JP2004505608A - 機能的に活性なガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の単離およびその活性およびインヒビターの検出法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ガンマ−セクレターゼ基質の開裂を触媒する単離した機能的に活性なタンパク質を提供する。単離したタンパク質の機能的活性は、単離した該タンパク質がガンマ−セクレターゼを含むことを示唆している。一つの態様において、単離したガンマ−セクレターゼタンパク質はPS1と会合している。本発明はまた、ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の開裂をモニターする均一法にも関し、該方法では開裂産物を単離および回収する工程が省略される。開裂の検出は、蛍光付加物の対をガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合させることにより行うことができる。好ましくは、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に結合して未開裂のβAPPや他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応せず、一方、第二の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントのアミノ末端領域内の部分に結合する。ガンマ−開裂βAPPフラグメントへの結合は、両付加物間での蛍光エネルギー移動をモニターすることにより決定する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、一般に、アルツハイマー病の顕著な特徴である斑アミロイド沈積物(plaque amyloid deposits)の分野に関する。とりわけ本発明は、ガンマ−セクレターゼ(gamma−secretase)活性を有する、単離した、機能的に活性なタンパク質に関する。ガンマ−セクレターゼ活性はアミロイドの産生に必要である。本発明はまた、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質を含む膜内在(integral−membrane)タンパク質およびタンパク質複合体の単離方法、およびガンマ−セクレターゼ活性の検出のためのアッセイにも関する。
【0002】
(背景技術)
アルツハイマー病は脳内の神経病理学的障害を特徴とし、大脳皮質および辺縁系皮質中の細胞外アミロイド斑およびニューロン内の対合した螺旋フィラメント(intraneuronal paired helical filaments)および神経細線維もつれを特色とする。一般に、アルツハイマー病は年配者の疾患であり、罹患率は60歳を過ぎると急激に上昇する。しかしながら、アルツハイマー病の早期の発病もわずか40〜50歳の患者で認められ、しばしば家族性のアルツハイマー病(FAD)と関連付けられている。
【0003】
両タイプのアルツハイマー病の経過は同じであると思われる。血管および斑のアミロイド沈積物の主要なタンパク質性成分は、βAPPのタンパク分解的開裂によって生成されるAβ−42ペプチドである。Aβ−42ペプチドがアルツハイマー病の病因において本質的役割を果たしているとの仮説を支持する多大な証拠がある。βアミロイド前駆体タンパク質(βAPP)からのAβの生成にはアルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼと称する3つの異なるプロテアーゼ活性が関与しており、βAPP、およびPS1およびPS2と称する2つの異なるプレセニリン中の変異によって変わる。
【0004】
今日ではβAPP(Kang, J.ら、1987 Nature 325: 733−736)、PS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)およびPS2(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977)についてヌクレオチド配列が決定されている。ベータ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードする候補ヌクレオチド配列(Vassar, R.ら、1999 Science 286: 735−741; 米国特許第5,744,346号および同第5,942,400号)、および候補アルファ−セクレターゼ分子(Lammich, S.ら、1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3922−3927)が同定されている。ガンマ−セクレターゼの単離配列は未だ解明されていない。
【0005】
成熟βAPPタンパク質は、細胞質膜、ゴルジ装置および小胞体に認められる膜内在性タンパク質である。βAPPは、大きな細胞外N末端ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび小さな細胞質内C末端テールを有する細胞表面レセプターと類似している(Kang, J.ら、1987上掲)。βAPP mRNAのスプライス変異体は、770、750および695アミノ酸のβAPPポリペプチドをコードしている。これら全ての形態のβAPPは開裂領域を含んでおり、アミロイド原性(amyloidogenic)のAβペプチドを生じ得る。正常な細胞では、βAPPは、アルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼが関与する2つの異なる連続的な開裂経路のうちの一つを受ける(Dovey, H. F.ら、1993 Neuroreport 4: 1039−1042; Selkoe, D. J.ら、1994 Ann. Rev. of Cell Biol. 10: 373−403; Asami−Odaka, A.ら、1995 Biochemistry 34: 10272−10278)。
【0006】
一つの開裂経路では、アルファ−セクレターゼがβAPPを細胞外の膜/近位ドメイン(たとえば、770アミノ酸形態のβAPPのアミノ酸残基687のC末端側)で開裂して可溶性のN末端フラグメント(たとえば、アルファ−sAPPフラグメント)と膜に結合したC末端フラグメント(たとえば、9kD CTFまたはC83 CTF)を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したCTFを膜結合ドメイン内で開裂して、p3フラグメント(たとえば、3kDフラグメント)および6kDのC末端フラグメントを生成する。
【0007】
他の開裂経路では、ベータ−セクレターゼがβAPPを細胞外の膜/近位ドメイン(たとえば、770アミノ酸形態のβAPPのアミノ酸残基671のC末端側)で開裂して可溶性のN末端フラグメント(たとえば、100kD NTFまたはベータ−sAPPフラグメント)と膜に結合したC末端フラグメント(たとえば、11kD CTFまたはC 100 CTF)を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したCTFを膜結合ドメイン内で開裂して、p6フラグメント(たとえば、6kDフラグメント)およびAβペプチド(たとえば、4kDフラグメント)を生成する。
【0008】
ガンマ−セクレターゼ開裂領域のアミノ酸配列は知られている(Duffy, C. L.ら、1988 Brain Res. 474: 100−111; Castano, E. M.およびFrangione, B. 1988 Lab. Invest. 58: 122−132)。ガンマ−セクレターゼは開裂領域内の様々な部位で開裂して(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993 Cell 75: 1039−1042)不均一なC末端を有するAβペプチドの集団を生成する。通常の患者ではAβペプチドは2つの主要な形態、すなわち大多数のAβ−40形と少数のAβ−42形(それぞれ異なるCOOH末端を有する)で認められる。最も一般的な形態のFADの患者は、42形の量の増大を示す。Aβ−40形はアミロイド斑の早期の沈積と関連していない。対照的に、Aβ−42形は早期かつ主として実質斑(parenchymal plaques)中に沈積し、Aβ−42がFAD患者でのアミロイド斑沈積において主要な役割を果たしているとの強力な証拠がある(Roher, A. E.ら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10836; Iwatasubo, T.ら、1994 Neuron 13: 45; Yamaguchi, H.ら、1995 Amyloid Int. J. Clin. Invest. 2: 7−16; Mann, D. M.ら、1996 Am. J. Pathol. 148: 1257)。
【0009】
一般に、同じガンマ−セクレターゼ酵素が40形および42形を生成すると考えられてきた。当該技術分野の研究者は相反する結果を報告しているため、今日でもこの問題は解決されていない。たとえば、2つの研究グループはそれぞれ独立に、ある種のプロテアーゼインヒビターがAβ−42レベルを選択的に低下させることを示唆するインビトロの結果を報告しており、Aβ−40およびAβ−42が2つの異なるガンマ−セクレターゼによって生成されると結論付けている(Citron, M.ら、1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 13170−13175; Klafki, H.−W.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 28655−28659)。第三の研究者のグループは、一連のプロテアーゼインヒビターがAβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドの分泌を抑制する相対的な能力を比較し、Aβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドが単一のプロテアーゼによって産生されるという反対の結論に到達した(Durkin, J. T.ら、1999 Journal of Biological Chemistry 274: 20499−20504)。
【0010】
Aβ−40形およびAβ−42形は広範囲の様々な細胞/組織で構成的に分泌され、生物学的流体中では可溶形態で見出されるため(Seubert, P.ら、1992 Nature 359: 325 375; Shoji, M.ら、1992 Science 258: 126−129)、FAD患者においてAβペプチドの両形態を充分に分析することが可能である。FAD患者の中には血清のAβ−42ペプチドレベルが上昇している者がある(Scheuner, D.ら、1996 Nat. Med. 2: 864−870)。FAD患者で認められるβAPP、PS1またはPS2遺伝子における変異が、βAPPタンパク質の開裂を変化させてAD−42ペプチドの相対量を増加させることが知られている(Tomita, T.ら、1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2025−2030; Duff, K.ら、1996 Nature 383: 710−713; Borchelt, D.ら、1996 Neuron 17: 1005−1013; Citron, M.ら、1997 Nat. Med. 3: 67−72)。
【0011】
βAPP遺伝子の点変異は、βAPP−ロンドン、βAPP−フラマン、およびβAPP−スウェーデンなどの比較的少数のFAD家系と連鎖している(Goate, A. M.ら、1991 Nature 349: 704−706; Chartier−Harlin, M. −C.ら、1991 Nature 353: 844−846; Murrell, J.ら、1991 Science 254: 97−99; Karlinsky, H.ら、1992 Neurology 42: 1445−1453; Mullan, M.ら、1992 Nature Genetics 1: 345−347)。PS2遺伝子の点変異はまた、少数のFADの症例と連鎖している(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977; Rogaev, E. I.ら、1995 Nature 376: 775−778)。FADの症例の大部分はPS1遺伝子の点変異によって引き起こされ(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)、それゆえAβ−42ペプチドの選択的な増大という結果となる(Scheuner, D.ら、1996上掲)。
【0012】
PS1およびPS2は膜内在タンパク質であり、6または8の膜貫通ドメインを有し(Doan, A.ら、1996 Neuron 17: 1023−1030; De Stooper, B.ら、1997 上掲)、小胞体、初期ゴルジ(early Golgi)、およびおそらく細胞表面に位置している(Xia, W.ら、1998 Biochem. 37: 16465−16471; Kovacs, D. M.ら、1996 Nature Med. 2: 224−229; Rayら、1999 J. Biol. Chem. 274: 36801−36807)。これらプレセニリンタンパク質は63%の配列同一性を有する。
【0013】
PS1が未解明の(elusive)ガンマ−セクレターゼであるかもしれないとの仮説がなされている。この仮説を支持する証拠としては、PS1を欠くマウスからの細胞が産生するAβペプチドレベルが有意に低減しているという観察が挙げられ、このことはPS1がガンマ−セクレターゼ活性を容易にするうえで何らかの役割を果たしていることを示している(De Stooper, B.ら、1997 上掲)。とりわけ、PS1がガンマ−セクレターゼ活性を有する自己賦活化した(autoactivated)アスパルチルプロテアーゼであるとの仮説がなされている(Wolfe, M. S.ら、1993 Nature 398: 513−517)。この仮説は、PS1の膜貫通ドメイン内に存在する2つのアスパラギン酸残基が、PS1およびガンマ−セクレターゼ活性のエンドタンパク分解プロセシングに必要であるという知見に基づいている(Wolfe, M. S.ら、1999上掲)。
【0014】
アスパラギン酸残基257のアラニンへの点変異およびアスパラギン酸残基385のアラニンへの点変異はPS1のエンドタンパク分解を抑制し、C100フラグメントおよびC83βAPPフラグメントの蓄積を引き起こしたが、このことはこれらアスパラギン酸残基がガンマ−セクレターゼ活性に特に必要であることを示唆している。同様の結果は、対応するアスパラギン酸残基の点変異を含む変異体PS2タンパク質で報告されている(Kimberley, W. T.ら、2000 J. Biol. Chem. 275: 3173−3178)。それでもPS1またはPS2が直接βAPP基質の開裂を触媒するとの証拠はない。さらに、PS1およびPS2は既知のプロテアーゼおよびアスパルチルプロテアーゼとの配列および構造上の類似性を有しない。
【0015】
他の仮説は、PS1がβAPP開裂経路の制御補助因子として機能することを示唆している(De Stooper, B.ら、1997 上掲; Wolfe, M. S.ら、1999 Nature 398: 513−517)。この仮説の支持は、PS1がSREBP開裂活性化タンパク質(SCAP)と構造上の類似性を有するとの観察によるものであり、このSREBP開裂活性化タンパク質(SCAP)もまた6〜8の膜貫通ドメインを有する膜内在タンパク質であり、SREBPの開裂を制御するうえで役割を果たしている(Hua, X.ら、1996 Cell 87: 415−426; Brown, M. S.およびGoldstein, J. L. 1997 Cell 89: 331−340; Sakai, J.ら、1997 J. Biol. Chem. 272: 20213 20221)。
【0016】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの仮説された役割は、βAPP様タンパク質であるAPLP1タンパク質(Wasco, W.ら、1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10758−10762)のC末端開裂産物がPS1を欠く原発(primary)ニューロンに蓄積する(Naruse, S.ら、1998 Neuron 21: 1213−1221)という事実によってさらに錯綜したものとなっている。この結果を説明する一つの仮説は、PS1がβAPPおよびAPLP1タンパク質の開裂の結果生じるC末端フラグメントの細胞内輸送を変調させるというものである(Naruse、上掲)。
【0017】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割として考えられるものはまた、βAPPおよびβAPP様タンパク質以外のタンパク質のタンパク分解プロセシングにも及んでいる。たとえば、ノッチ(Notch)タンパク質のタンパク分解開裂にPS1の存在が必要であることが以前に決定されている(Artavanis−Tsakonas, S.ら、1996 Science 268: 225−232; Kopan, R.およびTurner, D. 1996 Curr. Opin. Neurobiol. 6: 594−601; Weinmaster, G. 1997 Mol. Cell. Neurosci. 9: 91−102)。ノッチタンパク質は脊椎動物および無脊椎動物において多くの細胞運命の決定を媒体する単一膜貫通ドメイン細胞表面レセプターである。PS1内の2つの膜貫通アスパラギン酸残基の変異は、ノッチタンパク質の開裂を抑制する(Ray, W. J.ら、1999 J. Biol. Chem. 274: 36801−36807)。S2−開裂したノッチ1タンパク質内の仮説されたガンマ−セクレターゼ開裂配列(Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)は、一般に受け入れられているプロテアーゼ開裂部位のモチーフと類似性を有しない。
【0018】
(発明の開示)
(発明が解決しようとする技術的課題)
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体を単離することによって解決することができる。一般に、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は単離手順の際にその機能的活性を失いやすいので、機能的に活性な膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を単離することは困難である。この困難は、以下に記載する種々の方法を開発することにより克服された。
【0019】
さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有する単離したタンパク質複合体を提供する。本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒する。本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、Aβ−42ペプチドを生成するプロセシング経路を担う推定ガンマ−セクレターゼであると仮定されている。
【0020】
予備的な事項として、ガンマ−セクレターゼ活性の検出には、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在または不在の信頼でき、正確かつ迅速な検出を可能にするアッセイが必要である。さらに、ガンマ−セクレターゼ活性のインヒビターが望まれる場合には、大量の被験化合物を不当なプロセシングなしに正確にスクリーニングすることがとりわけ役立つ。
【0021】
(その解決方法)
それゆえ、本発明はガンマ−セクレターゼ活性およびそのインヒビターを検出する均一法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の均一アッセイ法の発見および応用は、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の単離および回収の工程を必要とすることなく活性を検出することを可能にする。開裂産物の単離および回収のためのこれら工程の省略は、スピードおよび正確さの点で明らかな利点を提供する。さらに、本発明は、Aβまたは6kDaフラグメントの検出を含む、ガンマ−セクレターゼ活性の特異産物の検出の均一法を提供する。
【0022】
本発明は、ガンマ−セクレターゼが様々な哺乳動物細胞型の小胞体、ゴルジ装置および細胞質膜に認められる膜内在タンパク質であるという知見を提供する。
本発明は、βAPPポリペプチドなどの基質のタンパク分解開裂を触媒する単離タンパク質を提供する。機能的に活性なタンパク質複合体は、本明細書ではガンマ−セクレターゼとして、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体として記載する。本発明は、機能的に活性なガンマ−セクレターゼを含む単離した細胞不含膜画分を提供する。本発明はまた、可溶性の形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体をも提供する。
【0023】
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質をPS1とともに単離することによるガンマ−セクレターゼタンパク質の単離方法を提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ複合体などの可溶化した膜内在タンパク質またはタンパク質複合体の単離方法を提供する。
さらに、本発明は、N−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]およびCHAPSOTMを含む組成物を提供する。この新規な組成物は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の単離、再構成、基質の単離、およびガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定に有用である。
【0024】
本発明はまた、ガンマ−セクレターゼ活性の検出方法およびガンマ−セクレターゼ産物、とりわけAβの検出方法をも提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定方法を提供する。
ガンマ−セクレターゼインヒビターを同定するため、未開裂のβAPP、βAPPフラグメント、およびガンマ−セクレターゼを含有する試料に被験化合物を入れる。ガンマ−セクレターゼを活性化させ、生成するガンマ−開裂βAPPフラグメントの量に及ぼす被験化合物の影響をモニターする。β−セクレターゼがフラグメントを開裂するかまたは存在する場合でも、Aβの量をモニターすることができる。
【0025】
とりわけ本発明は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントの産生を測定することにより、流体試料中でのガンマ−セクレターゼによるβAPP基質の開裂を検出する効率的な系を提供する。この検出系は、一方から他方へ蛍光エネルギーを移転することが可能な1対の蛍光付加物を利用する。この1対の付加物を基質およびガンマ−セクレターゼ産物の標識として用いることにより、ガンマ−セクレターゼの活性をモニターすることができる。
【0026】
この結合アッセイは、各蛍光付加物を標識として同じガンマ−開裂βAPPフラグメントの異なる部位に結合させることにより行う。本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に通常のガンマ−セクレターゼ開裂の部位、すなわちアミノ酸残基711(Aβアミノ酸残基40に対応)にて特異的に結合し、一方、第二の蛍光付加物は同じガンマ−開裂βAPPフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸1〜702の部分に結合する。最も好ましくは、とりわけAβ検出をも目的とする場合には、第二の蛍光付加物はAβのアミノ酸配列1〜31に対応するアミノ酸配列内に結合する。
【0027】
場合により、第一の蛍光付加物は、代わりにβAPP、PS1またはPS2の変異に最も一般的に関連する開裂部位であるガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端のアミノ酸713(Aβアミノ酸残基42)に特異的に結合してよい。これら蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントの重複する部位に結合せず、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPのカルボキシ末端に特異的であって、未開裂βAPPに対しても他の型のガンマ−開裂βAPPフラグメントに対しても実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂は、結合した一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動を与えるときに検出される。
【0028】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出の別の態様では、これら付加物は別々の開裂産物に結合する。各蛍光付加物は、未開裂βAPP上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。この別の態様では、蛍光付加物の少なくとも一つがそのアミノ酸配列に結合し、未開裂βAPPの他の部位とは実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じる場合は蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合し、それゆえ励起後にエネルギー移動の実質的な低減という結果となる。
【0029】
術語の定義
本明細書において「単離した」とは、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体がリン脂質二重層から、および他の膜内在タンパク質およびタンパク質複合体から分離されることをいう。
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質」および「ガンマ−セクレターゼ」とは、ガンマ−セクレターゼ活性を示すタンパク質をいう。ガンマ−セクレターゼ活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ−セクレターゼ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。
【0030】
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体」および「ガンマ−セクレターゼ複合体」とは、少なくとも2つのタンパク質分子を含むタンパク質複合体であって、該タンパク質分子のうち少なくとも1つがガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒するものをいう。ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体を構成するタンパク質分子は、互いに共有結合的相互作用および/または非共有結合的相互作用で結合していてよい。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体はまた、ビタミン、ATPまたは二価カチオンなどの非タンパク質分子をも含んでいてよい。
【0031】
本明細書において「アミノ末端領域」および「カルボキシ末端領域」は、ある特定の部位(とりわけガンマ−セクレターゼの開裂部位)のいずれかの側にあるペプチド鎖の部分が、それぞれアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれに近位した側にあるかを示す参照位置として用いる。該部分は、さらに該ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端を含んでいても含んでいなくともよい。さらに、本明細書において「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は同様に参照位置として用いるが、「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は該ペプチド鎖のそれぞれアミノ末端またはカルボキシ末端を含む点で「アミノ末端領域」または「カルボキシ末端領域」とは区別される。
【0032】
本明細書において「可溶化した」とは、膜を断片化することにより膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から分離する化合物を用い、脂質二重層(たとえば、膜二重層)および他の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体から所定の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を分離することをいう。膜内在タンパク質を可溶化する典型的な方法は、リン脂質二重層を断片化して膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を与える界面活性剤などの化合物を用いることを含み、その際、該脂質二重層の化学特性を模倣した環境を用いて可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体が天然のコンホメーションに折り畳まれるようにする。それゆえ、界面活性剤の環境中にあるタンパク質またはタンパク質複合体は可溶化形態にあるタンパク質またはタンパク質複合体である。さらに、可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体は、その天然のコンホメーションにある該タンパク質またはタンパク質複合体によって示される生物学的活性を有していても有していなくてもよい。
【0033】
本明細書に記載する本発明が一層完全に理解されるべく、以下の記載を列記する。
本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質
ガンマ−セクレターゼタンパク質は、機能的に活性である場合にはガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質を開裂する。開裂は典型的に基質開裂産物という結果となる。本発明は、たとえば界面活性剤で可溶化した形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質を提供する。一つの態様において、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質はガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の成分を含む。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質と反応する抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント)を提供する。
【0034】
単離したガンマ−セクレターゼの機能的活性
本発明は、ガンマ−セクレターゼが膜内在プロテアーゼであるという知見を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を示す単離した膜画分および可溶化タンパク質複合体を提供する。
ガンマ−セクレターゼの機能的活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はβAPPなどのポリペプチド基質を開裂する。
【0035】
細胞ではガンマ−セクレターゼ複合体はβAPPをガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂してβAPP開裂産物を生成する。βAPP開裂産物としては、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるAβ−40およびAβ−42ペプチド;アルファ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるp3ペプチド;ガンマ−セクレターゼによる開裂のC末端産物であるp6ペプチド;またはそれらのフラグメントが挙げられる(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 13 Cell 75: 1039−1042において概説)。βAPPのガンマ−セクレターゼ開裂配列は知られている(Duffy, C. L.ら、1988 Brain Res. 474: 100−111; Castano, E. M.およびFrangione, B. 1988 Lab. Invest. 58: 122−132)。
【0036】
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が様々な哺乳動物細胞型の小胞体またはゴルジ体において典型的に認められる膜内在タンパク質複合体であり得るとの知見を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は細胞質膜でも認められる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり(pI<5.6)、グリコシル化されており、約700kDaの分子サイズを示す。
【0037】
ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましくはヒトなどの哺乳動物種を含む多くの種から得た細胞から単離することができる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、植物、昆虫(D. melanogasterなど)および無脊椎動物(C. elegansなど)などの種から単離できる。さらに、ガンマ−セクレターゼはガンマ−セクレターゼ複合体を含むあらゆる適当な組織または細胞(たとえば、ガンマ−セクレターゼ陽性細胞)から単離できる。たとえば、ヒトH4神経膠腫細胞、およびマウスN2A神経芽細胞腫細胞、ヒト胚性腎(HEK)293細胞、COS−1細胞、CHO細胞、およびHeLa細胞などのガンマ−セクレターゼ陽性細胞(haass, C.ら、1992 Nature 359: 322−325; Busciglio, J.ら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2092−2096)は、βAPP開裂産物(たとえば、p3ペプチド、p6ペプチド、およびAβペプチド)を産生する。
【0038】
ガンマ−セクレターゼ複合体は、Aβペプチド(40形および42形)、p3ペプチドまたはp6ペプチドなどのβAPP開裂産物の通常レベルの蓄積のような野生型の表現型を示す細胞または組織から単離できる。あるいは、ガンマ−セクレターゼ複合体は、一層高レベルのβAPP開裂産物の蓄積などの変異表現型を示す細胞または組織から単離できる。変異した組織/細胞での蓄積したβAPP開裂産物のレベルは、正常な組織/細胞採取源で認められる同開裂産物のレベルと比較すると高い。変異表現型を示す組織/細胞としては、変異形のβAPP、またはPS1もしくはPS2タンパク質を有するあらゆる種、または組織、または細胞株からの対象物が挙げられる(Tanzi, R.ら、1996 Neurobiol. Dis. 3: 159−169で概説)。
【0039】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体の成分
本発明は、タンパク質成分としてPS1やPS2などの少なくとも1つのプレセニリンタンパク質分子とともにガンマ−セクレターゼを含む単離したガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、ガンマ−セクレターゼ活性を示す少なくとも1つの他のタンパク質分子と結合したPS1またはPS2タンパク質を含む。ガンマ−セクレターゼ複合体は、ビタミン、ATP、二価カチオンまたは脂質などの非タンパク質成分と結合していても結合していなくともよい。
【0040】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、同じかまたは異なる多型形態である1を超えるPS1またはPS2分子を含んでいてよく、その結果、それぞれホモ重合性またはへテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はPS1またはPS2分子の2つの同一の多型形態を含んでいてよく、その結果、ホモ重合性のタンパク質複合体となってよい。あるいは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はPS1またはPS2の2つの異なる形態を含んでいてよく、その結果、へテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、それぞれ少なくとも1つのPS1およびPS2分子を含んでいてよい。
【0041】
本発明は、野生型、変異体またはスプライス変異形を含む、PS1および/またはPS2タンパク質分子の少なくとも1つの異なる形態を含むガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。ガンマ−セクレターゼ複合体は、野生型、変異体、またはスプライス変異形のPS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)またはPS2(米国特許第5,986,054号)を有する主体(たとえば、あらゆる種から)、組織または細胞株などの採取源から単離できる。
【0042】
膜内在タンパク質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体を含む膜画分の単離
ガンマ−セクレターゼ複合体は、膜画分の成分として単離することができる。たとえば、膜画分を単離するための常法は以下の工程を含む:細胞を回収する;該細胞を溶解して周辺膜タンパク質および膜内在タンパク質を含む細胞膜を得る;該膜を回収する;該膜を洗浄して周辺膜タンパク質を除去する;ついで洗浄した膜画分を単離する。たとえば、HeLa細胞溶解法はHeintzおよびRoeder(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2713)によって記載されており、H4細胞の溶解および膜画分の単離法はS. B. Robertsら(1994 J. Biol. Chem. 269: 3111−3116)によって記載されており、膜の洗浄はP. WalterおよびG. Blobel(1981 J. Cell. Biol. 91: 551−556)によって記載されている。
【0043】
可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法
本発明は、可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法を提供する。本発明の方法は、機能的な活性を保持しているかまたは保持していない可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。さらに、本発明の方法は、ガンマ−セクレターゼの機能的な活性を有する可溶化したタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。
本発明は、下記の一般的工程を含む方法を提供する:膜を溶液で可溶化して膜内在タンパク質、タンパク質複合体および他の細胞成分を有する混合物を得る;ついで膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する。
【0044】
好ましい方法は洗浄した膜画分を可溶化することを含む。この洗浄した該膜画分に含まれる膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から可溶化する(たとえば抽出する)。通常の抽出法(たとえば、可溶化工程)は、一般に水溶液中の両親媒性界面活性剤を用いて行う。イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤などの多くの異なる界面活性剤が市販されているが、これらはその解離作用、臨界ミセル濃度(CMC)、酵素活性に及ぼす作用、さらなる精製に及ぼす作用、および溶液からの除去の容易さが異なる。多くの異なる界面活性剤および膜タンパク質の可溶化方法は当業者に知られている(Neugebauer 1990 Methods Enzymol. 182: 239−253; Hjelmiland 1990 Methods Enzymol. 182: 252−264)。
【0045】
単離手順の際に失われ得る膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の機能的活性を保持するため、本発明の一つの態様は、N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド](これはCHAPSOTM(Pierce、ロックフォード、イリノイ)の製造の際の中間体である)を含む抽出溶液を用いた抽出法を提供する。この中間体N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]は、以下、「mCHAPSO」と称する。
【0046】
本発明は、mCHAPSOおよび市販の界面活性剤CHAPSOTMを含む溶液を提供する。好ましい溶液は、1部(容量/容量)のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。この好ましい溶液は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体の単離に有用である。
【0047】
ガンマ−セクレターゼ複合体の濃縮方法
本発明は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体を有する試料(たとえば、調製物)の濃縮方法を提供する。たとえば、単離した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を本発明の可溶化方法により調製し、ついでイムノアフィニティー濃縮、陽イオン交換または陰イオン交換、レクチン−アフィニティー、および/またはゲル濾過などの常法を用いてガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体は、典型的に比活性(一定容量のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が1分当たりに基質開裂される量として定義される)の増大を示すであろう。
【0048】
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
本発明は、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼを単離することによるガンマ−セクレターゼの試料からの単離方法を提供する。好ましい方法はイムノアフィニティー濃縮法を用いる。たとえば、イムノアフィニティー法は以下の工程を含む:試料(たとえば、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体)をプレセニリンを認識および結合する試薬と接触させて試薬/プレセニリン複合体を形成させる;ついで該試薬/プレセニリン複合体を試料から単離する。
【0049】
好ましい濃縮方法は、プレセニリンに特異的に結合する抗プレセニリン抗体(たとえば、抗PS1抗体および/または抗PS2抗体)などの試薬を用いることを含む。しかしながら、他の手段による濃縮が可能であり、当業者には明らかである(表1)。好ましい濃縮方法は、mCHAPSOを含む溶液中でプレセニリンを認識および結合する試薬に試料を接触させることを含む。好ましい溶液は、1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
【0050】
好ましい態様において本発明の方法は以下の工程を含む:プレセニリンに特異的に結合するアフィニティーマトリックスを調製する;該アフィニティーマトリックスを新規な平衡溶液を用いて平衡化する;平衡化した該アフィニティーマトリックスを、プレセニリンがアフィニティーマトリックスに結合するのを可能にする条件下でガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼ)を含む可溶化した膜内在画分と接触させる;ついで該アフィニティーマトリックスに結合しなかったタンパク質を除去してガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。さらなる工程としては、所望のタンパク質を該アフィニティーマトリックスから溶出することが挙げられる。所望のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー濃縮のための一般的な工程および条件は、Antibodies: A Laboratory Manual(Harlow, E.およびLane, D., 1988 CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)に記載されている。
