプシンで消化すればＦ（ａｂ’）2 断片が得られ、さらに、２−メルカプトエチルアミンで還元すればＦａｂ’断片が得られる。完全抗体をジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールで還元し、次いで、ヨードアセトアミドのようなＳＨ試薬で処理すればＬ鎖とＨ鎖に切断できる。
【００１７】
本発明における非特異反応抑制剤は同一抗体の抗体（断片）単独の結合体であっても、他の高分子物質との結合体であってもよい。同一抗体の抗体（断片）単独の結合体の場合、完全抗体のみのまたは抗体断片のみの結合体であっても、それらの混合物の結合体であってもよい。結合体を製造するために同一抗体の抗体（断片）とともに用いられる他の高分子物質としては、標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、アルブミン、ゼラチンなどの蛋白質、デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの多糖類またはその誘導体、末端をアミノ基で修飾したポリアルキレングリコール誘導体などの合成高分子などが用いられる。好ましい他の高分子物質としては標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、アルブミン、ヒドロキシプロピルセルロース、等が挙げられる。又、他の高分子物質の分子量は１０００〜１００００００の範囲が好ましく、特に１００００〜３０００００の範囲が好ましい。
【００１８】
同一抗体の抗体（断片）はそれのみで、あるいは蛋白質、多糖類、または合成高分子物質等の他の高分子物質とともに、有機化学的手法、または生物学的親和性に基づく相互作用などを介して文献から公知の方法により結合体を製造することができる。
【００１９】
有機化学的方法では、例えば、架橋試薬を用いて共有結合させることにより結合体を製造することができる。主な架橋試薬としてはカルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、マレイミド化合物、ピリジル・ジスルフィド化合物等があげられる。これらの架橋試薬を使用した結合体の製造は、例えば酵素標識抗体で酵素と抗体を結合する方法と同一の方法で行うことができ、石川らの「酵素免疫測定法第３版（医学書院、１９８７年）７５〜１２６頁」やＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎの「エンザイムイムノアッセイ（生化学実験法１１、東京化学同人、１９８９年）１９６〜２５１頁」等に詳細に記載されている酵素標識抗体の作製方法を参照すればよい。これらの試薬の多くは抗体および抗体とともに使用する高分子物質のアミノ基やチオール基を利用している。抗体のチオール基を利用する方法としては抗体を酵素および還元処理してＦａｂ’に断片化して抗体のヒンジ部分にあるチオール基を利用したり、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等によりチオール基を導入する方法等がある。また、架橋試薬としては主に２つの官能基を持ったものを使用し、
同じ官能基を２つ持つ同反応性二価試薬と異なる官能基を有する異反応性二価試薬がある。
【００２０】
共有結合させることによる結合体の製造方法の例をいくつか説明する。グルタルアルデヒド法はグルタルアルデヒドが２つのアルデヒド基を持っていることから、同一抗体の抗体（断片）又はこれと他の高分子物質のアミノ基と反応して架橋させる方法である。過ヨウ素酸法は同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質の糖鎖を過ヨウ素酸により酸化して生成したアルデヒド基と同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質のアミノ基の反応により架橋する方法である。Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレイミドやＮ，Ｎ’−オキシジメチレンジマレイミド等の２つのマレイミド基を有する架橋試薬を使用する方法ではチオール基により架橋が行われる。ビス−コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のような同反応性二価試薬はアミノ基を介して架橋が行われる。Ｎ−スクシンイミジル−２−マレイミドアセテート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−３−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート等のマレイミド誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは異反応性二価試薬で、同一抗体の抗体（断片）や他の高分子物質のアミノ基とチオール基を介して架橋させる。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートもアミノ基とチオール基の架橋に使われる。
【００２１】
生物学的親和性を利用した結合体の製造方法の例としては、アビジンとビオチンの結合を利用した方法がある。例えば同一抗体の抗体（断片）とアルブミンなどの他の高分子物質の両方にビオチン分子を導入しアビジンにより架橋する方法や、あるいは両者の一方にアビジンを導入し、もう一方にビオチンを導入して架橋する方法がある。ビオチン分子の導入にはビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシミニドエステルなどが試薬として使われる。
【００２２】
前述の方法により製造した結合体は、一般にかなり広い分子量分布をもっている。結合体は分子量が大きくなるほど非特異反応抑制効果が増大するが、さらに分子量が大きくなると沈殿を起こし不溶化するため、非特異反応抑制効果は逆に低下する。結合体の分子量は可溶性を保持している範囲であることが望ましい。結合体は異なる分子量を有する混合物であってもかまわないが、ゲル濾過、限外濾過や遠心分離などの公知の方法により分別し、希望の分子量にして使用することもできる。結合体（非特異反応抑制剤）の平均分子量は１０万以上であることが好ましく、特に３０万〜４０００万の範囲であることが好ましい。又、結合体が同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質とを用いてえられるものである場合、同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質の使用割合は、モル比で１：０．０１〜１００の範囲であることが好ましく、特に１：０．１〜１０の範囲であることが好ましい。
【００２３】
同一抗体の抗体（断片）の特異活性は加熱処理、酵素による分解処理、酸・アルカリや還元剤等による化学処理、超音波処理などの公知の方法により喪失させることができる。また、これらの方法を組み合わせて行うことも可能である。同一抗体の抗体（断片）の特異活性を喪失させるための処理は、結合体を製造する前の同一抗体の抗体（断片）の段階で行ってもよいし、結合体にしてから処理してもよい。
【００２４】
ここで「抗体本来の特異反応活性を実質的に喪失している」とは、測定の正確さおよび信頼性の観点から判断して支障のない程度に特異反応活性を喪失しているという意味である。特異反応活性を完全に喪失させるために過剰の強い処理を行えば、非特異反応抑制活性も失われる場合もあるので、その処理条件を適宜選択して、特異反応活性は実質的に喪失しているが、非特異反応抑制活性は保持されうる穏和な条件で処理する必要がある。
【００２５】
この処理法の例として、最も簡便な方法の一つである加熱処理法を示す。この場合、ｐＨ３からｐＨ１２の範囲の適当な緩衝液中に同一抗体の抗体（断片）又は結合体を抗体濃度として１０μｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、５０℃から１００℃で１分間〜４８時間インキュベートすることによって非特異反応抑制剤は製造される。特異反応活性の喪失のしやすさは同一抗体の抗体（断片）又は結合体によってかなり異なり、処理条件は個々に検討しなければならないが、加熱処理の温度と時間の関係は一般的に言って、処理温度を高くすれば処理時間を短くする必要がある。酵素による分解処理の例としては、パパインやトリプシンにより完全抗体を消化し、ゲル濾過により分画してＦｃ断片を得る方法がある。Ｆｃ断片は抗体の特異活性部位を失っており、特異反応活性を有しない。このＦｃ断片を用いて、前記方法で結合体を製造することができる。
【００２６】
本発明の非特異反応抑制剤の使用方法としては、標識抗体を用いる免疫測定法において行なう特異的な免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液中で非特異反応抑制剤と検体を接触させ、適当な時間（例えば１分〜２時間）インキュベートする方法がある。この間に、検体中の非特異反応を起こす物質（非特異反応物質）は非特異反応抑制剤と反応し、特異的免疫反応工程での標識抗体との非特異反応活性は失われる。特異的免疫反応工程にはインキュベートを完了した検体と非特異反応抑制剤の混合液をそのまま用いればよい。
【００２７】
さらに簡便な本発明の非特異反応抑制剤の使用方法は、非特異反応抑制剤の共存下に特異的免疫反応工程を行う方法である。例えば、最も一般的に用いられる正サンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加するだけで、それ以外は何ら特別な工程を必要とせずに所望の効果を得ることができる。なぜなら、非特異反応が検出されるのは、抗体の特異的反応部位を介さずに「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体を形成するためであるが、第一免疫反応中に非特異反応物質の標識抗体に対する反応活性が非特異反応抑制剤により吸収されるからである。さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。なお、通常は第一免疫反応工程の緩衝液に添加されていれば十分な効果が得られる。
【００２８】
また、１段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。本発明の非特異反応抑制剤は結合体であるために標識抗体より非特異反応を起こす物質との結合力が高められている。また、標識抗体に比べて過剰量を添加しておけば非特異反応を起こす物質は優先的に非特異反応抑制剤と反応するので非特異反応は回避される。
【００２９】
