JPH07502646A - リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するdnaを含む細菌発現ベクター - Google Patents
リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するdnaを含む細菌発現ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するDNAを含む細菌発現ベクター
この出願は1991年10月21日に受理された出願番号780.261を部分
継承するものである。
この発明は、細菌、例えばミコバクテリアなどにあるタンパク質を発現するため
の発現ベクターに関する。より詳細には、この発明は、タンパク質を発現する細
菌に異種のタンパク質を発現し分泌する発現ベクターに関するものであり、ここ
でそのベクターは少なくとも異種タンパク質の脂質をアシル化および表面発現を
達成するように設計されたりボタンバク質の分泌シグナルをコード化するDNA
を更に含む。
ある種のミコバクテリアは、ヒトおよび動物の主要な病原を表わす。例えば結核
はヒト結核菌により一般にヒトに生じ、またウシ型結核菌により家畜に発生し、
それはヒトおよび他の動物に媒介される。ライ菌はライ病の原因となる因子であ
る。ヒト結核菌および鳥型・パテー打菌・スクロフラセウムミコバクテリアのグ
ループ(MA I Sグループ)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の患者
の主要な日和見性病原を表わす。仮性結核菌は、家畜の主要な病原である。
一方、ウシ型結核菌の無発病性菌株であるカルメットーゲラン杆菌、すなわちB
CGはヒトワクヂンとして広く用いられ、とりわけ結核を防ぐ生ワクチンとして
使用される。BCGは生まれると同時に一般に与えられる唯一の幼児用ワクチン
であり、副作用の影響が非常に低く、個体に対し繰返して(例えば多重形態で)
使用することができる。加えて、ワクチンに使用されるBCGおよび他のミコバ
クテリア(例えば恥垢菌)は、現在量も良く知らせているものの中でもアジュバ
ント性能を有しており、従って、抗原に非常に有効に反応するように受容体の免
疫システムを刺戟する。
「ネイチャー」327巻・6122号、532〜535頁(1987,6,11
)Tジェイコブ他により、BCGが組換えワクチンの構築のために宿主として使
用出来ることが提案された。言い換えれば、1個もしくはそれ以上の遺伝子を他
の病原から導入することにより(この場合結核に対して)現存するワクチンをと
り、その防護能力を高めることが提案された。
裸のDNAが細菌細胞に導入される方法である形質転換は、ミコバクテリア内で
首尾よく行われた。前記記載のシェイコブ他は、電気穿孔法によるミコバクテリ
アの形質転換につき記述している。電気穿孔法はプラスミドDNAのμg当り1
0’−10’個の形質転換細胞を得ることが出来、カナマイシンなどのような抗
生物質マーカー耐性の遺伝子を、そのプラスミドが運び、形質転換細胞゛に非形
質転換細胞から選択出来ることをスナツパ−他、「全米科学アカデミ−紀要」8
5巻、6987〜6991頁(1988,9)が示している。
ジエイコブ他(1987)およびスナツパ−他(1988)は、更に対象となる
遺伝子をミコバクテリアに導入するために、プラスミドやバクテリオファージな
どのようなりローニングビークルの使用について記述している。
クー他「全米科学アカデミ−紀要」88巻、3111−3115頁、(1991
,4)は、ミコバクテリア染色体への部位特異的組込みを行うために、ミコバク
テリオファージセインテグラーゼおよびファージ付着部位をコード化するDNA
を使用するベクターについても記述している。
ストーヴアー他([ネイチャーJ351巻、456−460頁(1991,6,
6))は、外部抗原を細胞形質的に組換えBCGに発現するために、ミコバクテ
リアH3P60および1(S P 70プロモーターを採用する組込み的染色体
外ベクターについて記述している。ストーヴアー他はこれらのベクターで外部抗
原を発現する組換えBCGが、外部抗原に対し体液性および細胞性免疫反応を発
生する免疫原として使用することができることを示した。
分子クローニングの標準道具(例えば制限酵素の使用等)とともに前記手法の組
合せは、対象となる遺伝子のベクターへのクローニングおよびその遺伝子のミコ
バクテリアへの導入を可能にする。
この発明の一局面に従って、細菌内にタンパク質あるいはポリペプチドもしくは
ペプチドを発現する発現ベクターが提供される。発現ベクターは少なくともりボ
タンバク質の分泌シグナルをコード化する第1DNA配列を含む。また望ましく
は、発現ベクターは、タンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドある
いはペプチドを発現する細菌に対し異種のタンパク質あるいはその断片、もしは
ポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第2DNA配列を含み、ここでそ
の細菌は、リポタンパク質あるいはりボタンバク質分節の融合タンパク質(分泌
シグナルを含むこともある)、およびタンパク質あるいはポリペプチドもしくは
ペプチドを発現する細菌に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペ
プチドあるいはペプチドを発現する。
そのような発現ベクターは、生ワクチンを含むワクチンに使用出来るいろいろな
細菌のいずれかに使用することが出来る。
特に一つの実施例において、細菌は必ずしもそれに限定されないがウシ型結核菌
−BCG、恥垢菌、トリ型結核菌、チモテ菌、腐生菌(ミコバクテリウムフォル
チュイッム)、ルフ菌。
仮性結核菌、ハバナ菌、スクロフラセウム菌、パテ−杆菌、メスウシ菌などのよ
うなミコバクテリアである。
一つの実施例において、ミコバクテリアBCGである。
この発明の範囲は何らかの理論的推論に限定されるべきではないが、リポタンパ
ク質のシグナル配列は、そのタンパク質がキメラリポタンパク質として細菌の表
面に発現されるように、発現された組換え融合タンパク質が変更されることを可
能にする。例えば融合タンパク質は、融合タンパク質の脂質アシル化を可能にす
るシグナル配列部分にあるシグナルベブチターゼ■の加工、あるいは認識部位を
含むことが出来る。このような融合タンパク質の脂質アシル化は、融合タンパク
質に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチ
ドの免疫原性を高めることが出来る。またシグナル配列は、細菌の表面で発現さ
れかつ固定され、かくして異種のタンパク質あるいはポリペプチドにより受け入
れやすくなり、それがタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドある
いはペプチドの免疫原性を増大することが出来る。更にその融合タンパク質は細
菌の表面で発現されるので、融合タンパク質のそのような発現あるいは分泌は、
細菌内で細胞形質的に発現されあるいは維持される場合に、致死的になり得る抗
原の発現を可能にする。異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプ
チドあるいはペプチドは、それ自身がこれから後に検耐されるライム病ボレリア
菌の0spA抗原などのりボタンバク質、あるいは例えばHI V抗原、破傷風
トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、お
よびマラリア抗原などのような非リポタンパク質である得ることも理解されねば
ならない。かくしてこの発明の発現ベクターは、細菌の表面に固定することの出
来る非リポタンパク質の成分の遺伝子工学も可能にする。
か(して、発現ベクターは、キメラ表面リポタンパク質として(もともと非リポ
タンパク質としてコードされる)異種遺伝子あるいは遺伝子分節の発現を可能と
する。これは外部遺伝子あるいは遺伝子分節を、それぞれリポタンパク質あるい
はりボタンバク質シグナルペプチドをコード化する遺伝子あるいは遺伝子分節に
コード化されるベクターに遺伝子融合することにより達成される。
一つの実施例において、第1 DNA配列は、少なくともミコバクテリアリポタ
ンパク質の分泌シグナルをコード化する。ミコバクテリアリポタンパク質は、一
つの実施例において、ヒト結核菌リポタンパク質である。ヒト結核菌リポタンパ
ク質は、ヒト結核菌19キロダルトン抗原およびヒト結核菌38キロダルトン抗
原よりなるグループより選択することが出来る。
少なくとも分泌シグナルが、第1 DNA配列によりコード化される他のりボタ
ンバク質は、必ずしもそれに限定されないが、大腸菌のリポタンパク質、S、n
+arcescens、 E、asylosora。
M、 morgani jおよびI’、m1rabilis、大腸菌およびサル
モネラ菌のTraTタンパク質、tl、 ljcheniformisおよびB
、ccrcusおよび黄色ブドウ球菌ベニシリナーゼ(PenP)タンパク質、
肺炎桿菌およびアエロゲネスクレブシエラ菌のプルラナーゼタンパク質;大腸菌
リポタンパク質tpp 28.Pa1、RplA、RplB、OsmB、N1p
Bi5よびOrl 17 ; V、harseyiのキトビオースタンパク質、
Pseudoegonassolanacearu−のβ−1,4−エンドグル
カナーゼタンパク質、インフルエンザ菌のPalおよびPcpタンパク質、緑膿
菌のOpr Iタンパク質、肺炎連鎖球菌のMalXおよびAm1Aタンパク質
、梅毒トレポネーマの34キロダルトン拡原およびTpmAタンパク質、ブタ関
節炎菌のP37タンパク質、および斑点熱リケツチアの17キロダルトン抗原で
ある。しかし、この発明の範囲は特定のりボタンバク質のいずれかの分泌シグナ
ルあるいはりボタンバク質に限定されるものではないことも理解されねばならな
い。
一つの実施例において、第1 DNA配列は更にリボタンノ\り質のすべて、あ
るいはその一部をコード化するDNAを含むことが出来る。かくしてそのような
実施例において、細菌により発現される融合タンパク質は、リポタンパク質の分
泌ジグづ一ル、リボクンバク質のすべであるいはその一部および異)重タンパク
質あるいはポリペプチドもしくはペプチドの融合タンノ(り質である。
第1および第2DNA配列は、適切なプロモーターの制御の下にある。一つの実
施例において、これらの抗原の一つの分泌シグナルをコード化するI) N A
が使用される場合には、このプロモーターはヒト結核菌の19キロダルトン抗原
プロモーターあるいは38キロダルトンに抗原プロモーターであり得る。代替的
には、このプロモーターは、ヒト結核菌の19キロダルトンおよび38キロダル
トン以外のミコノ〈クチリアプロモーター、あるいはミコバクテリオファージプ
ロモーターであることが出来る。
使用されるミコバクテリアおよびミコノくクチ1ノオフアージプロモーターは必
ずしもそれに限定されなし1カベ、BCGHS P 60および)lsP70プ
ロモーターなどのミコノ\クテノリアプロモーター、ヒト結核菌およびBCGか
らのミフノ(クチンプロモーター、ミコバクテリア14キロダJレトンおよび1
2キロダルトン抗原プロモーター、ヒト結核菌あるしA4まBCG力)らのミコ
バクテリアα−抗原プロモーター、 M +3 P −70プロモーター、ヒト
結果菌あるいはBCGからのミコバクテリア45キロダルトン抗原プロモーター
、スーパーオキサイドジスムターゼ・プロモーター、ミコバクテリアasdプロ
モーターおよびBxbl、Bxb2.Bxb3,1..1.L5.D29および
TM4プロモーターなどのミコバクテリオファージプロモーターである。一つの
実施例において、プロモーターは1(S P 60あるいは+1 S P 70
などのようなミコバクテリア熱ショックタンパク質プロモーターである。
前記記載のミコバクテリアプロモーターおよびミコバクテリオファージプロモー
ターを含む発現ベクターの例は、1991年1月16日受理された出願番号64
2,017に詳細に記述されているが、これは現在放棄された出願番号552,