【0051】
イムノアフィニティーマトリックスは、固体支持体マトリックスを選択し;ついで選択した該マトリックスにプレセニリンを認識および結合する試薬(たとえば、抗プレセニリン抗体)を付着させてアフィニティーマトリックスを生成することにより調整する。マトリックスは、プロテインAまたはプロテインGビーズ、または活性化ビーズを含む様々な市販の固体支持体マトリックスから選択することができる。使用するマトリックスの選択は、付着させる抗体に対するマトリックスの親和性に依存するであろう。たとえば、プロテインAおよびプロテインGビーズは種々の抗体に対して異なる結合親和性スペクトルを示す。
【0052】
マトリックスの抗体への付着は、直接カップリング法および高塩直接カップリング法を含む種々のカップリング法を用いて行うことができる(Gersten, D. M.およびMarchalonis, J. J., 1978 J. Immunol. Methods, 24: 305−309; Schneider, C.ら、1982 J. BIol. Chem. 257: 10766−10769)。別法は、抗体を活性化ビーズにカップリングすることを含む(Porath, J.およびAxen, R. 1976 Methods Enzymol. 44: 19−45; Scouten, W. H. 1987 Methods Enzymol. 135: 3065; Harlow, E.およびLane, D., 1988上掲)。ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための好ましいマトリックスとしては、プロテインAビーズが挙げられる。好ましいカップリング法としては、ジメチルスベリミデート(dimethyl suberimidate)を用いた直接カップリング法が挙げられる。
【0053】
マトリックスは、プレセニリンと特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその組み合わせに付着させることができる。抗PS1抗体および抗PS2抗体は、全長または断片のプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体は、天然源から単離したプレセニリンまたは組換えDNA法または化学的合成法によって合成したプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体はまた、抗プレセニリン抗体の単離および精製を容易にするためにシステインやヒスチジンなどの付加的なアミノ酸タグを有していてよい。別法として、マトリックスは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体に特異的に反応する抗体に付着させることができる。
【0054】
これら抗体は、プレセニリンへの弱い結合から堅固な結合に到る所定範囲の結合特性を示す。たとえば、マトリックスは、PS1またはPS2に結合したガンマ−セクレターゼのアフィニティー濃縮のために抗PS1および/または抗PS2ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を付着させることができる。
【0055】
一つの態様において、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼのイムノアフィニティー濃縮に用いる抗体としては、CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)(ヒトPS1のアミノ酸334−358に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのN末端システインを付加したもの)の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体(たとえば、1357)が挙げられる。他の好ましい抗体は、CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)(ヒトPS1のアミノ酸45−60に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのN末端システインを付加したもの)の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体(たとえば、1398)である。ガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮するための最も好ましいアフィニティーマトリックスとしては、1357抗体と1398抗体との混合物が挙げられる。
【0056】
他の好ましいポリクローナル抗体は、ノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)の配列を有するペプチドに対して産生させることのできるポリクローナル抗体(たとえば、SR92)である。
他の好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための抗ヒトPS1抗体の使用を提供し、該抗体としては、細菌発現したPS1フラグメント(PS1 1−77)(配列番号7)に対して産生させた精製ポリクローナルウサギ抗体であるJH2;およびPS1「ループ」−GST融合タンパク質(配列番号8)に対して産生させた精製ポリクローナル抗体であるJH5が挙げられる。イムノアフィニティーマトリックスは、低pHまたはグリシンなどのような穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にする抗体とカップリングすることができる。たとえば、1357抗体、1398抗体、JH2抗体またはJH5抗体とカップリングしたイムノアフィニティーマトリックスは、比較的穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にするであろう。
【0057】
アフィニティーマトリックスは新規な平衡溶液を用いて平衡化することができる。ガンマ−セクレターゼ複合体などの所望のタンパク質のアフィニティー濃縮のための好ましい平衡化溶液は、1部(容量/容量)のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
所望のタンパク質を含む可溶化した膜内在画分を、所望の該タンパク質とアフィニティーマトリックスとの結合を可能にする条件下でアフィニティーマトリックスと接触させる。接触工程は、懸濁液中、溶液中、またはカラム上で行うことができる。典型的には接触工程は4℃で1〜16時間行う。所望のタンパク質は、この接触工程の間にアフィニティーマトリックスに吸着または結合することができる。
【0058】
洗浄工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを洗浄溶液と接触させることを含む。好ましい洗浄溶液は非イオン性界面活性剤であるCHAPSOTMを含み、このものは膜内在画分中に存在する未結合(たとえば、未吸着)のタンパク質およびタンパク質複合体を除去する。典型的には、使用する洗浄溶液の容量は、アフィニティーマトリックスの容量の少なくとも20倍である。
【0059】
溶出工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを、所望の該タンパク質を結合させないようにする溶出液と接触させることを含む。選択する溶出液は、アフィニティーマトリックスにカップリングさせた抗体の結合特性に依存するであろう。さらに、異なる溶出液を組み合わせてまたは段階的に用いることができる。たとえば、溶出液は、高いかまたは低いpH、高い塩、イオン性界面活性剤、解離剤(たとえば尿素やグアニジンHCl)、カオトロピック剤、有機溶媒、および/または水を含んでいてよい。アフィニティーマトリックスからガンマ−セクレターゼ複合体を溶出するための好ましい溶出液は、グリシンおよびCHAPSOTMを含む低pH溶液(たとえば、pH2.5)である。
【0060】
他の濃縮方法
ガンマ−セクレターゼについて試料を濃縮する他の方法としては、PS1またはPS2に特異的に結合しない様々な方法が挙げられる。たとえば、他の方法としては、陽イオン交換クロマトグラフィー(たとえば、Mono S; Pharmacia);陰イオン交換クロマトグラフィー(たとえば、DEAEセファロースファーストフロー; Pharmacia);レクチンアフィニティー(たとえば、コムギ麦芽アグルチニンアガロース; Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー);およびゲル濾過(たとえば、スペロース6(Superose 6); Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)が挙げられる。
【0061】
一つの態様において、本発明の方法は、グリコシル化タンパク質を認識および結合する分子(たとえば、コムギ麦芽アグルチニン)に試料を接触させて分子/グリコシル化タンパク質複合体を生成させ;ついで該分子/グリコシル化タンパク質複合体を試料から除去してガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体について試料を濃縮することを含む。
【0062】
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の試料は、これら様々な濃縮方法のいずれかの組み合わせを用いてガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体について濃縮することができる。濃縮のための好ましい方法としては、可溶化した試料を陽イオン交換条件、陰イオン交換条件、レクチンアフィニティー条件、および/またはゲル濾過条件に供することが挙げられる。可溶化した画分の濃縮はガンマ−セクレターゼの単位活性によって測定されるように、様々な条件で増大した(Scopes, R. K., 1987 Protein Purification; Principles and Practice, Springer−Verlag、ニューヨーク、ニューヨーク)。たとえば、陰イオン交換条件は約2倍の濃縮という結果となり、レクチン−アフィニティー条件は約46倍の濃縮という結果となり、ゲル濾過条件は約56倍の濃縮という結果となった(表1参照)。
【0063】
これら結果は、単離したガンマ−セクレターゼ複合体の化学的および物理的性質の特性を明らかにした。たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり(pI<5.6;たとえば、陰イオン交換条件を用いた濃縮の場合)、グリコシル化されており(たとえば、コムギ麦芽レクチンに結合する)、極めて大きい(たとえば、>700kDa;たとえば、ゲル濾過により決定した場合)。
【0064】
【表1】
*=開裂した基質(フィコモル)/分/μl
**=フィコモル/分/mg
【0065】
ガンマ−セクレターゼの基質
本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するプロテアーゼによって開裂されることのできるガンマ−セクレターゼ基質(タンパク質およびタンパク質複合体である)を提供する。該基質は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列で開裂されて適当な開裂産物を生成することができる。さらに、本発明は、本発明の基質および基質の開裂産物と反応しうる抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント)を提供する。
【0066】
ガンマ−セクレターゼ開裂配列
ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂されるアミノ酸配列である。ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、以前にβAPPで同定されている(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993 Cell 75: 1039−1042で概説)(図4および配列番号10)。ガンマ−セクレターゼ基質は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体によって認識および開裂されるガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むタンパク質またはポリペプチドである。従って、ガンマ−セクレターゼ基質としては、βAPPプレタンパク質の完全長配列(Kang, J.ら、1987上掲)、成熟βAPPタンパク質の完全長配列(Kang, J.ら、1987上掲)、またはその断片が挙げられる。好ましい基質は、βAPPの膜貫通ドメインを含む。たとえば、基質は、C100 CTFやC83 CTF βAPP開裂産物などのように、膜貫通ドメインを含む完全長で成熟βAPPタンパク質の断片であってよい。好ましい基質は、C83 CTFなどのようにアルファ開裂βAPPタンパク質を模倣したものである(図3)。あるいは、基質は、C100 CTFなどのようにベータ開裂βAPPタンパク質を模倣したものである(図2)。
【0067】
さらに、ガンマ−セクレターゼは、ノッチやAPLP1などの他の膜貫通タンパク質を開裂すると仮定されている。開裂は膜にわたっているドメインのうちの細胞質側の半分で起こり(Selkoe, D. J. 1999 Nature 399 (6738補遺): A23−31; Wang, R.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 31894−31902; Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)、不均一な開裂産物を生成する(Wang, R.ら、1996上掲)。ガンマ−セクレターゼによる開裂のための基質の認識、およびおそらく利用可能性(availability)は、サイトゾル外膜フェース(extra−cytosolic membrane face)の30アミノ酸残基へのサイトゾル外ドメイン(extra−cytosolic domains)の短縮に依存している(Brown, M. S.ら、Cell 100: 391−398; Mumm, J. S.ら、2000 Molecular Cell 5: 197−206)。
【0068】
推定ガンマ−セクレターゼ開裂配列がノッチ−1タンパク質で同定されている(Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)(図5および配列番号11)。ガンマ−セクレターゼはまたAPLP1タンパク質を開裂するとも仮定されている(Wasco, W.ら、1992上掲)。好ましいガンマ−セクレターゼ基質としては、ノッチ−1タンパク質の完全長配列(Schroeter, E. H.ら、1998上掲; Mumm, J. S.ら、2000 Molecular Cell 5: 197−206)、APLP1タンパク質(Wasco, W.ら、1992上掲)、またはその断片が挙げられる。
【0069】
基質の構造
ガンマ−セクレターゼ基質はまた、βAPP、ノッチ、またはAPLP1などの基質に認められる天然のコンホメーションと類似または同一の構造に折り畳まれた膜貫通ドメインをも含む。天然のコンホメーションとは、天然に存在するタンパク質の折り畳まれた構造をいう。たとえば、膜内在タンパク質の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質の折り畳まれた構造である。同様に、膜内在タンパク質複合体の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質複合体の折り畳まれた構造である。
【0070】
基質は、それを膜様の環境が取り囲むときに天然のコンホメーションに折り畳まれることができる。たとえば、膜様の環境は、膜画分、ミクロソーム、膜内在タンパク質を可溶化するのに用いた界面活性剤により提供することができる。従って、基質は、膜画分またはミクロソーム中のタンパク質成分として、または界面活性剤で可溶化した基質として単離することができる。好ましい基質は、ミクロソーム膜により取り囲まれたポリペプチドである。さらに好ましい基質は、界面活性剤で可溶化した形態で単離したポリペプチドである。
【0071】
ガンマ−セクレターゼ基質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂され得るポリペプチド基質は、様々な方法によって生成することができる。たとえば、基質は、組織試料や細胞培養液などの天然に存在する採取源からの膜画分の成分として単離することができる(Seubert, P.上掲; Shoji, M.上掲; Haass, C.上掲; Busciglio, J.上掲)。別法として、基質は、組換えDNA法(Sambrookら、1989、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、Plainview、ニューヨーク;およびAusubel, F.ら、1989 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク)を用い、βAPP(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993上掲)、ノッチ(Schroeter, E. H.ら、1998上掲)、またはAPLP1(Kang, J.ら、1987上掲; Wasco, W.ら、1992上掲)タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および宿主−ベクター系を用いて生成することができる。
【0072】
基質はまた、ポリペプチドの合成の基礎としてβAPP、ノッチまたはAPLP1のアミノ酸配列を用いて化学合成法(Dugas, H.およびPenney, C. 1981、Bioorganic Chemistry, pp.54−92, Spring−Verlag、ニューヨーク)によっても生成することができる。基質はまた、インビトロでの転写−翻訳法(Pelham, H. R. B.およびJackson, R. J. 1976 Eur. J. Biochem. 67: 247; Krieg, P.およびMelton, D 1984 Nucl. Acids. Res. 12, 7057)によっても生成することができる。
【0073】
好ましい基質は、ミクロソーム膜や膜様の環境(たとえば、可溶化した形態)を模倣する界面活性剤などの膜様の環境に取り囲まれた形態で生成される。さらに好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜の形態で生成される。たとえば、市販のイヌ膵臓ミクロソームは内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さない(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。最も好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜から基質を可溶化する(たとえば、抽出する)ことにより生成される。
【0074】
これら方法のいずれかにより生成した基質は、検出しうるマーカーで標識することができる。検出しうるマーカーの例としては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素が挙げられるがこれらに限られるものではない。標識したポリペプチドおよびタンパク質を生成する方法は当該技術分野でよく知られている(Sambrookら、1989上掲)。
【0075】
基質をコードする組換え分子
基質は、基質またはその断片をコードする組換え分子(たとえば、rDNA)を用いて組換えDNA法により生成することができる。本明細書においてrDNA分子とは、インビトロで分子操作に供したDNA分子をいう。rDNA分子を生成する方法は当該技術分野(たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning (1989))でよく知られており、基質を生成するのに有用である。
【0076】
本発明は、基質をコードするヌクレオチド配列を有する種々の核酸分子を提供する。基質を生成する好ましい方法は、BAPPタンパク質の最後の100のアミノ酸残基のN末端にインフレームで連結したβAPPプレタンパク質からのシグナルペプチド(Kang, J.ら、1987上掲)を含むβAPP基質(図1Aおよび図2;配列番号1および2)をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、C100 C末端フラグメント(CTF)を模倣するβAPP基質をコードする。
【0077】
他の好ましい方法は、βAPPタンパク質の最後の83アミノ酸残基のN末端にインフレームで連結したβAPPシグナルペプチドを含むβAPP基質(図1Bおよび図3;配列番号3および4)をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、C−83 CTFを模倣するβAPP基質をコードする。
【0078】
基質配列を含むベクター
発現ベクターを用いて基質を生成することができる。たとえば、基質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに作動可能に連結させて組換え発現ベクターを生成することができる。
ベクターとは、プラスミド、コスミド、およびファージミドをいうがこれらに限られるものではない。好ましいベクターとしては、適当な宿主細胞内でのベクターの複製を指令するレプリコンを含む自動複製ベクターが挙げられる。好ましいベクターはまた、プロモーター配列などの発現制御配列をも含み、該配列は作動可能に連結した基質配列の転写を可能とし、大腸菌などの適当な宿主細胞中での作動可能に連結した基質配列の発現を制御するのに用いることができる(たとえば、転写および/または翻訳)。
【0079】
原核発現制御配列は当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、および他の転写制御配列が挙げられるがこれらに限られるものではない。翻訳に関与する他の発現制御配列は当該技術分野で知られており、シャイン−ダルガノ配列、および開始コドンおよび終止コドンが挙げられるがこれらに限られるものではない。さらに、開始コドンは、挿入配列全体の転写を確実にすべく正しい読取り枠になければならない。外来の転写配列および開始コドンは、様々な由来であってよく、天然および合成のいずれであってもよい。発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって促進することができる(Scharf, D.ら、1994 Results Probl Cell Differ 20: 125−62; Bittnerら、1987 Methods in Enzymol 153: 516−544)。
【0080】
好ましいベクターはまた、薬剤耐性、たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする少なくとも1つの選択マーカー遺伝子をも含む。典型的には、ベクターはまた、外来DNA配列の都合のよい挿入を可能にするマルチプルエンドヌクレアーゼ制限部位をも含む。
【0081】
好ましいベクターは、真核宿主細胞と適合する発現ベクターである。好ましいベクターは、精製した細菌またはバクテリオファージのRNAポリメラーゼとの反応でのmRNA転写物の産生のためのプロモーター配列要素を含む。真核細胞発現ベクターは当該技術分野でよく知られており、幾つかの市販のものから利用できる。そのようなベクターの典型的なものは、大腸菌で外来遺伝子を発現するのに用いるpcDNA3発現ベクターであり、ファージT7プロモーターを含み、アンピシリンおよびG418に対する耐性を付与する(InVitrogen、カールスバード、カリフォルニア)。他の例としては、容易に精製できる融合タンパク質の高レベルの発現を指令するベクターが挙げられる。そのようなベクターとしては、BLUESCRIPT(Stratagene)(基質コード配列をベクター中でアミノ末端のMetおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの7残基の配列とインフレームでライゲートしてハイブリッドタンパク質が産生されるようにする);pINベクター(Van Heeke & Schuster 1989 J Biol Chem 264: 5503−5509)などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられるがこれらに限られるものではない。
【0082】
pGEXベクター(Promega、マジソン、ウイスコンシン)もまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造するタンパク質は、目的とするクローニングポリペプチドを随意にGST残基から放出できるように、ヘパリン、トロンビンまたは第XA因子プロテアーゼ開裂部位を含ませるようにデザインする。
【0083】
基質を生成するのに用いる宿主−ベクター系
宿主−ベクター系を用いて基質を生成することができる。宿主−ベクター系としては、基質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを導入した適当な宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。たとえば、多くの市販の大腸菌株がとりわけ外来タンパク質の発現に有用である。適当な真核宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの動物細胞が挙げられる。
【0084】
さらに、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を変調する能力または所望の仕方で発現タンパク質をプロセシングする能力により選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加(lipidation)およびアシル化が挙げられるがこれらに限られるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、折り畳みおよび/または機能にとって重要である。様々な宿主細胞、たとえばCHO、HeLa、MDCK、293、WI38などが、そのような翻訳後の活性のための特別の細胞機構および特徴的なメカニズムを有しており、導入した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【0085】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生のためには安定な発現が好ましい。たとえば、基質を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内生の発現配列および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に切り換える前に細胞を増殖培地で1〜2日増殖させる。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性の凝集塊は、細胞型に適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【0086】
組換えベクターの適当な細胞中への導入は、使用したベクターおよび用いた系の種類に典型的に依存したよく知られた方法により行うことができる。たとえば、エレクトロポレーションおよび塩処理法による原核宿主細胞の形質転換を典型的に用いる。たとえば、Cohenら、Proc Acad Sci USA (1972) 69: 2110;およびManiatisら、(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)を参照。rDNAを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理法を典型的に用いる(Grahamら、1973 Virology 52: 456; Wiglerら、1979 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373−76)。
【0087】
組換えベクターを導入した宿主細胞はよく知られた方法により同定することができる。たとえば、本発明のrDNAの導入により得られる細胞をクローニングして単一のコロニーを産生することができる。これらコロニーからの細胞を回収し、溶解し、そのDNA含有物をSouthern, J. Mol. Biol. (1975) 98: 503またはBerentら、Biotech. (1985) 3: 208に記載された方法などを用いてrDNAの存在について調べるか、または該細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によりアッセイすることができる。
【0088】
いずれの選択系を用いても形質転換した細胞株を回収することができる。これらの選択系としては、これらに限られるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler, M.ら、1977 Cell 11: 223−32)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy, I.ら、1980 Cell 22: 817−23)が挙げられ、それぞれtk−マイナス細胞またはaprt−マイナス細胞に用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎に用いることができる;たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler, M.ら、1980 Proc Natl Acad Sci 77: 3567−70);アミノグリコシドネオマイシンおよびG−418に対する耐性を付与するnpt(Colbere−Garapin, F.ら、1981 J Mol Biol 150: 1−14)およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するalsまたはpat。
【0089】
さらなる選択遺伝子が記載されており、たとえば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisDがある(Hartman, S. C.およびR. C. Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 8047−51)。最近、目に見えるマーカーが人気を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるGUS、およびルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するのみならず特定のベクター系に基づく一過性のまたは安定なタンパク質発現の量を測定するためにも広く用いられている(Rhodes, C. A.ら、1995 Methods Mol Biol 55: 121−131)。
【0090】
酵母宿主細胞では、β−因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHなどの構成的または誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる(Ausubel, F.ら、1989、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク; Grantら、1987 Methods in Enzymology 153: 516−544)。
【0091】
植物発現ベクターを用いる場合は、基質をコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれによっても行うことができる。たとえば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーター(Brissonら、1984 Nature 310: 511−514)などのウイルスプロモーターを単独で、またはTMVからのオメガリーダー配列(Takamatsuら、1987 EMBO J. 6: 307−311)と組み合わせて用いることができる。あるいは、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら、1984 EMBO J 3: 1671−1680; Broglieら、1984 Science 224: 838−843)または熱ショックタンパク質(Winter, J.およびSinibaldi, R. M. 1991 Results Probl. Cell. Differ. 17: 85−105)などの植物プロモーターを用いることができる。これらベクターの植物細胞中への導入は、直接DNA形質転換または病原体を介したトランスフェクションにより行うことができる(Hobbs, S., 1992、McGraw Yearbook of Science and Technology、マックグロウヒル、ニューヨーク、ニューヨーク、pp191−196; WeissbachおよびWeissbach 1988、Methods for Plant Molecular Biology、アカデミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、pp.421−463)。
【0092】
基質を発現させるのに用いることができる他の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Autographa californica 核多角体病ウイルス(AcNPV)を、Spodoptera frugiperda細胞中またはTrichoplusia幼生中で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。基質コード配列はポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。基質配列の挿入が首尾よくいくとポリヘドリン遺伝子は不活化され、外殻タンパク質を欠く組換えウイルスを生成するであろう。ついで、この組換えウイルスを用いてS. frugiperda細胞またはTrichoplusia幼生に感染させると該細胞または該幼生中で基質は発現される(Smithら、1983 J Virol 46: 584; Engelhard, E. K.ら、1994 Proc Nat Acad Sci 91: 3224−7)。
【0093】
哺乳動物宿主細胞では多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、アデノウイルス後期プロモーター(たとえば、転写のため)および3分節リーダー配列(たとえば、翻訳のため)を含むアデノウイルスベクター中に基質コード配列を作動可能に連結する。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域中への挿入は、感染した宿主細胞中で基質を発現できるウイルスという結果となるであろう(LoganおよびShenk 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655−59)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞中での発現を増大させることができる。
【0094】
基質を生成するための宿主−ベクター法
一般に、宿主/ベクター系を利用した基質の産生は、典型的に以下の工程を含む。まず、たとえば配列番号1または3に開示するポリヌクレオチド配列のうちのいずれかの一つのような基質をコードする核酸分子を得る。ついで、基質をコードする核酸分子を、好ましくは上記のような発現制御配列に作動可能に連結させて発現ベクター中に挿入し、基質コード配列を含む組換え発現ベクターを生成させる。ついで、標準的な形質転換法により発現ベクターを適当な宿主中に導入し、得られた形質転換宿主を基質のインビボでの産生を可能にする条件下で培養する。たとえば、基質配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、増殖条件は適当なインデューサーを含むであろう。組換えベクターは、基質配列を宿主ゲノム中に組み込むことができる。別法として、組換えベクターは、自己複製ベクターの一部として基質配列を染色体外にて保持することができる。かくして産生させた基質は、増殖培地または細胞から直接、単離する。不純物が許容し得る幾つかの場合にはタンパク質の回収および精製は必要でない。
【0095】
当業者であれば容易に当該技術分野で知られた適当な宿主/発現系を基質コード配列に使用すべく適合させて基質を産生させることができる(Cohenら、1972 Proc. Acad. Sci. USA 69: 2110;およびManiatisら、1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)。種々のタンパク質精製法の例は、Strategies for Protein Purification and Characterization (1996) pp 396, Marshak, D. R.らに見出すことができる。
【0096】
基質を生成するためのインビトロ転写−翻訳法
基質は、当該技術分野でよく知られた転写−翻訳法を用いてインビトロで生成することができる。たとえば、インビトロ翻訳法としては、ウサギ網状赤血球法(Pelham, H. R. B.およびJackson, R. J. 1976 Eur. J. Biochem. 67: 247)およびコムギ麦芽溶解法が挙げられる。一般に、網状赤血球法は、所望のタンパク質をコードするRNA鋳型を細胞の翻訳成分(たとえば、リボソームタンパク質、rRNA、およびtRNA)およびアミノ酸と、該RNA鋳型のコードタンパク質への翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。RNA鋳型は、細胞または組織から単離したmRNAであってよい。RNA鋳型はまた、SP6/T7転写プロモーターを用いたpGEM系(Promega、マジソン、ウイスコンシン)などのように、組換えDNA法を用いてDNA鋳型から生成することもできる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応に含ませて、放射性標識したタンパク質を生成させることができる。ウサギ網状赤血球またはコムギ麦芽から単離した種々のインビトロ翻訳系が市販されている(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。
【0097】
別法として、基質はまた組み合わせた(coupled)転写−翻訳系を用いても生成することができる。一般に、このような組み合わせた系は、所望のタンパク質をコードするDNA鋳型を転写成分および翻訳成分と、該DNA鋳型のコードタンパク質への転写および翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。たとえば、TNTTM系(Promega、マジソン、ウイスコンシン)は、T3、T7、またはSP6プロモーターなどの高度に特異的なRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含むベクターを使用することを含む。所望のタンパク質をコードするDNA配列をプロモーターに作動可能に連結させて組換えベクターを生成することができ、この組換えベクターはDNA鋳型として作用する。このDNA鋳型を、転写および翻訳成分、たとえばRNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド、翻訳成分およびアミノ酸と反応させることができる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応中に含ませて放射性標識したタンパク質を生成させることができる。種々の組み合わせ系が市販されている(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。
【0098】
ミクロソーム基質の生成方法
本発明は、ミクロソーム形態の基質を生成する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む:(1)ガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むポリペプチド基質をミクロソーム膜中に挿入することにより、ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する;ついで(2)ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を単離する。
【0099】
基質は、ミクロソーム膜の存在下で組み合わせ転写−翻訳法を行うことにより生成させることができる(Walter, P.およびBlobel, G. 1983 Meth. Enzymology 65, 856)。組み合わせ転写−翻訳法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子(たとえば、DNAまたはRNA)を用いて行うことができる。この手順の際に、翻訳された基質はミクロソーム膜中に挿入され折り畳まれて、ガンマ−セクレターゼによって認識および開裂され得るポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する。ミクロソーム膜の脂質二重層は、膜環境内で挿入タンパク質の折り畳みを可能にする膜環境を提供する。ミクロソーム膜を生成するための好ましい方法は、イヌ膵臓ミクロソーム(Promega、マジソン、ウイスコンシン)などのように内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さないミクロソーム膜を用いることを含む。
【0100】
可溶化基質を生成する方法
本発明は、界面活性剤で可溶化した形態のガンマ−セクレターゼ基質を生成する方法を提供する。好ましい方法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドを挿入したミクロソーム膜から可溶化基質を単離する。この方法の一般的工程は、(1)ミクロソーム膜からポリペプチド基質を可溶化する;ついで(2)ミクロソーム膜からガンマ−セクレターゼ基質を単離することを含む。
【0101】
ミクロソームからのポリペプチド基質の抽出は、N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]およびCHAPSOTMを含む抽出溶液を用いて行うことができる。好ましい抽出溶液は、1部(容量/容量)のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSOTMを含む。
【0102】
ガンマ−セクレターゼ活性を検出するための再構成法
単離した膜画分を用いた再構成法
本発明は、単離したガンマ−セクレターゼ基質の開裂方法を提供する。これは本明細書ではまた「再構成」法とも称し、単離したガンマ−セクレターゼ基質を開裂することによりガンマ−セクレターゼ活性を検出することを含む。本明細書において「再構成」法とは、単離した触媒性タンパク質(たとえば、プロテアーゼ)の機能的活性を試験するために該触媒性タンパク質を別途単離した基質と混合するアッセイをいう。一般的な再構成法は当該技術分野でよく知られている(Jackson, R. C.およびBlobel, G. 1977 J Cell Biol 12: 5508; ZwizinskiおよびWickner 1980 J Biol Chem 255: 7973)。
【0103】
たとえば、再構成系では、単離したプロテアーゼが単離した基質を開裂する能力を試験するため、該プロテアーゼと該基質とを混合する。単離したプロテアーゼは、ガンマ−セクレターゼタンパク質、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体、またはガンマ−セクレターゼ活性を含む膜画分であってよい。典型的に、再構成系は、触媒性タンパク質の機能的活性に適した条件下でインキュベートする。
【0104】
本発明の一つの態様において、本発明の単離したガンマ−セクレターゼ基質を本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体と接触させ、ついでガンマ−セクレターゼが該基質を開裂させる条件下でかくして接触させた基質をインキュベートする方法を提供する。基質の接触は、mCHAPSOを含む溶液中で行うことができる。好ましい反応溶液は、1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
【0105】
他の態様において、本発明は、単離した膜画分中でガンマ−セクレターゼ活性を検出する再構成法を提供する。この方法は、単離した膜画分を(内生の基質(もし存在するなら)ではなく)別途単離したガンマ−セクレターゼ基質とともにインキュベートし、ついで該膜画分中のガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質が該基質を開裂させる条件下で、接触した該膜画分をインキュベートすることを含む。ガンマ−開裂基質の検出は、検出しうるマーカーで標識した別途単離した基質を用いてアッセイの明確な解釈を可能とすることによって行うことができる。別法として、ガンマ−開裂基質はまた、開裂したガンマ−セクレターゼ基質で新たに生成する末端に対して反応性の抗体などの免疫検出法を用いて検出することができる。
