JP2000513929A

JP2000513929A - 進行性神経疾患を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物

Info

Publication number: JP2000513929A
Application number: JP10503108A
Authority: JP
Inventors: シアオ，カレン; ボルチェルト，デビッド，アール．; シソディア，サングラム，エス．
Original assignee: ユニバーシティーオブミネソタ; ジョーンズホプキンスユニバーシティー
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2000-10-24
Also published as: US5877399A; US6509515B2; AU3481897A; EP0904349A4; US20020019992A1; EP0904349A1; CA2257852C; CA2257852A1; US20030229907A1; WO1997048792A1

Abstract

(57)【要約】生殖細胞および体細胞が動物またはその動物の先祖に胚期において導入されたアミロイド前駆体タンパク質配列を含む、トランスジェニック非ヒト真核細胞動物が提供される。マウスにおいては、興奮、新奇恐怖症、無活動、大脳のグルコース活用の低下、皮質-近縁系神経膠症および死亡によって特徴づけられる年齢関連ＣＮＳ障害が発生する。位置に依存しない、コピー数に依存する発現をもたらすハムスタープリオンタンパク質遺伝子由来のコスミドベクターを用いて作製された、ヒトおよびマウスアルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現するトランスジェニックマウスにおいては、この障害の加速化が起こる。トランスジェニックマウスにおいては、この障害はトランスジェニックＡＰＰの脳レベルに直接関連して発生するが、突然変異型ＡＰＰは野生型ＡＰＰに較べて低いレベルで表現型を付与する。この障害は細胞外アミロイド沈積の不在下で起こり、ＡＰＰのいくつかの病原活性はアミロイド形成とは別個のものであることを示している。

Description

【発明の詳細な説明】進行性神経疾患を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物連邦政府の助成金に関する通知本研究は助成金第K08-NS01419号を含む国立公衆衛生院からの助成金によって部分的に援助された。米国政府は本発明に権利を有する。関連出願との相互参照本出願は、1996年５月10日出願の米国特許出願第08/644,691号の部分継続出願であり、上記米国特許出願は1994年１月27日出願の米国特許出願第08/189,064号の継続出願である。これらの開示は参考として本明細書に組み入れるものとする。序文技術分野本発明は、非トランスジェニックの同一年齢の動物と比較した場合に行動的および神経病理学的変化の両方において特徴づけられる進行性神経疾患を有するトランスジェニック動物、およびアルツハイマー病等の進行性神経症候群を治療または治癒させるために用いることのできる作用物質のスクリーニングのための上記トランスジェニック動物の使用に関する。本発明は、プリオンタンパク質遺伝子調節配列の制御下で天然の、または突然変異型のβアミロイド前駆体タンパク質を脳組織中で内因性レベルを越えたレベルで発現するトランスジェニックマウスによって例証される。発明の背景神経系疾患に適用される「変性の(degenerative)」という用語は、神経系の構成要素の漸進的な、一般に容赦なく進行する荒廃(wasting away)が見られる一群の障害を指して用いられる。そのように称される病状の多くは、異常な遺伝的因子に依存している。変性疾患は、臨床的および病理学的特徴によって区別される多数の症候群の形で現われる。しかし、全てに共通する或る側面がある。これらの側面には、疾患発生の徐々に進行する経過、疾患によってもたらされる変化の両側性に対照的な分布、および多数の症例における解剖学的または生理学的に関連したニューロン系の殆ど選択的な関与が含まれる。典型的には、病理学的プロセスは、神経細胞体または神経線維としてのそれらの延長物のゆっくりした退縮のひとつである。神経系の変性疾患には、顕著な特徴が進行性痴呆である症候群がある。この群の症候群は、老年痴呆およびアルツハイマー病を含む。老年痴呆はヒトに限らず他の動物にも老年にかなり頻繁に見られる病状である。アルツハイマー病は病理学的には同じであるが、老年期のかなり前に始まる、はるかに頻度の低い、進行性痴呆である。これら２つの病状の区別は、純粋に臨床的なものである。病理学的に見れば、アルツハイマー病の場合には特徴的な異常性がより重篤で広範囲である傾向があり、また老年期より早い時期に始まる傾向がある、という点でのみ両者は異なっている。アルツハイマー病（ＡＤ）は、ゆっくりした進行性の、記憶力の減退をともなう精神的衰退、見当障害、および混乱を示し、深い痴呆へと進む。この疾患は主として脳の近縁系および皮質領域に関わる。いくつかの組織学的特徴が見られるが、そのうち２つは驚くべきものである。第１に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のアミロイド生成性αβ断片を含有する銀親和性斑が大脳皮質および海馬全体にばらまかれている。第２に、主に新皮質、海馬およびメイナート(Mey nert)基底核に存在する錐体ニューロンに神経細線維もつれ(tangle)が見いだされる。他の変化もまた存在する。ある人々によって斑または神経細線維もつれよりもＡＤの方に特異的であると考えられてきた、海馬の錐体細胞における顆粒空胞性変性が観察される。最後に、皮質および海馬にニューロンの喪失および神経膠症が観察される。ＡＤの病理学的特徴を欠く（そしてそれゆえ定義により別の病名を有する）痴呆症患者が存在する。そして逆に、ＡＤの病理学的特徴の多くを有しながら死亡前に痴呆化しないヒトもいる。ＡＤの診断には、この疾患に特徴的な臨床的および病理学的特徴の両方が患者に存在することが必要である。臨床的または病理学的特徴単独からは確実な診断を下すことはできない。神経機能障害および臨床的異常が病理学的特徴、特にアミロイド斑および神経細線維もつれの発生に先立つのかどうかは不明である。ＡＤの臨床的症状発現は、大脳皮質、海馬、肩桃、および海馬傍回を含む前脳における侵された脳構造体の領域を予言する。これらの領域は脳の皮質−近縁系領域として知られている。小脳、橋および延髄核を含む後脳は、悪影響を免れている。大脳新皮質内では、一次皮質領域が比較的免れている。これは、臨床的に観察される、基礎的運動および感覚機能が比較的侵されないのと対応している。ＡＤ等の進行性神経障害、およびこれらの障害を治療または治癒させるために用いることができる作用物質のスクリーニング手段の研究は、容易に入手可能な動物モデルがないことによって深刻に妨げられてきた。年老いた霊長類の神経病理のいくつかの側面はヒトＡＤのそれらに類似している(Priceら，1992，J．Neu robiol．23:1277-1294)。年老いた霊長類では、アミロイド斑をおよび不完全型神経細線維もつれが発生する。試験した動物のうち、他のものはいずれも年老いた霊長類ほどにはＡＤ類似の疾患を発症しなかった。年老いた霊長類を大量に試験することは実行不可能である。そしてそれらを試験に使用することは倫理面および環境面で問題を生じる。ＡＰＰ導入遺伝子を担持するトランスジェニックマウスが記載された；しかし、報告された導入遺伝子産物の発現はＡＰＰの内因性レベルにかなり及ばない。これらの他のトランスジェニックマウスにおける全ＡＰＰレベルは内因性レベルの150%を越えず、脳の皮質-近縁系領域における病状をともなった進行性神経行動障害を有する疾患表現型を創成しない。これらの他のトランスジェニックマウスにおいては、真の神経疾患の証拠と見なしうる進行性神経性疾患または脳における神経病理学的変化の徴候は全く見られなかった。また、進行性神経疾患を予防、改善または治癒させる作用物質のスクリーニング手段として生きた動物において使用することのできる神経行動性変化、等の変化も記載されていない。アミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子におけるミスセンス点突然変異が家族性ＡＤに結び付けられた。しかし、ＡＰＰにおける疾患関連突然変異の発見にもかかわらず、ＡＤを有するトランスジェニック動物を作製しようとする公表された試みの殆どは、マウスにおける野生型ＡＰＰ導入遺伝子とのみ関わり合ってきた(Kawabataら，1991，Nature 354，476-478;Quonら，1991，Nature 352，239-41;Wirakら，1991，Science 253，323-325;Kammesheidtら，1992，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 89，10857-61;Lambら，1993，Nature Genetics 5，22 -30)。残念なことに、病状を主題とする幾つかの公表された研究は導入遺伝子産物発現の文書による証拠固めの不十分なこと、および／または病状の誤った解釈によって混乱させられた。２つの研究は撤回された（Kawabataら，1991，Nature 354，476-478;およびWirakら，1991，Science 253，323-325）。トランスジェニックマウスを用いてＡＤのモデルを作製しようとした以前の努力は、落胆させるものであった。殆どの場合、ＡＰＰの内因性レベルと同等またはそれを越える導入遺伝子産物の発現は達成されず、また導入遺伝子は突然変異したＡＰＰをコードするものではなかった。PCT/US92/11276は突然変異型遺伝子の使用方法を報告している。ある場合には、全ＡＰＰ遺伝子は発現されず、カルボキシル末端のみが発現された(Kammesheidtら，1992，Proc．Natl．Acad.Sci． USA 89，10857-61);ＡＰＰのカルボキシル末端のみの発現は、ＡＰＰ分子の残りの部分がＡＤにおいて果たす何らかの生物学的作用を見逃す可能性がある。数匹のトランスジェニックマウスにおいてプレアミロイドＡＰＰ斑が観察されている。しかし、プレアミロイドＡＰＰ斑は必ずしも疾患の指標ではない。なぜなら、そのような斑は病状または臨床的症状発現の他の徴候を欠く小脳等のヒトの脳領域に日常的に観察されるからである。トランスジェニックマウスの海馬ニューロンの小嚢構造体内に位置するＡＰＰ免疫反応性の増大が報告されたが、この免疫反応性の重大性は不明である。なぜなら、そのマウスは進行性神経行動障害も真の神経病状の証拠も示さなかったからである。一般に、神経変性疾患のとどまることなく進行する経過は、現在の治療方法によつては影響を受けない。したがって、老年痴呆およびＡＤ等の変性神経疾患のトランスジェニック非ヒト動物モデルであって、臨床的にも病理学的にも上記疾患に類似した脳皮質-近縁系の進行性変性神経疾患（例えば、神経膠症および侵される特定の脳領域）を発症する動物モデルを開発することは興味深い。動物モデルが誕生後かなり短い期間内に神経疾患を発症し、多世代系統の分析を容易にすることもまた望ましい。このモデルは、変性神経疾患の病因および治療を研究するために使用することができる。なぜなら、検査し、点数をつけるべき明白で確固とした臨床的および病理学的表現型が生きた動物中に存在するからである。関連文献突然変異βAPPV717Fの３つのイソ型を発現し、KPI含有イソ型を過剰に提示する(overrepresentation)トランスジェニックマウス（Swiss Webster x C57B6/DB A2 Ｆ1）は、豊富なチオフラビンＳ陽性Ａβ沈積、神経炎斑、シナプスの喪失、星状細胞増加および小膠細胞症を含むアルツハイマー型神経病状を示すが(Games ら，Nature 373:523-527(1995))、記憶および学習の欠陥はいまだに報告されていない。ヒト野生型βAPP751を発現するトランスジェニックマウス（ＪＵ）は、 12月齢までに空間参照(spatial reference)および交互の仕事(alternation task s)の欠損を示すが(Moranら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:5341-5345(1995)) が、年取った(>>12月)トランスジェニックマウスのわずか4%が、コンゴーレッド色素で染まらない、まばらな広汎性Ａβ沈積を示したに過ぎなかった(Higginsら，Annals of Neurology 35:598-607(1994))。Quonら（1991）Nature 352:239は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質遺伝子を含むトランスジェニックマウスを記載している。Lambら（1993）Nature Genetics 5:22は、発現されるアミロイド前駆体タンパク質の量が内因性レベルよりも約50%高いトランスジェニックマウスを記載している。PCT出願US92/11276は、種々のプロモーターの下でβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の３つの形、APP69S、APP751およびAPP770を発現するであろうトランスジェニックマウスおよびラットの構築方法を開示している。これらの方法を用いてin vivoでＡＰＰ発現が得られたかどうかというデータは明細書には記載されていない。米国特許出願第5,455,160号およびWO 9213069 をも参照されたい。他のトランスジェニックマウスのアルツハイマーアミロイド前駆体（ＡＰＰ）タンパク質発現の研究には以下のものが含まれる。すなわち、Greenberg，（1 993）Abstract 421:12，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035はMAPPおよびmMt-Iプロモーターを用いたＡＰＰタンパク質遺伝子の発現を開示している。Schwartzら[(1993)Abstract 421:13，Society for Neuroscience Abstracts 1 9:1035]は、トランスジェニックマウスにおけるヒトβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のニューロン特異的発現を開示している。Savageら[(1993) Abst ract 421:14，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035]は、アルツハイマー病モデルとしてのトランスジェニックマウスにおけるヒトアミロイド前駆体タンパク質の発現を開示している。Lieberburg[(1993) Abstract421:15，Society for Neuroscience Abstracts 19:1035]は、トランスジェニックマウスにおけるN SEプロモーターを用いたヒトアミロイド前駆体タンパク質の発現を開示している。Fukuchiら[(1993) Abstract 421:16，Society for Neuroscience Abstracts 1 9:1035]は、トランスジェニックマウスにおける腸のβアミロイドーシスを開示している。ＡＰＰタンパク質遺伝子の発現にはニワトリβアクチンプロモーターおよびCMVエンハンサーが用いられた。 Wagnerら[(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:5016]は、ヒトグロビン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを記載している。Scottら((1989)Cell59:847 )は、ハムスタープリオンタンパク質遺伝子を含むトランスジェニックマウスを記載している。Hsiaoら((1990)Science 250:1587)は、突然変異体ヒトプリオンタンパク質遺伝子を含むトランスジェニックマウスを記載している。Hsiaoは、プリオンタンパク質(PrP)遺伝子の突然変異によって引き起こされる稀な神経変性疾患であるゲルストマン-シュトロイスラー-シェインカー(Gerstmann-Strauss ler-Scheinker)病（ＧＳＳ）のモデルをトランスジェニックマウスを用いて開示した。このマウスにおいては、臨床的および病理学的表現型を創り出すためには、内因性レベルを上回る突然変異導入遺伝子産物産物のレベルが必要であった(H siaoら（1990）Science 250:1587-1590;Hsiaoら（1994）Proc.Natl．Acad．Sci ．USA 91:9126-9130)。発明の概略進行性神経疾患のトランスジェニック非ヒト動物モデル、該動物モデルを作製するための方法および構成物、並びに該動物モデルの使用方法が提供される。この非ヒト哺乳動物は、発現カセットの多数コピーを胚期に非ヒト哺乳動物に導入し、そして妊娠期間の終了までその胚を偽妊娠した養い母親の中で発生させる工程によって得ることができる。発現カセットは、野生型アミロイド前駆体タンパク質の内因性発現レベルの少なくとも２〜４倍のレベルでコード配列を神経組織中で発現するために調節配列に機能しうる形で連結したアミロイド前駆体タンパク質コード配列を含む。得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、脳の皮質-近縁系領域において進行性神経疾患を発症する。このトランスジェニック動物は、例えば、進行性神経疾患の治療および／または予防に用いうる作用物質のスクリーニングプロトコールにおける有用性が見出されている。図面の簡単な説明図１は、HuAPP ｃＤＮＡ配列を図式的に表したものである。図２は、トランスジェニック動物中に発現させることのできる異なるＡＰＰ配列を図式的に表したものである（網羅的なものではない）。図３は、PrPコード領域と置換した、SalI部位で挟まれたテトラサイクリン耐性配列を有するハムスターPrPコスミドベクターを図式的に表したものである。図４および５は、強い翻訳開始を有するように図６および７に示すように改変した、HuAPP配列に融合させたハムスターPrPコスミドベクターを図式的に表したものである。図６および７は、強い翻訳開始を有するように改変したHuAPP配列およびそれに隣接するSalI制限部位を図式的に表す。図８は、導入遺伝子の検出に用いることができるＰＣＲプライマーを図式的に表す。図９は、トランスジェニックおよび非トランスジェニックＦＶＢマウスにおける年齢関連ＣＮＳ機能障害を示す。変異型HuAPPを内因性MoAPPレベルのそれぞれ 3.6倍および1.4倍発現するトランスジェニックマウスの２つの系統、すなわちTg(HuAPP695).TRImyc)1130HおよびTg(HuAPP695.TRImyc)1118においては、疾患の平均的な開始(onset)はＡＰＰレベルに逆比例していた。Tg(HuAPP695.WTmyc )1874マウスのサブセットおよび非トランスジェニックマウスは侵されたトランスジェニックマウスに類似した臨床的および病理学的異常を発症したが、どの年齢においでも浸透度は有意に低かった。図10は、行動異常を示すトランスジェニックおよび非トランスジェニックＦＶＢマウスにおける皮質-近縁系の肥大性星状細胞性神経膠症を示す。GFAPに対する抗体に反応した皮質-近縁系および脳幹構造体の冠状切片は、行動異常を示す動物の皮質-近縁系領域における肥大性神経膠症を示す。図10A:行動異常（興奮および低いコーナーインデックス(corner index)得点）を示すTg(HuAPP695.TRlm yc)1118-334、144日齢、206日目に屠殺;図10B、行動異常を示さないTg1118-334 の非トランスジェニックな同腹子、206日齢;図10C、行動異常（無活性および低いコーナーインデックス得点）を示す非トランスジェニック#4565、324日齢、33 4日目に屠殺;図10D、行動異常を示さない#4565の非トランスジェニックな同腹子、334日齢。図11は、脳組織におけるトランスジェニックHuAPPタンパク質の発現を示す。H uAPPタンパク質発現は、半定量的な様式で、それぞれ40、7、21および74のコピー数の導入遺伝子を担持するトランスジェニックマウスの４系統、すなわちTg(H uAPP695.WTmyc)466、Tg(HuAPP695.TRImyc)1056、Tg(HuAPP695.TRImyc)1118、Tg( HuAPP695.TRImyc)1130Hを用いて測定した。内因性脳MoAPPと比較したトランスジェニックの相対レベルを、２つのポリクローナルＡＰＰ抗血清CT15(図11A)および抗GID(図11A)、およびモノクローナル抗体22C11(図11B)を用いたイムノブロット分析によって調べた。CT15抗血清は、ＡＰＰのＣ末端にある15個のアミノ酸（この領域ではマウスおよびヒトＡＰＰは相同である）を認識した。GID抗血清は、APP695のアミノ末端から175〜186残基のエピトープ（この領域ではマウスおよびヒトＡＰＰは同一である）を認識する。界面活性剤で抽出した非トランスジェニックおよびトランスジェニック同腹子の脳ホモジネート由来のタンパク質を同量用いて、並行してイムノブロット分析を行なった。¹²⁵I-プロテインＡによって一次抗体を明らかにした。モノクローナル抗体の場合には、まずブロットをマウスＩｇＧに対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。結合した¹²⁵I-プロテインＡの量をホスホリメガー(phosphorimager) を用いて定量し、導入遺伝子コピー数と導入遺伝子産物発現の間の直接的関係を実証した。