本発明の非特異反応抑制剤は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。非特異反応抑制剤の非特異反応物質と反応させる系における濃度は０．１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましくと、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌである。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常添加される助剤たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応抑制剤と共に用いることもできる。適当な緩衝液として例えばリン酸塩緩衝液２０〜１００ｍＭ ｐＨ６〜８またはトリス−塩酸５０ｍＭ／ＮａＣｌ １００ｍＭ ｐＨ７〜８などが使用できる。反応促進剤としては例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては例えばトリトンＸ−１００、ツイーン２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどの蛋白質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧなどの防腐剤を挙げることができる。
【００３０】
本発明の他の対象は、標識抗体を用いた免疫測定法に使用する、標識抗体及び本発明の非特異反応抑制剤を含む測定キットに関するものである。一般に測定キットは標識抗体液、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、さらに必要に応じて、サンドイッチ法で検体と固相化抗体を反応させるため緩衝液、酵素反応のための発色液と反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。
【００３１】
本発明の非特異反応抑制剤は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬の成分としてもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。通常本発明の非特異反応抑制剤は検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体に添加してキットの構成試薬とする。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。標識抗体に対して非特異反応抑制剤は０．１〜１０００重量倍用いるのが好ましく、特に１〜１００重量倍用いるのが好ましい。
【００３２】
固相法に基づくキットの場合、固相の種類や形状は問わない。公知の通常免疫測定キットに使われるものでよい。固相の例としてはプラスチック試験管、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレンマイクロプレート、ポリエチレンテレフタレートマイクロプレート、ポリ塩化ビニルマイクロプレート、磁性粒子、ガラスビーズ、セルロース粒子、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙、ナイロン膜などが挙げられる。イムノクロマトグラフィーなどを原理とする簡易測定キットの試験片を使用することも可能である。
【００３３】
本発明の非特異反応抑制剤を用いる免疫測定法において使用される検体としては、例えば血清、血漿、髄液、唾液等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられ、又、測定物質としては、臨床検査に利用される物質、例えば体液中に含まれる、ヒトイムノグロブリン、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン、β2-ミクログロブリン、フェリチン、Ｃ反応性蛋白、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、塩基性フェトプロティン、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性蛋白、ＣＡ−５０、膵癌胎児性抗原、シアリルＬｅX −ｉ抗原、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、シアリルＴｎ、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、γ−セミノプロティン、前立腺特異抗原、ニューロン特異エノラーゼ、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリン、などが挙げられる。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 同反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３（サブクラス ＩｇＧ1 、λ、純度９５％以上）を２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに２．５％グルタルアルデヒド水溶液を１０μｌ加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、０．２Ｍ Ｌ−リジン塩酸塩水溶液を０．１ｍｌ添加し、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。その後１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３６】
実施例２ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３と１ｍｇの牛血清アルブミを溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。透析物の分子量分布をＨＰＬＣ（東ソー社製ゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷＸＬとＧ６０００ＳＷＸＬを直列につなぎ、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を移動相として用い、２８０ｎｍの吸光度を測定した。）で分析した結果を図１に示す。過ヨウ素酸法により結合体が形成されるとともに一部未反応の抗体及び牛血清アルブミンが含まれていることがわかる。
【００３７】
この透析物の一部を採取し、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（粗製物）（非特異反応抑制剤）を得た。残りの透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−６Ｂを充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）により精製し、分子量３００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（精製物）（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３８】
実施例３ 異反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
２ｍｇの牛血清アルブミンを溶解した１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌに０．５Ｍ Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０μｌを添加し、室温で攪拌しながら１時間反応した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して４℃で一夜透析し、マレイミド基を導入した牛血清アルブミンを調製した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３の完全抗体１０ｍｇを含む１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２ｍｌにシグマ社製ペプシン０．２ｍｇを加え、３７℃で２０時間消化した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ＩＢＦ社製ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）によりＦ（ａｂ’）2 を分画し、限外濾過により濃縮した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３のＦ（ａｂ’）2 ２ｍｇを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．４５ｍｌに１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールアミンと５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を５０μｌ加えて、３７℃で９０分間反応し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ファルマシア社製セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりＦａｂ’を回収した。マレイミド基を導入した牛血清アルブミンと回収したＦａｂ’を混合し、３０℃で９０分間反応し、さらに５０ｍＭのＮ−エチルマレイミド ２０μｌを添加して３０℃で３０分間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×７０ｃｍ）により精製し、分子量１００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３９】
実施例４ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトルイスＹ抗原マウスモノクローナル抗体Ｓ１１３（サブクラスＩｇＭ、純度９５％以上）と１ｍｇのヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製）を溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。この透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、２時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００４０】