828を継承したものである。出願番号642,017の内容は、ここで9照文
献としてとり入れられている。
望ましい実施例において、m RN Aの翻訳の開始を準備する転写開始部位、
リボゾーム結合部位、および出発コドンはそれぞれミコバクテリア起点である。
mRNAの翻訳を停止し、従って異種タンパク質の合成を終結させる停止コドン
、および転写終結部位はミコバクテリア起点、あるいは他の細胞起点のものであ
り、もしくは本来合成されるものであり、あるいはその停止コドンおよび転写終
結部位は異種タンパク質あるいはポリペプチドをコード化するものであり得る。
望ましくは、ミコバクテリアプロモーターはBCGプロモーターであり、そのミ
コバクテリアはBCGである。
第2DNA配列によりコード化される異種タンパク質ある5sはポリペプチドは
、必ずしもそれに限定されないが、抗原、抗腫瘍剤、酵素、リンフ才力イン、薬
理剤、免疫強化剤、および診断情況において対象となるリポータ−分子である。
コード化される抗原は必ずしもそれに限定されないが、ライ菌抗原、ヒト結核菌
抗原、リケッチャ抗原、クラジミア抗原、コクシェラ菌抗原、げっ歯頚マラリア
病原虫スポロゾイトからのサーカムスボロゾイトタンパク質、などのマラリアス
ポロゾイトおよびメロシイトタンバク質ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイ
ド、クロストリジウム抗原、リュージュマニア抗原、サルモネラ抗原、大腸菌抗
原、リステリア菌抗原、ライム病ボレリア菌の0spAおよび0spB抗原を含
むボレリア菌抗原、フランジセラ菌抗原、エルシニア菌抗原、ミコバクテリウム
、アワリカヌム抗原、パテ−杆菌抗原、トリ型結核菌抗原、トレポネーマ抗原、
住血吸虫抗原、フィラリア抗原、百日咳抗原、ブドウ球菌抗原、ヘルペスウィル
ス抗原、インフルエンザおよびパラインフルエンザウィルス抗原、はしかウィル
ス抗原、ボルデテラ抗原、血友病抗原、肺炎連鎖球菌抗原のような化膿連鎖球菌
および肺炎球菌のMタンパク質を含む連鎖球菌抗原、流行性耳下腺炎ウィルス抗
原、肝炎ウィルス抗原、赤痢菌抗原、ナイセリア抗原、狂犬病抗原、ポリオライ
リス抗原。
リフトバレー熱抗原、デング熱ウィルス抗原、はしかウィルス抗原、ロタウィル
ス抗原、gag+ polおよびenvタンパク質を含むヒト免疫不全ウィルス
(HI V)抗原、呼吸系合胞体ウィルス(R3V)抗原、蛇毒抗原、ヒト腫瘍
抗原、およびコレラ菌抗原である。コードされる酵素は、それに限定されないが
、ステロイド酵素である。
一つの実施例において、第2DNA配列は、HIVタンパク質あるいはその断片
もしは誘導体により誘発される細胞障害性Tリンフォカイトにより認識されるエ
ピトープを含む少な(とも一つのタンパク質あるいはポリペプチドもしくはその
断片あるいはその誘導体をコード化する。少なくとも1個のDNAをコードする
ことが出来るHIVタンパク質あるいはポリペプチドは、必ずしもそれに限定さ
れないが、HIV−I−gp120、HIV−I−gp 41.HIV−1−g
p 160、HIV−I−pol、HIV−I−nef、HIV−1−tat、
HIV−1−rev、HIV−I−vif、HIV−1−vpr、HIV−1−
vpu、HIV−Igag、HIV−2−gp 120.+IIVA−2−gp
160.HIV−2−gp 41.HIV−2−gag、HIV−2−pol
。
HIV−2−nef、HIV−2−tat、HIV−2−rev、HIV−2−
vi f、HIV−2−vpr、HIV−2−vpu、およびHIV−2−vp
xである。
コードされる抗腫瘍剤は、必ずしもそれに限定されないが、インターフェロン−
a、インターフェロン−β、あるいはインターフェロンγ、および腫瘍壊死因子
、すなわちTNFである。コードされるリンフ才力インは、必ずしもそれに限定
されないが、インターロイキンlから8までである。
異種タンパク質あるいはポリペプチドあるいはリポータ−分子あるいは選択的マ
ーカーであり得ることも考えねばならない。
コードされるリポータ−分子は、必ずしもそれに限定されないが、ルシフェラー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびカテコール脱水素酵
素である。
コードされる他のペプチドあるいはタンパク質は、必ずしもそれに限定されない
が、ストレスタンパク質をコード化するものであり、それは自己免疫疾患(例え
ばリウマチ様動脈炎)において免疫反応を呼び出しあるいは免疫寛容を誘発する
ために投与することが出来る。
コードされる選択的マーカーは必ずしもそれに限定されないが、βガラクトシダ
ーゼマーカー、カナマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー
、ネオマシイン耐性マーカー、およびヒグロマイシンfil性マーカー、バクテ
リオファージ耐性マーカー、あるいはアミノ酸などのように栄養性成分の合成に
含まれる酵素をコードする遺伝子である。
一つの実施例に従って、ベクターは更にミコバクテリア複製起、屯を含む。
も一つの実施例に従って、ベクターはプラスミドであることが出来る。プラスミ
ドは非シャトルプラスミドであることが出来、あるいは大腸菌複製起点、バシラ
ス複製起点、ブドウ球菌複製起点、ストレプトミセス複製起点、あるいは連鎖球
菌複製起点などのような細菌複製起点を更に含むシャトルプラスミドであること
が出来る。一つの実施例において、シャトルプラスミドは大腸菌複製起点を含む
。
更にまたもう一つの実施例において、ベクターは多重クローニング部位を含むこ
とが出来、また、異種タンパク質をコードする第2DNA配列は多重クローニン
グ部位に挿入される。
も一つの実施例において、発現ベクターは例えばテンペレートシャトルプラスミ
ドあるいは細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドであることが出来る。これ
らの発現ベクターのそれぞれは、少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコ
ード化する第1 DNA配列およびタンパク質あるいはその断片、もしくはポリ
ペプチドあるいはペプチドを発現するミコバクテリアに異種のタンパク質あるい
はその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第2DNA
配列を、その中でDNA配列が発現されるミコバクテリアに安定して導入するた
めに使用することが出来る。細菌内のプラスミドおよびミコバクテリア内のファ
ージとして複製するシャトルプラスミドが採用される時には、少なくともりボタ
ンバク質の分泌シグナルをコード化する第1 DNA配列、およびタンパク質あ
るいはその断片、もしはくはポリペプチドあるいはペプチドを発現するミコバク
テリアに異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペ
プチドをコード化する第2DNA配列を含むプラスミドのミコバクテリア染色体
への組込みは、部位特異的組込みを通して生じる。DNA配列は染色体DNAの
一部として複製される。細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドが使用される
場合には、DNA配列はプラスミド内で染色体外に安定的に維持される。DNA
配列の発現は染色体外に(すなわちエピゾーム、遺伝子副体的に)生じる0例え
ばDNA配列はシャトルプラスミドにクローンされ、プラスミドは前記記載のよ
うなミコバクテリアに導入され、そこでプラスミドはエピゾーム的に複製する。
そのようなシャトルプラスミドおよび細菌ミコバクテリアシャトルプラスミドの
例は、1989年6月5日受理された出願番号361,944に詳細に記述され
ており、参考文献としてここに組み込まれている。
少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化する第1 DNA配列およ
び異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチド
をコード化する第2DNA配列、また異種タンパク質あるいはポリペプチドの発
現を制御するミコバクデリアプロモーターに加えて、−・っの実施例で発現ベク
ターは、ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するD
N A配列を更に含む、ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込み
をコード化するDNA配列が誘導されるバクテリオファージは、必ずしもそれに
限定されないが、L5.LL、Bxbl、およびTM4ミコバクテリオファージ
大腸閑のラムダファージ;コリネバクテリアの毒素ファージ;M線菌類およびノ
ルカルディアNnrcardiaファージ、ストレプトミセスのφCa+Ca−
ジ:サルモネラの1)22フアージである。望ましくは、DNA配列はミコバク
テリア染色体のミコバクチリオフ゛アージ組込みをコード化する。ミコバクテリ
ア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するDNA配列は、インテグ
ラーゼをコード化するI) N Aを含み、このインテグラーゼはベクターのミ
コバクテリア染色体への組込みを提供するタンパク質である。望ましくけ、ミコ
バクテリアのファージ組込みをコード化するDNA配列は、更にattP部位を
コード化するDNAを含む。
attP部位をコード化するDNAおよびインテグラーゼは、部位特異的組込み
として参照される組込み事象を提供する。attP部位を含有するDNAおよび
インテグラーゼ遺伝子は、ミコバクテリア染色体の対応するattB部位への組
込みを可能にする。
attP部位をコード化する的確なりNA配列は、異なったファージの間で変化
することが出来るし、また、attB部位をコード化する的確なりNA配列は、
異なったミコバクテリアの間で変化することができる。
ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するファージD
NA部分であるDNAの例は、1992年4月5日受理された出願番号869,
330に更に詳細に記述されており、これは現在放棄された1990年7月16
日受理された出願番号553,907を部分的に継承するものである。出願番号
869,330の内容は参考としてここに合体されている。
この発明のベクターは細菌、とりわけミコバクテリアを形質転換するために使用
されることが出来、そのミコバクテリアは、必ずしもそれに限定されないが、ウ
シ型結核菌BCG、恥垢菌、トリ型結核菌、ヂモテ菌、腐生菌、ルフ菌、仮性結
核菌、ハバナ菌、スクロフラセウム閑、パテ−杆菌、雌つシ菌なとであり、特に
、このようなベクターはBCGを形質転換するため使用することができる。形質
転換ミコバクテリアは、かくして異種タンパク質を発現し、それは前記記載の通
り拡原であることが出来、それは免疫反応つまり治療剤を導入する。かくして形
質転換ミコバクテリアはワクチン、およびもしくは治療剤などのような医薬品組
成物の一部として使用することが出来、その組成物は形質転換ミコバクテリアお
よび許容可能な医薬品キャリアを含む。許容可能な医薬品キャリアは、必ずしも
それに限定されないが、鉱油、ミョウバン、合成ポリマーなとである。ワクチン
および治療剤のための賦形剤は従来の技術で周知であり、適切な賦形剤の選択は
ここに含まれる教訓から当業台の範囲内にあるものと見做される。適切な賦形剤
の選択もまた、ワクチンあるいは治療剤が投与されるべき方法に依存している。
ワクチンあるいは治療剤は注射処方量の形態にすることが出来、筋肉、静脈、口
腔、皮肉、あるいは皮下の投与により投与することが出来る。
ミコバクテリアは有効量で投与される。一般にはミコバクテリアは、処方当り約
I×10″′から約lXl0”コロー二形成単位(CFtJ’ S)の量で投与
される。
ワクチンあるいは治療剤を投与する伯の手段はここでの教訓から当Meにとって
は当然明白なことである。従って、この発明の範囲は特定のデリバリ形態に制限
されるものではない。
前記記載のように、この発明の発現ベクターは、必ずしもそれに限定されないが