特にHuAPPのレベルを特異的に測定するためには、ヒトＡβの残基１〜17に対して産生させた6E10抗体を用いて脳ホモジネートをプローブした(Kimら，1990、Neuroscience Research Communications，７，113-122)。図11Cは脳に存在するHuAPPの領域別発現を示す。種々の組織の10% w/vホモジネート中に存在するHuAPPの相対量を、6E10抗体を用いて、Tg(HuAPP695.TRImyc)1130Hマウスにおいて特異的に検出した。各レーンにおいて同量のタンパク質をイムノブロットした。レーン１、終脳；レーン２、間脳：レーン３、中脳；レーン４、橋；レーン５、小脳；レーン６、延髄：レーン７、脊髄。終脳におけるHuAPPの最高レベルは、小脳のそれの約２倍であった。図12は、トランスジェニック脳ＡＰＰ発現の種およびコピー数に対する依存を示す。図13は、トランスジェニックマウスのニューロンにおけるHuAPP発現を示す。図13A、トランスジェニック（Ｔｇ）、ギ酸による前処理、6E10抗体（海馬）；図13B、非トランスジェニック、ギ酸による前処理、6E10抗体（海馬）；図13C、トランスジェニック、ギ酸による前処理、6E10抗体（大脳皮質）；図13D、ＡＤ斑、ギ酸による前処理、6E10抗体；図13E、ＡＤ斑、ギ酸による前処理なし、6E1 0抗体；図13F、ＡＤ斑、マイクロ波による前処理、8E5抗体；図13G、トランスジェニック、マイクロ波による前処理、8E5抗体（海馬）；図13H、非トランスジェニック、マイクロ波による処理、8E5抗体（海馬）。図14は、トランスジェニック脳ＡＰＰ発現およびＡＰＰ遺伝子型に対するＣＮＳ障害の依存を示す。図15A。K670N-M671L突然変異を有するヒトβAPP695の発現を引き出すためにco sHaPrP.tetコスミドベクターを用いた。Tg2576マウスを作製するために用いた導入遺伝子は、第２エキソンに位置するハムスターPrP ORFを置換したテトラサイクリン耐性カセットを変異型ヒトβAPP ORFで置換することによって作製した。エキソンを太い黒線で示し、3'及び5'非翻訳領域を太い点線で示す。N=NotI、S＝SalI。導入遺伝子およびTg2576マウスを含むトランスジェニックマウスの作製方法は、Hsiaoら，(1995)Neuron 15:1-16に記載されている。図15B。若齢および老齢の導入遺伝子陽性マウスおよび非トランスジェニック対照マウスの脳βAPPのイムノブロット。このイムノブロット分析には、ヒトβA PPを認識するがマウスβAPPを認識しない6E10(21)、およびヒトおよびマウスβA PPの両方を認識する22C11 (Boehringer Mannheim)を用いた。レーン1〜3:非トランスジェニックマウス;レーン4〜6:73日齢マウス;レーン７〜8:430日齢マウス。 βAPPの詳しい定量方法はHsiaoら，(1995)Neuron 15:1-16に記載されている。ただし、抗体結合は¹²⁵I-プロテインＡの代わりに³⁵S-プロテインＡを用いて明らかにした。図16A。Ｙ型迷路における空間交替(spatial alternation)。導入遺伝子陽性Tg 2576マウスは10月齢では有意に損なわれた空間交替を示したが、３月齢では示さなかった。この試験を実施するのに用いた方法はHsiaoら，(1995)Neuron 15:1-1 6に記載されている。ただし、Ｙ型迷路は不透明で、また試験者が見えることによって気が散るのを排除するため、マウスはオーバーヘッドカメラから観察した。星印は統計学有意を示す（ｔ検定、ｐ＜0.05）図16B。マウス用に改変したMorris型水中迷路(Morris，(1984)J．Neurosci．M eth．11:47)を用いた空間参照の学習および記憶。導入遺伝子陽性Tg257６マウスは２月齢および６月齢では水面下のプラットフォームの位置を学習し、記憶することができる。しかし、９〜10月齢までにこの能力は有意な損傷を示す。星印は統計的有意を示す（ｔ検定、ｐ＜0.05）図16C。N2 Tg2576マウスにおいて12〜15月齢で再試験した場合の、Morris型水中迷路を用いた空間参照の学習および記憶。導入遺伝子陽性マウスは２月齢および６月齢では水面下のプラットフォームの位置を学習し記憶することができたが、これらマウスのサブセットは12〜15月齢で再試験した場合に、この能力の有意な損傷を示した。36回の空間トレーニング試行（９つの試行ブロック）および３回のプローブ試行を実施した。導入遺伝子陽性マウスは第５試行ブロック後は有意に伸びた脱出潜伏期(escape latency)を示し、また第２および第３プローブ試行において低下したプラットフォーム交差を示した。星印は統計的有意を示す（ｔ検定、ｐ＜0.05）図16D。手がかりを与えた空間参照テスト。水面下のプラットフォーム迷路において低い成績を示す９月齢の導入遺伝子陽性Tg2576マウスは、導入遺伝子陰性動物と同様に、視覚的に手がかりを与えたテストにおいて第１試行日に良い成績を挙げ、彼らの水面下のプラットフォーム迷路における低い成績は視覚損傷によるものでも運動損傷によるものでもないことを示した。試行日２〜４における一貫してより長い脱出潜伏期は、トランスジェニックマウスにおけるより広汎性の認識損傷を反映しているのかもしれない。星印は統計的有意を示す（ｔ検定、ｐ＜0.05）図17。K670N-M671L突然変異を有するヒトβAPP695を過剰発現しているTg2576 トランスジェニックマウス#A01493（368日齢）および#A01488（354日齢）における細胞外アミロイド沈積。図17A、Tg2576-A01493、大脳皮質および支脚における4G8モノクローナル抗体によって染色された多数の斑、倍率x10。図17B、Tg2576-A01493、パネルAからの差し込み図、倍率x25。図17C、Tg2576-A01488、支脚における4G8モノクローナル抗体によって染色された斑、倍率x50。図17D、Tg2576-A01488、パネルCに隣接する切片の斑は、前もってβ(14-24)を用いて吸収させた4G8モノクローナル抗体によって染色されない。図17E、Tg2576-A01488、チオフラビンＳによって染色された斑。図17F、Tg2576-A01488、Ａβのアミノ末端を特異的に認識するβ１アフィニティー精製抗血清によって染色された斑、倍率x100。図17G、Tg2576-A01488、Ａβのカルボキシル末端(1-42)を特異的に認識するβ 42アフィニティー精製抗血清によって染色された斑、倍率x100。図17H、Tg2576-A01488、Ａβのカルボキシル末端(1-40)を特異的に認識するα 40アフィニティー精製抗血清によって染色された斑、倍率x50。好ましい実施態様の説明本発明はトランスジェニック非ヒト真核細胞動物、好ましくはマウス等の齧歯類、または生まれつき学習および記憶テストを遂行することができる他の動物、ならびに該動物を作製および使用するための方法および構成物に関する。この動物は、生後短い期間内（一般的には生後１年以内、好ましくは生後２から６か月以内）に進行性神経障害を発症するようなレベルで脳組織内にアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）配列を発現する。ＡＰＰタンパク質配列は、動物または動物の先祖に胚期、好ましくは１細胞期または受精卵期で一般的には約８細胞期以前にに導入される。次に、その接合体または胚を偽妊娠した養い親の中で妊娠期間の終了まで発生させる。アミロイド前駆体タンパク質遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質の超内因性発現および脳の皮質-近縁系領域（ＡＤ等の進行性神経疾患病態にあって著しく侵される脳領域）における進行性神経疾患の発症をもたらす状態で、染色体に組み込まれるように動物の胚に導入される。侵されたトランスジェニック動物における神経膠症および臨床的な症状発現は、真の神経疾患を示す。神経疾患の進行性の側面は、探索(exploratory)および／または移動行動の減少、ならびに脳の皮質-近縁系領域における2-デオキシグルコースの摂取／利用の減少および肥大性神経膠症によって特徴づけられる。さらに、観察される変化はある種の老化動物に見られる変化に類似している。本発明は、ＡＤ等の進行性神経疾患の現存するモデルよりも有利な点をいくつか提供する。本発明のトランスジェニック動物は天然の、または突然変異体ＡＰＰを高レベルで発現し、早期死亡を伴う神経疾患を発症する。これらの動物においては、海馬および大脳皮質における神経膠症および細胞内ＡＰＰ／Ａβ付着物、等の神経病理学的変化、ならびに検索行動の減少および学習および記憶テストにおける遂行能力の損傷、等の行動上の変化を含む測定可能な変化が観察される。行動上の変化は、アルツハイマー病等の進行性神経障害の治療に使用できる作用物質のスクリーニングプロトコールにきわだった利点を提供する。なぜなら、結果を生きた動物において観察できるからである。作用物質が意図された目的に有効かどうかを決定するのに、動物を屠殺するまで待つ必要はない。本発明のトランスジェニック動物は、5'から3'の転写方向に、宿主動物中で機能する、脳組織における遺伝子発現に関連する転写および翻訳開始領域、突然変異体または野生型ＡＰＰタンパク質をコードするＤＮＡ、および転写および翻訳終結領域を含む発現カセットを用いて構築される。１以上のイントロンもまた存在できる。発現のため特に興味深いのは、選択的な、または少なくとも他の組織と較べて実質的に脳に特異的な発現を提供する、開始領域（「プロモーター」とも呼ばれる）である。「少なくとも実質的に」とは、脳組織における発現が他の組織の約10倍大きいことを意味する。脳内では、特に興味深いのは皮質-近縁系領域における発現である。転写開始領域は宿主動物にとって内因性のものでも、外来または外因性のものでもよい。外来とは、該転写開始領域が導入される野生型の宿主動物中に該転写開始領域が見いだされないという意味である。内因性とは、宿主動物にとって生来の（天然の）配列およびウイルス、プリオン等による感染性疾患の結果宿主動物中に存在する配列の両方を意味する。宿主動物の脳組織で発現される遺伝子由来のプロモーターは、宿主動物の表現型を変化させるために用いられる。転写レベルは、改変された動物中で産出できる量のＲＮＡを供給するに十分でなければならない。本発明に使用する「改変された動物」という用語は、同一種の非形質転換動物に由来する検出可能に異なる表現型を有する動物、例えば、そのゲノム中にＡＰＰコード配列を含む転写カセットを持たない動物を意味する。好ましくは、上記プロモーターは、脳組織内でＡＰＰコード配列の高レベルの発現を駆動する、および／または脳組織内にコード配列のコピーを多数供給する、強いプロモーターである。プロモーターは好ましくは、非翻訳5'配列、ｍＲＮＡのリボソームとの結合および翻訳開始に関与する「リボソーム結合部位」という転写開始調節領域および翻訳開始調節領域を含む。転写開始調節領域は、異なる細胞中に種々の量で存在するトランス作用性の因子の結合に応答して転写を活性化または抑制するシス作用性のサブドメインから構成されていてもよい。開始制御領域の全ての転写および翻訳機能性エレメントが同一の遺伝子に由来すること、または同一の遺伝子から得られる(obtainable)ことが好ましい。いくつかの実施態様においては、プロモーターはコロンハンサー等の配列の付加、または必須でないおよび／または好ましくない配列の削除によって改変することができる。「得られる」という用語は、目的ＤＮＡ配列の転写において所望の特異性を提供するに十分なだけ天然プロモーターのＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列を有するプロモーターを意図している。それは天然および合成配列、ならびに天然および合成配列の組合せである配列を含む。組織特異的転写は、遺伝子調節タンパク質がエンハンサー配列および他の上流プロモーターエレメントに結合していることを示唆する。エンハンサーエレメント（「エンハンサー」）という用語は、合成が正常なＲＮＡ開始部位から始まるとき、連結しているプロモーターからの転写を活性化することができ；両方の方向で（正常および逆向き）機能することができ；そしてプロモーターから上流または下流に移動しても機能する、調節性ＤＮＡ配列を意味する。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの両方は、それらの効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と結合する。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの機能にとって重要な正確なヌクレオチド配列を同定するため、対象の組織で発現されるタンパク質をコードしている非翻訳5'領域の断片を核タンパク質と結合する能力および異種プロモーターと共に機能する能力についてスクリーニングした。脳組織の核タンパク質との結合実験は、エンハンサーおよびサイレンサー配列の存在を確認するのに用いることができる。タンパク質結合試験は、対応する一連の遺伝子調節タンパク質に結合する特定のヌクレオチド配列を正確に突き止めるために用いることができる。各エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの活性は一般に、多数のタンパク質の結合部位を含んでいるかもしれないＤＮＡのセグメント上に存在する。これらの結合部位は、一般に、産物を容易に測定できるレポーター遺伝子に連結したエンハンサー配列のより小さい突然変異した配列を調製することによって詳細に分析することができる。次に、転写に及ぼす各突然変異の効果を試験することができる。または、この領域の断片を調製することができる。エンハンサー配列の突然変異したもの、または上記領域の断片の各々を適切な宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現効率を測定することができる。次に、この試験で得られたエンハンサー機能に必要なヌクレオチドを、ゲル移動シフト分析およびＤＮＡフットプリント法によって特定タンパク質の結合部位として同定する。プロモーターの上流領域に位置する単離された断片のレポーター遺伝子の発現を増大させる能力を調べる別の手段は、TATA CAATボックスを含むが殆どまたは全く検出可能な活性を示さない試験プロモーターからの発現レベルを増大させることができる上流領域のサブドメインを探すことである。5'領域の１断片を発現カセットの試験プロモーターの前に挿入し、レポーター遺伝子の発現に及ぼす効果を評価する。脳特異的なコピー数依存性発現にとって特に興味深いのは、脳特異的タンパク質遺伝子のｍＲＮＡ開始部位から約20kbまでの領域内の核タンパク質に結合可能な領域である。この領域内には、構築物を用いて評価することができる脳特異的エンハンサーエレメントの特徴を有するいくつかの対象のサブドメインが存在するかもしれない。ＡＰＰコード配列の発現を制御するために種々のプロモーター配列を用いることができる。これらとしては、そこからの発現を亜鉛およびグルココルチコイドホルモンレベルの調節によって制御することができるメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター（Palmiterら，Nature 300，611-615(1982));ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター(Forss-Petterら，Neuron 5;197-197(1990)) ;ヒトβアクチン遺伝子プロモーター(Rayら，Genes and Development（1991）5: 2265-2273);ヒト血小板由来増殖因子B(PDGF-B)鎖遺伝子プロモーター(Sasahara ら，Cell（1991）64:217-227);ラットナトリウムチャネル遺伝子プロモーター(M aueら，Neuron（1990）4:223-231);ヒト銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター(Ceballos-Picotら，Brain Res．（1991）552:198-214);および哺乳動物ＰＯＵドメイン調節遺伝子ファミリーメンバーのプロモーター(Xi ら，(1989)Nature 340:35-42)が含まれる。ＰＯＵドメインは、４つの哺乳動物転写因子Pit-1、Oct-1、Oct-2およびunc-86の間で類似性のある領域であって、ＤＮＡ結合ドメインの一部に相当する。これらのプロモーターは、トランスジェニック動物のニューロン内に特異的な発現をもたらす。転写開始領域として特に興味深いのは、宿主動物の脳において機能性である、プリオンタンパク質遺伝子由来の転写開始領域である。プリオンタンパク質は、ゲルストマン-シュトロイスラー(Gerstmann-Straussler)症候群の病因およびヒトにおける伝播、ならびにこれに等しい非ヒト動物疾患であるスクレイピー病に関係があるとされている。脳組織は所望の配列を調製するための核酸の供給源として役立つ。所望の特徴を有するプリオンプロモーターを同定するためには、プリオンタンパク質が単離されている、またはされる場合には、プリオンタンパク質に特異的なｍＲＮＡの同定のためにプローブが設計できるように、これを部分的に配列決定する。ｃＤＮＡにハイブリダイズする配列を単離し、操作する。そして、コード領域と結合した5'非翻訳領域を単離して、5'非翻訳領域の転写活性を同定するための発現構築物に使用する。適宜、当業者に公知のＰＣＲ法を用いて配列を増幅することができる。ある場合には、プローブを直接用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズする配列を同定する。配列は非翻訳領域を同定するために上に記載したように操作する。プリオンプロモーター配列はBaslerら，(1986)，Cell 46:417-428およびScottら，(1992) Protein Science 1:986-987に記載されている。主に用いられる終結領域は都合のよいものであればよい。なぜなら、終結領域は比較的相互交換可能に思われるからである。終結領域は転写開始領域に固有の (native)ものであってよい；または目的のＤＮＡ配列に固有のものであってよい；または別の起源に由来するものであってもよい。好都合な終結領域はプリオンタンパク質遺伝子から利用可能である。本発明で使用される発現カセットには、脳で発現される遺伝子に由来したプロモーターおよびエンハンサーの配列が含まれるが、好ましくは、これらの配列は、染色体中に取り込まれるこのような配列の数と関連するように、すなわち、染色体中に取り込まれてAPP遺伝子配列ならびに翻訳および転写終結領域に機能しうる形で結合される導入遺伝子コピーの数が増大するほどより多くの転写が起こるように、発現される遺伝子に由来するものである。脳で発現され、コピー数依存性発現を誘発するプロモーターおよびエンハンサーの配列としては、例えば、 Scott，et al.，Protein Science(1992)1:986-987に記載されているようなプリオンタンパク質プロモーターが挙げられるが、このプロモーターはプロモーターの上流の配列と併用される。なぜなら、コピー数依存性発現を行うためには、一般に、転写を調節するＤＮＡの領域を十分に大きくし、このように十分に大きな領域をとることにより位置効果の影響をそれほど受けないようにしなければならないからである。具体的には、ハムスター由来のプリオンタンパク質遺伝子に対して、プロモーターの上流の約20kb配列が利用できる。本発明で使用するためのコスミドベクターの構築例として、5'から3'の方向へアセンブルさせる要素には、プリオンタンパク質遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーの配列、目的のAPP遺伝子配列のコーディング領域、および転写および翻訳終結配列が含まれるが、これらは、マウスの卵の前核中にＤＮＡ構築物を送達して脳組織中でAPP遺伝子を発現させるためにコスミドベクターに機能しうる形で結合されている。エンハンサー配列には、プリオンタンパク質プロモーターの上流の20kb領域が含まれていてもよく、更に、プリオンタンパク質遺伝子由来の非コーディングエキソン１およびエキソン１の下流の10kbイントロンが含まれていてもよく、あるいは例えば、WO92/11276に記載されているように複数のAP Pタンパク質に対するコード配列が含まれていてもよい。当該技術分野で周知の分子遺伝子技術を用いて、プリオンタンパク質遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域を、プリオンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作出するために使用される哺乳動物ゲノムコスミドクローンから単離してもよい。APP 遺伝子のコード配列は、インフレームでコード配列が翻訳されるように、プロモーター／エンハンサー領域と終結配列との間の１ヶ所または複数ヶ所のユニーク制限部位に挿入される。上述したコスミドベクターを用いて導入されるトランスジェニック脳組織中のAPPタンパク質は、内因性レベルのAPPタンパク質の少なくとも2〜4倍であることが確認される場合もある。 ADのトランスジェニックモデルの作出に対する主な障害は、トランスジェニック動物の脳中のトランスジェニックAPPタンパク質を過剰発現することができない点にあった。ｍＲＮＡはうまく発現されるが、タンパク質はうまく発現されない場合もある。このことは、使用されるプロモーターの強さは適切であるが、タンパク質翻訳が最適でない可能性があることを示唆している。翻訳がうまくいかないのは、翻訳開始配列が弱いためと考えられる。