実施例５ 酵素免疫測定法に基づいたヒト血清中のＣＥＡ測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｃ４３抗体（ＨＲＰ−Ｃ４３）
Ｃ４３抗体のＦａｂ’は実施例３と同様の方法により調製した。一方、東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ１０ｍｇを１．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１２５ｍＭ Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１００μｌを加え、３０℃で６０分間撹拌しながら反応した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼを回収した。Ｆａｂ’とマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼをモル比で１：１になるように混合し、４℃で２０時間反応した。反応液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｃ４３を得た。
【００４１】
（２）Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ３８（サブクラス ＩｇＧ1 、κ、純度９５％以上）はＣ４３抗体とは異なるＣＥＡ上のエピトープを認識する。この抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４２】
（３）ヒト血清中ＣＥＡの測定キット
ヒト血清中のＣＥＡの測定キットの構成試薬は以下の通りである。
標準液：０〜５０ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標品を含む１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：０．５μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｃ４３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２、２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０） 反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４３】
（４）ヒト血清中のＣＥＡの測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清またはＣＥＡ標準液を２５μｌとり、酵素標識抗体液を１５０μｌ加え、さらに、固相化抗体ビーズを１個入れて、室温で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。濃度既知の標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のＣＥＡ濃度を求めた。多数の健常者検体を測定し、５０ｎｇ／ｍｌ以上に測定され、市販のＣＥＡ測定キット「ＣＥＡ「ロシュ」−ＥＩＡ（日本ロシュ社）」により５ｎｇ／ｍｌ以下に測定された検体Ｎｏ．１８８および検体Ｎｏ．３５７を非特異反応を示す検体として選択した。
【００４４】
（５）血清中ＣＥＡ測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のＣＥＡ測定キットの酵素標識抗体液に実施例１から実施例３で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行ない非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表１に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。非特異反応の抑制効果は検体によって異なるが、抗体濃度として２０μｇ／ｍｌ程度添加すれば十分な効果が得られた。また、実施例２の粗製品と精製品の比較では、精製により抗体と牛血清アルブミンの結合物だけとした精製品の方が多少効果が大きいことが示された。しかし、粗製物であっても十分効果が期待できることがわかった。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例６ 酵素免疫測定法によるヒト血清中ルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｓ１１３抗体（ＨＲＰ−Ｓ１１３）
東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ２ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム０．１ｍｌを加えて攪拌しながら室温で３０分間反応した。さらに２００ｍＭエチレングリコール０．１ｍｌを加えて３０分間反応した。反応液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一夜透析した。６ｍｇのＳ１１３抗体を２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌに溶解し、透析物を加えて、室温で攪拌しながら３時間反応させた。２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍｌ加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−４Ｂを充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｓ１１３を得た。
【００４７】
（２）Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
Ｓ１１３抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４８】
（３）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液：ルイスＹ抗原を高濃度に有する癌患者の血清に任意の単位を設定し、１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈して標準液とした。
緩衝液：０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）
反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４９】
（４）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清および標準液を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、酵素標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした。（第二免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のルイスＹ抗原濃度を求めた。健常者の血清のほとんどは低い値を示したがまれに高い値を示す検体があった。非常に高い値を示した健常者の検体Ｎｏ．２１４の希釈試験を行ったところ、血清中のルイスＹ抗原濃度は希釈により急激に低下し、健常者の抗原濃度レベルになったので非特異反応を示す検体であることがわかった。また、この検体を６０℃で１時間加熱すると健常者の抗原濃度レベルを示すようになった。
【００５０】
（５）血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表２に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例７ 放射免疫測定法に基づいたヒト血清中のルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１） 125Ｉ標識Ｓ１１３抗体（ 125Ｉ−Ｓ１１３）
２ｍｇ／ｍｌのＳ１１３抗体を溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）５０μｌに１％グルコース水溶液２５μｌおよび０．２５ｍＣｉのＮＥＮ社製Ｎａ 125Ｉを溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）２５μｌを加え、さらに、バイオラッド社製エンザイモビーズ懸濁液２５μｌを加えて室温で３０分間反応した。１％重亜硫酸ナトリウム水溶液２５μｌを加えて反応を停止し、０．５％牛血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カラムで 125Ｉ−Ｓ１１３を分画した。
【００５３】
（２）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液、緩衝液、固相化抗体ビーズ、洗浄液は実施例６のキットと同一のものを用いた。
標識抗体液：０．１μｇ／ｍｌの 125Ｉ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
【００５４】
（３）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定
プラスチック試験管に標準液および血清（検体Ｎｏ．２１４）を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした（第二免疫反応）。ビーズを生理食塩水で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、パッカード社製ガンマカウンターで放射活性を測定した。
【００５５】
（４）放射免疫測定法における血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（２）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（３）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表３に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫測定法において非特異反応を排除できるため、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、信頼性の高い臨床検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】過ヨウ素酸法によるＣ４３抗体とウシ血清アルブミン反応物のゲル濾過分析結果。横軸は溶出時間、縦軸は２８０ｎｍの吸光度を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は標識抗体を使用する免疫測定法において用いる、微量物質を正確に検出、定量するための障害となる非特異反応を抑制するための非特異反応抑制剤、これを用いる非特異反応抑制方法及びこれを含む免疫測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く利用されている。免疫測定法には一元放射免疫拡散法、比濁法、比ろう法、凝集法（血球やラテックスを担体として用いた方法）、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等の種類があるが、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法は測定感度も高く、特に極微量成分の検出あるいは定量に多用されている。