【0106】
開裂産物の検出
本発明はまた、開裂産物の存在を検出することによって試料中のガンマ−セクレターゼ活性または目的とする単離タンパク質を検出する方法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の結果生じる開裂産物は、免疫検出法を含む種々の方法を用いて検出することができる。たとえば、開裂産物は、AβペプチドのN末端またはC末端に特異的に反応する抗体を用いて免疫沈降させ、ついで標準SDS/PAGEゲル上で分離することができる(Citron, M.ら、1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13170−13175)。この方法の変法は、免疫沈降による種々のAβペプチドの存在の検出およびBicine/Tris SDS/尿素ゲル(Klafki, H. −W.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 28655−28659)または質量分析法(Wang, R.ら、1996 J Biol Chem. 271: 31894−902)による40ペプチド形と42ペプチド形との分離を同時に行うことを含む。他の方法はELISAアッセイを含む(Wolfe, M. S.ら、1999 Biochemistry 38: 4720−4727; Vassar, R.ら、1999 Science 286: 735−741)。
【0107】
別法として、基質を放射性標識などの検出しうるマーカーで標識し、開裂産物をゲル中で検出することができる。たとえば、適当なマーカーを35S−Met放射性標識で標識し、開裂産物を分離し、標準SDS−PAGEゲルで検出することができる。
【0108】
開裂産物の量は、免疫学的方法、クロマトグラフィー法または電気泳動法を含む種々の方法により測定できる。再構成アッセイの結果得られた開裂産物の量は、特定のアッセイで使用したガンマ−セクレターゼ複合体が機能的に活性であるか、変異体であるか、あるいはガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬によって阻害されているかを決定するのに用いることができる。たとえば、機能的に活性であることがわかっているガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成アッセイで得られた開裂産物の量は、活性が未知のガンマ−セクレターゼ複合体用いた、あるいはガンマ−セクレターゼに対する未知の阻害作用を有する試薬と反応させたガンマ−セクレターゼ複合体を用いた実験的な再構成アッセイから得られた開裂産物の量と比較するための比較標準として用いることができる。開裂産物の欠失を示す、または比較標準アッセイにおける量と比べて開裂産物の量が検出しうるほどに低減している実験的な再構成アッセイは、該実験的アッセイが、機能的に低減した(reduced−functional)ガンマ−セクレターゼ、非機能的(non−functional)ガンマ−セクレターゼ、またはガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を含んでいることを示している。
【0109】
ガンマ−セクレターゼのインヒビターの同定方法
本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質(たとえば、膜中の、可溶化した、または種々の濃縮形態の複合体)は、ガンマ−セクレターゼに結合するおよび/またはガンマ−セクレターゼの活性に変化を引き起こす試薬を同定するスクリーニング戦略に有用である。たとえば、試薬はガンマ−セクレターゼを活性化あるいは阻害する。好ましい試薬はガンマ−セクレターゼ活性を阻害するであろう。これら試薬は、アルツハイマー病などのようなAβペプチドの上昇レベルと関連した疾患を治療するうえで有用である。
【0110】
本発明の単離したガンマ−セクレターゼ複合体に結合する候補試薬を同定する一般的方法は以下の工程を含む。本発明のガンマ−セクレターゼを単離する;該ガンマ−セクレターゼを目的とする試薬と接触させる;ついで、該試薬がガンマ−セクレターゼを阻害するか否かを上記で述べた適当な手段により検出する。好ましい方法は、mCHAPSOを含む溶液の存在下でガンマ−セクレターゼを接触させることを含む。
【0111】
スクリーニングアッセイは、膜形態、可溶化形態、または種々の濃縮形態のいずれかにある単離したガンマ−セクレターゼ複合体を用い、上記で記載した再構成法と同様にして行うことができる。
候補試薬は、たとえばリガンドであってよく、これは典型的にポリペプチド、核酸分子、有機分子、ビタミン誘導体または金属である。当業者であれば本発明のスクリーニング法に用いる試薬の構造特性において何ら制約のないことが容易に認識できるであろう。該試薬は、合成したものであってもよいし、あるいは細胞構成成分のように天然に存在するものであってもよい。本発明の方法で試験する細胞抽出物は、たとえば、細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物または部分的に精製した細胞画分であってよい。
【0112】
ポリペプチド試薬は、当該技術分野で知られているように、標準的な固相または液相ペプチド合成法を用いて生成することができる。さらに、これらペプチドをコードする核酸分子は、標準的な組換えDNA法を用いて生成できるし、または市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いても合成できる。
抗体試薬は、ガンマ−セクレターゼ複合体の選択したドメインまたは領域に免疫反応することができる。一般に、抗体は、抗原性領域として該抗体の標的とされることを意図するガンマ−セクレターゼ複合体の部分を含むペプチドで適当な哺乳動物主体を免疫することにより得られる。
【0113】
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを低減するなどによりガンマ−セクレターゼの活性を低減させるときにガンマ−セクレターゼの活性に拮抗するという。好ましいアンタゴニストは、ガンマ−セクレターゼの活性を50%以上、好ましくは90%以上低減させ、最も好ましくはすべての活性を排除するであろう。
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを増大させるなどのようにガンマ−セクレターゼの活性を増大させるときにガンマ−セクレターゼの活性を増強させるという。
【0114】
ガンマ−セクレターゼ活性を有する膜画分の開裂活性を阻害する目的試薬を迅速に同定する方法
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および内生の基質を含む単離した膜画分は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬をスクリーニングするための比較的迅速な方法に有用である。内生の基質の完全性を保持する単離した膜画分は知られている(Roberts, S.ら、1994上掲)。たとえば、膜画分は、内生のガンマ−セクレターゼを発現するHeLa細胞およびβAPPのスウェーデン変異体(「βAPPSW」)などの基質から調製できる。
【0115】
単離した膜は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する候補試薬をスクリーニングするのに用いることができる。内生基質の開裂産物は、開裂産物のN末端またはC末端に特異的に結合する抗体を用いてモニターおよび検出できる。たとえば、AβペプチドのN末端領域に結合する抗体(たとえば、26D6−B2−B3R、SIBIA Neurosciences、ラジョラ、カリフォルニア)またはC末端領域に結合する抗体(たとえば、9S3.2R抗体、Biosolutions、ニューアーク、デラウエア)は知られている。さらに、これら抗体は、1対の蛍光付加物であって、AβペプチドのN末端またはC末端または領域に結合した結果として該蛍光付加物が近接した位置に置かれたときに蛍光エネルギーを移動させるもので修飾することができる(図9)。蛍光の欠如は、ガンマ−セクレターゼ活性の阻害の結果として、開裂産物の不在を示す。
【0116】
本明細書において、本発明の「ガンマ−開裂βAPPフラグメント」とは、ガンマ−セクレターゼによってそのガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂されたβAPPまたはβAPPフラグメントの幾つかのタイプのいずれか、すなわち、6kDa C末端フラグメント、p3フラグメント、Aβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドおよび大きなN末端産物をいう。たとえば、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントはAβ−40ペプチドもしくはAβ−42ペプチドかまたは6kDa C末端フラグメントのいずれかである。もしもα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼがガンマ−セクレターゼ活性の前提条件でないなら、ガンマ−開裂βAPPフラグメントは6kDa C末端かまたはβAPPのN末端からガンマ−セクレターゼ開裂部位にわたる大きなN末端産物(770形のβAPPから開裂された場合には約105kDa)のいずれかである。さらに、本明細書において「未開裂βAPP」とは、ガンマ−セクレターゼによっては開裂されていないが、α−セクレターゼもしくはβ−セクレターゼによって、または同一の切断または他の手段によって開裂されているβAPPまたはβAPPフラグメントをいう。
【0117】
上記に記載したように、本発明の検出系はガンマ−セクレターゼ開裂の産物を検出するために1対の蛍光付加物を用いる。当業者によって認識されるように、これら蛍光付加物はそれぞれ、蛍光エネルギーを移動または受領しうる分子、および該分子をタンパク質またはペプチドに結合させる官能基を含む。本発明の目的のために使用できるよく知られた官能基としては、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド−、ヨードアセトアミド−、またはブロモアセトアミド−官能基が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0118】
1対の蛍光付加物のうちの一方は、蛍光を与え、第二の分子に蛍光エネルギーを移動させることのできるドナー分子を含む。好ましくはドナー分子は永続する蛍光を有し、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、Alexa Fluor 488R(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン)などのN−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩、Cy3R(Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー)などの1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩および当該技術分野で知られた他のドナー分子であってよい。好ましいドナー分子の化学構造を図12に示してある。最も好ましくはドナー分子はユウロピウムクリプテートまたはキレートである。
【0119】
1対の蛍光付加物のうちの他の蛍光付加物は、ドナー分子からの蛍光エネルギーを受領するアクセプター分子を含む。好ましくはアクセプター分子自体は所定の波長(すなわち、x1−APCでは約665nm)で短期間の蛍光しか有しないが、ドナー分子から蛍光エネルギーを受領して増幅した蛍光シグナルを生成することができる。本明細書において増幅したシグナルとは、対合しないアクセプターに通常付随するシグナルに比べて一層長期間で一層大きな強度を有する蛍光シグナルをいい、アクセプターおよび/またはドナーの各種類に応じて変わる(Kolbら、1996, ”Homogeneous Fluorescent technology in High Throughput Screening”, Journal of Biomolecular Screening 1: 203−210を参照)。
【0120】
本発明において使用できるアクセプター分子としては、アロフィコシアニンの誘導体、すなわちXL665R(Packard Biosciences、メリデン、コネチカット)などの架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンまたはCy5R(Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー)などの1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩が挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましいアクセプター分子の化学構造は図13に示してある。当業者に知られた他のドナーおよびアクセプター分子は、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research chemicals, Molecular Probes Inc.、ユージーン、オレゴン(Haugland編、第6版、1996); Van Der Meerら、Resonance Energy Transfer, Theory and Data、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク(1991);およびHemmilaら、Bioanalytical Applications of Labelling Technologies、ワラックオイ、ツルク、フィンランド(Hemmila編、第2版、1994)に見出すことができる。
【0121】
互いに極めて近接して結合したときに、ドナー分子の励起はアクセプター分子へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす。たとえば、励起したユウロピウムクリプテートはx1−APCにエネルギーの直接移動をもたらし、かくして約665nmにて増幅したシグナル(約660−670nmで現れる)を生成する。ユウロピウムクリプテートは665nmでは殆ど蛍光を放射しないので、665nm蛍光シグナルの検出および測定は、2つの蛍光分子が極めて近接しているときに無放射蛍光共鳴エネルギーがアクセプター分子x1−APCに移動したことを示している。さらに、ユウロピウムクリプテートは約620nmで蛍光放射する(約615−625nmで現れる)ので、620nm蛍光の測定は内部標準を提供する。測定した620nm蛍光に対する665nm蛍光の比は、2つの蛍光分子の近接度の指標として用いることができる。それゆえ、エネルギーの検出しうる移動は、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長(ここでは665nmから620nm)へのシグナルの比に比べた該比の変化により、または当業者に知られたこのシグナルの他のある種の標準化(normalization)により、アクセプター波長(ここでは約665nm)での増幅したシグナルによって表される。さらに、この標準化法はユウロピウムクリプテートとx1−APCに限られるものではなく、近接結合を検出するための他の蛍光対、すなわち、フルオレセインとクマリン、Cy3RとCy5R(Amersham Pharmacia、ピスカタウエイ、ニュージャージー)またはフルオレセインとテトラメチルローダミンおよび当該技術分野でよく知られた他の蛍光対とともに用いることもできる。
【0122】
検出は、レーザー、キセノンフラッシュランプ、ジュウテリウム−タングステンランプまたは当該技術分野でよく知られた他のエネルギー源によるドナー分子の励起により行う。好ましい態様において、好ましい励起源はレーザーによるものである。とりわけ両付加物が同じフラグメントに極めて近接して結合している場合には、ドナー蛍光分子の励起はアクセプター分子への蛍光エネルギーの移動を引き起こし、かくしてアクセプターの放出波長(上記に記載したようにx1−APCでは約665nm)での蛍光シグナルを生じる。逆に付加物が極めて近接していない(すなわち、未結合かまたは別のフラグメントに結合している)ときは、アクセプター分子からの増幅されたシグナルが殆どまたは全くないことによって、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長へのシグナルの比に比べた該比が変化しないことによって、または当業者によく知られた他のある種の標準化によって示されるように、エネルギーの移動の実質的な低下をもたらす。
【0123】
別法として、アクセプター分子は、励起したドナー分子からの蛍光エネルギーを吸収することによりドナー蛍光シグナルを低減することのできる蛍光消光剤分子であってよい。蛍光消光剤分子はそれ自体は蛍光シグナルを生じることはなく、ドナー分子の蛍光エネルギーを熱または分子運動として消耗させるであろう。本発明において消光剤として用いることのできる蛍光アクセプターとしては、これらに限られるものではないが、ダブシル(dabcyl)、QSY−7R(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン)やBHQ−3R(Biosearch Technologies, Inc.、ノバト、カリフォルニア)などの9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩が挙げられる。
【0124】
好ましい消光剤分子の幾つかの化学構造を図13に示してある。当業者に知られた他の消光剤分子は、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research chemicals, Molecular Probes Inc.、ユージーン、オレゴン(Haugland編、第6版、1996); Van Der Meerら、Resonance Energy Transfer, Theory and Data、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク(1991);およびHemmilaら、Bioanalytical Applications of Labelling Technologies、ワラックオイ、ツルク、フィンランド(Hemmila編、第2版、1994)に見出すことができる。
【0125】
x1−APCなどの上記に記載したアクセプター分子とは対照的に、蛍光消光剤分子は同じフラグメント上に極めて近接して存在するときに励起したドナーからのエネルギーを吸収し、それ自体の蛍光シグナルは生じないであろう。それゆえ、極めて近接して存在するときにアクセプター分子が消光剤分子である場合のエネルギーの検出しうる移動は、対合しないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーの蛍光シグナルが低減することによって示される。従って、極めて近接することなく、またアクセプター分子が消光剤である場合に、エネルギー移動の実質的な低下の検出は対合していないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーによる蛍光シグナルの不変化をもたらす。
【0126】
両方の場合においてアクセプターはそれ自体のシグナルを生じない。ドナー分子と消光剤分子との好ましい対としては、EDANSとダブシル、Alexa Fluor 488RとQSY−7R(ともにMolecular Probes、ユージーン、オレゴンより入手可能)、およびCy5R(Amersham Pharmacia、ピスカタウエイ、ニュージャージー)とBHQ−3R(Biosearch Technologies, Inc.、ノバト、カリフォルニア)が挙げられるが、これらに限られるものではない。他のドナーとアクセプター(または消光剤)との対は、蛍光付加物の当業者による通常の実験によって見出すことができる。
【0127】
蛍光付加物によるガンマ−セクレターゼ開裂産物の結合または「標識」は、直接的、半直接的または間接的であってよい。たとえば、蛍光付加物の対は、未開裂βAPP、βAPPフラグメントまたはガンマ−開裂βAPPに直接結合させることができるし、または半直接的な場合は蛍光付加物の一方を抗体などの第二の分子に結合させるか、またはストレプトアビジン−ビオチン結合または当該技術分野でよく知られた他の結合法により結合させることができる。好ましくは結合は間接的なものであり、その際、各蛍光付加物を別々に抗体で修飾し、少なくとも一つの抗体がガンマ−開裂βAPPフラグメント上のエピトープに特異的であって未開裂βAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応しないものである。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、非交差反応エピトープはガンマ−開裂βAPPのアミノ酸残基711かまたは713のいずれかでの(ガンマ−開裂βAPPフラグメントがAβであるときはアミノ酸残基40または42)ガンマ−セクレターゼの開裂部位である。
【0128】
下記にさらに詳細に記載するように、当業者はガンマ−開裂ペプチド上のいずれの所望の部位についても結合特異性を有するモノクローナル抗体を作製することが可能である。モノクローナル抗体を作製することができるということは、今度はどの部位に蛍光付加物が結合するかに関して柔軟性をもたらす。
【0129】
本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−セクレターゼ開裂部位、すなわちガンマ−開裂βAPPのアミノ酸残基711(Aβ−40の場合はアミノ酸残基40)を含むカルボキシ末端でガンマ−開裂βAPPフラグメントに特異的であり、最も好ましくは未開裂βAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと交差反応をしない。ガンマ−セクレターゼがアミノ酸残基713(Aβ−42の場合はアミノ酸残基42)を開裂する場合は、第一の蛍光付加物はアミノ酸残基713を含むカルボキシ末端に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPとは交差反応しない。第二の蛍光付加物は、同じガンマ−開裂βAPPフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸1〜702の部分に結合する。最も好ましくは、第二の蛍光付加物は、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPに結合する(図4参照)。
【0130】
Aβアミノ酸配列1−31の対応位置は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントの性質に依存して変わるであろう:(1)p3フラグメントではアミノ酸1−15のみがAβに対応する、(2)大きなN末端フラグメントでは、対応するアミノ酸配列は開裂したβAPP形態のサイズに依存して3つの位置のうちの1つであってよい(695形では対応アミノ酸配列は596−627;750形では対応配列はアミノ酸651−682;および770形ではアミノ酸671−702)、およびもちろん(3)Aβペプチドでは対応するアミノ酸は1−31である。好ましくは、第一の蛍光付加物の結合部位は第二の蛍光付加物の結合部位と交差反応しないかまたは重複しない。最も好ましくは、第一の蛍光付加物はドナー分子を含み、抗体で修飾されており、一方、第二の蛍光付加物はアクセプター分子を含み、第二の抗体で修飾されている。
【0131】
好ましい態様において、検出系は、まずβAPP基質で開裂反応を行うことにより行う。ガンマ−セクレターゼによる開裂は、下記実施例9に記載するように0℃から37℃に温度をシフトすることにより開始する。基質の開裂後、好ましくはモノクローナル抗体で修飾した2つの蛍光付加物を反応液に加える。同じガンマ−開裂βAPPフラグメントへの第一の蛍光付加物および第二の蛍光付加物の結合は、蛍光エネルギーの移動を可能にする。第一の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントなどの前駆体と実質的に交差反応しないのが好ましい。第二の蛍光付加物は、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPフラグメント、並びに同配列を含むいかなるβAPP前駆体または他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合するであろう。
【0132】
エネルギーの検出しうる移動を生成し、それによって開裂を確認するには両方の蛍光付加物の結合が必要である。アクセプターがx1−APCなどである場合は、エネルギーの検出しうる移動は665nmでの増幅した蛍光シグナルによって示されるであろう。一方、アクセプターがダブシルなどの蛍光消光剤分子である場合は、エネルギーの検出しうる移動は対合していない状態に比べてドナー分子による蛍光シグナルが低下していることによって示されるであろう。
検出系の目的は、特定のガンマ−開裂βAPPフラグメントの存在を未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントから識別することである。検出法は均一であり、開裂産物を前駆体から分離および回収する工程が不要である。
【0133】
図9は、蛍光産物の対がユウロピウムクリプテートおよびx1−APCを含む好ましい態様における検出系の原理の模式図である。βAPP融合タンパク質は細胞によって作られ、典型的には通常のプロセシングの際にβ−セクレターゼによって開裂される。βAPPがガンマ−セクレターゼによって開裂されると、検出系は新たに生成した結合部位を第一の蛍光付加物のために利用する。一方、第二の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βAPPフラグメント(ここではAβ)並びにα−セクレターゼ、β−セクレターゼかまたはガンマ−セクレターゼを問わずその結合部位を有する他のいずれのβAPPフラグメントのアミノ末端領域に結合するかまたはすでに結合している。同じ開裂フラグメントへの両方の蛍光付加物の結合は、エネルギーの検出しうる移動をもたらす。
【0134】
本発明の最も好ましい態様において、一方の蛍光付加物はユウロピウムクリプテートを含み、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に対し、すなわちアミノ酸残基711(Aβではアミノ酸残基40に対応)で特異的な抗体で修飾されている。アミノ酸残基711(Aβアミノ酸40)を含むエピトープに対する結合特異性を有する一つの抗体は、9S3.2抗体(Bristol−Myers Squibb Co.、プリンストン、ニュージャージーのためにBiosolutions、ニューアーク、デラウエアにより調製された)である。これと対応して、最も好ましい態様の他の蛍光付加物はx1−APCを含み、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ末端領域内に結合する第二の抗体で修飾されている(図4参照)。Aβアミノ酸配列1−12に対応するエピトープに結合する抗体は26D6−B2−B3であり、これはSIBIA Neurosciences(ラジョラ、カリフォルニア)によって提供される。
【0135】
上記検出系は、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出することに加えて、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合にAβを検出するのにも応用できる。上記に記載したように、Aβの検出は、Aβのアミノ末端領域かまたはカルボキシ末端のいずれかにそれぞれ別々に結合する蛍光付加物の対を用いて行うことができる。たとえば、蛍光付加物の対が抗体9S3.2および26D6−B2−B3で修飾された上記態様では、存在するいかなるAβ−40も検出されるであろう。最も好ましくは、それぞれの蛍光付加物がAβのアミノ末端およびカルボキシ末端に別々に結合し、互いにまたは未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと実質的に交差反応しない。かくしてAβの検出は、一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすときに確認されるであろう。
【0136】
さらに、最も好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ開裂の結果得られるカルボキシ末端ではなくアミノ末端への特異的結合によってガンマ−セクレターゼ開裂を検出すべく改変することができる。たとえば、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端(典型的にAβペプチドのカルボキシ末端に対応する)に結合させる代わりに、第一の蛍光付加物を6kDフラグメントのアミノ末端に特異的に結合させ、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメント(すなわち、この改変態様ではAβ)と実質的に交差反応しないようにすることができる。この改変した形態の好ましい態様では、第二の蛍光付加物は6kDフラグメントのカルボキシ末端領域に結合するであろう。この改変態様でのエネルギー移動の検出は6kDフラグメントの存在を示しており、この6kDフラグメントはα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼもまた存在するか否かとは無関係にガンマ−セクレターゼ開裂の普遍的な産物である。
【0137】
検出系はさらに、ガンマ−セクレターゼのインヒビターをスクリーニングすべく改変することができる。被験化合物を開裂反応の開始前にアッセイウエルに入れ、該被験化合物がガンマ−セクレターゼを競合的に阻害し得るか否かを決定する。ついで、蛍光付加物の対を加えてガンマ−開裂βAPPフラグメントの存在を決定する。蛍光付加物がカルボキシル末端およびアミノ酸末端領域に対する結合特異性を有する上記好ましい態様では、エネルギーの移動の実質的な低下はガンマ−セクレターゼの阻害によりβAPPが開裂されなかったことを示すであろう。
【0138】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出のさらに別の態様として、蛍光付加物が別々の開裂産物に結合するものがある。この別の態様では、蛍光付加物はそれぞれ未開裂βAPP上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対の部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。たとえば、一方の蛍光付加物は未開裂βAPPのカルボキシ末端領域に対応するアミノ酸配列にアミノ酸配列720−770にて、すなわち6kDaフラグメントに結合する。他方の蛍光付加物は、未開裂βAPPのアミノ末端領域に対応するガンマ−セクレターゼ開裂部位の他方の部位にアミノ酸配列671−702にて、すなわちAβフラグメントまたはp3フラグメントに結合する。この別の態様では、少なくとも一方の蛍光付加物は、そのアミノ酸配列に未開裂βAPPの他の部分と実質的に交差反応することなく結合するのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じた場合は、蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βAPPフラグメント(すなわち6kDaフラグメントおよびAβフラグメント)に結合し、それゆえドナー分子が励起した際にエネルギー移動の実質的な低下という結果となるであろう。
【0139】
さらに、この別々の産物への結合という態様は、被験化合物を加えることによりガンマ−セクレターゼのインヒビターの検出のために適合させることができる。被験化合物をガンマ−セクレターゼと同時に加える場合は、蛍光エネルギーの移動の検出はガンマ−セクレターゼによる開裂の欠如、それゆえガンマ−セクレターゼのインヒビターの存在を示しているであろう。
【0140】
検出系は、上記で記載したような可溶化したガンマ−セクレターゼを含む試料、または適当に希釈した天然産物の試料で行うことができる。本発明では、βAPP基質の試料は、組織試料または細胞培養液から得られる膜画分中に認めることができる。これらの試料において、未開裂βAPP、βAPPフラグメントおよびガンマ−セクレターゼ複合体は内生的に産生される。しかしながら上記でも記載したように、βAPP基質は、組換え宿主−ベクター系、インビトロ転写−翻訳、またはβAPPアミノ酸配列の有機合成並びに当該技術分野でよく知られた他のあらゆる再現可能な方法を含む様々な採取源(これらに限られるものではない)から得ることができる。
【0141】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼタンパク質に対して向けられた抗体の産生方法
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体の産生方法はよく知られている(Harlow, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク)。たとえば、本発明は、PS1やPS2などのプレセニリンを認識および結合する抗体を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体を認識および結合する抗体を提供する。
【0142】
好ましくは、抗プレセニリン抗体はPS1またはPS2に選択的に結合し、非プレセニリンタンパク質には結合しない(または弱く結合する)であろう。好ましい抗ガンマ−セクレターゼ抗体はガンマ−セクレターゼに選択的に結合し、非ガンマ−セクレターゼタンパク質には結合しないであろう。抗PS1抗体、抗PS2抗体または抗ガンマ−セクレターゼ抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれら抗体の抗原結合ドメインおよび/または1またはそれ以上の補体決定(determining)ドメインを含むそのフラグメント(たとえば、組換えタンパク質)が挙げられる。これら抗体は、いかなる採取源、たとえば、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウスおよびヒトからのものであってよい。
【0143】
これら抗体は、PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を特異的に認識する抗体フラグメントであってよい。本明細書において抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域、すなわち抗原結合領域の少なくとも一部として定義される。免疫グロブリンの若干の定常領域も含まれていてよい。
【0144】
抗体を調製するための様々な方法が当該技術分野でよく知られている。たとえば、抗体は、単離した形態またはイムノコンジュゲートした形態の本発明のPS1、PS2、または単離ガンマ−セクレターゼタンパク質、またはペプチド、またはフラグメントを用いて適当な哺乳動物宿主を免疫することにより調製できる(Harlow, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク)。さらに、PS1またはPS2の融合タンパク質、たとえばPS1 GST−融合タンパク質を用いることもできる。PS1またはPS2を発現または過剰発現する細胞も免疫に用いることができる。同様に、PS1またはPS2を発現するように操作した細胞も用いることができる。この戦略は、内生のPS1またはPS2を認識する能力の促進されたモノクローナル抗体の産生という結果となる。
【0145】
抗体を産生するためのPS1またはPS2タンパク質の特異的な領域を選択するため、PS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)またはPS2(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977)のアミノ酸配列を用いることができる。たとえば、PS1またはPS2アミノ酸配列のハイドロフォビシティーおよびハイドロフィリシティー分析を用いてPS1またはPS2構造中の親水性領域を同定することができる。免疫原構造を示すPS1またはPS2タンパク質の領域並びに他の領域およびドメインを、テョウ−ファスマン(Chou−Fasman)、ガルニエ−ロブソン(Garnier−Robson)、カイト−ドゥーリットル(Kyte−Doolittle)、アイゼンベルク(Eisenberg)、カープラス−シュルツ(Karplus−Schultz)またはジェームソン−ウルフ(Jameson−Wolf)分析などの当該技術分野で知られた様々な他の方法を用いて容易に同定することができる。これら残基を含むフラグメントは、特定のクラスの抗PS1抗体を生成するのに特に適している。特に有用なフラグメントとしては、これらに限られるものではないが、配列CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)、CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)、およびノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)が挙げられる。
【0146】
免疫原として使用するタンパク質の調製方法、およびBSA、KLH、OVAまたは他の担体タンパク質などの担体とのタンパク質の免疫原コンジュゲートの調製方法は当該技術分野でよく知られている。幾つかの状況では、たとえばカルボジイミド試薬を用いた直接コンジュゲート法を用いることができる。他の場合には、Pierce Chemical Co、ロックフォード、イリノイによって提供されるもののような連結試薬が有効である。PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼ免疫原の投与は、当該技術分野で一般に理解されているように、一般に適当な期間の注射により、適当なアジュバントを用いて行う。免疫スケジュールの間に、抗体生成の適切さ(adequacy)を抗体の力価を決定するのに採用することができる。
【0147】
このようにして産生したポリクローナル抗血清も幾つかの応用においては満足のいくものであるが、タンパク質の単離のためにはモノクローナル抗体調製物が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を、一般に知られているように、KohlerおよびMilsteinの標準法(Nature 256: 495−497)またはリンパ球または脾臓細胞の不死化を行う改変法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株を、抗原がPS1またはPS2タンパク質またはフラグメント、または本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質であるイムノアッセイによりスクリーニングする。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養液が同定されたら、細胞をインビトロで培養するかまたは腹水中で産生させることができる。
【0148】
ついで、所望のモノクローナル抗体を培養上澄み液かまたは腹水上澄み液から回収する。免疫学的に有意の部分(すなわち、PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を認識および結合する部分)を含む本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のフラグメント(たとえば、Fab、F(ab’)2、Fvフラグメント、融合タンパク質)を、完全な抗体と同様にアンタゴニストとして用いることができる。
【0149】
Fab、Fab’、またはF(ab’)2フラグメントなどの免疫学的に反応性のフラグメントの使用がしばしば好ましい。さらに、2またはそれ以上のエピトープに特異的な2特異的抗体を当該技術分野で一般に知られた方法を用いて生成することができる。ホモダイマー抗体もまた、当該技術分野で知られた架橋法(たとえば、Wolffら、Cancer Res. 53: 2560−2565)により生成することができる。
抗体またはフラグメントはまた、最近の技術を用い、組換え手段により産生させることができる。PS1またはPS2タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、複数種の起源のキメラ抗体またはCDRグラフト抗体の関連で製造することができる。
【0150】
別法として、完全にヒトのモノクローナル抗体を産生する方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられ、知られており、ヒトMabの生成に用いることができる(概説としては、Vaughanら、1998, Nature Biotechnology 16: 535−539を参照)。たとえば、完全にヒトの抗PS1抗体または抗PS2抗体は、大きなヒトIg遺伝子コンビナトリアルライブラリー(すなわち、ファージディスプレイ)を用いたクローニング法を用いて生成することができる(GriffithsおよびHoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries, In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man、Clark, M.(編)、ノッティンガムアカデミック、pp45−64 (1993); BurtonおよびBarbas, Human Antibodies from combinatorial libraries、上掲、pp65−82)。
【0151】
完全にヒトの抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体はまた、PCT特許出願WO98/24893、Jakobovitsら、1997年12月3日公開(Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607−614をも参照)に記載されているように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニックマウスを用いても産生できる。この方法は、ファージディスプレイ法で必要なインビトロ操作を必要とせず、高度に親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【0152】
標的抗原に対する抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体の反応性は、必要に応じてPS1またはPS2タンパク質、ペプチド、PS1発現細胞またはその抽出物を用い、ウエスタンブロット、免疫沈降、ELISA、およびFACS分析を含むよく知られた多くの手段により確立することができる。抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体はまた、補体媒体腫瘍細胞溶解、抗体依存性細胞媒介細胞障害(ADCC)、抗体依存マクロファージ媒介細胞障害(ADMMC)、腫瘍細胞増殖などを含む様々なインビトロアッセイで特徴付けることもできる。
【0153】
本発明の抗体またはフラグメントは、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素などの検出しうるマーカーで標識することができる。
以下の実施例は本発明を説明するため、および当業者が本発明を製造および使用するのを助けるために記載するものである。これら実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0154】
実施例1
以下に、放射性標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチド模倣物などのβAPP配列を有するガンマ−セクレターゼ基質を生成するのに用いる方法を記載する。実施例1、4、5、6および8に記載してあり本明細書で「mCHAPSO界面活性剤溶液」と称する界面活性剤溶液は、1部のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSO(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を含む。
【0155】
BAPP基質をコードする組換えベクター