従って、開始コドンに対して -3および+4の位置がそれぞれAおよびGである翻訳開始配列を導入することが必要であると思われる。以下の表１を参照されたい。表１導入遺伝子の翻訳開始配列の最適化導入遺伝子翻訳開始配列本発明のトランスジェニック動物を作出するために、任意のアミロイド前駆体タンパク質配列を使用することができる。本明細書中で使用する場合、APPタンパク質配列とは、複数のコピーとして動物のゲノム中に導入され、内因性レベルを超えて発現させたときに、トランスジェニック動物において進行性神経系疾患を促進するAPP遺伝子のコーディング領域の配列を意味する。神経系疾患は、神経膠症および皮質-辺縁系脳構造におけるグルコースの摂取および／または利用の低減を伴う神経性行動障害により特性付けられる。コード配列は、野生型遺伝子に由来するものであっても、１つ以上の突然変異を含む遺伝子に由来するものであってもよい。コード配列は、天然配列もしくは合成配列または天然および合成配列の組合せであってもよい。突然変異体とは、天然APPの配列と異なり、置換、欠失などが含まれるアミノ酸配列を有する任意のAPPを意味する。野生型APP とは、関連する宿主動物中に見られる天然APPを意味する。天然ヒトAPPは、染色体21上の18個のエキソンを含む単一の400kb遺伝子によりコードされる。選択的ｍＲＮＡスプライシングにより３つのAPPイソ型が得られる。２つの型、すなわちAPP751およびAPP770には、クニッツ型プロテアーゼインヒビター(KPI)領域が含まれるが、第３のAPP-695にはKPIセグメントが欠失している。好ましい配列は、疾患性の配列である。疾患性突然変異としては、例えば、オランダコンゴ好染血管障害に関連したAPPコドン693（APP770の）における突然変異(Levy，et al.，(1990)Science 248:1124)、家族性ADに関連した APP中の突然変異、コドン717(APP770の)におけるバリン-イソロイシン(Goate，e t al.，(1991) Nature 349:704-706)、コドン717にあるバリンがフェニルアラニンまたはグリシンにより置換される突然変異(Chartier-Harlin，et al.，(1991) Nature 353:844-846;Murrell，et al.，(1991)Scjence 254：97-99)、ならびにコンゴ好染血管障害およびADの両方を患った１家族内で、コドン692においてアラニンがグリシンにより置換される突然変異(Hendriks,et al.，(1992) Nature Genetjcs 1:218-221)が挙げられる。スウェーデン人の家系においで、コドン670 および671における二重突然変異の結果、正常なリシン-メチオニンジペプチドがアスパラギン-ロイシンにより置換されることが見出された(Mullan，et al.，(1 992)Nature Genetics 1:345-347)。K670N-M671Lを有するAPPは、AB 1-40分泌の増大と関連することが報告されているが(Citron et al.，(1992) Nature 360:67 2-674;Cai et al.，(1993) Science 259: 514-516)、V717I突然変異を有するAPP に対してはAB 1-42生産の増強が報告されている(Cai et al.，(1993)，supra;Su zuki et al.，(1994) Science264:1335-1340)。進行性神経系疾患を有する動物を得るために、717座で突然変異を起こしたAPP遺伝子由来のコード配列を使用することは、可能であるが使用する必要があるわけではなく、同様に、コーディング領域内にKPI領域および／またはスプライス部位を含むコード配列を使用することは、可能であるが使用する必要があるわけけではない。以下の表２には、既知のアミロイド前駆体タンパク質配列が示されているが、この中には家族性アルツハイマー病と遺伝子的に関連するものがある。表２¹ APP 導入遺伝子の例表２中で使用されている略号は次の内容を意味する： CS1 ＝図６中に示されている翻訳開始配列；CS2＝図７中に示されている翻訳開始配列；V＝バリン；I＝イソロイシン；G＝グリシン；F＝フェニルアラニン；M＝メチオニン；A＝アラニン；K＝リシン；N＝アスパラギン；L＝ロイシン；E＝グルタミン酸；Q＝グルタミン；ORF＝オープンリーディングフレーム；「突然変異」欄の数値は、APP770番号系に基づく突然変異コドンを意味する。特に興味深いのは、マウスAPPのAβ領域をヒトAβ配列で置き換えた新規のキメラAPP遺伝子である。A158,5は、APPから誘導される4kDaペプチドである。マウス細胞系統において、ヒト(Hu)、マウス(Mo)、およびキメラ(Mo/Hu)APPプロセシングを調べると、明確な差異が存在することが分かる。HuAPPは、MoまたはMo/Hu APPの組合せと比べてマウス細胞中における成熟が悪い。しかしながら、ヒトAβ 配列は、正常に生産される可溶性Aβペプチドの形成を促進する。Mo/HuAPPキメラタンパク質は、HuAPPよりも効率的に成熟し、MoAPPよりも溶解性の高いAβを生産する。受精卵細胞または胚幹細胞の供給源として使用される動物、すなわち「宿主動物」は、任意の動物であってよいが、一般的に好ましい宿主動物は、多世代研究に役立つ動物である。宿主動物の他の好ましい特徴としては、学習および記憶テストを自然の状態で実施可能なこと、ならびに観測可能な行動変化および／または病理的変化を生じるまでの時間が不足するほど若い年齢で高レベルのAPPを発現して死亡することのないことが挙げられる。特に興味深いのは、マウスなどの醤歯類、例えば、FVB系統のマウスならびに(C57B6)×(SJL.F1)ハイブリッドおよび(Swiss Webster)×(C57B16/DBA-z.F1)ハイブリッドなどの交配された市販系統のマウスである。後者の親系統はまた、C57B16/D2とも呼ばれる。本明細書中に記載の技法を利用すると、他の系統および交配系統の動物が、ADなどの進行性神経系疾患のモデルとして使用するのに適しているかを評価することもできる。しかしながら、いくつかの場合、特に治療テストの場合、アカゲザルなどの霊長類が宿主動物として望ましいこともある。トランスジェニック哺乳動物は、多数の方法で調製される。トランスジェニック生物体とは、そのゲノム中にＤＮＡの過剰な断片または外因性断片を有する生物体を指す。過剰または外因性ＤＮＡ断片を安定に遺伝させるためには、精細胞または卵母細胞のいずれかの機能的生殖細胞を形成できる細胞型中で組込みイベントが起こらなければならない。生殖細胞を形成することができ、しかもＤＮＡを容易に導入できる２つの動物細胞は、受精卵細胞および胚幹細胞である。胚幹 (ES)細胞は、in vitro培養物から「宿主」胚へ戻すことができるが、この際、発生段階の動物中に組み込んですべての組織において、生殖細胞などのトランスジェニック細胞を形成することができる。培養中にES細胞へのトランスフェクトを行い、次に、その細胞を胚の中へ注入することによって突然変異が生殖細胞系統へ伝播される。その後、突然変異生殖細胞を有する動物を育成するとトランスジェニック子孫が形成される。目的のトランスジェニック動物を作出するための好ましい方法は、接合子注入による方法である。この方法については、例えば、USPN 4,736,866に記載されている。この方法には、受精卵または接合子の中にＤＮＡを注入する工程と、続いて、その卵を偽妊娠母体中で発生させる工程とが含まれる。接合子は、同じ系統の雄および雌の動物を用いるか、または異なる系統の雄および雌の動物から得ることができる。生まれるトランスジェニック動物は創始者と呼ばれ、これを育成すると同じＤＮＡ挿入がなされたより多くの動物が生まれる。トランスジェニック動物を作出するこの方法において、新しいＤＮＡは、典型的には、非相同的組換えイベントによりゲノム中にランダムに組み込まれる。ゲノムの１つの部位において組込み可能なＤＮＡのコピーの数は、１乃至何千という大きな数である。一般的には、ＤＮＡは、前核、通常はより大きな雄の前核、の中の１つに注入される。次に、同じ日に接合子を移入するか、または一晩培養して２細胞胚を形成してから偽妊娠の雌の輸卵管中に移入する。生まれた動物をスクリーニングし、所望の組込みＤＮＡが存在するかを調べる。偽妊娠の雌とは、精管切除された雄との交尾を行った発情状態の雌を意味し、この雌には胚を収容する能力はあるが受精卵はまったく含まれない。偽妊娠の雌は、トランスジェニック動物を作出するうえで重要である。なぜなら、偽妊娠の雌は、ＤＮＡまたは胚幹細胞が注入された胚に対して代理母としての働きをするからである。いくつかの方法で推定の創始者をスクリーニングし、導入遺伝子の存在を調べる。脳APPタンパク質およびＲＮＡ発現を分析し、当該技術分野で周知の方法を用いて導入遺伝子のコピー数および／または発現のレベルを調べる。脳APPタンパク質、ＲＮＡ発現、および導入遺伝子のコピー数を、離乳期動物(4〜5週)で調べる。離乳期およびそれ以降の動物において構成的に活性であるプロモーター、例えば、プリオンタンパク質遺伝子プロモーター、を使用した場合、離乳期以降のトランスジェニックAPP ＲＮＡ発現動物のレベルが変化することは期待されない。発生および／または組織特異的プロモーターを使用した場合、APPレベルをモニタリングし、年齢に関して発現レベルを調べる。また、トランスジェニック動物の臨床的変化についても観察する。評価対象となる神経性行動障害の例としては、交配反応の衰退、興奮、新しい状況下における探索行動の低減、無気力、および早逝がある。トランスジェニック動物の表現型に影響を与えうるパラメーターとして、宿主系統、APPの一次構造、およびAPP発現のレベルが含まれること、すなわち、臨床的変化は、これらの要因の組合せの結果であるということが、本発明の原理である。特定の系統および特定のコード配列に対して、APP遺伝子の十分なコピー、および／または、観測可能な臨床的および／または行動的徴候ならびに適合脳構造の測定可能な生化学的変化を生じる特定のAPP遺伝子から誘導されたコード配列の十分な発現レベルは、経験的に決定することができる。十分なコピーとは、各構築物からの全発現レベルが、内因性天然遺伝子のレベルの少なくとも２倍、好ましくは少なくとも2〜4倍、より好ましくは５倍以上であること、または総コピー数が、こうした相対増加をすることを意味する。APPの所望の相対増加を達成するうえで、遺伝子、特に突然変異性疾患に関連した遺伝子、の2〜4個のコピーで十分な場合もあるが、それ以外の場合、特に天然遺伝子を用いた場合には、より多くのコピー数が必要となることもある。コピー数は、発現されるAP Pの種およびAPP遺伝子中における特定の疾患に関連した突然変異にもよるが、５個のコピーから60個を超えるコピーまでの範囲に入りうる。具体的には、HuAPP6 95.TRImycに対するFVB/Nマウスのコピー数の有効範囲は、約20〜75であり；HuAP P695.SWEに対しては、約30〜50であり；MoAPP.wgでは、25より大きい。進行性神経系疾患が起こる場合、特に、遺伝子のAβ領域またはAβ領域のすぐ上流でAPP の突然変異が起こる場合、より少量のAPPでも有効なこともある。従って、導入遺伝子の十分なコピーとは、進行性神経系疾患が起こるレベルでAPPの発現を引き起こす数を指す。突然変異APPまたは天然APPのいずれかを過剰発現するトランスジェニック動物の安定な系統を作出するために、創始者動物を利用することができる。伝播を容易にするために、雄の創始者マウスが好ましい。動物は臨床的に観察する。導入遺伝子コピー数（多重導入遺伝子挿入部位を除く）、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、神経病理学的所見、およびこれらの動物中でのグルコース摂取の解析も行う。これらの研究により、疾患の開始年齢、疾患の持続期間、表現型の浸透度、神経病理学的な５つの所見の範囲、局所的脳機能障害、およびタンパク質発現のレベルに対する表現型の依存性、に関する情報が得られる。表現型の様々な変化が対象となる。これらの変化としては、出産日から短期間内で発現される脳の皮質-辺縁系領域における進行性神経系疾患；内因性発現レベルを超えるAPP遺伝子の発現レベルおよび早逝に伴う神経系疾患の進行；神経膠症ならびに海馬および大脳皮質に存在する細胞内APP/Aβ沈積物；探索／歩行行動の低減、記憶および学習テストに関する成績低下、ならびに脳の皮質-辺縁系領域における2-デオキシグルコースの摂取／利用および肥大性神経膠症により特性付けられる進行性神経系疾患、が挙げられる。また、種適応神経性行動テストを用いて動物をスクリーニングする。例えば、マウスにおける歩行／探索行動の研究は、神経心理学的な評価を行う標準的な手段である(File and Wardill，(1975)Psycopharmacologia(Berl)44:53-59;Loggi et al.，(1991) Pharmacol．Biochem．Behav．38:817-822)。例えば、マウスに対しては「コーナーインデックス」(CI)が使用される。これは、脳の病理学的所見に関して動物をスクリーニングするための迅速かつ簡便な神経性行動テストである。突然変異APPおよび野生型APPを発現するトランスジェニックマウスのCIも測定する。小さいCI(≦4)は、大きい突然変異APP導入遺伝子コピー数、早逝、および神経病理学的所見に対応する。CIは、導入遺伝子コピー数に対して用量依存的関係を呈するが、このことは、トランスジェニックマウス中の神経性行動の徴候の評価にCIを使用することの妥当性を支持する。動物の神経病理学的所見も評価する。ラットに対しては、Morrisの水迷路検査(Morris,(1984)J．Neu rosci．Meth．11:47に記載されている)が利用される。マウスに関しては、このテストの変形型が利用できる。対象の症候群により冒されることが知られいている脳の領域は、変化がないかを特によく調べる。対象の疾患がアルツハイマー病である場合の検査領域としては、APP/aβ排出、神経膠、グルコースの摂取および量の変化、ならびにAβ斑形成が関与する皮質-辺縁系領域が挙げられる。しかしながら、長命でない動物の系統では、天然の状態または高レベルのAPPを発現する場合、特定の疾患に関連したすべての行動的および／または病理学的変化が観測されないこともある。例えば、高レベルのAPPを発現するトランスジェニックFVB/Nマウスは、検出可能な Aβ斑を形成しない傾向を示すが、同じ導入遺伝子を発現する長命のC57B6/SJL F 1 マウスは、チオフラビンSおよびコンゴーレッドを用いて容易に検出されるアミロイド斑を形成する。また、導入遺伝子産物を検出するために、種々の脳領域の免疫学的研究を利用する。本発明の動物は、対象の物質、例えば、ADの進行に対する保護を行うと考えられるビタミンEまたはラザロイドなどの酸化防止剤に対する検定動物として利用することができる。対象となる物質で動物を処理し、未処理動物と比較して、神経系疾患の発生率の低下または発症の遅延を、保護の指標として検出する。使用される指標は、好ましくは、学習および記憶テストに関する成績変化などのように生きている動物で検出できるものである。動物が死亡するかまたは犠牲にするときに、病理学的変化に及ぼす影響から有効性を確認できる。これらの動物は更に、アルツハイマー病を改善または治療すると考えられる対象の物質に対する検定動物としても利用できる。神経系疾患を有する動物を対象の物質で処理し、未処理の動物と比較して、死亡の遅延、あるいは神経性行動、神経膠、もしくはグルコースの摂取／利用の改善を、軽減または治療の指標として検出する。本発明の動物は、アルツハイマー病を促進または誘発すると推測される酸化剤または頭部損傷などの物質または状況をテストするために利用できるが、その際、動物を物質または状況に暴露し、神経性行動衰退、早逝、神経膠、およびグルコースの摂取／利用の低減を、テスト物質または状況がアルツハイマー病を誘発する能力の指標として測定する。この方法では更に、アルツハイマー病を誘発すると推定される物質または状況に動物を暴露し、治療薬の効果を評価することができる。トランスジェニック動物の特性づけを注意深く行えば、ADなどの進行性神経系症候群の病因の推定ができるはずである。疾患に至る突然変異APP代謝における分子的イベントの順序を研究することができる。これらの動物はまた、以下に示されている種々の提案された病理発生機構を研究するためにも有用である：疾患の水平伝播(Prusiner，et al.，(1987)Cell 63，673-86)、酸化およびフリーラジカル生成(Blass and Gibson，(1991)Rev．Neurol (Paris)147:513-525; Ames et al.，(1993) Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．90:7915-7922）、炎症(McGee r et al.，(1993) Can．J．Neurol．Sci．18:376-379，Rogers etal.，(1992)Pr oc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．89:10016-10020)、向神経性因子誘導(Perry，(1 990) Alzheimer's Disease and Associated Disorders 4:1-13; Hefti and Schn eider，(1991)Clinical Neuropharmacology 1:62-76);Koliatsoess el al.，(19 91) Ann．Neurol．30:831-840)、アポリポタンパク質E4代謝(Strittmatter et a l.，(1993)Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．90:1977-1981)、およびカリウムチャネル機能障害(Etcheberrigaray，et al.，(1993)Proc．Nat'l．Acad．Sci．U. S.A．90:8209-8213)。このような知識があれば、神経系疾患に対するより良好な治療形態に到達するであろう。本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施態様の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。以下の実施例は、例示のために提供されたものであり、制限するためのものではない。実施例実施例１ PrP-HuAPP 導入遺伝子の構築ヒトｃＤＮＡからヒトAPPコード配列を誘導したが(Kang et al．(1987)Nature 325:733;Goldgabar et al.，(1987);Science 235:877;Tanzi，et al.,(1987)Sc ience 235:880;およびRobakis et al．(1987)Proc．Nat．Acad.Sci．U.S.A．84: 4190を参照されたい)、これは表１に示されている。Kitaguchiet al．(1988)Nat ure 331:530;Tanzi et al．(1988)Nature 331:528;およびPonte et al．(1988) Nature 331:525に示されているように、染色体21に位置する遺伝子から誘導される３つのスプライス型で存在する。図２は、本発明のトランスジェニック動物を作出するためにアミロイド前駆体タンパク質配列中に組込み可能な次の３つの構造体を示している：(1)OX領域をもつかまたはもたないクニッツ型プロテアーゼインヒビターの存在下または不存在下で得られるスプライス型変種、(2)Goate（ 1991）Nature 349:704;Chartier-Harlin et al.（1991）Nature 353:844;Murell et al．(1991)Science 254:97;Hendrikset al．(1992) Nature Genetics 1:218 ;およびMullan et al．(1992) NatureGenetics 1:345に記載されているようなアルツハイマー病を患った家族、ならびにLevy et al．(1990)Science 248:1124に記載されているようなコンゴ好染血管障害を患った家族において、疾患と関連付けられた突然変異を含むアミロイド前駆体タンパク質変種、(3)導入遺伝子産物の免疫検出を容易にするために使用できるカルボキシル末端のmyc-タグ、ただし、これは存在しない方が好ましい。必要とされるハムスタープリオンタンパク質遺伝子の機能は、Scott et al.(1 992) Protein Science 1:986に記載されているように、SalI部位で挟まれたテトラサイクリン耐性配列によりプリオンタンパク質コード配列が置換されたハムスタープリオンタンパク質コスミドベクターにより提供した。ハムスタープリオンタンパク質コスミドベクターは、図３に示されている。プリオンタンパク質遺伝子の3'-非翻訳領域にあるＤＮＡの1.6kb領域は、このコスミドから作製された導入遺伝子を検出するための有用なプローブとして記されている。 APP配列およびコスミドを使用して、図４および５に示されている２つの融合遺伝子構築物を構築した。翻訳開始を強化するようにAPP配列に改変を加えたが、これらは略号CS1およびCS2で示される。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および２セットのプライマーを用いて作製されるＤＮＡ配列をAPPコード配列の5'末端のS alI−KPNI ＤＮＡ配列で置換することにより、構築物を作製した。図６に示されているCS1 APP配列に対して使用したプライマーは、5'-AAGTCGACACCATGCTGCCCGG TTTGGCACT-3'および5'-AAGGTACCTCCCAGCGCCCGAGCC-3'であった。