【０００３】
放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を抗体に結合した標識抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。
【０００４】
ところで、これらの免疫測定法においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応により、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。この現象は、検体中に含まれる抗原以外の成分が標識抗体と反応することによって引き起こされる。
【０００５】
モノクローナル抗体を用いた測定系においても非特異反応が認められており、せっかく優れた特異性を持つモノクローナル抗体を得ることができたとしても、それを実際の測定系において使用する段階で、その性能を十分生かすことができないことが大きな問題となっている。
【０００６】
従来より、非特異反応を抑制し正しい測定値を得るために色々な試みが行われてきた。例えば、測定すべき検体を加熱や適当な試薬により前処理したり、各種動物血清、免疫グロブリン画分、アルブミン、スキムミルク、ゼラチン、界面活性剤等を測定系に添加することが一般的に行われてきた。リュウマチ因子のように抗体のＦｃ部位に結合することにより引き起こされる非特異反応を回避するためには、ＦａｂやＦ（ａｂ’）2 等の抗体断片を特異反応に使用することも行われている。また、測定系に使用するモノクローナル抗体とは反応特異性が異なりかつ測定系に係わる反応を阻害しないモノクローナル抗体を測定系に添加することも行われている。
【０００７】
特開平１−２５４８６９号公報には、測定対象に対し非特異性で、モノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体の使用が提案されている。この凝集体は該抗体のホモポリマーであっても、抗体断片あるいはアルブミンのような蛋白質やデキストランのような多糖類の巨大分子とのヘテロポリマーであってもよい。
【０００８】
特開平２−１５２９９９号公報では、非特異反応の抑制のために、特異反応に使用するモノクローナル抗体を加熱処理などすることにより調製した、本来の抗体の特異活性は失っているが、非特異反応抑制活性は保持しているモノクローナル抗体由来物質が開示されている。
【０００９】
しかし、これらの方法は非特異反応の抑制にある程度の効果はあるものの、一部の検体ではその効果はまだ不十分であり、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、標識抗体を用いる免疫測定法において、測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、検体中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するための非特異反応抑制剤とその使用方法を提供することが本発明の目的である。
また、非特異反応を防止するための有用な非特異反応抑制剤を含有する測定キットを提供することが本発明のもう一つの目的である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記した問題点を解決すべく非特異反応について鋭意検討した結果、本発明に至った。すなわち、本発明は、
（１）標識抗体を用いる免疫測定法において使用する非特異反応抑制剤であって、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片を用いて得られる結合体からなり、抗体本来の特異反応活性を完全にもしくは実質的に喪失しているが非特異反応抑制活性は実質的に保持している非特異反応抑制剤、
（２）結合体が、共有結合させることにより製造されたものである上記（１）に記載の非特異反応抑制剤、
（３）結合体が、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片とそれ以外の高分子物質とを用いて得られたものである上記（１），（２）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（４）抗体がモノクローナル抗体である上記（１）から（３）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（５）加熱処理、分解処理またはそれらの組み合わせによって抗体本来の特異反応活性が喪失させられた上記（１）から（４）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（６）検体中の抗原を標識抗体を用いて免疫測定する際に、上記（１）から（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を使用することを特徴とする非特異反応抑制方法、
（７）特異的な免疫反応工程を行う前に、検体と非特異反応抑制剤との間に反応を行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（８）非特異反応抑制剤の共存下に、検体を測定するための特異的な免疫反応工程を行うことを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（９）免疫測定がサンドイッチ法による測定であり、特異的な免疫反応工程の一つ以上の工程を非特異反応抑制剤の共存下で行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（１０）標識抗体及び上記（１）〜（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含む免疫測定キット、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において標識抗体は、代表的には、酵素、放射性物質、蛍光物質等の何らかの手段により定量可能なシグナルを出す物質を結合した抗体で、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものを指すが、シグナルを出す物質を直接抗体に結合していなくても、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体や放射活性あるいは蛍光活性を有する金属イオン等と錯化合物を形成する能力のある化合物を結合した抗体で可溶性のものも含まれる。
【００１３】
これらの標識抗体を用いる免疫測定法は、固相法であろうと液相法であろうと方法は問わない。固相法には正サンドイッチ法、逆サンドイッチ法、１段階サンドイッチ法等のサンドイッチ法や競合法が含まれる。液相法には、特公平７−７２７３１号公報に開示されるような、酵素標識抗体を用いて抗原抗体反応を行わせ、標識抗体と抗原の会合の結果生じる酵素活性の変化により抗原量を測定する測定法が含まれる。また、標識物質が抗体に直接結合されていなくても、抗原抗体反応に続く反応工程で標識物質を結合するような測定法、例えば、ビオチニル化抗体を用いたサンドイッチ法による免疫反応工程の後に、アビジン−酵素複合体を反応させるような測定法も含まれる。
【００１４】
本発明における非特異反応抑制剤は標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片（以下「同一抗体の抗体（断片）」という）より製造される。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えば家兎、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。
【００１５】
標識抗体に使用される抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）2 やＦａｂ’等のような抗体断片があるが、本発明の非特異反応抑制剤の製造に用いる抗体の形態は、抗体が標識抗体と同一であれば、標識抗体に使用した抗体の形態と同一の形態である必要はない。形態は特に限定されず、特異的結合部位を持たないＦｃ断片であってもよい。なお、非特異反応は検体中に存在する測定対象以外の何らかの物質が標識抗体に反応して起こることを考慮すると、標識抗体に用いた抗体断片部位を含む同一抗体の抗体（断片）を用いるのが好ましい。
【００１６】
抗体断片の作製は例えばパパイン、ペプシン、トリプシン等の酵素による消化又は還元剤によるＳ−Ｓ結合の切断又はこれらを組み合わせた公知の方法で行える。例えば完全抗体をパパインで消化するとＦａｂとＦｃ断片に切断できる。ペプシンで消化すればＦ（ａｂ’）2 断片が得られ、さらに、２−メルカプトエチルアミンで還元すればＦａｂ’断片が得られる。完全抗体をジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールで還元し、次いで、ヨードアセトアミドのようなＳＨ試薬で処理すればＬ鎖とＨ鎖に切断できる。
【００１７】
本発明における非特異反応抑制剤は同一抗体の抗体（断片）単独の結合体であっても、他の高分子物質との結合体であってもよい。同一抗体の抗体（断片）単独の結合体の場合、完全抗体のみのまたは抗体断片のみの結合体であっても、それらの混合物の結合体であってもよい。結合体を製造するために同一抗体の抗体（断片）とともに用いられる他の高分子物質としては、標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、アルブミン、ゼラチンなどの蛋白質、デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの多糖類またはその誘導体、末端をアミノ基で修飾したポリアルキレングリコール誘導体などの合成高分子などが用いられる。好ましい他の高分子物質としては標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、アルブミン、ヒドロキシプロピルセルロース、等が挙げられる。又、他の高分子物質の分子量は１０００〜１００００００の範囲が好ましく、特に１００００〜３０００００の範囲が好ましい。
