KR102282930B1 - Crm197 및 관련 단백질의 발현 및 정제 - Google Patents

Crm197 및 관련 단백질의 발현 및 정제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 세포, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 E. coli로부터 용해성의 CRM197 재조합 단백질을 고수율로 수득하기 위한 생산 방법에 관한 것이다. 세포는 바람직하게는 다이설파이드 리덕타제 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 포함하여, 다이설파이드 리덕타제의 활성이 저하된다. 또한, 본 발명은 CRM197의 정제 방법 뿐만 아니라 올바르게 폴딩된 CRM197 단백질의 규명 방법에 관한 것이다.

Description

CRM197 및 관련 단백질의 발현 및 정제 {EXPRESSION AND PURIFICATION OF CRM197 AND RELATED PROTEINS}
관련 출원에 대한 언급
본 출원은 동일한 발명 명칭의 2014년 1월 31일자 미국 가출원 번호 61/934,377에 대한 우선권을 주장하며, 그 출원의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
본 발명은 박테리아 숙주에서 재조합 단백질을 생산하는 기술 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 에스케리키아 콜라이로부터 용해성의 CRM197 재조합 단백질을 다량 수득하기 위한 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CRM197의 정제 및 특징 규명 방법과 본 방법에 의해 제조되는 CRM197의 용도에 관한 것이다.
디프테리아 독소 (DT)는 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae)의 병원성 균주로부터 합성 및 분비되는 단백질성 외독소이다. 이러한 병원성 균주는 독소 유전자를 운반하는 박테리오파지 용원 (bacteriophage lysogen)을 함유하고 있다. 디프테리아 독소는, 535개의 잔기로 된 전효소 (proenzyme)로서 분비되어 트립신-유사 프로테아제에 의해 처리됨으로써 2개의 단편 (A와 B)으로 분리되는, ADP-리보실화 효소 (ADP-ribosylating enzyme)이다. 단편 A는 기질로서 NAD를 이용하여, 니코틴아미드 고리와 N-리보스 간의 N-글리코시드 결합을 절단하는 과정을 촉매하며, ADP-리보스 (ADRT 활성)를 연장 인자 (elongation factor) EF-2의 변형된 히스티딘 715 (디프타미드)에 공유 결합시키는 과정을 매개한다. 이러한 번역 후 디프타미드 변형은 EF-2를 불활성화함으로써 단백질 합성을 정지시키고, 따라서 세포 사멸을 일으킨다. DT (C 도메인이라고도 함)의 A 단편은 촉매 활성 부위를 가지고 있으며, 독성화 (intoxication) 마지막 단계에 필요한 유일한 독소 단편이다. B 단편에 있는 R 도메인은 숙주 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 과정을 매개하며, 또한 B 단편에 존재하는 T 도메인은 단편 A를 pH 의존적인 방식으로 세포질로 수송하는 과정을 촉매한다. 아르기닌이 풍부한 이황화 연결된 루프가 단편 A와 단편 B (또는 도메인 C와 도메인 TR)를 연결하고 있다. 이러한 체인간 이황화 결합은, 186번 위치에서 단백질분해에 의해 체인이 절단된 이후에는, 이들 2개의 단편을 연결하는 유일한 공유 결합이다. 디프테리아 독소의 다양한 무독성 형태와 부분 독성의 면역학적으로 교차 반응하는 형태 (CRM 또는 교차 반응하는 물질들)의 분리로, CRM197 발견이 이루어졌다 (Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973; Giannini et al. Nucleic Acids Res. 1984 May 25;12(10):4063-9). 바람직하게는, CRM은 DT 전체를 또는 그 일부를 포함하는 임의의 크기 및 조성일 수 있다.
CRM197은, 하나의 아미노산 치환 G52E이 존재하는, 효소학적으로 고도로 비활성적이고 무독성인 형태의 디프테리아 독소이다. 이 돌연변이는 NAD-결합 부위 앞쪽에 위치한 활성-부위 루프에 고유한 유연성을 부여하므로써, NAD에 대한 CRM197의 결합성을 낮추고, DT의 독성을 없앤다 (Malito et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(14):5229-342012). CRM197은, DT와 마찬가지로, 이황화 결합을 2개 보유하고 있다. 이황화 결합 하나는 Cys186을 Cys201과 연결하여, 단편 A를 단편 B와 연결한다. 2번째 이황화 결합은 단편 B내에서 Cys461을 Cys471과 연결한다. DT와 CRM197은 단편 A에 기인한 뉴클레아제 활성을 가지고 있다 (Bruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2995-8, 1990).
다수의 항원들은, 단백질에 화학적으로 연결 ("접합")되지 않은 한, 특히 영유아에서, 면역원성이 낮아, 접합체 또는 접합 백신으로 제조된다. 이러한 접합 백신에서 단백질 성분을 "운반 단백질 (carrier protein)"이라고도 한다. CRM197은 단백질-탄수화물 접합 및 합텐-단백질 접합에서 운반 단백질로 흔히 사용된다. CRM197은, 운반 단백질로서, 디프테리아 톡소이드 뿐만 아니라 다른 톡소이드 단백질을 능가하는 여러 장점을 가지고 있는데, 그 대부분이 입증되어 있다 (Shinefield Vaccine, 28:4335, 2010, Broker et al, Biologicals, 39:195 2011). 예를 들어, CRM197은 유전자 수준에서 무독성화되었으므로, 접합에는 이용되지만 화학적 톡소이드화에 의해 블로킹 (blocking)되는 라이신들로 이루어진 큰 보체를 보유하고 있다. CRM197은, CRM197과 화학적으로 결합된 13종 이하의 캡슐 다당류로 구성된 백신 PREVNAR™ (Pfizer)의 성공을 통해 입증된 바와 같이, 스트렙토코커스 뉴모니애의 캡슐 다당류에 대한 효과적인 운반 단백질인 것으로 입증되었다. 또한, 파상풍 톡소이드와 비교해, 특히, 동일한 운반 단백질과 연결된 개별 다당류가 다수 존재하는 경우에, 운반체-유발성 면역 반응 억제가 거의 없음을 보여주는 증거도 있다.
CRM197과 천연 (native) DT는, HB-EGF 전구체인 pro-HB-EGF와 동일한 아미노산 서열을 가지는, 디프테리아 독소 수용체 (STR)에 대해 비슷한 친화성을 가지고 있다 (Mitamura et al., J. Biol. Chem. 272(43):27084-90, 1997). CRM197은 용해성 형태의 HB-EGF에 결합할 뿐만 아니라 막 결합 형태 즉 pro-HB-EGF에도 결합하므로, EGF 수용체에 HB-EGF가 결합하는 것을 방지함으로써 HB-EGF의 유사분열 작용을 저해한다. 즉, CRM197은 암 치료에도 향후 소정의 역할을 수행할 수 있을 것이다 (Miyamoto et al., Anticancer Res. Nov-Dec 27(6A):3713-21, 2007).
CRM197은 원 숙주인 코리네박테리움에서 만들어지지만, 생산량이 낮으며, 전형적으로 < 50mg/L이며, 또한 코리네박테리움은, 예를 들어 에스케리키아 콜라이와 비교해, 상대적으로 느리게 증식한다. CRM197을 고 수준으로 생산하도록 조작된 코리네박테리움 균주가 특허 등록되어 있다 (미국 특허 제 5,614,382). CRM197은 특허 등록된 슈도모나스 플루오레센스 (Psuedomonas fluorescens) 균주에서도 발현되었으며, 고 수준으로 발현된다. 에스케리키아 콜라이가 배양 및 증식이 저렴한 BL1 레벨의 유기체이기 때문에, 에스케리키아 콜라이에서의 CRM197의 생산이 유익할 것이다. 에스케리키아 콜라이에서 CRM197을 생산하는 방법은, 주로 불용성 봉입체를 만들어내므로 (일반적으로 불용성임), 이후 까다로운 리폴링 공정이 필요하게 되고, 수율이 낮거나 (EP20100742260) 또는 추가적인 펩타이드 서열 (테그)을 가지게 된다 (J Biotechnol.　2010 Dec 20;156(4):245-52, Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant　CRM197　in　Escherichia coli. Stefan A,　Conti M,　Rubboli D,　Ravagli L,　Presta E,　Hochkoeppler A.). 에스케리키아 콜라이에서 테그가 없는 용해성 CRM197을 과다발현하는 단백질을 대량 생산하는 적합한 방법은 보고된 바 없다. 따라서, 효율적이고, 비용 효과적인 방식으로 CRM197을 생산하는 개선된 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 현 전략과 관련된 문제점과 단점을 해소시키며, CRM을 생산하기 위한 새로운 조성물과 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는, 하나 이상의 시스트론이 CRM 단백질을 코딩하는 폴리시스트론형 유전자 서열 (polycistronic genetic sequence)과 기능적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 함유한 재조합 세포를 제공하는 단계; 이 발현 벡터를 유도하여 CRM 단백질을 생산하는 단계; 및 발현되는 CRM 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, CRM 단백질의 전체 또는 일부를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 세포는 활성이 저하된 다이설파이드 리덕타제 효소 하나 이상을 보유하며, 또한, 바람직하게는, 각각의 시스트론은 리보좀 결합 부위와 개시 코돈을 포함한다. 바람직하게는, 폴리시스트론형 유전자 서열은, 하나 이상의 리보좀 결합 부위와 하나 이상의 개시 코돈 사이에 하나 이상의 스페이서 (spacer)를 포함한다. 바람직하게는, 세포에 의해 발현되는 CRM 단백질은 용해성이며, 또한, 바람직하게는, 발현되는 CRM 단백질은 세포내 또는 페리플라즘 공간에 존재하거나 또는 분비된다. 바람직하게는, 재조합 세포를 약 15℃ - 약 32℃의 온도에서 증식시키며, 또한, 바람직하게는, CRM 단백질을 크로마토그래피에 의해 세포로부터 분리한다. 바람직한 크로마토그래피 매질로는, 예를 들어, 덱스트란 설페이트 수지, 겔 수지 (gel resin), 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지 등이 있다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 방법에 의해 분리된 CRM 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, 발현 벡터를 함유한 재조합 세포를 제공하는 단계; 상기 발현 벡터를 유도하여 CRM 단백질을 생산하는 단계; 및 발현되는 CRM 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, CRM 단백질의 전체 또는 일부, 바람직하게는 CRM197을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 재조합 세포는 비-변형된 재조합 세포와 비교해 세포질의 레독스 상태가 높은 산화성 상태 (oxidative state)로 시프트되도록 변형된 것이며, 상기 발현 벡터는 CRM 코딩 서열과 기능적으로 연결된 유도성 프로모터, 리포좀 결합 부위와 ATG 코돈 사이의 스페이서 서열, CRM 코딩 서열의 상류 발현 인핸서 영역을 포함한다. 재조합 세포는 진핵생물의 세포 또는 원핵생물의 세포일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 세포는, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포 또는 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 세포 (derivative) 또는 균주 (strain) 등의 원핵생물의 세포이다. 바람직하게는, 재조합 세포의 변형은, 예를 들어, 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 (thioredoxin) 및 티오레독신 리덕타제, 단백질 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 1종 이상 등의, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하는, 재조합 세포의 세포질의 레독스 상태를, 비-재조합 세포와 비교해, 산화성 상태로 시프트되게 한다. 바람직하게는, CRM 코딩 서열은 CRM 에피토프, CRM 펩타이드 서열, CRM 도메인 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 코딩한다. 바람직하게는, 스페이서는 뉴클레오티드를 9개 보다 많거나 또는 적게, 예를 들어, 뉴클레오티드를 5 - 20개 포함한다. 바람직하게는, 발현 인핸서는 ATG 코돈의 상류에 리보좀 결합 부위와 CRM 코딩 서열을 포함한다. 바람직하게는, 세포에 의해 발현되는 CRM 단백질은 용해성이며, 세포내 또는 페리플라즘에 위치하거나 또는 분비된다. 바람직하게는, 재조합 세포는 약 15℃ - 약 32℃의 온도에서 증식된다.
바람직하게는, CRM 단백질은, 바람직한 크로마토그래피 매질로서, 덱스트란 설페이트 수지, 활성 설페이트 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함하는 크로마토그래피에 의해, 세포로부터 분리된다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 방법에 의해 분리되는 CRM 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 분리된 CRM 단백질은 접합되며, 접합된 CRM 단백질은 백신으로서 제형화된다.
본 발명의 다른 구현예는, 리보좀 결합 부위 뒤에 위치한 CRM 코딩 서열과 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 함유한 재조합 세포를 제공하는 단계; 리보좀 결합 부위 뒤에 위치한 CRM 코딩 서열로부터 CRM 단백질을 발현하는 단계; 및 발현된 CRM 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, CRM 에피토프, CRM 펩타이드 서열, CRM 도메인 또는 이들의 조합 중 하나 이상, 바람직하게는 CRM197을 코딩하는 CRM 코딩 서열로부터 만들어지는 단백질 또는 펩타이드와 같은, CRM 단백질의 전체 또는 일부를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 세포는 원핵생물의 세포 또는 진핵생물의 세포이며, 바람직하게는, 원핵생물 세포는 에스케리키아 콜라이 세포 또는 에스케리키아 콜라이로부터 유래되는 세포 또는 균주이다. 바람직하게는, 프로모터는 구성적인 프로모터이거나 또는 유도성 프로모터이다. 바람직하게는, 재조합 세포는 세포질의 레독스 상태를 비-변형된 재조합 세포와 비교해 산화성이 높은 상태로 시트프되도록 변형된 것이다. 바람직하게는, 변형된 재조합 세포는 티올-다이설파이트 옥시도리덕타제 및/또는 티오레독신 및 글루타레독신 시스템에 관여하는 효소 (예, 티오레독신, 티오레독신 리덕타제, 글루타티온 리덕타제) 중 하나 이상의 활성이 저하된 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 리보좀 결합 부위에 의해 조절되며, 발현 인핸서 서열 (예, 서열번호 15) 또는 예를 들어 T7 테그 서열, CRM 코딩 서열의 상류 리보좀 결합 부위 등을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, CRM 단백질을 수지, 바람직하게는 덱스트란 설페이트 수지, 활성 설페이트 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지가 함유된 크로마토그래피 컬럼에 로딩 완충제와 함께 로딩하는 단계; 수지를 하나 이상의 세척 완충제로 세척하는 단계; 및 수지로부터 CRM 단백질을 용출 완충제로 용출시키는 단계를 포함하는, CRM 단백질의 분리 및/또는 정제 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 로딩 완충제와 세척 완충제는 동일 성분이거나 및/또는 동일 성분을 포함하며, 동일한 또는 비슷한 양이거나 및/또는 그러한 양으로 포함한다. 바람직하게는, 로딩 완충제와 하나 이상의 세척 완충제는, 전도성이 약 10 mS/cm 이하 (예로, 1 mS/cm, 2 mS/cm, 3 mS/cm, 4 mS/cm, 5 mS/cm, 6 mS/cm, 7 mS/cm, 8 mS/cm, 9 mS/cm)인, 전도성 (conductivity)이 낮은 완충제, 예를 들어, Tris-HCl, HEPES, 소듐 포스페이트 완충제 등이다. 바람직하게는, 용출 완충제는, 전도성이 약 10 mS/cm 이상 (예로, 12 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 20 mS/cm, 25 mS/cm, 30 mS/cm, 40 mS/cm, 50 mS/cm, 60 mS/cm, 70 mS/cm, 80 mS/cm, 90 mS/cm, 100 mS/cm 이상)인, 전도성이 높은 완충제, 예를 들어, NaCl 또는 KCl과 같은 염이 첨가된 완충제 등이다.
본 발명의 다른 구현예는, 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질을 HB-EGF와 접촉시키는 단계; HB-EGF에 대한 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질의 결합량을 측정하는 단계; 및 측정된 결합량을 통해 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질의 폴딩 (folding)을 확인하는 단계를 포함하며, 결합이 올바른 폴딩을 의미하는 것인, 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질의 폴딩을 규명하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 디프테리아 독소 또는 CRM은 수용체 결합 도메인을 포함한다. 바람직하게는, CRM 단백질은 CRM197을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질 및/또는 HB-EGF 중 하나 이상이 고상 지지체에 결합된다. 바람직하게는, 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질의 HB-EGF에 대한 결합량은 ELISA에 의해 측정되며, HB-EGF에 결합되는 CRM 단백질은 PBS에서 용해가능하다.
본 발명의 다른 구현예는, 프로모터와, 단백질을 코딩하는 2개 이상의 시스트론을 포함하는 발현 벡터를 포함하며, 여기서 하나 이상의 시스트론이 CRM 단백질을 코딩하며, 각각의 시스트론이 리보좀 결합 부위와 개시 코돈을 가진다. 바람직하게는, 발현 벡터는 리보좀 결합 부위와 개시 코돈 사이에 스페이서를 더 포함하며, 바람직하게는 스페이서는 뉴클레오티드를 5 - 20개 포함한다. 바람직하게는, 스페이서는 뉴클레오티드를 9개로는 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 구현예들과 이점들은 후술한 상세한 설명에 일부 기술되며, 부분적으로 이러한 설명으로부터 명확해지거나 또는 본 발명을 실시함으로써 학습할 수 있다.
도 1 벡터 구조체 crm7 (서열번호 10), crm7_2 (서열번호 11), crm 8 (서열번호 12), crm 9 (서열번호 13) 및 crm 12 (서열번호 14)의 개략도로서, 리보좀 결합 부위 (RBS)와 개시 코돈 (ATG)은 진하게 표시되어 있고, 스페이서는 밑줄 표시됨.
도 2 마우스 항-pn6B 혈청을 pn6B 2 ㎍/ml로 코팅된 이뮤노테크 플레이트 상에서 역가 적정한 결과.
도 3 pn14 코팅된 플레이트에서의 항-pn14 혈청의 역가 적정 결과.
용해성의 온전한 재조합 CRM은 프로테아제-결함성 E.coli에서 최초로 생산되었다 (Bishai et.al 1987). 그러나, 단백질의 생산량이 매우 낮다. 이후, CRM197은 E.coli 세포에서 봉입체로서 (Stefan A, et al. J Biotechnol. Dec 20;156(4):245-52, 2010; 국제 출원 공개번호 WO 2011/126811, 중국 특허 출원번호 200610042194) 또는 신호 펩타이드에 의해 페리플라즘으로 인가되는 수용성 단백질로서 (국제 출원 공개번호 WO 2011/042516) 발현되었다. E.coli의 페리플라즘은 이황화 결합의 형성이 가능한 산화성 환경이다. CRM197은 올바른 폴딩과 기능에, 그리고 단백질 용해성에도 아마 중요한 이황화 결합을 2개 포함하고 있다.
놀랍게도, 용해성의 CRM 재조합 단백질을 구성하는 단일한 비-절단된 체인을, 세포내에서 미생물로부터 공업적인 생산량으로 빠르게 생산할 수 있으며, 이를 대량으로 분리 및/또는 정제한 이후에도 용해성인 상태로 유지시킬 수 있다는 것을 알게 되었다. CRM은 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH 7.5)와 그외 유사 완충제에 용해가능하며, 이를 용해성인 상태로 유지하면서 이 완충제와 다른 완충제에서 5 mg/ml 이상으로 농축시킬 수 있다. 코리네박터에서 발현되는 CRM은 이들 완충제에서 농축가능하지만, 슈도모나스에서 페리플라즘으로 발현시켜 제조된 CRM은 이들 동일 완충제에서 쉽게 농축시킬 수 없다 (PFenex Inc., San Doego, CA). 페리플라즘 발현 대비 세포내 발현의 추가적인 이점은, 세포내 공간에 비해 페리플라즘 공간이 제한적이기 때문에, 더 높은 발현 수준이 달성된다는 것이다.
생산되는 바람직한 CRM 단백질은, 예를 들어, 펩타이드, 단일 또는 다중 도메인 또는 에피토프와 같은 전장 또는 일부 영역이며, 하나 이상의 결손, 치환 및/또는 부가 (예, 보존적인 또는 비-보존적인)에 의해 변형된 CRM 서열 및 숙주 유기체에서 발현을 촉진하는 추가 서열 (예, 하나 이상의 프로모터, 개시 코돈 및 번역 인자, 리보좀 또는 중합효소 결합 부위)을 가지도록 변형된 CRM 서열 등의, 천연적인 CRM 코딩 서열로부터 발현되는 임의의 특정 영역이다. 바람직한 CRM 단백질은 CRM197이다. 용해성이며, 세포의 불용성 봉입체로서 결합되지 않은 CRM 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다. CRM 단백질을 발현 및 생산하기 위한 바람직한 발현 시스템으로는 세포 내부가 산화성 상태인 미생물을 포함한다. 바람직한 발현 시스템은 재조합 또는 천연 진핵생물 또는 원핵생물 세포일 수 있는데, 재조합 세포로는 비-천연적인 CRM 코딩 서열을 함유한 세포를 포함한다. 바람직한 원핵생물 세포는, 한가지 이상의 유전자 변형 (예, 하나 이상의 결손 또는 돌연변이)을 가진 E. coli로부터 유래되는 세포 또는 그외 박테리아 균주이다. 바람직하게는, 하나 이상의 유전자 변형은, 예를 들어, 미국 특허 제 7,410,788 (이 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술된 바와 같이, 세포의 세포질내 레독스 상태를 야생형과 비교해 보다 산화성인 상태로 시프트되게 한다. 변형은, 바람직하게는, 세포질내 산화 상태를 감소시키는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 유전자 및/또는 기타 유전자의 활성을 떨어뜨린다. 바람직하게는, 활성 저하는 1종, 2종 또는 복수의 다이설파이드 리덕타제 또는 기타 유전자들의 비-발현 또는 발현 감소, 또는 하나 이상의 발현된 다이설파이드 리덕타제 단백질 또는 기타 단백질의 활성을 저하시키는 하나 이상의 돌연변이로 인한 것이다. 미생물 세포의 바람직한 균주 (예, 재조합, 조작되거나 또는 천연적인 진핵생물 또는 원핵생물 세포)는 다이설파이드 결합을 가진 천연적으로 폴딩된 단백질을 기능성 단백질로 유지된 상태로 생산하는 능력이 강화되어 있다. 본 발명의 방법은 전장, 절단형 (truncated) 또는 변형된 CRM 아미노산 서열을 포함하는 CRM 단백질을 다량으로 생산한다. 본 발명에 따라 생산되는 CRM 단백질의 양은, 예를 들어, 박테리아 세포 배양물 1 L 당 CRM 단백질 600 mg 이상과 같이, 놀라운 수준이다.
본 발명의 일 구현예는 CRM 단백질, 바람직하게는 CRM197을 다량 생산하는 방법에 관한 것이다. 생산량은 전형적으로 박테리아 세포 배양물 L에 대한 mg으로서 표시된다. 본 발명의 방법에 따른, CRM 단백질의 생산은, 200mg/L 이상, 300mg/L 이상, 400mg/L 이상, 500mg/L 이상, 600 mg/L 이상, 700 mg/L 이상, 800 mg/L 이상, 900 mg/L 이상, 1,000 mg/L 이상, 1,500mg/L 이상 또는 2,000mg/L 이상이다. 본 발명의 바람직한 양의 CRM197은 전장 및 절단형 CRM 단백질 뿐만 아니라 CRM 단백질의 변형된 아미노산 서열을 함유한 관련 단백질을 포함한다. 변형은 보존적인 아미노산 결손, 치환 및/또는 부가 중 하나 이상을 포함한다. 보존적인 변형은 분자의 기능적인 활성 및/또는 면역원성은 유지하되, 활성 및/또는 면역원성이 증가 또는 감소된 것이다. CRM의 보존적인 변형의 예로는, 비제한적으로, 아미노산 변형 (예로, 1개, 2개 및 그렇지 않을 경우 짧은 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환), 백신 제조시 접합을 위해 이용가능한 라이신 잔기의 39 α-아미노 기 (라이신의 1차 아민 기) 이외의 변형, DT의 혈청형 차이로 인한 변형, 면역원성을 높이거나 또는 접합 효율을 높이는 변형, 헤파린에 대한 결합성을 실질적으로 변형시키지 않는 변형, 적합한 폴딩 또는 3차 구조를 유지하는 변형, 및/또는 단백질의 면역원성 또는 DT에 대한 예방적 면역을 제공하는 단백질의 일부의 면역원성을 유의하게 변형시키지 않는 변형을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 재조합 세포는 바람직하게는 E. coli 박테리아이며, 바람직하게는, 예를 들어, 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제, 글루타메이트 시스테인 리아제 (lyase), 다이설파이드 리덕타제, 단백질 리덕타제 및/또는 글루타티온 리덕타제와 같은, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 유전자를 돌연변이화함으로써, 세포질의 레독스 상태를 산화성이 높은 상태로 시프트되도록 유전자 조작된 E. coli이다. 바람직하게는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 유전자는 돌연변이되며, 세포의 세포질의 레독스 상태는 야생형과 비교해 산화성이 높은 상태로 시프트되도록, 비-기능성 또는 약간의 기능성으로 바뀐다. 산화적인 단백질 폴딩은 이황화 결합의 형성과 이성질체화를 수반하며, CRM197 등의 다수 단백질의 안정성 및 용해성에 중요하게 작용한다. 이황화 결합의 형성과 파괴는 일반적으로 티올-다이설파이드 옥시도리덕타제에 의해 촉매된다. 이들 효소는 4가닥의 β-시트와 이를 둘러싼 3개의 α-나선으로 구성된 하나 이상의 Trx 폴드가 특징적이며, CXXC 레독스 활성-부위 모티프를 가지고 있다. 다양한 Trx 모듈들의 조립을 이용해, 원핵생물 및 진핵생물 유기체에서 발견되는 여러가지 티올 옥시도리덕타제를 만들어낸다. 박테리아 페리플라즘에서, 단백질은 커플 DsbB-DsbA 및 DsbD- DsbC/DsbE/DsbG의 조합 작용에 의해 적절한 산화 상태 중에 유지된다 (Inaba 2009, Gruber et al, 2006). 다수의 단백질 발현 시스템들이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 구입가능하다.
특히 바람직한 미생물로는 E. coli 발현 균주, 예를 들어, 세포질에서 이황화 결합된 단백질을 형성하도록 조작된 화학적인 컴피턴트 (chemically competent) E. coli K12 세포 (예, ORIGAMI™ (EMD Millipore) 및 SHUFFLE™ (New England Biolabs))가 있다. 세포의 다른 균주와 타입, 그리고 산화성 레독스 상태가 강화된 기타 E. coli 균주 역시 사용할 수 있다. 예를 들어, ORIGAMI™ 2 숙주 균주는, 티오레독신 리덕타제 (trxB)와 글루타티온 리덕타제 (gor) 유전자 둘다에 돌연변이가 있는, K-12 유도체로서, 이는 E. coli 세포질에서 이황화 결합 형성을 상당히 증가시킨다. 이들 균주는 카나마이신 민감성이며; 오리지날 Origami 균주와 마찬가지로, gor 돌연변이는 테트라사이클린에 의해 여전히 선별가능하다. 분자들 간에 이황화 결합이 형성될 가능성을 줄이기 위해, trxB와 gor에 돌연변이를 가진 균주는 적절한 폴딩을 위해 이황화 결합 형성이 필요한 단백질을 발현하기 위한 목적으로만 권고된다. SHUFFLE ™ 세포는 세포질에서 이황화 결합을 가진 단백질을 형성하도록 조작된 화학적인 컴피턴트 E. coli K12 세포이다. 바람직하게는, 이들 세포는 trxB와 gor, 그리고 세포질의 샤페론 이황화 결합 이소머라제 DsbC에 돌연변이를 가지고 있다 (fhuA2 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacI q ) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor (mcrC-mrr)114::IS10). 또한, 바람직하게는, 세포는 T7 프로모터에 의해 작동되는 단백질 발현에 적합하며, 유전자형 F' lac, pro, lacIQ / Δ(ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1 Δ(phoA)PvuII phoR ahpC* galE (또는 U) galK λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacI q ) ΔtrxB rpsL150(StrR) Δgor Δ(malF)3의 세포이다. SHUFFLE™ 균주는 이황화 결합 이소머라제 DsbC의 염색체 카피를 구성적으로 발현한다. DsbC는 미스-산화된 단백질 (mis-oxidized protein)을 올바른 형태로 보정하는 과정을 촉매한다. 세포질의 DsbC는 이황화 결합이 필요없는 단백질의 폴딩도 도울 수 있는 샤페론이다.
박테리아 배양물은, 바람직하게는, 발현된 단백질 (예, CRM 또는 CRM197)의 용해성이, 보다 높은 온도 (예, 37℃)에서의 용해성과 비교해, 우수한 온도에서 배양된다. 바람직한 배양 온도는 30℃ 이하이며, 바람직하게는 25℃ 이하, 바람직하게는 20℃ 이하, 바람직하게는 18℃ 이하, 바람직하게는 15℃ 내지 32℃이다.
본 발명의 다른 구현예는 CRM 생산용 벡터, 및 세포, 바람직하게는 원핵생물의 세포의 세포질에서 용해성인, CRM 단백질 전체 또는 일부, 바람직하게는 CRM197을 생산하는 방법에 관한 것이다. E.coli에서 CRM을 세포내로 발현시키고자 하는 이전 시도들은, CRM 서열만을 코딩하는 모노시스트론 mRNA에 기반한 것이었으며, 봉입체로 생산되었다. 세포의 세포질에서 용해성 CRM을 생산하는 방법은 CRM의 전사를 폴리시스트론 mRNA로 제공하는 발현 벡터를 이용해, 개발되었다. 폴리시스트론 mRNA는 메신저 RNA가 2종 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 지칭한다. 원핵생물 세포에서, 동일한 생화학적 또는 생리학적 경로에 관여하는 유전자들은 대개 오페론으로 그룹핑되어, 유전자들의 전사를 단일한 폴리시스트론 mRNA로 통제한다. 오페론의 유전자들 (시스트론들)은 리보좀 결합 부위 서열에 의해 통제되며, 이들은 여러개의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있거나 또는 중첩되는 서열이 있을 수 있으며, 예를 들어, 갈락토스 오페론에서와 같이 첫번째 유전자의 정지 코돈이 2번째 유전자의 개시 코돈의 하류에 존재한다. 오페론에서 유전자의 위치가는 번역 및 mRNA 안정성 효과를 통해 유전자 발현 수준에 현저하게 영향을 미친다는 것은 입증된 바 있다 (Smolke, C. D., and Keasling, J. D. (2002) Effect of gene location, mRNA secondary structures, and RNase sites on expression of two genes in an engineered operon. Biotechnol. Bioeng. 80, 762-76). 하류 유전자 발현 수준은 번역 커플링을 통한 상류 유전자 발현에 의해 강화되는 것으로 보인다 (Schumperli, D., McKenney, K., Sobieski, D. a, and Rosenberg, M. (1982) Translational coupling at an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. Cell 30, 865-71). 본 발명의 바람직한 일 구현예는 원핵생물의 프로모터와 하나가 CRM인 2종의 폴리펩타이드 코딩 시스트론을 포함하는 벡터이다. 각 시스트론은 리보좀 결합 부위와, 예를 들어 ATG와 같은 개시 코돈을 포함한다. 본 발명은, 추가적으로, CRM 단백질을 생산하기 위해 발현 벡터를 유도하는 단계 및 발현되는 CRM 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 바람직한 일 구현에에서, CRM 서열 앞에 위치한 제1 시스트론은 T7 테그 서열을 포함하되 CRM 시스트론과 중복되어, 제1 시스트론에 대한 정지 코돈이 CRM의 개시 코돈 하류에 위치한다 (예, 서열번호 15). 발현 인핸서는 서열번호 16 또는 서열번호 17로서 추가로 변형된다. CRM 코딩 서열 앞에 위치한 제1 시스트론은 "발현 인핸서 서열 (EES)"로 지칭된다. 발현 벡터는, (1) 리보좀 결합 부위와 발현 인핸서 서열이 뒤쪽에 위치한 프로모터와, (2) 리보좀 결합 부위, ATG 코돈 및 CRM 코딩 서열을 포함한다. 재조합 세포는 원핵생물 또는 진핵생물의 세포일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 세포는, 예를 들어, E. coli 세포 또는 E. coli 세포의 유래주 또는 계통주와 같은, 원핵생물의 세포이다. 바람직하게는, 재조합 세포 변형은, 예를 들어, 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제, 단백질 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 하나 이상 등의 다이설파이드 리덕타제 효소 하나 이상의 활성 저하를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하는 재조합 세포의 세포질의 레독스 상태를 비-재조합 세포와 비교해 산화성 상태로 만든다. 바람직하게는, CRM 코딩 서열은 하나 이상의 CRM 에피토프, CRM 펩타이드 서열, CRM 도메인 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 세포에 의해 발현되는 CRM 단백질은 용해성이며, 세포내 또는 페리플라즘에 위치하거나 또는 분비된다. 바람직하게는, 재조합 세포는 약 15℃ - 약 32℃의 온도에서 증식한다.
본 발명의 다른 구현예는, 예를 들어, 발현가능한 CRM 서열, 바람직하게는 CRM197 서열을 포함하는 박테리아, 포유류 또는 곤충 세포 등의, 재조합 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는, 비-제한적으로, 세포질의 레독스 상태가 산화성이 높은 상태로 시프트되도록 유전자 조작된 세포이다. 바람직한 세포는, 예를 들어, E. coli 세포 발현 시스템, 베큘로바이러스 발현 시스템 및 기타 박테리아 및/또는 진핵생물의 세포 발현 시스템과 같은, 원핵생물 또는 진핵생물의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 CRM 펩타이드와 같은 외래 또는 비-천연 서열을 발현하기 위한 단백질 발현 시스템을 포함한다. 또한, 발현 서열은, 폴리시스트론 mRNA로 전사되는 유도성 프로모터 (예, 자가-유도성 프로모터, 바람직하게는 특정 매질을 이용한 자가-유도성 프로모터), 개시 코돈 (예, ATG), 리보좀 결합 부위, 비-특이 폴리펩타이드 서열 및 CRM 코딩 서열을 하나 이상 포함하는 발현 벡터를 구성한다. 또한, 바람직하게는, 발현 벡터는 리보좀 결합 부위와 ATG 개시 코돈 사이에 또는 개시 코돈과 발현시킬 서열 사이에, 변형된 서열을 포함한다. 바람직한 변형된 서열 또는 스페이서 서열은, 예를 들어, 9개 보다 많거나 적은 (예, 7개 - 12개) 수개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 뉴클레오티드 9개를 제외한 갯수로 포함한다. 발현 시스템에 사용될 수 있는 스페이서 뉴클레오티드에 대한 구체적인 예로는, 비-제한적으로, GATATAC (서열번호 3), GATATACCA (서열번호 4) 및 GATATACCATAT (서열번호 5)를 포함한다. 이에, 본 발명의 다른 구현예는, CRM, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 구성되되 한정된 스페이서 서열이 부가되거나 또는 부가되지 않은, 발현 구축물을, 숙주 세포와 더불어 또는 숙주 세포 없이 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 재조합 CRM197 단백질, 및 유도성 프로모터 및/또는 리보좀 결합 부위와 ATG 개시 코돈 사이에 변형된 서열을 가진 발현 벡터를 이용한 E. coli 또는 기타 숙주 세포에서의 재조합 CRM의 발현 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 락토스/IPTG 유도성 프로모터, 바람직하게는 tac 프로모터, 및 리보좀 결합 부위와 ATG 개시 코돈 사이에 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 시스템은, 개시 코돈과 발현 서열 사이에, 9개 보다 많거나 적은 (예, 7개 - 12개) 복수의 뉴클레오티드, 바람직하게는 9개를 제외한 갯수의 뉴클레오티드로 구성된, 스페이서를 포함한다. 발현 시스템에 적용될 수 있는 스페이서 뉴클레오티드에 대한 구체적인 예로는, 비-제한적으로, 본원에 기술된 것을 포함한다. 놀랍게도, 뉴클레오티드 7개 또는 12개 길이의 스페이서를 사용하면, 뉴클레오티드 9개로 된 스페이서와 비교해 CRM197 발현 수준이 급격하게 증가하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 기술된 바와 같이 정의된 스페이서 서열이 부가되거나 또는 부가되지 않은, 인핸서 영역이 부가되거나 또는 부가되지 않되, CRM, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 된 발현 구축물을 포함한다. 인핸서 영역은 번역 커플링에 의해 하류 CRM 서열의 발현을 촉진하여, CRM의 올바른 폴딩 강화로 단백질은 용해성으로 만들어진다. 또한, 인핸서는 발현 증가를 위해 핵산 (예, 개시 코돈, 효소 결합 부위, 번역 또는 전자 인자 결합 부위) 인지를 촉진하는 하나 이상의 서열 부가에 의해 단백질의 발현을 촉진시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 인핸서는 상류 개시 코돈 및 CRM 단백질의 코딩 서열과는 다른 코딩 서열과 더불어, 리보좀 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, 본 발명의 방법에 따라 정제된, 재조합 CRM, 특히 CRM197에 관한 것이다. 정제는, 바람직하게는 헤파린 또는 헤파린-유사 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 놀랍게도, CRM197은 전형적인 헤파린 결합부의 서열-기반의 모티프 XBBXBX (서열번호 6)를 함유하는 것으로 확인되었는데, 여기서 B는 라이신 또는 아르기닌이고, X는 소수성 잔기이다 (Cardin AD, Weintraub HJ.,1989: Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions. Arteriosclerosis 9: 21-32). 이 모티프는 CRM197 수용체-결합 도메인에 위치하며, 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다: GRKIRMRCR (서열번호 7), 여기서 G (글리신), I (이소루신), M (메티오닌) 및 C (시스테인)은 소수성 잔기임. 헤파린 결합부위의 존재는 정제시 헤파린 또는 헤파린-유사 주기의 사용을 가능케한다. 헤파린-유사 수지로는 덱스트란 설페이트 등의 설페이트 관능기를 함유한 수지, 예를 들어 Dextran sulfate (Sterogene), Capto Devirs (GE), 또는 설페이트 에스테르 등의 설페이트를 관능기를 함유한 수지, 예를 들어, Cellufine Sulfate (Asahi Kasei Bioprocess)를 포함한다.
