HUT58349A

HUT58349A - Process for producing new isoleucine derivatives

Info

Publication number: HUT58349A
Application number: HU902706A
Authority: HU
Inventors: Per Balschmidt; Finn Benned Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1992-02-28
Also published as: NO913687D0; DK0463072T3; US5430016A; PT93502B; CA2049961A1; DE69015811T2; GR900100206A; FI914419A0; AU637365B2; ATE116661T1; EP0463072B1; YU53290A; NO913687L; AU5344890A; DD298788A5; IL93792A0; KR920701250A; IE901004L; ZA902086B; DK134189D0

Description

A jelen találmány uj inzulin vegyületekke1, az uj inzulin vegyületek előállítási folyamatával és meghosszabbított hatást mutató terápiás készítményekkel kapcsolatos és tartalmaz legalább egy uj inzulin vegyületet és ha kívánatos egy gyorsan ható inzulint.

Az inzulin 1922-ben való felfedezése óta számos különböző inzulin készítményt használnak a Diabetes mellitus kezelésére. Kezdetben kizárólag olyan inzulin oldatot alkalmaztak, mely gyorsan megkezdődő és relatíve gyorsan csökkenő inzulin aktivitást mutatott, de később szélesebb profilú aktivitást mutató inzulin készítményeket fejlesztettek ki. Ezt a hatást az inzulin oldhatóságának csökkentésével pl. cink só és/vagy protaminok hozzáadásával érték el. Az elérhetőség miatt az ilyen célra alkalmazott inzulint hagyományosan, nor má lis körülmények között háziállatok hasnyálmirigyéből vonták ki, leggyakrabban ökrökéből, sertésekéből és juhokéból. Azonban újabban biotechnológiai eredetű humán inzulint tartalmazó készítmények is megjelentek a piacon.

A humán inzulin szerkezetét az I. formula mutatja:

A -1ánc '7

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 lo 1112

S

I

B-1án cS

I

H-Phe-Val~Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

2 3 4 5 6 7 8 9 lo 1112

• · · · • · · ·

A -1 ánc /folyt. /

2o Leu=Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cvs-Asn°OH 13 14 15 16 17 )8 19 |21 / , S /I

B-lánc /folyt./S

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 2o 21 22 2324

B =1 ánc /folyt. /

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

5 2 6 27 2 829 3o

Az adott háziállatokból származó inzulinok szerkezete nagyon hasonló a humán inzulinéhoz. A kutya és sertés inzulin a humán inzulintól csupán abban tér el, hogy Ala-t tartalmaz Thr helyett a B-lánc 3o-as pozíciójában, a nyúl inzulin pedig csak abban, hogy Ser-t tartalmaz ugyanezen pozícióban . Ezek az inzulinok humán inzulinná konvertálhatók a B3o-aminosav maradék Thr-ra való kicserélésével, melyet f é 1 s z in t e t iku s eljárásokkal lehet Morihara et al. Natúré 28o (1979), 412-41 3 és Marcussen (US Patent No. 4,343,89 8 számú szabadalom) leírása szerint elvégezni.

Az inzulint oldatban tartalmazó készítmények általában gyorsan hatók, az inzulin aktivitás a be i n j e ke i ό z á s után már pár órával csökken. Ezért szükséges a folyamatos injekciózás, normális esetben naponta töhb alkalommal, a cukorbeteg vérglükóz szintjének normalizálása

- 4 céljából.

Hogy ezt a hátrányt leküzdjük, meghosszabbított hatású inzulin készítményeket formuláztunk úgy, hogy az in~ zulin aktivitás fennmaradjon néhány órán keresztül, akár 24 óráig is vagy még hosszabb ideig. Ilyen meghosszabbított hatású készítményeket használva néhány cukorbetegnek naponta csupán kis számú injekciót kell kapnia, pl.

vagy 2 injekciót 24 óra alatt.

Ilyen meghosszabbított hatást lehet elérni az inzulin enyhén oldható sóvá - mint amilyen a cink inzulin vagy a protamin inzulin - való konvertálásával. Az enyhén oldódó inzulin sókat szuszpenzió formájában alkalmazzuk, mely formából az inzulin fokozatosan szabadul fel a szubkután vagy in t r a m u s z ku 1 á r i s injekció után.

Újabban más módszereket is segítségül hívtunk a meghosszabbított hatás elérése céljából. Erre példa a polimerizált szérum albuminba való inzulin kristályok kapszulázása. Más példa a folyamatos működésű infúziós készülékek, az úgynevezett inzulin pumpák, melyek kényelmetlenek lehetnek és kockázatot jelentenek a beteg számára.

Az EP 13 2 7 7ο, EP 132769 és EP 1 3 57 2ο számú Európai Szabadalmi Közlemények specifikációi leírják azon inzulin származékok elkészítését és alkalmazását, ahol a B-lánc C-terminális végét megnövelték egy legalább egy pozitív töltést, előnyösen Arg-OH-t vagy Arg-Arg-OH-t tartalmazó szerves csoporttal. Az ilyen inzulin származékok s z us z pe η ζ i ó i t tartalmazó készítmények meghosszabbított hatással rendelkeznek. Azonban ezek az inzulin vegyületek nem nagyon alkalmasak az uj hasznos meghosszab

• · · » bitott inzulin készítmények formulázására, mert a meghosszabbítás mértékét nagyon korlátozottnak találták (J.

Markussen et a 1. , Protein Enginee r ing j. , 2o5-213 (19 87).

Az olyan inzulin származékok tulajdonságait, ahol a B-lánc N-terminális végét megnövelték az Arg-Arg dipeptiddel R.Geiger és F.Enzmann in: Proceedings of the Symposium on Proinzulin, Inzulin and C-peptid, Tokushima, 1987 ; Excerpta, Medica , Amsterdam 1979, p . 3o6-31o-ben írták le. Ezen inzulin vegyület oldhatóságát i z oe le kt r o m o s pontja körül még magasabbnak találták, mint a normál inzulinét.

Az inzulin molekulán belüli helyettesítéseket az inzulin aktivitási profiljának fejlesztése céljából lehet végezni a Diabetes kezelésében. így az EP 194 864 számú Európai Szabadalmi közlemény leírja, hogy a Glu 1 vagy több

B 2 7 pl. Ginénél való helyettesítése és/vagy a Thr Argnel való helyettesítése a C-te r m in ál i s karboxil csoport észter vagy amid formájában történő blokkolásával kombinálva az inzulin kicsapódási zónájának elmozdulását okozza oly. módon, hogy az injekciózás után lassú felszabadulást érünk el.

A közbenső aminosav helyettesítéseket tartalmazó inzulin vegyületek készítményekben való alkalmazása a Diabetes egész életre szóló kezelésében maga után vonja azt az alapvető kockázatot, hogy aktivizálja a beteg immunrendszerét az inzulin antitestek vérbe való jutását okozv a.

Az utóbbi években számos erőfeszítést tettek arra, hogy a hagyományos inzulin készítmények helyettesítésé « · · · re alkámas meghosszabbított hatású készítményeket találjanak. Ennek oka az, hogy a d í a be t ο 1 ógus ok a hagyományos meghosszabbított hatású inzulin készítményeket túl rövid . hatásuaknak találták, különösen a humán inzulin alkalmazása után és hogy az úgynevezett inzulin-ketrec /insulin pen/ bevezetése szükségessé tesz egy oldott, meghosszabbított hatású inzulint.

A jelen találmány tárgya olyan uj inzulin analógok biz tosítása, melyek meghosszabbított inzulin aktivitást mutatnak és melyek a lehető legalacsonyabb antigenitássa 1 bírnak.