【００１８】
同一抗体の抗体（断片）はそれのみで、あるいは蛋白質、多糖類、または合成高分子物質等の他の高分子物質とともに、有機化学的手法、または生物学的親和性に基づく相互作用などを介して文献から公知の方法により結合体を製造することができる。
【００１９】
有機化学的方法では、例えば、架橋試薬を用いて共有結合させることにより結合体を製造することができる。主な架橋試薬としてはカルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、マレイミド化合物、ピリジル・ジスルフィド化合物等があげられる。これらの架橋試薬を使用した結合体の製造は、例えば酵素標識抗体で酵素と抗体を結合する方法と同一の方法で行うことができ、石川らの「酵素免疫測定法第３版（医学書院、１９８７年）７５〜１２６頁」やＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎの「エンザイムイムノアッセイ（生化学実験法１１、東京化学同人、１９８９年）１９６〜２５１頁」等に詳細に記載されている酵素標識抗体の作製方法を参照すればよい。これらの試薬の多くは抗体および抗体とともに使用する高分子物質のアミノ基やチオール基を利用している。抗体のチオール基を利用する方法としては抗体を酵素および還元処理してＦａｂ’に断片化して抗体のヒンジ部分にあるチオール基を利用したり、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等によりチオール基を導入する方法等がある。また、架橋試薬としては主に２つの官能基を持ったものを使用し、
同じ官能基を２つ持つ同反応性二価試薬と異なる官能基を有する異反応性二価試薬がある。
【００２０】
共有結合させることによる結合体の製造方法の例をいくつか説明する。グルタルアルデヒド法はグルタルアルデヒドが２つのアルデヒド基を持っていることから、同一抗体の抗体（断片）又はこれと他の高分子物質のアミノ基と反応して架橋させる方法である。過ヨウ素酸法は同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質の糖鎖を過ヨウ素酸により酸化して生成したアルデヒド基と同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質のアミノ基の反応により架橋する方法である。Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレイミドやＮ，Ｎ’−オキシジメチレンジマレイミド等の２つのマレイミド基を有する架橋試薬を使用する方法ではチオール基により架橋が行われる。ビス−コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のような同反応性二価試薬はアミノ基を介して架橋が行われる。Ｎ−スクシンイミジル−２−マレイミドアセテート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−３−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート等のマレイミド誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは異反応性二価試薬で、同一抗体の抗体（断片）や他の高分子物質のアミノ基とチオール基を介して架橋させる。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートもアミノ基とチオール基の架橋に使われる。
【００２１】
生物学的親和性を利用した結合体の製造方法の例としては、アビジンとビオチンの結合を利用した方法がある。例えば同一抗体の抗体（断片）とアルブミンなどの他の高分子物質の両方にビオチン分子を導入しアビジンにより架橋する方法や、あるいは両者の一方にアビジンを導入し、もう一方にビオチンを導入して架橋する方法がある。ビオチン分子の導入にはビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシミニドエステルなどが試薬として使われる。
【００２２】
前述の方法により製造した結合体は、一般にかなり広い分子量分布をもっている。結合体は分子量が大きくなるほど非特異反応抑制効果が増大するが、さらに分子量が大きくなると沈殿を起こし不溶化するため、非特異反応抑制効果は逆に低下する。結合体の分子量は可溶性を保持している範囲であることが望ましい。結合体は異なる分子量を有する混合物であってもかまわないが、ゲル濾過、限外濾過や遠心分離などの公知の方法により分別し、希望の分子量にして使用することもできる。結合体（非特異反応抑制剤）の平均分子量は１０万以上であることが好ましく、特に３０万〜４０００万の範囲であることが好ましい。又、結合体が同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質とを用いてえられるものである場合、同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質の使用割合は、モル比で１：０．０１〜１００の範囲であることが好ましく、特に１：０．１〜１０の範囲であることが好ましい。
【００２３】
同一抗体の抗体（断片）の特異活性は加熱処理、酵素による分解処理、酸・アルカリや還元剤等による化学処理、超音波処理などの公知の方法により喪失させることができる。また、これらの方法を組み合わせて行うことも可能である。同一抗体の抗体（断片）の特異活性を喪失させるための処理は、結合体を製造する前の同一抗体の抗体（断片）の段階で行ってもよいし、結合体にしてから処理してもよい。
【００２４】
ここで「抗体本来の特異反応活性を実質的に喪失している」とは、測定の正確さおよび信頼性の観点から判断して支障のない程度に特異反応活性を喪失しているという意味である。特異反応活性を完全に喪失させるために過剰の強い処理を行えば、非特異反応抑制活性も失われる場合もあるので、その処理条件を適宜選択して、特異反応活性は実質的に喪失しているが、非特異反応抑制活性は保持されうる穏和な条件で処理する必要がある。
【００２５】
この処理法の例として、最も簡便な方法の一つである加熱処理法を示す。この場合、ｐＨ３からｐＨ１２の範囲の適当な緩衝液中に同一抗体の抗体（断片）又は結合体を抗体濃度として１０μｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、５０℃から１００℃で１分間〜４８時間インキュベートすることによって非特異反応抑制剤は製造される。特異反応活性の喪失のしやすさは同一抗体の抗体（断片）又は結合体によってかなり異なり、処理条件は個々に検討しなければならないが、加熱処理の温度と時間の関係は一般的に言って、処理温度を高くすれば処理時間を短くする必要がある。酵素による分解処理の例としては、パパインやトリプシンにより完全抗体を消化し、ゲル濾過により分画してＦｃ断片を得る方法がある。Ｆｃ断片は抗体の特異活性部位を失っており、特異反応活性を有しない。このＦｃ断片を用いて、前記方法で結合体を製造することができる。
【００２６】
本発明の非特異反応抑制剤の使用方法としては、標識抗体を用いる免疫測定法において行なう特異的な免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液中で非特異反応抑制剤と検体を接触させ、適当な時間（例えば１分〜２時間）インキュベートする方法がある。この間に、検体中の非特異反応を起こす物質（非特異反応物質）は非特異反応抑制剤と反応し、特異的免疫反応工程での標識抗体との非特異反応活性は失われる。特異的免疫反応工程にはインキュベートを完了した検体と非特異反応抑制剤の混合液をそのまま用いればよい。
【００２７】
さらに簡便な本発明の非特異反応抑制剤の使用方法は、非特異反応抑制剤の共存下に特異的免疫反応工程を行う方法である。例えば、最も一般的に用いられる正サンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加するだけで、それ以外は何ら特別な工程を必要とせずに所望の効果を得ることができる。なぜなら、非特異反応が検出されるのは、抗体の特異的反応部位を介さずに「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体を形成するためであるが、第一免疫反応中に非特異反応物質の標識抗体に対する反応活性が非特異反応抑制剤により吸収されるからである。さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。なお、通常は第一免疫反応工程の緩衝液に添加されていれば十分な効果が得られる。
【００２８】
また、１段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。本発明の非特異反応抑制剤は結合体であるために標識抗体より非特異反応を起こす物質との結合力が高められている。また、標識抗体に比べて過剰量を添加しておけば非特異反応を起こす物質は優先的に非特異反応抑制剤と反応するので非特異反応は回避される。
【００２９】
本発明の非特異反応抑制剤は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。非特異反応抑制剤の非特異反応物質と反応させる系における濃度は０．１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましくと、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌである。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常添加される助剤たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応抑制剤と共に用いることもできる。適当な緩衝液として例えばリン酸塩緩衝液２０〜１００ｍＭ ｐＨ６〜８またはトリス−塩酸５０ｍＭ／ＮａＣｌ １００ｍＭ ｐＨ７〜８などが使用できる。反応促進剤としては例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては例えばトリトンＸ−１００、ツイーン２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどの蛋白質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧなどの防腐剤を挙げることができる。