제1 단계로, E. coli 조 추출물을, 예를 들어, 바람직하게는, 원심분리 또는 심층 여과 (depth filtration)에 의해 청징 (clarifying)할 수 있다. 선택적으로, 청징된 라이세이트 (lysate)는 바람직하게는 단백질 용해성에 영향을 미치는 염을 첨가하고 CRM197을 염석함으로써, 추가적으로 분획화할 수 있다. 제2 단계에서, 청징된 라이세이트 또는 재-용해된 염석처리한 CRM197 함유 분획을, 예를 들어, CRM197이 통과 (flow through)하는 조건 하에 음이온 교환 수지에 적용할 수 있다. 제3 단계에서, CRM197이 함유된 통과 분획을 컬럼에 적용할 수 있다. 바람직한 컬럼 수지로는, 비-제한적으로, 덱스트란 설페이트 수지, CELLUFINE™ 수지 (Chisso Corporation; chromatography gel), 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함한다. 바람직하게는, 수지로의 CRM의 결합은 저염 완충제 중에서 수행되며, 고염 완충제에서 용출시켜, 고도로 정제된 CRM197을 수득한다. 바람직한 결합 완충제는, 예를 들어, 카오트로픽 시약 (chaotropic agent), NaCl, KCl, 글리세롤, 이소프로필 알코올, 에탄올, 아르기닌, 아세테이트, 구아니딘, 우레아, ATP, 한가지 이상의 모노-, 다이-, 트리 및/또는 폴리-포스페이트, 설페이트 또는 피로포스페이트, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 용출 완충제는, 예를 들어, 결합 완충제를 구성하는 하나 이상의 성분을 보다 고 농도로 포함한다.
다른 바람직한 정제 방법은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 Cibacron-Blue 수지 (CN 101265288A, 미국 특허 제 8,383,783) 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 정제 방법은 본원에 논의된 바와 같이 재조합 CRM 단백질 (예, CRM197)을 고수율로 생산하며, 그 순도는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 바람직하게는 그 보다 높다.
본 발명의 다른 구현예는, 수용체 결합 도메인 (서열번호 2 참조)을 함유한, 재조합 DT 및 CRM 단백질, 특히 CRM197의 특징 (예, 결합 활성)을 규명하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, DT의 수용체 결합 도메인의 천연 또는 변형된 서열을 포함하는 단백질의 결합 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 변형은, 바람직하게는, HB-EGF (헤파린 결합성 상피 성장 인자)에 대한 CRM의 결합력을 유지시킨다. 본 방법은 CRM197 조산물 및 정제된 CRM197 둘다에 적용가능하다. 결합 활성은 디프테리아 독소 수용체 HB-EGF (DTR)의 용해성 형태에 대한 결합성이다. 이러한 방법은, 바람직하게는, HB-EGF (DTR)의 DTR과의 결합을 측정하는 단계 및 적절하게 폴딩된 구조, 복합체, 결합 및/또는 결합부에 특이적인 분자 (예, 항체, 항체 단편, 항원)를 이용한 검출 단계, 바람직하게는 ELISA 포맷으로의 검출 단계를 포함한다. 결합을 측정 및 정량하기 위한 분석은, 올바르게 폴딩된 CRM197 만 수용체에 결합하기 때문에, CRM197이 바르게 폴딩되었는지를 신속하게 확인할 수 있다. 따라서, 본 방법은 개발, 생산 및 정제 공정시 제조된 CRM197 및 관련 단백질의 올바른 폴딩을 모니터링할 수 있다. 아울러, 이러한 규명 방법을 이용해, 백신 제조시와 같이, 다른 분자와 접합시킨 후, CRM 단백질을 동정 및 추적할 수 있다. 본 발명의 검출 방법을 이용해, 올바르게 폴딩되고 변환된 CRM 단백질을 환자에서 질환 및 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 백신으로 개발하는 경우 모니터링할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 예를 들어, 다당류 접합과 같이, 백신을 제조하기 위해 CRM 단백질을 접합시키는 방법을 포함한다. 또한, 단백질, 펩타이드, 올리고당 및 합텐의 접합이 포함된다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 CRM 단백질을 함유한 백신을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예는 다른 단백질 또는 다당류 등의 다른 분자와 유전자 수준에서 또는 화학적으로 융합된 본 발명의 CRM 단백질에 관한 것이다. 융합은 바람직하게는 분자들 간에 하나 이상의 공유 결합에 의해 이루어진다.
아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하지만, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1. RBS와 ATG 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드 7, 8, 9 또는 12개를 포함하는 발현 벡터로부터 CRM 197 발현 검출.
성숙형 CRM197을 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 폴리시스트론 형태로 클로닝하여, 다음과 같은 DNA 조절 및 코딩 단편의 서열을 제조하였다: tac 프로모터 - 리보좀 결합부 - ATG 코돈 - T7 tag - 리보좀 결합부 - ATG 코돈 - CRM 코딩 서열 - 종결 코돈. ORIGAMI 2, C41 등의 여러가지 E coli 균주를 발현 균주로 평가하였다 (도 1).
실시예 2. CRM 197 은 세포질에서 이황화 결합을 형성할 수 있는 Origami 2, E. coli 발현 균주에서 용해성으로 발현된다.
CRM197은 37℃에서 불용성으로 발현되었다. 발현 온도를 37℃ 미만으로 떨어뜨리면, ORIGAMI™ 2 세포와 SHUFFLE™ 세포에서 발현되는 단백질은 용해성이 증가하는 반면, 다른 시험 E. Coli 균주에서는 그렇지 않았다. CRM197은 18℃에서 ORIGAMI™ 2 세포에서 발현시켰을 때 대부분 용해성 형태이다.
실시예 3. CRM 197 발현에서 발현 인핸서 서열 (EES).
EES는 CRM-함유 벡터에서 CRM 서열의 전사를 촉진하며, 2종의 단백질, 즉 짧은 EES 펩타이드와 CRM 펩타이드로 번역되는 폴리시스트론 mRNA를 만든다. 천연 CRM 유전자의 코딩 서열을 대상으로 잠재적인 3D 구조 형성을 분석한 바, 복수의 잠재적인 헤어핀이 다수 포함되어 있어, 번역을 저해할 수 있는 것으로 확인되었다. 동일한 CRM 아미노산 서열을 번역하지만 헤어핀 구조가 없는 mRNA를 만들 수 있는, CRM 서열을 구축하였다. 이 유전자 서열을 최적화 CRM 서열이라 하며, 서열번호 8을 포함한다.
