JP2779509B2 - 検出方法 - Google Patents

検出方法

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JP2779509B2
JP2779509B2 JP63506330A JP50633088A JP2779509B2 JP 2779509 B2 JP2779509 B2 JP 2779509B2 JP 63506330 A JP63506330 A JP 63506330A JP 50633088 A JP50633088 A JP 50633088A JP 2779509 B2 JP2779509 B2 JP 2779509B2
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本願発明は、選択培地での準備段階または更に増殖さ
せる段階を要することなく抗体および固体免疫吸着支持
体を使用して混合培養物または試料から低レベルの特定
の１つの微生物または複数の微生物を検出する方法に関
する。
背景技術 標識として酵素かまたは放射性同位元素かのどちらか
に基づく固体相イムノアツセイは、特異性および感受性
が高いので診断微生物学での広範な適用が見い出されて
いる。
イムノアツセイの特異性は、固体支持体に固定されて
いる抗体または抗原によつて決定される。固体相の主要
な利点は、免疫反応が完結すると望ましくないものが簡
単な洗浄段階によつて抗原−抗体免疫複合体から容易に
且つ急速に除去される点にある。広範な種々の固体支持
体が抗体または抗原固定に適用されることが見い出され
ており、これら支持体にはポリスチレン、塩化ポリビニ
ル、ナイロン、水酸化第一チタン、アガロースビーズお
よびニトロセルロースがある。
試料中の微生物を検出するためにイムノアツセイを成
巧裡に適用することは、問題の特定の生物が十分な数で
存在する場合にのみ可能である。この臨界濃度は、特定
の抗体のその抗原との親和性および結合活性に依拠して
大いに変動するイムノアツセイの感度によつて決定され
る。多くのイムノアツセイに試験を実施する前に試料を
培養する必要があるのはこの理由による。
これには通常、損傷した微生物を蘇生させる予備増菌
段階、およびその後の問題の微生物の数を増加させる選
択的増菌が関わつている。競合微生物より特定の微生物
の増殖に都合の良い選択培養条件には、抗生物質、特定
の栄養要求または増殖培地の物理特性、例えば温度の操
作かのいずれかの使用が伝統的に関係している。これら
の方法は、生物によりそして他の微生物との夾雑の程度
により、１乃至２日または数週間を要することがある。
混合した集団から微生物を選択するために免疫吸着剤
を使用することは知られている。吸着剤は抗体が受けら
れる予め定められた微生物種を固定する。このようにし
て捕獲された細胞は増殖培地でインキユベートすること
ができ、次いでプレート化およびコロニー計数のような
伝統的な技術によって計数することができる。
米国特許第4,592,994号は試料中の微生物若しくは単
細胞生物の測定または同定の方法を記載している。この
方法は、検出すべき微生物に対して生起した抗体によつ
て提供され得る「特異的結合力」を有する吸収剤に試料
を暴露することに関する。結合していない試料は分離さ
せ、そして結合した生物を有する吸着剤は栄養培地に暴
露して代謝を開始させる。該栄養培地はこの代謝の結果
として物理的および化学的変化を受け、そしてこれらの
変化は、関係のある微生物の存在および量を決定するた
めの目盛り曲線によつて観察される。このアツセイは培
地中の代謝物を検出することによつて、生物の元々の数
を間接的に検出することに関する。このことは、種々の
微生物が代謝物を共有するので、アツセイの特異性に関
して問題を生じさせることがある。
米国特許第4,563,418号は試料中の特定の自動性生
物、例えばサルモネラ属（Salmonella）の種のような有
鞭毛細菌の検出方法を記載している。
この方法は、特定の自動性生物に選択的な増菌培地中
で試料を増菌させること並びに関連の生物およびその競
合菌を接種後しばらくの間培地中に一時的に固定するの
に役立つ化学走化性の誘引物質を含有する非−選択培地
で自動性容器を充たすことに関する。特定の自動性微生
物の鞭毛に特異的な抗体を自動性容器のもう１つの開口
部から添加する。この容器は、自動性生物に化学走化性
の誘引物質を代謝させるのに十分な温度および時間条件
下でインキユベートし、それによつて誘引物質の濃度が
十分低下して存在する生物の移動が可能になり、その結
果生物は培地を通過して移動し、アツセイされる特定の
自動性生物は抗体によって固定される。使用される抗体
量は永続的な固定化集団を生じさせるのに十分な量であ
る。
モヒツト（Mohit）等〔「多数の他の細菌の存在下で