C100 C末端フラグメントを模倣するヒトβAPP−C100ポリペプチドをコードする組換えベクター(図1Aおよび図2)としてはpcDNA3ベクター(InVitrogen、カールスバード、カリフォルニア)が挙げられ、これはファージT7プロモーター、ヒトβAPP(ジーンバンクY00264)のヌクレオチド1936〜2235に直接連結した、APPシグナル配列と成熟APPのアミノ末端ロイシンとをコードするDNA(APPのヌクレオチド1−54;ジーンバンクID Y00264;Kang, J.ら、1987 Nature 325: 733−736)を有している。この組換えヌクレオチド配列は、11kDaポリペプチドとして検出しうるC−100ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図2および配列番号1に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号2に記載してある。
【0156】
ヒトβAPP−C83ポリペプチド模倣物をコードする組換えベクター(図1Bおよび図3)としてはpcDNA3ベクターが挙げられ、これはファージT7プロモーター、配列CTGGATGCAGAATTC(これはヒトβAPP(ジーンバンクY00264)のヌクレオチド1987−2267に直接連結している)に連結したβAPPシグナル配列をコードするDNAを含んでいる。この組換えヌクレオチド配列は、9kDaであるC−83ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図3および配列番号3に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号4に記載してある。
【0157】
ミクロソーム中へのポリペプチド模倣物のインビトロ転写および同時翻訳挿入
ミクロソーム(たとえば、ミクロソーム基質)中に挿入した放射性標識したβAPP−100およびβAPP−C83ポリペプチドを、TnTTMカップルド・レティキュロサイト・ライセート・システム(カタログ#L4610;Promega、マジソン、ウイスコンシン)および35S−メチオニン(NEN、ボストン、マサチューセッツ)を用いて製造業者の指示に従い、組み合わせ転写−翻訳法により製造した。放射性標識したβAPP−C100およびβAPP−C83ポリペプチドのミクロソーム膜中への同時翻訳挿入を、製造業者の指示に従ってライセートシステムにイヌ膵臓ミクロソーム膜(カタログ#:Y4041;Promega、マジソン、ウイスコンシン)を58単位(膜)/400μl(反応液)にて補充することにより行った。
【0158】
簡単に説明すると、600μlの網状赤血球溶解液、48μlの反応混合液、24μlのT7RNAポリメラーゼ、および24μlのメチオニン以外のアミノ酸混合液(以上、Promega TnTTMカップルド・レティキュロサイト・トランスレーション・キット)を、24μlのRNAsinTM(Promega、マジソン、ウイスコンシン)および100μlの35S−メチオニンと混合した。全部で48μgのβAPP−C100かまたはβAPP−C83のベクターDNAを加え、ついで穏やかなピペッティングによって二重蒸留(double distilled)水を混合することにより容量を1100μlとした。ミクロソーム(172単位、典型的に〜90μl)を加え、反応液をもう一度穏やかに混合し、ついで30℃に75分間置いた。管を氷上に置いて反応を停止させた。
【0159】
ミクロソーム基質の単離
0.4mlの転写−翻訳液を氷冷高塩ショ糖(0.5M NaCl、0.5M ショ糖、20mM HEPES、pH7.5、0.5μM o−フェナントロリン、12&μg/mlのロイペプチン)の1.4mlクッション上に重層することによりミクロソーム膜を単離した。ミクロソーム膜を4℃で10分間、100,000rpm(Beckman TLA 100.3ローター)で遠心分離して回収した。ミクロソーム膜のペレットを再懸濁することなく150μlの冷低塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、0.5μM o−フェナントロリン、12μg/mlのロイペプチン)で濯ぎ、濯いだ緩衝液を捨てた。ペレットは、放射性標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチドが挿入された単離ミクロソーム(たとえば、ミクロソーム基質)を含んでいた。
【0160】
ミクロソーム基質からのポリペプチドの可溶化
放射性標識したβAPP−C100およびβAPP−C83ポリペプチド模倣物を、「mCHAPSO界面活性剤溶液」(1部のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSO(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を含む)を含む界面活性剤溶液を用いて界面活性剤可溶形態のミクロソームから抽出した。
【0161】
ペレットとして回収したミクロソーム基質を105μlのミクロソーム抽出緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、10%グリセリン、1mMエチレンジアミン四酢酸、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁して、可溶化した35S標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチドを得た。これら可溶化ポリペプチドを基質として用いた。可溶化した放射性標識βAPPポリペプチドのアリコート(25μl)を液体窒素中でフラッシュ凍結し、使用のときまで−80℃で貯蔵した。
【0162】
実施例2
以下に、膜画分(膜二重層内に埋め込まれた膜内在タンパク質を含む)を単離するのに用いた方法を記載する。
細胞の回収
スピナー増殖させたHeLa細胞を1リットル容器を1800rpm×15分×4℃にて遠心分離することにより回収した。収量は1リットル当たり約1mlの細胞ペレットであった。この細胞を50×のペレット容量を用いて氷冷PBS(カタログ#:14190;Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド)中に浮遊させた。この浮遊細胞を250ml容の円錐容器に移し、4℃にて1000×Gで10分間遠心分離した(Jouan GR 4−22低速遠心管)。細胞ペレットをPBS中に再浮遊させ、遠心分離工程を繰り返した。
【0163】
細胞の溶解
ペレットの容量を測定し、2×ペレット容量のHB低張溶解緩衝液(10mM HEPES、pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2)を加え、細胞を注意深く再浮遊させて洗浄した。使用の直前に0.5mM DTT、0.5mM PMSFまたはペファブロック(Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディアナ)を加えた。細胞を4℃にて1000×Gで10分間遠心分離にかけた(Jouan GR 4−22低速)。上澄み液を注意深く除去し、細胞ペレットを氷上で10分間インキュベートして細胞を膨潤させた。細胞をダウンスホモジナイザーを用いて破砕した。
【0164】
簡単に説明すると、20mlの細胞浮遊液を大きなダウンスホモジナイザーに加え、「B」乳棒を15回上下往復させてホモジナイズした。ついで、20mlのHB低張溶解緩衝液をさらに加え、乳棒を5回上下往復させて混合した。ホモジネートを4℃にて1000×Gで10分間遠心分離した。上澄み液を新たな管に移し、直ちに11%上澄み容量の氷冷10×トリス緩衝食塩水(200mMトリス−HCl、pH7.5、1.3M NaCl)を加えた。ペレットを1容量のHB低張溶解緩衝液(10mM HEPES、pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2)に再浮遊させ、細胞を膨潤させ、ホモジネートおよび遠心分離工程を繰り返した。上澄み液をコンバインし、4℃にて1000×Gで10分間、再度遠心分離にかけた。
【0165】
膜画分の回収
上記ホモジナイゼーション工程で得られた上澄み液を4℃にて2000×Gで10分間遠心分離にかけた(Jouan)。ペレットを捨てた。上澄み液を残した;これが「2K上澄み液」である。この2K上澄み液を12,000×Gで遠心分離(10,000rpm(Sorvall SS−34))して膜画分を回収した(たとえば、ペレットは膜画分を含む)。上澄み液を除去し、捨てた。ペレットを残した;これが「12K膜」である。この12K膜を20%グリセリン、20mM HEPES(1ペレット容量)中に再懸濁させた。膜画分を小さなアリコートにてフラッシュ凍結し、−80℃にて貯蔵した。
【0166】
実施例3
以下に、膜画分の大スケール洗浄に用いた方法を記載する。この方法を用いて膜(塩除去およびアルカリ除去する)を調製した。
洗浄膜画分の調製
膜洗浄手順の全工程において氷冷した管および緩衝液を用いた。
HeLa細胞膜画分(たとえば、実施例2)のタンパク質濃度を、BCATMタンパク質アッセイ試薬(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を用いて製造業者の指示に従って決定した。濃度は7〜12mg/mlの範囲であった。膜のアリコート(28mlを複数使用)を10容量の高EDTA緩衝液(15mM EDTA、50mM HEPES、pH7.4、0.05M KCl、10%グリセリン、1mMジチオトレイトール、0.1mMペファブロック)に加えた。ときどき攪拌しながら膜を氷上で15分間インキュベートした。膜をスーパーライトGSAローター(SL−1500)で4℃にて13,000rpmで30分間遠心分離して回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の高塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、1M NaCl、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁した。
【0167】
上下にピペッティングするとともにときどき攪拌しながら氷上で15分間インキュベートすることによって膜を穏やかに混合した。膜を上記遠心分離により回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを21mlの無塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、10%グリセリン、1mM EDTA酸、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁させた。次の工程は炭酸塩洗浄を記載する:12容量(たとえば、252ml)の氷冷0.1M Na2CO3、pH11.5を加えた;懸濁液を冷室中、ニューテーター(nutator)で30分間振動させた;懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の無塩緩衝液中に再懸濁させ、穏やかに混合し、上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットには洗浄した膜画分(たとえば、単離し洗浄した膜画分)が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質を含んでいる。
【0168】
実施例4
以下に、洗浄した膜画分から膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を抽出するのに用いた方法を記載する。抽出した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は、界面活性剤で可溶化された形態で単離される。
可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製
洗浄した膜ペレット(たとえば、実施例3)を、実施例3で決定したように、膜画分中のタンパク質の最初の濃度に基づいて7〜8mg/mlの濃度にて抽出緩衝液(20mMビス/トリス、pH7.1、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁した。
【0169】
再懸濁したペレットをときどき混合しながらゆっくりと攪拌することによって氷上で45分間インキュベートし、ついで4℃にてBeckman TLA−100.3ローターで50,000rpmにて45分間遠心分離にかけて未抽出のタンパク質およびタンパク質複合体をペレット化した。上澄み液は界面活性剤で可溶化した形態にて膜から抽出した膜内在タンパク質を含むので、残した。可溶化した膜内在タンパク質のアリコートを前もって冷却した管(〜10ml/管)に入れ、液体窒素中で急速凍結し、ついで−80℃で貯蔵した。この可溶性調製物のタンパク質濃度は0.5〜1mg/mlであった。
【0170】
実施例5
以下に、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製物をガンマ−セクレターゼ複合体についてイムノアフィニティー濃縮するのに用いた方法を記載する。
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物(たとえば、実施例4)を、抽出緩衝液(20mMビス/トリス、pH7.1;1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMからなる0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液;10%グリセリン;1mM EDTA;1mMジチオトレイトール;および4μg/mlロイペプチン)で平衡化した抗PS1アフィニティーカラム(たとえば、実施例8および9)上に吸着させた。吸着(たとえば、結合)は4℃で行った。
【0171】
カラムを少なくとも20容量のPBSと0.5%CHAPSOTMとで洗浄した。カラムを0.1Mグリセリン、pH2.5と0.5%CHAPSOTMおよび10%グリセリンとで4℃にて溶出した。溶出した画分(1カラム容量)を直ちに0.15Mトリス/Cl、pH8(0.1カラム容量)で中和した。投入した抽出物、フロースルー画分、および溶出画分を実施例7に記載のゲルシステムを用いてガンマ−セクレターゼ活性についてアッセイした。投入したガンマ−セクレターゼ活性はいずれも抗体カラムを通り抜けることはなかった。一般に、投入活性の30%が溶出画分で回収された。
抗PS1抗体JH2またはJH5を結合したマトリックスを有するアフィニティーカラムは、HeLa膜抽出物からガンマ−セクレターゼ活性を部分的に奪った。これら2つの抗体の組み合わせは、可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含有する試料からガンマ−セクレターゼ活性を完全に除去した。
【0172】
幾つかの実験では、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物をPS1アフィニティーカラムに吸着させる前に、該調製物をモノS(Pharmacia)陽イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、ついでDEAEセファロースファーストフロー(Pharmacia)陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、ついでコムギ麦芽アグルチニンアガロース上でアフィニティー精製した。この濃縮物質の吸着は、コムギ麦芽アグルチニン(WGA)溶出緩衝液(20mMトリス/Cl、pH7.7;0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液;0.1M NaCl;30%グリセリン;0.5M N−アセチルグルコサミン;0.13mMペファブロック;および4μg/mlロイペプチン)で行った。
【0173】
実施例6
以下に、放射性標識したβAPPポリペプチド模倣物(たとえば、ガンマ−セクレターゼ基質)を、(1)洗浄した膜画分(たとえば、実施例3);(2)可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体(たとえば、実施例4);または(3)アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、実施例5)と反応させる3つの異なる再構成方法を記載する。
【0174】
洗浄した膜画分を用いた再構成法
洗浄した膜画分(たとえば、実施例3)を低塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、12μg/mlロイペプチン、0.5μM o−フェナントロリン)中に再懸濁させた。2μlの洗浄した膜を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上で加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。別法として、5μlの洗浄した膜を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
【0175】
ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は反応管を氷上に置くことにより行った。8μlの4×NuPage試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加え、95℃にて5分間インキュベートすることにより、SDS−PAGE分析用に開裂反応液の試料を調製した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0176】
可溶化したタンパク質/複合体を用いた再構成法
2μlの可溶化したタンパク質および複合体(実施例4)を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
【0177】
別法として、5μlの可溶化したタンパク質を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで8μlの4×SDS−PAGE試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加えることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を95℃に5分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0178】
アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成法
2μlのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体(実施例5)を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
別法として、5μlのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで8μlの4×SDS−PAGE試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加ることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を95℃に5分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0179】
実施例7
以下に、再構成法(たとえば、実施例6)からのガンマ−セクレターゼ開裂産物の分離および検出を行うのに用いたゲルシステムを記載する。機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体の存在は、放射性標識したβAPPポリペプチド模倣物の開裂をモニターすることにより検出した。たとえば、11kDaのβAPP−C100ポリペプチドのガンマ−セクレターゼ開裂は4kDaおよび6kDaの開裂産物を生成した。同様に、9kDaのβAPP−C83ポリペプチドの開裂は3kDaおよび6kDaの開裂産物を生成した。
【0180】
ガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出
ガンマ−セクレターゼ開裂反応液を、SDS−PAGEゲル、たとえば10%NuPageTMゲル(NOVEX、サンジエゴ、カリフォルニア)に負荷し、製造業者の指示に従って泳動した。ゲルを乾燥し、35S−標識βAPP基質(たとえば、みかけの11kDaのβAPP−C100ポリペプチド)および開裂産物(たとえば、4kDaおよび6kDaのポリペプチド)を蛍光造影(phosphorimager)分析(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)により検出した。放射性標識した基質および開裂産物の放射能シグナルを蛍光造影により定量した。
【0181】
放射性標識したβAPP−C100基質は、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物(図6および図7)およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物(図8)中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βAPPポリペプチドのC末端側フラグメントに対応する6kDaの開裂産物を生成した。
放射性標識したβAPP−C83基質もまた、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物(図7)およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βAPPポリペプチドのC末端側フラグメントに対応する6kDaの開裂産物を生成した。
【0182】
実施例8
以下に、抗PS1ポリクローナル抗体を生成するのに用いた方法を記載する。化学合成法を用いたPS1ペプチド抗原の調製
CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)の配列を有するPS1の合成ペプチド抗原に対し、抗PS1ポリクローナル抗体(「1357」と称する)を産生させた。このペプチド抗原はPS1のアミノ酸344−358を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのC末端システインを含む。
【0183】
CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)の配列を有するPS1の合成ペプチドに対しては抗PS1ポリクローナル抗体(「1398」と称する)を産生させた。このペプチド抗原はPS1のアミノ酸45−60を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのC末端システインを含む。
ノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)の配列を有するPS1の合成ペプチドに対しては抗PS1ポリクローナル抗体(「SR92」と称する)を産生させた。このペプチドはPS1のアミノ酸344−358を包含する。
【0184】
抗PS1ポリクローナル抗体1357、1398、およびSR92を産生するのに用いた合成ペプチドは、J. Stewart & J. Young, ”Solid phase peptide synthesis”(Pierce Chemical Company、ロックフォード、1984)の方法により合成した。カップリング剤としてm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い、1357および1398ポリクローナル抗体をN−末端システイン残基を介して卵アルブミン担体タンパク質にカップリングした(Harlow, E.およびLane, D. 1988: Antibodies: A Laboratory Manual, pp82−83 CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。
【0185】
組換えDNA法を用いたPS1ペプチド抗原の調製
組換えDNA法を用い、細菌で発現したPS1ポリペプチドフラグメントに対して抗PS1ポリクローナル抗体(「JH2」と称する)を産生させた。このポリペプチドフラグメントはPS1のアミノ酸1−77(配列番号7)を包含する。このフラグメントは、pGEX4T1ベクター(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)を用いて細菌のグルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。PS1コード配列(ヌクレオチド554−786)を末端EcoRI部位およびBamHI部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,202号および同第4,965,188号(参照のため本明細書中に引用する))を用いてcDNAライブラリーから増幅させ、得られたEcoRI−BamHIポリヌクレオチドフラグメントをpGEX4T1中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製、融合タンパク質の精製、およびGST融合体からのPS1 1−77の開裂は、GST精製モデュール(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)で提供される標準プロトコールに従って行った。
【0186】
「JH5」と称する抗PS1ポリクローナル抗体は、PS1「ループ」−GST融合タンパク質(配列番号8)に対して産生される精製ポリクローナル抗体である。この融合タンパク質は、pGEX4T1ベクター(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)を用いて細菌のグルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。PS1コード配列(ヌクレオチド1382−1769)を末端EcoRI部位およびBamHI部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてcDNAライブラリーから増幅させ、得られたEcoRI−BamHIポリヌクレオチドフラグメントをpGEX4T1中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製および融合タンパク質の精製は、GST精製モデュール(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)で提供される標準プロトコールに従って行った。
【0187】
ポリクローナル抗体を生成するための動物の免疫
200μlの滅菌リン酸緩衝食塩水中に懸濁し、200μlのフロイントの完全アジュバント(SIGMA Chemical Company、セントルイス、ミズーリ)とともに乳濁化した約2mgのペプチド結合卵アルブミンを用いてウサギを免疫した。この乳濁化したペプチドをHarlowおよびLaneの記載(Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, p.109、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)に従い、8−10の部位にて皮内注射した。400μlの50%リン酸緩衝食塩水/50%フロイントのアジュバント(不完全)中に100μgの抗原を含有する皮内ブースター注射を3週間後に投与した。ブースター注射の2週間後、および抗体力価が高く保持されているその後2週間の間に供試採血を行った(HarlowおよびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, pp.116−119、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。抗体力価の決定は、コンジュゲートしていないペプチドを用いてELISAにより行った(HarlowおよびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, pp.553−612、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。
【0188】
抗体の免疫精製
これらポリクローナル抗体を抗原カラム上で免疫精製した。抗原カラムは、製造業者の指示に従い、適当なペプチドをPharmacia HiTrap NHS−活性化カラム(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)に結合させて調製した。免疫精製は標準法(Immunoaffinity Purification of Antibodies on an Antigen Column, pp.314−5, E. HarlowおよびD. Lane, ”Antibodies: A Laboratory Manual” c. 1988、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)により行った。
【0189】
実施例9
以下に、天然に存在する機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、内生のガンマ−セクレターゼ複合体)および基質(たとえば、内生の基質)を含む膜画分を単離するのに用いた方法を記載する。この膜画分は、試薬をスクリーニングしてガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を同定するのに用いることができる。
【0190】
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および基質を含む膜の調製
ガンマ−セクレターゼ開裂に対する天然に存在する基質(たとえば、スウェーデン変異体βAPP)並びに内生レベルのガンマ−セクレターゼを発現するHeLa細胞からの細胞膜を上記実施例2の記載と同様にして調製した。タンパク質濃度を実施例3の記載と同様にして決定したところ7〜12mg/mlの範囲であったが、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出するにはわずか3mg/mlのタンパク質を含む希釈液で充分であった。膜を上記実施例3の記載と同様にして高塩緩衝液で2回洗浄した。膜は炭酸塩溶液では洗浄しなかった。その代わり、膜をTween−80(基質を膜内に保持する)を含有する溶液で洗浄した。簡単に、Tween−80洗浄を本明細書に記載する。
【0191】
ガラス棒を用いてペレットを10容量のTween−80緩衝液(0.05M HEPES、pH7.5、10%グリセリン、0.5%Tween−80)中に再懸濁させた。懸濁液を冷室中、ニューテーターで30分間振動させた。懸濁液を4℃にてスーパーライトGSAローター(SL−1500)で13,000rpmで30分間遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の無塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁させ、穏やかに混合した。懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットにはTween−80洗浄した膜画分が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質(たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体)および基質(たとえば、βAPP)を含んでいる。
【0192】
内生基質の開裂
Tween−80洗浄した膜のアリコート(5〜50μl)を0.5〜1mg/mlの濃度で無塩緩衝液に懸濁させた。膜を37℃に約3時間温めて開裂反応を開始させ、試料を氷上に置いて反応を停止させた。
インヒビター化合物をスクリーニングするプロトコールにおいて、温度を37℃にシフトする前に被験インヒビター化合物を膜試料に4〜10℃にて約10〜30μMの最終濃度にて加えた。
【0193】
時間分析( Time−Resolved )蛍光による開裂の検出
内生基質(たとえば、βAPP)の開裂を、新たに生成したAβペプチドなどの開裂産物の定量測定により検出した。9S3.2抗体(Biosolutions、ニューアーク、デラウエア)は、Aβ−40ペプチドを用いて調製した高親和性マウスモノクローナル抗体である。9S3.2抗体はAβの開裂したC末端に特異的に結合する。この抗体は前駆体(たとえば、βAPPタンパク質)には結合しない。モノクローナル抗体26D6−B2−B3は、カルボキシル末端を介して担体にカップリングしたAβ1−12ペプチドを用いて調製した別の高親和性マウスモノクローナル抗体である(SIBIA Neurosciences、ラジョラ、カリフォルニア)。26D6−B2−B3抗体はAβのN末端領域に結合する。この抗体は前駆体および開裂産物の両者に結合するであろう。
【0194】
上記開裂反応の終了後、60μlの冷却した各蛍光標識抗体を20μlの1mg/ml開裂膜に加えた。各抗体/膜の組み合わせを8回アッセイした。9S3.2蛍光標識抗体は0.3μg/mlにて加え、一方、26D2蛍光標識抗体は0.8μg/mlにて加えた。これら蛍光標識抗体を膜試料中で室温にて18〜24時間インキュベートし、その後、シグナルをDiscoveryR HTRFマイクロプレート分析器(Packard Instrument Company、メリデン、コネチカット)で読み取った。
【0195】
抗体9S3.2および26D6−B2−B3を蛍光付加物の適当な対で修飾し、該抗体のAβペプチドへの結合によって該付加物が極めて近接したときに蛍光エネルギー移動が起こるようにすることによって、開裂産物へのこれら抗体の同時結合を検出した(Kolb]ら、1996, ”Homogeneous Fluorescent technology in High Throughput Screening”, Journal of Biomolecular Screening 1: 203−210)。ついで、蛍光団を窒素レーザーパルスにより励起させ、蛍光エネルギー移動の程度を時間分析蛍光測定により定量した(Kolb, J. M., Yamanaka, G.およびManly, S. P. J.上掲)。
【0196】
図10に示すように、時間分析蛍光アッセイは、HPLAP−βAPPSWの2μl未満の膜懸濁液を入れたウエルでガンマ−セクレターゼ活性を検出した。さらに、このアッセイは、シグナル/バックグラウンドの比例した蛍光比をもたらすことにより増大量のガンマ−セクレターゼ活性に対しても感度を有していた。
このアッセイはまた、図11に示すようにAβフラグメントの検出においても同様に感度を有していた。合成Aβ−40ペプチドを反応緩衝液中に希釈し、蛍光付加物で修飾した抗体26D6および9S3.2とともにインキュベートした。蛍光シグナルはAβ−40ペプチドの濃度の増大に応じて増大した。
【0197】
本明細書を通じて様々な刊行物を言及してある。これら刊行物の開示は、本発明が関連する技術の状態を一層詳細に記載するために、その全体が本明細書中に参照のため引用される。
【図面の簡単な説明】
【図1A】βAPP(C−100)ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図1B】βAPP(C−83)ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図2】組換えβAPP(C−100)ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図3】組換えβAPP(C−83)ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図4】ベータ−セクレターゼ開裂したヒトβAPP(ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される)のアミノ酸配列。
【図5】S2−開裂したヒトノッチ−1(ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される)のアミノ酸配列。
【図6】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られた放射性標識した6kDaガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出。
【図7】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたC83基質およびC100基質の開裂産物の検出。
【図8】免疫単離したガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたC100基質の開裂産物の検出。
【図9】ガンマ−セクレターゼ基質の開裂を検出するための時間分析蛍光法の模式図。
【図10】HPLAP−βAPPSWを発現する細胞からの増大する容量の膜懸濁液が、増大する蛍光シグナル/バックグラウンド比によって示されるように、比例量のガンマ−セクレターゼ活性を提供することを示すグラフ。細胞を抗体26D6および9S3.2で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図11】増大する濃度のAβ−40ペプチドが比例量の蛍光シグナルを提供することを示すグラフ。Aβペプチドを抗体26D6および9S3.2で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図12】好ましいドナー分子の化学構造を示す一覧。
【図13】好ましい消光剤分子を含む幾つかの好ましいアクセプター分子の化学構造を示す一覧。
(技術分野)
本発明は、一般に、アルツハイマー病の顕著な特徴である斑アミロイド沈積物(plaque amyloid deposits)の分野に関する。とりわけ本発明は、ガンマ−セクレターゼ(gamma−secretase)活性を有する、単離した、機能的に活性なタンパク質に関する。ガンマ−セクレターゼ活性はアミロイドの産生に必要である。本発明はまた、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質を含む膜内在(integral−membrane)タンパク質およびタンパク質複合体の単離方法、およびガンマ−セクレターゼ活性の検出のためのアッセイにも関する。
【0002】
(背景技術)
アルツハイマー病は脳内の神経病理学的障害を特徴とし、大脳皮質および辺縁系皮質中の細胞外アミロイド斑およびニューロン内の対合した螺旋フィラメント(intraneuronal paired helical filaments)および神経細線維もつれを特色とする。一般に、アルツハイマー病は年配者の疾患であり、罹患率は60歳を過ぎると急激に上昇する。しかしながら、アルツハイマー病の早期の発病もわずか40〜50歳の患者で認められ、しばしば家族性のアルツハイマー病(FAD)と関連付けられている。
【0003】
両タイプのアルツハイマー病の経過は同じであると思われる。血管および斑のアミロイド沈積物の主要なタンパク質性成分は、βAPPのタンパク分解的開裂によって生成されるAβ−42ペプチドである。Aβ−42ペプチドがアルツハイマー病の病因において本質的役割を果たしているとの仮説を支持する多大な証拠がある。βアミロイド前駆体タンパク質(βAPP)からのAβの生成にはアルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼと称する3つの異なるプロテアーゼ活性が関与しており、βAPP、およびPS1およびPS2と称する2つの異なるプレセニリン中の変異によって変わる。
【0004】
今日ではβAPP(Kang, J.ら、1987 Nature 325: 733−736)、PS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)およびPS2(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977)についてヌクレオチド配列が決定されている。ベータ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードする候補ヌクレオチド配列(Vassar, R.ら、1999 Science 286: 735−741; 米国特許第5,744,346号および同第5,942,400号)、および候補アルファ−セクレターゼ分子(Lammich, S.ら、1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3922−3927)が同定されている。ガンマ−セクレターゼの単離配列は未だ解明されていない。
【0005】
成熟βAPPタンパク質は、細胞質膜、ゴルジ装置および小胞体に認められる膜内在性タンパク質である。βAPPは、大きな細胞外N末端ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび小さな細胞質内C末端テールを有する細胞表面レセプターと類似している(Kang, J.ら、1987上掲)。βAPP mRNAのスプライス変異体は、770、750および695アミノ酸のβAPPポリペプチドをコードしている。これら全ての形態のβAPPは開裂領域を含んでおり、アミロイド原性(amyloidogenic)のAβペプチドを生じ得る。正常な細胞では、βAPPは、アルファ−セクレターゼ、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼが関与する2つの異なる連続的な開裂経路のうちの一つを受ける(Dovey, H. F.ら、1993 Neuroreport 4: 1039−1042; Selkoe, D. J.ら、1994 Ann. Rev. of Cell Biol. 10: 373−403; Asami−Odaka, A.ら、1995 Biochemistry 34: 10272−10278)。
【0006】
一つの開裂経路では、アルファ−セクレターゼがβAPPを細胞外の膜/近位ドメイン(たとえば、770アミノ酸形態のβAPPのアミノ酸残基687のC末端側)で開裂して可溶性のN末端フラグメント(たとえば、アルファ−sAPPフラグメント)と膜に結合したC末端フラグメント(たとえば、9kD CTFまたはC83 CTF)を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したCTFを膜結合ドメイン内で開裂して、p3フラグメント(たとえば、3kDフラグメント)および6kDのC末端フラグメントを生成する。
【0007】
他の開裂経路では、ベータ−セクレターゼがβAPPを細胞外の膜/近位ドメイン(たとえば、770アミノ酸形態のβAPPのアミノ酸残基671のC末端側)で開裂して可溶性のN末端フラグメント(たとえば、100kD NTFまたはベータ−sAPPフラグメント)と膜に結合したC末端フラグメント(たとえば、11kD CTFまたはC 100 CTF)を生成する。ついで、ガンマ−セクレターゼが膜に結合したCTFを膜結合ドメイン内で開裂して、p6フラグメント(たとえば、6kDフラグメント)およびAβペプチド(たとえば、4kDフラグメント)を生成する。
【0008】
ガンマ−セクレターゼ開裂領域のアミノ酸配列は知られている(Duffy, C. L.ら、1988 Brain Res. 474: 100−111; Castano, E. M.およびFrangione, B. 1988 Lab. Invest. 58: 122−132)。ガンマ−セクレターゼは開裂領域内の様々な部位で開裂して(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993 Cell 75: 1039−1042)不均一なC末端を有するAβペプチドの集団を生成する。通常の患者ではAβペプチドは2つの主要な形態、すなわち大多数のAβ−40形と少数のAβ−42形(それぞれ異なるCOOH末端を有する)で認められる。最も一般的な形態のFADの患者は、42形の量の増大を示す。Aβ−40形はアミロイド斑の早期の沈積と関連していない。対照的に、Aβ−42形は早期かつ主として実質斑(parenchymal plaques)中に沈積し、Aβ−42がFAD患者でのアミロイド斑沈積において主要な役割を果たしているとの強力な証拠がある(Roher, A. E.ら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10836; Iwatasubo, T.ら、1994 Neuron 13: 45; Yamaguchi, H.ら、1995 Amyloid Int. J. Clin. Invest. 2: 7−16; Mann, D. M.ら、1996 Am. J. Pathol. 148: 1257)。
【0009】
一般に、同じガンマ−セクレターゼ酵素が40形および42形を生成すると考えられてきた。当該技術分野の研究者は相反する結果を報告しているため、今日でもこの問題は解決されていない。たとえば、2つの研究グループはそれぞれ独立に、ある種のプロテアーゼインヒビターがAβ−42レベルを選択的に低下させることを示唆するインビトロの結果を報告しており、Aβ−40およびAβ−42が2つの異なるガンマ−セクレターゼによって生成されると結論付けている(Citron, M.ら、1996 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 13170−13175; Klafki, H.−W.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 28655−28659)。第三の研究者のグループは、一連のプロテアーゼインヒビターがAβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドの分泌を抑制する相対的な能力を比較し、Aβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドが単一のプロテアーゼによって産生されるという反対の結論に到達した(Durkin, J. T.ら、1999 Journal of Biological Chemistry 274: 20499−20504)。