최적화 CRM 서열은, E. coli (예, BL21)와 산화성 세포질을 가지도록 조작된 E. coli (예, Shuffle) 둘다에서 잘 발현된다. 폴리시스트론 mRNA로부터 번역된 CRM 펩타이드는 전장 단백질을 형성하며, 천연 CRM 코딩 서열 보다 훨씬 안정적일 것으로 생각된다. 천연 CRM 서열과는 달리, 최적화 CRM 서열은 Shuffle 서열에서 전장으로서, 그리고 용해성 단백질로서 발현되었다. 또한, 천연 CRM과 비교해, 최적화 CRM의 높은 발현성은 세포 밀도가 낮은 경우에 관찰되며, 크로마토그래피 수지에 대한 결합성이 증가되어 CRM 단백질의 생산율이 더 높아졌다.
실시예 4. 세포 라이세이트로부터 CRM 197 의 암모늄 설페이트 침전.
CRM197을 발현하는 SHUFFLE™ 세포를 마이크로플루이다이저 (microfluidizer)를 사용해 세포 분해하고, 1M 염화나트륨을 세포 라이세이트에 첨가하였다. 여기에, 충분한 암모늄 설페이트를 1M에 가깝게 첨가한 다음, 20,000 xg에서 30분간 원심분리하였으며, 이로써, 미스-폴딩된 CRM197과 대부분의 박테리아 단백질을 제거하였다. 청징 후, 암모늄 설페이트의 농도를 2.2 M까지 증가시켰다. 주로 CRM197인 석출물을 수집하여, 저 전도성 완충제에 재-용해하였다.
실시예 5. 헤파린 컬럼에서의 CRM 197 정제.
암모늄 설페이트를 이용해 침전시킨 CRM197을 20mM Tris-HCl pH 8.0에 재-용해하여, 전도성 5 mS/cm로 만들고, 이를 헤파린 세파로즈 CL-6B 수지 (GE) 함유 컬럼에 주입하였다. 정제는 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 유속 5ml/min, 세척 완충제 A: 20mM Tris-HCl pH8. 용출은 완충제 B 0-100% 농도 구배를 이용해 수행하였으며, 완충제 B: 완충제 A + 1M NaCl / 20 CV였다. 용출된 CRM197을 환원 조건 및 비-환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 용출된 CRM197의 순도는 95% 보다 놓았다. DTT로 환원한 단백질은 단일한 폴리펩타이드로서 나타나, CRM197의 온전한 형태가 E. coli에서 발현되는 것으로 검증되었다.
실시예 6. Capto Devirs 컬럼에서 CRM 197 의 정제.
CRM197을 발현하는 SHUFFLETM 세포를 1xPBS, pH 7.4, 1% 소듐 피로포스페이트 중에서 마이크로플루이다제를 이용해 세포 분해시켰다. 라이세이트를 심층 여과를 이용해 청징하였다. 청징 처리된 라이세이트를 Q 세파로즈 XL (GE)이 충진된 컬럼에 주입하고, 통과 분획을 수집하였다. 부피와 전도성을 낮추기 위해, 통과 분획에 대해 10K 카세트 (Sartorius)를 이용한 접선 유동 여과를 수행하였다. Capto Devirs 수지를 25mM 소듐 포스페이트 완충제, pH8.0로 평형화하였다. CRM197은 다음과 같은 조건에서 컬럼에 부착시켰다: 전도성 10mS/cm 미만, 카오트로픽 시약 (예, 이 경우, 우레아)이 첨가된 결합 완충제, 세포 완충제: 25mM 소듐 포스페이트, pH8.0. 용출은 NaCl로 행하였다. 용출된 CRM197은 환원 조건과 비-환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 용출된 CRM197의 순도는 95% 보다 높았다. DTT로 환원시킨 단백질은 단일 폴리펩타이드로 나타나, CRM197이 정제 공정 중에 온전한 상태로 유지되는 것으로 확인되었다.
실시예 7. CRM 197 특징 규명을 위한 결합 분석.
재조합 용해성 디프테리아 독소 수용체 HB-EGF (DTR) (Sigma)를 ELISA 플레이트에 결합시켰다. 5% 건조 탈지유인 블록킹 용액을 사용해 고도로 백그라운드를 차단하였다. 1xPBS, pH7.4, 0.1% Twin 20에 희석한 재조합 CRM197을 37℃에서 1시간 동안 플레이트 위에서 인큐베이션하였다. HB-EGF에 결합된 CRM197은 토끼 다클론 항-CRM197 항체와 대두 퍼옥시다제가 접합된 염소 항-토끼 항체로 검출하였다 (Fina BioSolutions; Rockville, MD). 변성된 재조합 CRM197은 수용체에 결합하지 않았다.
실시예 8. E. coli 에서 생산된 CRM 197 은 코리네박테리움과 슈도모나스 유래 CRM과 유사하게 DTR에 결합한다.
ELISA 플레이트를 용해성 HB-EGF (헤파린-결합성 EGF-유사 성장인자)로 코팅하고, 5% 건조 탈지유로 차단하였다. CRM197은 수용체에 결합하였으며, 토끼 항-CRM197 다클론 항체와 SBP 접합된 염소 항-토끼 다클론으로 검출되었다. E. coli에서 발현되는 CRM197은, 코리네박테리움 및 슈도모나스에서 생산되는 CRM과 유사한 HB-EGF에 대한 친화성을 나타내었다.
실시예 9 CRM 197 은 운반 단백질이다.
CRM197을 본 발명의 방법 (실시예 1)에 따라 발현 및 정제하였으며, 폐렴구균성 캡슐 다당류 혈청형 14 및 6B에 CDAP 화학법을 이용해 화학적으로 연결(접합)시켰다 (Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents. U.S. Patent Nos. 5,651,971; 5,693,326 and 5,849,301). 접합체를 비-접합된 단백질 및 다당류로부터 정제하였다. BALB/c 암컷 마우스에 표 1의 스케줄에 따라 접합체를 피하 면역 접종하였다. 프로인트의 완전 보강제 중의 제형으로 마우스를 면역시키고, 프로인트의 불완전 보강제 중의 제형으로 2번 부스팅하고, 57일째에 채혈하였다.
혈청형 CFA* 중의 1차 부스트 IFA** 부스트 IFA** D57
6B 20 ug 10 ug 28일 10 ug 48일 채혈
14 20 ug 5 ug 21일 5 ug 48일 채혈
*60% 프로인트 완전 보강제; **60% 프로인트 불완전 보강제.
혈청을, 2 ㎍/ml Pn6B 또는 Pn14 (ATCC로부터 입수)로 코팅된 Brandtech Immunograde 플레이트에서 감마-특이 검출을 이용해 ELISA에 의해 반응성을 검사하였다. 도 2의 결과는, Pn6B와의 강력한 반응성을 보여준다. 마우스 5086을 하이브리도마 생산용으로 사용하였고, 제조되는 하이브리도 3종을 이용해 고도로 특이적인 마우스 항-6B 단일클론 항체를 제조하였다. Pn14 코팅 플레이트에 대한 혈청 역가 적정 결과는 도 3에 나타낸다. 이후, 마우스 1397을 P14 다당류와 반응하는 고도로 특이적인 마우스 단일클론 항체 4종을 생산하는데 사용하였다. 비-접합된 다당류는 유의한 ELISA 흡광성을 나타내지 않는다.
본 발명의 다른 구현예들과 용도는 본원에 개시된 본 발명의 상세한 설명과 실무를 통해 당해 기술 분야의 당업자에게 자명해질 것이다. 모든 간행물, 미국 및 기타 외국 특허와 특허 출원들 등의 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 구체적이고 전체적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 어떤 경우에도 용어 "포함하는"은 "구성하는" 및 "필수적으로 구성하는"이라는 용어를 포괄하는 것으로 의도된다. 또한, 포함하는, 비롯하여, 함유하는 등의 용어들은 제한하고자 하는 것이 아니다. 상세한 설명과 실시예들은 첨부된 청구항에 의해 지시되는 본 발명의 정확한 범위와 사상에 대한 오직 예로서만 간주된다.