図７に示されているCS2 APP配列に対して使用したプライマーは、5'-AAAAAAGTCGACACCATGGTGCCC GGTTTGGCACT-3'および5'-AAGGTACCTCCAGCGCCCGAGCC-3'であった。手順は、Maniatis et al．(1982) Molecular Cloning:A Laboratory Manual(C old Spring Harbor Laboratory)に記載されている従来法およびSaiki et al．(1 988) Science 239:487に記載されているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であった。図1〜7に示されている制限部位は、SalI(S)、KpnI(K)、BglII(B)、XhoI(X)、およびNotI(N)である。動物中の融合構築物を検出するために使用したPCRオリゴマーの位置は、図８にAおよびPで示されている。構築物用に合成した各PCR断片の配列を決定した。構築物に使用するために選ばれたPCR断片には、目的外の突然変異は含まれていなかった。図3〜5に示されているpcos6EMBLベクターからPrP-APP融合遺伝子を放出するNo tIを用いて、上記のPrP-APPコスミドを消化した。アガロースゲル上でのサイズ分画の後、PrP-APP融合遺伝子の単離および電気溶離をおこなった。更に、フェノール-クロロホルム、クロロホルム、およびブタノールを用いた一連の有機抽出によりPrP-APP融合遺伝子を精製し、酢酸アンモニウムおよびエタノール中で沈殿させた。胚注入の前に、PrP-APP融合遺伝子を10mM Tris-Cl（pH8.0)中に溶解して最終濃度を3〜4μｇ/mlにした。実施例２ PrP-HuAPP 導入遺伝子を含有したトランスジェニックマウスの作出 (APP 配列VVM717/721/722IAV) 各PrP-APP融合遺伝子を別々に受精１細胞マウス卵中に注入した(Hogan et al ．(1986) Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，Cold spring Harbor Press，N.Y.;またUSPN 4,736,866も参照されたい)。胚ドナーおよび稔性種畜は、National Cancer Institute (NCI)から入手した近交系FVBマウスであった。これを使用し、PrP-APP融合遺伝子の1〜128個のコピーをマウスのゲノム中に組込んで最後まで発生させた。注入された卵は、Wagner et al．（1981 ）Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．78:5016に記載されているように、偽妊娠の飼育された雌に移入した。暗所10時間：明所14時間のサイクルが保たれた環境調節施設にマウスを入れた。飼育されたマウスの卵を最後まで発生させた。実施例３ VVM717/721/722IAV トランスジェニックマウスの分析４週齢で、尾部から採取したＤＮＡを用いたＰＣＲ反応にてそれぞれの子の骨を分析した。各場合において、尾部ＤＮＡを図８に示したプローブを用いるＰＣＲ反応用の鋳型として使用した。分析用のＤＮＡは、HanleyおよびMerlie(1991) Biotechniques 10:56に記載された方法によって尾部から抽出した。１μｌの尾部ＤＮＡ調製物（ＤＮＡ約１μｇ）を用いて、図８に示したように、プライマーＡおよびＰを含む25Z1 ＰＣＲ反応において導入遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ反応により、15匹の創始マウスが注入されたPrP-APP融合遺伝子を保持していることが示された。これらの動物のAPP配列には、VVM717/721/722IAV 突然変異およびmyc-tagが含まれていたが、図２に示したKPI/OX領域は欠けていた。導入遺伝子のコピー数を測定するために、指数関数的希釈系の変性ＤＮＡを、図３に説明されているハムスターPrP遺伝子の3'−非翻訳領域由来の1.6キロベース（KB）のＤＮＡの放射能標識部分を用いて調べた。導入遺伝子コピー数が非常に多い（約100以上）創始マウスの中で、２匹の創始マウスは繁殖できず、第３の創始マウスは子孫を創始したが、その後繁殖できなかった。したがって、15 匹の創始マウスによって12系統のトランスジェニック子孫が得られた。APP導入遺伝子を有するトランスジェニック創始動物のカタログを表３に示す。創始動物を非注入動物と交配し、得られた12系統のトランスジェニック子孫のＤＮＡを分析した。この分析により、全ての場合において注入遺伝子が生殖系列を通じて伝達されているということが示された。表３ APP 導入遺伝子を有するトランスジェニック創始動のカタログ６匹の創始動物がPrP-APP融合遺伝子のコピーを＞20個有していた。６匹全てにおいて５月齢までに探査／移動行動が前進的に低減し、そして早期死亡するということよって特徴づけられる神経疾患が発生していた。それとは対照的に、＜ 20個のPrP-APP融合遺伝子のコピーを有する９匹の創始動物においてはどれも最初の５月齢では神経疾患は発生していなかった。神経機能障害は常染色体優性様式で次の世代に伝達された。新たに獲得されたPrP-APP融合遺伝子の組織内での発現を、ウェスタンブロット分析によって、ヒトＡβペプチドの最初の17残基に対して生じさせたモノクローナル抗体6E10を用いて測定した（Kimら，(1990)Neuroscience Research Commu nicating 7:113-122）。融合遺伝子産物は、脳、脊髄、骨格筋、心臓および極微量であるが肺において検出された。融合遺伝子産物は、肝臓、脾臓、腎臓、または精巣においては検出されなかった。 PrP-APP融合遺伝子の脳組織内での発現を、免疫ブロット分析によって定量した。脳組織内での相対的なAPP発現を、指数関数的希釈系列でトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスにおいて比較し、APPのカルボキシル末端の15残基であるCT15を認識する抗体（これはマウスおよびヒトAPPの両方を認識する）と反応させた（Sisodiaら，(1993)J．Neurosciences 13:3136-3142）。神経疾患が発生したマウスの系統における全APPタンパク質は、内因性レベルの少なくとも300％であった。発現が300％未満の場合、動物には神経疾患が発生しなかった。影響を受けた(affected)トランスジェニックマウスの脳機能の指数を得るために、グルコース利用を、Chmielowskaら，(1986)Exp．Brain Res．63:607に記載されたSokoloff法（この方法によってマウスにおけるグルコース摂取／代謝が測定できる）の改良法を用いて局所的に測定した。デンシトメーターによって測定された局所2-デオキシグルコース濃度は、病状が全くない領域である小脳に対して標準化した。トランスジェニックマウスにおける結果から、同年齢の非トランスジェニック同腹子と比べて、海馬、扁桃体、および大脳皮質のいくつかの領域内でグルコース利用が20〜30％有意に減少していることがわかった。実施例４ in vitro での合成およびプロセシングの分析培養細胞におけるVVM7l7/721/722IAV突然変異体の合成およびプロセシングを調べることにより、病気の発生におけるこれらの突然変異体の影響を確認した。野生型HuAPP695mycおよび突然変異ｃＤＮＡ遺伝子を発現ベクターpEF-BOS（Osak a Bioscience Institute、大阪、日本）にクローニングし、次いで、マウス神経芽細胞腫細胞に一過性トランスフェクトし、続いて［³⁵Ｓ］メチオニンで４時間連続的に標識した。標識されたAPP分子をモノクローナル抗体22C11を用いて免疫沈降させた（Weidemann，(1989)Cells 57:115-126）。細胞の抽出物中においては、割り当でられた大きさの標識APP分子が同様のレベルで検出された。これらの培養物由来の培地を、mAb 6E10およびmAb 4G8を用いて可溶性APP断片の存在について調べた（Kimら，(1990)上述のとおり）。これらの抗体は両方ともヒトAPP のＡβ領域を認識する。mAb 6E10はＡβ１−17間のＡσにおける配列を認識し、一方、mAb 4G8はＡβ1〜28間の配列を認識するＡβ17〜28の配列は、マウスＡβ と同一であり、したがって4G8はヒトおよびマウスAPPを区別することができない。いずれかの遺伝子でトランスフェクトされた培養物の培地には、定常的に観察されるAPPの大型のエクトドメイン断片が含まれていた。 APPのプロセシングに関するより最近の発見の一つは、HuAPPを発現する培養細胞の培地における可溶性Ａβ１〜40断片の検出である。これらのＡβ断片はADアミロイドプラーク病巣で観察されるペプチドに似ている。したがって、APPはアミロイド生成断片(amyloidgenic fragments)に正常にプロセシングされているように見える。さらに、ADに関連した突然変異は、APPのプロセシングを変更するので可溶性Ａβの産生に都合がよいことがわかった。VVM717/721/722IAV突然変異がAPPのプロセシングに影響を及ぼすかどうかを確認するために、培養培地を、小型のＡβ含有APPペプチドについて調べた。mAb 6E10によって免疫精製された(immnopurified)Ａσペプチド断片が、突然変異配列でトランスフェクトされた細胞の培地中で優勢であった。同様に、mAb 4G8によって、突然変異体を含む培養物の培地中において高レベルのＡβペプチドが検出された。蓄積されたAPP断片について細胞抽出物を調べることにより、突然変異体を発現する細胞において、抗mycポリクローナル抗血清による免疫沈降後、高レベルの10kDaのAPPペプチド断片が検出された（図５Ｃ、３列）。突然変異体HuAPP695 mycにおいて生じた突然変異は、得られるAPP産物のプロセシングに影響を及ぼして高レベルの可溶性Ａβ、およびＡβ領域を含むのに十分な長さのAPPの細胞内Ｃ−末端断片を作製する。したがって、突然変異体APPを用いて創出した動物の表現型は、スウェーデン家系のADに見られる突然変異をコードする突然変異ヒト APP遺伝子を発現するヒトについて報告されているものとかなり似ている。現在までのところ、V642I AD-関連突然変異のみをコードするHuAPPの発現の結果、Ａ βが多量に産生されたということを報告した研究者はいない（Goldeら，(1993), Neuroscience Abstract 19:431，182.7）。しかしながら、この突然変異は、可溶性Ａβ誘導体の長さを変化させて、それをＡβ１〜42に対して増大させているように見える。したがって、VVM/717/721/722IAV突然変異は可溶性Ａβを多量に産生させる主な原因であると考えられる。Ａβ原繊維発生の研究は、より長いＡ βペプチドはアミロイド発生性がより高いということを示唆するものである。実施例５マウス細胞におけるヒトおよびマウスAPPのプロセシングの比較マウスAPP695およびヒトＡβ配列から構成されるキメラAPP導入遺伝子を調製し、それらのプロセシングを評価した。マウスおよびヒトAPPがマウス内でプロセシングされる方法には違いがあるというのが本発明の仮説である。ヒト化MoAP P ｃＤＮＡを構築するために、MoAPP遺伝子をクローニングし、それをcosSHaPrP .535ベクターに適合させるために突然変異させた。マウスｃＤＮＡを逆転写酵素 −ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）によって単離した。ＰＣＲプライマーにはクローニング目的のために5'および3'末端にXhoI部位が含まれていた。マウスｃＤＮＡの内部XhoI部位を除去するために、内部XhoI部位（コドン397）をつなぐ追加のプライマーが含まれており、この追加のプライマーにはXhoI部位を除去するが、正確なアミノ酸配列を保存する１塩基置換が含まれていた。その後、ＰＣＲ産物を配列決定して、所望していない突然変異がＰＣＲにおいて創出されなかったことを確かめた。 HuAPPとMoAPPのＡβ領域は、３個のアミノ酸残基が異なっており、導入遺伝子産物のアミロイド発生能に影響を及ぼし得る。マウスＡβ領域をヒト化するために、Ａβ領域を含むHuAPP遺伝子のセグメントを、ＰＣＲによって、HuAPP695のコドン590にBglII部位を含むセンスプラマーおよびコドン626にNarI部位（対応するNarI部位はMoAPP ｃＤＮＡに見られる）を創出する２点突然変異を含むアンチセンスプライマー（アミノ酸配列は維持されている）を含有するプライマー（表４、プライマー１および２）を用いて増幅した。このＰＣＲ産物をBglIIおよびNarIで消化し、次いでMoAPP ｃＤＮＡのBglIIおよびNarI部位にクローニングした。キメラ（Mo／HuAPP）ｃＤＮＡを、BglIIおよびNarI部位全域にわたって配列決定することにより、この領域がヒトＡβ配列を含んでいるということを確認し、その他の所望していない突然変異は生じなかったということを確認した。この組換えｃＤＮＡが発現して全長タンパク質が生じることを確認するために、ＤＮＡを修飾pEFBOSベクターにクローニングした。pEFBOSベクターには、プロモーターエレメント、第１のエキソン、第１のイントロン、ならびにSV40複製起点を有する哺乳類延長因子２の第２のエキソンの一部が含まれており、ベクターの複製が可能であり、COS-1細胞中における遺伝子の高発現が可能である。COS-1細胞をpE F-BOSMo/HuAPP695でトランスフェクトし、細胞抽出物を免疫ブロッティングによって分析した。CT15は全長Mo/HuAPPポリペプチドを認識したのに対して、モノクローナル抗体6E10による免疫染色により、ヒト化マウスｃＤＮＡ産物が実際にヒトＡβ配列をコードするということが確認された。初期発生(early-onset)ADに関連した二重突然変異をコードするキメラMo/HuAP P ｃＤＮＡを作製するために、プライマー２および３（表４）を用いる上記に概説したアプローチと同様のＰＣＲに基づくアプローチを使用した。反応用の鋳型は、Mo/HuAPP695のクローニングされたコピーであった。突然変異させたキメラ遺伝子をBglIIおよびNarI部位全域にわたって配列決定することにより、突然変異の存在を確認し、所望していない突然変異が導入遺伝子中に存在しないことを確認した。突然変異Mo/HuAPP ｃＤＮＡをpEFBOSにクローニングし、COS-1細胞にトランスフェクトすることによってAPPポリペプチドが合成されているかどうかを確認した。予想した大きさのAPPポリペプチドがCT15および6E10抗体の両方と反応した。マウスN2a細胞においてMo-、Hu-、およびMo/HuAPPの合成およびプロセシングを調べることにより、驚くべきことに識別できる相違がわかった。明らかなことは、MoAPPはHuAPPよりも高い割合で切断されて可溶性エクトドメイン断片が生じるということである。細胞関連と可溶性MoAPPの比は、約１：５であり、一方、H uAPPの場合、細胞関連が可溶性のものの３倍以上である。切断されて可溶性エクト断片を生じるMo/HuAPP695の割合は、細胞関連と可溶性のMo/HuAPPの比が１：１に近いので、Mo-とHuAPPの間にあると考えられる。可溶性APPエクト断片の大部分が、細胞表面にあるAD内の切断事象によって生じると考えられ；細胞関連AP Pと可溶性エクト断片の比の相違は、ポリペプチドの成熟における相違を示すものである。すなわち、MoAPPの大部分は細胞表面に到達し、セクレターゼ(secret ase)によって切断される。それとは対照的に、HuAPPは効率的に細胞表面に到達することができず、したがってセクレターゼ切断が排除される。Mo/HuAPPポリペプチドは、MoとHuAPPの中間体であると考えられる。一方、Ａβドメイン内の配列は、セクレターゼ切断の効率に影響を及ぼすことが可能である。可溶性APPエクト断片の産生における相違に加えて、可溶性Ａβペプチドのレベルの相違が示された。３つのタンパク質全てからＡβ１〜40としての同定と一致する大きさおよび性質を有する可溶性Ａβペプチドが生じた。MoAPPでトランスフェクトされた細胞においては、Ａβ17〜40としての同定と一致する大きさおよび性質の断片が検出された。Ａβ17−40断片は、推定セクレターゼ（これはＡ β16と17の間を切断する）によるAPPの膜切断後に生じると考えられる。Hu-およびMoHuAPP誘導Ａβ１〜40ペプチドのみが予測どおりmAb6E10によって認識された。MoAPPは、Ａβ１〜40とＡβ17〜40を比較的等しい量で生じさせるようであるが、HuAPPとMo/HuAPPは、Ａβ１〜40のみを生じるように優先的に切断された。これらの結果は、ヒトＡβドメイン内の配列の相違がAPPタンパク質分解的切断に影響を及ぼすということを示唆するものである。表４組換えAPP遺伝子の構築に使用されるプライマー実施例６正常な老齢マウスおよびトランスジェニックマウスの比較導入遺伝子構築 PrP-APP導入遺伝子を、実施例１に記載されたようにして、ハムスタ−PrPコスミドベクター（Scottら，(1992)，上述のとおり）内のSalI-隣接テトラサイクリン耐性配列をSalI-隣接ヒトおよびマウスAPPコード配列で置換することによって作製した。トランスジェニックマウスを、６個の異なるPrP/APPキメラ導入遺伝子：マウス野生型APP695（MoAPP695.WT）；K670NおよびM671L（APP770の番号付け）における２個の突然変異を含むヒトAPP695（HuAPP695.SWE）；K670NおよびM 671L（APP770の番号付け）における２個の突然変異を含むヒトAPP695（HuAPP695 .SWE）；E693Qにおける突然変異を含むヒトAPP695（HuAPP695.DUT）；K670およびM671Lを有するヒトAPP770（HuAPP770.SWE）；V717I、V721IAおよびM722Vにおける三重突然変異を有し、3'-myc tagを有するヒトAPP695（HuAPP695.TRImyc）；ならびに3'-myc tagを有するヒト野生型APP695（HuAPP695.WTmyc）の一つを用いて調製した。SC1HuAPP695.SWE、CS1HuAPP770.SWE、CS1HuAPP695.TRImycおよび CS2HuAPP695.TRImyc APP配列を、翻訳開始を強めるために修飾した。スウェーデン人の突然変異のように、APPの膜貫通ドメインにおける三重V717I 、V721AおよびM722V突然変異は、培養細胞におけるＡβの分泌を５倍に高める。 c-mycがん原遺伝子の12コドンセグメントである、3'-myc tagは、培養細胞内で、トランスフェクション産物の免疫検出を促進するということがわかった（Wong およびCleveland，(1990)The Journal of Cell Biology 111，1987-2003）。Tg( HuAPP695.WTmyc)およびTg(HuAPP695.TRImyc)マウスにおいては、myc-tagは、ウエスタンブロットおよび組織学的試料においてヒト特異的APP抗体と反応させたH uAPPほど明確に検出することができなかった。myc-tagが欠けているTg(HuAPP695 .SWE)、Tg(HuAPP770.SWE)およびTg(HuAPP695.DUT)マウスにおいては同一の臨床的および病理学的異常が発生したので、myc-tagは表現型に明白な影響を与えるものではなかった。構築は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および２組のプライマーを用いて製造したＤＮＡ配列についてのAPPコード配列の5'末端においてS alIをKpnIＤＮＡ配列に置換することによって行われた。CS1 APP配列に対しては、使用したプライマー組は、5'-AAGTCGACACCATGCTGCCCGGTTTGGCACT-3'および5'- AAGGTACCTCCCAGCGCCCGAGCC-3'であった。CS2 APP配列に対しては、使用したプライマー組は、5'-AAAAAAGRCGACACCATGGTGCCCGGTTTGGCACT-3'および5'-AAGGTACCTC CAGCGCCCGAGCC-3'であった。HuAPP突然変異は、部位特異的突然変異誘発についての標準方法を用いて行われた。構築のために合成された各ＰＣＲ断片を配列決定した。構築に使用するために選択されたＰＣＲ断片には意図しない突然変異はなかった。PrP-APPコスミドをNotI（これはpcos6EMBLベクターからPrP-APP融合遺伝子を放出させる）で消化した。PrP-APP融合遺伝子を、アガロースゲル上でのサイズ分画後に単離し、電気溶出した。さらに、PrP-APP融合遺伝子を有機溶媒で精製し、酢酸アンモニウムおよびエタノール中で沈殿させた。胚注入前に、 PrP-APP融合遺伝子を1OmMのトリス−CI（pH8.0）に、最終濃度３〜４μg/mlで溶解した。1503:5'-CTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGT-3'および1502:5'-GTGGATAACCCCTC CCCCAGCCTAGACCA-3'が、それぞれ、APPの3'領域とPrPの3'-非翻訳領域に位置していた。1503プライマーはマウスおよびヒトAPPに相同の領域を認識するので、かかるプライマーを用いることによりPrP-MoAPPとPrP-HuAPPの両方のＤＮＡを検出することができる。プライマー1502および1501:5'-AAGCGGCCAAAGCCTGGAGGGTGG AACA-3'を用いることにより、マウスPrPの断片を増幅する平行ＰＣＲ反応を陽性対照として行った。