Meglepően azt találtuk, hogy az inzulin vegyületek a

II ábrán látható általános szerkezettel bírnak:

A -1 án c

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser0123456 8 9 lo 1112

I

B-1án cS

I

H-Phe-Val-Asn-Gin-Hi s-Leu-Cys-Gly-Ser -His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 lo 1112

A-lánc /folyt./

2o

Leu-Tyr-Gln~Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH

14 15 16 17 18 1921

Is

I s

B-lánc /folyt./ • · ·

- 7 ι

B-lánc/folyt/ S

E-Ala-Leu-Tyr~Leu-Val-Cys-Gly-E~Arg-Gly-Phe

14 15 16 17 18 18 2o 21 22 23 24

B-1ánc /folyt./

Phe-Tyr-T-Pro-Lys- X-Y

26 27 28 29 3o ahol

E egyedül képvisel Glu-t vagy egy neutrális aminosav maradékot, melyet nukleotid szekvenciák kódolnak, N egy olyan aminosav maradékot képvisel, melyet nukleotid szekvenciák kódolnak,

T Thr-t vagy Arg-t képvisel,

X Thr-t, Ser-t, Ala-t vagy OH-t képvisel, és

12

Y OR-t vagy NR R -t képvisel, ahol R, R és R képvisel hidrogént vagy alacsonyabb alkilt, de nincs jelen ha X OH-t képvisel, egy kívánatos meghosszabbított inzulin hatást és/vagy an tigenitást mutat.

Ennek megfelelően a találmány a II általános formájú inzulin vegyületekke1 kapcsolatos:

A -I án c _s<-------------------------------_s

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser0 1 2 3 4 5 6 8 9 lo 11 12 • ·

Β -1 án c

I

S

H-Phe-Val-A sn -G1 n -H i g-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 lo 11 12

A-1ánc /folyt./

2o

Leu-Tyr-Gln-LsU“E~Asn-Tyr-Cys-N-OH

14 15 16 17 18 19

B -1ánc /folyt. /

S

E~Ala“Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Glyi-E-Arg-Gly-Phe-

14 15 16 17 18 19 2o 21 2 2 2 3 24

B-lánc /folyt./

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y

26 ⁹ 7 28 29 3o ahol E egyedül képvisel Glu-t vagy egy neutrális aminosav maradékot, melyet nukleotid szekvenciák kódolhatnak,

N egy olyan aminosav maradékot képvisel, melyet nukleotid szekvenciák kódolnak,

T Thr-t vagy Arg-t képvisel,

X Thr-t, Ser-t, Ala-t vagy OH-t képvisel, és

Y OR-t vagy NR^R^-t képvisel, ahol R, R^ és R^ egyedül képvisel hidrogént vagy alacsonybb alkilt, de nincs jelen ha X OH-t képvisel.

A jelen összefüggésben az alacsonyabb alkil-t úgy értelmezzük, hogy egyenes vagy elágazó 1-6 szénatomból • ·

- 9 álló alkil csoportokat tartalmaz.

A találmány különösen kapcsolatos a II formája inzulin vegyületekkel, ahol E egyedül képvisel Glu-t vagy Gln-t, N Asn-t, Asp-t, Ser-t vagy Gly-t képvisel,, T Thr-t vagy Arg-t képvisel, X Thr-t és Y NH -t képvisel.

A találmány előnyösen kapcsolatos a II formájú inzulin vegyületekkel, ahol E,N és T jelek legalább egyike egy olyan aminosav maradékot képvisel, mely eltér a humán inzulin megfelelő maradékától, ha Y OH-t képvise.

/

A találmány specifikusan olyan II formájú inzulin vegyületekkel kapcsolatos, ahol E Glu-t képvisel, N Asn-t, T és X mindkettő Thr-t és Y NH -t képvisel.

A találmány specifikusan olyan II formájú inzulin vegyületekkel kapcsolatos, ahol az összes E Glu-t képvisel, N Ser-t, R és X Thr-t és Y NH -t képvisel.

A találmány specifikusan olyan II formájú inzulin vegyületekkel kapcsolatos, ahol a Bl 3 pozícióban levő E Gln-t képvisel és az összes többi E Glu-t, N Asn-t T és X Thr-t és Y NH^-t képvisel.

A találmány specifikusan olyan II formájú inzulin vegyületekkel kapcsolatos, ahol az Á4 pozícióban levő E Gln-t képvisel és az összes többi fennmaradó E Glu-t, N Asp-t, T és X Thr-t és Y NH -t képviselnek.

A találmány olyan II formájú inzulin vegyületekkel kapcsolatos, ahol az összes E Glu-t képvisel, N Asn-t T Arg-t és X OH-t.

A találmány kapcsolatos egy a II formájú inzulin vegyül etek előállítására szolgáló módszerre! Is, mellyel egy a III. általános formájú inzulin prekurzor:

• ·

CQ

Ϊ>Ί ι ο

Ρη

I

Η ι u

Η ι

φ Λ Ρ< !

Ο

CM

CO

CM

CD

CM

LD

CM

Φ

PH CM t

cc

• · • · · · · · · ··«· ·· ·· ·· · ♦ · ·

- 11 ahol Ε, N és T ugyanolyan jelentésű, mint ahogy azt fent meghatároztuk, (AA)n egy C-terminális maradékként Lysnel rendelkező n aminosav maradékot tartalmazó peptid láncot képvisel vagy egy peptid kötést, ha n-o,és

Z hidrogént vagy egy tetszőleges hosszúságú, C-terminális maradékként L ys-ne 1 rendelkező peptid láncot képvisel, t r a n s zpe p t i d ál t, vagy egy lizin maradék karboxi oldalánál levő kizárólagos specifitásu hasítással rendelkező endope p tid áz z al hasított.

A találmány kapcsolatos egy legalább 1 II formájú inzulin vegyületet és tetszés szerint egy gyorsan ható inzulint - mint amilyen a humán inzulin, a háziállatok inzulinja vagy ezek származéka vagy analógja - tartalmazó készítménnyel is. Az ilyen készítmények lehetnek azonnal használható oldatban, vagy lehet liofilizált készítmény melyet pl. steril vízzel készítünk elő alkalmazás előtt.

A találmány inzulin készítményének egy különösen előnyös megtestesülése egy parenter álisan adható készítmény mely meghosszabbított inzulin hatással rendelkezik és a találmány legalább 1 inzulin vegyületet tartalmazza vizes közegben, mely izoozmotikus a v é r s z é r u m m a 1, pH éeté ke 2-5,5 között van, tetszőlegesen tartalmaz egy puffért és/vagy egy tartósító anyagot és ha kívánatos, egy gyorsan ható inzulint.

A találmány inzulin vegyületei megfelelnek a diabe to'r lógusok azon követelményeinek, miszerint minimális változások vannak a humán inzulin molekulábai, m inde gyík per se vagy ismerős az emberi test számára vagy éveken keresztül vizsgáltuk és igy nem találtuk immunválasz megindítójának. A találmány inzulin ve gyüle te inek fő jel• * · ♦ • ·

- 12 lemzője, hogy olyan humán inzulinként irható le, ahol egy arginin maradékot kapcsoltunk az A lánchoz és az N terminális véghez és ahol a B csoportját előnyösen am lánc id fór

C-terminális végi ka r boxi 1 májában blokkoltuk. Az in z u lin vegyületeket enyhén savas oldatban oldva szándékozzuk i

ilyen körülmények között az A pozícióban levő alk almazni, aszparagin maradék alapvető deamidálása bekövetkezhet kés zitm ény tárolási ideje hosszabbított hatást. Egy alatt és igy semlegesíti a megvagy feltehetően 2 glutaminsav maradék glutaminnal való védhető.