サルモネラ属を検出する簡単な１段階免疫固定化方
法」、J.Med.Microbiol.８、173（1975）〕では、混合
集団中のサルモネラ属の検出方法が記載されている。こ
の方法はサルモネラ属の移動を促進する半固形の選択培
地を使用し、次いで多価Ｈ抗血清を使用して固定化して
いる。
ラロツシユ（La Roche）等は「卵製品中のサルモネラ
属検出におけるメンブランフイルター・デイスク固定化
技術の野外評価」でサルモネラ属の検出方法を記載して
おり、該方法は回収を増加させるために選択的移動の前
にメンブランフイルターを使用して初期の増菌ブイヨン
からサルモネラ属を濃縮することに関する。
スタンナード（Stannard）はレザーヘツド（Leatherh
ead）RAの1986年報で、試料中のサルモネラ属検出に要
する時間を減少させる観点から、他の生物からサルモネ
ラ属を分離する研究を報告した。
この方法は抗体を被覆した磁気粒子に依存していた。
しかし乍ら、他の密接に関係のある生物以上のサルモネ
ラ属の明らかな増菌は、実際には、実験に使用したガラ
ス製品に対するこれら生物の親和性の差違によるもので
あることが見い出された。ガラスに対するこの異なる親
和性をサルモネラ属増菌に使用する試みは、効果が特異
的でなかつたので成功しなかつた。
かくして、混合集団から微生物を検出する先行技術の
方法は選択培地での増菌を使用して少数の微生物を検出
する手段を提供することが示される。免疫固定化が使用
されているが、選択培地での上記選択がない場合、少数
の微生物を検出するのに有効であることは示されていな
い。
本願発明は混合集団中の少数の特定の１つの微生物ま
たは複数の微生物を検出する方法を提供し、該方法によ
り免疫固定化技術を使用し、次いで非−選択的増殖およ
びイムノアツセイまたは抗体−微生物結合の開裂および
非−選択培地での微生物の増殖によつて選択培地での予
備選択をする必要性が克服される。
本方法はサルモネラ属の種およびリステリア属の種の
検出に特に有効に適用することができ、混合集団中のそ
れら菌種を検出する迅速で感度の良い方法の必要性に合
致する。
本発明の記載 本発明は固体支持体に吸着された特異的抗体を使用し
て、競合する微生物叢の存在下、特定の１つの微生物ま
たは複数の微生物を迅速に検出する方法を提供する。固
定化された抗体は微生物の抗原に対するものであり、該
抗体は所望の微生物の複製能力を損うことなく該微生物
の選択的捕獲および固定化を可能にする。適当な抗体
は、鞭毛またはリポ多糖類のような表面構造によつても
たらされる表現抗原に対して生じさせることができる。
所望の１つの微生物または複数の微生物の固体支持体へ
の選択的集中によつて試料中の競合する微生物叢からの
急速な分離が可能になり、固体支持体を簡単に洗浄する
ことによつて達成される。次いで、固定化された細胞は
栄養ブイヨンに移して複製させ、その間増殖している微
生物は捕獲され続け、抗体部位が満たされるまで固体支
持体上に固定化される。
微生物の濃度が検出可能なレベルに達するのに要する
時間は、特定の１つの微生物または複数の微生物の発生
時間およびイムノアツセイの感度限界に依存する。
検出可能なレベルが達成されるとすぐに固体支持体は
培養ブイヨンから簡単に分離され、次いで洗浄され、そ
して直接アツセイされる。
或いは、抗体−微生物結合は適当な作用剤によつて破
壊して、微生物を放出することができる。放出された細
胞は栄養培地に移して複製させ、形成するコロニーを検
出することができる。
免疫固定化段階中の特定の１つの微生物または複数の
微生物の選択は１つの属、該属内の特定の種に共通する
表面抗原の選択に関わることができ、または非常に高い
感度が要求される場合その種の抗原型に特異的な抗原を
選択することができる。
かくして、この技術により、混合集団から低いレベル
の特定の１つの微生物または複数の微生物の迅速な感度
の良い検出を提供する際に、精巧且つ高価な増菌培地の
必要性が排除される。
第１の実施態様では、本発明は、試料中の競合微生物
叢の存在下、低レベルの特定の１つの微生物または複数
の微生物を検出する方法を提供する。該方法は、検出さ
れる特定の１つの微生物または複数の微生物に特異的な
抗体を吸着している固体支持体に試料を暴露し（その
際、上記抗体は特定の１つの微生物または複数の微生物
の複製能力を損うことなく特定の１つの微生物または複
数の微生物を選択的に捕獲し固定化することができ
る）、結合していないものを除去するため支持体を洗浄
し、支持体に無菌の栄養ブイヨンを加え、特定の１つの
微生物または複数の微生物が検出可能なレベルに達する
のに十分な特定の１つの微生物または複数の微生物の発
生時間に適切な温度および時間で栄養ブイヨン中で支持
体をインキユベートし、そして次いで検出される特定の