【００３０】
本発明の他の対象は、標識抗体を用いた免疫測定法に使用する、標識抗体及び本発明の非特異反応抑制剤を含む測定キットに関するものである。一般に測定キットは標識抗体液、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、さらに必要に応じて、サンドイッチ法で検体と固相化抗体を反応させるため緩衝液、酵素反応のための発色液と反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。
【００３１】
本発明の非特異反応抑制剤は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬の成分としてもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。通常本発明の非特異反応抑制剤は検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体に添加してキットの構成試薬とする。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。標識抗体に対して非特異反応抑制剤は０．１〜１０００重量倍用いるのが好ましく、特に１〜１００重量倍用いるのが好ましい。
【００３２】
固相法に基づくキットの場合、固相の種類や形状は問わない。公知の通常免疫測定キットに使われるものでよい。固相の例としてはプラスチック試験管、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレンマイクロプレート、ポリエチレンテレフタレートマイクロプレート、ポリ塩化ビニルマイクロプレート、磁性粒子、ガラスビーズ、セルロース粒子、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙、ナイロン膜などが挙げられる。イムノクロマトグラフィーなどを原理とする簡易測定キットの試験片を使用することも可能である。
【００３３】
本発明の非特異反応抑制剤を用いる免疫測定法において使用される検体としては、例えば血清、血漿、髄液、唾液等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられ、又、測定物質としては、臨床検査に利用される物質、例えば体液中に含まれる、ヒトイムノグロブリン、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン、β2-ミクログロブリン、フェリチン、Ｃ反応性蛋白、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、塩基性フェトプロティン、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性蛋白、ＣＡ−５０、膵癌胎児性抗原、シアリルＬｅX −ｉ抗原、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、シアリルＴｎ、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、γ−セミノプロティン、前立腺特異抗原、ニューロン特異エノラーゼ、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリン、などが挙げられる。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 同反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３（サブクラス ＩｇＧ1 、λ、純度９５％以上）を２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに２．５％グルタルアルデヒド水溶液を１０μｌ加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、０．２Ｍ Ｌ−リジン塩酸塩水溶液を０．１ｍｌ添加し、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。その後１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３６】
実施例２ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３と１ｍｇの牛血清アルブミを溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。透析物の分子量分布をＨＰＬＣ（東ソー社製ゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷＸＬとＧ６０００ＳＷＸＬを直列につなぎ、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を移動相として用い、２８０ｎｍの吸光度を測定した。）で分析した結果を図１に示す。過ヨウ素酸法により結合体が形成されるとともに一部未反応の抗体及び牛血清アルブミンが含まれていることがわかる。
【００３７】
この透析物の一部を採取し、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（粗製物）（非特異反応抑制剤）を得た。残りの透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−６Ｂを充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）により精製し、分子量３００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（精製物）（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３８】
実施例３ 異反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
２ｍｇの牛血清アルブミンを溶解した１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌに０．５Ｍ Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０μｌを添加し、室温で攪拌しながら１時間反応した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して４℃で一夜透析し、マレイミド基を導入した牛血清アルブミンを調製した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３の完全抗体１０ｍｇを含む１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２ｍｌにシグマ社製ペプシン０．２ｍｇを加え、３７℃で２０時間消化した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ＩＢＦ社製ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）によりＦ（ａｂ’）2 を分画し、限外濾過により濃縮した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３のＦ（ａｂ’）2 ２ｍｇを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．４５ｍｌに１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールアミンと５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を５０μｌ加えて、３７℃で９０分間反応し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ファルマシア社製セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりＦａｂ’を回収した。マレイミド基を導入した牛血清アルブミンと回収したＦａｂ’を混合し、３０℃で９０分間反応し、さらに５０ｍＭのＮ−エチルマレイミド ２０μｌを添加して３０℃で３０分間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×７０ｃｍ）により精製し、分子量１００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３９】
実施例４ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトルイスＹ抗原マウスモノクローナル抗体Ｓ１１３（サブクラスＩｇＭ、純度９５％以上）と１ｍｇのヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製）を溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。この透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、２時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００４０】
実施例５ 酵素免疫測定法に基づいたヒト血清中のＣＥＡ測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｃ４３抗体（ＨＲＰ−Ｃ４３）
Ｃ４３抗体のＦａｂ’は実施例３と同様の方法により調製した。一方、東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ１０ｍｇを１．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１２５ｍＭ Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１００μｌを加え、３０℃で６０分間撹拌しながら反応した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼを回収した。Ｆａｂ’とマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼをモル比で１：１になるように混合し、４℃で２０時間反応した。反応液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｃ４３を得た。
【００４１】