helyettesítésével ez a hatás k i In z u 1 i n - f ügg ő Diabete s esetében egy folyamatosan alkalmazott terápia napi két injekciót bitott hatású inzulin készítményből, jelent a meghosszabegyet reggel és egyet este a lefekvés előtt, egy alap inzulin szint létrehozása céljából. Továbbá három gyorsan ható inzulin készítményt adhatunk be a fő étkezések előtt. Ezen terápia hátránya, hogy a meghosszabbított hatású készítmény késői beinjek ciózása veszélyesen alacsony vérglükóz szintet eredményezhet az éjszaka folyamán. Ez elkerülhető egy meghoszszabbitott és egy gyors hatású keverékből álló készítmény vacsora előtti beinjekciózásáva 1, melynek révén a hypoglikémia, ha egyáltalán valamikor, akkor este fordul elő, amikor az pl. egy könnyű evéssel elhárítható. Azonban az ilyen fajta terápia gyakran eredményez hypergl ikém iá t reggel, mivel a leggyakrabban használt meghosszabbított hatású inzulin készítmények, az Insulatard és Monotard nemhatnak elég hosszú ideig. így szükség van a cukorbetegek olyan inzulin készítményekkel való ellátására, melyek hosszabb ideig hatnak mint az általánosan használt készít13 mények, különösen ha egy ilyen készítmény be inj e ke i ό z á sa elég akár több napra is. A találmány szerint előállított inzulin készítmények egy az általában alkalmazott meghosszabbított inzulin készítménynél a Monot ard ”-n ál hoszszabb ideig ható meghosszabbított inzulin hatást mutatnak, A találmány előnyben részesített inzulin vegyületei különösen előnyösen alkalmazhatók ο 1 d o 11 k é s z i t m éjrye kb e n, mivel az oldhatóság magas, még 5-ös pH közelében is (mely pH értéknél a deamidálás lényegesen csökkentett) és még így is jelentős meghosszabbított hatást mutat a szubkután injekciózás után.

A találmány előnyösen a következő speciális vegyületekkel kapcsolatos:

A találmány inzulin vegyületei előállíthatok más inzulinokból az inzulin molekula A láncának N-terminális végéhez kémiai szintézissel való további arginin maradék beépítésével, de csupán nagy nehézségek árán. Egy messze sokkal vonzóbb ut az egyláncu prekurzor pl. egy természetben előforduló proinzulin vagy pr e -pr oinzul in vagy egy a III általános formájú bioszintetikusán előállított prekurzor enzimatikusan katalizált konverziója. A

III. általános formula:

• ·· · ··· · • · » · · · · ···· ·· «« ·· ··*· rg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH

bD <

I

W

I >>

α co CM

CM

<Ί — >> o 1	<x> f»4
1
CQ	OO
> *
l 3
Φ
I
f-4	CT
	l—4

<ς

	<D	LO 1 1
	CQ
		Π'·4
	1	co
	W l
	CQ	CM
	> 1	»—< r»^
	ω Ml I co	Γ ·4
		o
	1	1—<
	Φ ω 1 >5	CD
	0 1 co >>	00
	— Q 1 ö	o-
	CD co	CT
	K ! c	lO
	0 I tí
	CQ t	CO
	CQ >	CM
o	1 Φ
a	X
XCÖ I——4	Pl 1	1—4
PQ	N

o e-t—(

Q \cd r-H co ni

O

Ph

H t ρ

>> H

I

Φ

X!

Pi

I

Φ XI Pl í

>> H—< 0 σ>

CM co

CM [>

CM

CT

CM

ΙΛ

CM

CQ

CM

ahol

Ε , N és T mind ugyanolyan jelentésű, mint amit a II formulánál meghatároztunk, (AA)n n aminosav maradékból álló pép tid láncot képvisel és C-terminális maradékként Lysnel rendelkezik, de egy peptid kötés ha n = o, és

Z hidrogént vagy egy terminális maradékként lizint tartalmazó tetszőleges hosszúságú peptid láncot képvisel.

Az enzim atikus konverzióhoz használt enzim egy tripszin-szerü endopeptidáz kell legyen, mely képes a lizin maradék karboxi oldalán levő peptid láncot hasítani. A tripszin magában gyakran használható, de egy lizin spéci fitást mutató endopeptidáz, pl. a Lysobacter enzymogenes (Boehringer Mannhe im )baktér iumból származó Lys-C endoproteináz vagy az Achromobacter lyticusból (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) származó Lysyl endopeptidáz különösen előnyös.

A reakciót transzpeptidádóként lehet elvégezni treonin amidot használva, pl. az EP 163 529 számú Európai Szabadalmi Közlemény leírásához hasonló körülmények között, igy közvetlenül a B3o-amidot kapjuk eredményként, de el* végezhető két lépésű reakcióként is a des [nr^B3j vegyületet eredményező enzimatikus hasítással kezdve, mely Bjo-amiddá konvertálható a Morihara et al loc. c i t. 1 e i r á sa szerinti párositási reakcióval.

A találmány inzulin ve gyülete inek prekurzorai bioszintetikusán egy a prekurzort kódoló DNS szekvenciát expreszszáló élesztőgomba gazdában te r nh e 11 e t he t ők .

Hogy a tenyésztápközegbe való szekréciót elérjük az inzulin prekurzort kódoló DNS szekvencia egy élftsztőgom4« *·4· *4 a · • * · · a • ·· · * « 4 · • « ·· ··«·

- 17 TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCT AAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGA. Phe Val Asn Gln.His Leu CysGly Ser His Leu Vál Glu Alá

TTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCA AACATGAACCAAACACCACTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGT L@u Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

AAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTG TTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACAAGAAAC Lys Gly He Val Glu Gin CysGys Thr Ser Ile CysSer Leu

Sáli

TACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAATAGCGTCG ATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCT Tyr Gin Leu Glu AsnTyr Cys Asn EndEnd

Az is látható, hogy az inzulin prekurzor gén transzlációját két stop kódon terminálja és közvetlenül ezután egy Sáli restrikciós helyet pozícionáltunk, A terminátor régió azonos a oll62ol Al számú Európai Szabadalmi Közleményben leirt Sall-BamHI restrikciós fragmaittel. A szekvenciát teljesen standard technikákat alkalmazva szerkes ztettük meg.

Az alkalmazott mutagenizációs módszer az oligonukleotid hely Irányított mutagenezis volt, melyet Zoller és Smith írtak le, DNA, Vol. 3^ No, 6, 4 79 -4 88 (19 84 ), A módszert a következőkben röviden leírjuk, és részletesebben az I. példában. Az expressziós plazmídból izolálva az inzulin prekurzor szekvenciát egy egyszálu, kör alakú M13 bakteriofág vektorba inzertáltuk. Az egyszálu ge•9 ·· ·φ» • · · · · · · · * • ·· · ·»·» • · « · * · · **·· ·* s» »r*·«·

- 18 ηοmhoz egy kémiailag szintetizált komplementer DNS szálat adtunk. A DNS szál tartalmazza a kívánt szekvenciát a c ir ku 1 ár i s DNS - on levő inzulin szekvenciákkal teljesen homológ szekvenciákkal körülvéve. Ezután a prímért in vitro biokémiai utón kibővítettük a cirkuláris genom teljes hosszúságában Kleno'w polimerázt használva. Ez a szál egyszálu fágok keletkezését idézi elő, melyek az E. coliban szaporítva megadják a kívánt szekvenciáju kétszálu DNS izolálásának lehetőségét. Ebből a kétszálu DNSből egy restrikciós fragment izolálható és az expresszió vektora reinzertálható.

A találmányt részletesebben a továbbiakban magyarázzuk meg a rajzokra való utalással, melyek közül:

1. ábra: a pYGABA 142 76 expressziós plazmidot mutatja

2. ábra: a pAB24 élesztőgomba vektort mutatja és

3. ábra: az inzulin szubkután depóból való abszorpciójá- nak grafikai reprezentációját mutatja.

A találmányt a továbbiakban a következő példákkal szemléltetjük.

I . Példa

Egy a B (1 - 2 9 ) - AKR - A (1-21) prekur zor e xpr e s s z i ój áh ο z használható expressziós plazmid megszerkesztése

A BamHI restrikciós fragimeöten levő a pYGABA (lásd az 1. ábrát) expressziós plazmidban található expressziós kazettát izoláltuk: At expressziós plzmidot a BamHI restrikciós endonukleázzal inkubáltuk. A körülmények a következők voltak: 2o yug plazmid, 5o egység BamHI, loo mM NaCl, 5o mM Tris-HCl, pH = 7,5, lo mM °C volt, a reakcióidő 2 óra. A két DNS fragmentet 1% os agaróz gélben szeparáltuk és a kívánt fragmentet izoláltuk.

Az M13 M13mpl8 vektoron való ligálása

Az izolált restrikciós fragmentet az M13mpl8 bakteriofág vektorhoz ligáltuk, melyet szintén a BamHI restrikciós endonukleázzal hasítottunk a következő reakcióelegyben: Fragment o,2 pg, vektor o,o2 pg, 5o mM Tris-HCl, ρ H = 7,4 , lo mM M g C1 , lo mM D T T é s 1 mM ATP, 2 ο ρ 1 térfogatban. Ezen elegy 5 ^1 mennyiségét az E.coli JMlol törzsbe transzformáltuk. A fragment vektorban való jelenlétét és a fragment orientációját a t r a ns zf or m án so kb ól izolált kétszálu M13-DNS restrikciós enzimes térképezésével határoztuk meg.

Az egyszálu (ss) DNS (templát) izolálása

A fent leirt transzformánso kból ss=DNS-at Messing Gene-ben, 19, 2 69-276 (19 82 ) leirt módszerének megfelelően izoláltuk.

A m ut a ge n i z áci ó s primer 5’ f os z f or il ác i ó j a

Az 5’ -C'AA CAATACCTCTCTTAGCCTTTGGA GTG-3’ • · ·

-2οszekvenciáva1 rendelkező m ut a génizációs prímért az 5’ végen f o s z f o r í 1 ál t uk 7omM Tris-HCl-ot, pH 7,o, lomM MgCl ot, 5mM DTT-t, ImM ATP-t loo pmol ο 1 i gon ukle o t í d ot és 3,6 egység T4 pol inukle ot id kinázt tartalmazó 3o pl r e akcióé le gy be n. A reakció 3o percig 37 °C hőmérsékleten ment végbe. Ezután az enzimet lo percig 65 °C hőmérsékleten való inkubálással in akt i v ál t uk .

A templát és a foszforilált mutagenizációs primer kétszáluvá tétele

A templát és a primer kétszáluvá tételét o,5 pmol templátot, 5 pmol prímért , 2o mM Tris-HCl-t, pH=7,5, lo mM MgCl =ot₈ 5o mM NaCl-ot és 1 mM DTT-t tartalmazó lo jil térfogatban lo percig 65 C hőmérsékleten való melegitéssel, majd o °C hőmérsékletre való hűtéssel végeztük el.

Extenziós/ligáciős reakció

A fent nyert reakcióelegyhez a következő elegyből ad tünk lo yul-t: o,3 mM dATP, o,3 mM dCTP, o,3 mM dGTP, o,3 mM TTP, ImM ATP, 2o mM Tris-HCl, pH = 7,5, lo mM MgCl, lo mM DTT, 3 egység T4 DNS ligáz és 2,5 egység Klenow polimer áz. Ezután a reakciót 16 óráig 16 C hőmérsékleten vittük végbe.

A JMlol tr ans zf or m ál ás a

A fenti reakcióelegy különböző higitásaival CaCl^-dal • ·

- 21 kezelt E₀coli JMlol sejteket transzformáltunk standard technikákat használva, és 2 χ YT agarlemezekre szélesztettük 2 χ YT fedőagarban. ( 2 χ YT = tripton 16 g/1, éles ztőkivona t lo g/1, NaCl 5 g/1. 2 x YT fedőagar = 2 x YT o_s4% agaréz hozzáadással és autoklávozva. 2 x YT agarlemezek = 2 x YT 2% agar hozzáadásával és autoklávozva. ) A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán keresztül.

A pozitív kiónok azonosítása

Az alkalmazott módszer a tarfolt képző hibridizáció, mely a következőkkel jellemzett: egy nitrocellulóz szűrőt helyeztünk egy megfelelő tarfolt sűrűségű lemezre, úgy hogy a szűrőt megnedvesitettük. Ezután a szűrőt a következőket tartalmazó oldatban áztattuk: 1,5 M NaCl, o,5 M NaOH 3o percig, 1,5 M NaCl, o,5 M Tris-HCl, pH = 8,o 1 percig, 2 x SSC (o,3 M NaCl, o,o3 M Nátrium citrát) a későbbi felhasználás idejéig. A szűrőt 3 MM szűrőpapíron szárítottuk és 8o °C hőmérsékleten 2 óráig hevitettük vákuum kemencében.

Az 5’-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3’ szekvenciáju m u t a ge n i z ác i ó s prímért radioaktív jelöléssel láttuk el az 5’ végen 7o mM Tris-HCl-ot, pH=7,5, lo mm MgCl -ot, 5 mM DTT-t, lo pmol ο1igonukleot Id ot, ² 3 2

2o pmol gamma- P-ATP-t és 3,5 egység T4 polinukle otid kinázt tartalmazó 3o ^ul térfogatú elegyben. Az elegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk 3o percig és 5 percig loo °C hőmérsékleten.

A szárított szűrőt előhibridizáltattuk 2 órán át 65 °C • · ·

-22hőm ér s ékleten 6 x SSC₉ o₉ 2% szarvasmarha szérum albumin, o,2% Ficoll, o,2% polivinil pirrolidon, o,2% nátrium dodecil szulfát (SDS) és 5o jug/ml lazac sperma DNS elegyében. Ezután a jelölt próbát tartalmazó reakcióelegyet hozzáadtuk 15 ml friss el ohibridizációs keverékhez és a szűrőt ebben tároltuk egy éjszakán át 4o °C hőmérsékleten enyhe rázás mellett, A hibridizáció után a szűrőt háromszor mostuk alkalmanként 15 percig, 2 x SSC + o,l% SDS-ben és a u t or a d i o gr af ál t uk . Az ugyanezen oldatban, a·? zonban 62 °C hőmérsékleten végzett mosás és egy másik autoradiográfia után a mutagenizációs primerrel komplementer DNS szekvenciát tartalmazó plakkokat azonosítottuk,

A pozitív kiónok újra szkrinelése

Mivel az azonosított klón regy heteroduplex eredménye, a plakkot ismét s z él e s z t e 11 ük . A hibridizációt és az azonosítást megismételtük.

A kétszálu M13 fág DNS tisztítása

Az u j r a s zkr iné 11 kiónt használtuk az E.colt JMlol g törzsének infekt álás ár a . Egy megközelítően lo fágot és

JMlol telepet tartalmazó tenyészetet szaporítottunk 5 órán keresztül 5 ml 2 χ YT tápközegben 37 °C hőmérsékleten. Ezután a kétszálu, cirkuláris DNS-at tisztítottuk a pelletből a Bimbóim és Doly által a Nucleic Acid Rés, , 1513 (197 9)-ben leirt módszernek megfelelően.

• · · • · · • * · « · «· ·· • · · * « · · · • ·· • · · *··· ··

- 23 Egy módosított inzulin prekurzort tartalmazó restrikciós fragment izolálása,

A fentiekben izolált DNS-ké s z itm ényt (megközelítően 5 jJLg) lo egység BamHI restrikciós end onukle áz z a 1 emésztettük 6o pl loo mM NaCl-ot, 5o mM Ti? i s-H C 1-o t, pH=7,5, lo mM MgCl -ot és 1 mM DTT-t tartalmazó elegyben 2 órán át 37 C hőmérsékleten. A DNS termékeket egy agaróz gélen szeparáltuk és a fragmentet tisztítottuk a gélből.

A pAB24 élesztőgomba vektorhoz (2. ábra) való ligálás

Az izolált restrikciós fragmentet ligáltuk a BámHI restrikciós endonukleázzal emésztett pAB24 élesztő gomba vektorhoz a következőket tartalmazó reakcióelegyben: o,2 pg fragment, vektor o,o2 pg, 5o mM Tris-HCl, pH=7,4, lo mM MgCl lo mM DTT, I mM ΑΤΡ 2o pl teljes térfogatban. Ezen reakcióelegy 5 pl mennyiségét használtuk az E.coli MCI06I törzs transzformációjához, melynek során a módosított expressziós plazmidot azonosítottuk és szaporítottuk. A plazmidot pYGA B-AKR-A-nak neveztük és ez azonos a pYGABA-val a hozzáadott kódont leszámítva.