ニトロセルロース上に焼き付けられ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および実施例１に記載された２組のプライマーを用いることにより製造されたＤＮＡ配列についてのAPPコード配列の5'末端のＤＮＡ配列に位置するハムスターPrP3'- 非翻訳領域のセグメントをコードする、放射能標識された1.3kbのSalI-XhoI ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせた５μｇの変性精製尾部ＤＮＡを用いることによって、導入遺伝子コピー数分析を行った。HuAPP突然変異を部位特異的突然変異誘発についての標準方法を用いて行った。構築のために合成された各ＰＣＲ断片を配列決定した。構築に使用するために選択されたＰＣＲ断片には意図しない突然変異はなかった。PrP-APPコスミドをNotIで消化し、PrP-APP融合遺伝子をアガロースゲル上でのサイズ分画後に単離し、電気溶出し、さらに実施例１に記載したようにして精製する。胚注入前に、PrP-APP融合遺伝子を10mMのトリス−Cl（p H8.0）に、最終濃度３〜４μg/mlで溶解した。トランスジェニックマウス作製およびスクリーニング記載されたとおりに単細胞マウス胚の微量注入によってトランスジェニック系を開始させた（Hoganら，(1986)上述のとおり）。胚ドナーおよび繁殖力のある種畜(fertile studs)は、国立がん研究所（ＮＣＩ）から入手した同系繁殖ＦＭＢマウスであった。離乳後の尾部生検ＤＮＡを記載されたとおりに作製した（Ha nleyおよびMerlie，(1991)Biotechniques 10，56）。１マイクロリットルの未精製ＤＮＡを25μｌのＰＣＲ反応に使用した。PrP-APP融合ＤＮＡを検出するために、それぞれAPPの3'領域およびPrPの3'-非翻訳領域に位置する１組のオリゴマープライマー、1503:5'-CTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGT-3'および1502:5'-GTGGATAA CCCCTCCCCCAGCCTAGACCA-3'によるポリメラーゼ連鎖反応を用いてPrP-APP融合ＤＮＡを増幅した。1503プライマーはマウスおよびヒトAPPに相同の領域を認識するので、かかるプライマーを用いることによりPrP-MoAPPとPrP-HuAPPの両方のＤＮＡを検出することができる。プライマー1502および1501:5'-AAGCGGCCAAAGCCTG GAGGGTGGAACA-3'を用いることにより、マウスPrPの断片を増幅する平行ＰＣＲ反応を陽性対照として行った。ニトロセルロース上に焼き付けられ、ハムスターPrPコスミドベクター内に位置したハムスターPrP 3'-非翻訳領域のセグメントをコードする、放射能標識された1.3kbのSalI-XhoI ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせた５μｇの変性精製尾部ＤＮＡを用いることによって、導入遺伝子コピー数分析を行った（Scottら，( 1992)上述のとおり）。高ストリンジェンシー(high-stringency)洗浄を２回行って、放射線感受性フィルムに曝した後、トランスジェニックマウスおよびハムスターのゲノムＤＮＡ由来のシグナルの相対強度をホスホルイメージャー(phospho rimager)を用いて比較することにより、二倍体ハムスターゲノムＤＮＡに対する導入遺伝子コピー数が得られた。導入遺伝子発現の分析 APP導入遺伝子産物発現を、１〜４月齢で犠牲にしたトランスジェニック創始動物の子孫において調べた。脳ホモジネート由来の抽出物の定量的免疫ブロッティングを同年齢の非トランスジェニック同腹子から調製された抽出物と平行して行った。脳組織の20％(w/v)ホモジネートを、手で支えたポリトロン(hand-heldp olytron)を用いてＴＮＥ（50 mMトリス-Cl pH8.0、150mM NaCl、２％ＰＭＳＦを含む５mM ＥＤＴＡ）緩衝液中で調製した。ホモジネートを等容量のＴＮＥ１％Ｎ４０、１％デオキシコール酸塩、0.4％ＳＤＳで希釈し、粘性がなくなるまで浴超音波処理機で超音波処理した。次いで、ホモジネートを10分間煮沸し、10,0 00×ｇで10分間遠心分離した。上清を等容量の２×試料緩衝液（Laemmli，(1970)Nature 227，680-685）と混合し、２分間煮沸し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分画した。タンパク質を電気泳動によりImmobilon膜（Pierce）に移して、ポリクローナル（CT15および抗G ID）およびモノクローナル（22C11および6E10）APP抗体とともにインキュベートした。マウスIgGに対する第２のウサギ抗体とともにインキュベートし、続いて¹ ²⁵ Ｉ−タンパク質とともにインキュベートした後、反応性ウサギポリクローナル抗体が視覚化された。放射能強度をホスホルイメージャー（Molecular Dynamics 社）で定量化した。脳組織におけるAPP発現を、異なる導入遺伝子コピー数を有するトランスジェニックマウスにおいて、MoAPPおよびHuAPPの両方を認識する３つの抗体、CT15（図１１）、抗GID（図１１）および22C11（図１１）を有するトランスジェニック系における免疫ブロットの定量化によって測定した。CT15 （Sisodiaら，(1993)J．Neurosciences 13:3136-3142; Borcheltら，J．Biol.Ch em269:14711-14714）；抗GID(Coleら，(1989)Brain Res．Reviews 13:325-349）；および22C11（Weidemannら，(1989)Cell 57:115-126）は、マウスおよびヒトA PPの両方を同程度に認識するが、22C11は、APPに密接に関連したAPLP2にも同じアビディティで結合する（Sluntら，(1994)J．Biol．Chem 269:2637-2644）。種々の抗体を用いることにより得られるMoAPP発現に比べてHuAPPレベルの変動が少ないどいうことは、抗体結合のアビディティにおける相違、又は野生型と変異型 HuAPPとの間の翻訳後プロセシングにおける区別を反映するものであり得る。トランスジェニック脳APPタンパク質発現は、コピー数ならびに発現したAPPの種類に依存していた（図１２）。HuAPPに対し、同等レベルのMoAPPはより少ない導入遺伝子コピー数で得られた。特にHuAPPのレベルを測定するために、ヒトＡβの残基１〜17に対して生じさせた6E10抗体を用いて脳ホモジネートを調べた（Kimら，(1990)Neuroscience Re s．Comm．7:113-122）。非トランスジェニックマウスにおいては、約100〜125kD のAPP分子に対する反応性は検出されなかった（図１１）。Tg1130Hマウスにおいては、6E10抗体を用いる免疫ブロットにおいて検出されるHuAPPのレベルが非常に高いのは脳および脊髄であり、横紋筋、心臓、皮膚および肺においてはかなり少量（脳レベルの＜５％）であった。HuAPPは、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣および小腸においてはほとんど検出されないか、存在しなかった。 6E10または8E5抗体（Athena Neurosciences）を用いるヒトAPP／Ａβの特異的免疫染色により、脳全体にHuAPPが存在することがわかった。8E5は、残基444〜5 92（APP695の番号付け）に及ぶAPPのセグメントを認識する。２つの異なる方法を用いて、HuAPPを過剰発現するトランスジェニック系由来の脳組織においてAPP 免疫反応性を増大させた。コピー数の多い系においては、6E10抗体の１：5000希釈を用いる組織のギ酸前処理または１：100 6E10もしくは１：100 8E5抗体を用いる組織のマイクロ波前処理のいずれかを行った後、APP染色が海馬、海馬傍領域(parahippocampal area)、扁桃体および大脳皮質の大型錐体細胞における胞状構造(vesicular structures)内に常に存在していた（図１３Ａ、Ｃ、Ｈ）。いくつかの脳においては、脳の皮質辺縁領域の小型神経細胞、ならびに基底核、脳幹、および小脳の大型および小型神経細胞においてもわずかな免疫反応性が視覚化された。非トランスジェニックマウス（図１３Ｂ、Ｈ）および影響を受けたトランスジェニックマウス由来の非処理脳組織においては染色はなかった。得られた HuPPA免疫染色のパターンは、6E10抗体を用いて局所脳免疫ブロットにおいて独立に確認したところ、終脳で非常に高い発現レベルを示す、脳におけるHuAPPの広範な発現を反映するものであった。 8E5抗体は、ADを有する患者由来のアミロイドプラークおよびマイクロ波処理組織部分における神経細胞内胞状構造を染色した（図１３Ｆ）。１：5000希釈で、6E10抗体は、脳組織のギ酸前処理後においてのみADを有する患者由来のアミロイドプラークを染色した（図１３Ｄ，Ｅ）。しかしながら、TgHuAPPマウスにおいては、脳組織についてマイクロ波前処理を行った場合もギ酸前処理を行った場合も、いずれかの抗体を用いることによって、細胞外アミロイドおよび前アミロイド沈着物に似たHuAPP染色は示されなかった。したがって、これらのトランスジェニックマウスにおける異常な表現型は、アミロイドまたは前アミロイド沈着物によって生じたものではなかった。ＣＮＳ障害の発生における突然変異および野生型APP導入遺伝子発現の相対的な影響を評価するために、種々のレベルの野生型HuAPP、突然変異HuAPP、または野生型MoAPP（表５）を発現する系において100日目および200日目に病気になった、または死亡した動物の割合を測定した。これらのデータは、APP発現と異常な表現型の発生との直接的な関係を示すものである（図１５）。全範囲のAPP発現において野生型HuAPPおよび突然変異HuAPPを発現するトランスジェニックマウスを比較することは不可能であった。しかしながら、約２〜４倍の突然変異HuAP Pを発現するトランスジェニックマウス、(TgHuAPP695.TRImyc)1140および(TgHuA PP695.TRImyc)1130と、約３倍の野生型MoAPPを発現するトランスジェニックマウス、(TgMoAPP695.WT)1874との比較は、突然変異HuAPPが異常な表現型を容易に誘発するということを示すものである。この観察結果は、突然変異HuAPPは野生型M oAPPよりも高い浸透率で障害を与えたということから、異常な表現型が発現全体におけるトランスジェニックタンパク質の非特異的作用によるものであるということの反証となるものであり、それが発現されるトランスジェニックタンパク質種の特異的効果を示すものである。これらのデータを、APP発現と異常な表現型の発生との間の直接的な関係を示すタイトレーションカーブで示す（図１５を参照されたい）。しかしながら、野生型APPに比べて突然変異APPを発現するトランスジェニックマウスのカーブは左にシフトしていることから、突然変異APPの発現は、異常な表現型をより容易に誘発するということが示される。タンパク質の外来（ヒト）種の過剰発現が異常な表現型を人工産生しなかったということを確認するために、野生型MoAPPを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。3.1倍の内因性APPレベルと同等のMoAPPレベルを有するトランスジェニックマウスにおいては同じ表現型が発生し、このことによって観察された表現型がタンパク質の外来種の過剰発現によるものではないということがわかる。行動分析ＦＢＶマウスで加齢に伴う行動障害（ヒトにおける老人性痴呆に相当するマウス、または技を忘れた年寄り犬）が自然に出てくるのか否かを調べるため、ＦＢＶマウスを１年間観察し、これらの老齢マウスの行動をトランスジェニックマウスのそれと比較した。行動分析は通常コーナーインデックス（ＣＩ）テストを使用して週に３回実施した。このテストは多くの罹患した（affected）トランスジェニックマウスで生じる新奇恐怖（neophobic）応答を調べるものである。新奇恐怖応答は、新しいチャンバーにおけるテストに特異的な探求活動の減少として現れる。臨床段階の初期において、罹患したマウスは住み慣れたケージでは正常に見えることが多いが、清潔なケージに一匹で入れられると、新しい環境を探索し、嗅ぎまわるのが典型である罹患していないマウスと対照的に、３０から６０秒間、一時的な不動状態を示す。罹患マウスに特徴的な応答は、一時的不動状態の間、首を低くし、尾を硬くすることである。あるいはまた、罹患マウスは隅まで走り、そこでうずくまるか、または凍りついたような姿勢をとる。ＣＩテストでは、マウスが清潔なケージに単独で入れられた後、最初の30秒間にケージの隅を嗅いだ回数を測定する。100匹を越えるトランスジェニックマウスでの2000回を越えるテスト、および140匹を越える非トランスジェニックマウスでの2500回を越えるテストの集合観察に基づき、本発明者等は、行動障害の存在に対する標準は、３回の連続したテストにおいて２個の“０”または“０と１”のスコアであると決定した。病気の発症は、異常なスコアが得られた３回連続テスト日の初日とする。コーナーインデックステストを実施するために、尾を持った被験マウスを、住み慣れたケージと他は同一である清潔なケージの中央に置く。ケージに入れられた後の最初の30秒間にそのマウスがケージの隅を嗅いだ回数をＣＩとして記録する。ＣＩ標準に達する前に明らかに死にかけている動物、および発作が観察される動物も病気であると診断する。非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウスの何匹かは、一匹で住んでいるうちに、罹患したトランスジェニック動物に特徴的な凍りついた姿勢を見せることなく低いスコアを取るため、一匹で住んでいる動物は分析から除外する。こうしたマウスを他のマウスと一緒に住まわせとる、そのＣＩスコアは上昇する。日毎の活動の変化を調整するために、全ての動物を1430時間〜1830時間でテストする。ＦＶＢマウスの行動異常における年齢関連ＣＮＳ障害ＦＶＢマウスの予想寿命はおよそ600日であるが、ＦＶＢマウスにおける年齢関連ＣＮＳ障害についてはほとんど知られていない。ＦＶＢマウスで加齢に伴う行動障害が自然に起こるか否かを調べるために、３つの別の研究所（ミネソタ大学，Minneapolis，MN、McLaughlin研究所，Great Falls，MT、およびHarlan Spr ague Dawley，Inc．Indianapolis，IN）から入手した150から500日齢の110匹のＦＶＢマウスを観察した。加齢に伴い、早いもので154日齢の18匹のマウスで、コーナーインデックステストによって定義した、興奮、無活動、発作、新奇恐怖症（neophobia）等の行動異常、および若死にが見られた（表６）。別の６匹のマウスは腫瘍または事故で死亡した。興奮または無活動は全ての罹患したトランスジェニックマウスで見られるが、これらはほとんどの正常マウスではめったに見られない主観的な徴候であった。病気の発症は、発作、興奮または無関心の観察ど関連付けてコーナーインデックステストの結果によって定義した。雄および雌のマウスが共に罹患した。３匹の興奮したマウスがコーナーインデックス基準によって診断する前に死亡した。そのうちの一例は発作の観察後すぐに起きた。他のマウスは次第に活動が弱くなり、異常行動の徴候が見られた後９〜91日の間に病理学的研究に使用した。このFVBマウスの群における行動異常および死（事故によるものおよび腫瘍関連の死を除く）の累積的な発生は、500日齢で２３％であった（図９参照）。グリオーシス。９〜12月齢の16匹の老齢非トランスジェニックFVBマウス、異常行動を示している７匹の罹患したトランスジェニックAPPマウス、および９匹の同月齢の行動の正常なマウスの脳を決められた方法で調べた。行動異常のマウスの７つの脳のうち６つは、海馬、海馬周辺（parahippocampal）領域、扁桃体、および大脳皮質において、深い肥大性の星状細胞グリオーシスを示した（図１０）。同月齢の行動の正常な９匹のマウスの脳では、海馬に限定された中程度のグリオーシスが何匹かで観察されたが、この程度までのグリオーシスは見られなかった。これらの知見から、罹患した老齢の非トランスジェニックマウスにおける行動障害は皮質近縁のグリオーシスと密接に関連していることが示される（イエーツ修正 X²=8.96、ｐ＝0.003）。行動異常の非トランスジェニックFVBマウスの脳では、アミロイドプラーク沈析、神経原線維もつれの形成、ニューロン異常、またはニューロンあるいはグリアの数の定性的変化は見られなかった。大脳の領域別グルコース利用。障害のあるFVBマウスで観察される異常行動の独立した機能的評価をするために、Sokoloff法（Sokoloffら，J．Neurochem．28 ，897-916(1977)）の修飾法を使用して脳の領域別グルコース利用を測定した。認識に関しで障害のあるヒトおよびAD患者で最も障害を受ける大脳皮質、海馬、鼻内（entorhinal）皮質、および扁桃体のような、学習、記憶、および感情に関連する領域を調べた。小脳は臨床的および病理学的に関与していないように思われるため、¹⁴Ｃ−デオキシグルコース分布のデンシトメトリー値を小脳の値に標準化した。障害のあるＦＶＢマウスの脳組織における脳の領域別グルコース利用を、行動的に正常な、同年齢のＦＶＢマウスの脳組織のそれと比較した。障害のあるＦＶＢマウスの脳組織では、特に海馬（−４２％）、扁桃体（−４３％）、鼻内皮質（−４６％）、頭頂（parietal）皮質（−３４％）、前（frontal）皮質（−１９％）、および側頭（temporal）皮質（−１８％）において、領域別グルコース利用の有意な減少（ｐ＜0.05、分散分析）が観察された。反対に、脳梁、随質網状体、歯状核、および虫部等のいくつかの構造では有意な減少は観察されなかった。ＦＶＢマウスにおける、皮質近縁の肥大性のグリオーシスおよび特に大脳における脳の領域別グルコース利用の減少が伴う障害のある行動の増加は、近縁および皮質構造における肥大性グリオーシスおよび領域別グルコース利用の減少のような、他の齧歯類の種で観察される初老期の変化の性質を有する特徴的な年齢関連のＣＮＳ障害を定義する。障害のあるＦＶＢマウスで観察される年齢関連の行動異常は他の齧歯類で自然に起こることが報告されていないが、学習、記憶、および感情に関わる脳の皮質−近縁領域で見られる脳の領域別グルコース利用の大きな減少によって、罹患したＦＶＢマウスにおける行動異常のほとんどでなくともいくつかは、これらの脳の領域における機能障害を反映していることが強く示唆される。これらのマウスで観察される行動的、病理学的、および機能的な異常は、他の加齢した障害のある齧類および痴呆のヒトで見られる特徴を共有するため、一連の発見はＦＶＢマウスにおけるＣＮＳ老化の形態を示す。変異型および野生型ＡＰＰを発現するトランスジェニックマウス行動異常。加齢した、障害のあるＦＶＢマウスにおけるものと類似の異常な表現型が高レベルのＡＰＰを発現している動物で見られた。３０−５０コピーのハムスターＰｒＰ遺伝子コスミドによって機能するヒトＰｒＰを発現している先に公表されたＦＶＢマウスで発達したトランスジェニック系、Ｔｇ（ＨｕＰｒＰ）ＦＶＢ−１５２では早過ぎる行動異常または死を示さないため、コピー数自体はＣＮＳ障害の直接の原因ではないようである（Tellingら、（1994）Proc．Natl ．Acad．Sci．U.S.A．91，9936-9940）。ＴｇＡＰＰマウスの表現型を、ほぼ同じコピー数（２０−３０）を有する４種の系で種、遺伝子型およびＡＰＰ発現レベルに従って分離した（Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＷＹｍｙｃ）４６６、Ｔｇ（ＭｏＡＰＰ６９５．Ｗｔｍｙｃ）６２０９）。ＰｒＰレベルが相当数のＰｒＰ遺伝子成分の存在によって影響されるか否かを決定するために、７４個の導入遺伝子コピーを有するＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１３０マウス、および非トランスジェニックマウスで脳のＰｒＰレベルを測定した。差異は見られず、ＰｒＰ発現における変化も異常な表現型の原因ではないことが示された。トランスジェニック動物は、加齢した、障害のある非トランスジェニックＦＶＢマウスで観察される興奮、驚き応答の増加、無関心、および新奇恐怖症等の全ての臨床的な徴候（表６）を示すが、これらは早い時期から有意に高い表現率で生じた（図９、表５）。後には無活動および生殖不能が見られるようになるが、自閉症で判断される振せん、協調不能、虚弱、麻痺あるいは感覚の見かけ上の喪失、または尾あるいは足を挟まれたことに対する音声応答はなかった。発作は罹患したＴｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）マウスでは低い率（３％（６／１８１））で観察された。発作の実際の発生率がより高い可能性があり、マウスを週に３回、３０−６０秒以上観察していれば検出されるだろう。トランスジェニックマウスにおける行動異常は１月齢で既に発生した。雄および雌のマウスにおける行動異常の発症に有意な違いはなかった。ＡＰＰを過剰発現しているトランスジェニックマウスの何匹か（＝１４％）は、先に発作または新奇恐怖症を見せることなく１月齢で死んだ。これらのマウスのうち２匹の神経病理学的検査では、特徴的な行動徴候を示した後に死んだトランスジェニックマウスと区別できない皮質−近縁グリオーシスが同定され、これらのマウスが他のトランスジェニックマウスと同じ障害の結果死亡した可能性がある。