【0010】
Aβ−40形およびAβ−42形は広範囲の様々な細胞/組織で構成的に分泌され、生物学的流体中では可溶形態で見出されるため(Seubert, P.ら、1992 Nature 359: 325 375; Shoji, M.ら、1992 Science 258: 126−129)、FAD患者においてAβペプチドの両形態を充分に分析することが可能である。FAD患者の中には血清のAβ−42ペプチドレベルが上昇している者がある(Scheuner, D.ら、1996 Nat. Med. 2: 864−870)。FAD患者で認められるβAPP、PS1またはPS2遺伝子における変異が、βAPPタンパク質の開裂を変化させてAD−42ペプチドの相対量を増加させることが知られている(Tomita, T.ら、1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2025−2030; Duff, K.ら、1996 Nature 383: 710−713; Borchelt, D.ら、1996 Neuron 17: 1005−1013; Citron, M.ら、1997 Nat. Med. 3: 67−72)。
【0011】
βAPP遺伝子の点変異は、βAPP−ロンドン、βAPP−フラマン、およびβAPP−スウェーデンなどの比較的少数のFAD家系と連鎖している(Goate, A. M.ら、1991 Nature 349: 704−706; Chartier−Harlin, M. −C.ら、1991 Nature 353: 844−846; Murrell, J.ら、1991 Science 254: 97−99; Karlinsky, H.ら、1992 Neurology 42: 1445−1453; Mullan, M.ら、1992 Nature Genetics 1: 345−347)。PS2遺伝子の点変異はまた、少数のFADの症例と連鎖している(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977; Rogaev, E. I.ら、1995 Nature 376: 775−778)。FADの症例の大部分はPS1遺伝子の点変異によって引き起こされ(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)、それゆえAβ−42ペプチドの選択的な増大という結果となる(Scheuner, D.ら、1996上掲)。
【0012】
PS1およびPS2は膜内在タンパク質であり、6または8の膜貫通ドメインを有し(Doan, A.ら、1996 Neuron 17: 1023−1030; De Stooper, B.ら、1997 上掲)、小胞体、初期ゴルジ(early Golgi)、およびおそらく細胞表面に位置している(Xia, W.ら、1998 Biochem. 37: 16465−16471; Kovacs, D. M.ら、1996 Nature Med. 2: 224−229; Rayら、1999 J. Biol. Chem. 274: 36801−36807)。これらプレセニリンタンパク質は63%の配列同一性を有する。
【0013】
PS1が未解明の(elusive)ガンマ−セクレターゼであるかもしれないとの仮説がなされている。この仮説を支持する証拠としては、PS1を欠くマウスからの細胞が産生するAβペプチドレベルが有意に低減しているという観察が挙げられ、このことはPS1がガンマ−セクレターゼ活性を容易にするうえで何らかの役割を果たしていることを示している(De Stooper, B.ら、1997 上掲)。とりわけ、PS1がガンマ−セクレターゼ活性を有する自己賦活化した(autoactivated)アスパルチルプロテアーゼであるとの仮説がなされている(Wolfe, M. S.ら、1993 Nature 398: 513−517)。この仮説は、PS1の膜貫通ドメイン内に存在する2つのアスパラギン酸残基が、PS1およびガンマ−セクレターゼ活性のエンドタンパク分解プロセシングに必要であるという知見に基づいている(Wolfe, M. S.ら、1999上掲)。
【0014】
アスパラギン酸残基257のアラニンへの点変異およびアスパラギン酸残基385のアラニンへの点変異はPS1のエンドタンパク分解を抑制し、C100フラグメントおよびC83βAPPフラグメントの蓄積を引き起こしたが、このことはこれらアスパラギン酸残基がガンマ−セクレターゼ活性に特に必要であることを示唆している。同様の結果は、対応するアスパラギン酸残基の点変異を含む変異体PS2タンパク質で報告されている(Kimberley, W. T.ら、2000 J. Biol. Chem. 275: 3173−3178)。それでもPS1またはPS2が直接βAPP基質の開裂を触媒するとの証拠はない。さらに、PS1およびPS2は既知のプロテアーゼおよびアスパルチルプロテアーゼとの配列および構造上の類似性を有しない。
【0015】
他の仮説は、PS1がβAPP開裂経路の制御補助因子として機能することを示唆している(De Stooper, B.ら、1997 上掲; Wolfe, M. S.ら、1999 Nature 398: 513−517)。この仮説の支持は、PS1がSREBP開裂活性化タンパク質(SCAP)と構造上の類似性を有するとの観察によるものであり、このSREBP開裂活性化タンパク質(SCAP)もまた6〜8の膜貫通ドメインを有する膜内在タンパク質であり、SREBPの開裂を制御するうえで役割を果たしている(Hua, X.ら、1996 Cell 87: 415−426; Brown, M. S.およびGoldstein, J. L. 1997 Cell 89: 331−340; Sakai, J.ら、1997 J. Biol. Chem. 272: 20213 20221)。
【0016】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの仮説された役割は、βAPP様タンパク質であるAPLP1タンパク質(Wasco, W.ら、1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10758−10762)のC末端開裂産物がPS1を欠く原発(primary)ニューロンに蓄積する(Naruse, S.ら、1998 Neuron 21: 1213−1221)という事実によってさらに錯綜したものとなっている。この結果を説明する一つの仮説は、PS1がβAPPおよびAPLP1タンパク質の開裂の結果生じるC末端フラグメントの細胞内輸送を変調させるというものである(Naruse、上掲)。
【0017】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割として考えられるものはまた、βAPPおよびβAPP様タンパク質以外のタンパク質のタンパク分解プロセシングにも及んでいる。たとえば、ノッチ(Notch)タンパク質のタンパク分解開裂にPS1の存在が必要であることが以前に決定されている(Artavanis−Tsakonas, S.ら、1996 Science 268: 225−232; Kopan, R.およびTurner, D. 1996 Curr. Opin. Neurobiol. 6: 594−601; Weinmaster, G. 1997 Mol. Cell. Neurosci. 9: 91−102)。ノッチタンパク質は脊椎動物および無脊椎動物において多くの細胞運命の決定を媒体する単一膜貫通ドメイン細胞表面レセプターである。PS1内の2つの膜貫通アスパラギン酸残基の変異は、ノッチタンパク質の開裂を抑制する(Ray, W. J.ら、1999 J. Biol. Chem. 274: 36801−36807)。S2−開裂したノッチ1タンパク質内の仮説されたガンマ−セクレターゼ開裂配列(Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)は、一般に受け入れられているプロテアーゼ開裂部位のモチーフと類似性を有しない。
【0018】
(発明の開示)
(発明が解決しようとする技術的課題)
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼの役割は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体を単離することによって解決することができる。一般に、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は単離手順の際にその機能的活性を失いやすいので、機能的に活性な膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を単離することは困難である。この困難は、以下に記載する種々の方法を開発することにより克服された。
【0019】
さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有する単離したタンパク質複合体を提供する。本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒する。本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、Aβ−42ペプチドを生成するプロセシング経路を担う推定ガンマ−セクレターゼであると仮定されている。
【0020】
予備的な事項として、ガンマ−セクレターゼ活性の検出には、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在または不在の信頼でき、正確かつ迅速な検出を可能にするアッセイが必要である。さらに、ガンマ−セクレターゼ活性のインヒビターが望まれる場合には、大量の被験化合物を不当なプロセシングなしに正確にスクリーニングすることがとりわけ役立つ。
【0021】
(その解決方法)
それゆえ、本発明はガンマ−セクレターゼ活性およびそのインヒビターを検出する均一法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の均一アッセイ法の発見および応用は、ガンマ−セクレターゼ開裂産物の単離および回収の工程を必要とすることなく活性を検出することを可能にする。開裂産物の単離および回収のためのこれら工程の省略は、スピードおよび正確さの点で明らかな利点を提供する。さらに、本発明は、Aβまたは6kDaフラグメントの検出を含む、ガンマ−セクレターゼ活性の特異産物の検出の均一法を提供する。
【0022】
本発明は、ガンマ−セクレターゼが様々な哺乳動物細胞型の小胞体、ゴルジ装置および細胞質膜に認められる膜内在タンパク質であるという知見を提供する。
本発明は、βAPPポリペプチドなどの基質のタンパク分解開裂を触媒する単離タンパク質を提供する。機能的に活性なタンパク質複合体は、本明細書ではガンマ−セクレターゼとして、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体として記載する。本発明は、機能的に活性なガンマ−セクレターゼを含む単離した細胞不含膜画分を提供する。本発明はまた、可溶性の形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体をも提供する。
【0023】
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質をPS1とともに単離することによるガンマ−セクレターゼタンパク質の単離方法を提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ複合体などの可溶化した膜内在タンパク質またはタンパク質複合体の単離方法を提供する。
さらに、本発明は、N−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]およびCHAPSOTMを含む組成物を提供する。この新規な組成物は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の単離、再構成、基質の単離、およびガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定に有用である。
【0024】
本発明はまた、ガンマ−セクレターゼ活性の検出方法およびガンマ−セクレターゼ産物、とりわけAβの検出方法をも提供する。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬の同定方法を提供する。
ガンマ−セクレターゼインヒビターを同定するため、未開裂のβAPP、βAPPフラグメント、およびガンマ−セクレターゼを含有する試料に被験化合物を入れる。ガンマ−セクレターゼを活性化させ、生成するガンマ−開裂βAPPフラグメントの量に及ぼす被験化合物の影響をモニターする。β−セクレターゼがフラグメントを開裂するかまたは存在する場合でも、Aβの量をモニターすることができる。
【0025】
とりわけ本発明は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントの産生を測定することにより、流体試料中でのガンマ−セクレターゼによるβAPP基質の開裂を検出する効率的な系を提供する。この検出系は、一方から他方へ蛍光エネルギーを移転することが可能な1対の蛍光付加物を利用する。この1対の付加物を基質およびガンマ−セクレターゼ産物の標識として用いることにより、ガンマ−セクレターゼの活性をモニターすることができる。
【0026】
この結合アッセイは、各蛍光付加物を標識として同じガンマ−開裂βAPPフラグメントの異なる部位に結合させることにより行う。本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に通常のガンマ−セクレターゼ開裂の部位、すなわちアミノ酸残基711(Aβアミノ酸残基40に対応)にて特異的に結合し、一方、第二の蛍光付加物は同じガンマ−開裂βAPPフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸1〜702の部分に結合する。最も好ましくは、とりわけAβ検出をも目的とする場合には、第二の蛍光付加物はAβのアミノ酸配列1〜31に対応するアミノ酸配列内に結合する。
【0027】
場合により、第一の蛍光付加物は、代わりにβAPP、PS1またはPS2の変異に最も一般的に関連する開裂部位であるガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端のアミノ酸713(Aβアミノ酸残基42)に特異的に結合してよい。これら蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントの重複する部位に結合せず、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPのカルボキシ末端に特異的であって、未開裂βAPPに対しても他の型のガンマ−開裂βAPPフラグメントに対しても実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂は、結合した一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動を与えるときに検出される。
【0028】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出の別の態様では、これら付加物は別々の開裂産物に結合する。各蛍光付加物は、未開裂βAPP上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。この別の態様では、蛍光付加物の少なくとも一つがそのアミノ酸配列に結合し、未開裂βAPPの他の部位とは実質的に交差反応しないのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じる場合は蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合し、それゆえ励起後にエネルギー移動の実質的な低減という結果となる。
【0029】
術語の定義
本明細書において「単離した」とは、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体がリン脂質二重層から、および他の膜内在タンパク質およびタンパク質複合体から分離されることをいう。
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質」および「ガンマ−セクレターゼ」とは、ガンマ−セクレターゼ活性を示すタンパク質をいう。ガンマ−セクレターゼ活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ−セクレターゼ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。
【0030】
本明細書において「ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体」および「ガンマ−セクレターゼ複合体」とは、少なくとも2つのタンパク質分子を含むタンパク質複合体であって、該タンパク質分子のうち少なくとも1つがガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒するものをいう。ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体を構成するタンパク質分子は、互いに共有結合的相互作用および/または非共有結合的相互作用で結合していてよい。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体はまた、ビタミン、ATPまたは二価カチオンなどの非タンパク質分子をも含んでいてよい。
【0031】
本明細書において「アミノ末端領域」および「カルボキシ末端領域」は、ある特定の部位(とりわけガンマ−セクレターゼの開裂部位)のいずれかの側にあるペプチド鎖の部分が、それぞれアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれに近位した側にあるかを示す参照位置として用いる。該部分は、さらに該ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端を含んでいても含んでいなくともよい。さらに、本明細書において「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は同様に参照位置として用いるが、「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は該ペプチド鎖のそれぞれアミノ末端またはカルボキシ末端を含む点で「アミノ末端領域」または「カルボキシ末端領域」とは区別される。
【0032】
本明細書において「可溶化した」とは、膜を断片化することにより膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から分離する化合物を用い、脂質二重層(たとえば、膜二重層)および他の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体から所定の膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を分離することをいう。膜内在タンパク質を可溶化する典型的な方法は、リン脂質二重層を断片化して膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を与える界面活性剤などの化合物を用いることを含み、その際、該脂質二重層の化学特性を模倣した環境を用いて可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体が天然のコンホメーションに折り畳まれるようにする。それゆえ、界面活性剤の環境中にあるタンパク質またはタンパク質複合体は可溶化形態にあるタンパク質またはタンパク質複合体である。さらに、可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体は、その天然のコンホメーションにある該タンパク質またはタンパク質複合体によって示される生物学的活性を有していても有していなくてもよい。
【0033】
本明細書に記載する本発明が一層完全に理解されるべく、以下の記載を列記する。
本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質
ガンマ−セクレターゼタンパク質は、機能的に活性である場合にはガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質を開裂する。開裂は典型的に基質開裂産物という結果となる。本発明は、たとえば界面活性剤で可溶化した形態で単離したガンマ−セクレターゼタンパク質を提供する。一つの態様において、本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質はガンマ−セクレターゼタンパク質複合体の成分を含む。さらに、本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質と反応する抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント)を提供する。
【0034】
単離したガンマ−セクレターゼの機能的活性
本発明は、ガンマ−セクレターゼが膜内在プロテアーゼであるという知見を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼの機能的活性を示す単離した膜画分および可溶化タンパク質複合体を提供する。
ガンマ−セクレターゼの機能的活性としては、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の認識、およびガンマ−セクレターゼ開裂部位でガンマ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はβAPPなどのポリペプチド基質を開裂する。
【0035】
細胞ではガンマ−セクレターゼ複合体はβAPPをガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂してβAPP開裂産物を生成する。βAPP開裂産物としては、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるAβ−40およびAβ−42ペプチド;アルファ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるp3ペプチド;ガンマ−セクレターゼによる開裂のC末端産物であるp6ペプチド;またはそれらのフラグメントが挙げられる(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 13 Cell 75: 1039−1042において概説)。βAPPのガンマ−セクレターゼ開裂配列は知られている(Duffy, C. L.ら、1988 Brain Res. 474: 100−111; Castano, E. M.およびFrangione, B. 1988 Lab. Invest. 58: 122−132)。
【0036】
単離したガンマ−セクレターゼタンパク質複合体
本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が様々な哺乳動物細胞型の小胞体またはゴルジ体において典型的に認められる膜内在タンパク質複合体であり得るとの知見を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は細胞質膜でも認められる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり(pI<5.6)、グリコシル化されており、約700kDaの分子サイズを示す。
【0037】
ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体は、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましくはヒトなどの哺乳動物種を含む多くの種から得た細胞から単離することができる。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、植物、昆虫(D. melanogasterなど)および無脊椎動物(C. elegansなど)などの種から単離できる。さらに、ガンマ−セクレターゼはガンマ−セクレターゼ複合体を含むあらゆる適当な組織または細胞(たとえば、ガンマ−セクレターゼ陽性細胞)から単離できる。たとえば、ヒトH4神経膠腫細胞、およびマウスN2A神経芽細胞腫細胞、ヒト胚性腎(HEK)293細胞、COS−1細胞、CHO細胞、およびHeLa細胞などのガンマ−セクレターゼ陽性細胞(haass, C.ら、1992 Nature 359: 322−325; Busciglio, J.ら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2092−2096)は、βAPP開裂産物(たとえば、p3ペプチド、p6ペプチド、およびAβペプチド)を産生する。
【0038】
ガンマ−セクレターゼ複合体は、Aβペプチド(40形および42形)、p3ペプチドまたはp6ペプチドなどのβAPP開裂産物の通常レベルの蓄積のような野生型の表現型を示す細胞または組織から単離できる。あるいは、ガンマ−セクレターゼ複合体は、一層高レベルのβAPP開裂産物の蓄積などの変異表現型を示す細胞または組織から単離できる。変異した組織/細胞での蓄積したβAPP開裂産物のレベルは、正常な組織/細胞採取源で認められる同開裂産物のレベルと比較すると高い。変異表現型を示す組織/細胞としては、変異形のβAPP、またはPS1もしくはPS2タンパク質を有するあらゆる種、または組織、または細胞株からの対象物が挙げられる(Tanzi, R.ら、1996 Neurobiol. Dis. 3: 159−169で概説)。
【0039】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体の成分
本発明は、タンパク質成分としてPS1やPS2などの少なくとも1つのプレセニリンタンパク質分子とともにガンマ−セクレターゼを含む単離したガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。さらに、ガンマ−セクレターゼ複合体は、ガンマ−セクレターゼ活性を示す少なくとも1つの他のタンパク質分子と結合したPS1またはPS2タンパク質を含む。ガンマ−セクレターゼ複合体は、ビタミン、ATP、二価カチオンまたは脂質などの非タンパク質成分と結合していても結合していなくともよい。
【0040】
単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、同じかまたは異なる多型形態である1を超えるPS1またはPS2分子を含んでいてよく、その結果、それぞれホモ重合性またはへテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。たとえば、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はPS1またはPS2分子の2つの同一の多型形態を含んでいてよく、その結果、ホモ重合性のタンパク質複合体となってよい。あるいは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体はPS1またはPS2の2つの異なる形態を含んでいてよく、その結果、へテロ重合性のタンパク質複合体となってよい。単離したガンマ−セクレターゼ複合体は、それぞれ少なくとも1つのPS1およびPS2分子を含んでいてよい。
【0041】
本発明は、野生型、変異体またはスプライス変異形を含む、PS1および/またはPS2タンパク質分子の少なくとも1つの異なる形態を含むガンマ−セクレターゼ複合体を提供する。ガンマ−セクレターゼ複合体は、野生型、変異体、またはスプライス変異形のPS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)またはPS2(米国特許第5,986,054号)を有する主体(たとえば、あらゆる種から)、組織または細胞株などの採取源から単離できる。
【0042】
膜内在タンパク質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体を含む膜画分の単離
ガンマ−セクレターゼ複合体は、膜画分の成分として単離することができる。たとえば、膜画分を単離するための常法は以下の工程を含む:細胞を回収する;該細胞を溶解して周辺膜タンパク質および膜内在タンパク質を含む細胞膜を得る;該膜を回収する;該膜を洗浄して周辺膜タンパク質を除去する;ついで洗浄した膜画分を単離する。たとえば、HeLa細胞溶解法はHeintzおよびRoeder(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2713)によって記載されており、H4細胞の溶解および膜画分の単離法はS. B. Robertsら(1994 J. Biol. Chem. 269: 3111−3116)によって記載されており、膜の洗浄はP. WalterおよびG. Blobel(1981 J. Cell. Biol. 91: 551−556)によって記載されている。
【0043】
可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法
本発明は、可溶化形態の膜内在タンパク質の単離方法を提供する。本発明の方法は、機能的な活性を保持しているかまたは保持していない可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。さらに、本発明の方法は、ガンマ−セクレターゼの機能的な活性を有する可溶化したタンパク質複合体を単離するのに用いることができる。
本発明は、下記の一般的工程を含む方法を提供する:膜を溶液で可溶化して膜内在タンパク質、タンパク質複合体および他の細胞成分を有する混合物を得る;ついで膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する。
【0044】
好ましい方法は洗浄した膜画分を可溶化することを含む。この洗浄した該膜画分に含まれる膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を膜から可溶化する(たとえば抽出する)。通常の抽出法(たとえば、可溶化工程)は、一般に水溶液中の両親媒性界面活性剤を用いて行う。イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤などの多くの異なる界面活性剤が市販されているが、これらはその解離作用、臨界ミセル濃度(CMC)、酵素活性に及ぼす作用、さらなる精製に及ぼす作用、および溶液からの除去の容易さが異なる。多くの異なる界面活性剤および膜タンパク質の可溶化方法は当業者に知られている(Neugebauer 1990 Methods Enzymol. 182: 239−253; Hjelmiland 1990 Methods Enzymol. 182: 252−264)。
【0045】
単離手順の際に失われ得る膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の機能的活性を保持するため、本発明の一つの態様は、N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド](これはCHAPSOTM(Pierce、ロックフォード、イリノイ)の製造の際の中間体である)を含む抽出溶液を用いた抽出法を提供する。この中間体N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]は、以下、「mCHAPSO」と称する。
【0046】
本発明は、mCHAPSOおよび市販の界面活性剤CHAPSOTMを含む溶液を提供する。好ましい溶液は、1部(容量/容量)のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。この好ましい溶液は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体の単離に有用である。
【0047】
ガンマ−セクレターゼ複合体の濃縮方法
本発明は、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体、たとえばガンマ−セクレターゼ複合体を有する試料(たとえば、調製物)の濃縮方法を提供する。たとえば、単離した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を本発明の可溶化方法により調製し、ついでイムノアフィニティー濃縮、陽イオン交換または陰イオン交換、レクチン−アフィニティー、および/またはゲル濾過などの常法を用いてガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体は、典型的に比活性(一定容量のガンマ−セクレターゼタンパク質複合体が1分当たりに基質開裂される量として定義される)の増大を示すであろう。
【0048】
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
本発明は、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼを単離することによるガンマ−セクレターゼの試料からの単離方法を提供する。好ましい方法はイムノアフィニティー濃縮法を用いる。たとえば、イムノアフィニティー法は以下の工程を含む:試料(たとえば、可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体)をプレセニリンを認識および結合する試薬と接触させて試薬/プレセニリン複合体を形成させる;ついで該試薬/プレセニリン複合体を試料から単離する。
【0049】
好ましい濃縮方法は、プレセニリンに特異的に結合する抗プレセニリン抗体(たとえば、抗PS1抗体および/または抗PS2抗体)などの試薬を用いることを含む。しかしながら、他の手段による濃縮が可能であり、当業者には明らかである(表1)。好ましい濃縮方法は、mCHAPSOを含む溶液中でプレセニリンを認識および結合する試薬に試料を接触させることを含む。好ましい溶液は、1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
【0050】
好ましい態様において本発明の方法は以下の工程を含む:プレセニリンに特異的に結合するアフィニティーマトリックスを調製する;該アフィニティーマトリックスを新規な平衡溶液を用いて平衡化する;平衡化した該アフィニティーマトリックスを、プレセニリンがアフィニティーマトリックスに結合するのを可能にする条件下でガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼ)を含む可溶化した膜内在画分と接触させる;ついで該アフィニティーマトリックスに結合しなかったタンパク質を除去してガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮する。さらなる工程としては、所望のタンパク質を該アフィニティーマトリックスから溶出することが挙げられる。所望のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー濃縮のための一般的な工程および条件は、Antibodies: A Laboratory Manual(Harlow, E.およびLane, D., 1988 CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)に記載されている。
【0051】
イムノアフィニティーマトリックスは、固体支持体マトリックスを選択し;ついで選択した該マトリックスにプレセニリンを認識および結合する試薬(たとえば、抗プレセニリン抗体)を付着させてアフィニティーマトリックスを生成することにより調整する。マトリックスは、プロテインAまたはプロテインGビーズ、または活性化ビーズを含む様々な市販の固体支持体マトリックスから選択することができる。使用するマトリックスの選択は、付着させる抗体に対するマトリックスの親和性に依存するであろう。たとえば、プロテインAおよびプロテインGビーズは種々の抗体に対して異なる結合親和性スペクトルを示す。
【0052】
マトリックスの抗体への付着は、直接カップリング法および高塩直接カップリング法を含む種々のカップリング法を用いて行うことができる(Gersten, D. M.およびMarchalonis, J. J., 1978 J. Immunol. Methods, 24: 305−309; Schneider, C.ら、1982 J. BIol. Chem. 257: 10766−10769)。別法は、抗体を活性化ビーズにカップリングすることを含む(Porath, J.およびAxen, R. 1976 Methods Enzymol. 44: 19−45; Scouten, W. H. 1987 Methods Enzymol. 135: 3065; Harlow, E.およびLane, D., 1988上掲)。ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための好ましいマトリックスとしては、プロテインAビーズが挙げられる。好ましいカップリング法としては、ジメチルスベリミデート(dimethyl suberimidate)を用いた直接カップリング法が挙げられる。
【0053】
マトリックスは、プレセニリンと特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその組み合わせに付着させることができる。抗PS1抗体および抗PS2抗体は、全長または断片のプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体は、天然源から単離したプレセニリンまたは組換えDNA法または化学的合成法によって合成したプレセニリンタンパク質に対して産生させることができる。これら抗体はまた、抗プレセニリン抗体の単離および精製を容易にするためにシステインやヒスチジンなどの付加的なアミノ酸タグを有していてよい。別法として、マトリックスは、単離したガンマ−セクレターゼ複合体に特異的に反応する抗体に付着させることができる。
【0054】
これら抗体は、プレセニリンへの弱い結合から堅固な結合に到る所定範囲の結合特性を示す。たとえば、マトリックスは、PS1またはPS2に結合したガンマ−セクレターゼのアフィニティー濃縮のために抗PS1および/または抗PS2ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を付着させることができる。
【0055】
一つの態様において、プレセニリンに結合したガンマ−セクレターゼのイムノアフィニティー濃縮に用いる抗体としては、CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)(ヒトPS1のアミノ酸334−358に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのN末端システインを付加したもの)の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体(たとえば、1357)が挙げられる。他の好ましい抗体は、CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)(ヒトPS1のアミノ酸45−60に対応するものに、該ペプチド抗原を担体タンパク質へカップリングするためのN末端システインを付加したもの)の配列を有する合成ペプチド抗原に対して産生することのできるポリクローナル抗体(たとえば、1398)である。ガンマ−セクレターゼ複合体を濃縮するための最も好ましいアフィニティーマトリックスとしては、1357抗体と1398抗体との混合物が挙げられる。
【0056】
他の好ましいポリクローナル抗体は、ノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)の配列を有するペプチドに対して産生させることのできるポリクローナル抗体(たとえば、SR92)である。
他の好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ複合体のアフィニティー濃縮のための抗ヒトPS1抗体の使用を提供し、該抗体としては、細菌発現したPS1フラグメント(PS1 1−77)(配列番号7)に対して産生させた精製ポリクローナルウサギ抗体であるJH2;およびPS1「ループ」−GST融合タンパク質(配列番号8)に対して産生させた精製ポリクローナル抗体であるJH5が挙げられる。イムノアフィニティーマトリックスは、低pHまたはグリシンなどのような穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にする抗体とカップリングすることができる。たとえば、1357抗体、1398抗体、JH2抗体またはJH5抗体とカップリングしたイムノアフィニティーマトリックスは、比較的穏やかな溶出条件下での結合ガンマ−セクレターゼ複合体の溶出を可能にするであろう。
【0057】
アフィニティーマトリックスは新規な平衡溶液を用いて平衡化することができる。ガンマ−セクレターゼ複合体などの所望のタンパク質のアフィニティー濃縮のための好ましい平衡化溶液は、1部(容量/容量)のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
所望のタンパク質を含む可溶化した膜内在画分を、所望の該タンパク質とアフィニティーマトリックスとの結合を可能にする条件下でアフィニティーマトリックスと接触させる。接触工程は、懸濁液中、溶液中、またはカラム上で行うことができる。典型的には接触工程は4℃で1〜16時間行う。所望のタンパク質は、この接触工程の間にアフィニティーマトリックスに吸着または結合することができる。
【0058】
洗浄工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを洗浄溶液と接触させることを含む。好ましい洗浄溶液は非イオン性界面活性剤であるCHAPSOTMを含み、このものは膜内在画分中に存在する未結合(たとえば、未吸着)のタンパク質およびタンパク質複合体を除去する。典型的には、使用する洗浄溶液の容量は、アフィニティーマトリックスの容量の少なくとも20倍である。
【0059】
溶出工程は、所望のタンパク質が結合したアフィニティーマトリックスを、所望の該タンパク質を結合させないようにする溶出液と接触させることを含む。選択する溶出液は、アフィニティーマトリックスにカップリングさせた抗体の結合特性に依存するであろう。さらに、異なる溶出液を組み合わせてまたは段階的に用いることができる。たとえば、溶出液は、高いかまたは低いpH、高い塩、イオン性界面活性剤、解離剤(たとえば尿素やグアニジンHCl)、カオトロピック剤、有機溶媒、および/または水を含んでいてよい。アフィニティーマトリックスからガンマ−セクレターゼ複合体を溶出するための好ましい溶出液は、グリシンおよびCHAPSOTMを含む低pH溶液(たとえば、pH2.5)である。
【0060】
他の濃縮方法
ガンマ−セクレターゼについて試料を濃縮する他の方法としては、PS1またはPS2に特異的に結合しない様々な方法が挙げられる。たとえば、他の方法としては、陽イオン交換クロマトグラフィー(たとえば、Mono S; Pharmacia);陰イオン交換クロマトグラフィー(たとえば、DEAEセファロースファーストフロー; Pharmacia);レクチンアフィニティー(たとえば、コムギ麦芽アグルチニンアガロース; Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー);およびゲル濾過(たとえば、スペロース6(Superose 6); Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)が挙げられる。
【0061】
一つの態様において、本発明の方法は、グリコシル化タンパク質を認識および結合する分子(たとえば、コムギ麦芽アグルチニン)に試料を接触させて分子/グリコシル化タンパク質複合体を生成させ;ついで該分子/グリコシル化タンパク質複合体を試料から除去してガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体について試料を濃縮することを含む。
【0062】
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の試料は、これら様々な濃縮方法のいずれかの組み合わせを用いてガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体について濃縮することができる。濃縮のための好ましい方法としては、可溶化した試料を陽イオン交換条件、陰イオン交換条件、レクチンアフィニティー条件、および/またはゲル濾過条件に供することが挙げられる。可溶化した画分の濃縮はガンマ−セクレターゼの単位活性によって測定されるように、様々な条件で増大した(Scopes, R. K., 1987 Protein Purification; Principles and Practice, Springer−Verlag、ニューヨーク、ニューヨーク)。たとえば、陰イオン交換条件は約2倍の濃縮という結果となり、レクチン−アフィニティー条件は約46倍の濃縮という結果となり、ゲル濾過条件は約56倍の濃縮という結果となった(表1参照)。