Élesztő gomba transzformálás

Az expressziós pl az mid Saccharomyces cerevisiae

JC4 82 p e p/\Le u/\2 c i r ° (of,his4, pep4, ura‘3, leu2, cir°) élesztőgomba törzsbe való transzformálását az Ito et al. által leírtak szerint végeztük, J.Bact. Vol. 153 No. 1, 163-168 (1983). A transzformált sejteket SC-ura tápközeg···· • · * * .:.. *··’ ··

- 24 re ( o,7% Élesztő Nitrogén Alap, 2, o% glükóz, o,5% kazaminosav, 2,o% agar) s z éle s z te 11 ük a plzmid tartalmú sejtek szelekciója céljából.

II. Példa

Egy a B(l-.29j-Gly-Ser-Lys~Arg-A ¢-1-21) prekurzor termelésére hasznélható expressz i#s plazmid megszerkesztése

Az eljárás alapjában véve ugyanaz, mint amit az I. Példában leirtunk azzal az eltéréssel, hogy a mutagenizá ciós primer szerkezete 5’ “CAACAATACCTCTCTTAGAACC C T T TG G A G T G - 3 ’ volt, a hibridizációs hőmérséklet 42 °C és a hibridizáció utáni mosási hőmérséklet 64 °C.

A módosított plazmid szekvencia a pYGABA szerkezetével azonos a hozzáadott kódonoktól eltekintve.

III. P é 1 d a

Egy a (g 1 n ^'j-B(l-29)-Ala-Lys-Arg-A(l~21) prekurzor termeléséhez használható expressziós plazmid megszerke s zt é s e

Az alkalmazott eljárás alapjában véve ugyanaz, mint amit az I. példában leírtunk azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott templátot úgy nyertük, hogy a BamHI kazettát a p YG A B - A KR - A-b ól az M13-ba klónoztuk, hogy a mutagenizációs primer szekvenciája 5’-GTACAAAGCTT G A A C C A A G T G - 3 ’ volt, a hibridizációs hőmérséklet 31°C, és a hibridizáció utáni mosási hőmérséklet 53 °C volt.

• · *

- 25 A módosított plazmid szekvenciája azonos a pYGABA-val a meg vált ο zt at ott és hozzáadott kódonok kivételével.

IV. Példa

Egy a [g In , A s p Β (1-2 9 ) - A ía-Ly s - Ar g - A (1-2 1) prekurzor termelésére alkalmazható expressziós plazmid megszerkesz 8é se

Az alkalmazott eljárás alapjában véve ugyanaz, mint az I. példában leírtak, azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott templátot a BamHI kazetta p YG A B = A KR - A-b ól

Ml 3-b a való klónozással nyertük és a mutagenezist két lépésben végeztük. Az első lépésben a primer 5’ -ACAACATTGTTGAACAATACC-3’ volt, a hibridizációs hőmérséklet 27 °C és a hibridizáció után a mosási hőmérséklet 49 °C. A második lépésben a primer 5 ’ = C G C T A T T A G T C A C A G T A GTTT-3’, a hibridizációs hőmérséklet 29 °C és a hibridizáció után a mosási hőmérséklet 51 °C volt. A módosított plazmid szekvenciája azonos a pYGABA-éval a megváltoztatott és hozzáadott kódonoktól eltekintve.

V. Példa

Γ A 2 11

Egy a [Ser J- Β (1 - 2 9 ) - A1 a - L y s - A r g - A (1 - 2 1) prekurzor termelésére használható expressziós plazmid megszerkesztése

Az alkalmazott eljárás alapjában véve ugyanaz, mint amit az I. példában leirtunk azzal az eltéréssel, hogy az ·<*

- 26 alkalmazott templátot úgy nyertük, hogy a BamHI kazettát a pYGAB-AKR - A-ból az M13-ba klónoztuk és a mutagenizációs primer szekvenciája 5’-GACGCTATTAAGTACAGTAGT3’, a hibridizációs hőmérséklet 29 °C és a hibridizáció utáni mosási hőmérséklet 51°C volt. A módosított plazmid szekvenciája a pYGABA szerkezetével azonos a hozzáadott és m e g v á 11 ο z t a t o tt kódonoktól eltekintve.

VI. Példa

Egy az jArg^B273~B(l~29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21) prekurzor termeléséhez használható expressziós plazmid megszerkesztése

Az alkalmazott eljárás alapjában véve ugyanaz, mint amit az I példában leírtunk, azzal az eltéréssel, hogy alkalmazott templátot úgy nyertük, hogy a BamHI kazettát a p YG A B - A KR - A-bó 1 az M13-ba klónoztuk , valamint a mutagenizációs primer szekvenciája 5’-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-‘3’ , hogy a hibridizációs hőmérséklet 43 °C és a hibridizáció utáni mosási hőmérséklet 65 °C volt. A módosított plazmid szekvenciája azonos a pYGABA -éval a m e g v ál t ο z t a t o tt és hozzáadott kódonoktól eltekintve.

VII. Példa

A prekurzor expressziója és a tenyész tápközegből való izolálása

Az I. - VI. példákban leírtak szerint t r a n s z f or m á 11 élesztőgombát uracil nélküli minimál táptalajt tartalmazó Petri-csészében szaporítottuk 48 óráig 3 o °C hőmérsékleten. A Petri-csészér ől származó egyedüli teleppel uracil nélküli minimál tápközeget + 5 g/1 kazaminosavat + lo g/1 borostyánkősavat + 3o g/1 glükózt (pH=5,o értéknél) tartalmazó loo ml-es rázólombikokat i nők u 1 ál t unk . A lombikokat ezután inkubátorban rázattuk 3 o °C hőmérsékleten 72 órán keresztül.

Ce n t r if ug ál á s után az összegyűjtött felüluszó 1 liter mennyiségét szűréssel sterileztük, a pH-t 4-4,5 értekre; és lo mS-nél kisebb kond ukt i v i t ás értékre igazítottuk 5 M HC1 és víz hozzáadásával. 12o ml/óra áramlási sebességet alkalmazva a felüluszót azután 1,6 x 6 cm-es S-Sepha(R) rose^FF oszlopra adagoltuk, melyet korábban 5o mM ecetsav, 5o% (térfogat) NaOH-dal 4,o pH értékűre igazított etanollal equlibráltunk. Az oszlopot 6 o ml pufferrel mostuk és a prekurzort NaCl lineáris grádiensével o o,35 M-ig 36o ml pufferben lo ml/óra áramlással eluáltuk. Az eluátumot 4 ml-es frakciókra bontottuk és U V ab szorban ciáját detektáltuk. A prekurzort tartalmazó frakciókat RP-HPLC analízissel azonosítottuk és összegyűjtöttük. I M-os ecetsavban Sephadex G25-ös oszlopon való sótalanitás után a prekurzort 1 i of i le z é s s e 1 izoláltuk.

VIII. Példa

A z

29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21) prekurzor ból • · • »· * ·<

·♦ ·» ····

- 28 Az I. ¢5 VII. példákban leirt módszerekkel előállított B (1-29)-Ala-Lys-Arg-A(L-21) 25o mg mennyiségét felolo dottuk 4 C hőmérsékleten 25 ml 5o mM-os Tris-(hidroxim e t il) a m inom e t á η, 2o%( térfoga t) etanol elegyében és a pH értéket HCl-dal lo-re igazítottuk, ο, 8 mg immobilizált t r i p s z in/m 1 - t tartalmazó Sepharose-t mostunk egy üveg szűrőn ugyanezzel a pufferrel és ezután szárítottuk. Puffért adtunk a szárított gél 4o g mennyiségéhez és a térfogatot 75 ml-re igazítottuk. A prekurzort tartalmazó oldatot hozzáadtuk a s z u s z p e n z i óh o z és az elegyet 1 órán át enyhén rázattuk 4 °C

A HPLC analízis hőmérsékleten és ezután szűrtük.