内在レベルの２倍を越えるトランスジェニックマウスの脳のＡＰＰレベルを有する動物において低身長が観察された（表５）。この大きさの違いは出生時にははっきりしないが、４〜６週齢までに目立つようになり、より週齢のいった動物ではより少ないか、見られなくなる。トランスジェニック動物では正常な比率で現れた。Ｔｇ（ＨｕＡＰＰ６９５．ＴＲＩｍｙｃ）１１１８マウスは早く死に、正常な大きさにも関わらず行動異常を見せたことから、大きさの小さいことは行動異常の発生に必要ではなかった。表６ＡＰＰ導入遺伝子を発現している加齢した障害ＦＶＢマウスおよび罹患したＦＶＢマウスにおける臨床的および病理学的徴候トランスジェニックマウスの病理学的分析行動異常を示すか、死亡が発見されたトランスジェニックマウスおよび同年齢の非トランスジェニックマウスの脳を神経病理学的異常について調べた。脳を１０％ホルマリン−リン酸緩衝液または４％の緩衝パラホルムアルデヒドで液浸固定するか、または環流し、パラフィン中に包埋して、回転ミクロトームで５−８ μｍの切片に切った。組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン、クレシルバイオレット、チオフラビンS、あるいはコンゴーレッド染料、またはビールショスキー銀あるいはTUNEL（Gavrieliら、（1992）Journal of Cell Biology 119，49 3-501）法を使用して染色した。免疫組織学的研究のために、パラフィン切片から脱パラフィンし、キシロールおよび等級をつけた（graded）アルコールを通して再水和した。メタノール中６％過酸化水素で１０分間、またはメタノール中３．０％過酸化水素（１：５）で処理して内在性ペルオキシダーゼをクエンチし、脱イオン水またはリン酸緩衝食塩水ですすいだ。ＡＰＰ抗原の検出を増幅するために、選択された切片を水中で１５分間、フル出力でマイクロ波照射し、室温まで冷却し、０．４％ＴＸ／ＴＢＳ、次いで３％正常ヤギ血清ＴＢＳ液で前処理した。一次抗体６Ｅ１０（１：１００）および８Ｅ５（１：１００腹水症液）を２％正常ヤギ血清含有０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中で調製した。２４時間のインキュベーションの後、スライドをすすぎ、０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中のヤギの抗−ウサギまたは抗−マウスIgG（１：２０）と共にインキュベートし、ＴＢＳですすいだ後に、室温でウサギまたはマウスのペルオキシダーゼ− 抗ペルオキシダーゼ（１：１００）と共に１時間インキュベートした。すすいだスライドを０．０１％過酸化水素中０．０５％ジアミノベンジジンの存在下で反応させ、ＴＢＳで３回すすぎ、等級をつけたアルコールからキシレンを通して再水和した。代表的な切片をFontana-Masson法（Masson（1928）Am．J．Path．H:1 81-211）に従って銀−増幅し、透過型光学顕微鏡および示差干渉対比光学（diff erential interferenc econtrast optics）で見た。他の切片は７０％蟻酸に１０分間液浸し、リン酸緩衝食塩水ですすぎ、１０％正常ウマ血清に１時間液浸した。一次抗体６Ｅ１０（１：５０００）をリン酸緩衝食塩水中に調製した。４℃ で一晩インキュベートした後、切片をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、抗−マウスIg Gと、次いでアビジン−ビオチン複合体（Vector Labs，Inc.）と共にインキュベートした。すすいだスライドをジアミノベンジジンと反応させ、Harrisヘマトキシリンで対比染色した。リン酸緩衝食塩水で１：６０の希釈をしたＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体を使用してＧＦＡＰを検出した。グリオーシス。標本を使用して、三重の（triple）ＨｕＡＰＰ変異体、Dutch ＨｕＡＰＰ変異体、SwedishHuAPP変異体、野生型HuAPPを発現している２１匹の罹患したトランスジェニックマウスの脳、並びに同年齢の１２匹の罹患していない非トランスジェニックマウスの脳を調べた。１６匹の罹患したトランスジェニックマウスの脳は、基底（basal）神経節を比較的避けて主として海馬傍領域、海馬、扁桃休、および大脳皮質に位置する目立つ肥大性の星状細胞グリオーシスを示す（図１０）。星状細胞は、神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のための免疫染色時に大きく、長くなる過程を有するが、星状細胞の数の増加はなかった。同年齢の非トランスジェニックマウスの脳では、グリオーシスと異常行動の強力な関連性を示す反応性のグリオーシスがなかった（イェーツ修正Ｘ² ＝１４．８３、ｐ＝0.00012）。ビールショスキー銀染色では、神経原線維もつれ、発育異常の軸索、または神経炎プラークは見られなかった。Nisslおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色でニューロンは正常に見えた。死亡が発見された６匹のトランスジェニックマウスの肉眼的または顕微鏡的検査によって、特徴的な脳の病理（下記に記載する海馬、大脳皮質、肩桃体、および海馬傍領域での星状細胞のグリオーシス）が見られたが、ＣＮＳの外側では顕微鏡的または肉眼的病理の証拠はなかった。これらのトランスジェニックマウスの４匹で、心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、小腸、および精巣におけるチオフラビンS染色によってアミロイドが特異的に除外された。ＣＮＳの外側で病理学的知見がないことから、死亡は元々神経学的な原因によるものである可能性が非常に高いこどが示される。領域別脳のグルコース利用罹患したトランスジェニックマウスの脳で機能的な差異があるか否かを決定するために、罹患したトランスジェニックマウス、加齢した、障害のある非トランスジェニックＦＶＢマウスおよび同年齢の非トランスジェニックマウスで領域別の脳のグルコース利用を比較した。正常な、非トランスジェニックの同胞子と比較して、トランスジェニックマウスでは海馬（−３１％）、扁桃体（−２８％）、頭頂皮質（−３４％）、側頭皮質（−３３％）、後頭皮質（−３６％）等の種々の大脳領域でグルコース利用の有意な減少（ｐ＜0.05；分散分析）が観察された。対照的に、知覚−運動皮質、脳梁、網状体、虫部、前庭複合体、および歯状核等の多くの領域では有意な減少は示されなかった（ｐ＞０．０５）。罹患したトランスジェニックマウスにおける領域別グルコース利用の下降は特に海馬、扁桃体、およびいくつかの皮質領域で見られ、加齢した、障害のある非トランスジェニックＦＶＢマウスで生じるものと非常に類似していた。４トランスジェニックマウスにおける細胞外Ａβ染色 Saidoら，J．Blol．Chemistry 269:15253-15257(1994)に記載された抗体による一匹の動物の細胞外染色を示す。この抗体はＡβのアミノ末端を特異的に染色する。これはアフィニティー精製したポリクローナル抗体である。本発明のトランスジェニックマウスにおける染色はＡβ断片との特異的な競合によって阻止することができる。本発明のトランスジェニックマウスの染色パターンは、同じ抗体で染色したＡＤ脳で見られるものと類似している。より多くの動物について調べている。他の抗体による更なる特徴付けをしている。超微構造研究も行っている。実施例７ＦＶＢ／ＮマウスにおけるAPP導入遺伝子の発現導入遺伝子の構築 Sal１に隣接したヒトまたはマウスのＡＰＰＯＲＦをハムスターＰｒＰコスミドベクター中に挿入してＰｒＰ−ＡＰＰ導入遺伝子を作成した。このベクターは、ハムスターＰｒＰＯＲＦがユニークなSal１制限部位で置換される約２０ｋｂの上流配列と共にハムスターＰｒＰ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの約４０ｋｂの断片である。HuAPP695.SWE、HuAPP695.TRImyc、およびＡＰＰ配列を翻訳開始を強力にするために修飾した。ＡＰＰコード配列の5'末端にはSal１部位および強いKozak(翻訳開始配列（5'−GTCGACACC−ATGCTGCCC...）があり、ＡＰＰコード配列の3'末端のすぐ次にはSal１部位（...AACTAGCAGCTG−3'；開始および終止コドンは下線で示す；部位は太字）がある。これらの修飾およびＡＰＰ変異は、標準的なクローニング方法、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた部位指向性の突然変異誘発を使用して行った。ＰｒＰ−ＡＰＰコスミドをNo t１で分解し、これによってpcos6EMBLベクターからＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を遊離させる。アガロースゲル上のサイズ分画の後にＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を単離し、電気溶出した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を有機溶媒で更に精製し、酢酸アンモニウムおよびエタノール中で沈殿させた。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合遺伝子を５ｍＭ Tris-Cl（ｐＨ７．４）または１０ｍＭ Tris-Cl（ｐＨ８．０）に溶解して、胚への注入に先立ち、最終濃度２−４μｇ／ｍｌとした。トランスジェニックマウスの作製およびスクリーニングトランスジェニックの系は単一の細胞であるマウスの胚へのマイクロインジェクションによって開始した。胚のドナーおよび受精スタッド(fertile stud)は、 National Cancer Institute(NIH)から入手した同種繁殖させたＦＶＢ／Ｎマウスであった。離乳後の尾の生検ＤＮＡを作成し、未精製ＤＮＡ１μｌを２５μｌのＰＣＲ反応に使用した。ＰｒＰ−ＡＰＰ融合ＤＮＡを検出するために、それぞれＡＰＰの3'領域、およびＰｒＰの3'の非翻訳領域に位置する一対のオリゴマープライマー、１５０３：（5'−CTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGT−3'）および１５０２：（5'−GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACCA−3'）を用いてＰＣＲでＰｒＰ−ＡＰＰ融合ＤＮＡを増幅した（図８参照）。１５０３プライマーはマウスおよびヒトのＡＰＰで相同である領域を認識し、従ってＰｒＰ−ＭｏＡＰＰおよびＰｒＰ− ＨｕＡＰＰＤＮＡの双方を検出するために使用することができた。陽性対照として、プライマー１５０２および１５０１（5'−AAGCGGCCAAAGCCTGGAGGGTGGAACA −3'）を使用して、マウスＰｒＰ断片を適用する並行ＰＣＲ反応を実施した。ニトロセルロースに焼き付けた変性した精製尾ＤＮＡ５μｇを使用して導入遺伝子のコピー数分析を実施し、ハムスターＰｒＰコスミドベクター中に位置するハムスターＰｒＰ3'の非翻訳領域のセグメントをコードする放射線標識した１．３ｋｂのSal１−Xho１ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせた。ストリンジェンシーの高い２回の洗浄の後、トランスジェニックマウスおよびハムスターのゲノムＤＮＡからのシグナルの相対強度をりん光測定器（phosphorimager）を使用して比較し、二倍体のハムスターゲノムＤＮＡに比較して導入遺伝子のコピー数を得た。導入遺伝子発現分析ＡＰＰ導入遺伝子産物を、１−４月齢で犠牲にしたトランスジェニック確立動物の子孫で調べた。脳ホモジェネートからの抽出物の定量的イムノブロッティングを、同年齢の非トランスジェニックの同胞子で調製した抽出物と並行して実施した。脳組織のホモジェネート（２０％、ｗ／ｖ）は、手で保持する（hand− held）ポリトロンを使用してＴＮＥ（２％フェニルメチルスルホニルフルオライドを含有する５０ｍＭ Tris-Cl（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ NaCl、５ｍＭEDT A）緩衝液中で調製した。ホモジェネートを等量のＴＮＥ、１％NonidetＰ−４０、１％デオキシコレート、０．４％ＳＤＳで希釈し、全ての粘度が消失するまでバスソニケーターで音波処理した。次いでホモジェネートを１０分間沸騰させ、 10,000×ｇで１０分間遠心分離した。上清を２×試料緩衝液（Laemmli,1970）の等量ど混合し、２分間沸騰させ、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分画した。タンパク質を電気泳動的にImmobilon膜（Pierce）に移し、モノクローナル（２２Ｃ１１および６Ｅ１０）抗−ＡＰＰ抗体とインキュベートした。反応したモノクローナル抗体は、¹²⁵Ｉ−プロテインＡとのインキュベーションの前、マウスIgGに対するウサギの二次抗体とインキュベートした後に視覚化した。りん光測定器（Molecular Dynamics，Inc.）上で放射活性を定量した。脳組織のＡβの分析およそ０．２ｇの組織を７０％ガラス−蒸留蟻酸１ｍｌ中でホモジナイズした（４ストローク）。ホモジェネートを100,000Ｘｇ以上で１時間遠心分離した。蟻酸抽出物（上にある脂質層と少量のペレットの間の層）をとり、小アリコートを１Ｍ Tris（ｐＨ８．０）で５０倍に希釈した。次いでこの試料をＥＣ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ EDTA、０．４ＭNa Cl、０．２％ウシ血清アルブミン、０．０５％CHAPS、０．４％Block-Ace、０．０５％アジ化ナトリウム）で更に２．４倍に希釈し、このうち１００μｌを、先に記載されでいるＢａｎ５０／Ｂａ２７またはＢａｎ５０／Ｂｃ０５ ELISA系（Suzukiら、1994; Gravinaら、1995）を使用して直接分析した。報告されたＡ β値は、２個の試料で得た吸光度をBeachemから入手したＡβ_1-40（Ｂａｎ５０／Ｂａ２７）またはＡβ_1-42（Ｂａｎ５０／Ｂｃ０５）の標準曲線と比較して得た。これらの値を希釈および組織の初期湿重量を考慮して補正し、湿重量１ｇ当たりのピコモルとして表した。試料は全て動物のトランスジェニック状態に関して表した。行動分析：新奇恐怖症：コーナーインデックステストを実施するために、被検マウスを尾で保持し、清潔な寝わらの（汚れた寝わらはテスト中に取り除く）ケージ（１８×３０×１３ｃｍ）の中央に置き、マウスがケージに入れられた後の最初の３０秒間にテストケージの隅を嗅いだ回数をコーナーインデックス（ＣＩ）として記録する。（明細書中第18頁第１〜18行を参照すること。）動物は通常週に３回テストする。単独で住んでいる動物の低スコアは、それらが走触性、または他の新奇恐怖症のトランスジェニックマウスの特徴的な凍りつき姿勢を示さない限り、分析から除外した。日毎の活動の変化を調整するために、全ての動物は１３００時間〜１８３０時間でテストした。１５０日齢を越える非トランスジェニックマウスにおける新奇恐怖症の存在の基準は３回以上連続してスコアが０であることである。マウスの病理学的分析行動異常を示すマウス、または死亡が発見されたマウス、および同年齢の同胞子の脳を神経病理学的異常について調べた。脳を１０％リン酸緩衝ホルマリンまたは４％緩衝パラホルムアルデヒドで液浸固定、または環流し、パラフィンに包埋し、５−８μｍの切片に切った。組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、クレシルバイオレット、チオフラビンS、あるいはコンゴーレッド染料で、またはビールショスキー銀法で染色した。免疫組織学的研究のために、メタノール中６％過酸化水素またはメタノール中３．０％過酸化水素（１：５）で処理して内在性ペルオキシダーゼをクエンチした。ＡＰＰ抗原検出を増強させるために、選択した切片に水中にてフルパワーで１５分間マイクロ波照射した。室温まで冷却し、０．５ＭＴＢＳ（ｐＨ７．６）中の脱イオン水中に移し、ＴＢＳ中０．４％TritonX-100（ＴＸ／ＴＢＳ）、次いでＴＢＳ中３％正常ヤギ血清で前処理した。一次抗体６Ｅ１０（１：１００）および８Ｅ５（１：１００腹水症液）を、２％正常ヤギ血清含有０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中に調製した。２４時間のインキユベーシヨンの後、スライドを０．１％ＴＸ／ＴＢＳ中のヤギの抗−ウサギまたは抗−マウスIgG（１：２０）とインキュベートし、次にウサギまたはマウスのペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（１：１００）と室温で１時間インキュベートした。すすいだスライドを０．０１％過酸化水素中０．０５％ジアミノベンジジンの存在下で反応させた。代表的な切片をFontana-Masson法（Masson，1928）に従って銀増幅した。他の切片を７０％蟻酸に１０分間液浸し、ＰＢＳですすぎ、１０％正常ウマ血清に１時間液浸した。一次抗体６Ｅ１０と共に（１：５０００）４℃で一晩インキュベートした後、切片をＰＢＳですすぎ、抗−マウスIgG、次いでアビジン−ビオチン複合体（VectorLabs，Inc.）と共にインキュベートした。すすいだスライドをジアミノベンジジンと反応させ、Harrisヘマトキシリンで対比染色した。ブタＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体（Sigma）を使用してＧＦＡＰを検出した。領域別脳のグルコース利用分析マウスに（¹⁴Ｃ）２−デオキシグルコース（New Engl and Nuclear;０．９％N aCl０．４ml中に５μCi）を腹腔内注射し、６０分後に犠牲にした。脳を速やかに取り出し、ドライアイスで−３０℃に冷却したイソペンタン中で凍結した。体幹血液（trunk blood）の試料を回収し、グルコース分析器（Beckman）による血漿中のグルコース濃度の測定に使用した。定量的オートラジオグラフィーのための技術はLadecolaら、1983；LadecolaおよびXu、1994に記載の方法に従い、ここでは要約する。Colonal脳冠（coronal brain）切片（２０μｍ）をクライオスタット（Hacker-Bright）上で切り、ガラススライド上に載せ、較正した¹⁴Ｃ標準と共にＸ−線フィルム（Dupont）に暴露した（Ladecolaら、1983）。フィルムを１０日後に自動現像器（Kodak）を使用して現像し、目的の領域の光学密度（ＯＤ）を、コンピューター化した画像分析器（MCIDシステム、Imaging Research I nc.）を使用して、４個の隣接した切片上の左右両側で測定した。フィルム上の標準を使用してＯＤを¹⁴Ｃ濃度（ｎＣｉ／ｇ）に変換した。何匹かのマウスは大きさが小さい（１５−２０ｇ）ため、動脈での２−デオキシグルコースの経時変化測定のための採血は、犠牲時を除いて実施できなかった。従って、領域別放射活性値（nCi／１００ｇ／min）を病理のない領域、すなわち小脳全体の放射活性で割ってＣＧＵインデックスを得た。この標準化法は有効であることが確認され、小実験動物で広く使用されてきた（例えばSharpら，1983; MitchellおよびCro ssman，1984; W1lliotら，1988）。本発明者等の実験においては、小脳および血漿グルコースの¹⁴Ｃ蓄積速度（nCi／１００ｇ／min）は対照、加齢、およびトランスジェニックマウス間で異ならなかった。この知見より、ＣＧＵインデックスはSokoloffらの方法（1977）で測定したもののようなグルコース利用の正確な推測ができることが示される。ＰｒＰコスミドベクターはトランスジェニックマウスにおけるＡＰＰの過剰発現を誘導するＦＶＢ／Ｎマウスにおける変異型および野生型のＡＰＰ発現の影響を測定するために、本発明者等はプリオンタンパク質（ＰｒＰ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をハムスターＰｒＰコスミドベクター中の種々のＡＰＰＯＲＦと置き換えた。トランスジェニックマウスは４種の異なる導入遺伝子の１種を有し、いくつかは家族性ＡＤと関連する変異を有している（MoAPP695.WT（野生型）；HuAPP695.SWE（K67ONおよびM671L、ＡＰＰ₇₇₀ナンバリング）；HuAPP695.TR Imyc（3'−mycタグを有するV7171、V721A、およびM722V）；HuAPP695.WTmyc（3' −mycタグを有する野生型）；Mo、マウス；Hu、ヒト）。最初に、導入遺伝子に3 '−mycタグ、すなわちｃ−mycプロトオンコジーンの１２コドンセグメントを導入し、導入遺伝子産物の免疫検出を容易にした（WongおよびCleveland、1990）。mycタグのないＴｇ（HuAPP695.SWE）マウスがmycタグを有するものと同じ臨床的および病理学的性状を示したことから、mycタグは表現型に対しで明らかな影響を示さなかった。すなわち、本発明者らのマウスで得た高レベルのＡＰＰ発現はmycタグを必要としなかった。早期の家族性ＡＤの発症につながるV7171変異を有するＡＰＰＯＲＦに予期せずして導入され、導入遺伝子の系が確立された後に発見された実験的変異V721AおよびM722Vは、Ｔｇ（HUAPP695.TRImyc）マウスが他の３種の導入遺伝子を発現しているトランスジェニックマウスと同じ臨床的および病理学的異常を発症したため、表現型に対して明らかな影響を示さなかった。