【0063】
これら結果は、単離したガンマ−セクレターゼ複合体の化学的および物理的性質の特性を明らかにした。たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体は酸性であり(pI<5.6;たとえば、陰イオン交換条件を用いた濃縮の場合)、グリコシル化されており(たとえば、コムギ麦芽レクチンに結合する)、極めて大きい(たとえば、>700kDa;たとえば、ゲル濾過により決定した場合)。
【0064】
【表1】
*=開裂した基質(フィコモル)/分/μl
**=フィコモル/分/mg
【0065】
ガンマ−セクレターゼの基質
本発明は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するプロテアーゼによって開裂されることのできるガンマ−セクレターゼ基質(タンパク質およびタンパク質複合体である)を提供する。該基質は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列で開裂されて適当な開裂産物を生成することができる。さらに、本発明は、本発明の基質および基質の開裂産物と反応しうる抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメント)を提供する。
【0066】
ガンマ−セクレターゼ開裂配列
ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂されるアミノ酸配列である。ガンマ−セクレターゼ開裂配列は、以前にβAPPで同定されている(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993 Cell 75: 1039−1042で概説)(図4および配列番号10)。ガンマ−セクレターゼ基質は、ガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質またはタンパク質複合体によって認識および開裂されるガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むタンパク質またはポリペプチドである。従って、ガンマ−セクレターゼ基質としては、βAPPプレタンパク質の完全長配列(Kang, J.ら、1987上掲)、成熟βAPPタンパク質の完全長配列(Kang, J.ら、1987上掲)、またはその断片が挙げられる。好ましい基質は、βAPPの膜貫通ドメインを含む。たとえば、基質は、C100 CTFやC83 CTF βAPP開裂産物などのように、膜貫通ドメインを含む完全長で成熟βAPPタンパク質の断片であってよい。好ましい基質は、C83 CTFなどのようにアルファ開裂βAPPタンパク質を模倣したものである(図3)。あるいは、基質は、C100 CTFなどのようにベータ開裂βAPPタンパク質を模倣したものである(図2)。
【0067】
さらに、ガンマ−セクレターゼは、ノッチやAPLP1などの他の膜貫通タンパク質を開裂すると仮定されている。開裂は膜にわたっているドメインのうちの細胞質側の半分で起こり(Selkoe, D. J. 1999 Nature 399 (6738補遺): A23−31; Wang, R.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 31894−31902; Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)、不均一な開裂産物を生成する(Wang, R.ら、1996上掲)。ガンマ−セクレターゼによる開裂のための基質の認識、およびおそらく利用可能性(availability)は、サイトゾル外膜フェース(extra−cytosolic membrane face)の30アミノ酸残基へのサイトゾル外ドメイン(extra−cytosolic domains)の短縮に依存している(Brown, M. S.ら、Cell 100: 391−398; Mumm, J. S.ら、2000 Molecular Cell 5: 197−206)。
【0068】
推定ガンマ−セクレターゼ開裂配列がノッチ−1タンパク質で同定されている(Schroeter, E. H.ら、1998 Nature 393: 382−386)(図5および配列番号11)。ガンマ−セクレターゼはまたAPLP1タンパク質を開裂するとも仮定されている(Wasco, W.ら、1992上掲)。好ましいガンマ−セクレターゼ基質としては、ノッチ−1タンパク質の完全長配列(Schroeter, E. H.ら、1998上掲; Mumm, J. S.ら、2000 Molecular Cell 5: 197−206)、APLP1タンパク質(Wasco, W.ら、1992上掲)、またはその断片が挙げられる。
【0069】
基質の構造
ガンマ−セクレターゼ基質はまた、βAPP、ノッチ、またはAPLP1などの基質に認められる天然のコンホメーションと類似または同一の構造に折り畳まれた膜貫通ドメインをも含む。天然のコンホメーションとは、天然に存在するタンパク質の折り畳まれた構造をいう。たとえば、膜内在タンパク質の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質の折り畳まれた構造である。同様に、膜内在タンパク質複合体の天然のコンホメーションは、天然に存在する膜で認められるようなタンパク質複合体の折り畳まれた構造である。
【0070】
基質は、それを膜様の環境が取り囲むときに天然のコンホメーションに折り畳まれることができる。たとえば、膜様の環境は、膜画分、ミクロソーム、膜内在タンパク質を可溶化するのに用いた界面活性剤により提供することができる。従って、基質は、膜画分またはミクロソーム中のタンパク質成分として、または界面活性剤で可溶化した基質として単離することができる。好ましい基質は、ミクロソーム膜により取り囲まれたポリペプチドである。さらに好ましい基質は、界面活性剤で可溶化した形態で単離したポリペプチドである。
【0071】
ガンマ−セクレターゼ基質の単離方法
ガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂され得るポリペプチド基質は、様々な方法によって生成することができる。たとえば、基質は、組織試料や細胞培養液などの天然に存在する採取源からの膜画分の成分として単離することができる(Seubert, P.上掲; Shoji, M.上掲; Haass, C.上掲; Busciglio, J.上掲)。別法として、基質は、組換えDNA法(Sambrookら、1989、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、Plainview、ニューヨーク;およびAusubel, F.ら、1989 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク)を用い、βAPP(Haass, C.およびSelkoe, D. J. 1993上掲)、ノッチ(Schroeter, E. H.ら、1998上掲)、またはAPLP1(Kang, J.ら、1987上掲; Wasco, W.ら、1992上掲)タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および宿主−ベクター系を用いて生成することができる。
【0072】
基質はまた、ポリペプチドの合成の基礎としてβAPP、ノッチまたはAPLP1のアミノ酸配列を用いて化学合成法(Dugas, H.およびPenney, C. 1981、Bioorganic Chemistry, pp.54−92, Spring−Verlag、ニューヨーク)によっても生成することができる。基質はまた、インビトロでの転写−翻訳法(Pelham, H. R. B.およびJackson, R. J. 1976 Eur. J. Biochem. 67: 247; Krieg, P.およびMelton, D 1984 Nucl. Acids. Res. 12, 7057)によっても生成することができる。
【0073】
好ましい基質は、ミクロソーム膜や膜様の環境(たとえば、可溶化した形態)を模倣する界面活性剤などの膜様の環境に取り囲まれた形態で生成される。さらに好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜の形態で生成される。たとえば、市販のイヌ膵臓ミクロソームは内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さない(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。最も好ましい基質は、内生のガンマ−セクレターゼ活性を欠くミクロソーム膜から基質を可溶化する(たとえば、抽出する)ことにより生成される。
【0074】
これら方法のいずれかにより生成した基質は、検出しうるマーカーで標識することができる。検出しうるマーカーの例としては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素が挙げられるがこれらに限られるものではない。標識したポリペプチドおよびタンパク質を生成する方法は当該技術分野でよく知られている(Sambrookら、1989上掲)。
【0075】
基質をコードする組換え分子
基質は、基質またはその断片をコードする組換え分子(たとえば、rDNA)を用いて組換えDNA法により生成することができる。本明細書においてrDNA分子とは、インビトロで分子操作に供したDNA分子をいう。rDNA分子を生成する方法は当該技術分野(たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning (1989))でよく知られており、基質を生成するのに有用である。
【0076】
本発明は、基質をコードするヌクレオチド配列を有する種々の核酸分子を提供する。基質を生成する好ましい方法は、BAPPタンパク質の最後の100のアミノ酸残基のN末端にインフレームで連結したβAPPプレタンパク質からのシグナルペプチド(Kang, J.ら、1987上掲)を含むβAPP基質(図1Aおよび図2;配列番号1および2)をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、C100 C末端フラグメント(CTF)を模倣するβAPP基質をコードする。
【0077】
他の好ましい方法は、βAPPタンパク質の最後の83アミノ酸残基のN末端にインフレームで連結したβAPPシグナルペプチドを含むβAPP基質(図1Bおよび図3;配列番号3および4)をコードする核酸分子を用いる。この核酸分子は、C−83 CTFを模倣するβAPP基質をコードする。
【0078】
基質配列を含むベクター
発現ベクターを用いて基質を生成することができる。たとえば、基質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに作動可能に連結させて組換え発現ベクターを生成することができる。
ベクターとは、プラスミド、コスミド、およびファージミドをいうがこれらに限られるものではない。好ましいベクターとしては、適当な宿主細胞内でのベクターの複製を指令するレプリコンを含む自動複製ベクターが挙げられる。好ましいベクターはまた、プロモーター配列などの発現制御配列をも含み、該配列は作動可能に連結した基質配列の転写を可能とし、大腸菌などの適当な宿主細胞中での作動可能に連結した基質配列の発現を制御するのに用いることができる(たとえば、転写および/または翻訳)。
【0079】
原核発現制御配列は当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、および他の転写制御配列が挙げられるがこれらに限られるものではない。翻訳に関与する他の発現制御配列は当該技術分野で知られており、シャイン−ダルガノ配列、および開始コドンおよび終止コドンが挙げられるがこれらに限られるものではない。さらに、開始コドンは、挿入配列全体の転写を確実にすべく正しい読取り枠になければならない。外来の転写配列および開始コドンは、様々な由来であってよく、天然および合成のいずれであってもよい。発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって促進することができる(Scharf, D.ら、1994 Results Probl Cell Differ 20: 125−62; Bittnerら、1987 Methods in Enzymol 153: 516−544)。
【0080】
好ましいベクターはまた、薬剤耐性、たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする少なくとも1つの選択マーカー遺伝子をも含む。典型的には、ベクターはまた、外来DNA配列の都合のよい挿入を可能にするマルチプルエンドヌクレアーゼ制限部位をも含む。
【0081】
好ましいベクターは、真核宿主細胞と適合する発現ベクターである。好ましいベクターは、精製した細菌またはバクテリオファージのRNAポリメラーゼとの反応でのmRNA転写物の産生のためのプロモーター配列要素を含む。真核細胞発現ベクターは当該技術分野でよく知られており、幾つかの市販のものから利用できる。そのようなベクターの典型的なものは、大腸菌で外来遺伝子を発現するのに用いるpcDNA3発現ベクターであり、ファージT7プロモーターを含み、アンピシリンおよびG418に対する耐性を付与する(InVitrogen、カールスバード、カリフォルニア)。他の例としては、容易に精製できる融合タンパク質の高レベルの発現を指令するベクターが挙げられる。そのようなベクターとしては、BLUESCRIPT(Stratagene)(基質コード配列をベクター中でアミノ末端のMetおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの7残基の配列とインフレームでライゲートしてハイブリッドタンパク質が産生されるようにする);pINベクター(Van Heeke & Schuster 1989 J Biol Chem 264: 5503−5509)などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられるがこれらに限られるものではない。
【0082】
pGEXベクター(Promega、マジソン、ウイスコンシン)もまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造するタンパク質は、目的とするクローニングポリペプチドを随意にGST残基から放出できるように、ヘパリン、トロンビンまたは第XA因子プロテアーゼ開裂部位を含ませるようにデザインする。
【0083】
基質を生成するのに用いる宿主−ベクター系
宿主−ベクター系を用いて基質を生成することができる。宿主−ベクター系としては、基質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを導入した適当な宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。たとえば、多くの市販の大腸菌株がとりわけ外来タンパク質の発現に有用である。適当な真核宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの動物細胞が挙げられる。
【0084】
さらに、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を変調する能力または所望の仕方で発現タンパク質をプロセシングする能力により選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加(lipidation)およびアシル化が挙げられるがこれらに限られるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、折り畳みおよび/または機能にとって重要である。様々な宿主細胞、たとえばCHO、HeLa、MDCK、293、WI38などが、そのような翻訳後の活性のための特別の細胞機構および特徴的なメカニズムを有しており、導入した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【0085】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生のためには安定な発現が好ましい。たとえば、基質を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内生の発現配列および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に切り換える前に細胞を増殖培地で1〜2日増殖させる。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性の凝集塊は、細胞型に適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【0086】
組換えベクターの適当な細胞中への導入は、使用したベクターおよび用いた系の種類に典型的に依存したよく知られた方法により行うことができる。たとえば、エレクトロポレーションおよび塩処理法による原核宿主細胞の形質転換を典型的に用いる。たとえば、Cohenら、Proc Acad Sci USA (1972) 69: 2110;およびManiatisら、(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)を参照。rDNAを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理法を典型的に用いる(Grahamら、1973 Virology 52: 456; Wiglerら、1979 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373−76)。
【0087】
組換えベクターを導入した宿主細胞はよく知られた方法により同定することができる。たとえば、本発明のrDNAの導入により得られる細胞をクローニングして単一のコロニーを産生することができる。これらコロニーからの細胞を回収し、溶解し、そのDNA含有物をSouthern, J. Mol. Biol. (1975) 98: 503またはBerentら、Biotech. (1985) 3: 208に記載された方法などを用いてrDNAの存在について調べるか、または該細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によりアッセイすることができる。
【0088】
いずれの選択系を用いても形質転換した細胞株を回収することができる。これらの選択系としては、これらに限られるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler, M.ら、1977 Cell 11: 223−32)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy, I.ら、1980 Cell 22: 817−23)が挙げられ、それぞれtk−マイナス細胞またはaprt−マイナス細胞に用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎に用いることができる;たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler, M.ら、1980 Proc Natl Acad Sci 77: 3567−70);アミノグリコシドネオマイシンおよびG−418に対する耐性を付与するnpt(Colbere−Garapin, F.ら、1981 J Mol Biol 150: 1−14)およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するalsまたはpat。
【0089】
さらなる選択遺伝子が記載されており、たとえば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisDがある(Hartman, S. C.およびR. C. Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 8047−51)。最近、目に見えるマーカーが人気を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるGUS、およびルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するのみならず特定のベクター系に基づく一過性のまたは安定なタンパク質発現の量を測定するためにも広く用いられている(Rhodes, C. A.ら、1995 Methods Mol Biol 55: 121−131)。
【0090】
酵母宿主細胞では、β−因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHなどの構成的または誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる(Ausubel, F.ら、1989、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク; Grantら、1987 Methods in Enzymology 153: 516−544)。
【0091】
植物発現ベクターを用いる場合は、基質をコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれによっても行うことができる。たとえば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーター(Brissonら、1984 Nature 310: 511−514)などのウイルスプロモーターを単独で、またはTMVからのオメガリーダー配列(Takamatsuら、1987 EMBO J. 6: 307−311)と組み合わせて用いることができる。あるいは、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら、1984 EMBO J 3: 1671−1680; Broglieら、1984 Science 224: 838−843)または熱ショックタンパク質(Winter, J.およびSinibaldi, R. M. 1991 Results Probl. Cell. Differ. 17: 85−105)などの植物プロモーターを用いることができる。これらベクターの植物細胞中への導入は、直接DNA形質転換または病原体を介したトランスフェクションにより行うことができる(Hobbs, S., 1992、McGraw Yearbook of Science and Technology、マックグロウヒル、ニューヨーク、ニューヨーク、pp191−196; WeissbachおよびWeissbach 1988、Methods for Plant Molecular Biology、アカデミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、pp.421−463)。
【0092】
基質を発現させるのに用いることができる他の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Autographa californica 核多角体病ウイルス(AcNPV)を、Spodoptera frugiperda細胞中またはTrichoplusia幼生中で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。基質コード配列はポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。基質配列の挿入が首尾よくいくとポリヘドリン遺伝子は不活化され、外殻タンパク質を欠く組換えウイルスを生成するであろう。ついで、この組換えウイルスを用いてS. frugiperda細胞またはTrichoplusia幼生に感染させると該細胞または該幼生中で基質は発現される(Smithら、1983 J Virol 46: 584; Engelhard, E. K.ら、1994 Proc Nat Acad Sci 91: 3224−7)。
【0093】
哺乳動物宿主細胞では多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、アデノウイルス後期プロモーター(たとえば、転写のため)および3分節リーダー配列(たとえば、翻訳のため)を含むアデノウイルスベクター中に基質コード配列を作動可能に連結する。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域中への挿入は、感染した宿主細胞中で基質を発現できるウイルスという結果となるであろう(LoganおよびShenk 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655−59)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞中での発現を増大させることができる。
【0094】
基質を生成するための宿主−ベクター法
一般に、宿主/ベクター系を利用した基質の産生は、典型的に以下の工程を含む。まず、たとえば配列番号1または3に開示するポリヌクレオチド配列のうちのいずれかの一つのような基質をコードする核酸分子を得る。ついで、基質をコードする核酸分子を、好ましくは上記のような発現制御配列に作動可能に連結させて発現ベクター中に挿入し、基質コード配列を含む組換え発現ベクターを生成させる。ついで、標準的な形質転換法により発現ベクターを適当な宿主中に導入し、得られた形質転換宿主を基質のインビボでの産生を可能にする条件下で培養する。たとえば、基質配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、増殖条件は適当なインデューサーを含むであろう。組換えベクターは、基質配列を宿主ゲノム中に組み込むことができる。別法として、組換えベクターは、自己複製ベクターの一部として基質配列を染色体外にて保持することができる。かくして産生させた基質は、増殖培地または細胞から直接、単離する。不純物が許容し得る幾つかの場合にはタンパク質の回収および精製は必要でない。
【0095】
当業者であれば容易に当該技術分野で知られた適当な宿主/発現系を基質コード配列に使用すべく適合させて基質を産生させることができる(Cohenら、1972 Proc. Acad. Sci. USA 69: 2110;およびManiatisら、1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)。種々のタンパク質精製法の例は、Strategies for Protein Purification and Characterization (1996) pp 396, Marshak, D. R.らに見出すことができる。
【0096】
基質を生成するためのインビトロ転写−翻訳法
基質は、当該技術分野でよく知られた転写−翻訳法を用いてインビトロで生成することができる。たとえば、インビトロ翻訳法としては、ウサギ網状赤血球法(Pelham, H. R. B.およびJackson, R. J. 1976 Eur. J. Biochem. 67: 247)およびコムギ麦芽溶解法が挙げられる。一般に、網状赤血球法は、所望のタンパク質をコードするRNA鋳型を細胞の翻訳成分(たとえば、リボソームタンパク質、rRNA、およびtRNA)およびアミノ酸と、該RNA鋳型のコードタンパク質への翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。RNA鋳型は、細胞または組織から単離したmRNAであってよい。RNA鋳型はまた、SP6/T7転写プロモーターを用いたpGEM系(Promega、マジソン、ウイスコンシン)などのように、組換えDNA法を用いてDNA鋳型から生成することもできる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応に含ませて、放射性標識したタンパク質を生成させることができる。ウサギ網状赤血球またはコムギ麦芽から単離した種々のインビトロ翻訳系が市販されている(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。
【0097】
別法として、基質はまた組み合わせた(coupled)転写−翻訳系を用いても生成することができる。一般に、このような組み合わせた系は、所望のタンパク質をコードするDNA鋳型を転写成分および翻訳成分と、該DNA鋳型のコードタンパク質への転写および翻訳を可能とする条件下で反応させることを含む。たとえば、TNTTM系(Promega、マジソン、ウイスコンシン)は、T3、T7、またはSP6プロモーターなどの高度に特異的なRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含むベクターを使用することを含む。所望のタンパク質をコードするDNA配列をプロモーターに作動可能に連結させて組換えベクターを生成することができ、この組換えベクターはDNA鋳型として作用する。このDNA鋳型を、転写および翻訳成分、たとえばRNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド、翻訳成分およびアミノ酸と反応させることができる。さらに、放射性標識した同位体などの検出しうるマーカーを翻訳反応中に含ませて放射性標識したタンパク質を生成させることができる。種々の組み合わせ系が市販されている(Promega、マジソン、ウイスコンシン)。
【0098】
ミクロソーム基質の生成方法
本発明は、ミクロソーム形態の基質を生成する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む:(1)ガンマ−セクレターゼ開裂配列を含むポリペプチド基質をミクロソーム膜中に挿入することにより、ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する;ついで(2)ガンマ−セクレターゼによって開裂しうるポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を単離する。
【0099】
基質は、ミクロソーム膜の存在下で組み合わせ転写−翻訳法を行うことにより生成させることができる(Walter, P.およびBlobel, G. 1983 Meth. Enzymology 65, 856)。組み合わせ転写−翻訳法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子(たとえば、DNAまたはRNA)を用いて行うことができる。この手順の際に、翻訳された基質はミクロソーム膜中に挿入され折り畳まれて、ガンマ−セクレターゼによって認識および開裂され得るポリペプチド基質を有するミクロソーム膜を生成する。ミクロソーム膜の脂質二重層は、膜環境内で挿入タンパク質の折り畳みを可能にする膜環境を提供する。ミクロソーム膜を生成するための好ましい方法は、イヌ膵臓ミクロソーム(Promega、マジソン、ウイスコンシン)などのように内生のガンマ−セクレターゼ活性を示さないミクロソーム膜を用いることを含む。
【0100】
可溶化基質を生成する方法
本発明は、界面活性剤で可溶化した形態のガンマ−セクレターゼ基質を生成する方法を提供する。好ましい方法は、ガンマ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチドを挿入したミクロソーム膜から可溶化基質を単離する。この方法の一般的工程は、(1)ミクロソーム膜からポリペプチド基質を可溶化する;ついで(2)ミクロソーム膜からガンマ−セクレターゼ基質を単離することを含む。
【0101】
ミクロソームからのポリペプチド基質の抽出は、N−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]およびCHAPSOTMを含む抽出溶液を用いて行うことができる。好ましい抽出溶液は、1部(容量/容量)のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSOTMを含む。
【0102】
ガンマ−セクレターゼ活性を検出するための再構成法
単離した膜画分を用いた再構成法
本発明は、単離したガンマ−セクレターゼ基質の開裂方法を提供する。これは本明細書ではまた「再構成」法とも称し、単離したガンマ−セクレターゼ基質を開裂することによりガンマ−セクレターゼ活性を検出することを含む。本明細書において「再構成」法とは、単離した触媒性タンパク質(たとえば、プロテアーゼ)の機能的活性を試験するために該触媒性タンパク質を別途単離した基質と混合するアッセイをいう。一般的な再構成法は当該技術分野でよく知られている(Jackson, R. C.およびBlobel, G. 1977 J Cell Biol 12: 5508; ZwizinskiおよびWickner 1980 J Biol Chem 255: 7973)。
【0103】
たとえば、再構成系では、単離したプロテアーゼが単離した基質を開裂する能力を試験するため、該プロテアーゼと該基質とを混合する。単離したプロテアーゼは、ガンマ−セクレターゼタンパク質、ガンマ−セクレターゼタンパク質複合体、またはガンマ−セクレターゼ活性を含む膜画分であってよい。典型的に、再構成系は、触媒性タンパク質の機能的活性に適した条件下でインキュベートする。
【0104】
本発明の一つの態様において、本発明の単離したガンマ−セクレターゼ基質を本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体と接触させ、ついでガンマ−セクレターゼが該基質を開裂させる条件下でかくして接触させた基質をインキュベートする方法を提供する。基質の接触は、mCHAPSOを含む溶液中で行うことができる。好ましい反応溶液は、1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMを含む。
【0105】
他の態様において、本発明は、単離した膜画分中でガンマ−セクレターゼ活性を検出する再構成法を提供する。この方法は、単離した膜画分を(内生の基質(もし存在するなら)ではなく)別途単離したガンマ−セクレターゼ基質とともにインキュベートし、ついで該膜画分中のガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質が該基質を開裂させる条件下で、接触した該膜画分をインキュベートすることを含む。ガンマ−開裂基質の検出は、検出しうるマーカーで標識した別途単離した基質を用いてアッセイの明確な解釈を可能とすることによって行うことができる。別法として、ガンマ−開裂基質はまた、開裂したガンマ−セクレターゼ基質で新たに生成する末端に対して反応性の抗体などの免疫検出法を用いて検出することができる。
【0106】
開裂産物の検出
本発明はまた、開裂産物の存在を検出することによって試料中のガンマ−セクレターゼ活性または目的とする単離タンパク質を検出する方法を提供する。ガンマ−セクレターゼ活性の結果生じる開裂産物は、免疫検出法を含む種々の方法を用いて検出することができる。たとえば、開裂産物は、AβペプチドのN末端またはC末端に特異的に反応する抗体を用いて免疫沈降させ、ついで標準SDS/PAGEゲル上で分離することができる(Citron, M.ら、1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13170−13175)。この方法の変法は、免疫沈降による種々のAβペプチドの存在の検出およびBicine/Tris SDS/尿素ゲル(Klafki, H. −W.ら、1996 J. Biol. Chem. 271: 28655−28659)または質量分析法(Wang, R.ら、1996 J Biol Chem. 271: 31894−902)による40ペプチド形と42ペプチド形との分離を同時に行うことを含む。他の方法はELISAアッセイを含む(Wolfe, M. S.ら、1999 Biochemistry 38: 4720−4727; Vassar, R.ら、1999 Science 286: 735−741)。
【0107】
別法として、基質を放射性標識などの検出しうるマーカーで標識し、開裂産物をゲル中で検出することができる。たとえば、適当なマーカーを35S−Met放射性標識で標識し、開裂産物を分離し、標準SDS−PAGEゲルで検出することができる。
【0108】
開裂産物の量は、免疫学的方法、クロマトグラフィー法または電気泳動法を含む種々の方法により測定できる。再構成アッセイの結果得られた開裂産物の量は、特定のアッセイで使用したガンマ−セクレターゼ複合体が機能的に活性であるか、変異体であるか、あるいはガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬によって阻害されているかを決定するのに用いることができる。たとえば、機能的に活性であることがわかっているガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成アッセイで得られた開裂産物の量は、活性が未知のガンマ−セクレターゼ複合体用いた、あるいはガンマ−セクレターゼに対する未知の阻害作用を有する試薬と反応させたガンマ−セクレターゼ複合体を用いた実験的な再構成アッセイから得られた開裂産物の量と比較するための比較標準として用いることができる。開裂産物の欠失を示す、または比較標準アッセイにおける量と比べて開裂産物の量が検出しうるほどに低減している実験的な再構成アッセイは、該実験的アッセイが、機能的に低減した(reduced−functional)ガンマ−セクレターゼ、非機能的(non−functional)ガンマ−セクレターゼ、またはガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を含んでいることを示している。
【0109】
ガンマ−セクレターゼのインヒビターの同定方法
本発明の単離したガンマ−セクレターゼタンパク質(たとえば、膜中の、可溶化した、または種々の濃縮形態の複合体)は、ガンマ−セクレターゼに結合するおよび/またはガンマ−セクレターゼの活性に変化を引き起こす試薬を同定するスクリーニング戦略に有用である。たとえば、試薬はガンマ−セクレターゼを活性化あるいは阻害する。好ましい試薬はガンマ−セクレターゼ活性を阻害するであろう。これら試薬は、アルツハイマー病などのようなAβペプチドの上昇レベルと関連した疾患を治療するうえで有用である。
【0110】
本発明の単離したガンマ−セクレターゼ複合体に結合する候補試薬を同定する一般的方法は以下の工程を含む。本発明のガンマ−セクレターゼを単離する;該ガンマ−セクレターゼを目的とする試薬と接触させる;ついで、該試薬がガンマ−セクレターゼを阻害するか否かを上記で述べた適当な手段により検出する。好ましい方法は、mCHAPSOを含む溶液の存在下でガンマ−セクレターゼを接触させることを含む。
【0111】
スクリーニングアッセイは、膜形態、可溶化形態、または種々の濃縮形態のいずれかにある単離したガンマ−セクレターゼ複合体を用い、上記で記載した再構成法と同様にして行うことができる。
候補試薬は、たとえばリガンドであってよく、これは典型的にポリペプチド、核酸分子、有機分子、ビタミン誘導体または金属である。当業者であれば本発明のスクリーニング法に用いる試薬の構造特性において何ら制約のないことが容易に認識できるであろう。該試薬は、合成したものであってもよいし、あるいは細胞構成成分のように天然に存在するものであってもよい。本発明の方法で試験する細胞抽出物は、たとえば、細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物または部分的に精製した細胞画分であってよい。
【0112】
ポリペプチド試薬は、当該技術分野で知られているように、標準的な固相または液相ペプチド合成法を用いて生成することができる。さらに、これらペプチドをコードする核酸分子は、標準的な組換えDNA法を用いて生成できるし、または市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いても合成できる。
抗体試薬は、ガンマ−セクレターゼ複合体の選択したドメインまたは領域に免疫反応することができる。一般に、抗体は、抗原性領域として該抗体の標的とされることを意図するガンマ−セクレターゼ複合体の部分を含むペプチドで適当な哺乳動物主体を免疫することにより得られる。
【0113】
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを低減するなどによりガンマ−セクレターゼの活性を低減させるときにガンマ−セクレターゼの活性に拮抗するという。好ましいアンタゴニストは、ガンマ−セクレターゼの活性を50%以上、好ましくは90%以上低減させ、最も好ましくはすべての活性を排除するであろう。
本明細書において試薬は、該試薬が開裂産物のレベルを増大させるなどのようにガンマ−セクレターゼの活性を増大させるときにガンマ−セクレターゼの活性を増強させるという。
【0114】
ガンマ−セクレターゼ活性を有する膜画分の開裂活性を阻害する目的試薬を迅速に同定する方法
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および内生の基質を含む単離した膜画分は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する試薬をスクリーニングするための比較的迅速な方法に有用である。内生の基質の完全性を保持する単離した膜画分は知られている(Roberts, S.ら、1994上掲)。たとえば、膜画分は、内生のガンマ−セクレターゼを発現するHeLa細胞およびβAPPのスウェーデン変異体(「βAPPSW」)などの基質から調製できる。
【0115】
単離した膜は、ガンマ−セクレターゼの活性を阻害する候補試薬をスクリーニングするのに用いることができる。内生基質の開裂産物は、開裂産物のN末端またはC末端に特異的に結合する抗体を用いてモニターおよび検出できる。たとえば、AβペプチドのN末端領域に結合する抗体(たとえば、26D6−B2−B3R、SIBIA Neurosciences、ラジョラ、カリフォルニア)またはC末端領域に結合する抗体(たとえば、9S3.2R抗体、Biosolutions、ニューアーク、デラウエア)は知られている。さらに、これら抗体は、1対の蛍光付加物であって、AβペプチドのN末端またはC末端または領域に結合した結果として該蛍光付加物が近接した位置に置かれたときに蛍光エネルギーを移動させるもので修飾することができる(図9)。蛍光の欠如は、ガンマ−セクレターゼ活性の阻害の結果として、開裂産物の不在を示す。
【0116】
本明細書において、本発明の「ガンマ−開裂βAPPフラグメント」とは、ガンマ−セクレターゼによってそのガンマ−セクレターゼ開裂部位で開裂されたβAPPまたはβAPPフラグメントの幾つかのタイプのいずれか、すなわち、6kDa C末端フラグメント、p3フラグメント、Aβ−40ペプチドおよびAβ−42ペプチドおよび大きなN末端産物をいう。たとえば、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントはAβ−40ペプチドもしくはAβ−42ペプチドかまたは6kDa C末端フラグメントのいずれかである。もしもα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼがガンマ−セクレターゼ活性の前提条件でないなら、ガンマ−開裂βAPPフラグメントは6kDa C末端かまたはβAPPのN末端からガンマ−セクレターゼ開裂部位にわたる大きなN末端産物(770形のβAPPから開裂された場合には約105kDa)のいずれかである。さらに、本明細書において「未開裂βAPP」とは、ガンマ−セクレターゼによっては開裂されていないが、α−セクレターゼもしくはβ−セクレターゼによって、または同一の切断または他の手段によって開裂されているβAPPまたはβAPPフラグメントをいう。
【0117】
上記に記載したように、本発明の検出系はガンマ−セクレターゼ開裂の産物を検出するために1対の蛍光付加物を用いる。当業者によって認識されるように、これら蛍光付加物はそれぞれ、蛍光エネルギーを移動または受領しうる分子、および該分子をタンパク質またはペプチドに結合させる官能基を含む。本発明の目的のために使用できるよく知られた官能基としては、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド−、ヨードアセトアミド−、またはブロモアセトアミド−官能基が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0118】
1対の蛍光付加物のうちの一方は、蛍光を与え、第二の分子に蛍光エネルギーを移動させることのできるドナー分子を含む。好ましくはドナー分子は永続する蛍光を有し、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、Alexa Fluor 488R(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン)などのN−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩、Cy3R(Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー)などの1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩および当該技術分野で知られた他のドナー分子であってよい。好ましいドナー分子の化学構造を図12に示してある。最も好ましくはドナー分子はユウロピウムクリプテートまたはキレートである。
【0119】
1対の蛍光付加物のうちの他の蛍光付加物は、ドナー分子からの蛍光エネルギーを受領するアクセプター分子を含む。好ましくはアクセプター分子自体は所定の波長(すなわち、x1−APCでは約665nm)で短期間の蛍光しか有しないが、ドナー分子から蛍光エネルギーを受領して増幅した蛍光シグナルを生成することができる。本明細書において増幅したシグナルとは、対合しないアクセプターに通常付随するシグナルに比べて一層長期間で一層大きな強度を有する蛍光シグナルをいい、アクセプターおよび/またはドナーの各種類に応じて変わる(Kolbら、1996, ”Homogeneous Fluorescent technology in High Throughput Screening”, Journal of Biomolecular Screening 1: 203−210を参照)。
【0120】
本発明において使用できるアクセプター分子としては、アロフィコシアニンの誘導体、すなわちXL665R(Packard Biosciences、メリデン、コネチカット)などの架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンまたはCy5R(Amersham Pharmacia Biotech Inc.、ピスカタウエイ、ニュージャージー)などの1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩が挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましいアクセプター分子の化学構造は図13に示してある。当業者に知られた他のドナーおよびアクセプター分子は、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research chemicals, Molecular Probes Inc.、ユージーン、オレゴン(Haugland編、第6版、1996); Van Der Meerら、Resonance Energy Transfer, Theory and Data、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク(1991);およびHemmilaら、Bioanalytical Applications of Labelling Technologies、ワラックオイ、ツルク、フィンランド(Hemmila編、第2版、1994)に見出すことができる。
【0121】
互いに極めて近接して結合したときに、ドナー分子の励起はアクセプター分子へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす。たとえば、励起したユウロピウムクリプテートはx1−APCにエネルギーの直接移動をもたらし、かくして約665nmにて増幅したシグナル(約660−670nmで現れる)を生成する。ユウロピウムクリプテートは665nmでは殆ど蛍光を放射しないので、665nm蛍光シグナルの検出および測定は、2つの蛍光分子が極めて近接しているときに無放射蛍光共鳴エネルギーがアクセプター分子x1−APCに移動したことを示している。さらに、ユウロピウムクリプテートは約620nmで蛍光放射する(約615−625nmで現れる)ので、620nm蛍光の測定は内部標準を提供する。測定した620nm蛍光に対する665nm蛍光の比は、2つの蛍光分子の近接度の指標として用いることができる。それゆえ、エネルギーの検出しうる移動は、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長(ここでは665nmから620nm)へのシグナルの比に比べた該比の変化により、または当業者に知られたこのシグナルの他のある種の標準化(normalization)により、アクセプター波長(ここでは約665nm)での増幅したシグナルによって表される。さらに、この標準化法はユウロピウムクリプテートとx1−APCに限られるものではなく、近接結合を検出するための他の蛍光対、すなわち、フルオレセインとクマリン、Cy3RとCy5R(Amersham Pharmacia、ピスカタウエイ、ニュージャージー)またはフルオレセインとテトラメチルローダミンおよび当該技術分野でよく知られた他の蛍光対とともに用いることもできる。
【0122】
検出は、レーザー、キセノンフラッシュランプ、ジュウテリウム−タングステンランプまたは当該技術分野でよく知られた他のエネルギー源によるドナー分子の励起により行う。好ましい態様において、好ましい励起源はレーザーによるものである。とりわけ両付加物が同じフラグメントに極めて近接して結合している場合には、ドナー蛍光分子の励起はアクセプター分子への蛍光エネルギーの移動を引き起こし、かくしてアクセプターの放出波長(上記に記載したようにx1−APCでは約665nm)での蛍光シグナルを生じる。逆に付加物が極めて近接していない(すなわち、未結合かまたは別のフラグメントに結合している)ときは、アクセプター分子からの増幅されたシグナルが殆どまたは全くないことによって、対合していないときのアクセプターの波長からドナーの波長へのシグナルの比に比べた該比が変化しないことによって、または当業者によく知られた他のある種の標準化によって示されるように、エネルギーの移動の実質的な低下をもたらす。
【0123】
別法として、アクセプター分子は、励起したドナー分子からの蛍光エネルギーを吸収することによりドナー蛍光シグナルを低減することのできる蛍光消光剤分子であってよい。蛍光消光剤分子はそれ自体は蛍光シグナルを生じることはなく、ドナー分子の蛍光エネルギーを熱または分子運動として消耗させるであろう。本発明において消光剤として用いることのできる蛍光アクセプターとしては、これらに限られるものではないが、ダブシル(dabcyl)、QSY−7R(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン)やBHQ−3R(Biosearch Technologies, Inc.、ノバト、カリフォルニア)などの9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩が挙げられる。
【0124】
好ましい消光剤分子の幾つかの化学構造を図13に示してある。当業者に知られた他の消光剤分子は、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research chemicals, Molecular Probes Inc.、ユージーン、オレゴン(Haugland編、第6版、1996); Van Der Meerら、Resonance Energy Transfer, Theory and Data、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、ニューヨーク(1991);およびHemmilaら、Bioanalytical Applications of Labelling Technologies、ワラックオイ、ツルク、フィンランド(Hemmila編、第2版、1994)に見出すことができる。
【0125】
x1−APCなどの上記に記載したアクセプター分子とは対照的に、蛍光消光剤分子は同じフラグメント上に極めて近接して存在するときに励起したドナーからのエネルギーを吸収し、それ自体の蛍光シグナルは生じないであろう。それゆえ、極めて近接して存在するときにアクセプター分子が消光剤分子である場合のエネルギーの検出しうる移動は、対合しないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーの蛍光シグナルが低減することによって示される。従って、極めて近接することなく、またアクセプター分子が消光剤である場合に、エネルギー移動の実質的な低下の検出は対合していないときのドナーの蛍光シグナルに比べてドナーによる蛍光シグナルの不変化をもたらす。
【0126】
両方の場合においてアクセプターはそれ自体のシグナルを生じない。ドナー分子と消光剤分子との好ましい対としては、EDANSとダブシル、Alexa Fluor 488RとQSY−7R(ともにMolecular Probes、ユージーン、オレゴンより入手可能)、およびCy5R(Amersham Pharmacia、ピスカタウエイ、ニュージャージー)とBHQ−3R(Biosearch Technologies, Inc.、ノバト、カリフォルニア)が挙げられるが、これらに限られるものではない。他のドナーとアクセプター(または消光剤)との対は、蛍光付加物の当業者による通常の実験によって見出すことができる。
【0127】
蛍光付加物によるガンマ−セクレターゼ開裂産物の結合または「標識」は、直接的、半直接的または間接的であってよい。たとえば、蛍光付加物の対は、未開裂βAPP、βAPPフラグメントまたはガンマ−開裂βAPPに直接結合させることができるし、または半直接的な場合は蛍光付加物の一方を抗体などの第二の分子に結合させるか、またはストレプトアビジン−ビオチン結合または当該技術分野でよく知られた他の結合法により結合させることができる。好ましくは結合は間接的なものであり、その際、各蛍光付加物を別々に抗体で修飾し、少なくとも一つの抗体がガンマ−開裂βAPPフラグメント上のエピトープに特異的であって未開裂βAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応しないものである。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、非交差反応エピトープはガンマ−開裂βAPPのアミノ酸残基711かまたは713のいずれかでの(ガンマ−開裂βAPPフラグメントがAβであるときはアミノ酸残基40または42)ガンマ−セクレターゼの開裂部位である。
【0128】
下記にさらに詳細に記載するように、当業者はガンマ−開裂ペプチド上のいずれの所望の部位についても結合特異性を有するモノクローナル抗体を作製することが可能である。モノクローナル抗体を作製することができるということは、今度はどの部位に蛍光付加物が結合するかに関して柔軟性をもたらす。
【0129】
本発明の好ましい態様において、第一の蛍光付加物はガンマ−セクレターゼ開裂部位、すなわちガンマ−開裂βAPPのアミノ酸残基711(Aβ−40の場合はアミノ酸残基40)を含むカルボキシ末端でガンマ−開裂βAPPフラグメントに特異的であり、最も好ましくは未開裂βAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと交差反応をしない。ガンマ−セクレターゼがアミノ酸残基713(Aβ−42の場合はアミノ酸残基42)を開裂する場合は、第一の蛍光付加物はアミノ酸残基713を含むカルボキシ末端に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPとは交差反応しない。第二の蛍光付加物は、同じガンマ−開裂βAPPフラグメントのアミノ末端領域のアミノ酸1〜702の部分に結合する。最も好ましくは、第二の蛍光付加物は、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPに結合する(図4参照)。
【0130】
Aβアミノ酸配列1−31の対応位置は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントの性質に依存して変わるであろう:(1)p3フラグメントではアミノ酸1−15のみがAβに対応する、(2)大きなN末端フラグメントでは、対応するアミノ酸配列は開裂したβAPP形態のサイズに依存して3つの位置のうちの1つであってよい(695形では対応アミノ酸配列は596−627;750形では対応配列はアミノ酸651−682;および770形ではアミノ酸671−702)、およびもちろん(3)Aβペプチドでは対応するアミノ酸は1−31である。好ましくは、第一の蛍光付加物の結合部位は第二の蛍光付加物の結合部位と交差反応しないかまたは重複しない。最も好ましくは、第一の蛍光付加物はドナー分子を含み、抗体で修飾されており、一方、第二の蛍光付加物はアクセプター分子を含み、第二の抗体で修飾されている。
【0131】
好ましい態様において、検出系は、まずβAPP基質で開裂反応を行うことにより行う。ガンマ−セクレターゼによる開裂は、下記実施例9に記載するように0℃から37℃に温度をシフトすることにより開始する。基質の開裂後、好ましくはモノクローナル抗体で修飾した2つの蛍光付加物を反応液に加える。同じガンマ−開裂βAPPフラグメントへの第一の蛍光付加物および第二の蛍光付加物の結合は、蛍光エネルギーの移動を可能にする。第一の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントなどの前駆体と実質的に交差反応しないのが好ましい。第二の蛍光付加物は、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPフラグメント、並びに同配列を含むいかなるβAPP前駆体または他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合するであろう。
【0132】
エネルギーの検出しうる移動を生成し、それによって開裂を確認するには両方の蛍光付加物の結合が必要である。アクセプターがx1−APCなどである場合は、エネルギーの検出しうる移動は665nmでの増幅した蛍光シグナルによって示されるであろう。一方、アクセプターがダブシルなどの蛍光消光剤分子である場合は、エネルギーの検出しうる移動は対合していない状態に比べてドナー分子による蛍光シグナルが低下していることによって示されるであろう。
検出系の目的は、特定のガンマ−開裂βAPPフラグメントの存在を未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントから識別することである。検出法は均一であり、開裂産物を前駆体から分離および回収する工程が不要である。
【0133】
図9は、蛍光産物の対がユウロピウムクリプテートおよびx1−APCを含む好ましい態様における検出系の原理の模式図である。βAPP融合タンパク質は細胞によって作られ、典型的には通常のプロセシングの際にβ−セクレターゼによって開裂される。βAPPがガンマ−セクレターゼによって開裂されると、検出系は新たに生成した結合部位を第一の蛍光付加物のために利用する。一方、第二の蛍光付加物は、ガンマ−開裂βAPPフラグメント(ここではAβ)並びにα−セクレターゼ、β−セクレターゼかまたはガンマ−セクレターゼを問わずその結合部位を有する他のいずれのβAPPフラグメントのアミノ末端領域に結合するかまたはすでに結合している。同じ開裂フラグメントへの両方の蛍光付加物の結合は、エネルギーの検出しうる移動をもたらす。
【0134】
本発明の最も好ましい態様において、一方の蛍光付加物はユウロピウムクリプテートを含み、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に対し、すなわちアミノ酸残基711(Aβではアミノ酸残基40に対応)で特異的な抗体で修飾されている。アミノ酸残基711(Aβアミノ酸40)を含むエピトープに対する結合特異性を有する一つの抗体は、9S3.2抗体(Bristol−Myers Squibb Co.、プリンストン、ニュージャージーのためにBiosolutions、ニューアーク、デラウエアにより調製された)である。これと対応して、最も好ましい態様の他の蛍光付加物はx1−APCを含み、Aβのアミノ酸配列1−31に対応するアミノ末端領域内に結合する第二の抗体で修飾されている(図4参照)。Aβアミノ酸配列1−12に対応するエピトープに結合する抗体は26D6−B2−B3であり、これはSIBIA Neurosciences(ラジョラ、カリフォルニア)によって提供される。
【0135】
上記検出系は、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出することに加えて、β−セクレターゼも開裂するかまたは存在する場合にAβを検出するのにも応用できる。上記に記載したように、Aβの検出は、Aβのアミノ末端領域かまたはカルボキシ末端のいずれかにそれぞれ別々に結合する蛍光付加物の対を用いて行うことができる。たとえば、蛍光付加物の対が抗体9S3.2および26D6−B2−B3で修飾された上記態様では、存在するいかなるAβ−40も検出されるであろう。最も好ましくは、それぞれの蛍光付加物がAβのアミノ末端およびカルボキシ末端に別々に結合し、互いにまたは未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと実質的に交差反応しない。かくしてAβの検出は、一方の蛍光付加物の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすときに確認されるであろう。
【0136】
さらに、最も好ましい態様は、ガンマ−セクレターゼ開裂の結果得られるカルボキシ末端ではなくアミノ末端への特異的結合によってガンマ−セクレターゼ開裂を検出すべく改変することができる。たとえば、ガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端(典型的にAβペプチドのカルボキシ末端に対応する)に結合させる代わりに、第一の蛍光付加物を6kDフラグメントのアミノ末端に特異的に結合させ、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメント(すなわち、この改変態様ではAβ)と実質的に交差反応しないようにすることができる。この改変した形態の好ましい態様では、第二の蛍光付加物は6kDフラグメントのカルボキシ末端領域に結合するであろう。この改変態様でのエネルギー移動の検出は6kDフラグメントの存在を示しており、この6kDフラグメントはα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼもまた存在するか否かとは無関係にガンマ−セクレターゼ開裂の普遍的な産物である。
【0137】
検出系はさらに、ガンマ−セクレターゼのインヒビターをスクリーニングすべく改変することができる。被験化合物を開裂反応の開始前にアッセイウエルに入れ、該被験化合物がガンマ−セクレターゼを競合的に阻害し得るか否かを決定する。ついで、蛍光付加物の対を加えてガンマ−開裂βAPPフラグメントの存在を決定する。蛍光付加物がカルボキシル末端およびアミノ酸末端領域に対する結合特異性を有する上記好ましい態様では、エネルギーの移動の実質的な低下はガンマ−セクレターゼの阻害によりβAPPが開裂されなかったことを示すであろう。
【0138】
ガンマ−セクレターゼ開裂の検出のさらに別の態様として、蛍光付加物が別々の開裂産物に結合するものがある。この別の態様では、蛍光付加物はそれぞれ未開裂βAPP上のガンマ−セクレターゼ開裂部位の反対の部位に対応する別々のアミノ酸配列に結合する。たとえば、一方の蛍光付加物は未開裂βAPPのカルボキシ末端領域に対応するアミノ酸配列にアミノ酸配列720−770にて、すなわち6kDaフラグメントに結合する。他方の蛍光付加物は、未開裂βAPPのアミノ末端領域に対応するガンマ−セクレターゼ開裂部位の他方の部位にアミノ酸配列671−702にて、すなわちAβフラグメントまたはp3フラグメントに結合する。この別の態様では、少なくとも一方の蛍光付加物は、そのアミノ酸配列に未開裂βAPPの他の部分と実質的に交差反応することなく結合するのが好ましい。ガンマ−セクレターゼ開裂が生じた場合は、蛍光付加物はそれぞれ別々のガンマ−開裂βAPPフラグメント(すなわち6kDaフラグメントおよびAβフラグメント)に結合し、それゆえドナー分子が励起した際にエネルギー移動の実質的な低下という結果となるであろう。
【0139】
さらに、この別々の産物への結合という態様は、被験化合物を加えることによりガンマ−セクレターゼのインヒビターの検出のために適合させることができる。被験化合物をガンマ−セクレターゼと同時に加える場合は、蛍光エネルギーの移動の検出はガンマ−セクレターゼによる開裂の欠如、それゆえガンマ−セクレターゼのインヒビターの存在を示しているであろう。
【0140】
検出系は、上記で記載したような可溶化したガンマ−セクレターゼを含む試料、または適当に希釈した天然産物の試料で行うことができる。本発明では、βAPP基質の試料は、組織試料または細胞培養液から得られる膜画分中に認めることができる。これらの試料において、未開裂βAPP、βAPPフラグメントおよびガンマ−セクレターゼ複合体は内生的に産生される。しかしながら上記でも記載したように、βAPP基質は、組換え宿主−ベクター系、インビトロ転写−翻訳、またはβAPPアミノ酸配列の有機合成並びに当該技術分野でよく知られた他のあらゆる再現可能な方法を含む様々な採取源(これらに限られるものではない)から得ることができる。
【0141】
プレセニリンおよびガンマ−セクレターゼタンパク質に対して向けられた抗体の産生方法
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体の産生方法はよく知られている(Harlow, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク)。たとえば、本発明は、PS1やPS2などのプレセニリンを認識および結合する抗体を提供する。さらに本発明は、ガンマ−セクレターゼタンパク質またはタンパク質複合体を認識および結合する抗体を提供する。
【0142】
好ましくは、抗プレセニリン抗体はPS1またはPS2に選択的に結合し、非プレセニリンタンパク質には結合しない(または弱く結合する)であろう。好ましい抗ガンマ−セクレターゼ抗体はガンマ−セクレターゼに選択的に結合し、非ガンマ−セクレターゼタンパク質には結合しないであろう。抗PS1抗体、抗PS2抗体または抗ガンマ−セクレターゼ抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれら抗体の抗原結合ドメインおよび/または1またはそれ以上の補体決定(determining)ドメインを含むそのフラグメント(たとえば、組換えタンパク質)が挙げられる。これら抗体は、いかなる採取源、たとえば、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウスおよびヒトからのものであってよい。
【0143】
これら抗体は、PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を特異的に認識する抗体フラグメントであってよい。本明細書において抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域、すなわち抗原結合領域の少なくとも一部として定義される。免疫グロブリンの若干の定常領域も含まれていてよい。
【0144】
抗体を調製するための様々な方法が当該技術分野でよく知られている。たとえば、抗体は、単離した形態またはイムノコンジュゲートした形態の本発明のPS1、PS2、または単離ガンマ−セクレターゼタンパク質、またはペプチド、またはフラグメントを用いて適当な哺乳動物宿主を免疫することにより調製できる(Harlow, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク)。さらに、PS1またはPS2の融合タンパク質、たとえばPS1 GST−融合タンパク質を用いることもできる。PS1またはPS2を発現または過剰発現する細胞も免疫に用いることができる。同様に、PS1またはPS2を発現するように操作した細胞も用いることができる。この戦略は、内生のPS1またはPS2を認識する能力の促進されたモノクローナル抗体の産生という結果となる。
【0145】
抗体を産生するためのPS1またはPS2タンパク質の特異的な領域を選択するため、PS1(Sherrington, R.ら、1995 Nature 375: 754−760)またはPS2(Levy−Lahad, E.ら、1995 Science 269: 973−977)のアミノ酸配列を用いることができる。たとえば、PS1またはPS2アミノ酸配列のハイドロフォビシティーおよびハイドロフィリシティー分析を用いてPS1またはPS2構造中の親水性領域を同定することができる。免疫原構造を示すPS1またはPS2タンパク質の領域並びに他の領域およびドメインを、テョウ−ファスマン(Chou−Fasman)、ガルニエ−ロブソン(Garnier−Robson)、カイト−ドゥーリットル(Kyte−Doolittle)、アイゼンベルク(Eisenberg)、カープラス−シュルツ(Karplus−Schultz)またはジェームソン−ウルフ(Jameson−Wolf)分析などの当該技術分野で知られた様々な他の方法を用いて容易に同定することができる。これら残基を含むフラグメントは、特定のクラスの抗PS1抗体を生成するのに特に適している。特に有用なフラグメントとしては、これらに限られるものではないが、配列CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)、CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)、およびノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)が挙げられる。
【0146】
免疫原として使用するタンパク質の調製方法、およびBSA、KLH、OVAまたは他の担体タンパク質などの担体とのタンパク質の免疫原コンジュゲートの調製方法は当該技術分野でよく知られている。幾つかの状況では、たとえばカルボジイミド試薬を用いた直接コンジュゲート法を用いることができる。他の場合には、Pierce Chemical Co、ロックフォード、イリノイによって提供されるもののような連結試薬が有効である。PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼ免疫原の投与は、当該技術分野で一般に理解されているように、一般に適当な期間の注射により、適当なアジュバントを用いて行う。免疫スケジュールの間に、抗体生成の適切さ(adequacy)を抗体の力価を決定するのに採用することができる。
【0147】
このようにして産生したポリクローナル抗血清も幾つかの応用においては満足のいくものであるが、タンパク質の単離のためにはモノクローナル抗体調製物が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を、一般に知られているように、KohlerおよびMilsteinの標準法(Nature 256: 495−497)またはリンパ球または脾臓細胞の不死化を行う改変法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株を、抗原がPS1またはPS2タンパク質またはフラグメント、または本発明のガンマ−セクレターゼタンパク質であるイムノアッセイによりスクリーニングする。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養液が同定されたら、細胞をインビトロで培養するかまたは腹水中で産生させることができる。
【0148】
ついで、所望のモノクローナル抗体を培養上澄み液かまたは腹水上澄み液から回収する。免疫学的に有意の部分(すなわち、PS1、PS2、またはガンマ−セクレターゼタンパク質を認識および結合する部分)を含む本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のフラグメント(たとえば、Fab、F(ab’)2、Fvフラグメント、融合タンパク質)を、完全な抗体と同様にアンタゴニストとして用いることができる。
【0149】
Fab、Fab’、またはF(ab’)2フラグメントなどの免疫学的に反応性のフラグメントの使用がしばしば好ましい。さらに、2またはそれ以上のエピトープに特異的な2特異的抗体を当該技術分野で一般に知られた方法を用いて生成することができる。ホモダイマー抗体もまた、当該技術分野で知られた架橋法(たとえば、Wolffら、Cancer Res. 53: 2560−2565)により生成することができる。
抗体またはフラグメントはまた、最近の技術を用い、組換え手段により産生させることができる。PS1またはPS2タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、複数種の起源のキメラ抗体またはCDRグラフト抗体の関連で製造することができる。
【0150】
別法として、完全にヒトのモノクローナル抗体を産生する方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック法が挙げられ、知られており、ヒトMabの生成に用いることができる(概説としては、Vaughanら、1998, Nature Biotechnology 16: 535−539を参照)。たとえば、完全にヒトの抗PS1抗体または抗PS2抗体は、大きなヒトIg遺伝子コンビナトリアルライブラリー(すなわち、ファージディスプレイ)を用いたクローニング法を用いて生成することができる(GriffithsおよびHoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries, In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man、Clark, M.(編)、ノッティンガムアカデミック、pp45−64 (1993); BurtonおよびBarbas, Human Antibodies from combinatorial libraries、上掲、pp65−82)。
【0151】
完全にヒトの抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体はまた、PCT特許出願WO98/24893、Jakobovitsら、1997年12月3日公開(Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607−614をも参照)に記載されているように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニックマウスを用いても産生できる。この方法は、ファージディスプレイ法で必要なインビトロ操作を必要とせず、高度に親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【0152】
標的抗原に対する抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体の反応性は、必要に応じてPS1またはPS2タンパク質、ペプチド、PS1発現細胞またはその抽出物を用い、ウエスタンブロット、免疫沈降、ELISA、およびFACS分析を含むよく知られた多くの手段により確立することができる。抗PS1または抗PS2モノクローナル抗体はまた、補体媒体腫瘍細胞溶解、抗体依存性細胞媒介細胞障害(ADCC)、抗体依存マクロファージ媒介細胞障害(ADMMC)、腫瘍細胞増殖などを含む様々なインビトロアッセイで特徴付けることもできる。
【0153】
本発明の抗体またはフラグメントは、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素などの検出しうるマーカーで標識することができる。
以下の実施例は本発明を説明するため、および当業者が本発明を製造および使用するのを助けるために記載するものである。これら実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0154】
実施例1
以下に、放射性標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチド模倣物などのβAPP配列を有するガンマ−セクレターゼ基質を生成するのに用いる方法を記載する。実施例1、4、5、6および8に記載してあり本明細書で「mCHAPSO界面活性剤溶液」と称する界面活性剤溶液は、1部のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSO(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を含む。
【0155】
BAPP基質をコードする組換えベクター
C100 C末端フラグメントを模倣するヒトβAPP−C100ポリペプチドをコードする組換えベクター(図1Aおよび図2)としてはpcDNA3ベクター(InVitrogen、カールスバード、カリフォルニア)が挙げられ、これはファージT7プロモーター、ヒトβAPP(ジーンバンクY00264)のヌクレオチド1936〜2235に直接連結した、APPシグナル配列と成熟APPのアミノ末端ロイシンとをコードするDNA(APPのヌクレオチド1−54;ジーンバンクID Y00264;Kang, J.ら、1987 Nature 325: 733−736)を有している。この組換えヌクレオチド配列は、11kDaポリペプチドとして検出しうるC−100ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図2および配列番号1に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号2に記載してある。
【0156】
ヒトβAPP−C83ポリペプチド模倣物をコードする組換えベクター(図1Bおよび図3)としてはpcDNA3ベクターが挙げられ、これはファージT7プロモーター、配列CTGGATGCAGAATTC(これはヒトβAPP(ジーンバンクY00264)のヌクレオチド1987−2267に直接連結している)に連結したβAPPシグナル配列をコードするDNAを含んでいる。この組換えヌクレオチド配列は、9kDaであるC−83ポリペプチド模倣物をコードしている。そのヌクレオチド配列は図3および配列番号3に記載してあり、コードされるアミノ酸配列は配列番号4に記載してある。
【0157】
ミクロソーム中へのポリペプチド模倣物のインビトロ転写および同時翻訳挿入
ミクロソーム(たとえば、ミクロソーム基質)中に挿入した放射性標識したβAPP−100およびβAPP−C83ポリペプチドを、TnTTMカップルド・レティキュロサイト・ライセート・システム(カタログ#L4610;Promega、マジソン、ウイスコンシン)および35S−メチオニン(NEN、ボストン、マサチューセッツ)を用いて製造業者の指示に従い、組み合わせ転写−翻訳法により製造した。放射性標識したβAPP−C100およびβAPP−C83ポリペプチドのミクロソーム膜中への同時翻訳挿入を、製造業者の指示に従ってライセートシステムにイヌ膵臓ミクロソーム膜(カタログ#:Y4041;Promega、マジソン、ウイスコンシン)を58単位(膜)/400μl(反応液)にて補充することにより行った。
【0158】
簡単に説明すると、600μlの網状赤血球溶解液、48μlの反応混合液、24μlのT7RNAポリメラーゼ、および24μlのメチオニン以外のアミノ酸混合液(以上、Promega TnTTMカップルド・レティキュロサイト・トランスレーション・キット)を、24μlのRNAsinTM(Promega、マジソン、ウイスコンシン)および100μlの35S−メチオニンと混合した。全部で48μgのβAPP−C100かまたはβAPP−C83のベクターDNAを加え、ついで穏やかなピペッティングによって二重蒸留(double distilled)水を混合することにより容量を1100μlとした。ミクロソーム(172単位、典型的に〜90μl)を加え、反応液をもう一度穏やかに混合し、ついで30℃に75分間置いた。管を氷上に置いて反応を停止させた。
【0159】
ミクロソーム基質の単離
0.4mlの転写−翻訳液を氷冷高塩ショ糖(0.5M NaCl、0.5M ショ糖、20mM HEPES、pH7.5、0.5μM o−フェナントロリン、12&μg/mlのロイペプチン)の1.4mlクッション上に重層することによりミクロソーム膜を単離した。ミクロソーム膜を4℃で10分間、100,000rpm(Beckman TLA 100.3ローター)で遠心分離して回収した。ミクロソーム膜のペレットを再懸濁することなく150μlの冷低塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、0.5μM o−フェナントロリン、12μg/mlのロイペプチン)で濯ぎ、濯いだ緩衝液を捨てた。ペレットは、放射性標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチドが挿入された単離ミクロソーム(たとえば、ミクロソーム基質)を含んでいた。
【0160】
ミクロソーム基質からのポリペプチドの可溶化
放射性標識したβAPP−C100およびβAPP−C83ポリペプチド模倣物を、「mCHAPSO界面活性剤溶液」(1部のN−[3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]および2部のCHAPSO(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を含む)を含む界面活性剤溶液を用いて界面活性剤可溶形態のミクロソームから抽出した。
【0161】
ペレットとして回収したミクロソーム基質を105μlのミクロソーム抽出緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、10%グリセリン、1mMエチレンジアミン四酢酸、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁して、可溶化した35S標識したβAPP−C100またはβAPP−C83ポリペプチドを得た。これら可溶化ポリペプチドを基質として用いた。可溶化した放射性標識βAPPポリペプチドのアリコート(25μl)を液体窒素中でフラッシュ凍結し、使用のときまで−80℃で貯蔵した。
【0162】
実施例2
以下に、膜画分(膜二重層内に埋め込まれた膜内在タンパク質を含む)を単離するのに用いた方法を記載する。
細胞の回収
スピナー増殖させたHeLa細胞を1リットル容器を1800rpm×15分×4℃にて遠心分離することにより回収した。収量は1リットル当たり約1mlの細胞ペレットであった。この細胞を50×のペレット容量を用いて氷冷PBS(カタログ#:14190;Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド)中に浮遊させた。この浮遊細胞を250ml容の円錐容器に移し、4℃にて1000×Gで10分間遠心分離した(Jouan GR 4−22低速遠心管)。細胞ペレットをPBS中に再浮遊させ、遠心分離工程を繰り返した。
【0163】
細胞の溶解
ペレットの容量を測定し、2×ペレット容量のHB低張溶解緩衝液(10mM HEPES、pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2)を加え、細胞を注意深く再浮遊させて洗浄した。使用の直前に0.5mM DTT、0.5mM PMSFまたはペファブロック(Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディアナ)を加えた。細胞を4℃にて1000×Gで10分間遠心分離にかけた(Jouan GR 4−22低速)。上澄み液を注意深く除去し、細胞ペレットを氷上で10分間インキュベートして細胞を膨潤させた。細胞をダウンスホモジナイザーを用いて破砕した。
【0164】
簡単に説明すると、20mlの細胞浮遊液を大きなダウンスホモジナイザーに加え、「B」乳棒を15回上下往復させてホモジナイズした。ついで、20mlのHB低張溶解緩衝液をさらに加え、乳棒を5回上下往復させて混合した。ホモジネートを4℃にて1000×Gで10分間遠心分離した。上澄み液を新たな管に移し、直ちに11%上澄み容量の氷冷10×トリス緩衝食塩水(200mMトリス−HCl、pH7.5、1.3M NaCl)を加えた。ペレットを1容量のHB低張溶解緩衝液(10mM HEPES、pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2)に再浮遊させ、細胞を膨潤させ、ホモジネートおよび遠心分離工程を繰り返した。上澄み液をコンバインし、4℃にて1000×Gで10分間、再度遠心分離にかけた。
【0165】
膜画分の回収
上記ホモジナイゼーション工程で得られた上澄み液を4℃にて2000×Gで10分間遠心分離にかけた(Jouan)。ペレットを捨てた。上澄み液を残した;これが「2K上澄み液」である。この2K上澄み液を12,000×Gで遠心分離(10,000rpm(Sorvall SS−34))して膜画分を回収した(たとえば、ペレットは膜画分を含む)。上澄み液を除去し、捨てた。ペレットを残した;これが「12K膜」である。この12K膜を20%グリセリン、20mM HEPES(1ペレット容量)中に再懸濁させた。膜画分を小さなアリコートにてフラッシュ凍結し、−80℃にて貯蔵した。
【0166】
実施例3
以下に、膜画分の大スケール洗浄に用いた方法を記載する。この方法を用いて膜(塩除去およびアルカリ除去する)を調製した。
洗浄膜画分の調製
膜洗浄手順の全工程において氷冷した管および緩衝液を用いた。
HeLa細胞膜画分(たとえば、実施例2)のタンパク質濃度を、BCATMタンパク質アッセイ試薬(Pierce、ロックフォード、イリノイ)を用いて製造業者の指示に従って決定した。濃度は7〜12mg/mlの範囲であった。膜のアリコート(28mlを複数使用)を10容量の高EDTA緩衝液(15mM EDTA、50mM HEPES、pH7.4、0.05M KCl、10%グリセリン、1mMジチオトレイトール、0.1mMペファブロック)に加えた。ときどき攪拌しながら膜を氷上で15分間インキュベートした。膜をスーパーライトGSAローター(SL−1500)で4℃にて13,000rpmで30分間遠心分離して回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の高塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、1M NaCl、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁した。
【0167】
上下にピペッティングするとともにときどき攪拌しながら氷上で15分間インキュベートすることによって膜を穏やかに混合した。膜を上記遠心分離により回収した。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを21mlの無塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、10%グリセリン、1mM EDTA酸、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁させた。次の工程は炭酸塩洗浄を記載する:12容量(たとえば、252ml)の氷冷0.1M Na2CO3、pH11.5を加えた;懸濁液を冷室中、ニューテーター(nutator)で30分間振動させた;懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の無塩緩衝液中に再懸濁させ、穏やかに混合し、上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットには洗浄した膜画分(たとえば、単離し洗浄した膜画分)が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質を含んでいる。
【0168】
実施例4
以下に、洗浄した膜画分から膜内在タンパク質およびタンパク質複合体を抽出するのに用いた方法を記載する。抽出した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体は、界面活性剤で可溶化された形態で単離される。
可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製
洗浄した膜ペレット(たとえば、実施例3)を、実施例3で決定したように、膜画分中のタンパク質の最初の濃度に基づいて7〜8mg/mlの濃度にて抽出緩衝液(20mMビス/トリス、pH7.1、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁した。
【0169】
再懸濁したペレットをときどき混合しながらゆっくりと攪拌することによって氷上で45分間インキュベートし、ついで4℃にてBeckman TLA−100.3ローターで50,000rpmにて45分間遠心分離にかけて未抽出のタンパク質およびタンパク質複合体をペレット化した。上澄み液は界面活性剤で可溶化した形態にて膜から抽出した膜内在タンパク質を含むので、残した。可溶化した膜内在タンパク質のアリコートを前もって冷却した管(〜10ml/管)に入れ、液体窒素中で急速凍結し、ついで−80℃で貯蔵した。この可溶性調製物のタンパク質濃度は0.5〜1mg/mlであった。
【0170】
実施例5
以下に、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体の調製物をガンマ−セクレターゼ複合体についてイムノアフィニティー濃縮するのに用いた方法を記載する。
ガンマ−セクレターゼ複合体のイムノアフィニティー濃縮
可溶化した膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物(たとえば、実施例4)を、抽出緩衝液(20mMビス/トリス、pH7.1;1部のmCHAPSOおよび2部のCHAPSOTMからなる0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液;10%グリセリン;1mM EDTA;1mMジチオトレイトール;および4μg/mlロイペプチン)で平衡化した抗PS1アフィニティーカラム(たとえば、実施例8および9)上に吸着させた。吸着(たとえば、結合)は4℃で行った。
【0171】
カラムを少なくとも20容量のPBSと0.5%CHAPSOTMとで洗浄した。カラムを0.1Mグリセリン、pH2.5と0.5%CHAPSOTMおよび10%グリセリンとで4℃にて溶出した。溶出した画分(1カラム容量)を直ちに0.15Mトリス/Cl、pH8(0.1カラム容量)で中和した。投入した抽出物、フロースルー画分、および溶出画分を実施例7に記載のゲルシステムを用いてガンマ−セクレターゼ活性についてアッセイした。投入したガンマ−セクレターゼ活性はいずれも抗体カラムを通り抜けることはなかった。一般に、投入活性の30%が溶出画分で回収された。
抗PS1抗体JH2またはJH5を結合したマトリックスを有するアフィニティーカラムは、HeLa膜抽出物からガンマ−セクレターゼ活性を部分的に奪った。これら2つの抗体の組み合わせは、可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含有する試料からガンマ−セクレターゼ活性を完全に除去した。
【0172】
幾つかの実験では、膜内在タンパク質およびタンパク質複合体の調製物をPS1アフィニティーカラムに吸着させる前に、該調製物をモノS(Pharmacia)陽イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、ついでDEAEセファロースファーストフロー(Pharmacia)陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、ついでコムギ麦芽アグルチニンアガロース上でアフィニティー精製した。この濃縮物質の吸着は、コムギ麦芽アグルチニン(WGA)溶出緩衝液(20mMトリス/Cl、pH7.7;0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液;0.1M NaCl;30%グリセリン;0.5M N−アセチルグルコサミン;0.13mMペファブロック;および4μg/mlロイペプチン)で行った。
【0173】
実施例6
以下に、放射性標識したβAPPポリペプチド模倣物(たとえば、ガンマ−セクレターゼ基質)を、(1)洗浄した膜画分(たとえば、実施例3);(2)可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体(たとえば、実施例4);または(3)アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、実施例5)と反応させる3つの異なる再構成方法を記載する。
【0174】
洗浄した膜画分を用いた再構成法
洗浄した膜画分(たとえば、実施例3)を低塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、12μg/mlロイペプチン、0.5μM o−フェナントロリン)中に再懸濁させた。2μlの洗浄した膜を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上で加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。別法として、5μlの洗浄した膜を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
【0175】
ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は反応管を氷上に置くことにより行った。8μlの4×NuPage試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加え、95℃にて5分間インキュベートすることにより、SDS−PAGE分析用に開裂反応液の試料を調製した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0176】
可溶化したタンパク質/複合体を用いた再構成法
2μlの可溶化したタンパク質および複合体(実施例4)を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
【0177】
別法として、5μlの可溶化したタンパク質を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応を開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで8μlの4×SDS−PAGE試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加えることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を95℃に5分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0178】
アフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を用いた再構成法
2μlのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体(実施例5)を16μlのガンマ−セクレターゼ反応緩衝液(40%グリセリン、0.5%mCHAPSO界面活性剤溶液、20mM HEPES、pH7.5)に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド(実施例1)を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。
別法として、5μlのアフィニティー濃縮したガンマ−セクレターゼ複合体を13μlのガンマ−セクレターゼ開裂反応混合液に氷上にて加え、ついで2μlの可溶化した放射性標識βAPP−C100ポリペプチド模倣物を加えてガンマ−セクレターゼ反応混合液の最終容量を20μlとした。ガンマ−セクレターゼ反応混合液を37℃に20分間置くことにより開裂反応開始した。開裂反応の停止は、ガンマ−セクレターゼ反応混合液を氷上に置き、ついで8μlの4×SDS−PAGE試料緩衝液(Novex、サンジエゴ、カリフォルニア)を加ることにより行った。ゲル電気泳動の前に試料を95℃に5分間加熱した。ガンマ−セクレターゼ開裂産物の存在は、下記実施例7に記載するようにSDS−PAGEゲルを行うことによって検出した。
【0179】
実施例7
以下に、再構成法(たとえば、実施例6)からのガンマ−セクレターゼ開裂産物の分離および検出を行うのに用いたゲルシステムを記載する。機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体の存在は、放射性標識したβAPPポリペプチド模倣物の開裂をモニターすることにより検出した。たとえば、11kDaのβAPP−C100ポリペプチドのガンマ−セクレターゼ開裂は4kDaおよび6kDaの開裂産物を生成した。同様に、9kDaのβAPP−C83ポリペプチドの開裂は3kDaおよび6kDaの開裂産物を生成した。
【0180】
ガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出
ガンマ−セクレターゼ開裂反応液を、SDS−PAGEゲル、たとえば10%NuPageTMゲル(NOVEX、サンジエゴ、カリフォルニア)に負荷し、製造業者の指示に従って泳動した。ゲルを乾燥し、35S−標識βAPP基質(たとえば、みかけの11kDaのβAPP−C100ポリペプチド)および開裂産物(たとえば、4kDaおよび6kDaのポリペプチド)を蛍光造影(phosphorimager)分析(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)により検出した。放射性標識した基質および開裂産物の放射能シグナルを蛍光造影により定量した。
【0181】
放射性標識したβAPP−C100基質は、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物(図6および図7)およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物(図8)中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βAPPポリペプチドのC末端側フラグメントに対応する6kDaの開裂産物を生成した。
放射性標識したβAPP−C83基質もまた、可溶化したタンパク質およびタンパク質複合体調製物(図7)およびアフィニティー濃縮したタンパク質調製物中に存在するガンマ−セクレターゼ複合体によって開裂されて、βAPPポリペプチドのC末端側フラグメントに対応する6kDaの開裂産物を生成した。
【0182】
実施例8
以下に、抗PS1ポリクローナル抗体を生成するのに用いた方法を記載する。化学合成法を用いたPS1ペプチド抗原の調製
CRDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号5)の配列を有するPS1の合成ペプチド抗原に対し、抗PS1ポリクローナル抗体(「1357」と称する)を産生させた。このペプチド抗原はPS1のアミノ酸344−358を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのC末端システインを含む。
【0183】
CGHPEPLSNGRPQGNSR−アミド(配列番号6)の配列を有するPS1の合成ペプチドに対しては抗PS1ポリクローナル抗体(「1398」と称する)を産生させた。このペプチド抗原はPS1のアミノ酸45−60を包含し、ペプチド抗原を担体タンパク質にカップリングするためのC末端システインを含む。
ノルロイシン−RDSHLGPHRSTPESR−アミド(配列番号9)の配列を有するPS1の合成ペプチドに対しては抗PS1ポリクローナル抗体(「SR92」と称する)を産生させた。このペプチドはPS1のアミノ酸344−358を包含する。
【0184】
抗PS1ポリクローナル抗体1357、1398、およびSR92を産生するのに用いた合成ペプチドは、J. Stewart & J. Young, ”Solid phase peptide synthesis”(Pierce Chemical Company、ロックフォード、1984)の方法により合成した。カップリング剤としてm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い、1357および1398ポリクローナル抗体をN−末端システイン残基を介して卵アルブミン担体タンパク質にカップリングした(Harlow, E.およびLane, D. 1988: Antibodies: A Laboratory Manual, pp82−83 CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。
【0185】
組換えDNA法を用いたPS1ペプチド抗原の調製
組換えDNA法を用い、細菌で発現したPS1ポリペプチドフラグメントに対して抗PS1ポリクローナル抗体(「JH2」と称する)を産生させた。このポリペプチドフラグメントはPS1のアミノ酸1−77(配列番号7)を包含する。このフラグメントは、pGEX4T1ベクター(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)を用いて細菌のグルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。PS1コード配列(ヌクレオチド554−786)を末端EcoRI部位およびBamHI部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,202号および同第4,965,188号(参照のため本明細書中に引用する))を用いてcDNAライブラリーから増幅させ、得られたEcoRI−BamHIポリヌクレオチドフラグメントをpGEX4T1中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製、融合タンパク質の精製、およびGST融合体からのPS1 1−77の開裂は、GST精製モデュール(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)で提供される標準プロトコールに従って行った。
【0186】
「JH5」と称する抗PS1ポリクローナル抗体は、PS1「ループ」−GST融合タンパク質(配列番号8)に対して産生される精製ポリクローナル抗体である。この融合タンパク質は、pGEX4T1ベクター(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)を用いて細菌のグルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として調製した。PS1コード配列(ヌクレオチド1382−1769)を末端EcoRI部位およびBamHI部位をコードするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてcDNAライブラリーから増幅させ、得られたEcoRI−BamHIポリヌクレオチドフラグメントをpGEX4T1中にライゲートした。細菌の増殖、誘発、溶解、封入体の精製および融合タンパク質の精製は、GST精製モデュール(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)で提供される標準プロトコールに従って行った。
【0187】
ポリクローナル抗体を生成するための動物の免疫
200μlの滅菌リン酸緩衝食塩水中に懸濁し、200μlのフロイントの完全アジュバント(SIGMA Chemical Company、セントルイス、ミズーリ)とともに乳濁化した約2mgのペプチド結合卵アルブミンを用いてウサギを免疫した。この乳濁化したペプチドをHarlowおよびLaneの記載(Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, p.109、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)に従い、8−10の部位にて皮内注射した。400μlの50%リン酸緩衝食塩水/50%フロイントのアジュバント(不完全)中に100μgの抗原を含有する皮内ブースター注射を3週間後に投与した。ブースター注射の2週間後、および抗体力価が高く保持されているその後2週間の間に供試採血を行った(HarlowおよびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, pp.116−119、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。抗体力価の決定は、コンジュゲートしていないペプチドを用いてELISAにより行った(HarlowおよびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, pp.553−612、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)。
【0188】
抗体の免疫精製
これらポリクローナル抗体を抗原カラム上で免疫精製した。抗原カラムは、製造業者の指示に従い、適当なペプチドをPharmacia HiTrap NHS−活性化カラム(Amersham Pharmacia Biotech、ピスカタウエイ、ニュージャージー)に結合させて調製した。免疫精製は標準法(Immunoaffinity Purification of Antibodies on an Antigen Column, pp.314−5, E. HarlowおよびD. Lane, ”Antibodies: A Laboratory Manual” c. 1988、CSHL、コールドスプリング、ニューヨーク)により行った。
【0189】
実施例9
以下に、天然に存在する機能的に活性なガンマ−セクレターゼ複合体(たとえば、内生のガンマ−セクレターゼ複合体)および基質(たとえば、内生の基質)を含む膜画分を単離するのに用いた方法を記載する。この膜画分は、試薬をスクリーニングしてガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を同定するのに用いることができる。
【0190】
内生のガンマ−セクレターゼ複合体および基質を含む膜の調製
ガンマ−セクレターゼ開裂に対する天然に存在する基質(たとえば、スウェーデン変異体βAPP)並びに内生レベルのガンマ−セクレターゼを発現するHeLa細胞からの細胞膜を上記実施例2の記載と同様にして調製した。タンパク質濃度を実施例3の記載と同様にして決定したところ7〜12mg/mlの範囲であったが、ガンマ−セクレターゼ開裂を検出するにはわずか3mg/mlのタンパク質を含む希釈液で充分であった。膜を上記実施例3の記載と同様にして高塩緩衝液で2回洗浄した。膜は炭酸塩溶液では洗浄しなかった。その代わり、膜をTween−80(基質を膜内に保持する)を含有する溶液で洗浄した。簡単に、Tween−80洗浄を本明細書に記載する。
【0191】
ガラス棒を用いてペレットを10容量のTween−80緩衝液(0.05M HEPES、pH7.5、10%グリセリン、0.5%Tween−80)中に再懸濁させた。懸濁液を冷室中、ニューテーターで30分間振動させた。懸濁液を4℃にてスーパーライトGSAローター(SL−1500)で13,000rpmで30分間遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。ガラス棒を用いてペレットを10容量の無塩緩衝液(50mM HEPES、pH7.4、10%グリセリン、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、4μg/mlロイペプチン)中に再懸濁させ、穏やかに混合した。懸濁液を上記遠心分離にかけた。上澄み液を除去した。得られたペレットにはTween−80洗浄した膜画分が含まれており、該膜画分は脂質二重層中に埋め込まれた膜内在タンパク質(たとえば、ガンマ−セクレターゼ複合体)および基質(たとえば、βAPP)を含んでいる。
【0192】
内生基質の開裂
Tween−80洗浄した膜のアリコート(5〜50μl)を0.5〜1mg/mlの濃度で無塩緩衝液に懸濁させた。膜を37℃に約3時間温めて開裂反応を開始させ、試料を氷上に置いて反応を停止させた。
インヒビター化合物をスクリーニングするプロトコールにおいて、温度を37℃にシフトする前に被験インヒビター化合物を膜試料に4〜10℃にて約10〜30μMの最終濃度にて加えた。
【0193】
時間分析( Time−Resolved )蛍光による開裂の検出
内生基質(たとえば、βAPP)の開裂を、新たに生成したAβペプチドなどの開裂産物の定量測定により検出した。9S3.2抗体(Biosolutions、ニューアーク、デラウエア)は、Aβ−40ペプチドを用いて調製した高親和性マウスモノクローナル抗体である。9S3.2抗体はAβの開裂したC末端に特異的に結合する。この抗体は前駆体(たとえば、βAPPタンパク質)には結合しない。モノクローナル抗体26D6−B2−B3は、カルボキシル末端を介して担体にカップリングしたAβ1−12ペプチドを用いて調製した別の高親和性マウスモノクローナル抗体である(SIBIA Neurosciences、ラジョラ、カリフォルニア)。26D6−B2−B3抗体はAβのN末端領域に結合する。この抗体は前駆体および開裂産物の両者に結合するであろう。
【0194】
上記開裂反応の終了後、60μlの冷却した各蛍光標識抗体を20μlの1mg/ml開裂膜に加えた。各抗体/膜の組み合わせを8回アッセイした。9S3.2蛍光標識抗体は0.3μg/mlにて加え、一方、26D2蛍光標識抗体は0.8μg/mlにて加えた。これら蛍光標識抗体を膜試料中で室温にて18〜24時間インキュベートし、その後、シグナルをDiscoveryR HTRFマイクロプレート分析器(Packard Instrument Company、メリデン、コネチカット)で読み取った。
【0195】
抗体9S3.2および26D6−B2−B3を蛍光付加物の適当な対で修飾し、該抗体のAβペプチドへの結合によって該付加物が極めて近接したときに蛍光エネルギー移動が起こるようにすることによって、開裂産物へのこれら抗体の同時結合を検出した(Kolb]ら、1996, ”Homogeneous Fluorescent technology in High Throughput Screening”, Journal of Biomolecular Screening 1: 203−210)。ついで、蛍光団を窒素レーザーパルスにより励起させ、蛍光エネルギー移動の程度を時間分析蛍光測定により定量した(Kolb, J. M., Yamanaka, G.およびManly, S. P. J.上掲)。
【0196】
図10に示すように、時間分析蛍光アッセイは、HPLAP−βAPPSWの2μl未満の膜懸濁液を入れたウエルでガンマ−セクレターゼ活性を検出した。さらに、このアッセイは、シグナル/バックグラウンドの比例した蛍光比をもたらすことにより増大量のガンマ−セクレターゼ活性に対しても感度を有していた。
このアッセイはまた、図11に示すようにAβフラグメントの検出においても同様に感度を有していた。合成Aβ−40ペプチドを反応緩衝液中に希釈し、蛍光付加物で修飾した抗体26D6および9S3.2とともにインキュベートした。蛍光シグナルはAβ−40ペプチドの濃度の増大に応じて増大した。
【0197】
本明細書を通じて様々な刊行物を言及してある。これら刊行物の開示は、本発明が関連する技術の状態を一層詳細に記載するために、その全体が本明細書中に参照のため引用される。
【図面の簡単な説明】
【図1A】βAPP(C−100)ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図1B】βAPP(C−83)ポリペプチド基質をコードする組換えベクターの模式図。
【図2】組換えβAPP(C−100)ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図3】組換えβAPP(C−83)ポリペプチド基質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図4】ベータ−セクレターゼ開裂したヒトβAPP(ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される)のアミノ酸配列。
【図5】S2−開裂したヒトノッチ−1(ガンマ−セクレターゼによって認識され開裂される)のアミノ酸配列。
【図6】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られた放射性標識した6kDaガンマ−セクレターゼ開裂産物の検出。
【図7】可溶化ガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたC83基質およびC100基質の開裂産物の検出。
【図8】免疫単離したガンマ−セクレターゼ複合体を含む開裂反応液から得られたC100基質の開裂産物の検出。
【図9】ガンマ−セクレターゼ基質の開裂を検出するための時間分析蛍光法の模式図。
【図10】HPLAP−βAPPSWを発現する細胞からの増大する容量の膜懸濁液が、増大する蛍光シグナル/バックグラウンド比によって示されるように、比例量のガンマ−セクレターゼ活性を提供することを示すグラフ。細胞を抗体26D6および9S3.2で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図11】増大する濃度のAβ−40ペプチドが比例量の蛍光シグナルを提供することを示すグラフ。Aβペプチドを抗体26D6および9S3.2で修飾した蛍光付加物とともにインキュベートした。
【図12】好ましいドナー分子の化学構造を示す一覧。
【図13】好ましい消光剤分子を含む幾つかの好ましいアクセプター分子の化学構造を示す一覧。
Claims (97)
- ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の開裂を検出する均一法であって、該方法はガンマ−開裂βAPPフラグメントと1対の蛍光付加物との結合を検出することを含み、その際、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂βAPPフラグメントのカルボキシ末端に特異的に結合して未開裂のβAPPや他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応することなく、第二の蛍光付加物はβ−アミロイドペプチド(Aβ)のアミノ酸配列1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPフラグメントに結合し、これら蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすことを特徴とする方法。
- 液体試料中、未開裂のβAPPおよび他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントの存在下で行う、請求項1に記載の方法。
- 試料が、内生のガンマ−セクレターゼおよびスウェーデン変異体βAPPを有する膜画分を含む、請求項2に記載の方法。
- 試料が、可溶化したガンマ−セクレターゼ複合体およびβAPPを含む、請求項2に記載の方法。
- 蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項1に記載の方法。
- ガンマ−開裂βAPPフラグメントがAβ−40である、請求項5に記載の方法。
- 第一の蛍光付加物が、アミノ酸残基40を含むエピトープでAβ−40に結合する第一の抗体で修飾されている、請求項6に記載の方法。
- 第二の蛍光付加物が、アミノ酸配列1−12を含むエピトープでAβに結合する第二の抗体で修飾されている、請求項7に記載の方法。
- 第一の蛍光付加物の励起が第二の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 第一の該付加物が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、N−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩および1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項9に記載の方法。
- 第一の蛍光付加物がユウロピウムクリプテートを含む、請求項10に記載の方法。
- 第二の蛍光付加物がx1−APCを含む、請求項10に記載の方法。
- エネルギーの検出しうる移動が第二の蛍光付加物からの増幅したシグナルを含む、請求項12に記載の方法。
- 他方の蛍光付加物が蛍光消光剤分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 蛍光消光剤分子が、ダブシルおよび9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項14に記載の方法。
- 蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項15に記載の方法。
- エネルギーの検出しうる移動が、励起された蛍光付加物からの蛍光シグナルの低減を含む、請求項16に記載の方法。
- 励起を、レーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより行う、請求項13または17に記載の方法。
- 励起をレーザーにより行う、請求項18に記載の方法。
- β−アミロイドペプチド(Aβ)の存在を決定する均一法であって、
(1)試料を1対の蛍光付加物に暴露し、その際、第一の蛍光付加物はAβのカルボキシ末端領域に結合し、第二の蛍光付加物はAβのアミノ末端領域に結合し、少なくとも一方の蛍光付加物が未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと実質的に交差反応することなく、ついで
(2)該蛍光付加物の一方の励起により該1対の蛍光付加物とAβとの結合を検出する
ことを含む方法。 - 第一の蛍光付加物がAβのカルボキシ末端に特異的に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応しない、請求項20に記載の方法。
- AβがAβ−40である、請求項21に記載の方法。
- 蛍光付加物がそれぞれ別々にAβのアミノ末端かまたはカルボキシ末端のいずれかに特異的に結合し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応しない、請求項22に記載の方法。
- 励起を、レーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより行う、請求項21に記載の方法。
- 励起をレーザーにより行う、請求項24に記載の方法。
- β−アミロイドペプチドAβ−40の存在を決定する均一法であって、
(1)試料を1対の蛍光付加物に暴露し、その際、第一の蛍光付加物はAβ−40のカルボキシ末端領域に結合し、第二の蛍光付加物はAβ−40のアミノ末端領域に結合し、第一の蛍光付加物は未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントと実質的に交差反応することなく、ついで
(2)第一の蛍光付加物の励起により該1対の蛍光付加物とAβ−40との結合を検出する
ことを含む方法。 - 第一の蛍光付加物がアミノ酸残基40を含むエピトープでAβ−40に結合する第一の抗体で修飾されている、請求項26に記載の方法。
- 第一の蛍光付加物がユウロピウムクリプテートで修飾されている、請求項27に記載の方法。
- 第二の蛍光付加物が、アミノ酸配列1−12を含むエピトープでAβに結合する第二の抗体で修飾されている、請求項28に記載の方法。
- 第二の蛍光付加物がx1−APCを含む、請求項29に記載の方法。
- 第一の蛍光付加物の励起をレーザーにより行う、請求項30に記載の方法。
- ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の開裂を検出する均一法であって、該方法は6kDaフラグメントと1対の蛍光付加物との結合を検出することを含み、その際、第一の蛍光付加物は該6kDaフラグメントのアミノ末端に結合して未開裂のβAPPや他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントとは実質的に交差反応することなく、第二の蛍光付加物は該6kDaフラグメントのカルボキシ末端領域内の部分に結合し、これら蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらすことを特徴とする方法。
- 蛍光付加物がそれぞれ別々に抗体で修飾されている、請求項32に記載の方法。
- 蛍光付加物の一方が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、N−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩および1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項33に記載の方法。
- 他方の蛍光付加物が、架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれた分子を含む、請求項34に記載の方法。
- 他方の蛍光付加物が、ダブシルおよび9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子を含む、請求項34に記載の方法。
- ガンマ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の開裂を検出する均一法であって、
(1)第一の蛍光付加物を6kDaフラグメントに結合させ、第二の蛍光付加物をβ−アミロイドペプチド(Aβ)かまたはp3フラグメントに結合させ、その際、少なくとも一方の蛍光付加物が未開裂βAPPの他の部分と実質的に交差反応することなく、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、
(2)ドナー分子をレーザー、キセノンフラッシュランプまたはジュウテリウム−タングステンランプにより励起し、ついで
(3)アクセプター分子へのエネルギーの実質的に低減した移動を検出する
工程を含む方法。 - ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、N−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩および1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項37に記載の方法。
- アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項38に記載の方法。
- エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、アクセプター分子からの殆どまたは全く増幅されていないシグナルを検出することを含む、請求項39に記載の方法。
- アクセプター分子が、ダブシルおよび9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項38に記載の方法。
- エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、ドナー分子からの変化しない蛍光シグナルを検出することを含む、請求項41に記載の方法。
- β−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)におけるガンマ−セクレターゼ開裂のインヒビターをスクリーニングする均一法であって、
(1)ガンマ−セクレターゼおよびβAPPを含む試料に被験化合物を加え、
(2)ついで、1対の蛍光付加物を該試料に加え、その際、第一の蛍光付加物はガンマ−開裂したβAPPフラグメントのカルボキシ末端に対する結合特異性を有し、未開裂のβAPPまたは他の種類のガンマ−開裂βAPPフラグメントに対しては実質的に交差反応性を有さず、第二の蛍光付加物はβ−アミロイドペプチド(Aβ)の1−31に対応するアミノ酸配列内でガンマ−開裂βAPPに対する結合特異性を有し、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、ついで
(3)該ドナー分子の励起後に両蛍光付加物間での蛍光エネルギーの実質的に低減した移動を検出する
工程を含む方法。 - ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、N−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩および1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項43に記載の方法。
- アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項44に記載の方法。
- エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、アクセプター分子からの殆どまたは全く増幅されていないシグナルを検出することを含む、請求項45に記載の方法。
- アクセプター分子が、ダブシルおよび9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項44に記載の方法。
- エネルギーの実質的に低減した移動を検出する工程が、ドナー分子からの変化しない蛍光シグナルを検出することを含む、請求項47に記載の方法。
- β−アミロイド前駆体タンパク質(βAPP)におけるガンマ−セクレターゼ開裂のインヒビターをスクリーニングする均一法であって、
(1)ガンマ−セクレターゼおよびβAPPを含む試料に被験化合物を加え、
(2)ついで、1対の蛍光付加物を未開裂のβAPPに結合させ、その際、第一の蛍光付加物は未開裂のβAPPのアミノ酸配列722−770内の部分に結合し、第二の蛍光付加物は未開裂βAPPのアミノ酸配列671−702内の部分に結合し、これら蛍光付加物のうちの少なくとも一方が未開裂βAPPの他の部分に対して実質的に交差反応性を有さず、両蛍光付加物がそれぞれ別々にドナー分子かまたはアクセプター分子のいずれかを含み、ついで
(3)該ドナー分子の励起後に両蛍光付加物間でのエネルギーの移動を検出する工程を含む方法。 - ドナー分子が、ランタニドのクリプテートまたはキレート、フルオレセイン、EDANS、N−[6−アミノ−9−[2−カルボキシ−フェニル]−4,5−ジスルホキシ−3H−キサンテン−3−イリデン]アミニウムイオン(2−)の塩および1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項49に記載の方法。
- アクセプター分子が、架橋アロフィコシアニン(「xl−APC」)、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミンおよび1−(イプシロン−カルボキシペンチル−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートイオンの塩よりなる群から選ばれる、請求項50に記載の方法。
- エネルギーの移動を検出する工程が、アクセプター分子からの増幅したシグナルを検出することを含む、請求項51に記載の方法。
- アクセプター分子が、ダブシルおよび9−[2−[[4−カルボキシ−ピペリジン−1−イル]スルホニル]フェニル]−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン]−N−メチルベンゼンアミニウムイオンの塩よりなる群から選ばれた蛍光消光剤分子である、請求項52に記載の方法。
- エネルギーの移動を検出する工程が、ドナー分子からの蛍光シグナルの低減を検出することを含む、請求項53に記載の方法。
- ガンマ−セクレターゼ活性を有する単離タンパク質。
- ガンマ−セクレターゼを含む単離タンパク質。
- 該ガンマ−セクレターゼがガンマ−セクレターゼ開裂部位を有する基質を認識および開裂する、請求項56に記載の単離タンパク質。
- 該ガンマ−セクレターゼ開裂部位でのガンマ−セクレターゼによる基質の開裂がβ−アミロイドペプチド(Aβ)および6kDaフラグメントを生成する、請求項57に記載の単離タンパク質。
- ガンマ−セクレターゼおよびPS1を含むタンパク質複合体である、請求項56に記載の単離タンパク質。
- ガンマ−セクレターゼを含む膜画分。
- PS1と複合体を形成したガンマ−セクレターゼを単離することによる、試料からガンマ−セクレターゼを単離する方法。
- PS1と複合体を形成したガンマ−セクレターゼを単離することが、PS1を認識および結合する試薬に試料を接触させ、それによって試薬/PS1/ガンマ−セクレターゼ複合体を生成させてガンマ−セクレターゼ活性を有する分子を単離することを含む、請求項61に記載の方法。
- 請求項61に記載の方法によって単離したガンマ−セクレターゼ活性を有する分子。
- PS1を認識および結合する試薬が抗PS1抗体を含む、請求項62に記載の方法。
- 試料からガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体を単離する方法であって、
(a)試料をPS1を認識および結合する分子と接触させて分子/PS1複合体を生成させ、ついで
(b)試料から該分子/PS1複合体を除去してガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。 - 請求項65に記載の方法によって単離したガンマ−セクレターゼ活性を有するタンパク質複合体。
- PS1を認識および結合する分子が抗PS1抗体を含む、請求項65に記載の方法。
- 該タンパク質複合体がガンマ−セクレターゼおよびPS1を含む、請求項65に記載の方法。
- 請求項65に記載の方法によって単離したタンパク質複合体。
- ガンマ−セクレターゼおよびPS1を含むタンパク質複合体を単離する方法であって、
(a)ガンマ−セクレターゼ陽性細胞を可溶化してガンマ−セクレターゼおよびPS1を含むタンパク質複合体と他の細胞成分との混合物を生成させ、
(b)該混合物を、PS1を認識および結合する分子と接触させて分子/PS1複合体を生成させ、ついで
(c)該複合体を他の細胞成分から除去することにより、ガンマ−セクレターゼおよびPS1を含むタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。 - 請求項70に記載の方法によって単離した、ガンマ−セクレターゼおよびPS1を含むタンパク質複合体。
- PS1を認識および結合する分子が抗PS1抗体である、請求項70に記載の方法。
- 工程(a)において、ガンマ−セクレターゼ陽性細胞の可溶化をN−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]を含む溶液中で行う、請求項70に記載の方法。
- ガンマ−セクレターゼによって開裂される単離された機能的に活性な基質。
- βAPPを含む、請求項74に記載の機能的に活性な基質。
- 機能的に活性な基質を開裂する方法であって、機能的に活性な基質を、ガンマ−セクレターゼ活性を有する分子と、ガンマ−セクレターゼ活性を有する該分子が機能的に活性な該基質を開裂して開裂産物を生成する条件下でインキュベートすることを含む方法。
- 目的とする分子が請求項76に記載の方法に従って基質を開裂することができるか否かを決定することによる、目的とする分子においてガンマ−セクレターゼ活性を検出する方法。
- 機能的に活性な基質がβAPPを含む、請求項76に記載の方法。
- 機能的に活性な基質およびガンマ−セクレターゼ活性を有する分子を、N−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]を含む溶液中でインキュベートする、請求項76に記載の方法。
- 機能的に活性な基質を単離する方法であって、
(a)ガンマ−セクレターゼ開裂配列を含む基質を生成させ、
(b)該基質をミクロソーム膜フラグメント中に挿入して機能的に活性な基質を生成させ、ついで
(c)機能的に活性な該基質を含む該ミクロソーム膜フラグメントを単離する
ことを含む方法。 - 請求項80に記載の方法によって生成した機能的に活性な基質。
- 該基質がβAPPを含む、請求項80に記載の方法。
- 該基質が配列番号2または4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項80に記載の方法。
- 機能的に活性な該基質が検出しうる標識を含む、請求項80に記載の方法。
- N−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]を含む溶液を用いて機能的に活性な基質をミクロソーム膜フラグメントから可溶化する、請求項80に記載の方法。
- さらに、
(a)機能的に活性な基質をミクロソーム膜フラグメントから可溶化し、ついで
(b)機能的に活性な該基質を単離する
ことを含む請求項80に記載の方法。 - 試料中のガンマ−セクレターゼ活性を阻害する試薬を同定する方法であって、
(a)該試料および該試薬を機能的に活性な基質と接触させ、ついで
(b)機能的に活性な該基質の開裂産物が試料中に生成するか否かを決定し、その際、試料中の開裂産物の欠如は該試薬が試料中のガンマ−セクレターゼ活性を阻害することを示す
ことを含む方法。 - 開裂産物の検出を、開裂産物のN末端を認識および結合する抗体を用いて行う、請求項87に記載の方法。
- 開裂産物の検出を、開裂産物のC末端を認識および結合する抗体を用いて行う、請求項87に記載の方法。
- 開裂産物の検出を1対の蛍光付加物を用いて行い、第一の蛍光付加物は開裂産物のN末端に結合し、第二の蛍光付加物は開裂産物のC末端に結合し、両蛍光付加物のうちの一方の励起が他方の蛍光付加物へのエネルギーの検出しうる移動をもたらす、請求項87に記載の方法。
- 複数の実質的に同一の試料をそれぞれ異なる試薬と別々に接触させる、請求項87に記載の方法。
- 複数の試料が約104を超える試料を含む、請求項87に記載の方法。
- 複数の試料が約105を超える試料を含む、請求項87に記載の方法。
- 複数の試料が約106を超える試料を含む、請求項87に記載の方法。
- 複数の実質的に同一の試料をそれぞれ異なる試薬と本質的に同時に接触させる、請求項87に記載の方法。
- 膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する方法であって、
(a)N−3[(ジメチルアミノ)プロピル]3,7,12−トリヒドロキシ(3a,5b,7a,12a)コラン−2−アミド]を含む溶液で細胞を可溶化することにより、膜内在タンパク質またはタンパク質複合体および他の細胞成分を有する混合物を得、ついで
(b)膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を単離する
ことを含む方法。 - 請求項96に記載の方法により単離した膜内在タンパク質またはタンパク質複合体。
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