61% £ArgA°J-des Thr ^{B 3} - humán inzulinná történő konverziót mutat.

A gélt 5o ml pufferben ( etanol nélkül) mostuk és szárítottuk és az összegyűjtött szürletben levő proteineket kicsapattuk a pH 6-os ét-tékre történő állításával. A csapa dékot centrifugálissal izoláltuk és liofileztük.

A csapadékot feloldottuk 4 °C hőmérsékleten 2o ml 7 M-os ureában a pH értékét 8,1-re igazítva és az oldatot előzőén 4 °C hőmérsékleten 2 o mM tris-(hidroximetil)ami(Arg^A°j-des Rhr^B3°J nometánnal és 7 M-os ureával ( melynek pH értékét HCldal 8,1-re állítottuk be) et^uilibrált 1,6 x 2o cm-es <5Sepharose FF oszlopra adagoltuk. 4o ml/óra áramlási sebességet alkalmazva ezután az oszlopot eluáltuk NaCl-os o - 5o mM-os lineáris grádienssel ugyanezen pufferben 24 órán keresztül. Az eluátumot UV abszorbanciával detektáltuk és a két fő csúcs közül az elsőt összegyűjtöttük. Az összegyűjtött anyagot 1 M-os ecetsavban s ót a 1 an itott uk Sephadex G25-ÖS oszlopon és liofileztük. A hozam 75 mg

- humán inzulin volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel megerősítettük, plazma deszorpciós tömeg s p e kt r o m e tr i á v a 1 és a szepad.lt vinilpiridilált A és B láncok egymást követő Edman-féle lebontásával.

IX. Példa

29i-Gly-Ser-Lys-Arg-A(l-21 j prekurzor ból a B(lA II.Ö VII. példákban leírt módszerekkel előállított B(l-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(l-21) prekurzor 4 ο o mg mennyiségét feloldottuk 5o ml 5o mM-os Tr i s - (h i d r ox i me t i 1) a m i nometán és HCl-dal lo-es pH értékre állított 2o% (térfogat) etanol elegyében. A o,8 g/ml ímmobilizált tripszint tartalmazó Sepharose't üvegszürőn mostuk ugyanezzel a pufferrel és szárítottuk. A szárított gél 8o g mennyiségé hez puffért adtunk és a térfogatot 15o ml-re igazítottuk.

A prekurzort tartalmazó oldatot dhozzáadtuk a szuszpenzió hoz és az elegyet 3o percig 2o °C hőmérsékleten hagytuk enyhe

A rázatás mellett és ezután szűrtük.

HPLC analízis az

humán in z u linná történő 5o%-os konverziót mutat.

A gélt mostuk loo ml pufferrel (etanol nélkül), meg szárítottuk és az ös s zegyüj tött s zűr letekben levő protei neket kicsapattuk a pH 6,o értékre való állításával. A csapadékot centrifugáLássál izoláltuk és liofileztük.

A csapadékot feloldottuk 4 °C hőmérsékleten 2o ml

M-os ureában a pH érték 8,1-re való igazításával és az elegyet előzetesen 4 °C hőmérsékleten 2o mM t r i s - (h id r ox i 3ο metil) aminometánnal és HCl-dal 8,1 pH értékre igazított 7 M-os ureával ec|.u il ibr á 11 1, 6 x 2o cm-es Q-Sepharose FF oszlopra adagoltuk. 4o ml/óra áramlási sebességet alkalmazva az oszlopot ezután eluáltuk ugyanezen pufferben levő NaCl o mM - 5o mM-os lineáris gradiensével 24 órán keresztül. Az eluátumot UV abszorpcióval detektáltuk és a két fő csúcs közül az elsőként eluálódót összegyűjtöttük. Az összegyűjtött anyagot 1 M-os ecetsav-r bán Sephadex G25-ös oszlopon s ó t a 1 a n i t o 11 uk és liofileztük tűk. A hozam 145 mg ^A r g °J - d e s -humán inzulin volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel, HPLC analízissel és az egymást követő Edman-féle degradációval erősítettük meg.

X. Példa

A z

-humán ból való előállítása inzulin sertés proinzulin4o mg sertés proinzulint oldottunk fel 8oo yul o,l M~ os HCl-ban és 8 ml 5o mM-os t r i s - (h i d r ο x i m e t i 1) a m i η ometánt adtunk hozzá. A Lysobacter enzym ogetie sb ől (Boehringer Mannheim) származó 1 U endoproteináz Lys-C bői HCl-dal 8,5 pH értékre állított o,l M-os tr is - (h idroxi r ox i m e t i 1 ) a m í η o m e t án 2oo ^il mennyiségében egy oldatot készítettünk. A két oldatot összekevertük és 12 °C hőmérsékleten 16 óráig hagytuk.

A reakciót a ρ H = 6, 2 értékre való állításával állítottuk le miután 1,8 ml 96%-os etanolt adtunk az oldathoz, • · • · · ο

és a kapott szuszpenziót 4 C hőmérsékleten hagytuk egy éjszakán át. A csapadékot centrifugálissal izoláltuk és 4 °C hőmérsékleten újra oldottuk 2 ml 7 M-os ureában a pH értéket 8,I-re állítva. Ezt az oldatot megelőzően 4 °C hőmérsékleten 2o mM tr i s - (h i d r ox i m e t ik) a m i no me t á n és

HCl-dal 8,1-es pH értékre állított 7 M-os ureával ecyuilib-. rált 1,6 x 2o cm-esQ-Sepharose FF oszlopra adagoltuk.

4o ml/óra áramlási sebességet alkalmazva az oszlopot (Arg^A°J-des ÍThr^B3oJ ezután o mM- 5o mM NaCl (ugyanezen pufferben) lineáris grádiensével eluáltuk 24 órán keresztül. Az eluátumot UV abszorpcióval detektáltuk és a fő csúcsot összegyűjtöttük. Az összegyűjtött anyagot sótalanltottuk 1 M-os ecetsavban Sephadex G25-ös oszlopon és liofileztük. A hozam 15 mg -humán inzulin volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel és HPLC analízissel valamint egymást követő Edman-féle degradációval rerősitettük meg.

XI, Példa ^rg^A°J -humán inzulin-(B3o~amid) készítése

A VII - X. példákban leirt móds zerek egyikével elő-

á 11 i t o 11

^Ar g ^A°J-de s [rh r ^{B 3} -h u m á n inzulin 2oo mg meny-

ny i s é g é t feloldottuk 4 oo mg treonmamidot, 2,o ml etanolt és o,S ml vizet tartalmazó elegyben. A pH értéket ecetsavval 6, 3-ra állítottuk és 4 ml (ülepített) 3,2 mg immo© bilizált tripszint tartalmazó Sepharoset adtunk hozzá. A óráig tartó 2o °C hőmérsékleten való enyhe rázatás után a gélt szűréssel eltá v'ol itottuk és a fehérjét kicsa- 32 pattuk lo térfogat 2-propanol hozzáadásával. A levegővel szárított csapadékot feloldottuk 4 °C hőmérsékleten 2o ml

M-os ureában a pH érték 8,1-re való állításával és az oldatot előzetesen 4 °C hőmérsékleten 2 o mM tris-(hidroxim e t il) a m ino me t á nn a 1 és 7 M-os HCl-dal 8,1 pH értékre állított ureával et^uilibrált 1,6 x 2o cm-es 0.- Sepharose FF oszlopra adagoltuk. 4o ml/őra áramlási sebességet alkalmazva az oszlopot ezután eluáltuk ugyanezen pufferben levő NaCl o mM - 5 o mM-os lineáris gradiensével 24 órán keresztül. Az eluátumot UV a b s ζ o r b an c i á v a 1 detektáltuk és a fő csúcsot Összegyűjtöttük. Az összegyűjtött anyagot Sephadex

G25-ös oszlopon 1 M-os ecetsavban s ó t a 1 a n i t o 11 uk és liofileztűk. A hozam 8o mg É^TgA°J -humán i η z ul in - (B3 o - a m i d ) volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel, plizma deszorpciós tömeg spektrometriáva 1 és egymást követő Edina n -f él e degradációval erősítettük meg.

XII. Példa

A [gi n ^B1 ³ , Ar g ^A °J-d e s £rh r ^{B 3}°J-h u m án inzulin előállítása

A III. és VII. példákban leírt módszerekkel előállított

B 1 31 [Gin J-B(l - 2 9 ) - Al a - Ly s - Ar g - A (1 - 21) 25o mg mennyiségét immobilizált trípszinnel kezeltük és a reakció terméket a

VIII. példában leírtakkal alapjában véve egyező módon tisztítottuk. A hozam 6o mg [Gln^Bl3, Arg^A°J-des |jhr^B3oJ -hu m án inzulin.

A termék azonosságát aminosav analízissel, plazma deszorpciós tömeg spektrometriáva 1 és egymást követő

Edman-féle de gr adációval erősítettük meg.

XIII. (Példa . L. A4 . A21 . ΑοΊ ,

A [Gin , Asp , Arg J-human li tá s a inzulin-(B3o-amid) elő ΑΙΑ IV. és VII. példában leirt módszerekkel előállított ~ A 4 A 21Ί

Gin , Asp J- B(l-29)~ A 1 a - L y s - A r g - A (1 - 2 1) 5oo mg mennyiség ét immobilizált tripszi nn el kezeltük és a reakció terméket a VIII. példában lertakkal alapjában véve egyező módon tisztítottuk. A

Arg^°]-des- &hr ^{B 3} °1 -h um án

Γ A4 hozam 175 mglGln inzulin volt.

Ezt konvertáltuk B3o-araiddá a treonin amiddal való kapcsolás révén, melyet a XI. példában leírt módszerrel végeztünk. A tisztított [θΙη^Α \Aí?p^, Arg^AoJ-humán inzulin-(B3o-amid) hozama 5o mg volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel, plazma deszorpciós tömeg spektrometriával és egymást követő Edman-féle d eg r a d á c i ó v a 1 erősítettük meg.

XIV. Példa

Γ A 21 A ol

A Is e r , A r g J-humán inzulin-.(B3o-amid) előállítása

Az V. és VII. példában leírt módszerekkel előállit o 11 ^Se r ^A 2 (i _ 2 9 ) - A1 a - Ly s - Ar g - A (1 - 2 1) 4oo mg mennyiségét kezeltük immobilizált tripszinnel és a kapott terméket a VIII. példában leírtakkal alapjában véve egyező mó-.

. Γ A21 . ΑοΊ , ΓΑ, Β3οΊ , dón tisztítottuk. AlSer , Arg J-des[Thr J-human • · inzulin hozama 125 mg volt.

Ezt B3o-amiddá konvertá ltuk a treonin amid XI. példában leirt módszerrel végzett hozzákapcsolásával. A

Γ A 21 Aol t i s z t o t o 11 (_Se r ,Arg J-humán in zu 1 in - (B 3 o - a m i d ) hozama 4o mg volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel, plazma deszorpciós tömeg' Spektrometriával és egymást követő Edman-féle d e gr a d á c i ό v a 1 erősítettük meg.

XV, Példa

inzulin előállítása

A VI. és VII. példában leirt módszerekkel előállított B 2 7 Ί

Arg J-B(l-29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21) 25o mg mennyiségét immobilizált tripszinnel kezeltük és a kapott terméket a VIII. példában leírtakkal alapjában véve azonos módon tisztítottuk. Az/Arg

um án inzulin hozama 5o mg volt.

A termék azonosságát aminosav analízissel és egymást követő Edman-féle degradációval erősítettük meg.

XVI. Példa

Egy oldott

-humán in z ul in - (B3 o - a m id o t) tartalmazó injektálható, meghosszabbított hatású készítmény formu1 á z á s a

6o yttm ol (Arg^A°J -humán i η z u 1 in - (B3 o - a m id o t) oldottunk fel 4 ml o,l M-os HCl-ban és 2o ml 1,5%-os m-krezolt adtunk hozzá. Az oldatot összekevertük 7o ml 1%-os NaCI dal és 3,25 ml o,5 M-os ZnCl -dal és a pH értéket 4, o-ra állítottuk,, A térfogatot végül loo ml igazítottuk vízzel és szűréssel sterileztük.

XVII. Példa

-humán i η z ul i η - (B 3 o - a m i d ) egy kristályos szuszpenzióját tartalmazó, injektálható meghosszabbított hatású készítmény formulázása

6o mól urnán !nzulín-(B3o-amldot) oldottunk fel 7o ml 1 M-os NaOH-dal 9,7-es pH értékre állított o,5%-os m-kbezolt tartalmazó 1%-os NaCl oldatban és 325 /11 o,l M-os cink-acetátot adtunk hozzá, A pH 9,7-es ét-tékre való újra igazítása után a térfogatot 8o ml-re állítottuk be vízzel és az oldatot szűréssel sterileztük.

o,3% m-krezolt tartalmazó és NaOH-dal 6,o pH értékre állított 65 mM-os NaH PO 2o ml mennyiségét szűrésse 1 sterilé ztük .

Steril körülmények között a két oldatot összekevertük és a kapott szuszpenziót nagyon óvatos keverés mellett 2 o °C hőmérsékleten hagytuk 1 óráig. A pH értéket végül HCl-dal 7,3-ra állítottuk.

XVIII, Példa

A szubkután injekció utáni, meghosszabbított hatás demonstrálása patkányokban külső gamma számlálással « *

A kísérletben megközekítően 25o g testsúlya és 9o napnál idősebb nőstény Wistar patkányokat használtunk. A patkányokat kb. egy hétig a használat előtt aklimatizéltük és ad libitum tápláltuk. Négy nappal a kísérletek e lőtt a patkányok 2o mM-os Na t r i u m - j od i d vizes oldatát kapták ivóvízként.

A teszt körülmények a következők voltak:

F' ''J

I A XVII. példa szerint e lké s z i te tt [Ar g J-humán inzulin-(B 3 o - a m i d )-o t tartalmazó szuszpenzió készítmény

II.

A XVI. példa szerint e lk é s z i te 11 £Á r g °J-h um á n inzulin-(B 3 o - a mi d )-o t tartalmazó oldat készítmény

III. Egy f é 1 s z in te t i ku s humán inzulint (Velosulin, loo

U/ml) tartalmazó gyorsan ható oldat készítmény

Mind a “3 készítmény továbbá tartalmazott 5o ^iCi/ml mono- IJ-inzulint vagy inzulin vegyi nyomjelzőt megfelelően, melyeket standard radio j o d i nációs módszerekkel készítettünk .

A patkányokat szubkután a comb hátsó részén injekcióztuk 5o ul készítménnyel, mely 3,5 nmol inzulin vefi 2 5 1 gyületet és 2,5 yuCi[_ ' IJ-jelölésü nyomjelzőt tartalmazott, A vizsgálat ideje alatt a patkányok mozgását korlátoztuk patkány tartókat használva.

A nyomjelző injekciós helyről való eltűnését, mely az inzulin vegyület abszorpciójának mértéke a szubkután

3Ί depóból (C.Binder: Az Injektált Inzulin Abszorpciója.

Munksgaard, Copenhagen, 1969) 2 ir ós zerke zete s MIP-lo sebességmérőkkel és 3 mm-es NaI s zcintillác iós kristályokkal, Be-ablake kkal és ko11 im átorokka1 6o °-os vizuális szöggel, és lo mm~es résekkel (Raytrdnic) jellemzett E 749 detektorokkal mértük. A sebességmérőket 121N (RaytrOnic) minirekorderekhete kapcsoltuk. A detektorokat az injekciózási helynél 2 cm-rel a bőr fölé rögzítettük. A radioaktivitást 5 perces időtartamig figyeltük a készítmény be in j eke i ó z ás a ut án o,; o,5,; 1. ; 1,5.; 2.; 2,5.; 3.; 4,;

5,; 6-5 8.; 12. és 24 . órában. A háttérszámok levonása után a számláié si sebességet az indulási számlálási sebesség százalékává alakítottuk át.

A 3. ábrán a maradék radioaktivitás átlagértékeit mutatjuk az egyes készítmények esetén az idő függvényében. Az 5o%-os maradvány aktivitás idejét véve (Τ^θ^) a meghosszabbítás mértékeként a görbékből azt olvashatjuk le , hogy:

I. Készítmény

II. Készítmény

III. Készítmény

T

5o% óra óra o,5 óra

Az eredmények azt mutatják, hogy az (Arg^A°j

-humán in zul in - (B 3 o - a m id ) - o t tartalmazó mindkét készítmény ki fejezett meghosszabbított hatást mutat a gyorsan ható hu mán inzulin készítményhez viszonyítva.

- 38 XIX. Példa

^B27J-des[tür

-humán inzulin oldatát tartalmazó injektálható meghosszabbított hatású ké szítmény létrehozása yUmol[Arg^Ao,Arg^B2,j-des (Thr^B3oJ -hűm án inz ul int oldottunk fel 35 ml l%~os NaCl-bara, mely o, 5% m-krezolt tartalmazott, a pH 1 M-os HCl-dal 3 , 5=ös értékre való állításával, és 65o yul o,l M-os c ink-a c e t át ot adtunk hozzá. A pH 3,5 értékre való újraállítása után a térfogatot 5o ml-re igazítottuk vízzel és az oldatot szűréssel sterilé ztiik.

XX. Példa nyulakban a szubm M

Ao . B2 7) , Arg J oldat készítmény

A meghosszabbított hatás demonstrálása kután injekció után

A XIX. példa szerint készített, o,24 -des [_Thr^B3°J -humán inzulint tartalmazó meghosszabbítási mértékét nyulakban a Br i t i sh|Ph a r m a c o poela, 198o-ban leirt módszerének megfelelően határoztuk meg.

A készítmény 65 yul mennyiségét szubkután injektáltuk nyulba és vérmintákat vettünk a glükóz meghatározása céljából az injektálást megelőzően és 1, 2, 4 és 6 órával az injektálás után. A glükóz értékeket az injekciózás előtti érték %-ában fejeztük ki.

··♦*

- 39 A meghatározás a következő átlagértékeket mutatja:

Az injekciózás . , . . ,,, oóra 1 . 2 . 4. 6ór a után i ία o

A ke z de t i gl ii k ό z % - a loo% 6 8,2% 65, o % 8 ο, 1 % 79,4%

A J.Markussen et al: Protein Engineering Vol,l No.3 pp. 2 o 5 - 21 3 (19 87) által leirt módszer szerint meghatározott meghosszabbítási indexet 42 értéknek számítottuk. Az 1. táblázatban szereplő eredményekkel összehasonlíth u m án inzulint tartalmazó oldat készítményt úgy találtuk azonos meghoszszabbitást ad, mint az általánosan használt meghosszabbítva ható cink inzulin szuszpenzió készítmény az Actrapid Humán.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK /

1. Inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy a II formulával rendelkeznek:

A-1án c

S—— S

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cjis - Cys - Thr-Ser-Ile-Cys-Sero 1 2 3456 | 8 9 lo 1112

S

I

I

Β -1 án cS

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 lo 1112

A-lánc /folyt./
2o

Leu-Tyr~Gln~LeU-E“Asn-Tyr-Cys-N-OH

13 14 , 15 16 17 18 19 |21

I-S

I

Β-1ánc /folyt. /S

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe—

13 14 15 16 17 18 19 2o 21 22 2324

B-1 ánc /folyt./

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y

25 26 2728 2930 • r «·

- 41 ahol,

E egyedül képviseli Glu-t vagy egy neutrális aminosav maradékot, melyet nukleotid szekvenciák kódolhatnak, N egy olyan aminosav maradékot képvisel, melyet nukleotid szekvenciák kódolhatnak,

T Thr-t vagy Arg=t képvisel,

X. Thr-t, Ser-t, Ala-t vagy OH-t, és

Y OR~t vagy NR^R²-t képvisel, ahol R, R^ és R² egyedül képviselnek hidrogént vagy alacsonyabb alkilt, kivéve ha

Y nincs jelen, amikor X OH-t képvisel.

2. Az 1, igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy minden egyes E egyedül képvisel Glu-t vagy Gln-t, N .Asn-t, Asp-t, Ser-t vagy Gly-t, T Thr-t, Arg-t, X Thr-t és Y NH -t.

&
3. Az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy az összes E Glu-t képvisel, N Asn-t, T és X egyaránt Thr~t képviselnek és Y NH^-t.
4. Az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy az összes E Glu-t képvisel, N Ser-t T és X egyaránt Thr-t és Y NH -t.

Li
5. Az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy E a B13 poticióban Gln-t képvisel és az összes további E Glu-t, N Asn-t és T és X egyaránt Thr-t és Y NH -t képvisel.

Λ
6.

• · · ·

6. Az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy E az A4 pozícióban Gln-t képvisel és az összes további E Glu-t, N Asp-t T és X egyaránt Thr-t és Y NH -t képvisel.
7. Az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek azzal jellemezve, hogy az összes E Glu-t, N a A s n -1, T Arg-t és OH-t képvisel.

8. Eljárás az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek előállítására azzal jellemezve, hogy egy III. általános formájú inzulin prekurzor:

*··· α

<q

I___

bC <M P co c 1 w ( 1—f co 1 >> o 0 l tM t CO í**! σ> o f'·4 05 00 > 1 r-4 1 •Ö Φ i-q 1 1 P >3 CD H CD LO pl | 05 1··' < Tf< c *“* 1 co M r—< 05 CM > 1 d ω —< t-l I 1 cn o £ | 1 p CD o U2 ►*> 0 I OO co

Ο pl

CD ι

ö w co <q

-u>

>9

O <4-4 co >9 p!

I o

I

H

I

P >9 H

I Φ XI

Oi <M

CO

ΓΟΟ

CO

LQ

CO

Q Ö 'oá r—4

9 m > t

Φ Λ

9 N (M o Cl 'd

I

Φ

X5 co r

>i O~ <·« • · ··· » «4 • · ·· • · ·· ·· • · · ·«· · • · ·· ·♦·· ahol,

E,N és T mind ugyanolyan jelentésű, mint amfolyet az 1. igénypontban megállapítottunk, (AA)n egy n aminosav maradékkal rendelkező peptid láncot képvisel és C-terminális matradékként Lys van, vagy egy peptid kötés, ha n=o é s

Z hidrogént vagy egy C-terminális amaradékként L y s -1 tartalmazó tetszőleges hosszúságú peptid láncot, tr ans zpiep t id ál t vagy egy endopeptidázza 1 hasított, mely enzim kizárólagos spe c if i t á s s a 1 rendelkezik a lizin maradék karboxi oldalának hasításához.

9. Inzulin készítmények azzal jellemezve, hogy tartal- maznak az 1. igénypont szerinti inzulin v egy ü le t e kb ől legalább egyet és tetszőlegesen tartalmaznak egy gyorsan . ható inzulintm, mint pl. a humán inzulint, háziállatok inzulinját vagy ezek származékait vagy analógjait.

lo. A 9. igénypont szerinti inzulin készítmények azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti inzulin vegyületek legalább egyikének oldatát tartalmazzák egy vizes közegben, mely izoozmotikus a vérszérummal, pH értéke 2 és 5,5 között van és tetszőlegesen tartalmaznak egy puffért és/vagy egy tartósító ágenst és tetszőlegesen egy gyorsan ható inzulint.