培養細胞におけるHuAPP695.TRImycの次の分析によって、これらの予期しない変異では、可溶性アクトドメインまたはＡβペプチドを生成するためのタンパク質の成熟、修飾、またはタンパク分解プロセシングに関し、ＨｕＡＰＰのプロセシングに顕著な影響を与えないことが示された。マウスおよびヒトのＡＰＰ双方、並びにアミロイド前駆体様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）で同一のエピトープを認識し、これが内在性MoAPPに相対的なトランスジェニックＡＰＰ量の過小評価につながる可能性のあるモノクローナル抗体２２Ｃ１１を有するトランスジェニック系におけるイムノブロットの定量によって、異なる導入遺伝子のコピー数を有するトランスジェニックマウスの脳におけるＡＰＰ発現を測定した。トランスジェニック脳におけるＡＰＰタンパク質の発現は、コピー数並びに発現するＡＰＰの種類に依存した：MoAPP導入遺伝子はHuAPP 導入遺伝子と同じレベルを、より少ないコピー数で達成した。Ｔｇ（HuAPP695.TRImyc）マウスにおけるＡβの測定によって、脳においてＡ β_1-40およびＡβ_1-42の双方が生成していることが示される。HuAPP.SWEを発現しているトランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスにおいては、その繁殖性能が乏しく、マウスの数が不充分であるため、Ａβレベルは測定されず、MoAPPを発現しているトランスジェニックマウスにおいては、脳におけるマウスＡβを確実に測定する方法が未だ利用できないため、Ａβレベルが測定されなかった。Ban50捕捉（capture）抗体はMoAPPを認識しない；非トランスジェニックマウスについて示されたレベルはバックグラウンドシグナルに相当する。Ａβの双方の形態はトランスジェニックマウスで容易に検出可能であるが、ＡＰＰをより低いレベルで発現している罹患していない系よりも、ＡＰＰを過剰発現し、臨床的な異常を示す系において顕著に高いものであった。８Ｅ５または６Ｅ１０モノクローナル抗体を使用したヒトＡＰＰ／Ａβのための特異的な免疫染色から、海馬、海馬傍領域、扁桃体、および大脳皮質、および大きな錐体（pyramidal）細胞内の小胞構造中のＨｕＡＰＰが明らかになり、並びに脳全体にわたってより小さいニューロンおよびいくつかのグリア細胞でより弱い染色が見られた。抗体８Ｅ５（Dale Schenk，Athena Neurosciencesより寄贈）は残基５１９−６６７（ＡＰＰ₇₇₀のナンバリング）にわたるＡＰＰのセグメントを認識し、６Ｅ１０はヒトＡβの残基１−１７を認識する（Kimら、1990 ）。ＨｕＡＰＰ免疫染色のパターンは、大脳において最も高い発現レベルを示す領域別の脳免疫ブロットのものと合致した。脳および脊髄は最も高い量でＨｕＡＰＰを含有した；横紋筋、心臓、皮膚、および肺は脳の５％未満のレベルで含有した；胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、および小腸においてはＨｕＡＰＰは検出できなかった。導入遺伝子の高いコピー数を有する動物においてＰｒＰレベルは未変化のままであり、導入遺伝子のＰｒＰプロモーターおよび他の配列は転写因子プールを枯渇させていないこと、および膜糖タンパク質を合成、修飾、および移動する細胞機構は過剰に負荷を負っていないことが示された。行動異常：新奇恐怖症および他の神経学的徴候コーナーインデックステストから、トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウス間に驚くほどの差が見られた。非トランスジェニックマウスのコーナーインデックスのスコアは最初の３カ月の間１以下の低い値を示したが、一方ＡＰＰを過剰発現している何匹かのトランスジェニックマウスのスコアは加齢につれて１以下の値を示した。低いスコアは新奇恐怖応答を反映しているようである。１００匹を越えるトランスジェニックマウスの２０００回を越えるテスト、および１５０日齢未満の１４０匹を越える非トランスジェニックマウスの２５００回を越えるテストに基づき、“０”のスコアが二つでまたは“０”と“ １”が３回の連続したテストの期間で見られたときの齢を新奇恐怖症の発症と定義した。１００日齢を通じてテストした１００匹の非トランスジェニックマウス、または１５０日齢を通じてテストした４８匹の非トランスジェニックマウスでコーナーインデックステストに失敗したものはいなかった。新奇恐怖症はＡＰＰを過剰発現しでいる雄および雌のトランスジェニックマウスの両方で１月齢程度から見られ、トランスジェニック１１３０Ｈマウスにおいて平均して死亡する４０日前に見られた。６種のトランスジェニックＦＶＢ／Ｎ系、および野生型MoAP P695.WT、HuAPP695.SWE、HuAPP695.WTmyc、またはHuAPP695.TRImycを高レベルで発現しでいる４種の更なる創始系は新奇恐怖症を示した。コーナーインデックステストで失敗したマウスはまた、走触性、内的興奮（agitation）、静止した尾、凝視、振せん、および無活動等の他の神経学的徴候をも示した。罹患した系の 181匹のマウスのうち、６匹はコーナーインデックステスト中に全身性の強直性 −間代性発作を起こした。本発明者等はまた、野生型MoAPPを過剰発現しているトランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスを作製した；トランスジェニック１８５５マウスの３７％およびトランスジェニック１８７４マウスの５４％は１００日齢で新奇恐怖症であり、トランスジェニック１８７４マウスの１１％は１００日で死亡した。新奇恐怖症の発症率は、HuAPP695.TRImycを発現しているトランスジェニックマウスよりもMoA PP695.WTを発現しているトランスジェニックマウスにおいてより低かった。領域別の脳グルコース利用新奇恐怖症トランスジェニックマウスおよび新奇恐怖症の中期から後期の成体非トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスにおける脳の罹患した領域を同定するために、（¹⁴Ｃ）デオキシグルコースレベル（μCi／１００ｇ／ｍｉｎ）のデンシトメトリー測定によって領域別の脳グルコース利用を測定した。新奇恐怖症のTg 1130H、および同年齢の非トランスジェニックマウスの領域別の脳グルコース利用を比較した。前者は、大脳皮質の鼻内皮質（−３７％；ｐ＝0.008）、海馬（ −３０％；ｐ≦0.003）、および扁桃体（−２８％；ｐ＝0.004）並びに大脳皮質の頭頂葉（−３４％；ｐ＝0.001）、側頭葉（−３３％；ｐ＝0.017）、および後頭葉（−３６％；ｐ＝0.001）等の種々の皮質−近縁領域におけるグルコース利用において顕著な減少を示した。体性感覚−運動皮質は比較的保たれ、これらのマウスにおける運動および感覚の異常が見かけ上ないことを確証し、橋網状体(p ontine reticular formation)、前庭核複合体、および歯状核等の多くの脳幹領域でグルコース利用における顕著な減少は示されなかった。トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスの脳におけるアミロイド形成のない星状細胞グリオーシス定まった標本を使用して、本発明者等はHuAPP695.SWE、HuAPP695.WTmyc、HuAP P695.TRImyc、またはMoAPP695.WTを発現している19匹の新奇恐怖症のトランスジェニックマウス、並びに12匹の同年齢の罹患していない非トランスジェニックマウスの脳を調べた（表２参照）。罹患したトランスジェニックマウスの15の脳では主として海馬傍領域、海馬、扁桃体、および大脳皮質に位置する目立つ肥厚性の星状細胞を示し、基底節では比較的変化がなかった。星状細胞は、神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を免疫染色した際に大きく、長くなる過程を有し、星状細胞の数における増加はなかった。同年齢の非トランスジェニックマウスの脳では反応性のグリオーシスはなかった。一般に、グリオーシスと異常行動間には関連性がある（イェーツ修正Ｘ²＝14.83、ｐ＝0.00012）。ビールショスキー銀染色では神経原線維もつれ、栄養失調性軸索、または神経炎プラークは見られなかった。Nisslおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色ではニューロンは正常に見えた。新奇恐怖症を示す9〜12月齢の７匹の非トランスジェニックFVB/Nマウス、及び同年齢の行動が正常な９匹のマウスを定められた手法で調べた。新奇恐怖症マウスの７つの脳の内の６つが、海馬、海馬傍領域、小脳扁桃、及び大脳皮質にGFAP 染色により検出される明確な神経膠星状細胞グリオーシスを示した。新線条体は殆どあるいは全く星状細胞増加を示さなかった。９匹の同年齢の行動が正常なマウスはいずれもこのような程度のグリオーシスを示さなかったが、一部の対照FV B/Nマウスに海馬に限定された軽いグリオーシスが観察された。これらの知見は、非トランスジェニックFVB/Nマウスの新奇恐怖症は大脳皮質及び近縁系脳領域におけるグリオーシスに関連していることを示している（イェーツ修正χ²=8.96 ，p=.003）。これらのマウスの脳は、アミロイド沈積、神経細線維もつれ(neuro fibrillary tangles)、ニューロン異常、あるいはニューロンもしくはグリア数における質的な変化を示さなかった。HuAPPを過剰発現するトランスジェニックF VB/N系における臨床的異常を示す動物から得た脳組織においてAPPあるいはAβ免疫反応性を検出するため、２種の抗体、すなわち、ADを有する患者から得た高周波処理された組織切片におけるアミロイド及びニューロン内小胞構造を染色する 8E5抗体、及び脳組織を蟻酸前処理したときにのみADを有する患者由来のアミロイドを染色する6E10抗体を使用した。４匹のTg(HuAPP695.SWE)マウス及び７匹の Tg(HuAPP695.TRImyc)マウスにおいては、高周波及び蟻酸による脳の前処理のいずれにおいてもこれらの抗体を使用して細胞外APPあるいはAβ免疫反応性が示されなかった。アミロイド沈積はコンゴーレッドあるいはチオフラビンSによる染色では示すことができなかった。我々はこれらのトランスジェニックマウスの異常表現型はアミロイドプラーク沈積とは無関係に発生するものと結論づけた。 MoAPP及びHuAPP導入遺伝子を発現するFVB/Nマウスについての年齢依存性の死亡と新奇恐怖症の表現率の差異は、異なるアミノ酸配列を有するAPP導入遺伝子は、その効果に関するそれらの年齢に依存した能力において異なることを示している。しかし、APPを過剰発現する全てのトランスジェニックFVB/Nマウスにおいて観察された表現型の性質的特徴は、APPの一次構造にかかわらずFVB/Nマウスにおける天然のCNS障害の促進に類似している。HuAPP.TRImycにおける２つの追加的なトランスメンブラン変異の存在がAβの生成を減じ、それにより表現型が変化している可能性があるが、我々のデータは、この導入遺伝子を発現するマウスは実際にAβ_1-40及びAβ_1-42の両方を生成し、HuAPP695.SWE、HuAPP695.WTmyc 及びMoAPP695.WT導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと同じ臨床的異常を発症し得ることを示している。実施例８トランスジェニックマウスにおける相関的な記憶欠失、 A β上昇及びアミロイドプラーク PrPオープンリーディングフレーム(ORF)が変異体βAPP ORFに置換されたハムスタープリオンタンパク質(PrP)コスミドベクター(Scottら、PrOtein Sci.1:986 -97(1992))を有する、早期発症ADを有する大きなスェーデンのファミリーに見られる変異であるK670N-M671L(βAPP-770ナンバリング)(Mullanら、Nature Geneti cs 1:345-347(1992))を含むヒトβAPP-695の発現を誘導することにより、Tg(HuA PP695.K670N-M671L)2576マウスを生成した(図15a)。Tg 2576マウスは5.56±0.33 ユニット(平均±SEM)(73日齢マウス)から5.76±0.74ユニット(430日齢マウス)のトランスジェニック脳βAPP発現を生成した。この発現の１ユニットは、非トランスジェニック同腹子における内在的マウスβAPPの量に相当する(図15b)。トランスジェニックβAPP発現は、2〜14月齢の間で変化しないままであるようであった。 7〜9匹の導入遺伝子陽性マウス及び10〜11匹の導入遺伝子陰性同腹子の２つの群について、３月及び10月齢でY字-迷路において空間交替試験(spatialalternat ion testing)を行った。9〜13匹の導入遺伝子陽性マウス及び10〜14匹の導入遺伝子陰性同腹子の３つの群について、２、６及び９月齢でMorris水迷路(Morris ，J．Neurosci．Meth．11:47(1984))において空間参照学習及び記憶試験を行った。各セットの動物の試験経験は新規なものであり、全ての動物は定められた手法により試験した。9〜10月齢動物はN1世代マウスであった(C57B6x C 57B6/SJL F1)。2〜3及び６月齢動物はN2世代マウスであった(C57B6 xC56B6 xC57 B6/SJL F1)。N2世代マウスのサブセット（８匹の導入遺伝子陽性及び10匹の導入遺伝子陰性マウス)を12及び15月齢で再試験した。導入遺伝子陽性及び導入遺伝子陰性マウスにＹ字-迷路の２つの経路のいずれかに入ることを選択させると、動物は自発的に交替して選択する傾向を見せた。しかし10月齢導入遺伝子陽性マウスは、連続的な選択において交替に経路を選択することに関して、同年齢の導入遺伝子陰性マウスと比較して有意に低い傾向を示した(p＜.03)(図16a)。空間交替タスクにおける年齢の高い導入遺伝子陽性マウスの行動は海馬形成に損傷を受けた動物の特徴である(Douglas,Spontaneous A lternation Behavior Richman及びRichman編（Springer-Verlag，New York，199 0）pp．73-109)。別の重要な学習テストにおいては、９月齢の導入遺伝子陽性マウスは、水迷路における能力において同年齢の導入遺伝子陰性マウスよりも劣っていた(図l6b) 。Morris，(1984) J．Neuroscj．Meth．11:47に記載された水迷路試験を改変してマウスに使用した。水迷路は、29℃に維持された水で満たした直径１メートルの円形プールであり、粉乳を加えて不透明にした。水の表面から1.5cmの深さに沈め、プール内のランダムな位置においた12.7cm平方のプレキシガラスプラットフォームへ泳がせることにより動物を予備トレーニングした。予備トレーニングの間、厚いカーテンをプールの周りに引き、マウスが空間トレーニングの最初の日に迷路外空間の手掛かりを知らないようにした。空間トレーニングは日に４回の試行からなるものとし、各試行は動物がプラットフォームに到達するか60秒が経過するまでのいずれか早い方まで継続した。各試行の後、マウスを30秒間プラットフォームに留まらせた。12回目及び24回目の試行の24時間後、全ての動物をプローブ試行にかけ、これにおいては動物をプラットフォームを除去したプールで60秒間泳がせた。動物をプールの真上の天井部に装着したカメラによりモニターし、その後のプローブ試行の間のプラットフォーム横断及び各４分の１部分で費やした時間％の分析のために全ての試行をビデオテープに録画した。２回目のプローブ試行の少なくとも24時間後に可視的プラットフォームトレーニングを行い、ここではプラットフォームを今度は黒くし、少し大きくし (14.2cm平方)、水の表面より上に設けたことを除いて先に記載したのと同じプールにおいてマウスを泳がせた。プラットフォームの位置は試行によりランダムに変更し、迷路外の空間的手掛かりによる混乱を招く可能性を排除した。可視的なプラットフォームと隠されたプラットフォームの両方の場合において、動物はプールのランダムに選択された７つの場所の内の１つにプールの壁に向けて置いた。２及び６月齢のトレーニングされ試験された導入遺伝子陽性マウスは殆どの測定において同じ年齢の導入遺伝子陰性マウスと異ならなかった。マウスが隠されたプラットフォームに到達するのに要した時間（脱出潜伏期）は、２月齢の導入遺伝子陽性及び陰性マウスの間ではトレーニングのあらゆる時点において異ならなかったが、９月齢の動物においては脱出潜伏期は毎日有意に異なつていた(p＜0.05)。６月齢の導入遺伝子陽性動物はトレーニングの最後の日のみにおいて潜伏期が対照と異なった。プラットフォームを除去したプールで60秒間動物を泳がせたプローブ試行は12回目及び24回目の試行の24時間後に行い、動物がプラットフォームの位置を横断した回数を記録した。この方法では動物のプラットフォームについての知識のより正確な測定が得られることが多く、遊泳速度のような能力因子による混乱がより少ない。２回目のプローブ試行において９月齢の導入遺伝子陽性マウスは同年齢の導入遺伝子陰性マウスと有意に異なっていたが(p＜0.05)、２月齢及び６月齢の動物ではいずれのプローブ試行においても違いが見られなかった。 12〜15月齢のN2世代導入遺伝子陽性マウスを水迷路で再試験すると(迷路外の手掛かりを再配置した後)、５回目の試行ブロックの後の脱出潜伏期及び６回目及び９回目の試行ブロックの後に行われたプローブ試行において、動物の能力は導入遺伝子陰性同腹子と比較して有意に低下していた(図16c)。これらのデータは、N1世代導入遺伝子陽性マウスに見られた年齢と相関する学習障害は、SJL株の遺伝子がさらに希釈されていることにもかかわらず起こり得ることを示している(図16c)。導入遺伝子陽性N2マウスの脱出潜伏期はそれらの導入遺伝子陰性同腹子よりも有意に長いが、同年齢のナイーブ動物よりはやはり短いことに注意されたい。従って、十分に訓練した年齢の高いマウスは若いマウスと同様によく泳げるので、年齢の高い導入遺伝子陽性マウスにおける脱出潜伏期の欠損は水泳の困難性から生じた結果ではないと思われる。年齢の高い導入遺伝子陽性マウスの能力は感覚あるいは運動機能障害によるものである可能性があるので、水迷路の可視的なプラートホームを使用したもので９月齢マウスの試験も行った(図16b)。脱出潜伏期の違いは４日のトレーニング日の２日目及び４日目において明らかであるが、１日目においては違いはない。これらのデータは、より年齢の高い導入遺伝子陽性マウスは全身認識機能障害を示し得るが、いずれも比較的ナイーブな場合は対照と同様な能力を有し得ることを示唆している。また、導入遺伝子陽性及び導入遺伝子陰性の９月齢マウスの運動能力を、プローブ試行の間に各動物が４つのそれぞれの４分の１の部分に位置する想像上のプラットフォームを横断した回数の合計数をスコアとして記録することによって比較した。プローブ試行の間に機能障害を受けたマウスが正常に泳ぐがランダムなパターンである場合、機能障害を受けていない動物と同じ回数だけ全ての４つの４分の１部分の中心を横断するはずであり、標的のプラットフォームを単に横断する回数はより少なくなる。一方、動物が泳がないことからプローブ試行において能力が低下している場合は、プラットフォーム横断の総回数はより少なくなる。実際には、導入遺伝子陽性マウス(24.4±8.7:平均±SEM)及び導入遺伝子陰性マウス(29.5±1.4)のプラットフォーム横断の合計数は有意には異ならず、運動障害は水迷路における劣った能力の原因ではなかったことを示している。行動試験の後、マウスの各群のサブセットを屠殺した。一方の大脳半球は大脳皮質Aβ測定のために凍結し、もう一方の大脳半球は組織病理学的分析のために浸漬固定した。全ての脳を定められた手法により分析した。これまでに記載されたBan-50/Ba-27あるいはBan-50/Bc-05ELISAシステムのいずれかを使用したAβ1- 40及びAβ1-42(43)の測定(Suzukiら、Scjence264:1335-1340(1994);Gravinaら、 .lournal of Biological Chemjstry 270:7013-7016(1995))によリ、最も若い(2 〜8ヶ月)導入遺伝子陽性動物及び最も年齢の高い(11〜13ヶ月)導入遺伝子陽性動物の間で、Aβ1-40レベルの５倍の上昇(p=0.03、ランク合計試験)及びAβ1-42(4 3)レベルの14倍の上昇(p=0.03、ランク合計試験)が示された (表７)。このように、導入遺伝子陽性マウスの最も年齢の高い群において有意に上昇したAβレベルと記憶及び学習欠損との間に良好な相関関係が見られた。Ａβ沈積は、β(1-5)(Saidoら、J．Biol．Chemistry 269:15253-15257(1994)) 、β(1-17)(Kimら、Neuroscience Research Communicatjons 7:113-122(1990)) 、β(17-24)(Kimら、Neurosci.Res.Commun.2:121-130(1998))、β(34-40)(Makら、Brain Research 667:138-142 (1994))、β42/43(Yangら、Neuroreport 5:2117 -2120 (1994))及び遊離のβ42(Harigayaら、BBRC211:1015-1022(1995))を認識する抗体に対して免疫反応性を有する。隣接する切片において複数の抗体により同じプラークが容易に同定され、予備免疫あるいは非特異的腹水では観察されず、免疫反応性は関連するペプチドによる予備吸着により除去された(図17)。沈積は調べた年齢の高い導入遺伝子陰性あるいはより年齢の低い導入遺伝子陽性もしくは陰性マウスに見られなかった。