１つの微生物または複数の微生物に特異的な免疫試薬を
使用して支持体上でイムノアツセイ実施することからな
る。
好ましくは、抗体は微生物の表面抗原に対して生じさ
せる。更に好ましくは、表面抗原は鞭毛蛋白質またはリ
ポ多糖類である。
好ましい態様では、抗体は、ビーズ、管またはウエル
からなる固体支持体上に固体化される。
好ましくは、支持体材料はポリスチレン、塩化ポリビ
ニル、ナイロン、水酸化第一チタン、アガロースビーズ
またはニトロセルロースである。
本発明に従う好ましい微生物にはサルモネラ属の種お
よびリステリア属の種がある。
抗体で被覆した支持体への試料の暴露は一般に１時間
またはそれ以下である。洗浄段階は好ましくは無菌の塩
類緩衝液、更に好ましくはトリス−塩類緩衝液を使用し
て実施される。実質的には任意の栄養ブイヨンを本方法
で使用することができるが、好ましいブイヨはトリプト
ン大豆ブイヨンおよびＭブイヨンである。栄養培地での
インキユベーシヨンは一夜であることができ、そして通
常は37℃である。しかし乍ら、ねずみチフス菌（Salmon
ella typhimurium）の検出には、約６時間のインキユベ
ーシヨン時間が有効であることが示されている。より多
数の特定の微生物が最初の試料に存在している場合、１
から６時間の間のインキユベーシヨン時間を使用するこ
とができる。好ましくはイムノアツセイはエリザ（ELIS
A）法である。
更に好ましい態様では、本方法は抗−サルモネラ属鞭
毛抗体が吸着されているポリスチレン支持体にサルモネ
ラ属試験試料を約５分から約30分間暴露し（その際上記
抗体はサルモネラ属の複製能力を損うことなくサルモネ
ラ属の選択的捕獲および固定化することができる）、結
合していないものを除去するために支持体を洗浄し、無
菌の栄養ブイヨンを支持体に添加し、支持体を約１時間
から約６時間の間37℃でインキユベートし、支持体を洗
浄し、サルモネラ属に特異的な酵素標識抗体を添加し、
約５分から約30分間インキユベートし、過剰の酵素−標
識抗体を全て廃棄し、支持体を洗浄し、酵素標識抗体の
酵素に特異的な色素原基質を添加し、そして色素原基質
の着色化合物への転換を測定する、ことからなる。
好ましくは支持体は管、ビーズまたは微量滴定ウエル
である。
好ましくは、酵素標識抗体は（抗−サルモネラ属）抗
体−ベルオキシダーゼ抱合体である。しかし乍ら、結合
したサルモネラ属のアツセイの間接的方法に、抗−サル
モネラ属抗体に対して生じた標識抗体と共に標識されて
いない抗−サルモネラ属抗体を使用できることが認めら
れる。
好ましくは洗浄は洗浄溶液としてトリス−塩類溶液を
使用して実施される。
好ましくは上記基質はABTS/H2O2溶液である。
好ましくは栄養ブイヨンはトリプトン大豆ブイヨンで
ある。
第２の実施態様では、本発明は競合する微生物叢の存
在下で試料中で低レベルの特定の１つの微生物または複
数の微生物を検出する方法を提供する。該方法は、特定
の１つの微生物または複数の微生物に特異的な抗体が吸
着されている固体支持体に試料を暴露し（その際上記抗
体は特定の１つの微生物または複数の微生物の複製能力
を損うことなく特定の１つの微生物または複数の微生物
の選択的捕獲および固定化をすることができる）、結合
していないものを除去するために支持体を洗浄し、放出
化剤を用いて結合した特定の１つの微生物または複数の
微生物を放出させ、放出されたものを栄養培地に添加
し、そして特定の１つの微生物または複数の微生物を検
出可能なレベルに到達させるため、検出する特定の１つ
の微生物または複数の微生物の発生時間に適切な温度お
よび時間でインキユベートする、ことからなる。
抗体−微生物結合を分離させるのに適当な放出化剤に
は次のものがある： １） カオトロピツク剤、例えば4.5M MgCl2（pH7.5）
または2.5M NaI（pH7.5）、 ２） 極性減少剤、例えばエチレングリコールの50％ま
での溶液、 ３） pH変更誘導剤、例えばグリシン/HCl（pH2.5）、
水性NH3（pH11）または0.5％KOH（pH2.5）。
好ましくは放出化剤は0.5％KOH（pH2.5）である。放
出される微生物の担体を提供するために、上記溶液に蛋
白質を加えることができる。
好ましい態様では、微生物はリステリア属の種または
サルモネラ属の種であり、更に好ましくはリステリアモ
ノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）である。
結合した微生物の数を放出および検出前に増加させる
ために、該微生物の放出に先立つてそれらを栄養培地中
で非−選択的増殖に付すこともできることが認められ
る。
試料は好ましくは約５分間抗体を被覆した支持体に暴
露する。洗浄溶液は好ましくは無菌の塩類溶液であり、
更に好ましくは無菌のトリス−HCl緩衝塩類溶液（pH7.