、ライム病の原因因子となるライム病ボレリア閑の表面タンパク質あるいは抗原
であるボレリア抗原をコード化するDNAを含む。かくしてこの発明の一局面に
従って、動物をライム病がら防護する一つの方法が提供され、これはライム病ボ
レリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドをコード化す
る少なくとも1個のDNA配列を含むDNAで形質転換されたミコバクテリアを
動物に投与することによりなる。ミコバクテリアは、動物をライム病から防護す
るのに有効な量で投与される。その量は前記記載の通りである。一つの実施例に
おいて、少なくとも1個のDNA配列は、ライム病ボレリア菌のタンパク質ある
いはその断片もしくは誘導体をコード化する。少な(とも1個のDNA配列でコ
ード化されるライム病ボレリア菌の表面タンパク質は、必ずしもそれに限定され
ないが、外部表面タンパク質Aおよび外部表面タンパク質Bを含み、以下でそれ
ぞれ0spAおよび0spBとして引用される。
形質転換ミコバクテリアは、前記記載のものを含む。一つの実施例において、ミ
コバクテリアはウシ型結核菌−BCGである。
望ましい実施例において、ライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク
質あるいはポリペプチドをコードする少なくとも1個のDNA配列は、ミコバク
テリア発現ベクターに含まれる。一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベ
クターは前記記載のもののように少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコ
ード化するDNA配列を含み、ここでこのミコバクテリアは(分泌シグナルを含
むことが出来る)リポタンパク質あるいはりボタンバク質分節、およびライム病
ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドのキメラ融
合タンパク質を発現する。このような発現ベクターは、ライム病ボレリア菌に対
する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドがミコバクテリアの表面で
発現され、それにより、タンパク質あるいはポリペプチドがより近づきやすくな
るようにさせる。
もう一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベクターは、ミコバクテリア排
出タンパク質の全体あるいは一部をコードするDNA、ならびに、ライム病ボレ
リア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドをコードするD
NAを含むことが出来ることも考慮されねばならない、ミコバクテリアは、ライ
ム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すミコバクテリア排出タンパク質あるいは
その部分およびタンパク質あるいはポリペプチドの融合タンパク質を発現する。
このような発現ベクターは、タンパク質あるいはポリペプチドがミコバクテリア
から排出されることを可能にする。コードされるミコバクテリア排出タンパク質
の例は、必ずしもそれに限定されないが、ウシ型結核菌およびBCGのα抗原で
ある。
ミコバクテリア発現ベクターは、一つの実施例において、前記記載のもののよう
なミコバクテリアプロモーターおよびミコバクテリオファージプロモーターより
なるグループから選択された1個のプロモーターを含むことが出来、およびもし
くは同じく記載されているバクテリオファージのミコバクテリア染色体への組込
みをコードするDNA配列を含むことが出来る。
もう一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベクターは、同じく的記記載さ
れている細菌複製起点を更に含む非シャトルプラスミドあるいはシャトルプラス
ミドなどのようなブラミドであることが出来る。
更に、ミコバクテリア発現ベクターは前記記載のテンペレートシャトルプラスミ
ドあるいは細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドであることもある。
形質転換ミコバクテリアは動物をライム病から防護する組成物の一部として使用
される。そのような組成物は、前記記載のもののような形質転換ミコバクテリア
、および許容可能な医薬品キャリアを含む。
この発明は下記の実施例に関連し更に精しく記述されるが、この発明の範囲はそ
れにより限定されるものではない。
実−」[−泗−」よ
プラスミドpAL5000は、腐生菌の複製起点を有し、ラビディ他rFEMS
Microbiol、 Lett、 J 30巻、221−225頁(198
5)および「遺伝子」71巻、315−321(1988)に記載されているが
、部分Sau 3A消化を受け、5キロベ一ス断片はゲル精製される。5キロベ
一ス断片は次いでBamHI消化plJ666 (大腸菌複製起点を有する大腸
菌ベクターでネオマイシン・カナマイシン耐性をも有し、キーザー他が「遺伝子
165巻、83−91頁(1988)に記述している)に結合されプラスミドp
YUB12を形成する。プラスミドpYUB l 2の形成の構成図。プラスミ
ドpYUB 12形成の構成図は図1に示される。pYUB12およびpIJ6
66は次いで恥垢菌およびBCGに形質転換された。pYtJB121f三質転
換のみにより得られたネオマイシン耐性形質転換細胞は、[)ΔL 5000が
恥垢菌およびBCGにあるp I 、J 666に自律複製を与えたことを確認
した。
スナツパ−他(+988.前記記載)によるショットガン突然変異誘発は、pA
L5000プラスミドの半分だけがBCGにプラスミド複製を行うのに必要であ
ることを示した。この分節は多分ロージ五他「遺伝子J71巻315−321頁
(1988)により確認された読取り枠ORF lおよび0RF2を実施したで
あろうし、またミコバクテリア複製起点を多分実施した。pYUB 12は、次
いで11 p a IおよびEcoRVで消化され、この領域を運ぶ2586塩
基対すなわち分節pAL5000は除去され、PvuTI消化pVUB8に結合
された。プラスミドpYUB8 (pB11322誘導体)は大腸菌レブリフン
およびKan” (aph)遺伝子を含む。
2586塩基対断片のPvulI消化pYUB8への結合は、図2に示されるよ
うにpYU853の形成を生じる。pYUB53の形質転換は、M、repと指
定されたEcoRV−Hp a I断片が、BCGに自律複製することが出来る
のを確認した。
プラスミドpYBU53は、次いで下記の制限部位を除去するためにAatl、
EcoRV、およびPstlで消化された。
AaしI 5703
Econl 5783
BamHI 5791
SalI 5797
Pstl 5803
Pstl 7252
Sail 7258
BamHI 7264
EcoRI 7273
C1al 7298
HindIII 7304.および
EcoRV 7460
断片末端はT4 DNAポリメラーゼで流され、ブラミスドpYUB 125形
成のため再結合されるが、その構築は図3で前もって操作で不活性化されていた
tet遺伝子の792塩基対は、完全Nar I消化、6407塩基対断片のゲ
ル精製および大腸菌株HB 101の結合、再循環、形質転換、およびKan”
形質転換細胞の選択により除去された。生じるプラスミドpMV 101の構築
は図4で構成図に示されており、除去される領域のマーキングを含むp、MVl
ol、およびこの後で示される突然変異のDNA配列は、図5で示される。
将来の操作を容易にするために、apH遺伝子内のHindIIIおよびC1a
I制限部位は、「遺伝子」77巻57−59頁(1989)に記載されている方
法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR1突然変異誘発により同時に突然変
異:^発された。aphiil伝子内で変化した塩基は各制限部位内でコドンの
第3の位置(ゆらぎ塩基)にあり、行われた塩基置換はコード化タンパク質のア
ミノ酸配列を変更しないように設計された。
プラスミドpMV t o tとCl aMut−Kan+Il i ndnM
ut;−KanプライマーおよびII i ndl”Mu L−Kan+Bam
−Kanプライマーの別々のpcn反応が94℃(1分)、50℃(1分)およ
び72℃(1分)で25サイクルで行われた。P CIプライマーは、下記の塩
基配列を有していた。
CIaMut−Kan
CTT GTA ’rGG GAA GCCC(:11indRMut−にan
GTG AGA ATG GCA AAA GAT TAT GCA TTT
CTT TCCAGtlindFIAut、−にan
GTCTGG AAA GAA ATG CAT AAT CTT TTG C
CA TTCTCA CCG GBaIl−にan
CGT AGA GGA TCCA(:A GGA CG生じたPCR製品はゲ
ル精製され、混合され、プライマーなしの単−pcn反応が94℃(1分)、7
2℃(1分)10サイクルで行われた。CIaMut−Kanプライマーおよび
Bam−Kanプライマーが追加され、pciが94℃(1分)、50℃(1分
)、および72℃(2分)20サイクルで再び行われた。生じたPCR製品(K
am、mut)はBam1−IIで消化され、ゲル精製された。プラスミドpM
V101はC1a!で消化され、付着末端はフレノウ+dc:TP+dGTPに
より充填された。フレノウは熱不活性化され、更にBamHIで消化された。5
232の塩基対断片はゲル精製され、断片Kan、mutで混合され結合された
。結合は大腸菌株HB 101に形質転換され、Kan”コロニーはC1alお
よびHi n d I I I /l′i化に対する酊1性のあるプラスミドに
ふるまい分けられた。このようなプラスミドはpMV 110と名付けられ、図
4で説明されている。
プラスミドpMV110は、プラスミドpMV110および1)MV112を作
り出すため別の構造に切除された。一つの構造において、pMV l l Oは
NarIおよびBa1lで消化され、末端は充填され、5296塩基対断片はp
MV 111を形成するために結合され再循工景された。もう一つの構築物にお
いて、pMVlloはNde Iおよび5plIで消化され、末端が充填され、
5763塩基対断片がpMV ] 12を形成するだめに結合され、M ?A
r=された。pMV 111およびpMV112積築の構成図は図6に示される
。これらの構築物は史に、ミコバクテリア複製に必要でないpAL5000から
誘導される余分の大腸菌ベクター配列を除去した。クローニングは大腸菌で行わ
れた。プラスミドpMV111およびpMV112は恥垢閑に複製する能力を検
定された。二つのプラスミドが恥垢菌に複製したので、各プラスミドの除去は組
合せられpMV I 13を構築した(図6)。
pMV I 13を構築するために、pMV l 1 +はI3amllTおよ
びEcoRIで消化され、1071塩基対断片が分離された。pMV112はB
am)IIおよびEcollIで消化され、3570塩基対断片が分離され、次
いでpMVlllから肖られた107目話基対断片に結合され、pMV l 1
3を形成した。これらの構築物は、かくして、ミコバクテリア内の自律複製に必
要なpAL5000の領域を1910塩基対以下である史にミコバクテリアレプ
リコンの操作を容易にするために、P CI”?突然変異誘発がpΔL5000
のORF 1として知られる読取り枠1こ位置1−るSal I、EcoRl、
およびBg111部位を除去するために前のように実施された。PCR突然変化
誘発は各制限部位内のゆらぎ塩基で実施され、塩基置換は、推定1−のコード化
o n x: tタンパク質のアミノ酸配列を変化させないように設計された。
制限部位はミコバクテリア内の検定の際に一時に一つずつ除去された。恥垢菌の
複製を変更しないで5ailおよびEcoRIを除去することが可能であった。
一つの構築において、p c n突然変化誘発は、Ec。
Mut−M、repおよびBam−M、repプライマーと共にpMVII3の
EcoRI 1071で実施され、Ecotll 1071部位を欠除するpM
v 117を形成した。 E c o M u t −M 、r e pプライ
マーは下記の配列を持TCCGTG CAA CGA GTG TCCにGG
AまたBam−M、repは下記の配列を有する。
CACCCG TCCTGT GGA T、cc TCT 八Cもう一つの構築
において、p c rtt然変異誘発はSalMut−M、repおよびBam
−M、repプライマーを用いて5ai1 1389部位で実施され、5alI
1389部位を欠除するpMV119を形成した。SalMut−M、rep
プライマーは下記の配列を有する。
TGG CGA C(:G GAG TTA GTCAGG CCT。
pMV I 17は次いでA p a I−IおよびBgl、IIで消化され、
また3360塩基材断片が分離された。pMV l 19はApaLIおよびB
gl、IIで消化され、また!281281塩基材断離され、pMV117から
分離された3360塩基材断片と結合してpMV123を形成した。pMv 1
17゜pMV119.およびpMV l 23プラスミドの構築の構成図は図7
で示される。13 g I I I部位の除去はしかしp c rt突突然変異
誘発クンノウ充填よって、ミコバクテリア内でのプラスミド複製を除去し、がく
してBgl I I部位がミコバクテリアプラスミド復製に必要な配列に近接し
ているかもしくはその範囲内にあることを示唆している。
6、M■200シリーズベクターの 築大腸菌およびミコバクテリアにあるプラ
スミド複製(E。
repおよびM、rep)および組換え体(Kan”)に必要なすべての成分の
操作を容易にするために、各成分のカセットは、将来のベクターに単純化された
アセンブリーとして、またユニーク制限部位および転写および翻訳ターミネータ
−を含有する多重クローニング部位(MC3)を含めるように構築された。カセ
ットは、すべての転写で無指向性であるプラスミドに指向性クローニングおよび
アセンブリーを可能にするよう構築aph (Kan” )遺伝子を含むDNA
カセットが、Kan” およびKan” プライマーを用いてpcnにより構築
された。Spe1部位がPCRプライマーKan” ’の5′末端に付加され、
下記の配列を持つPCRプライマーの形成が行われた。
CTCGACTAG TGA GGT CTG CCT CGT GAA G。
B a n HI + N h e 1部位がプライマーKanr″の5′末端
に加えられ、下記の配列を持っPCRプライマーの形成が行われた。
CAG AGG ATCCTT AGCTAG CCA CT GA(: GT
CGGG G。
pcnはpMV123の3375および4585塩基で実施され、BamHIお
よびNhe 1部位は3159塩基で付加され、またSpe1部位は4585塩
基で付加された。
BamHIおよびSp’eIでの消化、およびそれに続く精製でBamHIから
5pelまで進むaph遺伝子に向けて転写指向性を持っBamHIおよび5p
eI付着末端で結合される+ 228/2443Kan”カセットが生成された
。
E、re 、カセット
pUc l 9のCo1EIレプリコンを含有するDNAカセットが、E、re
p/SpeおよびE、rep/MluプライマーでPCRにより構築された。S
pe 1部位がPCIプライマーE、rep/Speの5゛末端に付加され、M
lu1部位はPCRプライマーE、rep/Mluの5′末端に付加された。生
じたプライマーは下記の配列を持っていた。
E、re 、 /S e
CCA CTA GTT CCA CTG AGCGTCAGA CCCE、r
e Mlu
GACAACGCG TTG CGCTCG GTCGTT CGG CTGP
CRはpuc 19(7)塩基713および1500で実施され、またM l
u 1部位は塩基713に付加され、Spe1部位は塩基1500に付加された
。M l u Iおよび5peIによる消化、および続く精製により、5peI
がらM l u Iまで続くRNA IおよびRNA II複製プライマーに向
けられる転写指向性を持っ5peIおよびM l u I付着末端で結合される
E、repカセットが生成された。
M、re カセット
ミコバクテリア内のプラスミド複製に必要な配列を含有するDNAカセットがM
、r6p/MluおよびM、rep/BamプライマーでpMV123のPCR
により構築された。
Mlu1部位がp c iプライマーM、rep/Mluの5′末端に付加され
た。I3am111部位はI) C11ブライマ−M/r e p / B a
mの5゛末端に付加された。生成するPCIプライマーは下記の塩基配列を有
していた。
M、re Mlu
CCA TACGCG TGA GCCCACCAG CTCCG性工り且■/
上」
CAに CCG TにCTGT GGA TCCTCT ACPCRはpMV
123の塩基134および2082で実施された。M l u 1部位が塩基2
082に付加された。
BamHIおよびM I LJ +での消化および続くゲル精製により、M l
u IからBamHIまで続<pAL5000 0RFlおよび0lIF2遺
伝子のための転写指向性を持つMluIおよびBamt(I付着末端により結合
される1935塩基対DNA力セントが生成した。
Kan” 、E、rep、およびM、repのPCRカセトが次いで等モル濃度
で混合され、連結され、次いでKan”形質転換細胞の選択のために大腸菌株H
B 101に形質転換された。コロニーは、Bam+II+Mlul+5pel
で消化の後すべての3個のカセットを保持するプラスミドの存在を確認するため
ふるい分けられ、plv’lV 200と指定された。追加の制限部位であるN
co Iは、pMV 200をNeo Iでの消化によってM、repカセット
から除去され、フレノウ充填され、連続および再循環された後、pMV201が
形成される結果となった。pMV123およびpUC19からのpMV200、
およびpMV200から(7)pMV201の形成ニツイての構成図は、図8で
示される。プラスミドpMV 200およびpMV201は恥垢菌およびBCG
に形質転換された。二つのプラスミドはKan”形質転換細胞を産出し、かくし
てミコバクテリアに複製できる能力のあることを示した。
合成多重クローニング配列(MC3)(図9)は、次いでミコバクテリア内での
外部遺伝子発現およびミコバクテリア染色体への組込みのための多様な分子クロ
ーニングおよび操作のために設計され合成された。図9で示される合成MC3は
、pMV201に対しユニークな16個の制限部位を含み、3個の読取り枠のそ
れぞれに翻訳停止コドンを運ぶ領域、および大腸菌rrnABリボゾームRNA
オペロンから誘導されるTI翻訳ターミネータ−を含む。
MCSカセットを挿入するために、pMV201がNarIおよびNhe Iで
消化され、生じた断片がゲル精製された。MC3はHinPIおよびNhe I
で消化され、生じた断片がゲル精製された。2個の断片はpMV 204を産出
するために次いで結合された。pMV 204の構築の構成図は図10で示され
る。
プラスミドpMV204は次いで更なる構築でM、repカセットの除去を容易
にするように操作された。pMV 204はMluIで消化され、M 1 u
I −N o t Iリンカ−は、pMV 206を発生ずるためにM、rep
およびE、repの間のMluI部位に挿入された。pMV204からのpMV
206の横築についての構成図は図11で示され、pMV206のDNA配列は
図12で示される。
7.8CG H3P60プロモーター ダのBCG 1lsP60遺伝子の公開
配列(ソール他、「感染および免疫」55巻、1466−1475頁(1987
゜6))および外界配列がPCRによりH3P60プロモ一ター断片の構築を可
能にした。251塩基対II S Pプロモーター断片(図13、およびストー
ヴアー他による公開(1991))は、追加Xba IおよびNhe I部位を
含むプライマーでのPCRにより増幅された。PCII H3P60断片は次い
でXba rおよびNhe Tで消化され、Xbal消化pMV206と結合さ
れてplIB26(図14)を形成する。
8.19キロダルトンヒト上)タ シグナル配ダをコード化するDNAおよびO
s Δ゛伝−ミコバクテリア、ベクターへの挿入
19キロダルトンヒト結核菌遺伝子の配列は、アシュブリッジ他「核酸研究j1
7巻、1249頁(1989)で与えられている。ヒト結核菌染色体DNAから
の19キロダルトン抗原遺伝子リボゾ一ム結合部位出発コドンおよびシグナル配
列は、ヌクレオチドブライマーでPCRにより増幅された。
PCRにより(1られた生成153塩基対断片は、追加Bglz15’)および
Bam1l I : Ecoll 1部位(3′)を含む。この断片は、プロモ
ーター配列の例外はあるが27番目のコドンに至るまでの19キロダルトン遺伝
子の全5′領域を含有する。PCR断片はBgl I TおよびE c o I
t Iで消化されp26195を形成するためにB a m I−11−E c
o It I消化pRB26に結合される(図161゜
0spA抗原をコードする遺伝子は、パーゲスローム他「分子微生物字、3巻、
4号、479−486頁(1989)に記載されている。N末端18コドン(分
泌シグナルをコード化するもの)のみを除いて、0spA遺伝子配列は、780
塩基対0spA断片を提供するために、追加I3amHI (5′)およびSa
l E (3’ )部位でPcRにより誘導された。
p26195はB a m I−(1および5ailで消化され、また780塩
基対PCR0spA断片は付着末端を生成するためのBam1lTおよび5ai
lで消化され、またp26+9::0spAを形成するためにBamflIj;
よび5ail消化26195に結合された(図17)。
夫−血一斑一1−
19キロダルトンヒト+核 几7、のシグナル配列コードイす蚕1旦jニノ上J
bロアD\Ae遣皇」」1宸−扉り乙6λl二Δ導筈
プラスミドpMV 206は実施例1で記載されるように横築された。19キロ
ダルl−ンヒト結核閑抗原遺伝子プロモーター、リボゾーム結合部位、出発コド
ン、および分泌シグナルはヌクレオチドブライマーでPCRにより増幅された。
p c n断片は追加XarおよびBamH1部位を含む。図18で示されるこ
の配列は286塩基材の長さであり、第27番目のコドンまでの19キロダルト
ン逍伝子の全公開5′領域を含む。
P CR新島は次いでXbalおよびBamt(Iで消化され1、) + 91
) Sをj(ε成するためにX b a IおよびL3amllIで消化され、
p I 91’ Sを形成するためにXba rおよび+3amllr消化p
M V 206に結合される。実施例1で記載されているように、780塩基対
Os p A P CRカセットはBamHIおよび5alIで消化され、p1
9Ps: :0spAを形成するためにB a m )(Iおよび5all消化
p19Psに結合される。
上N11および0s)AJR伝−を用いるミコバクテリア ベニ二夏」j
ヒ1〜結核菌38キロダルトン抗原の遺伝子配列は、アンダースン他「感染と免
疫j57巻、8号 2481−2488頁(1989,8)で与えられる。ヒト
結核菌染色体DNAより11られ45番目コドンまでの全5′配列を含む38キ
ロダルトン抗原プロモーター、リボゾーム結合部位、出発コドンおよび分泌ジグ
づルをコードするI) N A配列は、ヌクレオチドブライマーでPCRにより
増幅された。生じるPCR断片は追加X k)a rおよびBamllI部位を
含む。P Cn断片は297塩基対の長さで図20に示されるように、Xba
IおよびB a m HIで消化され、p 38 P Sを形成するためにXb
alおよび13amlll消化[)M V 206に結合された(図21)。
実施例1および2で示されるように、780塩基対OspΔI)C11カセツト
は、+3amllIおよびS a l Fで消化され、p38PS: :0sp
Aを形成するためにBamHIおよび5ail消化p38PSに結合された。
実−1ifjf舛−」−
B CG 115 P 60およびO3AI仁−にもとづluカセットでのミコ
バクテリア−ベクターの −策pMV206は実施例1で前記記載されるように
横築された。
BCG l−1sP60遺伝子の公開配列(トール他「感染と免疫」55巻 +
466−1475頁(1987,6)lおよび外界配列は、P C11によって
、発現制御配列(すなわちストーヴアー他(1991)で公開されたように)プ
ロモーター、リボゾーム結合部位、および翻訳開始配列)を運ぶカセットの構築
を可能にした。BCG tlsP61カセット(図22)は、B CG HS
P 60出発コドンに対する375塩基5′をまた、出発コドンに対する151
話基(5コドン)3′を含む。
PCRオリゴヌクレオチドプライマーが次いで合成された。下記の配列を有する
プライマーX b a −HS P 60、CAG ATCT^G A(:G
GTG 八CCACA ACG CGCCがカセットの3′末端のため合成され
た。このプライマーは、BCG菌株パスツール染色体1)NAからP CRによ
りカセットを増幅するために使用された。カセットの3゛末端でのBam111
部位の追加は、It S P 60遺伝子の最初の6個のコドンに対し、1個の
コドン(Asp)を追加する。
pMV 206およびpcnカセットH3P61はそれぞれXba IおよびB
am1−11で消化された。PC,+1カセツトは次いでpMV206のXba
IおよびBamHI部位の間に挿入され、更にプラスミドpMV261を形成
するために結合された。このプラスミドの構築は構成図で図23で示される。
前記記載の780塩基対0spA PCnカセットはDamHIおよび5all
で消化され、p261 : : 0spAをバa成するためにBamHIおよび
5ail消化pMV261に結合された。
支−1LIP+一旦一
ストーヴアー他(199+1で確認されたプロモーターおよび転写開始部位をコ
ードするDNAカセット、リボゾーム結合部位、およびBCG ll5P60遺
伝子の出発つトンはPCRによって構築された。このカセットは前記記載のBC
GH3P61カセットのそれと同じであるが、例外はこのカセットカ咄発コドン
に対する15塩基(5コドン)3′を含まないことである。長さ267塩基対で
図24に示されるこのカセットは、追加XbalおよびNco 1部位、更にN
co 1部位に含まれる出発つトンを含む。このカセットは、構築の後でXba
lおよびNcolで消化された。
このカセットはpMV251を形成するためXbaIおよびNeo I消化pM
V206に置かれた(図25)、(シグナル配列を含みパンゲスローム他(19
89)により公開された)全長0spA遺伝子は、次いでNcol−3alI制
限断片としてPCRにより誘導された。この断片は次いでNco Iおよび5a
ilで消化され、p251 : :0spAを形成するためにNco Iおよび
5alI消化pMV251に結合された。
丈−1L」引−ミニ
pRB26は実施例1で記載されたように構築された。38キロダルトン抗原遺
伝子リボゾ一ム結合部位、出発コドン、および分泌シグナル配列がヒト結核菌染
色体DNAから得られ、ヌクレオチドブライマーでPCRにより増幅された。得
られた断片は更に追加Bglll−BamHI EcoRI部位を含む。長さ2
10塩基対のpcn断片(図26)は、BgllIおよびEcoRIで消化され
、p2638Sを形成するためにBamHIおよびEcoRI消化pRB26に
結合される(図27)、p2638Sは次いでBamHIおよび5ailで消化
される。実施例1で記載される780塩基対0spAPCR断片はBamtll
および5allで消化され、p2638::0spAを形成するためにBamH
,Iおよび5ail消化p2638Sに結合される。
1−胤一奥一ユエ
この実施例はp3638 : :0spAの形成を記述する。
それはミコバクテリア染色体へのバタテリオファージ組込みをコードする配列、
38キロダルトンヒト結核菌抗原の分泌シグナルをコードするDNA、および0
spA遺伝子を含む。
pMV 206は、実施例1に前記記載された通り構築された。
ミコバクテリオファージL5 attP部位、およびL5インテグラーゼ追伝子
を含むプラスミドpMl+9.1よ、BCG発現ベクターにL5組込み配列を提
供するものとして用いられた。pM119.4の構築およびその恥垢菌および1
3CGへの組込みは、下記のセクション(i)から(vi)に記述される。
(i)K の1・ 一部位attB、aしtL、およびattRΔ」凡人N皿9
亘鷲
標準の技術を利用して、ラムダEMBL3ライブラリーカイmc261(恥垢菌
の一つの菌株であり、ミコノ〈クチ+7オフアージL5のゲノムがそのなかに組
込まれた恥垢菌染色体を含む菌株)から準備された染色体DNAを用いて溝築さ
れ。
BamHlで消化された。ファージL5は、ファージLL(スナツパ−(1fi
、1988)のそれと同じ制限部位を持つDNAを含有するが、ただしL5は4
2℃で複製出来るが、ファージLlはそのような成長が不能であることのみ異な
る。このライブラリーは、次いでattP配列を運ぶものとしてこれまでに確認
されてきたL5ゲノムかも分離された6、7キロベ一スDNA断片でプローブさ
れた(スナツパ−他、1988)。正のクローンの1個がプラーク精製され、D
NAが用意され、(ΔttL配列を含む)1.1キロペ一ス5all断片がベク
ターpUcL19配列にサブクローンされた。この断片のDNA配列は、ショッ
トガンアプローチおよびサンガー配列化を用いて決定された。attL接合部位
を分離配列化することにより、またこれを利用出来るL5のDNA配列と比較す
ることによって、2個の配列が整列するがそこに、特異な不連続が存在する領域
が決定された。この不連続はコア配列の一側面を表し、それはAttP、att
B、およびattLにおいて同一である。組換え交差点を含む領域は、図28で
示される。
attL DNA (1,1キロベ一ス5alI断片)が、ファージ組込みのな
い恥垢菌染色体を含も恥垢菌株BamHI消化mc’ 6 DNAのサザンプロ
ットに対し、ハイブリット化のためのプローブとして使用された(ジエイコブ他
。
1987、前記記l!2)。恥垢菌のattB配列に対応して、約6.4キロベ
ースの一つの帯が発見された。この同じattLプローブが、 (イエシーヴア
大学アルバート・アインシュタイン カレッジ オブ、メディスンのビル・ジェ
イコプ博大により提供された)mc26のコスミド、ライブラリーをふるい分け
るため利用され、数多くの正のコスミドクローンが確認された。DNAはこれら
のクローンから用意され、attLプローブに対しハイブリット化する(at、
tB部位を含有する)1.9キロベ一ス5ail断片が、配列化および詳細分析
のためにpUC119にサブクローンされた。コア配列を含有するDNA配列が
決定され、図28で示される。attP。
a t t; Bおよびat t、Lで同一であるコア配列は43塩基対の長さ
を持つ。
mc”61ラムダE M B I−3ライブラリーは、次いでattB部位を含
む1.9キロベ一ス5ail断片でプローブされた。正のプラークが確認され、
DNAが用意され制限分析およびサザンプロットにより分析された。ラムダクロ
ーンは推定上のa t、 t R部位を含む3.2キロベ一スBamHI断片を
含むことが確認された。3.2キロベ一スBamHI断片は精製され、配列化お
よび詳細分析のためにpuc l 19にクロー前記方法と同時に、L 5のD
NA配列のかなりの部分が決定され、いくつかの「コンティグfcont i
gs)JすなわちDNA配列島として表された。前記記載の6.7キロベースB
a m +−I I断片の配列は(a)L5DNAのコンティグにあるBam
HIの位置分析によって、また(b)L5の6.7キロベ一スBamt11断片
を運ぶプラスミドpJR−1(図33)のBamHI部位の周辺がらDNA配列
の短い範囲を決定することによって決定された。
DNA配列の一つの分節は、ファージL5の6.7キロベースB a m HI
断片を表して位置を占めていた。他のファージの研究は、インテグラーゼ遺伝子
がattP部位に近接してしばしば位置を占めていることを示している。かくし
て、L55インテグラーゼnt)遺伝子が、6.7ギロベ一スBamHI断片内
か、DNA配列のどちらかの側のいずれかに存在するものであるべきことが決定
された。その領域にあるDNA配列は、それを6個のすべての読み取り枠に翻訳
し、またこれらのアミノ酸配列をタンパク質に関連するインテグラーゼの系統群
で探し、DNA配列のコンピュータ支援分析を通じて分析された。図29で示さ
れたように、L5インテグラーゼおよび他のインテグラーゼの中でかなりよく保
存された2個の領域および領域2で完全に保存された3個のアミノ酸残基が示さ
れている(ヤジール他、rJ、Mo1.Biol、J 207巻、695−71
7頁(19891,およびボイヤートーサルメロン他rJ、EMBOJ 8巻、
2425−2433頁(1989)参照のこと)。一つの領域が確認され、対応
するDNA配列の分析は、約333個のアミノ酸を持つタンパク質をコード化す
ることが出来る読み取り枠を示した。これらの観察は推定上のint遺伝子を確
認した。
int遺伝子の位置は、6.7キロベースB a m )−I Iの範囲内には
なかった。しかし、それは遺伝子出発の上流100塩基対以下の(6,7キロベ
一スBamHI断片を定義する)B a m I−11部位の一つに近接してい
た。BamHI部位の分析はi n を遺伝子が6.7キロベ一スBam1lI
断片に近接して存在する1、9キロベースのBamt(I断片内に存在すること
を示した。この1.9キロベ一スBamHI断片は、pMHlを精製するために
L5DNAのBamHI消化からの断片の精製およびpuc l 19へのクロ
ーニングによりクローンされた(図34)。
前記アブローヂの組合せから、L5のattP−int領域の組織構成図が構築
され(図30)、at、t、P−int領域の遺伝子配列が図31で5えれる。
(i i)パμ涜■
ミコバクテリオファージ1..5の6.7キロベ一スBam1(I断片は、前記
記載の通りattP部位を含んでおり、pt、J C119のBamt11部位
にクローンされた(図32)。これはアガロースゲル電気泳動により分離された
L5DNAのBamHI消化から6.7キロベースB a m t−I I断片
を精製し、BamHI cut pUc]19と結合することで達成された。l
) N Aは候補組換え体から用意され、制限酵素分析およびゲル電気泳動によ
り特徴付けられた。組換え体ptJC119にクローンされたL5の6.7キロ
ベ一スBamHI断片を含むことで確認された。このプラスミドはp J R−
1と名付けられ、図33で示される。
L5を配列決定するためのプロジェクトから得られた1) N A配列データの
分析は、前記記載の6.7キロベースのBamHI断片に隣接する1、9キロベ
一スBamHI断片がインテグラーゼ遺伝子を含むことを示した。
pUc119のBam111部位にクローンされるインテグラーゼをコード化す
るI) N Aを含む1.9キロベ一スBamHI断片を含むプラスミドが構築
された。1,9キロベ一ス断片は[,5DNAの13amlll消化から精製さ
れp、Uc119のBamt(1部位にクローンされた。組換え体の構築は制限
分析およびゲル電気泳動により決定された。このプラスミドはpMHlと名付け
られ、その構造は図34で図式的に示される。
pJR−1は次いで、その間がB a m HI部位であるE c o 111
および5naBI (いずれもユニーククローニング部位)で消化によって脩飾
された。Bam81部位を含むEcon l−3nar31断片は切除され、こ
のプラスミドはp M I+ 2プラスミドを形成するためにtTf結合された
。pMf(2プラスミドはp J 11−1に含まれる2個のBamHI部位に
対比されるBamHT部位を含有する。pMH2の構築についての構成図は図3
5で示される。
1.9キロベ一スBamtlI断片は、インテグラーゼ遺伝子を含むが、それが
p M +−(1のBamt(I消化から精製され、BamHI消化p M H
2に結合された。組換え体は前記のように確認され、1.9キロベ一ス断片の配
向が決定された。
p M H4と名付けられたブラミスドはかくして構築され(図36)、ここで
5naB I部位(attP上流)からBamHI部位(インテグラーゼ遺伝子
の下流)に到るまでの領域がL5にあるものと同じであった。
pMH4はHindIII(ユニーク部位)で消化され、カナマイシン耐性を決
定する遺伝子を含む(ナイジェル・ギントレー・ラボラトリ−のキース・ダービ
ーシャーより提供された)pKD43かも精製された1キロベース)Iindl
ll断片に結合された。組換え体は確認され、前記の通り特徴付けられた。この
組替え体はpMH5と名付けられる。p M H5の構築についての構成図は図
37で示される。
(iv) M115の恥 のattBへの ”入みプラスミドpYUB12(ビ
ル・ジエイコブ博士よりの贈与されたものであり、その形成の構成図は図1で示
される)、pMDOl(図38)、およびp M H5は1000倍レンジ以上
のプラスミドDNAの4沖の異なった濃度で、プラスミド複製を支援出来る菌株
である恥垢菌株mc”155に電気穿孔された。セクション(iv)から(vi
)まで、恥垢菌あるいはBCGのすべての電気穿孔手順が下記のとおり実施され
た。
生体の培養はスナツパ−他(1988)に記載されているように、ミドルプルツ
ク7119培地で成長し、遠心分離で収穫され、冷却された10%クリセロール
で3回洗浄され、細胞の約100X11度で再懸濁された。
1μmのDNAが氷で冷却されたクヴエット内の100μmの細胞に加えられ、
バイオラット遺伝子パルサーでパルスが与えられ、1.25Kv、25LLFで
単一パルスが与えられた。
lulの肉汁が、抗生物質耐性マーカーの発現のために細胞に加えられ、1時間
37℃で保温された。細胞は次いで濃縮され、カナマイシン15ug/mlを含
むミドルプルツクあるいはトリプシン大豆培地でプレート培養された。コロニー
は3−5日間37℃で保温された後に観察された。
pYUB l 2.pMDo 1.およびpM)+5のそれぞれが、カナマイシ
ン耐性を有している。プラスミドpYUB 12はDNA複製起点を保持し、一
方pMDo 1はミコバクテリア複製起点を欠除している。プラスミドp M
H5はミコバクテリア複製起点を保持しないが、attP部位およびインテグラ
ーゼ遺伝子を含有するファージL5の2キロベース領域を保持している(図31
)。数多(の形質転換細胞がDNA濃度に従って線形であった。ブラミスドpY
UB12は、mc” 155内で数多くの形質転換細胞(DNAug当たり2x
to’)を与え、一方、pMH5は、DNAug当り6X10’個の形質転換細
胞を与えるがpMDOlは形質転換細胞を与えない。
前記の実験は、プラスミドpYUB 12.pMDo l 、およびpMH5を
プラスミド複製を支援しない恥垢菌mc” 6に電気穿孔させ繰返された。pY
UB 12あるいはpMDo 1からmc” 6内に形質転換細胞は得られなか
ったが、一方p M H5ハD N A Ll g当りmc”6内に約10’個
のカナマイシン耐性形質転換細胞を生じ、かくしてpMH5のmc” 6染色体
への組込みを示すものとなった。
6個の独立pMH5形質転換細胞(mc”155が4個、mc” 6が2個)か
らのDNAが用意された。これらのDNAは(mc2155自身、およびプラス
ミドpYtJB l 2を運ぶmc”155の双方からのDNAとともに)制限
酵素で消化され、前記記載の恥垢菌1.9キロベースattBプローブを用いて
サザンプロットおよびハイブリッド形成で分析された。図39で示されるように
、6個の形質転換細胞すべてがattB部位に組込まれ、異なった移動度を持つ
新しい2個のDNA断片が生産された。もしp M H5がattB部位に組込
まれなかったら、mc”155対照内にあるattB部位に対応して単−帯が得
られることが期待されたであろう。
(v) MII9.2および MB2.4のpLIC119はHindIIIで
消化され、またカナマイシン耐性遺伝子を含みpKD43で精製される1キロベ
ースH3ndlIIは、9MH8を形成するためにHindllI消化pUc1
19に結合された(図40)。2キロベ一ス5alI断片(塩基対3226−5
310)は5alI消化pMH5からのattPおよびインテグラーゼ遺伝子を
運ぶが、これは精製され、プラスミドpMH9,2およびpMH9,4を形成す
るために5alI消化p HM 8のベクター・バックボーンに関連して双方向
に挿入された(図41および図42)。
電気穿孔の結果として、プラスミドpYtJB 12.’pMH9,2あるいは
pMH9,4を運ぶ恥垢菌株mc”155細胞、もしくは前記記載の電気穿孔の
結果としてプラスミドpMH5を運ぶ株菌mc” 6は、カナマイシンと共に肉
汁内で飽和成長した。培養は次いでl:100に希釈されカナマイシンなしの肉
汁で飽和成長した。約20世代の細菌成長に対応し、更に2種のサイクルの希釈
と成長が行われた。培養は平板からとり出され非選択平板に単一コロニーにされ
、約100個のコロニーが非選択平板および選択平板両方の上にパッチ・プレー
トされた。カナマイシン感受性であり、従って、プラスミドを失った細胞の割合
に対応するコロニーの%が下記表1で与損耗%
pYUB l 2 (mc” 155) 35pMHB5 (mc” 6) l
7
pMHB9.2 (mc” 155) 3pMHB9.4 (mc” 155)
0(vi) MB2.4によ BCGの七 −前記記載の恥垢菌のattB部
位を含む1.9キロベ一ス5ail断片は、pLIC119にクローンされ、生
じたプラスミドはpMH−12と名付けられた(図43)。
(pMH−12から分離された)attBを含むゲル精製5alI 1.9キロ
ベ一ス恥垢菌断片が、BCGサブ菌株パスツールを含むBamHI消化ミコバク
テリアDNAのサザン転移をプローブするために使用され1図44で示される。
これは恥垢菌attBプローブに対し協力にハイブリット形成する1個のBCG
のBamHI断片および微弱にハイブリット形成する3個の断片があることを示
していた。もつとも強力なハイブリッド形成帯は最速移動帯(約1.9キロベー
ス)である。
前記の同一プローブが(ビル・ジエイコブ博士の提供による)BCGコスミドラ
イブラリーをプローブするのに用いられ、正のクローンが確認された。DNAは
いくつかの正のクローンから用意され、制限分析およびサザンブロツティングに
より分析された。(サザンブロッテインクにある最強のハイブリット形成帯に対
応する)1.9キロベ一スBamHI断片が確認され、コスミドDNAからゲル
精製され、pUc119にクローンされさた。生じたプラスミドはpMH−15
と名付けられた(図45)。
プラスミドpMH−5および9M89.4は、BCGパスツールに電気穿孔され
た。pMH9,4は高収率(DNAug当り約10’個の形質転換細胞)でBC
Gを形質転換し、一方pMH−5は低収率(DNAug当り1−10個の形質転
換細胞)でBCGを形質転換することが観察された。DNAはBCG形質転換細
胞から用意され、BamHI制限分析およびサザンプロット分析により分析され
、pMH−15からの1.9キロベ一スBamHI BCG attB断片ゲル
精製でプローブされた。これらのデータは図41で示されており、p M H5
およびpMH9,4双方の組込みはBCG attB部位(すなわちBCG内の
強力交差パイブリット形成断片)に特異的であることとを示している。これは形
質転換細胞から1.9キロベ一スBam1lI断片が損耗し、attLおよびa
ttR結合断片を表わす2個の新しい帯が出現することにより説明される。図4
6は1個のみのpMH5/BCG形質転換細胞を示しており、一方1分析された
4個のすべてが(最大のものである)帯のtHが期待されたものより小さく (
また、形質転換細胞のそれぞれが異なっており)、pMH−5の形質転換効率が
BCGでは低いものであることを示している。対照的に4個の9M89.4形質
転換細胞はお互いに同一であり(図46)、また予想されたサイズのattll
およびattL結合断片を生じる。
プラスミドpMV206はミコバクテリアレプリコンを除去するためにN Ot
、 Tで消化された。生じた22o9塩基対断片は、aph(Kan″)遺伝子
、大腸菌レプリコンおよび多重クローニング部位を含むが、それは結合されpM
V 205を形成するために再循環されるが、この構築は図11で構成図として
示される。
XbaT−Att/Inj、およびNhe I−Att/I ntプライマーで
のp c nは、次いでat、t、P部位および1,5インチクラーゼ遺伝子を
含有する$)M119.4から5alI断片上で行われた。生じたカセットは次
いでXba +およびNhe 1で消化され、1789塩基材断片はゲル精製さ
れた。pMV205は次いでNhe Iで消化され、生じた断片は9M89.4
から得られた1989塩基対断片に結合されpM■306を形成した。p、MV
306の構築についての構成図は図47で示される。
(実施例6からの)p2638 : : 0spAおよびpMV306はそれぞ
れXba IおよびS a l Iで消化された。
p2638 : : 0spAのXbal−3al I断片は、HS P60フ
ロモーター、38キロダルトン分泌シグナル配列、および0spA抗原配列を含
有するが、それはXbaIおよび5alI消化pMV306に結合され、p36
38 : :Osp八を形成した。
実施例8゜
p II B 26は実施例1で記述されたようにI#I築された。ヒト結核菌
あるいはBCGの32ギロダルトンα抗原遺伝子(松尾他、r、L Bact、
criol、 J 170巻、9号、3847−38154頁(1988,9)
、ボッレマンズ他、「感染および免疫157巻 10号、3+23−3130頁
(1989,10))がB CG染色体DNAより得られ、追加BgllI−B
amt(I:Ecotlr部位を含むプライマーを用いてPCHにより増幅さt
]た。長さ420塩基材のP CR断片(図48)は、r3gl I Iおよび
EcoRIで消化され、全α抗原遺伝子を含(1するp A B 261を形成
するために13aml11およびE c o It Iに結合された(図49)
。pA3261は次いでBamt(Iおよび5alIで消化され、実施例1に記
述された780塩基材P CII Os p AカセットもまたBam1(Iお
よびS a I Iで消化され、pAB261 : :0spAを形成するたぬ
にB a m t−i Iおよび5ail消化pAB261に結合されlこ。
実施例9ニ
プラスミドpMV 206は実施例1に記載の通りt#I築された。
B CG HS P 70遺伝子の5′領域の部分配列(これはB CG HS
P 70熱シヨツクタンパク質をコード化し、70キロダルトン抗原として知
られており、ロンドン、メディカルリサーチ力ウンシイルのラジュ・ラシクラ博
士より大手したもの)が、プロモーター配列を運ぶカセットの構築を可能にした
。HS P 70プロモーターはXbalおよびNhe I部位を含むプライマ
ーでPCRにより増幅された。長さ1.21塩基材のHS P 70プロモ一タ
ーPCI断片(図50)は、Xba IおよびNhe Iで消化され、pRB2
7を形成するためにXbaI消化pMV 206に結合された(図51)、BC
Gの32キロダルトンα抗原遺伝子は、実施例8に記述されるようにBCG染色
体DNAから得られ、追加I3 g l I I −BamHI : ECOR
I部位を含むプライマーを使用してPCRにより増幅された。PCR断片はBg
lllおよびE c o RIで消化され、全α抗原遺伝子を含むpAB271
を形成するために、Bamt(IおよびEcoRI消化p RB 27に結合さ
れた(図52)apΔB 271は次いでBam111および5ulTで消化さ
れ、実施例1でここに記述された780塩基対PCR0spAカセツトもまたB
a m +(Iおよび5alIで消化され、pAM271 : : Os p
Aを形成するためにBamHTおよびSal消化pAB271に結合された。
丈−考し」町−1旦・
ベクターp19Ps: :0spA、p38PS: :0spA、pMV261
: :0spA、およびpMV251 : :0spAはBCGに形質転換さ
れた。形質転換BCG細胞は培養され、細胞は次いで培養から沈殿した。細胞は
次いで食塩加リン酸緩衝液(PBS)で懸濁され、細胞懸濁液は等密度に正常化
された。細胞は音波処理で破砕され、細胞外波は沈殿し、上澄み(細胞質ゾル富
化分画)は保全された。細胞外被はPBSで再懸濁され、IIはトリトンX−1
14を2%(容積/容積)まで加えることによって可溶化された。不溶材質(細
胞壁富化分画)は沈殿し、上澄み(膜富化分画)は除去された。トリトンX−1
14が細胞質ゾル富化分画に加えられた。トリトンX−114溶液を37℃で短
い間暖めた後、短い遠心分離を行うことで、水と洗浄剤の位相で達成された。こ
れら2個の位相は3回バック抽出され、代表的な試料にあるタンパク質はアセト
ンの添加により沈殿した。各培養上澄みの一部は、限外濾過装置(セントリコン
−30,アミコン社)により濃縮され、ニトロセルロースに形質移入され、抗0
spAモノクローン抗体(M a b ) H5332でウェスタンプロットさ
れた(ハウ他、「感染および免疫」54巻、1号、207−232頁(1986
,10)。フィルター拘束抗体は強化ケミルミネセンスシステム(アマージャム
社)を用いて視覚化された。図53で示されるように、レーンlは分子量標準(
レインボーマーカー、アマージャム社)である。レーン2は全細胞音波破砕分画
である。レーン3はトリトンX−114不溶性材質である。レーン4は水相膜分
画である。レーン5は洗浄剤相膿分画である。レーン6は、水相細胞ゾル分画で
ある。またレーン8は濃縮培養培地である。
図53から見ることが出来るように1発現ベクターp19PS::0spAおよ
びp38S : :から発現された組換え0spA融合タンパク質は、 gi分
画からのトリトンX−119相に主として偏在していることが見出され、かくし
て、これら組換え0spAタンパク質がミコバクテリア19キロダルトンおよび
38キロダルトン分泌シグナルに融合し、それはN末端システィンで、脂肪酸ア
シル化により分泌および翻訳後処理に向けられたことが示唆された。pMV25
1 : : 0spAにより未変性リポタンパク質シグナルペプチドで発現され
た0spAは洗浄剤可溶BCG膜分画に偏在することが見出された。もっとも追
加0spAはBCGm胞形質水性分画にも見出された。か(して、0spAシグ
ナルは、19キロダルトンおよび38キロダルトンシグナル配列であったように
は、BCG内では、効率的には処理されなかったことが示唆された。0spAが
リポタンパク質シグナルに融合しないpMV261 : :0spAにより発現
された組換え0spAは、水性細胞形質分画にのみ偏在していた。
−11,’
BCG細胞はpAB261 : :0spA、pAB271 : :0spA、
あるいはpMV261 : :0spAで形質転換され、培養された。BCG培
養上澄みの部分が培地の一成分であるウシ血清アルブミン(BSA)からアフィ
ーゲル・ブルー(バイオラット社)による吸着により除去された。培養から得た
BCG細胞ペレットがPBSで懸濁され音波破砕された。吸着あるいは未吸着上
澄みは(セントリコン30で)濃縮され、次いで溶解細胞として培養量ベースで
同じ相対濃度に希釈された。試料は5DS−PAGEとして使用され、続いて抗
0spA (Mad 85332)、抗Hsp70(MadIT−41,WHO
ミコバクテリア・モノクローナル抗体バンク)、あるいは抗Hsp60 (Ma
d IT−B、WHOミコバクテリア・モノクローナル抗体バンク)などで免疫
プロット法処理された。図54で示されるように、レーンM、W。
Std、は分子量標準であり、レーンWは全細胞ライゼートであり、レーンSは
培養上澄み(未吸着)であり、またレーンAは吸着上澄みである。図54で示さ
れるように、分泌シグナルなしで完全α抗体遺伝子に対する0spA遺伝子の融
合は、高水準の発現を生じたし、また生じた組換えα抗原0spA融合タンパク
質は培養培地にFIL出されることが発見された。上澄み内で細胞形質タンパク
質(tl s p 60およびHs p 70 )の検出可能な量が見出せない
ことは、細胞溶解が最小であり、また、組換えα抗原::0spA融合タンパク
質が特に分泌されることに目標をおき、自己溶解のために培養上澄みには単に見
出せない、ということも示していた。
実施 12゜
l3CG生体(パスツール菌株)は下記のベクターの1個で形質転換された。
pMV261 : :OspA
pMV251 : :0spA
P2619 : : 0spA
P19PS: :0spA
p38PS: :0spA
P3638: :0spA
pAB261 : :0spA
頁の対象として、pMV261/L2が生体の対象グループを形質転換するため
に使用された。pMV261/L2は(βガラクトシダーゼをコード化する)大
腸菌1 acZ遺伝子をBamHI消化pMV261に運ぶBam11!制限断
片をクローニングすることにより構築された。
形質転換BCGコロニーは、カナマイシン耐性に対する選択によって分離され、
詳細分析に対する液体培地培養に拡張された。培1m等量を表す組換えBCG試
料が5DS−PAGEにより処理され、ニトロセルロースに転移され、抗Osp
AM a b H5332でウェスタンプロットされた。採用された正の対象は
、ライム病ボレリア菌株B31の処理試料、および濃度500μg/m+、11
00u/m1.および20 u g/mlの0spA抗原の試料であった。フィ
ルター拘束抗原が強化ケミルミネセンスシステム(アマージャム社)で視覚化さ
れ、た。図55で示されるように、0spAは0spA遺伝子を含むベクターで
BCG形質転換されることにより発現された。更に図55は、p2619: :
08pA、p19Ps: :0spA、p38PS : : 0spA、あるい
はp3638 : :0spAでB CG形質転換されることにより、0spA
およびミコバクテリア分泌シグナルの融合タンパク質の発現を示した。
: 13゜
BCG生体はpMV261 : :0spAで形質転換され、形質転換生体は培
養された。5個のマウスがそれぞれの菌株を表わしている24個の異なったマウ
ス菌株が、腹腔内でpMV261 : :0spA (42%のポスト凍結力価
)によりBCG形質転換の1X10’cFUの単一処方量で免疫化された。マウ
スは16週間各4週間毎に放血された。ウェルの」二にコートされたライム病ボ
レリア菌全細胞およびB CGライゼートに関し、血清がエリザで分析された。
この反応はペルオキシダーゼ接合抗マウス免疫グロブリンおよび基質で展開した
。カラー展開は405nmでの吸収として読みとられた。正の血清は、上記予備
放血血清の平均値以上の3標準偏差で光学濃度(0,D)の値を有していた。1
7週間の後、マウスは、pMV261 : : 0spAで形質転換されたBC
GlxlO”CFUの腹腔内ブースター注射が行われた。
図56および57で示されるように、下記の菌株:AKR/J
B A L B / c B y J
B 10. BR/5gSn、J
D4 5w1ss Wehster
は一次免疫の後で免疫反応を示しました下記の菌種B 10 、 B R/ S
g S n JD4 5w1ss Webster
はライム病ボレリア菌に対し、著しく高い水準で反応した。
′33置14゜
pMV261 : :0spA、pAB261 : :0spA。
p19Ps: :Os[)AあるいはpMV251 二:0spA。
プラス弁組換えr3 CGパスツール生体のいずれかでバ5質転換したBCG生
体は、011記記載のベクターにある0spA遺伝子の発現が組換え0spAタ
ンパク質の輸出および脂質アシル化に帰着したかどうかを決定するために、細胞
分画およびトリトンX−114洗浄剤相分配分析を受けた(ボーティア他r、J
、 B11o、 Chcm、j 256巻、1604頁(+981)。
ラドルフ他 「感染および免疫」56巻、49o頁(+ 988))。
組換えBCG細胞はB CG r?=養から沈殿し、食塩加すン酸緩南液CPB
Sで懸濁され、細胞懸濁液は等密度に調節された。
細胞は音波処理で破砕され、膜はトリトンX−114の2%(容積/容積)での
追加で4℃で可消化された。不溶材質(細胞壁富化分画)は遠心分離され、−1
二澄みは洗浄剤用分配を受けた。トリトンX−114溶液を短く加熱(37℃)
した後、短い遠心分離により水および洗浄剤の位相の分離が行われた。この2f
4の位相は3回バック抽出され、代表的な材料にあるタンパク質はアセトンの追
加で沈殿した。各培養上澄みの一部は、■前濾過により濃縮された。5倍濃縮培
養等量を表わす試料は5DS−PAGEで処理され、ニトロセルロースに転移さ
れ抗0spA MAt) 115332でプロットされた(図58)。
弁組換え[3CGから(!)られるin似の分画は、未変性融合パートナ−(タ
ンパク質)の細胞イー7置を決定するために、B CGあるいはヒト結核菌+−
1s p 60タンパク質(TT13)、 α抗原(HYT27)、あるいはヒ
ト結株菌19キロダルトン抗原(HYT6)に特異的な適切なモノクローナル抗
体でブロンI・された。図58で示されるように、レーンWは全細胞音波処理分
画である。レーンIはトリトンX−114不溶解細胞壁富化分画である。レーン
Aは細胞ゾル富化水性分画である。レーンr)は洗浄開用(膜富化)分画であり
、またレーンMは5倍濃縮培養培地分画である。
図58で示されるように、pMV261 : :08pAによりコード化された
0spA遺伝子製品は水性細胞ゾル分画(レーンA)で過剰に見出され、ll5
P60の専用細胞形質位置と相関していた。pAB261 : :0spAおよ
び未変性α抗原により発現されるα抗原0spA遺伝子製品は、不溶解細胞壁富
化分画(レーンI)、水性細胞ゾル分画(レーンA)、および培養培地分画(レ
ーンM)に見出されたが、洗浄剤可溶リポタンパク質富可分画(レーンI))に
は仔在しなかった。α抗原が組換えB CG培養培地に存在することは、113
P 60が培養培地に見出されなかったので組換えB CG自己融解によるも
のではなかった。未変性B CGの抗原に比べて、pAB261 : :0sp
Aにより発現される融合タンパク質のかなり小さな分画が培地に分泌され、−万
人部分のものは細胞壁富化不溶解分画で見出された。これはα抗原に対する融合
が細胞壁に対し直接の外部抗原になり得ることを示した。0spAシグナルベブ
ヂドに対するヒ1−結核菌19キロダルトン抗原シグナルペプチドの置換は、殆
どオペで洗浄剤可溶分画に位置するキメラOs p Aタンパク質の発現を生じ
た。この発見は、ヒト結核菌19キロダル[−ン抗原シダジルベブヂドのOS
I) Aへの融合が直接の効果的な発現であり、0spAタンパク質のBCGの
膿への輸出シこなることを示した。この結果は、pMV251 : :QspA
で形質転換される生体により発現される製品と対照的である。ここでは大部分の
0spAが水性分画で見出され、これが未変性ボレリア菌シグナルペプチドの処
理にこれまで効果実施例14の組換えBCG生体は、組換え0spA遺伝子製品
が抗0spA抗体に対する組換えBCGの表面に接近できるかどうかを決めるた
めに、流動計算法(flow cyLoa+etry orflow cyto
photometryl で分析された。
アルブミン・デキストラーゼ錯体および0.05%トウイーン80で補足された
デュボス液体培地で成長した約2X10’組換えBCG生体で遠心分離で収穫さ
れた。ペレット化化された組換えBCG生体は、0.05%トウイーン80 (
PBS−T2O)を含イイする食塩加リン酸緩衝液(pl−17,4)の10m
1で洗浄され、2%のバラフォルムアルデヒドで10分間固定された。固定組換
えBCG生体はペレット化され、5mlのPBS−780で2回洗浄され、次い
で1mlのP [3S −1’ 80内でM懸濁された。0spA (BCG吸
着)に特異的な多クローン性ラビット血清が最終希釈が1:200になるように
固定組換えBCG細胞に加えられ、室温で30分間および氷上で30分間保温さ
れた。この懸濁液は次いで遠心分離され、0.5mlのPBS−T2Oで2回洗
浄され、1mlのPBS−780で再懸濁された。ヤギ抗うビットFITC接合
二次抗体が最終希釈1.50になるように加えられ、30分間水上で保温された
。組換えBCG二次抗体懸濁液は遠心分離でペレット化され1mlのI) B
S −T80で2回洗浄され、2mlのPBS−780で再懸濁された。標識組
換えBCGは塊状細胞を分散させるために軽く音波処理され、希釈液はFACS
スキャン(ベクトン・ディキンソン社)で流動血球計算法で分析された。指定さ
れたプラスミドを含有し、指定されたキメラ0spA遺伝子製品を発現する組換
えBCGは弁組換えBCGと比較される(図59)。
図59で示されるように、プラスミドp19Ps: :0spA、pMV251
: :QspA、およびpΔB261 : :0spAから0spAを発現す
る組換えBCG生体はすべて、プラスミドpMV261 : : 0spAから
0spAを発現する弁組換えBCGあるいは組換えBCGと比較した時に、表面
蛍光の増加を示していた。pMV251 : :0spAで形質転換される生体
からの0spAの発現により示される相対表面蛍光は、p19Ps: :0sp
Aで形質転換される生体で観察されたものより少なかったし、また、実施例14
での分画分析と合致した。pAB261 : :0spAから0spAを発現す
る組換えBCGもまた表面蛍光を提示し、かくしてトリトン不溶解分画(実施例
14)で見出されたα抗原0spA融合タンパク質は細胞壁に連合しており、不
溶解包含体から誘導されたものではなかったことも確認した。従って、ヒト結核
菌19キロダルトン抗原シグナル配列に対する融合によって模連合リポタンパク
質して、あるいはα抗原に対する融合によって分泌および細胞壁連合タンパク質
として、rJ CGの表面に0spAを輸出することが可能となった。
LJi例16゜
C3H/He、BΔLB/C1およびスイス、ウェブスターマウスは、pMV2
61 : :0spA、pMV251 : :0spA、p19Ps: :0s
pA、pAB261 : :0spA、で形質転換されたBCG、あるいは弁組
換えBCGパスツール010″コロニー形成ユニット(CF[J’s)で免疫化
された。マウスは同一が力量で16週間ブースターを与えられた。図60で示さ
れるように、pMV251 : :0spAあるいはp19Ps: :0spA
で形質転換されたBCGで免疫化される3個のマウス菌株すべてが、全ボレリア
生体あるいは精製0spAに対するエリザで測定されたように、−次元免疫化の
後4ないし8週間で強い0spA特異的特異反抗を示した。
とりわけめざましかったことは、低い反応体であるスイス。
ウェブスター菌株において、pMV251・:0spA、あるいはp19Ps:
:0spAのいずれかで形質転換されたBCG主体の単一処方量により誘発さ
れる抗0spA反応であった。pMV261・:0spAあるいはpAB261
: :0spAで形質転換されたBCGで免疫化されたマウスの同一菌株は、
ブースターの後でさえも抗0spA反応を示さなかつた。BALB/CおよびC
3H/Heマウスで1:10@、およびスイス、ウェブスター・マウスにおいて
1:10’を上まわる最高の高0spA抗体力価は、pMV251 : :0s
pAあるいはp19Ps: :0spAで形質転換したBCGでブースターをか
けることにより誘発され、これらの反応はpMv261 : :0spAあるい
はpAB261 : :Q3pAで形質転換されたBCGで誘発された反応より
も100倍から1000倍高かった。
17゜
実施例16の免疫化されたC3H/HeおよびBALB/Cマウスから得た免疫
血清が、2個の独立した実験でライム病ボレリア菌の非病原体B31ラボラトリ
ー菌株の成長を阻害する能力を分析された(サジエン他、rJ、 Infect
、 DiseasesJ (1992出版))。免疫血清のそれぞれについての
成長阻害力価は下記の表■で示される。
表I
前記結果は、pMV251 : +0spaあるいはp19Ps:・0spAで
形質転換されたBCGで免疫化されたマウスより得られた抗血清が、強い成長阻
害力価を示し、一方pMV261 : :0spAで形質転換されたBCGで免
疫化されたマウスより得られた血清が、低いあるいは検知不能の成長阻害力価で
あることを示した。
前記記載のBCG生体で免疫化したC 31−1 / HeおよびBALB/C
マウスは、ついで106ライム病ボレリア菌株Sh2生体で腹腔内(IP)に、
あるいは104生体で皮肉(II))12のいずれかで抗原投与された。ライム
病ボレリア菌生体は、106形質転換T3CG生体のブースター免疫の後5週間
投与された。マウスはライム病ボレリア菌抗原投与の14日で犠牲となり、プラ
ズマおよび膀胱組織はBSKII培地で培養された(シコワンタ、rJ、 Cl
1n、 Microbiol、 J 20巻。
155頁(1,984))。培養は14日間通じて位相差顕微鏡で、スピロヘー
タの存在をモニターされた。いずれか1個のプラズマあるいは組織培養の20@
のハイパワー分野当り1個もしくはそれ以上のスピロヘータが存在する時には、
感染として記録された。IPおよびID抗原投与で正の感染を示す抗原投与マウ
スの分画は下記の表IIで示される。
上記結果は、すべての対照マウスが感染し、一方、pM■251 : :0sp
Aあるいはp19Ps: :0spAで形質転換されたB CGで免疫化された
マウスは感染から保護されたことを示している。
しかし、この発明の範囲は前記記載の特異な実施例に限定されるものでないこと
は理解されねばならない。この発明は特に記載されたちの意外にも実施すること
ができ、しかも添付の請求の範囲内にあることが可能である。
141日amHI・
GCrAGCTCrATAfYχm’rc+シ該人’ITrCTATGQx論O
■Iπ−=F℃6AGC1に’A1 ′GrAQCCr、Q”、CCA O:バ
x;AC[7rAGAnCCCAGCAflλ”C^CGCCTA CTACC
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GITaA GCGACバχコ℃C↑y〕uユAOTバムTC人TC人GT人A
ctズ工「^]Xゴ℃^CiAπで 、 πXfT^TCCACTCAAcC′
rcC;AA Aciχλπテ^GンACCACACrpAAAACGAGAω
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鞭S撰嬉)λ郊ル升i蕨)K汁4必嶌愚°敲’C−14−FIG、5b
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110−°中°9−0゛ °°◆0000°°006◆°°0°0°°°。
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T■℃ロ℃σ■込αメαハ0χメαカQμα℃0:υ■℃晶σ■℃GLnt A
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P5tY5749 AUrTl 4g+9So−115310
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FIG、45
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、Be1l 4476
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pMV261 :’、05pA b
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フロントページの続き
//CC12N 1/21
C12R1:32)
I
Claims (22)
- 1.タンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドを最近に発現する一つの 発現ベクターであって、少なくともリボタンパク質の分泌シグナルをコード化す る第1DNA配列、および細菌に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくは ポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第2DNA配列よりなる発現ベク ターであり、ここでこの細菌はタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプ チドあるいはペプチドを発現し、前記細菌は、タンパク質あるいはポリペプチド もしくはペプチドを発現する細菌に異種のリボタンパク質あるいはリボタンパク 質分節および前記タンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいは ペプチドの融合タンパク質を発現する。
- 2.細菌がミコバクテリアである請求の範囲第1項記載の発現ベクター。
- 3.前記第1DNA配列が少なくともミコバクテリアリボタンパク質の分泌シグ ナルをコード化する請求の範囲第1項記載の発現ベクター。
- 4.前記ミコバクテリアリボタンパク質がヒト結核菌リボタンパク質である請求 の範囲第3項記載の発現ベクター。
- 5.前記ヒト結核菌リボタンパク質が19キロダルトンおよび38キロダルトン 抗原よりなるグループから選択される請求の範囲第4項記載の発現ベクター。
- 6.前記ベクターが更にミコバクテリア複製起点を含も請求の範囲第2項記載の 発現ベクター。
- 7.前記ベクターが更にミコバクテリア染色体へのミコバクテリオファージ組込 みをコード化するDNA配列を含む請求の範囲第2項記載の発現ベクター。
- 8.請求の範囲第1項記載のベクターであって、ここでタンパク質あるいはその 断片もしくはポリペプチドを発現する細菌に異種の前記タンパク質あるいはその 断片もしくはポリペプチドあるいはペプチドが肺炎連鎖球菌のPspA抗原ある いはその断片もしくは誘導体であるベクター。
- 9.請求の範囲第2項のベクターで形質転換される一つのミコバクテリア。
- 10..ミコバクテリアがBCGである請求の範囲第9項記載の形質転換ミコバ クテリア。
- 11.一つの医薬品組成物であって 請求の範囲第9項記載のミコバクテリア、および許容できる医薬品キャリア よりなる組成物。
- 12.前記ベクターがプラスミドである請求の範囲第1項記載の発現ベクター。
- 13.ベクターがシャトルプラスミドであり、更に細菌複製起点を含む請求の範 囲第12項記載のベクター。
- 14.ライム病から動物を防護する一つの方法であって、ライム病ポレリア菌に 対する抗体を誘発するタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくと も1個のDNA配列を含むDNAで形質転換されたミコバクテリアを動物に投与 し、前記ミコバクテリアは、動物をライム病から防護するのに有効な量で投与さ れることよりなる一つの方法。
- 15.前記少なくとも1護のDNA配列がライム病ポレリア菌あるいはその断片 もしくは誘導体の表面タンパク質をコード化する請求の範囲第14項記載の方法 。
- 16.前記ライム病ポレリア菌の表面タンパク質が外部表面タンパク質Aおよび 外部表面タンパク質Bよりなるグループから選択される請求の範囲第15項記載 の方法。
- 17.前記ミコバクテリアがウシ型結核菌−BCG種である請求の範囲第14項 記載の方法。
- 18.動物をライム病から防護する一つの組成物であって、タンパク質あるいは ポリペプチドをコード化する少なくとも一つのDNA配列を含み、ライム病ポレ リア菌に対し抗体を誘発するDNA配列を含むDNAで形質転換されたミコバク テリア、および 前記ミコバクテリアが動物をライム病から防護するための有効な量で存在する許 容可能な医薬品キャリアよりなる一つの組成物。
- 19.請求の範囲第18項記載の組成物であって、前記少なくとも1個のDNA 配列がライム病ポレリア菌の表面タンパク質あるいはその断片もしくは誘導体を コード化する組成物。
- 20.請求の範囲第19項記載の組成物であって、前記ライム病ポレリア菌の表 面タンパク質で外部表面タンパク質Aおよび外部表面タンパク質Bからなるグル ープより選択される組成物。
- 21.前記ミコバクテリアがウシ型結核菌−BCG種のものである請求の範囲第 18項記載の組成物。
- 22.少なくともリボタンパク質の分泌シグナルをコード化するDNA配列を含 む細菌にタンパク質あるいはポリペプチドを発現する一つの発現ベクター。
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