緻密なアミロイドコアを有する古い老年性のプラークと拡散沈積の両方が存在した。沈積は、ELISAアッセイにより上昇したAβ を示す３匹のマウスの全てにおいて、前頭部、側頭部及び内側嗅領皮質、海馬、前海馬台、海馬台、及び小脳において見られた。緻密なアミロイドプラークは皮質、海馬台及び前海馬台においてもっとも頻繁に見られた。緻密なアミロイド沈積はチオフラビンS蛍光により容易に検出され、通常はコンゴーレッドでも標識され古典的なアミロイドの特徴的な黄緑色の複屈折を与える(Puchtlerら、J．Hj stochem．Cytochem．10:355-363(1962))。いくつかの小さい沈積は、AD脳に見られるアミロイドコアの「マルティーズクロス(Maltese cross)」サインパターンを有していた。高倍率下においては、チオフラビンS及びコンゴーレッド陽性アミロイドプラークは、多くの場合神経膠星状細胞及びミクログリア形態の両方を有するグリア核により環状になった中央部の塊から放射状に伸びる小束あるいは繊維を通常示した。GFAP免疫反応性神経膠星状細胞はアミロイド沈積と関連していた。Gallyas銀法での染色によリ緻密なコアプラークを囲む異栄養性神経突起が明らかになった。散発性のAD脳とは対照的に、β１及び遊離のβ42及びβ(34-40)の両者に対する抗体（これはx-40を優先的に認識する）は沈積の大部分を標識した。これは、 x-42のパーセンテージを増加させる717変異とは異なり、β１部位における切断を大幅に増加させ、β１エピトープで始まる全ての断片の高いレベルを生じるβ APP670/671変異を反映したものであり得る(Suzukiら、Science 264:1335- 1340(1994);Citronら、Nature 360:672-4(1992))。我々の結果は、ADにおいて見られたものに似た粗暴な行動及び病理学的特徴の両者を有するトランスジェニックマウスの作製の実現可能性を示している。空間参照あるいは空間交替学習及び記憶タスクにおいて有意な欠損を示さない９月齢よりも若いTg2576マウスはAβの中程度のレベルを示し、アミロイドプラークを示さなかった。学習及び記憶の障害は、９月齢より年齢の高いマウスにおいて明確になり、Aβの顕著に増加したレベルに相関し、多数のアミロイドプラーク及びAβ沈積を伴った。Aβレベルの上昇は、トランスジェニックβAPP発現の上昇により説明できず、これは年齢とともには変化しなかった。Aβ1-42(43)レベルはAβ1-40レベルよりもさらに劇的に上昇した。興昧深いことには、これは、血清及び培養繊維芽細胞中でAβ1-40よりもAβ1-42(43)がより有意な上昇を示すプレセニリン１及びプレセニリン２変異を有するヒトにおける知見と似ている(S． Younkin、未刊行のデータ)。学習及び記憶試験における個体の能力をAβレベル及びアミロイド沈積の程度に相関させる研究が、各パラメーターの行動欠損への貢献を確認するために現在進行中である。確固とした細胞外Aβ沈積を有するトランスジェニックマウスを作製しようとする初期の試みは、Games及びその共同研究者により報告されたマウス(Gamesら、Nature 373:523-527(1995))を除いて殆ど成功していなかった。そのマウスにおけるβAPP発現はPDGFプロモーターにより誘導されたものである。我々の研究は、PrPプロモーターもAβ沈積を有するトランスジェニックマウスを生成するのに使用できることを示している。PDGF及びPrPプロモーターの両方が主として大脳及び小脳のニューロンにおいてβAPP発現を誘導する。明らかに、V717Fと同様に、豊富なプラーク沈積を促進することにおいてK670N-M671Lを有するβAPP変異体が有効である。Games及びその共同研究者及びQuon及びその共同研究者のマウス(Quonら、Nature 352:239-41 (1991))はKPIドメインを含むβAPPを多量にかつそれのみを発現する。我々は、KPIドメインを欠くβAPP導入遺伝子もマウスにおいてアミロイドプラークを発生させることができることを示した。これらのトランスジェニックマウスは、上昇したAβレベル及び緻密なアミロイドコアを有する古典的な老年性プラークの出現に関連する学習及び記憶の欠損を発生させることにおいてユニークである。これらのマウスにおける学習及び記憶の欠損が、脳Aβレベルの上昇及びアミロイド沈積により発生するのか、あるいは単に相関しているだけなのかどうかは未解決のままである。これらのトランスジェニックマウスにおいて、行動変化、生化学的変化及び組織学的変化の時間的相関関係を微妙に調整することにより、この基本的な問題に対する回答が得られる可能性がある。これらのマウスの価値は、それらが学習及び記憶の欠損、上昇したAβレベル及びアミロイドプラークを相関して現わすことにあり、ADの電気生理学、病理生理学、生化学、遺伝学、及び神経生物学を研究する新たな機会を与えるものである。実施例９進行性神経疾患を防止する薬剤の試験本発明の動物を使用して、試験物質の進行性神経疾患の発症に対する保護を付与する能力を試験する。進行性神経疾患を示す動物を試験物質で処理し、同時にその神経疾患を示す未治療トランスジェニック動物を対照とする。処理された動物におけるその進行性神経疾患の相対的に低い発症率が保護を示すものとして検出される。処理及び未処理動物を、減少した探索/運動行動(CI試験、実施例６参照)並びに減少した2-デオキシグルコース取り込み/利用及び脳の皮質-辺縁構造における肥大性グリオーシスについて分析する。処理が疾患の発症を予防しあるいは遅延させ得るかどうかを調べるため、神経疾患を発症することが判っているマウスの系統からの同腹子のトランスジェニックマウスの半分をランダムに治療を受けるものに割り当て、他の半分をプラセボの投与を受けるものに割り当てることができる。これは所与のマウスの系統について知られる最も早い疾患の発症より前の年齢において開始する。使用する同腹子の数は処理及び未処理マウスの間で観察される差違の大きさに依存する。マウスは毎日観察する。その診断はCI試験を使用することにより容易化され( 実施例６参照)、これは実験群に対してブラインドとされた個人により１週に３回行われる。生存曲線及び疾患発症及び死亡の平均年齢を蓄積された臨床データから計算する。実験及び対照群におけるサンプルで神経病理学的試験及びグルコース取り込み試験を行うことにより臨床結果を補強する。神経膠線維性酸性タンパク質に対する抗体を使用した免疫組織学的試験においてグリオーシスを評価する。グルコース取り込み試験は、Chmielowskaら、(1986)Exp．Brain Res．63:607により記載されたSokoloff法を改変したものを使用して行う。処理によって疾患を緩和または治療し得るかどうかを調べるため、病気の同腹子をランダムに対象の処理を受けるものと生理食塩水のプラセボを受けるものとに割り当てる。神経病理学的試験及びグルコース取り込み試験と合わせてCI試験における生存及び臨床的改善を上記のようにして確認する。実施例10 進行性神経疾患を治療する薬剤の試験本発明の動物を使用して、試験物質の進行性神経疾患を改善または治療する能力を試験する。進行性神経疾患を示す動物を試験物質で処理し、同時にその神経疾患を示す未治療トランスジェニック動物を対照とする。相対的に遅い死亡、あるいは疾患の神経行動的、病理学的あるいは機能的指標の改善が保護の指標として検出される。処理及び未処理動物を、減少した探索/運動行動並びに減少した2 -デオキシグルコース取り込み/利用及び脳の皮質-辺縁構造における肥大性グリオーシスについて分析する。上記の結果により示されるように、変異体あるいは本来のアミロイド前駆体タンパク質を内在レベルよりも高レベルで含む非ヒト哺乳動物における臨床的及び病理学的知見は、アルツハイマー病のような進行性神経疾患を有するヒトにおけるものと、予測できないが顕著な相似を示す。罹患したトランスジェニックマウス及びヒトにおける新皮質の関与する領域は類似している。さらに、大脳皮質の感覚運動領域におけるグルコース取り込みはトランスジェニックマウスにおける神経疾患によっては影響を受けなかった。これは、初生新皮質と連合新皮質の混合ではなく、主として初生新皮質を示すサンプリングされたマウス新皮質の唯一の領域である。アルツハイマー病の患者の脳においては初生新皮質は連合皮質と比較して神経病理学的知見を比較的有していないということは周知の観察であるトランスジェニックマウスのCNS表現型は、同じFVB株の年齢の高い非トランスジェニックマウスの一部のCNS表現型に極めて類似している。海馬神経膠星状細胞グリオーシスにおけるグリオーシスは、年齢の高い記憶欠損ラットの海馬形成 (Landfieldら、(1977) J．Gerontology 32:2-12)及び年齢の高いヌードマウス(M andyburら、(1989)ActaNeuropathol．(Brel.)77:507-513)において特徴的に見られるものである。罹患トランスジェニックマウス及び年齢の高い障害非トランスジェニックマウスの両者における部分的領域のグルコース代謝低下は、海馬、大脳皮質、及び小脳肩桃において顕著に減少し、ADのヒトにおいて起こるグルコース代謝低下(de Leonら、(1983)Am．J．Neuroradiology 4:568-571)、及び年齢の高い障害Sprague-Dawleyラットの近縁系の限定された領域において起こるグルコース代謝低下(Gageら、(1984) J．Neuroscience 11:2856-2865)のパターンに類似するものである。トランスジェニック動物により示される神経疾患及び同じ株のより年齢の高いマウスにおいて天然に起こる疾患における顕著な類似性は、これらのトランスジェニックマウスをアルツハイマー病を含む脳の進行性老化疾患のモデルとして使用することを支持するものである。神経疾患により死亡した動物は、海馬、小脳扁桃、及び大脳皮質のいくらかの領域で肥大性グリオーシスを示した。トランスジェニックマウスにおけるHuAPP の免疫組織学的マッピングは脳全体にわたる広範な発現を示した。しかし行動異常は、神経膠病理及び選択前脳領域に見られたグルコース利用低下の範囲を限定された領域に対応していた。これらのトランスジェニックマウス及びアルツハイマー病における脳の皮質辺縁領域（海馬、小脳扁桃、及び大脳皮質のいくらかの領域）における標的細胞特異性の顕著な類似性は、これらのトランスジェニックマウスをアルツハイマー病等の進行性神経障害のモデルとして使用することを支持するものである。要約すると、これらのトランスジェニックマウスはAPPを内在レベルよりも多く発現する。神経疾患を発症するマウス系統において、内在的なレベルの少なくとも200％、あるいはこれまでの文献に報告されたものの２倍を越えるAPP導入遺伝子産物発現が得られた。より重要なことは、これらのマウスが明確な進行性神経障害を有することである。他のトランスジェニックマウスにおいてAPP発現が得られた場合でも、それらは脳の皮質-辺縁領域に影響する進行性疾患を発症しないものであった。野生型及び変異体ヒトまたはマウスβAPP695を過剰発現するトランスジェニックマウス(FVB/N)は、FVB/Nマウスの天然の老化障害を促進したものに類似する、体性感覚-行動領域を残す脳の皮質-辺縁領域が関与する中枢神経系障害を発生する。βAPPを発現するトランスジェニックマウスの表現型に影響を及ぼすパラメーターには、宿主株、βAPP一次構造、βAPP発現のレベル等がある。ヒトK670N-M671Lアルツハイマーβ-アミロイド前駆体タンパク質(βAPP )の695-アミノ酸イソ型を過剰発現するトランスジェニックマウスは、３月齢において空間参照及び交替タスクで正常な学習及び記憶を有するが、9〜10月齢で障害を示す。Aβ1-40の５倍の増加及びAβ1-42(43)の14倍の増加がこれらの行動欠損の出現に伴った。上昇したAβレベルを有するマウスの皮質及び辺縁構造において多数の親コンゴー性のAβプラークが存在した。アルツハイマー病(AD)を暗示する行動的、生化学的、及び病理学的異常の相関的な出現は、マウスにおけるADの病理生理学及び神経生物学を探索する新たな機会を与える。本明細書に挙げた全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物あるいは特許出願がそれぞれについて個々に引用により本明細書の一部とするとしたのと同等な範囲で、引用により本明細書の一部とする。これで本発明を十分に説明するものであるが、添付の請求の範囲の概念及び範囲を越えることなく本発明に多くの変更及び改変を加えることが可能なことは当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボルチェルト，デビッド，アール. アメリカ合衆国 21286 メリーランド州, ボルチモア，スティーブンソンレーン 723 (72)発明者シソディア，サングラム，エス. アメリカ合衆国 21212 メリーランド州, ボルチモア，オールドトレイル 416

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、記憶および学習テストにおいて該動物に損なわれた成績をもたらし、かつ該動物の脳の皮質-近縁系領域に異常な神経病状を誘導するに十分な量のアミロイド前駆体タンパク質発現を該動物の神経組織中に含み、但し、該損なわれた成績および該異常な神経病状とは対照動物と比較してのものである、前記動物。２．前記アミロイド前駆体タンパク質発現が、対照動物における内因性アミロイド前駆体タンパク質の発現の少なくとも約２倍である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。３．前記異常な神経病状がチオフラビンＳ陽性アミロイド斑である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。４．前記アミロイド前駆体タンパク質が突然変異体アミロイド前駆体タンパク質遺伝子由来のコード配列によってコードされる、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。５．前記突然変異体アミロイド前駆体タンパク質遺伝子がコドン717突然変異体以外のものである、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。６．前記コード配列が実質的にスプライス部位を含まない、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。７．前記コード配列が実質的にクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含まない、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。８．前記哺乳動物が齧歯類である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。９．前記齧歯類がマウスである、請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 10．前記マウスの非トランスジェニック先祖がマウスの他の系統に較べてより長い寿命を有する系統に由来する、請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 11．前記発現が、前記アミロイド前駆体タンパク質をコードするコード配列に機能しうる形で連結されたプリオンタンパク質遺伝子に由来する調節配列を用いて得られる、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 12．請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の子孫。 13．アルツハイマー病の症状を改善する作用物質をスクリーニングする方法であって、該作用物質に接触させた第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と該作用物質に接触させていない第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物との記憶および学習テストの成績を比較することを含み、但し、該第１および該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は神経組織中にアミロイド前駆体タンパク質を、該記憶および学習テストの成績を対照哺乳動物と比較して損なうに十分な量で発現し、それにより、該症状を改善する作用物質は、該第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して優れた該記憶および学習テストの成績を示すことによって同定される、前記方法。 14．アルツハイマー病の治療に有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、：該作用物質に接触させた第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と該作用物質に接触させていない第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物との記憶および学習テストの成績を比較し、但し、該第１および該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は神経組織中にアミロイド前駆体タンパク質を、該記憶および学習テストの成績を対照哺乳動物と比較して損なうに十分な量で発現し；そして該第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して優れた該記憶および学習テストの成績を示す場合は、該第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物との脳の皮質-近縁系領域における神経病状を比較し、それによって、アルツハイマー病の治療に有効な作用物質は、該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較した場合に該第１のトランスジェニックヒト非ヒト哺乳動物において神経病状の所見が減少することによって同定される；ことを含んでなる、前記方法。 15．前記の減少した神経病状の所見が以下のものから成る群より選択される１以上の所見である、請求項14に記載の方法：チオラビンＳ陽性Ａβ沈積物の数の減少；チオフラビンＳ陽性Ａβ沈積物の量の減少；前記脳の皮質-近縁系構造体における肥大性神経膠症の減少；前記脳の皮質-近縁系構造体における2-デオキシグルコース取り込みの減少の軽減；前記脳の皮質-近縁系構造体における2-デオキシグルコース利用の減少の軽減。 16．アルツハイマー病の治療に有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、：該作用物質に接触させた第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と該作用物質に接触させていない第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物との記憶および学習テストの成績を比較し、但し、該第１および該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は神経組織中にアミロイド前駆体タンパク質を該記憶および学習テストの成績を対照哺乳動物と比較して損なうに十分な量で発現し；そして該第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して優れた該記憶および学習テストの成績を示す場合は、該第１および該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の死亡年齢(age o f death)を比較し、それによって、アルツハイマー病の治療に有効な作用物質は、該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較した場合に、該第１のトランスジェニックヒト非ヒト哺乳動物において死亡年齢が高くなることによって同定される；ことを含んでなる、前記方法。 17．アルツハイマー病の症状を改善する作用物質をスクリーニングする方法であって、該作用物質に接触させた第１のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と該作用物質に接触させていない第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物との探索(exploratory)行動または移動行動を比較することを含み、但し、該第１および該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は神経組織中にアミロイド前駆体タンパク質を、該探索行動または移動行動の遂行能力を対照マウスと比較して損なうに十分な量で発現し、それによって、該症状を改善する作用物質は、該第２のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較した場合に該第１のトランスジェニックヒト非ヒト哺乳動物において探索行動または移動行動があまり損なわれていないことによって同定される、前記方法。 18．前記探索または移動行動がコーナーインデックステスト(corner index test )を用いて評価される、請求項17に記載の方法。 19．前記マウスの非トランスジェニック先祖がＦＶＢ、Swiss WebsterおよびC57 B6からなる群から選択される系統に由来する、請求項17に記載の方法。 20．前記アミロイド前駆体タンパク質がK670N-M671Lアミロイド前駆体タンパク質遺伝子由来のコード配列によってコードされる、請求項17に記載の方法。