（２）Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ３８（サブクラス ＩｇＧ1 、κ、純度９５％以上）はＣ４３抗体とは異なるＣＥＡ上のエピトープを認識する。この抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４２】
（３）ヒト血清中ＣＥＡの測定キット
ヒト血清中のＣＥＡの測定キットの構成試薬は以下の通りである。
標準液：０〜５０ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標品を含む１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：０．５μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｃ４３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２、２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０） 反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４３】
（４）ヒト血清中のＣＥＡの測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清またはＣＥＡ標準液を２５μｌとり、酵素標識抗体液を１５０μｌ加え、さらに、固相化抗体ビーズを１個入れて、室温で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。濃度既知の標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のＣＥＡ濃度を求めた。多数の健常者検体を測定し、５０ｎｇ／ｍｌ以上に測定され、市販のＣＥＡ測定キット「ＣＥＡ「ロシュ」−ＥＩＡ（日本ロシュ社）」により５ｎｇ／ｍｌ以下に測定された検体Ｎｏ．１８８および検体Ｎｏ．３５７を非特異反応を示す検体として選択した。
【００４４】
（５）血清中ＣＥＡ測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のＣＥＡ測定キットの酵素標識抗体液に実施例１から実施例３で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行ない非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表１に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。非特異反応の抑制効果は検体によって異なるが、抗体濃度として２０μｇ／ｍｌ程度添加すれば十分な効果が得られた。また、実施例２の粗製品と精製品の比較では、精製により抗体と牛血清アルブミンの結合物だけとした精製品の方が多少効果が大きいことが示された。しかし、粗製物であっても十分効果が期待できることがわかった。
【００４５】
【表１】
実施例６ 酵素免疫測定法によるヒト血清中ルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｓ１１３抗体（ＨＲＰ−Ｓ１１３）
東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ２ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム０．１ｍｌを加えて攪拌しながら室温で３０分間反応した。さらに２００ｍＭエチレングリコール０．１ｍｌを加えて３０分間反応した。反応液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一夜透析した。６ｍｇのＳ１１３抗体を２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌに溶解し、透析物を加えて、室温で攪拌しながら３時間反応させた。２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍｌ加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−４Ｂを充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｓ１１３を得た。
【００４７】
（２）Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
Ｓ１１３抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４８】
（３）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液：ルイスＹ抗原を高濃度に有する癌患者の血清に任意の単位を設定し、１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈して標準液とした。
緩衝液：０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）
反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４９】
（４）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清および標準液を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、酵素標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした。（第二免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のルイスＹ抗原濃度を求めた。健常者の血清のほとんどは低い値を示したがまれに高い値を示す検体があった。非常に高い値を示した健常者の検体Ｎｏ．２１４の希釈試験を行ったところ、血清中のルイスＹ抗原濃度は希釈により急激に低下し、健常者の抗原濃度レベルになったので非特異反応を示す検体であることがわかった。また、この検体を６０℃で１時間加熱すると健常者の抗原濃度レベルを示すようになった。
【００５０】
（５）血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表２に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５１】
【表２】
実施例７ 放射免疫測定法に基づいたヒト血清中のルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１） 125Ｉ標識Ｓ１１３抗体（ 125Ｉ−Ｓ１１３）
２ｍｇ／ｍｌのＳ１１３抗体を溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）５０μｌに１％グルコース水溶液２５μｌおよび０．２５ｍＣｉのＮＥＮ社製Ｎａ 125Ｉを溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）２５μｌを加え、さらに、バイオラッド社製エンザイモビーズ懸濁液２５μｌを加えて室温で３０分間反応した。１％重亜硫酸ナトリウム水溶液２５μｌを加えて反応を停止し、０．５％牛血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カラムで 125Ｉ−Ｓ１１３を分画した。
【００５３】
（２）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液、緩衝液、固相化抗体ビーズ、洗浄液は実施例６のキットと同一のものを用いた。
標識抗体液：０．１μｇ／ｍｌの 125Ｉ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
【００５４】
（３）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定
プラスチック試験管に標準液および血清（検体Ｎｏ．２１４）を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした（第二免疫反応）。ビーズを生理食塩水で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、パッカード社製ガンマカウンターで放射活性を測定した。
【００５５】
（４）放射免疫測定法における血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（２）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（３）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表３に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５６】
【表３】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫測定法において非特異反応を排除できるため、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、信頼性の高い臨床検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】過ヨウ素酸法によるＣ４３抗体とウシ血清アルブミン反応物のゲル濾過分析結果。横軸は溶出時間、縦軸は２８０ｎｍの吸光度を示す。
Claims (10)
- 標識抗体を用いる免疫測定法において、使用する非特異反応抑制剤であって、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片を用いて得られる結合体（ただし、酵素または不活化酵素との結合体を除く）からなり、抗体本来の特異反応活性を完全にもしくは実質的に喪失しているが非特異反応抑制活性は実質的に保持している非特異反応抑制剤。
- 結合体が、共有結合させることにより製造されたものである請求項１に記載の非特異反応抑制剤。
- 結合体が、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片とそれ以外の高分子物質とを用いて得られたものである請求項１または２に記載の非特異反応抑制剤。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項１から３のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤。
- 加熱処理、分解処理またはそれらの組み合わせによって抗体本来の特異反応活性が喪失させられた請求項１から４のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤。