서열
서열번호 1 CRM197
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFG DG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFE TR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLE EF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLF QV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRT GF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKT HI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLH VA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLS LF FEIKS
서열번호 2 CRM197의 도메인
SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRT GF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKT HI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLH VA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLS LF FEIKS
서열번호 3 GATATAC 스페이서
서열번호 4 GATATACCA 스페이서
서열번호 5 GATATACCATAT 스페이서
서열번호 6 XBBXBX 추정의 헤파린 결합부
서열번호 7 GRKIRMRCR 헤파린 결합부
서열번호 8 최적화 CRM 서열
ACAGGCCATTCCGCTGGTAGGCGAATTGGTGGATATCGGTTTCGCGGCTTACAATTTCGTTGAGTCGATCATTAACCTGTTTCAAGTCGTTCACAATAGCTATAACCGTCCGGCATACAGCCCGGGTCATAAGACGCAACCGTTTCTGCATGATGGCTATGCCGTGAGCTGGAACACGGTCGAGGATTCGATTATCCGTACCGGTTTTCAGGGTGAGAGCGGTCACGACATCAAAATCACCGCGGAGAACACGCCGCTGCCTATTGCGGGCGTCCTGCTGCCGACGATCCCGGGCAAACTGGACGTTAACAAGAGCAAGACCCATATCAGCGTCAACGGTCGTAAGATTCGCATGCGTTGTCGTGCAATCGACGGTGACGTGACGTTCTGCCGCCCAAAAAGCCCGGTGTACGTGGGTAACGGCGTGCACGCGAATCTGCATGTCGCGTTCCACCGCTCCTCAAGCGAGAAAATCCACAGCAATGAAATTAGCAGCGACAGCATTGGTGTGTTGGGCTACCAAAAGACCGTGGATCACACCAAGGTTAATAGCAAGCTGAGCCTGTTCTTTGAGATCAAAAGC
서열번호 9 최적화되지 않은 CRM 서열
ACAGGCGATCCCGCTGGTTGGTGAACTGGTTGACATTGGCTTCGCGGCCTACAACTTCGTTGAATCCATCATCAACCTGTTCCAGGTTGTGCACAACTCTTACAACCGTCCAGCTTACTCTCCGGGTCACAAAACCCAGCCGTTCCTGCACGACGGTTATGCGGTTTCTTGGAACACCGTTGAAGACAGCATCATCCGTACTGGTTTCCAGGGTGAATCTGGCCACGACATCAAAATCACTGCTGAAAACACCCCGCTGCCGATCGCAGGTGTTCTCCTGCCAACTATTCCGGGTAAACTGGACGTGAACAAATCCAAAACGCACATCTCCGTGAACGGTCGTAAAATCCGCATGCGTTGTCGTGCGATTGATGGTGACGTTACTTTCTGTCGTCCGAAATCTCCGGTCTACGTAGGTAACGGTGTACATGCTAACCTCCATGTAGCGTTCCACCGTTCTTCTTCCGAGAAAATCCACTCCAACGAGATCTCTAGCGACTCTATCGGTGTTCTGGGTTACCAGAAAACCGTTGACCACACCAAAGTGAACTCCAAACTCAGCCTGTTCTTCGAAATCAAATCT
서열번호 10 crm 7
GAGCTCTAAGAAGGAGATATACATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
서열번호 11 crm 7_2
GAGCTCTTAAGAAGGA GATATAC ATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
서열번호 12 crm 8
GAGCTCTAAGAAGGA GATATACA ATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
서열번호 13 crm 9
GAGCTCTAAGAAGGA GATATACAC ATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
서열번호 14 crm 12
GAGCTCTAAGAAGGA GATATACCATAT ATGGGTGCCGATGACGTGGTTGACTCT
서열번호 15
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCTAAGAAGGAGATATACC
서열번호 16
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTAAGGAGATATACC
서열번호 17
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGCGMAYCCATTCAGTGAAGAAGRAGSTTYATTT
SEQUENCE LISTING <110> FINA BIOSOLUTIONS, LLC <120> EXPRESSION AND PURIFICATION OF CRM197 AND RELATED PROTEINS <130> 8164.014.PCT <140> PCT/US2015/14130 <141> 2015-02-02 <150> 61/934,377 <151> 2014-01-31 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val 1 5 10 15 Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly 20 25 30 Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro 35 40 45 Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn 50 55 60 Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg 65 70 75 80 Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro 85 90 95 Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His 100 105 110 Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser 115 120 125 Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn 130 135 140 Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gatatac 7 <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 gatatacca 9 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 gatataccat at 12 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any hydropathic residue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any hydropathic residue <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any hydropathic residue <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg 1 5 <210> 8 <211> 1608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 atgggtgctg 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatggctag catgactggt 60 ggacagcaaa tgggtcggga tccgaattcg agctctaaga aggagatata cc 112 <210> 16 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatggctag catgactggt 60 aaggagatat acc 73 <210> 17 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatggctag catgactggt 60 gcgmayccat tcagtgaaga agragsttya ttt 93

Claims (58)

  1. CRM 단백질의 전체 또는 일부를 생산하는 방법으로서,
    CRM 코딩 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 함유한 재조합 세포를 제공하는 단계;
    상기 발현 벡터를 유도하여 CRM 단백질을 세포질에서 생산하는 단계; 및
    발현되는 CRM 단백질이 용해성인, 발현되는 CRM 단백질을 분리하는 단계를 포함하며,
    상기 재조합 세포는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소 (disulfide reductase enzyme)의 활성이 저하된 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 세포는, 비-변형된 재조합 세포와 비교해, 세포질의 레독스 상태가 높은 산화성 상태로 시프트되도록 변형된 것이며, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성인 저하된 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    발현된 용해성 CRM 단백질이 천연적으로 폴딩된 단백질을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로모터가 유도성 프로모터인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CRM 단백질이 크로마토그래피에 의해 분리되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 크로마토그래피가 설페이트 수지, 겔 수지 (gel resin), 활성 황산화 수지 (active sulfated resin), 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 에스케리키아 콜라이 (E. coli) 세포 또는 E. coli로부터 유래된 세포 (derivative) 또는 균주 (strain)인, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소가 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제, 단백질 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하가 상기 재조합 세포의 세포질의 레독스 상태를 비-재조합 세포와 비교해 산화성 상태로 시프트시키는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CRM 코딩 서열이 하나 이상의 CRM 에피토프, CRM 펩타이드 서열, CRM 도메인 또는 이들의 조합을 코딩하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 CRM 코딩 서열이 CRM197을 코딩하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    분리된 CRM 단백질에 항원을 접합하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    접합된 CRM 단백질이 면역원성 (immunogenic)인, 방법
  14. 제1항에 있어서,
    상기 분리가,
    상기 CRM 단백질을 수지가 충진된 크로마토그래피 컬럼에 주입 (loading) 완충제와 함께 주입하는 단계;
    상기 수지를 하나 이상의 세척 완충제로 세척하는 단계;
    용출 완충제를 사용해 상기 수지로부터 CRM 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 주입 완충제와 상기 세척 완충제가 동일한 것일 수 있는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 주입 완충제와 상기 하나 이상의 세척 완충제가 전도성이 약 10 mS/cm 이하인 저 전도성 완충제이고,
    상기 용출 완충제가 전도성이 약 10 mS/cm 이상인 고 전도성 완충제이고,
    상기 수지가 설페이트 수지, 겔 수지, 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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