5）である。実質的には任意の栄養培地が使用できる
が、トリプチカーゼ（Trypticase）大豆寒天が好ましい
培地である。プレートは好ましくは18から24時間の間37
℃でインキユベートする。選択培地の代わりに栄養培地
を使用して、インキユベーシヨンを12時間程の短時間に
減少させることができる。
更に好ましい実施態様では、本方法は、リステリア属
の種に特異的な抗体が吸着されているポリスチレン支持
体にリステリア属試験試料を約５分間暴露し（その際、
上記抗体はリステリア属の種の複製能力を損うことなく
リステリア属の種の選択的捕獲および固定化が可能であ
る）、結合していないものを除去するために支持体を洗
浄し、放出化剤を使用して結合したリステリア属を放出
させ、栄養寒天プレートに放出物を添加し、そしてプレ
ートを37℃で約16〜18時間インキユベートすることから
なる。
好ましくは抗体は（抗−リステリア属鞭毛）抗体であ
る。
好ましくは放出化剤は0.5％KOH溶液である。
好ましくは洗浄はトリス／塩類溶液（pH7.5）を使用
して実施する。
好ましくは栄養寒天プレートはトリプチカーゼ大豆寒
天プレートである。
本発明はまた、混合集団中の低レベルの特定の１つの
微生物または複数の微生物を検出するための試験キツト
も提供する。該キツトは、検出される特定の１つの微生
物または複数の微生物に特異的な抗体が吸着している固
体支持体、洗浄溶液、検出される特定の１つの微生物ま
たは複数の微生物に特異的な酵素標識抗体および酵素標
識抗体の酵素用の色素原基質溶液からなる。
酵素標識抗体の代わりに、該キツトは抗−微生物抗体
並びに該抗−微生物抗体に対して生じる酵素標識抗体か
らなることもできる。
本発明はまた、検出される特定の１つの微生物または
複数の微生物に特異的な抗体が吸着している固体支持
体、放出化剤および洗浄溶液からなる試験キツトも提供
する。
本発明を実施する最良の方法 本発明は以下の実施例を参照して更に記載するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を制限するものでは決して
ない。
実施例１ 抗体で被覆したウエルを使用するサルモネラ属の選択的
単離 ネズミチフス菌（内部株BTA 438）およびシトロバク
ターデイバーサス（Citrobacter diversus）（BTA 132
3）は別々のＭブイヨン溶液に接種し、37℃で一夜イン
キユベートした。各培養物は109個の微生物/mlにまで増
殖した。次いで、これらを次のように希釈した： 108個の細胞/mlのC.デイバーサスと104個の細胞/mlの
ネズミチフス菌 108個の細胞/mlのC.デイバーサスと103個の細胞/mlの
ネズミチフス菌 108個の細胞/mlのC.デイバーサスと102個の細胞/mlの
ネズミチフス菌 108個の細胞/mlのC.デイバーサスと101個の細胞/mlの
ネズミチフス菌 108個の細胞/mlのC.デイバーサスと100個の細胞/mlの
ネズミチフス菌 108個の細胞/mlのC.デイバーサスのみ（対照）。
次いで、サルモネラ属鞭毛に対する、非常に純粋な抗
体で被覆したポリスチレンウエルを混合培養物を含有す
るＭブイヨンに加えた。非−免疫ヒツジ免疫グロブリン
で被覆したウエルは、対照として２つ１組の混合培養物
中に入れた。ウエルを入れたブイヨンは37℃で１時間振
とうした。
次いでウエルを注意深く取り出し、トリス−塩類溶液
中で３回洗浄し、次いで新鮮なＭブイヨン溶液中に入れ
た。これらのＭブイヨンは37℃で一夜インキユベートし
て、固定化した生物を増殖させた。次いでウエルをＭブ
イヨンから取り出し、それらにエリザ法を実施した。
EIA法 ウエルはトリス−塩類−トウイーン（TST）で３回洗
浄し、次いで抗−サルモネラIgG−西洋ワサビペルオキ
シダーゼで標識した抱合体を加えた。37℃で30分間イン
キユベートした後、ウエルをTSTで３回洗浄し、次いで
過酸化水素（0.005％）含有クエン酸−リン酸塩緩衝液
（0.1M、pH4）中の基質（2,2−アジノビス（３−エチル
ベンズチアゾリンスルホン酸））を加えて発色させた。
実施例２ 本方法は標準培養物増菌プロトコール（Standard Cul
ture Enrichment protocol）〔AOAC official Methods
of Analysis、963〜971（1984）〕と比較して、実施速
度が増大しており、そして以下で記載するように選択性
および感度が高まつていることが示された。
本プロトコールは、混合培養物を含有するＭブイヨン
1mlをテトラチオネートブイヨン10ml中に入れ、37℃で
６時間インキユベートした以外は実施例１のとおりであ
つた。
その後、該ブイヨンに対してエリザ法を実施した。ブ
イヨンの残り9mlにサルモネラ属鞭毛に対する非常に純
粋な抗体を被覆したウエルを加えて、Ｍブイヨンのイン
キユベーシヨンが６時間だけであつた以外は実施例１の
方法に従い、次いでエリザを実施した。
６時間後、108個のシトロバクター属の存在下103個の
サルモネラ属はエリザ法によつて上記被覆ウエルから検
出され、一方テトラチオネート中での６時間の選択的増
菌後ではサルモネラ属はエリザ法で検出されなかつた。
実施例３ 混合培養物からリステリアモノサイトゲネスの選択的単
離 リステリアモノサイトゲネス（BTA第1767号）、黄色
ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（BTA第1414号）
および糞便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）（ATCC
第19433号）は個別にトリプトース（Tryptose）−大豆
ブイヨン中28℃で一夜培養した。各培養物は最低109個
の生物/mlにまで増殖し、次いで希釈して次のような混
合物とした： 混合物A:109個の細胞/mlの黄色ブドウ球菌＋106個の細
胞/mlのL.モノサイトゲネス 混合物B:109個の細胞/mlの糞便連鎖球菌＋106個の細胞/
mlのL.モノサイトゲネス 対 照:109個の細胞/mlの糞便連鎖球菌 109個の細胞/mlの黄色ブドウ球菌 106個の細胞/mlのL.モノサイトゲネス。
上記培養物の各々から得た200μの試料は、リステ
リア属鞭毛に対する非常に純粋な抗体で被覆したポリス
チレンウエル中でインキユベートした。室温で５分間イ
ンキユベートした後、ウエルを空にし、無菌のトリス−
塩酸緩衝塩類溶液（pH7.5）で３回洗浄した。次いで、p
H12.5の0.5％KOH溶液（100μ）を添加して、捕獲され
た全ての生物を溶液中に放出させ、直ちにトリプトース
大豆寒天プレートに移し、そしてガラス製スプレツダー
を使用して押し拡げた。比較の目的で、上記培養物はま
た、トリプトース大豆寒天に10μ分別物を筋状につけ
て、免疫増菌をしないで直接試験した。プレートは全て
37℃で18〜24時間インキユベートし、次いでリステリア
モノサイトゲネスの典型的コロニー（輝きのある青味の
ある灰色、半透明、直径0.5〜1.5mm、水分の多い粘稠
性）を薄暗い光の下で調べた。
結果 １つの段階で、競合する微生物の約1000倍のL.モノサ
イトゲネスの増菌が達成された。単離は非常に単純化さ
れており、このような混合物の直接的プレート化でリス
テリアコロニーを単離できないときでも、検出が可能で
あつた。
実施例４ リステリアモノサイトゲネスの単離に対する免疫増菌の
感度 リステリアモノサイトゲネスはトリプトース大豆ブイ
ヨン中28℃で18時間培養した。次いで、培養物は無菌の
塩類溶液で希釈して107、106、105および104個の生物/m
lの濃度とした。三重複して試験した各希釈液の試料（2
00μ）は個別の抗−リステリア抗体で被覆したウエル
中で５分間インキユベートし、次いでウエルを空にし、
無菌の緩衝塩類溶液（pH7.5）で洗浄した。固定化され
た微生物は全て、pH12.5の0.5％KOHを添加して溶液中に
放出させ、次いで直ちにトリプトース大豆寒天プレート
に移し、ガラス製スプレツダーを使用して押し拡げた。
プレートは37℃で18〜24時間インキユベートし、コロニ
ーの数を計数した。
結果 本方法の感度によつて、２×103個程の少ない生物を
抗体被覆ウエル中でインキユベートしたときでも、リス
テリアモノサイトゲネスの検出が可能であつた。
実施例５ 一般的方法： リステリア属の試験試料はpH7.5〜8.0に調整し、200
μをUSAデイナテツク リモーバウエル（商標）（USA
Dynatech RemovawellTM）（これはpH8.1の10mMりん酸
緩衝液中抗−リステリア抗体（10μg/mlのO/N）で20〜2
5℃で被覆されている）に移した。
試料は室温で５分間インキユベートした。
次いで、ウエルはpH7.5の無菌トリス−塩溶液で静か
に洗浄した。
KOH（pH11.1）100μを加えた。
得られたKOH混合物の100μ分別物はトリプトン大豆
寒天または修正マツクブライド（McBride）寒天（MMA）
プレートに移し、そしてガラス製スプレツダーを使用し
て押し拡げた。プレートは37℃で18時間から24時間イン
キユベートし、典型的なリステリア属コロリーを調べ
た。
免疫増菌の反応時間の最適化 培養：リステリアモノサイトゲネス（BTA1767）はオキ
ソイド（OXOID）のTSB＋0.6％の酵母軸出物中28℃で一
夜増殖させた。
放出化剤:0.5％KOH（pH10.5） プレート：修正マツクブライド寒天プレート 免疫増菌の特異性 （１）培養：培養物は全てオキソイドのTSB中28℃で一
夜増殖させた。
放出化試薬:0.01％KOH＋0.85％NaCl（pH11.1）。
微量滴定ウエル：リステリア属抗体で被覆したウ
エル。
スタフイロコツカス属外毒素抗体で被覆したウエル。
ブランクのウエル（正常なガンマ線を照射したポリス
チレンウエル）。
実施例６ サルモネラ属の迅速検出キツト このキツトによつて、ユーザーは食物、環境または臨
床試料中のサルモネラ属の存在を迅速に試験することが
できる。サルモネラ属の鞭毛に対し非常に特異的な抗体
で表面を被覆したポリスチレン管を使用して、試験試料
中に存在するサルモネラ属生物を捕獲する。この捕獲は
抗体を被覆した管の中で試験試料を短時間、例えば５〜
30分間インキユベートして達成される。次いで、管は結
合していないものを除去するために完全に洗浄する。次
いで、無菌の栄養ブイヨン、例えばトリプトン大豆ブイ
ヨンを加え、そして管を37℃で１〜６時間インキユベー
トする。この間に固定化されたサルモネラ属は複製し、
そして管表面上の利用可能な抗体によつて捕獲され続け
る。これにより、その後に続くイムノアツセイによる検
出に十分な密度の生物が達成される。
捕獲された生物の存在は、培養ブイヨンを棄て、次い
でサルモネラ属に特異的な酵素標識抗体を加えることに
よつて検出することができる。短時間（５〜30分）イン
キユベートした後過剰の酵素−抗体試薬は棄て、管は洗
浄する。
固定化した生物に特異的に結合している酵素−抗体抱
合体は、その酵素用の基質の添加によつて検出される。
提供される材料 −抗−サルモネラ抗体で被覆したポリスチレン管 −抗−サルモネラ−抗体−ペルオキシダーゼ抱合体 −トリス塩類トウイーン洗浄溶液 −基質溶液−ABTS/H2O2 サルモネラ試薬の代わりにリステリア試薬を使用して、
このキツトをリステリア属の検出に適応させることがで
きる。
リステリア検出キツト このキツトによつて、食物かまたは環境試料かのいず
れかに由来する培養ブイヨンからリステリア属の選択的
単離が可能になり、そして生物の単離用の選択寒天プレ
ートの開発／使用の必要性がなくなる。
リステリア属に対して非常に特異的な抗体は、提供さ
れたポリスチレン管の内表面上に固定される。試験溶液
の１分別物を特定の時間（５分間）抗体で被覆した管中
でインキユベートする。次いで管を空にし、結合してい
ないものを除去するために洗浄する。次いで放出化剤、
例えば0.5％KOH溶液を添加して、捕獲されたリステリア
属の全てを放出させる。溶液中に放出されたリステリア
属は栄養寒天、例えばトリプチカーゼ大豆寒天上に広
げ、そしてこのプレートを37℃で16〜18時間インキユベ
ートして生物を複製させる。
この方法によつて、多種の他の生物と夾雑している最
初の培養ブイヨン（試料）から所望の生物が容易に単離
され、その結果選択的寒天の必要性が不要になる。リス
テリア属の特別な事例では、記載した方法は、微生物学
的標準法（Microbiological Standard Methods）により
現在推奨されている選択的寒天より優れて選択的である
ことが示される。
提供される材料 （１） 抗−リステリア属鞭毛抗体で被覆したポリスチ
レン管 （２） 放出化剤（0.5％KOH溶液） （３） トリス／塩類洗浄緩衝液、pH7.5 リステリア試薬をサルモネラ試薬に置き代えることに
よつて、このキツトはサルモネラ属を検出するために適
応させることができる。
これらの実施例は、混合培養物中の特定の生物を迅速
に検出するためのこれら方法の有用性を示す。
これらの方法は従来の培養増菌プロトコールより一層
迅速であり、陽性結果は、標準的培養方法による最低48
時間に比べて６時間という早さで得ることができる。
工業的適用 本願発明は、混合集団中の数の少ない特定の１つの微
生物または複数の微生物の検出に特別の選択培地を使用
するための変法を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アシュ，メーガン オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2077、ホーンスビィ、エッジ ワース・デヴィッド・アヴェニュー 20 ／３‐７ (72)発明者 ヴァン・ヒュン，カ オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2142、グランヴィル、ブラッ クセル・ストリート 67 (56)参考文献 特開 昭59−141097（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501726（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/569

Claims (46)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の競合する微生物叢の存在下、低い
    レベルの特定の１つの微生物または複数の微生物の検出
    方法であって、該方法は、検出される上記１つの微生物
    または複数の微生物に特異的な、かつ微生物の複製能力
    を損うことなく上記１つの微生物または複数の微生物の
    選択的捕獲および固定化が可能である抗体が吸着してい
    る固体支持体であって、かつ複製後にこれら生じた微生
    物が選択的に捕獲されかつ固定化される能力を損なうこ
    とのない固体支持体に試料を暴露し、結合していないも
    のを除去するために支持体を洗浄し、支持体に無菌の栄
    養ブイヨンを添加し、上記１つの微生物または複数の微
    生物を検出可能なレベルに到達させるのに十分な、上記
    １つの微生物または複数の微生物の発生時間に適切な温
    度および時間で栄養ブイヨン中で支持体をインキュベー
    トし、そして検出される上記１つの微生物または複数の
    微生物に特異的な免疫試薬を使用して支持体上でイムノ
    アッセイを実施する、ことからなる。
  2. 【請求項２】抗体が特定の１つの微生物または複数の微
    生物の表面抗原に対して生じた抗体である請求の範囲第
    １項に記載の方法。
  3. 【請求項３】表面抗原が鞭毛蛋白質またはリポ多糖類で
    ある請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】固体支持体がビーズ、管またはウエルであ
    る請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】支持体がポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
    ナイロン、水酸化第一チタン、アガロースビーズまたは
    ニトロセルロースである請求の範囲第４項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】微生物がサルモネラ属の種またはリステル
    ア属の種である請求の範囲第１項から第５項のいずれか
    １項に記載の方法。
  7. 【請求項７】試料が１時間またはそれより短かい時間支
    持体に暴露される請求の範囲第１項から第６項のいずれ
    か１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】支持体が無菌の塩類緩衝液で洗浄される請
    求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】無菌の塩類緩衝液がトリス−塩類緩衝液で
    ある請求の範囲第８項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】栄養ブイヨンがトリプトン大豆ブイヨン
    またはＭブイヨンである請求の範囲第１項から第９項の
    いずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】栄養ブイヨン中のインキュベーションが
    37℃で一夜である請求の範囲第１項から第10項のいずれ
    か１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】栄養ブイヨン中のインキュベーションが
    37℃が６時間である請求の範囲第１項から第11項のいず
    れか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】イムノアッセイがエリザ法である請求の
    範囲第１項から第12項のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】免疫試薬が酵素標識抗微生物抗体である
    請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】免疫試薬が抗−微生物抗体および該抗−
    微生物抗体に対して生じた酵素標識抗体からなる請求の
    範囲第13項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】請求の範囲第１項から第14項のいずれか
    １項に記載の方法であって、該方法は、サルモネラ属の
    複製能力を損うことなくサルモネラ属の選択的捕獲およ
    び固定化が可能である抗−サルモネラ属鞭毛抗体を吸着
    しているポリスチレン支持体であって、かつ複製後にこ
    れら生じたサルモネラ属が選択的に捕獲されかつ固定化
    される能力を損なうことのないポリスチレン支持体に約
    ５分から約30分間サルモネラ属試験試料を暴露し、結合
    していないものを除去するために第１の洗浄溶液で支持
    体を洗浄し、無菌の栄養ブイヨンを支持体に加え、37℃
    で約１時間から約６時間支持体をインキュベートし、支
    持体を第２の洗浄溶液で洗浄し、サルモネラ属に特異的
    な酵素標識抗体を添加し、約５分間から約30分間インキ
    ュベートし、過剰の酵素標識抗体を全て廃棄し、支持体
    を上記第２の洗浄溶液で洗浄し、酵素標識抗体の酵素に
    特異的な色素原基質を添加し、そして色素原基質の着色
    化合物への転換を測定する、ことからなる。
  17. 【請求項１７】支持体が管、ビーズまたは微量滴定ウエ
    ルである請求の範囲第16項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】酵素標識抗体が（抗−サルモネラ属）抗
    体−ベルオキシダーゼ抱合体である請求の範囲第16項ま
    たは請求の範囲第17項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】第１の洗浄が洗浄溶液としてトリス−塩
    類溶液を用いて実施され、第２の洗浄が洗浄溶液として
    トリス−塩類−トウイーン溶液を使用して実施される請
    求の範囲第16項から第18項のいずれか１項に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】上記基質溶液がABTS/H2O2溶液である請
    求の範囲第16項から第19項のいずれか１項に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】栄養培地がトリプトン大豆ブイヨンであ
    る請求の範囲第16項から20項のいずれか１項に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】試料中の競合する微生物叢の存在下、低
    レベルの特定の１つの微生物または複数の微生物を検出
    する方法であって、該方法は、上記１つの微生物または
    複数の微生物に特異的な、かつ微生物の複製能力を損う
    ことなく上記１つの微生物または複数の微生物の選択的
    捕獲および固定化が可能である抗体を吸着している固体
    支持体であって、かつ複製後にこれら生じた微生物が選
    択的に捕獲されかつ固定化される能力を損なうことのな
    い固体支持体に試料を暴露し、結合していないものを除
    去するために支持体を洗浄し、結合した上記１つの微生
    物または複数の微生物を放出化剤を用いて放出させ、放
    出されたものを栄養培地に添加し、そして検出される上
    記１つの微生物または複数の微生物を検出可能なレベル
    に到達させるために、上記１つの微生物または複数の微
    生物の発生時間に適切な温度および時間でインキュベー
    トする、ことからなる。
  23. 【請求項２３】放出化剤がカオトロピック剤、極性減少
    剤またはpH変更誘導剤である請求の範囲第22項に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】放出化剤が4.5MのMgCl2（pH7.5）若しく
    は2.5MのNaI（pH7.5）から選択されるカオトロピック
    剤、または50％までのエチレングリコール溶液から選択
    される極性減少剤、またはグリシン/HCl（pH2.5）、NH3
    水性溶液（pH11）若しくは0.5％KOH（pH12.5）から選択
    されるpH変更誘導剤である請求の範囲第23項に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】微生物がリステリア属の種またはサルモ
    ネラ属の種である請求の範囲第22項から第24項のいずれ
    か１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】リステリア属の種がリステリアモノサイ
    トゲネスである請求の範囲25項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】試料が約５分間支持体に暴露される請求
    の範囲第22項から第26項のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】支持体が無菌の緩衝塩類溶液で洗浄され
    る請求の範囲第22項から第27項のいずれか１項に記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】無菌の緩衝塩類溶液がトリス−HCl緩衝
    塩類溶液（pH7.5）である請求の範囲第28項に記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】栄養培地がトリプチカーゼ大豆寒天であ
    る請求の範囲第22項から第29項のいずれか１項に記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】栄養培地が37℃で約12時間から約24時間
    インキュベートされる請求の範囲第22項から第30項のい
    ずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】栄養培地が37℃で約18時間から約24時間
    インキュベートされる請求の範囲第22項から第31項のい
    ずれか１項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】請求の範囲第22項から第32項のいずれか
    １項に記載の方法であって、その際該方法は、リステリ
    ア属の種に特異的な、かつリステリア属の種の複製能力
    を損うことなくリステリア属の種の選択的捕獲および固
    定化が可能である抗体を吸着しているポリスチレン支持
    体であって、かつ複製後にこれら生じたリステリア属の
    種が選択的に捕獲されかつ固定化され能力を損なうこと
    のないポリスチレン支持体にリステリア属試験試料を約
    ５分間暴露し、結合していないものを除去するために支
    持体を洗浄し、結合したリステリア属を放出化剤を用い
    て放出させ、放出したものを栄養寒天プレートに添加
    し、そしてこのプレートを37℃で約16〜18時間インキュ
    ベートする、ことからなる。
  34. 【請求項３４】栄養寒天プレートがトリプチカーゼ大豆
    寒天プレートである請求の範囲第33項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】抗体が（抗−リステリア属鞭毛）抗体で
    ある請求の範囲第33項または請求の範囲第34項に記載の
    方法。
  36. 【請求項３６】放出化剤が0.5％KOH（pH12.5）溶液であ
    る請求の範囲第33項から第35項のいずれか１項に記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】洗浄がトリス／塩類（pH7.5）溶液を使
    用して実施される請求の範囲第33項から36項のいずれか
    １項に記載の方法。
  38. 【請求項３８】混合集団中の低レベルの特定の１つの微
    生物または複数の微生物を請求の範囲第１〜21項の何れ
    か１項に記載の検出方法により検出する試験キットであ
    って、該キットは、検出される上記１つの微生物または
    複数の微生物に特異的な、かつ微生物の複製能力を損う
    ことなく上記１つの微生物または複数の微生物の選択的
    捕獲および固定化が可能である抗体を吸着している固体
    支持体であって、かつ複製後にこれら生じた微生物が選
    択的に捕獲されかつ固定化される能力を損なうことのな
    い固体支持体、検出される上記１つの微生物または複数
    の微生物に特異的な酵素標識抗体、および酵素標識抗体
    の酵素に対する色素原基質溶液からなる。
  39. 【請求項３９】支持体が抗−サルモネラ抗体で被覆した
    ポリスチレン管からなる請求の範囲第38項に記載の試験
    キット。
  40. 【請求項４０】酵素標識抗体が抗−サルモネラ−抗体−
    ペルオキシダーゼ抱合体からなる請求の範囲第38項また
    は請求の範囲第39項に記載の試験キット。
  41. 【請求項４１】上記基質溶液がABTS/H2O2からなる請求
    の範囲第38項から第40項に記載の試験キット。
  42. 【請求項４２】混合集団中の低レベルの特定の１つの微
    生物または複数の微生物を請求の範囲第１〜21項の何れ
    か１項に記載の検出方法により検出するための試験キッ
    トであって、該キットは、検出される上記１つの微生物
    または複数の微生物に特異的な、かつ微生物の複製能力
    を損うことなく上記１つの微生物または複数の微生物の
    選択的捕獲および固定化が可能である抗体を吸着してい
    る固体支持体であって、かつ複製後にこれら生じた微生
    物が選択的に捕獲されかつ固定化される能力を損なうこ
    とのない固体支持体、上記１つの微生物または複数の微
    生物に特異的な抗体、上記１つの微生物または複数の微
    生物に特異的な抗体に特異的な酵素標識抗体、および酵
    素標識抗体の酵素に対する色素原基質溶液からなる。
  43. 【請求項４３】検出される特定の１つの微生物または複
    数の微生物に特異的な、かつ微生物の複製能力を損うこ
    となく上記１つの微生物または複数の微生物の選択的捕
    獲および固定化が可能である抗体を吸着している固体支
    持体であって、かつ複製後にこれら生じた微生物が選択
    的に捕獲されかつ固定化される能力を損なうことのない
    固体支持体、放出化剤および洗浄溶液からなる、請求の
    範囲第22〜37項の何れか１項に記載の検出方法が用いら
    れる試験キット。
  44. 【請求項４４】支持体が抗−リステリア属鞭毛抗体で被
    覆したポリスチレン管からなる請求の範囲第43項に記載
    の試験キット。
  45. 【請求項４５】放出化剤が0.5％KOH溶液である請求の範
    囲第43項または請求の範囲第44項に記載の試験キット。
  46. 【請求項４６】洗浄溶液がトリス／塩類溶液（pH7.5）
    からなる請求の範囲第45項に記載の試験キット。
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