- 検体中の抗原を標識抗体を用いて免疫測定する際に、請求項１から５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を使用することを特徴とする非特異反応抑制方法。
- 特異的な免疫反応工程を行う前に、検体と非特異反応抑制剤との間に反応を行わせることを特徴とする請求項６に記載の非特異反応抑制方法。
- 非特異反応抑制剤の共存下に、検体を測定するための特異的な免疫反応工程を行うことを特徴とする請求項６に記載の非特異反応抑制方法。
- 免疫測定がサンドイッチ法による測定であり、特異的な免疫反応工程の一つ以上の工程を非特異反応抑制剤の共存下で行わせることを特徴とする請求項６に記載の非特異反応抑制方法。
- 標識抗体及び請求項１から５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を含む免疫測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12078996A JP3667434B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12078996A JP3667434B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09288108A JPH09288108A (ja) | 1997-11-04 |
| JP3667434B2 true JP3667434B2 (ja) | 2005-07-06 |
Family
ID=14795046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12078996A Expired - Fee Related JP3667434B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3667434B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3315969A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-05-02 | Sysmex Corporation | Antibody reagent and reagent kit for detecting test substance by immune complex transfer method, method for producing the same, and use of the same |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4892500B2 (ja) * | 2008-02-12 | 2012-03-07 | 富士フイルム株式会社 | 非特異吸着抑制剤を用いたイムノクロマトグラフ方法 |
| JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| KR102176382B1 (ko) * | 2012-09-28 | 2020-11-09 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | 면역학적 검출 방법 및 면역학적 검출 시약 |
| EP2930514B1 (en) * | 2012-12-05 | 2019-08-28 | Konica Minolta, Inc. | Method for suppressing nonspecific signals from contaminants in an immunoassay using surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (spfs) |
| JP2013152247A (ja) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| TW202342979A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-11-01 | 日商積水醫療股份有限公司 | 檢測方法及檢測試劑 |
-
1996
- 1996-04-19 JP JP12078996A patent/JP3667434B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3315969A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-05-02 | Sysmex Corporation | Antibody reagent and reagent kit for detecting test substance by immune complex transfer method, method for producing the same, and use of the same |
| US11268956B2 (en) | 2016-06-30 | 2022-03-08 | Sysmex Corporation | Method for producing antibody reagent |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09288108A (ja) | 1997-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0782710B1 (en) | Method for detecting antibodies | |
| FI92879B (fi) | Menetelmä ja väline immuunikokeissa esiintyvien häiriötekijöiden kompensoimiseksi | |
| Yorde et al. | Competitive enzyme-liked immunoassay with use of soluble enzyme/antibody immune complexes for labeling. I. Measurement of human choriogonadotropin. | |
| US4959306A (en) | Labeling design for a binding assay reagent | |
| JP3524401B2 (ja) | 酵素抗体複合体およびその製造方法 | |
| JPH0421818B2 (ja) | ||
| CA2008360A1 (en) | Myocardial infarction immunoassay | |
| EP0166623A2 (en) | Antibody lectin sandwich assay | |
| JP4920415B2 (ja) | プローブ複合体 | |
| JP3781934B2 (ja) | 酵素−タンパク質複合体 | |
| US4621048A (en) | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy | |
| EP0124366B1 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| JP3667434B2 (ja) | 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット | |
| JPH07325083A (ja) | 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 | |
| US4757001A (en) | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase | |
| JP3667435B2 (ja) | 非特異反応抑制剤、抑制方法及び測定キット | |
| JPH0421819B2 (ja) | ||
| US4816390A (en) | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor | |
| EP0431169A1 (en) | Immunoassay method, reagent and kit | |
| JPH048748B2 (ja) | ||
| JPH0246896B2 (ja) | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho | |
| EP0425665A1 (en) | Method for assaying chondrocalcine | |
| JPH07118291A (ja) | 核酸と免疫化学的活性物質との複合体、その製法およびその複合体を使用する免疫化学的測定試薬 | |
| JPH02173569A (ja) | ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット | |
| JPH0634013B2 (ja) | 高感度免疫測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040210 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040213 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040412 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040803 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041108 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050404 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050406 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110415 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110415 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140415 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |